CN102060913B

CN102060913B - 一种与人血清白蛋白结合的七肽与应用

Info

Publication number: CN102060913B
Application number: CN201010565230A
Authority: CN
Inventors: 洪岸; 马义
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2030-11-30
Also published as: CN102060913A

Abstract

本发明公开了一种与人血清白蛋白结合的七肽与应用。该短肽的氨基酸序列组成为WQRPSSW。该短肽由7个氨基酸组成的、且与人血清白蛋白专一亲和的、具有较高亲和力。本发明所述与人血清白蛋白结合的七肽应用于与多肽构建成融合蛋白，注射到人体中后，可显著提高多肽的稳定性及生理活性周期。

Description

一种与人血清白蛋白结合的七肽与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种与人血清白蛋白结合的七肽与应用。

背景技术

药物肽通常通过作用于特异性受体，以特定的细胞信号传导途径发挥其特定的生物学功能，但许多药物肽因含有特定氨基酸组成或其分子量小，通过自身的代谢和肾的滤过作用，在生物体内被迅速降解或清除而丧失生理活性。提高肽类等分子药物的稳定性、延长其在生物体内的半衰期是现在许多新型分子药物研发的目标。适当增加、修饰或突变某些特定的氨基酸可以改善和提高某些肽分子药物的稳定性；而分子量小的药物肽与某些血浆组成成份融合表达或在生物体内与半衰期长的、可以作为药物运输载体的血浆蛋白结合，可显著改善他们的药物代谢动力学特性，提高药物肽在体内的半衰期和生理活性。

人血清白蛋白(HSA，分子量为66.478kDa.)是人体血浆中含量最为丰富的蛋白种类，浓度约为600μM，它也是人体血浆中主要的药物运输蛋白，在人体内的半衰期可达19天。许多药物肽或蛋白在生物体内与人血清白蛋白结合能有效的改善其代谢动力学特性，延长其半衰期，提高其稳定性和生理活性。

筛选与人血清白蛋白具有较高的专一亲和作用的短肽，专一亲和性短肽在血液中与人血清白蛋白结合，可使某些药物肽与专一亲和性短肽融合表达的融合多肽或蛋白在生物体内的半衰期有效延长。而目前筛选的人血清白蛋白亲和性短肽多为20个氨基酸或12个氨基酸的短肽，且较少有与人血清白蛋白具有高亲和力的短肽。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种与人血清白蛋白具有高亲和力的七肽。

本发明的另一目的在于提供所述与人血清白蛋白结合的七肽的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种与人血清白蛋白结合的七肽，其氨基酸序列如下所示：WQRPSSW；

所述与人血清白蛋白结合的七肽的编码核苷酸序列为：TGG CAG CGC CCG AGCAGC TGG；

所述与人血清白蛋白结合的七肽应用于与多肽构建融合蛋白；该融合蛋白可以与人血清白蛋白结合；

所述的多肽优选为药物多肽；该七肽与药物多肽融合后，显著提高药物肽在生物体内的稳定性及生理活性周期；

所述的药物多肽包括：治疗糖尿病的药物多肽如：PACAP及其衍生物；抗肿瘤的多肽如：TNF及其衍生物以及某些促进细胞凋亡的多肽等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明首次提供了由7个氨基酸组成的、且与人血清白蛋白专一亲和的、具有较高亲和力的短肽。短肽与某些药物多肽融合后，短肽的氨基酸个数越少，不仅有利于该短肽不易造成药物多肽作用位点的位阻，而且在生物体内不会存在抗原性影响。

附图说明

图1为含所选7-mer肽的噬菌体与人血清白蛋白的亲和作用曲线。

图2为重组多肽MHDBAY的制备示意图。

图3为MHDBAY基因合成及重组表达质粒pKY-MHDBAY构建示意图；

图中：MCS-多克隆位点；CBD-几丁质结合结构域；intein-内含肽。

图4为SDS-PAGE检测融合蛋白Intein-CBD-MHDBAY表达的鉴定图；其中，泳道1是IPTG诱导后菌体破碎上清液；泳道2是IPTG诱导前菌体破碎上清液。

图5为制备的重组多肽MHDBAY的飞行质谱鉴定图。

图6为重组多肽MHDBAY与BAY55-9837的稳定性比较与检测结果图。

图7为重组多肽MHDBAY/BAY55-9837和[¹²⁵I]PACAP38对VPAC2受体的竞争性结合检测结果图。

图8为重组多肽MHDBAY和BAY55-9837对ICR小鼠的急性糖耐量试验的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

