CN113185585B

CN113185585B - Tom70蛋白特异性结合多肽及其应用

Info

Publication number: CN113185585B
Application number: CN202110440505.XA
Authority: CN
Inventors: 崔胜�; 高小攀; 朱凯祥; 秦博
Original assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Current assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2041-04-23
Also published as: CN113185585A

Abstract

本发明公开了TOM70蛋白特异性结合多肽及其应用。本发明具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的特异性结合人源TOM70蛋白的orf9b多肽。本发明提供了人源TOM70(106‑608)蛋白以及SARS‑CoV‑2orf9b蛋白的克隆及表达的方法，以及orf9b蛋白与TOM70(106‑608)共结晶的方法，通过结构生物学方法发现了小分子多肽orf9b，本发明orf9b多肽可以特异性结合TOM70蛋白别构抑制Hsp90与TOM70的结合，为设计新型抗新冠病毒药物提供最为直接的药物筛选平台，为抗新冠病毒药物的研发提供新的方向。

Description

TOM70蛋白特异性结合多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及TOM70蛋白特异性结合多肽及其应用，具体涉及人源TOM70蛋白与SARS-CoV-2orf9b蛋白的表达、纯化、结晶方法以及小分子多肽的发现和应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2，COVID-19)是单链RNA病毒，基因组全序列显示其与SARS-CoV的基因组的相似性为79％，大部分蛋白都相似。它们都具有4个主要的结构蛋白(S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白)以及16个非结构蛋白(nsp1-16)，还有一些小的辅助蛋白，如orf3a、3b、6、7a、7b、8a、8b、9b。研究表明这些小的辅助蛋白在病毒入侵宿主细胞的过程中发挥着重要的作用。如orf6可以与宿主的Nup98和Rae1相互作用，从而劫持干扰素信号通路的传递。orf9b也被证明能与宿主的TOM70蛋白相互作用，抑制I型干扰素(IFN-I)的产生。TOM70是一个70kD大小的多功能接头蛋白，它是进入线粒体的前体蛋白外膜转运复合体TOM家族的一员，是一种线粒体外膜蛋白，它可以作为线粒体抗病毒信号蛋白MAVS的受体，参与响应抗病毒感染的先天免疫系统，能结合热休克蛋白(Hsp90)，启动抗病毒反应。而新型冠状病毒(SARS-CoV-2)进入人体后，其orf9b蛋白会与人体TOM70蛋白结合，形成人源TOM70与SARS-CoV2 orf9b复合物，从而抑制TOM70蛋白与Hsp90蛋白(TOM70-Hsp90)的相互作用，影响TOM70在干扰素途径中的功能和病毒感染后诱导细胞凋亡。

酿酒酵母TOM70的晶体结构表明TOM70包含11个TPR模体，并且TPR模体聚集成两个域，N端结构域中的三个TPR模体形成了与Hsp70/Hsp90的C末端EEVD肽结合口袋，C端结构域包含一个大的前体蛋白结合口袋。而人源TOM70的结构一直未能解析出来。因此，人源TOM70与SARS-CoV2 orf9b复合物结构的解析将为我们阐释新冠病毒入侵宿主后拮抗宿主先天免疫的机制，为抗病毒药物的设计提供结构基础。

新型冠状病毒(COVID-19)作为新突发传染病，尽管全世界的科学家争相开发抗病毒药物，但目前尚无有效的治疗方法。虽然目前好几款新冠疫苗已经上市，开始大规模的接种，但是对于抗病毒药物的研发一刻也不能停止，因此，挖掘新的靶向药物，阻断orf9b蛋白与TOM70蛋白的结合，能有效减弱或抑制新冠病毒对人体的感染作用，对抗病毒药物的研发具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种TOM70蛋白特异性结合多肽。

本发明首先提供了特异性结合TOM70蛋白的多肽，命名为orf9b多肽，所述orf9b多肽为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽；

A2)将SEQ ID No.1的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的多肽具有80％以上的同一性且特异性结合TOM70蛋白的多肽；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合多肽；

A4)在A1)或A2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的多肽衍生物。

所述orf9b多肽为特异性结合人源TOM70蛋白的多肽。

进一步地，所述人源TOM70蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

A3)所述标签如表1所示：

表1：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

A4)所述修饰可为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰。

上述A2)中的多肽，为与SEQ ID No.1所示多肽的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的多肽。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的多肽的编码核苷酸可通过将SEQ ID No.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还提供了核酸分子，命名为Norf9b，所述核酸分子为下述任一种：

