CN114940707B - Rae1-Nup98特异性结合多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了Rae1‑Nup98特异性结合多肽及其应用。具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的特异性结合人源Rae1‑Nup98蛋白的ORF6‑C3Q56E多肽。本发明提供了人源Rae1‑Nup98蛋白克隆及表达的方法，以及ORF6多肽与Rae1‑Nup98共结晶的方法，通过结构生物学方法确定了ORF6多肽与Rae1‑Nup98相互作用的氨基酸位点，从而发现并设计了ORF6‑C3Q56E多肽，其与Rae1‑Nup98的亲和力提升了6倍，在新冠病毒感染后期机体的免疫过激或炎症反应过度的时候可以用于拮抗干扰素信号的传递，调节并减轻机体的症状。

Description

Rae1-Nup98特异性结合多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及Rae1-Nup98复合物蛋白特异性结合多肽及其应用，具体涉及人源Rae1-Nup98蛋白表达、纯化、结晶方法以及小分子多肽的发现和应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2)是单链RNA病毒，基因组全序列显示其与SARS-CoV的基因组的相似性为79％，大部分蛋白都相似。它们都具有4个主要的结构蛋白：刺突蛋白(Spike Protein，S蛋白)、包膜蛋白(Envelop Protein，E蛋白)、膜蛋白(Membrane Protein，M蛋白)、核衣壳蛋白(Nucleoprotein， N蛋白)，以及16个非结构蛋白(nsp1-16)，还有一些小的辅助蛋白，如ORF3a、3b、 6、7a、7b、8a、8b、9b。研究表明这些小的辅助蛋白在病毒入侵宿主细胞的过程中发挥着重要的作用。由于SARS-CoV-2为RNA病毒，容易在复制过程中出错，大量复制可引起多种变异，并且变异速度极快。遗传变异株表现出增强的传播性，导致更严重的疾病或降低当前诊断、疫苗和治疗的有效性。奥密克戎(英文名：Omicron，编号：B.1.1.529)是突变株，大量突变聚集在刺突蛋白(S蛋白)中。研究表明，变异株不仅在刺突蛋白的关键残基中含有突变，以逃避中和抗体，而且还通过上调先天免疫拮抗剂(如SARS-CoV-2ORF9b和ORF6)的亚基因组RNA和蛋白质水平来增强感染期间对宿主先天免疫的抑制。
ORF9b和ORF6是冠状病毒的辅助蛋白，在SARS-CoV-2和SARS-CoV中均存在。ORF9b通过靶向线粒体多功能接头蛋白TOM70来抑制干扰素的产生，而ORF6通过阻断细胞 mRNA和蛋白质的双向核质转运来抑制宿主抗病毒免疫反应。SARS-CoV-2ORF6比 SARS-CoV ORF6更有效地拮抗宿主抗病毒免疫，为SARS-CoV-2感染患者的无症状感染或延迟症状发作提供了可能的解释。Nup98(核孔蛋白98，Nucleoporin 98)是核孔复合体的一个组成部分，与RNA输出因子Rae1相互作用以结合单链RNA并促进mRNA 通过核孔复合体的易位。SARS-CoV的辅助蛋白ORF6已被证明通过与核输入因子的相互作用阻断STAT1的核输入来阻断干扰素途径的诱导。最近研究也显示SARS-CoV-2ORF6能够结合Rae1-Nup98(Li T.,Wen Y.,Guo H.,YangT.,Yang H.and Ji X.2021. Molecular Mechanism of SARS-CoVs Orf6 Targeting theRae1-Nup98 Complex to Compete With mRNA Nuclear Export.Front Mol Biosci.8:813248.；Addetia A., Lieberman N.A.P.,Phung Q.,Hsiang T.Y.,Xie H.,RoychoudhuryP.,et al.2021.SARS-CoV-2ORF6 Disrupts Bidirectional NucleocytoplasmicTransport through Interactions with Rae1 and Nup98.mBio.12(2)；Miorin L.,Kehrer T.,Sanchez-Aparicio M.T.,Zhang K.,Cohen P.,Patel R.S.,et al.2020.SARS-CoV-2 Orf6 hijacks Nup98 to block STAT nuclear import and antagonizeinterferon signaling.Proc Natl Acad Sci U S A.117(45):28344-28354.)，拮抗宿主的抗病毒天然免疫反应。然而，SARS-CoV-2ORF6和SARS-CoV ORF6与Rae1-Nup98发生相互作用的方式与机制一直不清楚。因此，进一步研究ORF6多肽和Rae1-Nup98相互作用机制，开发更为有效的新型冠状病毒的治疗药物，对于新型冠状病毒的临床治疗和诊断试剂的研发均具有重要的科学意义和广泛的应用前景。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种亲和力高的Rae1-Nup98蛋白特异性结合多肽。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为了实现上述目的，本发明首先提供了多肽，名称为ORF6-C3 Q56E，所述多肽可为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽；
A2)将SEQ ID No.1的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的多肽具有80％以上的同一性且特异性结合Rae1-Nup98蛋白的多肽；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合多肽；