人血清白蛋白亲和结合7-mer肽的淘选

利用New England Biolabs，Inc公司的随机七肽噬菌体展示文库(Ph.D.-7噬菌体展示肽库)筛选人血清白蛋白高亲和7-mer肽。

Ph.D.-7噬菌体展示肽库是将随机七肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，是一个组合文库，本文库包含的随机七肽序列数在10⁹以上，本文库的滴度为2×10¹³pfu/mL。

用固定靶分子直接包被平板法进行四轮淘选。

第一轮淘选：

(1)将人血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司)溶于0.1M的NaHCO₃溶液(pH8.6)，配制浓度为100μg/mL的人血清白蛋白溶液(pH 8.6)；

(2)在单个灭菌聚苯乙烯培养皿平板(60×15mm，Coring Incorporated公司)中加入1.5mL上述人血清白蛋白溶液溶液，反复旋转直到表面完全湿润，在增湿容器中4℃轻微震荡，孵育过夜，平板可在此容器中4℃贮存备用；

(3)用1mL的TBST缓冲液(TBS缓冲液中含0.1％[v/v]的吐温-20，pH 7.5)稀释2×10¹¹的噬菌体(即10μL的原始文库)，然后加到已包被和封闭好的平板上，室温温和摇动50min；

(4)倾倒除去未结合噬菌体并拍甩除去残余溶液，用上述TBST缓冲液洗板10次；将人血清白蛋白溶于TBS缓冲液(pH 7.5)中，配制浓度为100μg/mL的溶液，用此溶液1mL将结合的噬菌体竞争性洗脱下来，洗脱时间为40min；

(5)取少量洗脱的噬菌体按照试剂盒说明书方法进行滴度测定，其余洗脱的噬菌体按照试剂盒说明书方法进行扩增并测定滴度；

第二轮淘选：

按照第一轮淘选方法，取包被好的聚苯乙烯培养皿平板，封闭后加入第一轮淘选扩增后的噬菌体，加入噬菌体量为2×10¹¹pfu，进行第二轮淘选，方法与第一轮淘选相同；

第三轮淘选：

按照第一轮淘选方法，取包被好的聚苯乙烯培养皿平板，封闭后加入第二轮淘选扩增后的噬菌体，加入噬菌体量为2×10¹¹pfu，进行第三轮淘选，方法与第一轮淘选略有改动：在清洗步骤中将TBST缓冲液中吐温-20的浓度增至0.3％[v/v]；

第四轮淘选：

按照第一轮淘选方法，取包被好的聚苯乙烯培养皿平板，封闭后加入第三轮淘选扩增后的噬菌体，加入噬菌体量为2×10¹¹pfu，进行第四轮淘选，方法与第一轮淘选有部分改动：在清洗步骤中将TBST缓冲液中吐温-20的浓度增至0.3％[v/v]；包被平板时所用人血清白蛋白溶液的浓度降低为10μg/mL；噬菌体与平板的结合时间由前三轮筛选时的50min缩短为20min，洗脱时间由前三轮筛选时的40min增加为60min。

在第四轮淘选出的噬菌体中随机选择10个噬菌斑进行DNA测序，测序引物为-96gIII测序引物(其DNA序列为：5’-CCC TCA TAG TTA GCG TAACG-3’)，根据DNA测序结果推演为氨基酸序列，实验结果表明，与人血清白蛋白亲和结合7-mer肽的氨基酸序列为：WQRPSSW。

实施例2

人血清白蛋白亲与所淘选的7-mer肽的亲和力测定

利用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测淘选得到的7-mer肽与人血清白蛋白的亲和力，具体步骤如下：

对要鉴定的含有与人血清白蛋白亲和结合7-mer肽(其氨基酸序列为：WQRPS SW)的噬菌斑克隆进行纯培养并测定滴度。将过夜培养的大肠杆菌ER2738(New England Biolabs公司)按1∶100的体积比例稀释于20mLLuria-Bertani(broth)培养基(LB)中，于每管ER2738培养液中加入5μL噬菌体上清，37℃通气培养4.5h。

上述培养物转入离心管中，10,000rpm离心10min，上清移入新鲜离心管，再离心，取体积百分比80％上清于新鲜离心管中，加1/6体积的PEG-8000/NaCl(20％[w/v]PEG-8000，2.5M NaCl)，4℃沉淀过夜后，10,000rpm离心沉淀15min，弃上清，沉淀重悬于1mL TBS缓冲液中，悬液转入微量离心管，4℃离心5min，上清转入新鲜微量离心管，加1/6体积的PEG-8000/NaCl再沉淀，冰上作用30min，4℃离心10min，弃上清；沉淀重悬于50μL TBS缓冲液中，测定噬菌体滴度，4℃贮存。