B1)编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

B2)核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

B3)与B1)或B2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码orf9b多肽的DNA分子；

B4)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码orf9b多肽的DNA分子。

上述核酸分子中：

SEQ ID No.2所示的DNA分子编码SEQ ID No.1所示的orf9b多肽。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码orf9b多肽的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的orf9b多肽的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码orf9b多肽且具有特异性结合TOM70蛋白的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料为下述C1)至C3)中的任一种：

C1)含有Norf9b核酸分子的表达盒；

C2)含有Norf9b核酸分子的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；

C3)含有Norf9b核酸分子的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。

本发明还提供了一种用于治疗和/或预防冠状病毒感染的药物，所述药物与orf9b多肽特异性结合。

所述药物可含有一种或者是多种药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。

进一步地，所述冠状病毒为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。

本发明还提供了orf9b多肽或Norf9b核酸分子或所述生物材料在制备用于治疗或辅助治疗新冠病毒感染的药物中的应用。

本发明还提供了orf9b多肽或Norf9b核酸分子或所述生物材料在制备用于新冠病毒的靶向药物筛选的试剂中的应用。

本发明还提供了orf9b多肽或Norf9b核酸分子或所述生物材料在制备用于治疗或预防新冠病毒的靶向药物中的应用。

本发明还提供了orf9b多肽作为药物靶点在制备用于治疗或预防新冠病毒感染的药物中的应用。

本发明所述TOM70蛋白可为人源TOM70蛋白。

本发明提供了SARS-CoV-2orf9b与人源TOM70共结晶的制备过程，结构信息以及orf9b小分子多肽别构抑制Hsp90与TOM70的结合。

进一步地，本发明提供了人源TOM70(106-608)蛋白以及SARS-CoV-2orf9b蛋白的克隆及表达的方法，以及orf9b蛋白与TOM70(106-608)共结晶的方法，通过结构生物学方法发现了小分子多肽orf9b，并对发现的小分子多肽orf9b与TOM70(106-608)进行体外ITC实验，确定了它们的结合常数。

本发明提供了TOM70(106-608)-orf9b的表达和纯化方法，并对TOM70(106-608)-orf9b复合物进行共纯化和结晶的过程。本发明使用大肠杆菌的原核表达系统对orf9b蛋白和TOM70(106-608)蛋白以融合蛋白的形式进行了可溶性表达。所述方法通过将orf9b蛋白的编码基因(SEQ ID No.3)和TOM70(106-608)蛋白的编码基因(SEQ ID No.4的316位-1824位)克隆到pETDuet-1载体以表达带组氨酸标签的融合蛋白。

本发明提供了TOM70(106-608)与SARS-CoV-2orf9b复合物的晶体结构。

本发明还提供了SARS-CoV-2orf9b多肽和TOM70(106-608)复合物晶体结构的三维模型，该结构描述了orf9b多肽和TOM70(106-608)相互作用模式及相应的相互作用位点。

本发明还提供了orf9b多肽和TOM70(106-608)的体外结合数据。证明orf9b多肽对TOM70(106-608)具有很强的结合力，KD值为0.96μM。

本发明提供的orf9b多肽可以特异性结合TOM70蛋白别构抑制Hsp90与TOM70的结合，从而抑制SARS-CoV-2入侵宿主后的干扰素信号通路。这是一个以orf9b多肽为靶点进行抗病毒的新策略，将为设计新型抗新冠病毒药物提供最为直接的药物筛选平台，为后期药物的应用和开发提供强有力的支撑，为抗新冠病毒药物的研发提供新方向。

附图说明

图1为人源TOM70与SARS-CoV-2orf9b复合物蛋白的纯化结果。其中，图1中A为SARS-CoV-2orf9b和人源TOM70(hTOM70)蛋白的结构域图。TM为跨膜结构域，NTD为N末端结构域，CTD为C末端结构域。图1中B为在大肠杆菌中共表达时，没有融合组氨酸标签的hTOM70的三个截短体蛋白：hTOM70ΔN1(60-608)、hTOM70ΔN2(106-608)和hTOM70ΔN3(235-608)与带有N端His-tag的SARS-CoV-2orf9b共洗脱后的SDS-PAGE胶图。图1中C为hTOM70ΔN2(106-608)与orf9b经过分子筛superdex200纯化后的SDS-PAGE胶图。

