CN113321714B - SARS-CoV-2的重组N蛋白及其制备与纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体而言，涉及一种SARS‑CoV‑2的重组N蛋白及其制备与纯化方法。该SARS‑CoV‑2的重组N蛋白具有N蛋白序列，且所述N蛋白序列的两端分别与寡聚精氨酸片段相连；其表达方法包括：a.提供包含重组N蛋白的样品；以及b.经至少一次阳离子交换层析树脂纯化处理，收集穿透物。该方法可以有效提高重组N蛋白的表达纯度。根据本发明纯化得到的重组N蛋白的纯度最高可以达到约95%以上。

Description

SARS-CoV-2的重组N蛋白及其制备与纯化方法
技术领域
本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体而言，涉及一种SARS-CoV-2的重组N蛋白及其制备与纯化方法。
背景技术
严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（Severe Acute Respiratory SyndromeCoronavirus 2，SARS-CoV-2）是冠状病毒科乙型冠状病毒属严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒种的一个分型，具有包膜的正链单股RNA，它造成了于2019年底爆发的2019冠状病毒病（COVID-19）。它的基因序列和非典病毒及中东呼吸综合征病毒属于同一谱系但不同进化枝。中华人民共和国国家卫生健康委员会将此病毒感染引起的急性呼吸道疾病定为法定乙类传染病，按甲类管理。
N蛋白是冠状病毒的一种主要结构蛋白，其是一种碱性蛋白，以往对动物冠状病毒结构蛋白的研究表明，N蛋白在病毒复制和产生的病理反应中起重要作用。N蛋白的苏素化在同源性低聚物的形成中起着很大的促进作用，并且N蛋白对宿主细胞裂解的调节方面也起重要作用。
现有技术中对COVID-19的确诊主要是采用核酸检测试剂盒进行。核酸检测法通过反转录酶将RNA反转录为DNA，再在DNA聚合酶的作用下PCR扩增使信号增强，从而显示出病毒核酸的存在。但是，新冠病毒属于RNA病毒，在样本采集、保存及运输过程中，RNA分子极易降解，造成核酸检测的假阴性结果。核酸检测一个反应耗时大约2小时，需要荧光定量PCR仪，耗时长且设备要求高。
在病毒感染的过程中，人体会应激产生相对应的抗体来抵抗感染，因此通过检测抗体是否存在来判断是否感染病毒的免疫诊断法，可以作为核酸检测法的一个很好补充。人体产生的抗体在血液中能稳定存在，特异性高，检测速度快。N蛋白作为冠状病毒主要结构蛋白，会刺激机体产生大量特异性抗体，但现有技术中还未有针对SARS-CoV-2的N蛋白的特异性、高收率的纯化方法，因而如果将现有技术制备的重组N蛋白用于COVID-19相关抗体的检测往往准确度不高，会对检测结果造成干扰。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明涉及SARS-CoV-2的重组N蛋白，其具有SEQ ID NO：1所示的N蛋白序列，且所述N蛋白序列的两端分别与寡聚精氨酸片段相连。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及一种SARS-CoV-2的N蛋白的纯化方法，包括：
a. 提供包含如上所述的重组N蛋白的样品；以及
b. 经至少一次阳离子交换层析树脂纯化处理，收集穿透物。
SEQ ID NO：1所示的N蛋白序列为SARS-CoV-2保守序列，有利于提高检出率以及检测灵敏度和特异性。其两端与寡聚精氨酸片段相连具有多方面的作用，一方面寡聚精氨酸片段不具有免疫原性，从而可有效降低背景噪音，避免出现假阳性的问题；另一方面，N蛋白本身的理论等电点达到10.51，在两端添加寡聚精氨酸片段，使理论等电点更偏向于碱性（10.93），在应用阳离子交换层析纯化过程中，使目的蛋白更有效的结合在阳离子交换柱上。同时在蛋白制备时，例如在菌体匀浆时通常添加少量RNase，可以有效快速降解结合在目的蛋白上的RNA分子，又因为高等电点，在盐浓度线性洗脱过程中，NP蛋白与其他大部分杂蛋白可有效分离开。以上诸多因素可以有效提高重组N蛋白的表达纯度。根据本发明纯化得到的重组N蛋白的纯度最高可以达到约95%以上。
本发明还提供该重组N蛋白涉及的核酸、载体、宿主细胞及制备方法。
本发明还提供组合物，其由如上所述的方法纯化得到。
本发明还涉及用于检测抗SARS-CoV-2的N蛋白抗体的试剂或试剂盒，其含有如上所述的重组N蛋白或如上所述的组合物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中不同上样量的纯化后N蛋白（从2μg~10μg）电泳图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及SARS-CoV-2的重组N蛋白，其具有SEQ ID NO：1所示的N蛋白序列，且所述N蛋白序列的两端分别与寡聚精氨酸片段相连。
在一些实施方式中，所述N蛋白序列的两端的寡聚精氨酸片段中精氨酸的个数独立地选自为4~6个，优选为5个。
在一些实施方式中，所述N蛋白序列通过连接肽与所述寡聚精氨酸片段相连。
在一些实施方式中，所述连接肽为柔性连接肽。
在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自Gly、Ser、Pro、Ala以及Glu中的一种或多种；优选Gly和Ser。
在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸数目为1~30个；可以是1，2，3，4，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个，优选3~5个，更优选4个。