将人血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司)溶于0.1M的NaHCO₃溶液(pH 8.6)，配制浓度为100μg/mL的人血清白蛋白溶液(pH 8.6)，用此溶液包被ELISA板的一排空，每空加入200μL，作为阳性实验组；用另一ELISA板连续四倍稀释噬菌体，由第12孔加入10¹²个病毒子，进行4倍系列稀释至第1孔为2.4×10⁵个病毒子；这两个多孔板均用1％[w/v]酶水解干酪素封闭。

用多通道移液器将稀释好的噬菌体加入包被有人血清白蛋白的板中，室温震荡作用2h；用TBST缓冲液(TBS缓冲液中含0.3％[v/v]的吐温-20，pH 7.5)洗板6次。

在封阻液中以1∶5,000的比例稀释HRP标记的抗-M13抗体(Pharmacia#27-9411-01)。每孔加入200μL稀释抗体，室温震荡作用1h，用TBST缓冲液(TBS缓冲液中含0.3％[v/v]的吐温-20，pH 7.5)洗板6次，然后加入ABTS/H₂O₂(Sigma#A1888)底物溶液200μL，室温作用40min，用酶标仪记录405nm处的吸光值，实验重复三次，取其平均值；对照实验组，不加入噬菌体，其他同阳性实验组，以测定底物背景吸光值。

经统计学处理，表1为阳性实验组和空白对照组在405nm处各空的吸光值；图1显示了含有亲和结合7-mer肽(其氨基酸序列为：WQRPSSW)的噬菌体与与人血清白蛋白的亲和力曲线，实验结果显示，所淘选到的7-mer肽与人血清白蛋白具有较高的亲和力。

表1利用酶联免疫吸附技术检测所选7-mer肽与人血清白蛋白的亲和作用

注：1表中数字1，2，3......12表示4倍系列稀释后依次升高的噬菌体数目.如1表示2.4×10⁵，12表示10¹².

2实验重复3次.表中数值为3次的平均值.

实施例3

重组VPAC2型受体特异激动剂MHDBAY的制备

高稳定性VPAC2型受体特异激动剂MHDBAY的制备过程如图2所示，具体步骤如下：

(1)MHDBAY编码序列的获得：

按照大肠杆菌的密码偏好性设计编码MHDBAY的cDNA，设计3条引物，采用两步法获得该序列(如图2所示)：

引物F1：

5’GGT GGT CAT ATG TGG CAG CGC CCG AGC AGC TGG ATT GAA GGT CGC TTT CCGCAT AGC GAT-3’；

引物F2：

5’-CGC CAG CTG TTT ACG CAG ACG GGT ATA CTG ATC GGT AAA CAC CGC ATC GCTATG CGG AAA-3’；

引物F3：

5’-CCA CCA TGC TCT TCC GCA ATA ACG TTT CTG TTT AAT GCT CTG CAG ATA TTTTTT CGC CGC CAG CTG TTT-3’

其中，GGT GGT或CCA CCA为保护碱基，CATATG为NdeI酶切位点，TGC TCTTCC GCA为SapI酶切位点；

①链延伸反应：

反应体系为：引物F1(250μM/L)2μL，引物F2(250μM/L)2μL，10×TaKaRaBuffer(含有4mmol/L MgCl₂)2μL，dNTP 2μL，H₂O 11.5μL，TaKaRa Taq酶0.5μL；

反应条件为：94℃，10min；降至58℃5min；72℃10min；

得到延伸反应液。

②PCR反应：

反应体系为：以延伸反应液为DNA模板，引物F1(25μM/L)2μL，F3(25μM/L)2μL，延伸反应液1.5μL，dNTP 2μL，10×TaKaRa Ex Buffer 2μL，TaKaRa Taq酶0.5μL，H₂O 10μL；

反应条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；

得到长度为162bp的PCR产物。

(2)构建重组载体pKY-MHDBAY，如图3所示：

用NdeI和SapI进行酶切步骤(1)得到的PCR产物，利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化(根据说明书进行操作)。纯化后的PCR产物先进行LguI(SapI的同功酶，Fermatas产品)单酶切，酶切条件为：在1×Tango^TM buffer反应体系中，1μg PCR产物加入15unit LguI(3μL)，37℃酶切4h；LguI单酶切完成后，加入适量体积的10×Tango^TM buffer，使得反应体系成为2×Tango^TM buffer体系，加入20unit NdeI(2μL，Fermatas产品)，37℃酶切4h；