图1中hTOM70ΔN1表示hTOM70ΔN1(60-608)；hTOM70ΔN2表示hTOM70ΔN2(106-608)hTOM70ΔN3表示hTOM70ΔN3(235-608)；orf9b表示带有N端His-tag的SARS-CoV-2orf9b。

图2为人源TOM70(human TOM70，hTOM70)与SARS-CoV-2orf9b复合物结构图。图2中A为hTOM70结构域的带状模型，其中SARS-CoV-2orf9b占据了CTD口袋。该结构指出了四肽重复(TPR)模体和二级结构元件。图2中B为hTOM70与SARS-CoV-2orf9b结合的表面电荷分布图，NTD呈现带正电荷的钳子结构，而CTD是疏水且带负电荷的口袋，SARS-CoV-2orf9b占据了CTD口袋。

图3为hTOM70(即实施例3步骤2-1中的TOM70(106-608)与C肽的ITC实验结果图。其中，左图显示hTOM70和C肽(来源于晶体结构中的SARS-CoV-2orf9b的可见部分)的ITC(等温滴定量热法)结果，确定了二者的相互作用，结果指示二者的相互作用是一个吸热过程，结合常数为0.96μM；右图为hTOM70与orf9b复合物蛋白与C肽的ITC滴定结果，显示没有结合。图3中hTOM70/SARS-CoV-2orf9b表示TOM70(106-608)-orf9b复合物。

图4为hTOM70(即实施例3步骤2-1中的TOM70(106-608)与N肽的ITC实验结果图。其中，左图显示hTOM70和N肽(来源于Hsp90蛋白)的ITC(等温滴定量热法)结果，确定了二者的相互作用，结果指示二者的相互作用是一个放热过程，结合常数为2.56μM；右图为hTOM70与orf9b复合物蛋白与N肽的ITC滴定结果，结合常数为72.99μM，表明orf9b与hTOM70的结合会影响hTOM70进一步结合N肽。图4中hTOM70/SARS-CoV-2orf9b表示TOM70(106-608)-orf9b复合物。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1重组蛋白的设计和制备

1、将orf9b(核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子)与TOM70(106-608)(核苷酸序列是SEQ ID No.4的316-1824位的DNA分子)分别构建到pETDuet-1载体(Novagen公司产品)的BamHI/HindIII，NdeI/XhoI酶切位点处，得到orf9b基因和TOM70(106-608)基因的重组表达载体，命名为pDuet-N-his-orf9b-TOM70(106-608)。pDuet-N-his-orf9b-TOM70(106-608)是将pETDuet-1载体上BamHI和HindIII识别位点之间的小片段替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的orf9b基因，并将pETDuet-1载体上NdeI和XhoI识别位点之间的小片段替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的316-1824位的TOM70(106-608)基因，并保持pETDuet-1载体上其它核苷酸序列不变得到的重组载体。pDuet-N-his-orf9b-TOM70(106-608)表达氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质orf9b和氨基酸序列是SEQ ID No.7的106-608位的蛋白质TOM70(106-608)。将pDuet-N-his-orf9b-TOM70(106-608)质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，次日挑取单克隆接种到10ml LB培养基(含100ug/mL氨苄青霉素)，37℃摇床250rpm振荡培养5个小时；

2、将10ml菌液全部接种至1L LB培养基中(含100ug/mL氨苄青霉素)大量培养，37℃，200rpm，培养大约3小时至OD₆₀₀＝0.8左右停止培养，将摇床温度降至18℃，加入终浓度0.5mmol/L的IPTG，18℃，180rpm过夜诱导；

3、第二日早上将菌液5000rpm离心10min，收集菌体，根据菌量加入适量的裂解液(50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、10mM imidazole、5mMβ-巯基乙醇、1mM PMSF)，将菌泥涡旋振荡均匀，也可置于烧杯中，在4℃用磁力搅拌器搅拌混匀；

4、冰上超声波破碎菌体(功率200W，超声3s，间隔5s，20min)至破碎完全，将裂解后菌体20000rpm离心30min，取上清经0.45微米滤膜过滤，弃沉淀。

5、Ni亲和层析纯化过程：①用25ml上述裂解液平衡柱子；②加入步骤2得到的滤液；③用25ml洗涤液(50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、20mM imidazole)洗涤柱子，以去除杂蛋白；④用25ml洗脱液(50mM Tris-HCl pH8.0、75mM NaCl、300mM imidazole)洗脱柱子，收集过柱后溶液。