A4)在A1)或A2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的多肽衍生物。
所述多肽ORF6-C3 Q56E为特异性结合Rae1-Nup98蛋白的多肽，相比ORF6野生型多肽，亲和力提升了6倍。
所述Rae1-Nup98蛋白为RNA输出因子Rae1和Nup98(核孔蛋白98，Nucleoporin 98)相互作用形成的核孔复合物蛋白，简称Rae1-Nup98蛋白。
进一步地，所述Rae1-Nup98蛋白可为人源Rae1-Nup98蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述Rae1-Nup98蛋白为Rae1(31-368)-Nup98(157 -217)复合物蛋白质(又称为Rae1+Nup98GLEBS，图1)。所述Rae1(31-368)-Nup98(157- 217)复合物蛋白质为氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质Rae1(31-368)和氨基酸序列是SEQ IDNo.4的蛋白质Nup98(157-213)相互作用形成的复合物蛋白。
为了使A1)中的多肽便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、 HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
A4)所述修饰可为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰。
上述A2)中的多肽，为与SEQ ID No.1所示多肽的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的多肽。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码多肽ORF6-C3 Q56E的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的多肽ORF6-C3 Q56E的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码多肽ORF6-C3 Q56E且具有多肽ORF6-C3 Q56E功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子可为下述任一种：
B1)编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
B2)核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
B3)与B1)或B2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述多肽ORF6-C3 Q56E的DNA分子；
B4)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述多肽ORF6-C3Q56E的DNA分子。
上述核酸分子中：
SEQ ID No.2所示的DNA分子编码SEQ ID No.1所示的多肽ORF6-C3 Q56E。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter 设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述C1)至C3)中的任一种：
C1)含有所述核酸分子的表达盒；
C2)含有所述核酸分子的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；
C3)含有所述核酸分子的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物；
C4)含有权利要求2所述核酸分子的细胞系、或含有C1)所述表达盒的细胞系、或含有C2)所述重组载体的细胞系。
上述生物材料中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为pFastBacDual载体。
所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。
所述细胞系(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)或原核细胞。在本发明的一个实施例中，所述细胞系具体可为大肠杆菌感受态细胞DH10Bac或SF21 细胞。
术语“细胞”和“细胞系”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。
在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体可为重组载体pFastBacDual-N-his-TEV-Nup98(157-213)-Rae1(31-368)。
重组载体pFastBacDual-N-his-TEV-Nup98(157-213)-Rae1(31-368)是将pFastBacDual载体上BamHI和HindIII识别位点之间的小片段替换为核苷酸序列是序列表中S EQID No.19的N-his-TEV-Nup98(157-213)基因，并将pFastBacDual载体上XhoI和 KpnI识别位点之间的小片段替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的Rae1(31-3 68)基因，并保持pFastBacDual载体上其它核苷酸序列不变得到的重组载体。pFastBacDual-N-his-TEV-Nup98(157-213)-Rae1(31-368)表达氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质Rae1(31-368)和N端带有his标签和TEV识别位点的融合蛋白质N-his-TEV-N up98(157-213)，所述融合蛋白质N-his-TEV-Nup98(157-213)的氨基酸序列为SEQ ID No.20。