质粒pKYB(New England Biolabs(NEB)公司)的双酶切：LguI(SapI的同功酶)和NdeI的双酶切条件同上。

将双酶切后的MHDBAY基因和双酶切后的质粒pKYB连接，连接体系和连接时间、大肠杆菌DH5α(购自大连宝生物公司)感受态细胞的制作、转化以及筛选(卡那霉素)，根据《分子克隆》进行操作。将MHDBAY基因克隆到质粒pKYB的NdeI和SapI位点间，得到重组载体pKY-MHDBAY，测序，目的序列如下：

ATG TGG CAG CGC CCG AGC AGC TGG ATT GAA GGT CGC TTT CCG CAT AGC GATGCG GTG TTT ACC GAT CAG TAT ACC CGT CTG CGT AAA CAG CTG GCG GCG AAA AAATAT CTG CAG AGC ATT AAA CAG AAA CGT TAT；

其表达蛋白序列如下：

MWQRPSSWIEGRFPHSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLQSLKQKRY。

(3)表达和纯化：

①将重组质粒pKY-MHDBAY转化表达宿主菌E.coli Strain ER2566(NewEngland Biolabs(NEB)公司)，得到表达工程菌pKY-MHDBAY/ER2566；挑取单克隆于5mL含50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(broth)培养基(简称LB培养基)，摇菌培养过夜，再扩大，以体积比为1∶100的比例接于1L含50mg/L卡那霉素的LB培养基，37℃摇菌至OD₆₀₀为0.6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))至终浓度0.6mmol/L，37℃诱导表达6h。8000rpm离心20min收集菌体，将菌体重悬于60mL Buffer A溶液(20mM Tris-HCl，500mM NaCI，1mM EDTA，pH 8.0)中，然后用低温超高压连续流细胞破碎仪进行破碎，破碎条件为：BufferA溶液稀释菌体的浓度为18％(m/v)，破碎压力为1700bar，制冷温度为3℃。

破碎产物在4℃，10000rpm离心30min，收集上清，该上清称为破碎上清。SDS-PAGE检测融合蛋白Intein-CBD-MHDBAY的表达，鉴定结果如图4所示。

取25mL几丁质珠(NEB公司产品#S6651L)装填4.5×20cm层析柱，以10倍柱体积的BufferA溶液洗柱；破碎上清以0.5mL/min的流速上注；用10倍柱体积的Buffer A溶液以2mL/min过柱，以洗去杂蛋白或未亲和结合的融合蛋白，用80mL Buffer B溶液(20mM Tris-HCI，0.5M NaCl，1mM EDTA，50mMβ-巯基乙醇，pH 8.0)自然过柱，使β-巯基乙醇均匀分布并浸泡柱内填料，然后封闭进、出口端，上述反应体系在16℃反应24h，以诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的多肽C端硫酯。用Buffer A溶液洗脱并用洁净的烧杯收集目的多肽溶液C端硫酯，4℃透析过夜除去β-巯基乙醇并使目的多肽C端硫酯水解，再经高效液相色谱(HPLC)纯化、制备得到纯度为质量百分比95％以上的VPAC2型受体特异激动剂MHDBAY，目的多肽的制备条件为：流动相A[在体积百分比10％乙腈(CNCH₃，溶质为纯水)中添加三氟乙酸(TFA)得到，TFA的终浓度为体积百分比0.1％]，流动相B[100％乙腈(CNCH₃)中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的终浓度为体积百分比0.1％]，流速1mL/min，20min线性梯度洗脱，线性梯度洗脱中流动相B由0～60％(v/v)，收集目的多肽洗脱峰，光吸收检测波长为218nm。目的多肽MHDBAY的纯度通过分析性HPLC测定(条件同目的多肽的制备条件)。制备的高稳定性VPAC2型受体特异激动剂MHDBAY利用质谱技术鉴定(如图5所示)，质谱检测分子量为5544.2kDa.，与其理论值相符合。