6、将过柱后溶液经过离子交换层析进一步纯化，将蛋白上到Hitrap Q HP柱，用Buffer A(20mM Tris-HCl pH8.0、75mM NaCl)和Buffer B(20mM Tris-HCl pH8.0、1MNaCl)进行梯度洗脱。根据出峰位置取样进行SDS-PAGE后，取含有目标蛋白的区间样品用10kD超滤管进行浓缩。

7、浓缩到1mL后进一步使用分子筛superdex200进行纯化。分子筛Buffer的成份为：20mM Tris-HCl pH8.0，100mM NaCl。根据蛋白在280nm的紫外检测收集不同区段峰进行SDS-PAGE，确定目的样品。

8、根据SDS-PAGE结果，收集孔中蛋白样品置于截留分子量在10KD的超滤浓缩管进行蛋白超滤浓缩，4℃4000rpm离心浓缩至蛋白浓度大约10mg/ml，得到蛋白质TOM70(106-608)和蛋白质orf9b形成的复合物，即TOM70(106-608)-orf9b复合物(图1)。

实施例2晶体初筛、优化与结构解析

1、晶体初筛

晶体初筛使用Hampton公司的Crystal Screen；PEG/Ion；PEGRx；Index等，采用悬滴法进行点晶体，蛋白10mg/mL，蛋白与池液各1uL混合后置于20℃静置培养。点晶体后的第一周，需每天观察晶体生长状况并记录，第二周则隔天观察一次，直至观察点晶后一个月。TOM70(106-608)-orf9b复合物大约需要15天才能长出晶体。

2、优化条件：0.1M Bis-Tris pH＝6.5，19-25％PEG3350

3、晶体数据收集与结构解析

TOM70(106-608)-orf9b复合物晶体在上海光源线站收集。数据处理与整合使用XDS软件包。通过使用Phaser MR软件，用PDB 7KDT作为模型，进行分子置换来解析结构，产生初始电子密度图。使用Coot进行手动建模。最后通过PHENIX来优化整个结构(图2)。

实施例3多肽的合成与体外结合实验(ITC)

1、多肽的合成

根据解析的晶体结构，确定SARS-CoV-2orf9b多肽的长度和序列，对orf9b多肽进行体外化学合成。orf9b多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；orf9b多肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2、多肽的体外结合实验(ITC)

2-1蛋白或多肽的制备

通过对orf9b多肽分别与人源TOM70(106-608)、TOM70(106-608)-orf9b复合物进行体外结合实验(ITC)，确定小分子多肽的亲和力和特异性。人工合成氨基酸序列是SEQ IDNo.1的orf9b多肽和氨基酸序列是SEQ ID No.5的Hsp90多肽。按照实施例1的方法制备TOM70(106-608)-orf9b复合物。构建pET28a-TOM70(106-608)-c-his，其操作是将pET28a(+)载体上NcoI和XhoI识别位点之间的小片段替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的第316-1824位的TOM70(106-608)基因，并保持pET28a(+)载体上其它核苷酸序列不变得到的重组载体，转化BL21(DE3)感受态细胞，按照按照实施例1的方法制备蛋白质TOM70(106-608)。pET28a-TOM70(106-608)-c-his表达氨基酸序列是SEQ ID No.7的第106-608位的蛋白质即TOM70(106-608)。

2-2体外结合实验(ITC)

使用MicroCal iTC200热量计(MicroCal，美国)在25℃下进行等温滴定量热法(ITC)实验。N肽(源自人源Hsp90蛋白C端部分，即步骤2-1中的氨基酸序列是SEQ ID No.5的Hsp90多肽)和C肽(即步骤2-1中的氨基酸序列是SEQ ID No.1的orf9b多肽，包含SARS-CoV-2orf9b核心序列第44-70位氨基酸)是在北京中科亚光生物科技有限公司合成的。蛋白质和多肽都溶解在含有20mM Tris-HCl，pH＝8.0和100mM NaCl的缓冲液中。将多肽浓度稀释到1mM上到滴定针中，将蛋白质浓度稀释到0.016-0.02mM上到样品池中。使用400rpm的速度，连续18次进样，每次2μL多肽滴定到350μL样品池中，两次滴定之间间隔120秒。使用制造商提供的Microcal Origin软件选择单点绑定模型，进行非线性曲线拟合，得出结合曲线并计算结合常数。对于每个实验，ITC滴定至少重复两次。C肽与步骤2-1中的TOM70(106-608)的亲和力检测结果见图3。N肽与步骤2-1中的TOM70(106-608)的亲和力检测结果见图4。