本发明还提供了用于治疗冠状病毒感染后期机体免疫过激或细胞因子风暴的药物，所述药物含有所述多肽ORF6-C3 Q56E。
进一步地，所述药物还含有一种或多种药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。
进一步地，所述冠状病毒可为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
所述药物可用于改善、预防或治疗SARS-CoV-2感染引起的炎症反应过激。
所述SARS-CoV-2感染可为呼吸系统感染和/或消化系统感染。
所述呼吸系统感染可为呼吸道感染和/或肺部感染，所述呼吸道感染可为鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎，所述肺部感染可为肺炎，如为新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎)。所述消化系统感染可为腹泻。
本发明还提供了所述多肽ORF6-C3 Q56E或所述核酸分子或所述生物材料在制备用于治疗或辅助治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。
本发明还提供了所述多肽ORF6-C3 Q56E或所述核酸分子或所述生物材料在制备用于治疗新冠病毒感染后期机体的免疫过激或细胞因子风暴的药物中的应用。
本发明还提供了所述多肽ORF6-C3 Q56E或所述核酸分子或所述生物材料在制备用于检测Rae1-Nup98蛋白的产品中的应用。
本发明还提供了所述多肽ORF6-C3 Q56E或所述核酸分子或所述生物材料在制备用于结合或富集Rae1-Nup98蛋白的产品中的应用。
本发明还提供了所述多肽ORF6-C3 Q56E或所述核酸分子或所述生物材料在制备用于Rae1-Nup98蛋白的体内显像的产品中的应用。
上述应用中，所述产品可为试剂、试剂盒或芯片。
本文中，术语“ORF6多肽”、“ORF6小分子多肽”、“小分子多肽ORF6”、“ORF6 C 末端多肽”及“ORF6-C3肽”具有相同的含义，可互换使用。
本发明所述Rae1-Nup98蛋白可为鼠源Rae1-Nup98蛋白或人源Rae1-Nup98蛋白。
本发明提供了SARS-CoV-2ORF6多肽与人源Rae1-Nup98共结晶的制备过程，结构信息以及ORF6小分子多肽与Rae1-Nup98的体外亲和力。
进一步地，本发明提供了人源Rae1-Nup98蛋白克隆及表达的方法，以及ORF6多肽与Rae1-Nup98蛋白共结晶的方法，通过结构生物学方法确定了小分子多肽ORF6与 Rae1-Nup98的相互作用位点，对小分子多肽ORF6以及关键氨基酸突变位点多肽与 Rae1-Nup98进行体外ITC实验，确定了它们的亲和力。
本发明中使用了Rae1-Nup98的表达和纯化方法，并对Rae1-Nup98复合物与ORF6多肽进行共纯化和结晶的过程。本发明使用昆虫细胞杆状病毒重组表达系统对Rae1 和Nup98以融合蛋白的形式进行了可溶性表达。所述方法通过将Rae1蛋白的编码基因(SEQ IDNo.5)和Nup98蛋白的编码基因(SEQ ID No.6)克隆到pFastBacDual载体以表达带组氨酸标签的融合蛋白。
本发明提供了Rae1-Nup98和SARS-CoV-2ORF6多肽以及Rae1-Nup98和SARS-CoVORF6多肽复合物晶体结构的三维模型，该结构描述了ORF6多肽和Rae1-Nup98相互作用方式及相应的相互作用位点。
本发明还提供了细胞生物学实验证明ORF6与Rae1-Nup98的相互作用是ORF6破坏细胞核与细胞质间转运的所必须的。
本发明分别解析出了SARS-CoV-2ORF6 C端多肽与Rae1-Nup98核孔复合物的结构，并通过体外ITC实验确定了ORF6多肽以及一系列多肽相关氨基酸突变体与 Rae1-Nup98核孔复合物的亲和力，相关衍生肽为进行免疫抑制药物的开发提供了理论依据。
本发明还提供了ORF6-C3 Q56E多肽以及其他关键氨基酸位点突变多肽分别和Rae1-Nup98的体外结合数据。证明ORF6-C3 Q56E多肽对Rae1-Nup98具有很强的结合力，kd＝0.04uM。
本发明提供的ORF6-C3 Q56E多肽相比ORF6野生型多肽，与Rae1-Nup98蛋白结合的亲和力提高了6倍，具有全新的分子结构，作用机制明确，靶点明确，拮抗SARS-CoV-2 入侵宿主后的干扰素信号通路的能力也增强，因此可以作为感染新冠病毒后引起的机体免疫过激、炎症反应过度时的免疫调节药物，降低因免疫过激引起的细胞因子风暴带来的对身体的伤害，将为开发新型免疫抑制药物提供极大帮助，具有开发更为有效的新型冠状病毒的治疗药物的潜力，对于新型冠状病毒的临床治疗和诊断试剂的研发均具有重要的科学意义和广泛的应用前景。
附图说明
图1为Rae1-Nup98蛋白的纯化结果。其中图1中A为Rae1、Nup98和SARS-CoV-2 ORF6蛋白的结构域结构图。图1中B为Rae1-Nup98复合物经过分子筛superdex200 纯化的峰图。图1中C为SDS-PAGE分析来自图1中B所示尺寸排阻色谱的洗脱液。
图2为Rae1-Nup98复合物与SARS-CoV-2ORF6 C末端肽结合的复合物晶体结构。其中图2中A的左图为SARS-CoV-2ORF6-C3肽与Rae1-Nup98复合的带状模型。右图为肽-蛋白质相互作用的放大图。图2中B为Rae1和SARS-CoV-2ORF6-C3肽之间的详细相互作用。标记了参与相互作用的残基，分子间氢键用虚线表示。