在一些实施方式中，所述连接肽的序列为GSGS。
本发明还提供核酸，其能够表达如上所述的重组N蛋白。
在一些实施方式中，所述核酸的序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供载体，其含有如上所述的核酸。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点（IRES）和其他表达控制元件（例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等）。在一个具体的实施方式中，所述载体为pET-28a(+)。
本发明还提供宿主细胞，其基因组中掺有如上所述的核酸。
术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞优选为原核细胞，更优选为大肠杆菌。
本发明还涉及SARS-CoV-2的N蛋白的制备方法，包括：
在适宜的条件下培养如上所述的宿主细胞，收集培养液和/或所述宿主细胞的裂解液。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及一种SARS-CoV-2的N蛋白的纯化方法，包括：
a. 提供包含如上所述的重组N蛋白的样品；以及
b. 经至少一次阳离子交换层析树脂纯化处理，收集穿透物。
在本发明中，术语“处理”可以描述样品流过或通过层析柱、树脂、膜、过滤器，或其它机构的过程，并且应包括经每一机构的连续流动以及在每一机构间暂停或停止的流动。
在本发明的一个实施方式中，提供包含重组N蛋白的样品。任何包含重组N蛋白的样品均可以用在本发明中。包含重组N蛋白的样品可以包含例如细胞培养物（特别是细胞培养物上清）。作为实例，可以在大肠杆菌中表达重组N蛋白。
本领域技术人员可获得的任何满足SARS-CoV-2的重组N蛋白纯化条件的阳离子交换层析系统均可用在本实施方式中，例如，阳离子交换层析所用基质可以含有磺酸基、季胺基，也可以含有咪唑、吡啶、喹啉、哌啶等基团，优选的基团为磺丙基（SP）；优选的阳离子交换层析树脂为SP Sepharose FF；阳离子交换层析树脂的孔径（A）可选用500~100；粒径（μm）可选自15、30、60、80等。
阳离子交换层析分离中流动相的盐可以采用磷酸氢盐（特别是Na2HPO4）和NaCl等。
在一些实施方式中，先用约30mM~70 mM Na2HPO4，pH 7.1~7.7缓冲液平衡阳离子交换柱并洗去未结合的蛋白；
在一些实施方式中，先用约30mM~70 mM Na2HPO4，0mM~600mM的NaCl，pH 7.1~7.7线性梯度洗脱目的蛋白。
在一些实施方式中，所述疏水层析分离所用的平衡与上样缓冲液中NaCl的浓度为500 mM ~ 2000mM；例如500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、1000mM、1100mM、1200mM、1300mM、1400mM、1500mM、1600mM、1700mM、1800mM、1900mM、2000mM，或任两个数值所组成的范围值。
疏水层析分离中流动相的缓冲液常用的有PB/PBS、Tris-HCl、HEPES、醋酸缓冲液等。在一些实施方式中，所述疏水层析分离所用的平衡与上样缓冲液中PB/PBS的浓度≥20mM，例如30mM，40mM，50mM，且缓冲液pH=7.0~9.0。
PB：Phosphate Buffer，磷酸缓冲液 ；PBS：Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液。
在一些实施方式中，步骤b）中所述穿透物为纯度达90%的目的蛋白部分，且步骤b）还包括将所述穿透物经至少一次透析处理。
在一些实施方式中，在步骤b）之后，所述方法还包括，将所得产物再经至少一次阴离子交换层析树脂纯化处理，收集穿透物。
在一些实施方式中，本发明包含一步或多步澄清（或称收集沉淀/上清）步骤，澄清的方法可以通过一步或多步离心、微滤、超滤或深层过滤等方法进行；澄清可以在例如上述任一步操作结束后进行，例如在收集穿透物之前和之后进行。
本发明还提供组合物，其由如上所述的方法纯化得到。
所述组合物中重组N蛋白的纯度约为80%~97%，优选不低于95%。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及用于检测抗SARS-CoV-2的N蛋白抗体的试剂或试剂盒，其含有如上所述的重组N蛋白或如上所述的组合物。
抗SARS-CoV-2的N蛋白抗体优选来源于人，也可以是包含SARS-CoV-2的其它潜在宿主，例如蝙蝠、穿山甲、果子狸，或其它哺乳动物；
抗体的类型可以选自IgM、IgE、IgA、IgD、IgG。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例
本实施例提供了SARS-CoV-2的重组N蛋白的制备与纯化方法。
选择核衣壳蛋白（N蛋白），氨基酸序列为：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTAAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA（SEQ ID NO：1）；
以及寡聚精氨酸序列为RRRRR，连接肽的氨基酸序列为GSGS。寡聚精氨酸、N蛋白、寡聚精氨酸均通过连接肽连接，融合成N蛋白重组蛋白，其DNA序列为