在相同条件下，我们发现TOM70(106-608)与N肽之间的相互作用是放热和焓驱动的过程，ΔH＝-4，150cal/mole，ΔS＝11.7cal/mole/deg和KD＝2.56μM；TOM70(106-608)与C肽之间的相互作用是吸热和熵驱动的过程，ΔH＝2，651cal/mole，ΔS＝36.4cal/mole/deg，KD＝0.96μM。接下来，我们针对通过共表达制备的TOM70(106-608)-orf9b复合物滴定了合成的多肽。当C肽滴定至TOM70(106-608)-orf9b复合物时，我们观察到的焓变化可忽略不计，表明几乎没有结合，可能是由于合成的短的C肽无法与已经占据CTD口袋的全长orf9b蛋白竞争。接下来，我们滴定了N肽与共表达制备的实施例1的TOM70(106-608)-orf9b复合物，其结合常数为72.99μM，与N肽和TOM70(106-608)的结合亲和力(2.56μM)相比，N肽对TOM70(106-608)-orf9b复合物的结合亲和力降低了约29倍。

以上结果表明，本发明的orf9b多肽能够特异性的结合在hTOM70的CTD口袋处，具有极高的亲和力，KD值为0.96μM，并且它的结合会对Hsp90的EEVD基序在NTD口袋处的结合产生负面影响。即orf9b多肽别构抑制NTD口袋处的底物结合，从而可能破坏TANK结合激酶1(TBK1)和干扰素调节因子3(IRF3)对Hsp90的募集，并最终削弱干扰素激活的级联信号。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院病原生物学研究所