图3为Rae1-Nup98与ORF6-C3肽以及相关氨基酸突变位点多肽的等温滴定量热图。其中图3中A为ORF6-C3肽与Rae1-Nup98的等温滴定量热图；图3中B为ORF6-C3 Q56E肽与Rae1-Nup98的等温滴定量热图；图3中C为ORF6-C3 D53A肽与Rae1-Nup98 的等温滴定量热图；图3中D为ORF6-C3 E54A肽与Rae1-Nup98的等温滴定量热图；图3中E为ORF6-C3 E55A肽与Rae1-Nup98的等温滴定量热图；图3中F为ORF6-C3 Q56A 肽与Rae1-Nup98的等温滴定量热图；图3中G为ORF6-C3 P57A肽与Rae1-Nup98的等温滴定量热图；图3中H为ORF6-C3 M58R肽与Rae1-Nup98的等温滴定量热图；图3 中I为ORF6-C3 M58L肽与Rae1-Nup98的等温滴定量热图；图3中J为ORF6-C3 M58A肽与Rae1-Nup98的等温滴定量热图；图3中K为ORF6-C3E59A肽与Rae1-Nup98的等温滴定量热图；图3中L为ORF6-C3 I60A肽与Rae1-Nup98的等温滴定量热图；图3 中M为ORF6-C3 D61A肽与Rae1-Nup98的等温滴定量热图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1重组蛋白的设计和制备
本实施例利用了昆虫杆状病毒表达系统，该系统是一种成熟的昆虫细胞基因转移技术。该系统由转移质粒(pFastBacDual)、辅助质粒、杆状病毒Bacmid质粒以及感受态细胞DH10Bac组成，是基于大肠杆菌转座酶Tn7的转座原理，将外源基因克隆到转移质粒中后转化大肠杆菌感受态细胞DH10Bac，然后在辅助质粒所表达的转座酶的作用下，外源基因被转座到Bacmid质粒中的attTn7位点，进而成功实现在大肠杆菌中快速将外源基因重组到杆状病毒Bacmid质粒中，并扩增重组杆状病毒的目的。进一步提取和纯化Bacmid重组质粒；将Bacmid重组质粒转染包装昆虫细胞，包装与纯化 Bacmid重组病毒；包装病毒感染靶细胞，从而实现外源基因在靶细胞中的转移与表达。其中，感受态细胞DH10Bac是稳定转化有辅助质粒和杆状病毒质粒Bacmid的大肠杆菌感受态细胞。具体步骤如下：
一、重组载体的构建：
将Rae1(31-368)基因(核苷酸序列是SEQ ID No.5的DNA分子，编码氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质Rae1(31-368))和Nup98(157-213)基因(核苷酸序列是S EQ ID No.6的DNA分子，编码氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质Nup98(157-213))分别构建到pFastBacDual载体(Invitrogen公司)的XhoI/KpnI，BamHI/HindIII酶切位点处，在PCR过程中在Nup98(157-213)基因的N端加上his标签基因以及TEV酶切位点(N-his-TEV-Nup98(157-213)基因，SEQ ID No.19)，得到Rae1(31-368)基因和Nup98(157-213)基因的重组表达载体，命名为pFastBacDual-N-his-TEV-Nup98(15 7-213)-Rae1(31-368)。pFastBacDual-N-his-TEV-Nup98(157-213)-Rae1(31-368)是将 pFastBacDual载体上BamHI和HindIII识别位点之间的小片段替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.19的N-his-TEV-Nup98(157-213)基因，并将pFastBacDual载体上 XhoI和KpnI识别位点之间的小片段替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的Ra e1(31-368)基因，并保持pFastBacDual载体上其它核苷酸序列不变得到的重组载体。pFastBacDual-N-his-TEV-Nup98(157-213)-Rae1(31-368)表达氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质Rae1(31-368)和N端带有his标签和TEV识别位点的融合蛋白质N-his-TEV-Nup98(157-213)，所述融合蛋白质N-his-TEV-Nup98(157-213)的氨基酸序列为S EQ ID No.20。
二、重组蛋白的表达和纯化：
1.将pFastBacDual-N-his-TEV-Nup98(157-213)-Rae1(31-368)质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞(Invitrogen公司产品)，用卡那霉素、庆大霉素、四环素三种抗性的板子加Blue gal(Amresco公司产品)进行蓝白斑筛选，48h后挑取白色单克隆菌斑至20mL含有卡那霉素、庆大霉素、四环素抗性的LB培养基中，过夜培养后进行杆状病毒质粒Bacmid的提取。将提取的杆状病毒质粒Bacmid取2ug转染至昆虫细胞SF21细胞，4天后收获上清即得到第一代重组杆状病毒(P1重组杆状病毒)，收集P1重组杆状病毒侵染SF21细胞，8天后收获上清即得到第二代重组杆状病毒(P2 重组杆状病毒)，收集P2重组杆状病毒侵染SF21细胞，12天后收获上清即得到第三代重组杆状病毒(P3重组杆状病毒)，收集P3重组杆状病毒加入大量培养的SF21细胞中进行蛋白的大量表达。4000rpm收集细胞，根据细胞量加入适量的裂解液(50mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl、10mM imidazole、1mM PMSF)，将细胞涡旋均匀。
2.冰上超声波破碎细胞(功率200W，超声3s，间隔5s，18min)至破碎完全，将裂解后细胞20000rpm离心30min，取上清经0.45微米滤膜过滤，得滤液，弃沉淀。
3.Ni亲和层析纯化过程：①用25ml上述裂解液平衡柱子；②加入步骤2得到的滤液。③用25ml洗涤液(50mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl、20mM imidazole)洗涤柱子，以去除杂蛋白；④用25ml洗脱液(50mM Tris-HCl pH 8.0、75mM NaCl、300 mM imidazole)洗脱柱子，收集过柱后溶液。在所得到的蛋白洗脱液中加入适量TEV蛋白酶，装入含有透析液(20mM Tris-HCl,pH 8.0；100mM NaCl)的透析袋中过夜透析酶切，以除去N端的his标签，得到透析酶切的蛋白溶液。