ATGCGTCGCAGACGTCGAGGATCTGGCTCGATGAGTGATAACGGCCCGCAGAATCAGCGCAATGCCCCGCGCATTACCTTTGGTGGCCCGAGTGATAGTACCGGTAGTAATCAGAATGGTGAACGCAGCGGCGCCCGCAGTAAACAGCGTCGTCCGCAGGGTCTGCCGAATAATACCGCAAGCTGGTTTACCGCCCTGACCCAGCATGGCAAAGAAGATCTGAAATTTCCGCGCGGTCAGGGTGTTCCGATTAATACCAATAGCAGTCCGGATGATCAGATTGGTTATTATCGTCGTGCCACCCGTCGTATTCGCGGCGGCGATGGTAAAATGAAAGATCTGAGTCCGCGTTGGTATTTTTATTATCTGGGCACCGGTCCGGAAGCAGGCCTGCCTTATGGTGCCAATAAGGATGGCATTATTTGGGTGGCAACCGAAGGCGCCCTGAATACCCCGAAAGATCATATTGGTACCCGTAATCCGGCCAATAATGCAGCAATTGTGCTGCAGCTGCCGCAGGGCACCACCCTGCCTAAAGGCTTTTATGCAGAAGGTAGTCGCGGTGGCAGCCAGGCAAGCAGCCGTAGTAGTAGCCGCAGTCGTAATAGCAGTCGCAATAGCACCCCGGGTAGCAGTCGTGGTACCAGCCCGGCACGCATGGCAGGCAATGGTGGTGACGCCGCACTGGCACTGCTGCTGCTGGATCGTCTGAATCAGCTGGAAAGCAAAATGAGTGGCAAAGGTCAGCAGCAGCAGGGCCAGACCGTGACCAAAAAATCTGCCGCAGAAGCCAGCAAAAAACCGCGTCAGAAACGTACCGCCACCAAAGCCTATAATGTGACCCAGGCATTTGGCCGTCGCGGCCCGGAACAGACCCAGGGTAATTTTGGTGACCAGGAACTGATTCGCCAGGGCACCGATTATAAACATTGGCCGCAGATTGCACAGTTTGCACCGAGTGCCAGTGCCTTTTTCGGCATGAGCCGCATTGGCATGGAAGTTACCCCGAGTGGTACCTGGCTGACCTATACCGGTGCCATTAAGCTGGATGATAAAGATCCGAATTTTAAAGATCAGGTTATTCTGCTGAACAAACATATTGATGCCTATAAAACCTTCCCGCCGACCGAACCGAAAAAAGATAAAAAGAAAAAGGCAGATGAGACCCAGGCACTGCCGCAGCGCCAGAAAAAACAGCAGACCGTGACACTGCTGCCGGCAGCAGATCTGGATGATTTTAGTAAACAGCTGCAGCAGAGCATGAGTAGCGCCGATAGTACCCAGGCCGGATCTGGCTCGCGTCGCAGACGTCGATAA（SEQ ID NO：2）。
N蛋白重组蛋白的DNA通过基因合成（通用生物系统(安徽)有限公司）获得。该N蛋白重组蛋白的DNA上游带有Nco I位点，下游带有Hind III位点。该DNA经过相应的限制性内切酶酶切，连接到用Nco I和Hind III酶切后的表达载体pET-28a(+)，得到重组质粒pET-28a(+)-N。
将该重组质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，挑取单克隆菌落接种至100 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200 rpm培养过夜。次日吸取1%体积的过夜培养物至1 L新鲜的含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200 rpm培养至OD600=0.6左右，用终浓度为1 mM的IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）于18℃诱导表达20 h。4℃、12000 g离心3 min收集菌体，每升菌液的菌体用冰上预冷的40 mL 50 mM Na2HPO4，pH 7.4缓冲液（缓冲液A）悬浮，添加少量RNase，高压均质机破碎，4℃、12000 g离心30 min，上清液使用0.22 μm滤膜过滤，过阳离子交换柱。
用10倍柱体积的缓冲液A平衡阳离子交换柱，加入上清液，用至少10 倍柱体积的缓冲液A洗去未结合的蛋白。配制50 mM Na2HPO4/500 mM NaCl，pH 7.4缓冲液（缓冲液B），用20个柱体积含有0 mM~500 mM NaCl的缓冲液线性梯度洗脱目的蛋白。选择纯度达90%的目的蛋白部分合并，在4℃环境下充分透析于10 mM Tris 7.5缓冲液（缓冲液C）中。为了进一步去除杂质，将透析后的N蛋白，上柱于Buffer C预平衡的阴离子交换柱，收集穿透液，充分透析于PBS缓冲液中。N蛋白超滤浓缩后，-20℃保存备用。
经过以上纯化步骤得到的目的蛋白纯度可以达到95%以上，SDS-PAGE显示不同上样量的（从2μg-10μg）泳道，看不到任何杂带，结果如图1所示。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司
<120> SARS-CoV-2的重组N蛋白及其制备与纯化方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 419
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 1