<120> TOM70蛋白特异性结合多肽及其应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

Ile Ile Leu Arg Leu Gly Ser Pro Leu Ser Leu Asn Met Ala Arg Lys

1 5 10 15

Thr Leu Asn Ser Leu Glu Asp Lys Ala Phe Gln

20 25

<210> 2

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

atcattctgc gtctgggtag cccgctgagc ctgaacatgg cgcgtaagac cctgaacagc 60

ctggaggaca aagcgttcca g 81

<210> 3

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

atggacccga agatcagcga gatgcacccg gcgctgcgtc tggttgatcc gcagattcaa 60

ctggcggtta cccgtatgga aaacgcggtg ggtcgtgacc agaacaacgt tggcccgaaa 120

gtgtacccga tcattctgcg tctgggtagc ccgctgagcc tgaacatggc gcgtaagacc 180

ctgaacagcc tggaggacaa agcgttccag ctgaccccga tcgcggttca aatgaccaag 240

ctggcgacca ccgaggaact gccggatgaa tttgtggttg tgaccgtgaa ataa 294

<210> 4

<211> 1824

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

atggcggcga gcaaaccggt tgaagcggcg gttgttgcgg cagcggttcc gtctagcggt 60

agcggtgttg gtggcggtgg caccgcgggt ccgggcaccg gtggcctgcc gcgttggcag 120

ctggcgctgg ctgtgggcgc cccgctgctg ctgggtgcgg gcgcgatcta cctgtggagc 180

cgtcagcagc gtcgtcgtga agcacgtggt cgtggcgacg cgtcgggtct gaaacgtaac 240

tctgaacgta aaaccccgga aggccgtgca tctccggcgc cgggtagcgg ccacccggaa 300

ggtccgggtg cacacctgga tatgaacagc ctggatcgcg cgcaggcggc gaaaaataaa 360

ggtaacaaat acttcaaagc gggtaaatac gaacaggcga tccagtgcta tactgaagca 420

atctccctgt gtccgaccga gaaaaacgtt gatctgagca ctttctacca gaaccgtgcc 480

gcggccttcg aacagctgca gaaatggaaa gaagtggctc aggattgtac taaagctgtt 540

gaactgaacc cgaaatacgt gaaagcactg ttccgtcgtg cgaaagcgca cgaaaaactg 600

gataacaaaa aagaatgcct ggaggacgtt accgctgttt gcatcctgga aggtttccag 660

aaccagcaga gcatgctgct ggcagacaaa gtcctgaaac tgctgggtaa agaaaaagct 720

aaagaaaaat ataaaaaccg cgaaccgctg atgccgtccc cgcagttcat taaatcctac 780

ttcagctcct tcaccgatga tatcatttct cagccgatgc tgaaaggtga aaaaagcgat 840

gaagataaag ataaagaagg tgaagctctg gaagttaaag aaaactccgg ttatctgaaa 900

gcaaaacagt atatggaaga agaaaactat gataaaatta ttagcgaatg ctctaaagaa 960

attgatgcag aaggtaaata catggcggaa gccctgctgc tgcgcgcgac cttttacctg 1020

ctgatcggca acgcgaacgc ggctaaaccg gatctggata aagttatcag cctgaaagaa 1080

gcaaacgtta aactgcgtgc taacgcgctg attaaacgtg gctccatgta tatgcagcag 1140

cagcagccgc tgctgtctac tcaggatttc aatatggctg ctgacattga tccgcagaac 1200

gctgatgttt accaccaccg cggccagctg aaaatcctgc tggatcaggt tgaagaagct 1260

gttgcagatt tcgatgaatg tatccgtctg cgtccggaat ctgcgctggc gcaggcgcag 1320

aaatgcttcg ctctgtaccg tcaggcatac accggcaaca acagcagcca gattcaggct 1380

gcgatgaaag gcttcgaaga agtgatcaaa aaatttccgc gttgtgcgga aggttacgca 1440

ctgtacgcgc aggcgctgac cgatcagcag cagttcggta aagccgatga aatgtatgat 1500

aaatgcatcg atctggaacc ggacaacgct actacctacg ttcataaagg cctgctgcag 1560

ctgcaatgga aacaggatct ggatcgtggt ctggaactga tttctaaagc tatcgaaatc 1620

gataacaaat gtgacttcgc ttacgaaacc atgggtacca tcgaagttca gcgtggcaac 1680

atggaaaaag ccatcgatat gttcaacaaa gcgatcaacc tggcgaaatc tgaaatggaa 1740

atggctcacc tgtacagcct gtgtgatgcg gctcacgctc agaccgaagt tgctaaaaaa 1800

tacggcctga aaccgccgac cctg 1824

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

Pro Leu Glu Gly Asp Asp Asp Thr Ser Arg Met Glu Glu Val Asp

1 5 10 15

<210> 6

<211> 97

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

Met Asp Pro Lys Ile Ser Glu Met His Pro Ala Leu Arg Leu Val Asp

1 5 10 15

Pro Gln Ile Gln Leu Ala Val Thr Arg Met Glu Asn Ala Val Gly Arg

20 25 30

Asp Gln Asn Asn Val Gly Pro Lys Val Tyr Pro Ile Ile Leu Arg Leu

35 40 45

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Asn Met Ala Arg Lys Thr Leu Asn Ser Leu