4.将过夜的透析酶切的蛋白溶液经过离子交换层析进一步纯化，将蛋白上到Hitrap Q HP柱，用Buffer A(20mM Tris-HCl pH 8.0、75mM NaCl)和Buffer B(20mM Tris-HCl pH 8.0、1M NaCl)进行梯度洗脱。根据出峰位置取样进行SDS-PAGE后，取含有目标蛋白的区间样品用10kD超滤管进行浓缩。
5.浓缩到1mL后进一步使用分子筛superdex200进行纯化。分子筛溶液的成份为：20mM Tris-HCl pH 8.0，100mM NaCl。根据蛋白在280nm的紫外检测收集不同区段峰进行SDS-PAGE，确定目的样品。
6.根据SDS-PAGE结果，收集孔中蛋白样品置于截留分子量在10KD的超滤浓缩管进行蛋白超滤浓缩，4℃4000rpm离心浓缩至蛋白浓度大约1mg/ml，得到 Rae1(31-368)-Nup98(157-217)复合物蛋白质(又称为Rae1+Nup98GLEBS，图1)。然后按摩尔比1：4加入过量序列SEQID No.7的ORF6 C末端多肽(命名为ORF6-C3肽)，过夜孵育。第二天浓缩Rae1(31-368)-Nup98(157-217)和ORF6-C3肽混合液至浓度5mg/mL (Rae1(31-368)-Nup98(157-217)和ORF6-C3肽的总质量浓度为5mg/mL)，最终得到名称为Rae1(31-368)-Nup98(157-217)-ORF6的复合物。
所述ORF6-C3肽的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，由北京中科亚光生物科技有限公司合成。
所述Rae1-Nup98蛋白为人源Rae1-Nup98蛋白。所述Rae1-Nup98蛋白为 Rae1(31-368)-Nup98(157-217)复合物蛋白质(又称为Rae1+Nup98GLEBS，图1)。
实施例2晶体初筛、优化与结构解析
1、晶体初筛
晶体初筛使用Hampton公司的Crystal Screen；PEG/Ion；PEGRx；Index等，采用悬滴法进行点晶体，实施例1中的Rae1(31-368)-Nup98(157-217)-ORF6蛋白5mg/mL，蛋白与池液各1uL混合后置于20℃静置培养。点晶体后的第一周，需每天观察晶体生长状况并记录，第二周则隔天观察一次，直至观察点晶后一个月。 Rae1(31-368)-Nup98(157-217)-ORF6大约3天能长出晶体。
2、优化池液条件：0.1M BIS-TRIS pH 6.5,45％v/v Polypropylene glycolP400。
3、晶体数据收集与结构解析
Rae1(31-368)-Nup98(157-217)-ORF6复合物晶体在上海光源线站收集。数据处理与整合使用XDS软件包。通过使用Phaser MR软件，用PDB 4OWR作为模型，进行分子置换来解析结构，产生初始电子密度图。使用Coot进行手动建模。最后通过PHENIX来优化整个结构(图2)。
实施例3多肽的合成与体外结合实验(ITC)
1、多肽的合成
根据解析的晶体结构，确定SARS-CoV-2ORF6 C末端多肽(命名为ORF6-C3肽)与Rae1-Nup98相互作用的关键位点，对ORF6 C3肽的关键位点进行氨基酸突变后进行体外化学合成。ORF6-C3肽的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；
在ORF6-C3肽的基础上进行氨基酸突变改造后的突变体多肽如下所示：
ORF6-C3 M58A多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；ORF6-C3 Q56E多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；ORF6-C3 D53A多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；ORF6-C3E54A多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；ORF6-C3 E55A多肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.11所示；ORF6-C3 Q56A多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示；ORF6-C3 P57A多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示；ORF6-C3 M58R多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示；ORF6-C3 M58L多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示；ORF6-C3 E59A多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示；ORF6-C3 I60A多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示； ORF6-C3 D61A多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。上述ORF6-C3肽及其突变体多肽由北京中科亚光生物科技有限公司合成。
2、多肽的体外结合实验(ITC)
通过对ORF6-C3肽(SEQ ID No.7)以及突变体多肽(SEQ ID No.1、SEQ ID No.8-18) 分别与Rae1-Nup98进行体外结合实验(ITC)，确定小分子多肽的亲和力和特异性。