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Ala Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 2
<211> 1317
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
atgcgtcgca gacgtcgagg atctggctcg atgagtgata acggcccgca gaatcagcgc 60
aatgccccgc gcattacctt tggtggcccg agtgatagta ccggtagtaa tcagaatggt 120
gaacgcagcg gcgcccgcag taaacagcgt cgtccgcagg gtctgccgaa taataccgca 180
agctggttta ccgccctgac ccagcatggc aaagaagatc tgaaatttcc gcgcggtcag 240
ggtgttccga ttaataccaa tagcagtccg gatgatcaga ttggttatta tcgtcgtgcc 300
acccgtcgta ttcgcggcgg cgatggtaaa atgaaagatc tgagtccgcg ttggtatttt 360
tattatctgg gcaccggtcc ggaagcaggc ctgccttatg gtgccaataa ggatggcatt 420
atttgggtgg caaccgaagg cgccctgaat accccgaaag atcatattgg tacccgtaat 480
ccggccaata atgcagcaat tgtgctgcag ctgccgcagg gcaccaccct gcctaaaggc 540
ttttatgcag aaggtagtcg cggtggcagc caggcaagca gccgtagtag tagccgcagt 600
cgtaatagca gtcgcaatag caccccgggt agcagtcgtg gtaccagccc ggcacgcatg 660
gcaggcaatg gtggtgacgc cgcactggca ctgctgctgc tggatcgtct gaatcagctg 720
gaaagcaaaa tgagtggcaa aggtcagcag cagcagggcc agaccgtgac caaaaaatct 780
gccgcagaag ccagcaaaaa accgcgtcag aaacgtaccg ccaccaaagc ctataatgtg 840
acccaggcat ttggccgtcg cggcccggaa cagacccagg gtaattttgg tgaccaggaa 900
ctgattcgcc agggcaccga ttataaacat tggccgcaga ttgcacagtt tgcaccgagt 960
gccagtgcct ttttcggcat gagccgcatt ggcatggaag ttaccccgag tggtacctgg 1020
ctgacctata ccggtgccat taagctggat gataaagatc cgaattttaa agatcaggtt 1080
attctgctga acaaacatat tgatgcctat aaaaccttcc cgccgaccga accgaaaaaa 1140
gataaaaaga aaaaggcaga tgagacccag gcactgccgc agcgccagaa aaaacagcag 1200
accgtgacac tgctgccggc agcagatctg gatgatttta gtaaacagct gcagcagagc 1260
atgagtagcg ccgatagtac ccaggccgga tctggctcgc gtcgcagacg tcgataa 1317

Claims (1)

1.一种SARS-CoV-2的N蛋白的制备方法，包括：
将序列如SEQ ID NO：2所示的核酸连接到用Nco I和Hind III酶切后的表达载体pET-28a(+)，得到重组质粒pET-28a(+)-N；
将重组质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，挑取单克隆菌落接种至100 mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200 rpm培养过夜；次日吸取1%体积的过夜培养物至1L新鲜的含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200 rpm培养至OD600=0.6左右，用终浓度为1 mM的IPTG于18℃诱导表达20 h；4℃、12000 g离心3 min收集菌体，每升菌液的菌体用冰上预冷的40 mL缓冲液A悬浮，添加RNase，高压均质机破碎，4℃、12000 g离心30 min，上清液使用0.22 μm滤膜过滤；所述缓冲液A为50 mM Na2HPO4 pH 7.4的缓冲液；
用10倍柱体积的所述缓冲液A平衡阳离子交换柱，加入过滤后的上清液，用至少10 倍柱体积的所述缓冲液A洗去未结合的蛋白；用20个柱体积含有0 mM~500 mM NaCl的缓冲液线性梯度洗脱目的蛋白；选择纯度达90%的目的蛋白部分合并，在4℃环境下充分透析于10mM Tris 7.5缓冲液中；将透析后的目的蛋白，上柱于10 mM Tris 7.5缓冲液预平衡的阴离子交换柱，收集穿透液，充分透析于PBS缓冲液中，获得纯化后的SARS-CoV-2的N蛋白。
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