50 55 60

Glu Asp Lys Ala Phe Gln Leu Thr Pro Ile Ala Val Gln Met Thr Lys

65 70 75 80

Leu Ala Thr Thr Glu Glu Leu Pro Asp Glu Phe Val Val Val Thr Val

85 90 95

Lys

<210> 7

<211> 608

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

Met Ala Ala Ser Lys Pro Val Glu Ala Ala Val Val Ala Ala Ala Val

1 5 10 15

Pro Ser Ser Gly Ser Gly Val Gly Gly Gly Gly Thr Ala Gly Pro Gly

20 25 30

Thr Gly Gly Leu Pro Arg Trp Gln Leu Ala Leu Ala Val Gly Ala Pro

35 40 45

Leu Leu Leu Gly Ala Gly Ala Ile Tyr Leu Trp Ser Arg Gln Gln Arg

50 55 60

Arg Arg Glu Ala Arg Gly Arg Gly Asp Ala Ser Gly Leu Lys Arg Asn

65 70 75 80

Ser Glu Arg Lys Thr Pro Glu Gly Arg Ala Ser Pro Ala Pro Gly Ser

85 90 95

Gly His Pro Glu Gly Pro Gly Ala His Leu Asp Met Asn Ser Leu Asp

100 105 110

Arg Ala Gln Ala Ala Lys Asn Lys Gly Asn Lys Tyr Phe Lys Ala Gly

115 120 125

Lys Tyr Glu Gln Ala Ile Gln Cys Tyr Thr Glu Ala Ile Ser Leu Cys

130 135 140

Pro Thr Glu Lys Asn Val Asp Leu Ser Thr Phe Tyr Gln Asn Arg Ala

145 150 155 160

Ala Ala Phe Glu Gln Leu Gln Lys Trp Lys Glu Val Ala Gln Asp Cys

165 170 175

Thr Lys Ala Val Glu Leu Asn Pro Lys Tyr Val Lys Ala Leu Phe Arg

180 185 190

Arg Ala Lys Ala His Glu Lys Leu Asp Asn Lys Lys Glu Cys Leu Glu

195 200 205

Asp Val Thr Ala Val Cys Ile Leu Glu Gly Phe Gln Asn Gln Gln Ser

210 215 220

Met Leu Leu Ala Asp Lys Val Leu Lys Leu Leu Gly Lys Glu Lys Ala

225 230 235 240

Lys Glu Lys Tyr Lys Asn Arg Glu Pro Leu Met Pro Ser Pro Gln Phe

245 250 255

Ile Lys Ser Tyr Phe Ser Ser Phe Thr Asp Asp Ile Ile Ser Gln Pro

260 265 270

Met Leu Lys Gly Glu Lys Ser Asp Glu Asp Lys Asp Lys Glu Gly Glu

275 280 285

Ala Leu Glu Val Lys Glu Asn Ser Gly Tyr Leu Lys Ala Lys Gln Tyr

290 295 300

Met Glu Glu Glu Asn Tyr Asp Lys Ile Ile Ser Glu Cys Ser Lys Glu

305 310 315 320

Ile Asp Ala Glu Gly Lys Tyr Met Ala Glu Ala Leu Leu Leu Arg Ala

325 330 335

Thr Phe Tyr Leu Leu Ile Gly Asn Ala Asn Ala Ala Lys Pro Asp Leu

340 345 350

Asp Lys Val Ile Ser Leu Lys Glu Ala Asn Val Lys Leu Arg Ala Asn

355 360 365

Ala Leu Ile Lys Arg Gly Ser Met Tyr Met Gln Gln Gln Gln Pro Leu

370 375 380

Leu Ser Thr Gln Asp Phe Asn Met Ala Ala Asp Ile Asp Pro Gln Asn

385 390 395 400

Ala Asp Val Tyr His His Arg Gly Gln Leu Lys Ile Leu Leu Asp Gln

405 410 415

Val Glu Glu Ala Val Ala Asp Phe Asp Glu Cys Ile Arg Leu Arg Pro

420 425 430

Glu Ser Ala Leu Ala Gln Ala Gln Lys Cys Phe Ala Leu Tyr Arg Gln

435 440 445

Ala Tyr Thr Gly Asn Asn Ser Ser Gln Ile Gln Ala Ala Met Lys Gly

450 455 460

Phe Glu Glu Val Ile Lys Lys Phe Pro Arg Cys Ala Glu Gly Tyr Ala

465 470 475 480

Leu Tyr Ala Gln Ala Leu Thr Asp Gln Gln Gln Phe Gly Lys Ala Asp

485 490 495

Glu Met Tyr Asp Lys Cys Ile Asp Leu Glu Pro Asp Asn Ala Thr Thr

500 505 510

Tyr Val His Lys Gly Leu Leu Gln Leu Gln Trp Lys Gln Asp Leu Asp

515 520 525

Arg Gly Leu Glu Leu Ile Ser Lys Ala Ile Glu Ile Asp Asn Lys Cys

530 535 540

Asp Phe Ala Tyr Glu Thr Met Gly Thr Ile Glu Val Gln Arg Gly Asn

545 550 555 560

Met Glu Lys Ala Ile Asp Met Phe Asn Lys Ala Ile Asn Leu Ala Lys

565 570 575

Ser Glu Met Glu Met Ala His Leu Tyr Ser Leu Cys Asp Ala Ala His

580 585 590

Ala Gln Thr Glu Val Ala Lys Lys Tyr Gly Leu Lys Pro Pro Thr Leu

595 600 605

Claims

1.TOM70蛋白特异性结合多肽在制备别构抑制Hsp90与TOM70的结合的药物中的应用，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述多肽别构抑制Hsp90与TOM70的结合。

2.生物材料在制备别构抑制Hsp90与TOM70的结合的药物中的应用，所述生物材料为下述任一种：

C1）SEQ ID No.2所示的DNA分子；

C2）含有C1）所述DNA分子的表达盒；

C3）含有C1）所述DNA分子的重组载体、或含有C2）所述表达盒的重组载体。