使用MicroCal iTC200热量计(MicroCal，美国)在25℃下进行等温滴定量热法(ITC)实验。蛋白质(Rae1-Nup98)和多肽都分别溶解在含有20mM Tris-HCl， pH＝8.0和100mM NaCl的缓冲液中，得到Rae1-Nup98溶液和多肽溶液。将多肽溶液浓度稀释到1mM上到滴定针中，将蛋白质Rae1-Nup98溶液浓度稀释到0.03mM上到样品池中。使用400rpm的速度，连续18次，每次2μL多肽溶液滴定到350μL 样品池中，两次滴定之间间隔120秒。使用制造商提供的Microcal Origin软件选择单点绑定模型，进行非线性曲线拟合，得出结合曲线并计算结合常数。对于每个实验， ITC滴定至少重复两次。
所述蛋白质Rae1-Nup98为实施例1中制备的Rae1(31-368)-Nup98(157-217)复合物蛋白质。
ITC结果显示ORF6 C末端多肽(ORF6-C3肽，SEQ ID No.7)与Rae1-Nup98之间的结合常数为240nM。除此之外，本发明系统地对ORF6 C末端多肽进行氨基酸突变，对第58位甲硫氨酸(M58)侧翼的酸性残基D53A、E54A、E55A、E59A和D61A的突变适度降低了对Rae1-Nup98的结合亲和力2.4-11.5倍。而M58A突变完全丧失了ORF6 C末端多肽与Rae1-Nup98的结合亲和力，说明M58是非常重要的氨基酸位点。而Q56E 突变使ORF6 C末端多肽与Rae1-Nup98的亲和力提升了约6倍，其亲和常数为kd＝0.04 uM，这样高的亲和力，使ORF6-C3Q56E多肽(SEQ ID No.1)非常有希望成为一个多肽药物。
ORF6-C3 Q56E多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
ORF6-C3 Q56E多肽的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
ORF6-C3 Q56E多肽是在ORF6-C3肽(SEQ ID No.7)的基础上突变得到，即将SEQ IDNo.7的第8位Gln突变为Glu，得到ORF6-C3 Q56E多肽。
综上所述，本发明为冠状病毒ORF6蛋白劫持细胞核质转运机制提供了结构基础。本发明揭示了SARS-CoV-2ORF6 C末端多肽与Rae1-Nup98复合物结合的原子细节，并确定了决定ORF6与Rae1-Nup98结合亲和力的关键残基。重要的是本发明中的ORF6-C3 Q56E多肽对Rae1-Nup98表现出纳摩尔级的结合亲和力，这将为开发新型免疫抑制药物的提供极大帮助。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院病原生物学研究所
<120> Rae1-Nup98 特异性结合多肽及其应用
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Tyr Ser Gln Leu Asp Glu Glu Glu Pro Met Glu Ile Asp
1 5 10
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
tacagtcaac tagacgaaga agaaccaatg gaaattgat 39
<210> 3
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
Asp Ile Glu Val Thr Ser Ser Pro Asp Asp Ser Ile Gly Cys Leu Ser
1 5 10 15
Phe Ser Pro Pro Thr Leu Pro Gly Asn Phe Leu Ile Ala Gly Ser Trp
20 25 30
Ala Asn Asp Val Arg Cys Trp Glu Val Gln Asp Ser Gly Gln Thr Ile
35 40 45
Pro Lys Ala Gln Gln Met His Thr Gly Pro Val Leu Asp Val Cys Trp
50 55 60
Ser Asp Asp Gly Ser Lys Val Phe Thr Ala Ser Cys Asp Lys Thr Ala
65 70 75 80
Lys Met Trp Asp Leu Ser Ser Asn Gln Ala Ile Gln Ile Ala Gln His
85 90 95
Asp Ala Pro Val Lys Thr Ile His Trp Ile Lys Ala Pro Asn Tyr Ser
100 105 110
Cys Val Met Thr Gly Ser Trp Asp Lys Thr Leu Lys Phe Trp Asp Thr
115 120 125
Arg Ser Ser Asn Pro Met Met Val Leu Gln Leu Pro Glu Arg Cys Tyr
130 135 140
Cys Ala Asp Val Ile Tyr Pro Met Ala Val Val Ala Thr Ala Glu Arg
145 150 155 160
Gly Leu Ile Val Tyr Gln Leu Glu Asn Gln Pro Ser Glu Phe Arg Arg
165 170 175
Ile Glu Ser Pro Leu Lys His Gln His Arg Cys Val Ala Ile Phe Lys
180 185 190
Asp Lys Gln Asn Lys Pro Thr Gly Phe Ala Leu Gly Ser Ile Glu Gly
195 200 205
Arg Val Ala Ile His Tyr Ile Asn Pro Pro Asn Pro Ala Lys Asp Asn
210 215 220
Phe Thr Phe Lys Cys His Arg Ser Asn Gly Thr Asn Thr Ser Ala Pro
225 230 235 240
Gln Asp Ile Tyr Ala Val Asn Gly Ile Ala Phe His Pro Val His Gly
245 250 255
Thr Leu Ala Thr Val Gly Ser Asp Gly Arg Phe Ser Phe Trp Asp Lys