实施例4

重组肽MHDBAY(即实施例3制备的MHDBAY)的体外稳定性测定

重组肽MHDBAY、化学合成MHDBAY(与重组肽MHDBAY相比，其N端无甲硫氨酸)和BAY55-9837(Tocris Bioscience公司产品#2711)以终浓度1mg/ml分别溶解在20mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0，含150mM氯化钠)，37℃水浴锅中孵育，在不同的时间点取样，利用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)检测多肽在水溶液环境中随时间的存留量，以确定重组肽MHDBAY在体外水溶液环境中的稳定性，结果如图6所示：孵育1周时，BAY55-9837消减33.7％，孵育2周时，BAY55-9837消减73.9％，孵育3周和4周时，BAY55-9837分别消减86.5％和95.9％；化学合成MHDBAY多肽在孵育2周时，消减23.2％，孵育4周时，消减48.0％；而重组肽MHDBAY在孵育2周时，仅消减2.1％，孵育4周时，仅消减6.7％。实验结果统计学处理表明，重组肽MHDBAY的体外稳定性比BAY55-9837提高约25倍，比化学合成MHDBAY多肽提高约8倍。

实施例5

重组肽MHDBAY对VPAC2受体的竞争性结合活性测定

用200μL PBS(PH7.4)溶解重组肽MHDBAY至终浓度分别为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM、0.0001μM、0.00001μM置冰上冷却20min，保持样品在冰上，然后加入10unit凝血因子Xa酶/(每毫克重组肽MHDBAY)和1ng人源二肽基肽酶(DPPIV)/(1μM重组肽MHDBAY)，37℃水浴中反应24h，以释放活性多肽MBAY(作用于VPAC2受体)。然后加入Rivaroxaban(Toronto Research Chemicals，Inc公司产品#2711 L28828775)和DPP-IV inhibitor(Linco，St.Charles，MO)均至终浓度为50μM以终止酶切反应。

VPAC2-CHO细胞(Invitrogen公司)接种至12孔板上培养，实验前2h，用0.5mL无血清Ham’s F-12培养基洗涤细胞两次。然后，细胞用含2％(mg/ml)牛血清白蛋白(BSA)和10mM葡萄糖的Ham’s F-12培养液4℃培养过夜，培养液中加入0.1nM[¹²⁵I]PACAP38和待测多肽(即为BAY55-9837或不同浓度组重组肽MHDBAY的双酶切反应液)，并逐步提高待测多肽浓度(10^-11M～10^-5M)。培养完毕后，弃掉上清液，用冰冷PBS(0.01M，pH值为7.4)洗细胞3次，细胞在室温下用0.5mL 0.5M NaOH和0.1％(mg/ml)SDS混合10min，然后用γ计数法测定细胞裂解物放射量，计算重组肽MHDBAY或BAY55-9837的半抑制量(IC50，half-maximal inhibitory concentration)，每组实验重复3次。

实验结果如图7，BAY55-9837对VPAC2受体的半抑制量IC50为68.3±8.1nM；重组肽MHDBAY释放多肽MBAY的对VPAC2受体的半抑制量IC50为49.8±7.5nM；结果表明，重组肽MHDBAY对VPAC2受体的竞争性结合活性高于VPAC2受体特异激动剂BAY55-9837。

实施例6

重组多肽MHDBAY对正常ICR小鼠口服葡萄糖耐量影响的检测

正常雄性ICR小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号SCXK[京]2002-0003)按体重均分为4组，正常对照组、BAY55-9837组(0.5mg/kg)、重组肽MHDBAY组(0.5mg/kg)。动物禁食过夜(12h)，取空腹血(0min)后，静脉注射给药，正常对照组静脉注射生理盐水，分别于给药后15min灌胃给予葡萄糖溶液(2g/kg)，并在给糖后30min、60min及120min时取血测定血糖值。

实验结果如图8所示：重组肽MHDBAY给药15min后，可显著降低正常小鼠葡萄糖负荷后30min、60min及120min血糖水平(p＜0.05)，曲线下面积显著降低；BAY55-9837也可降低正常小鼠葡萄糖负荷后30min血糖，但不能降低正常小鼠葡萄糖负荷后60min及120min血糖水平。实验结果表明，重组肽MHDBAY可明显降低葡萄糖依赖的血糖水平，效果明显优于BAY55-9837。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种与人血清白蛋白结合的七肽，其特征在于该七肽的氨基酸序列如下所示：WQRPSSW。

2.编码权利要求1所述与人血清白蛋白结合的七肽的核苷酸序列，其特征在于该七肽的编码核苷酸序列为：TGG CAG CGC CCG AGC AGC TGG。

3.权利要求1所述与人血清白蛋白结合的七肽的应用，其特征在于：所述与人血清白蛋白结合的七肽应用于与多肽构建融合蛋白；

所述的多肽为治疗糖尿病的药物多肽或抗肿瘤的多肽；

所述治疗糖尿病的药物多肽为PACAP；

所述抗肿瘤的多肽为TNF。