260 265 270
Asp Ala Arg Thr Lys Leu Lys Thr Ser Glu Gln Leu Asp Gln Pro Ile
275 280 285
Ser Ala Cys Cys Phe Asn His Asn Gly Asn Ile Phe Ala Tyr Ala Ser
290 295 300
Ser Tyr Asp Trp Ser Lys Gly His Glu Phe Tyr Asn Pro Gln Lys Lys
305 310 315 320
Asn Tyr Ile Phe Leu Arg Asn Ala Ala Glu Glu Leu Lys Pro Arg Asn
325 330 335
Lys Lys
<210> 4
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
Pro Thr Gly Thr Thr Ile Lys Phe Asn Pro Pro Thr Gly Thr Asp Thr
1 5 10 15
Met Val Lys Ala Gly Val Ser Thr Asn Ile Ser Thr Lys His Gln Cys
20 25 30
Ile Thr Ala Met Lys Glu Tyr Glu Ser Lys Ser Leu Glu Glu Leu Arg
35 40 45
Leu Glu Asp Tyr Gln Ala Asn Arg Lys
50 55
<210> 5
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
gacatcgagg tcactagcag tccggatgac tctatcggct gcctttcgtt ctccccgccc 60
acgctgccgg gaaacttcct aatcgctggt tcttgggcca acgacgtgag atgttgggag 120
gttcaggata gtggccagac gatcccgaag gcccagcaaa tgcataccgg gcctgtttta 180
gatgtgtgct ggagcgatga cgggtcaaaa gtctttactg cgagctgtga taagacggcg 240
aagatgtggg acttgtcgag taatcaggct atacagatcg ctcaacatga tgcgcccgtc 300
aagacaatac attggataaa ggcgcccaac tactcgtgtg taatgactgg ttcctgggac 360
aaaacgctca aattctggga tacccgttca tctaacccca tgatggttct tcaacttcca 420
gaacgatgct attgtgcaga cgtcatatac ccgatggccg tagtcgctac agctgagcga 480
gggctcatcg tataccagct ggaaaatcaa ccatcagaat ttaggcgtat agaatcccct 540
ttgaagcacc aacaccgctg tgtggccatt tttaaagaca agcaaaataa gcccactggt 600
tttgccctcg gttctattga gggcagagtg gccatacatt atattaatcc tccaaaccct 660
gcaaaagaca attttacctt caaatgccat cggtctaatg gcacaaatac aagtgcgcca 720
caagatatat acgcggtaaa cgggattgct ttccacccag tacacggaac gctggctaca 780
gttggttcgg atggccgctt ttcattttgg gacaaagacg caagaacaaa gttgaagacc 840
agcgaacaat tagatcagcc aattagcgcc tgctgtttca accacaacgg gaacattttt 900
gcatatgcaa gttcctatga ttggtcaaag ggacatgagt tctacaatcc ccagaaaaaa 960
aattatattt tcttacggaa tgcagcagag gaattaaaac cgaggaacaa aaaa 1014
<210> 6
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
ccaaccggca cgactattaa gtttaacccc ccgacgggta ctgacacaat ggtgaaagcg 60
ggggtatcaa cgaacataag tacaaagcac caatgcatca ccgccatgaa agaatacgag 120
agcaagtccc tagaagaatt acgtctggaa gattatcagg caaatcgaaa a 171
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
Tyr Ser Gln Leu Asp Glu Glu Gln Pro Met Glu Ile Asp
1 5 10
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
Tyr Ser Gln Leu Asp Glu Glu Gln Pro Ala Glu Ile Asp
1 5 10
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
Tyr Ser Gln Leu Ala Glu Glu Gln Pro Met Glu Ile Asp
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
Tyr Ser Gln Leu Asp Ala Glu Gln Pro Met Glu Ile Asp
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
Tyr Ser Gln Leu Asp Glu Ala Gln Pro Met Glu Ile Asp
1 5 10
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
Tyr Ser Gln Leu Asp Glu Glu Ala Pro Met Glu Ile Asp
1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
Tyr Ser Gln Leu Asp Glu Glu Gln Ala Met Glu Ile Asp
1 5 10
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
Tyr Ser Gln Leu Asp Glu Glu Gln Pro Arg Glu Ile Asp
1 5 10
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
Tyr Ser Gln Leu Asp Glu Glu Gln Pro Leu Glu Ile Asp
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
Tyr Ser Gln Leu Asp Glu Glu Gln Pro Met Ala Ile Asp
1 5 10
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
Tyr Ser Gln Leu Asp Glu Glu Gln Pro Met Glu Ala Asp
1 5 10
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
Tyr Ser Gln Leu Asp Glu Glu Gln Pro Met Glu Ile Ala
1 5 10
<210> 19
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 19
atgtcgtact accatcacca tcaccatcac gattacgata tcccaacgac cgaaaacctg 60
tattttcagg gcggatcccc aaccggcacg actattaagt ttaacccccc gacgggtact 120
gacacaatgg tgaaagcggg ggtatcaacg aacataagta caaagcacca atgcatcacc 180
gccatgaaag aatacgagag caagtcccta gaagaattac gtctggaaga ttatcaggca 240
aatcgaaaa 249
<210> 20
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1 5 10 15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Thr Gly Thr Thr Ile
20 25 30
Lys Phe Asn Pro Pro Thr Gly Thr Asp Thr Met Val Lys Ala Gly Val
35 40 45
Ser Thr Asn Ile Ser Thr Lys His Gln Cys Ile Thr Ala Met Lys Glu
50 55 60
Tyr Glu Ser Lys Ser Leu Glu Glu Leu Arg Leu Glu Asp Tyr Gln Ala
65 70 75 80
Asn Arg Lys

Claims (9)

1.多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
2.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：
B1)编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
B2)核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子。
3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述C1)至C4)中的任一种：
C1)含有权利要求2所述核酸分子的表达盒；
C2)含有权利要求2所述核酸分子的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；
C3)含有权利要求2所述核酸分子的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物；
C4)含有权利要求2所述核酸分子的细胞系、或含有C1)所述表达盒的细胞系、或含有C2)所述重组载体的细胞系。
4.用于治疗新型冠状病毒感染后期机体的免疫过激或细胞因子风暴的药物，其特征在于，所述药物含有权利要求1所述的多肽。
5.权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的生物材料在制备用于治疗新型冠状病毒感染后期机体的免疫过激或细胞因子风暴的药物中的应用。
6.权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的生物材料在制备用于检测Rae1-Nup98蛋白的产品中的应用。
7.权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的生物材料在制备用于结合或富集Rae1-Nup98蛋白的产品中的应用。
8.权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的生物材料在制备用于Rae1-Nup98蛋白的体内显像的产品中的应用。
9.根据权利要求6-8中任一所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂、试剂盒或芯片。
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