CN101579362A - 用于将效应分子定向递送至肿瘤的组合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及用于将效应分子定向递送至肿瘤的组合物及方法。具体地说，本申请公开了定向于肿瘤的减毒细菌载体的制备和用途，该细菌载体可用于将一种或多种初级效应分子递送至实体瘤部位。在本发明的方法中，本发明的初级效应分子可用来治疗癌、黑色素瘤、淋巴瘤或肉瘤等实体瘤癌症。本发明涉及一项惊人的发现，即利用定向于肿瘤并且对宿主的毒性较低的减毒细菌可将全身给药于宿主时会产生毒性的效应分子局部递送至肿瘤。本申请还公开一种或多种可选效应分子(称为次级效应分子)的递送方法，这些效应分子可通过定向于肿瘤的减毒细菌与初级效应分子协同递送。
Description
本申请是申请日为2000年8月24日，申请号为00816714.1，发明名称为“用于将效应分子定向递送至肿瘤的组合物及方法”的发明专利申请的分案申请。
本申请要求1999年10月4日提交的美国临时专利申请60/157,500、60/157,581和60/157,637的优先权，其各自的内容均在此全面引入，作为参考。
1.发明领域
本发明涉及将一种或多种初级效应分子递送至实体瘤，用于治疗或抑制该肿瘤。更明确地说，本发明涉及诸如沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌的制备和用途，将其作为载体把一种或多种初级效应分子递送至适当的作用部位，如实体瘤部位。详细地说，本发明的定向于肿瘤的减毒细菌是经过修饰可编码一种或多种初级效应分子的兼性需氧菌或兼性厌氧菌。本发明的初级效应分子包括TNF细胞因子家族的成员、抗血管生成因子和细胞毒性多肽或肽。本发明的初级效应分子可用来，例如，治疗癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肉瘤或来源于这些肿瘤的转移灶等实体瘤。本发明还涉及一项惊人的发现，即利用定向于肿瘤并且对宿主的毒性较低、引起的免疫并发症较少的减毒细菌可将诸如TNF家族成员、抗血管生成因子和细胞毒性多肽或肽等初级效应分子局部递送至肿瘤。本发明还涉及一种或多种可选效应分子(称为“次级效应分子”)的递送方法，这些效应分子可通过定向于肿瘤的减毒细菌与初级效应分子协同递送。次级效应分子提供额外的抗肿瘤治疗活性，促进定向于肿瘤的减毒细菌释放初级效应分子，以及(或者)加强实体瘤部位等适当作用部位对初级效应分子的摄取。
2.发明背景
赘生物，或肿瘤，是由细胞异常生长而产生的一种赘生性团块，它可以是良性的，也可以是恶性的。良性肿瘤一般可维持在局部。恶性肿瘤通常有可能侵袭和破坏邻近的身体组织，并能扩散到远端部位和导致死亡(关于综述，可参考Robins and Angel，1976，BasicPathology，2d Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-122)。当肿瘤从一种器官或组织扩散到另一种器官或组织时被称为发生了转移。
对实体瘤进行化疗的一个主要难题是递送的治疗剂浓度，如递送的药物浓度，要足以根除肿瘤细胞，同时又要尽量减少对正常细胞的损害。因此，有许多实验室的研究方向是设计生物递送系统，例如，用于将药物、前体药物转化酶和(或)基因定向递送至肿瘤细胞的抗体、细胞因子和病毒(可参考，例如，Crystal，R.G.，1995，Science270：404-410)。
2.1.细胞免疫与细胞因子
有一种治疗癌症的策略涉及加强或激活细胞免疫应答。与传统的化疗方法相比，成功诱导一种针对自体肿瘤的细胞免疫应答的方法具有几个优点：1)免疫识别具有高度特异性，它可专门针对肿瘤；2)通过免疫监视可抑制转移部位的生长；3)免疫应答与免疫识别的多样性可弥补肿瘤细胞的不同抗性机制；4)细胞毒性T细胞克隆可以比肿瘤扩张得更快，使得抗肿瘤机制能够最终战胜肿瘤；以及5)在进行身体检查前，记忆应答可以将疾病复发抑制在最早期阶段。对应答病人的临床研究支持动物模型的研究结果，它显示虽然有证据说明CD4+T细胞、巨噬细胞和NK细胞的参与，但成功的免疫疗法涉及激活CD8+T细胞(I类应答)，而对响应患者的临床研究也证明了该结果。可参考，例如，Chapoval et al.，1998，J.Immunol.161：6977-6984；Gollubet al.，1998，J.Clin.Invest.102：561-575；Kikuchi et al.，1999，Int.J.Cancer 80：425-430；Pan et al.，1995，Int.J.Cancer80：425-430；Saffran et al.，1998，Cancer Gene Ther.5：321-330；以及Zimmermann et al.，1999，Eur.J.Immunol.29：284-290。
2.2.细胞因子的肿瘤坏死因子(TNF)家族
性质了解最清除的TNF家族成员是TNF-α。已知TNF-α可对免疫系统产生多方面的影响。TNF-α是一种可直接对肿瘤细胞产生有力的细胞毒性作用的细胞因子。通常认为TNF-α可通过其他机制发挥其抗肿瘤作用，例如刺激增殖与分化，阻止单核细胞凋亡(可参考，例如，Manganet al.，1991，J.Immunol.146：1541-1546；和Ostensen et al.，1987，J.Immunol.138：4185-4191)，提高组织因子样促凝血活性，以及抑制内皮细胞表面抗凝活性，从而最终导致肿瘤内形成血凝块(见Beutler and Cerami，1989，Ann.Rev.Immunol.7：625-655；和Vassalli，P.，1992，Ann.Rev.Immunol.10：411-452的综述)。但这些特性的结果是，如果将TNF-α全身给药，会造成宿主因弥散性血管内凝血而致死的后果。
抗肿瘤应答还涉及了其他细胞因子。IL-2属于I类细胞因子，它被认为在抗肿瘤应答中起一定的作用。例如，黑色素瘤的自然消退与肿瘤内TNF-α和IL-2水平的增加有关。可参考，例如，Beutler andCerami，1989，Annu.Rev.Immunol.7：625-655；Lowes et al.，1997，J.Invest.Dermatol.108：914-919；Mangan et al.，1991，J.Immunol.146：1541-1546；Scheruich et al.，1987，J.Immunol.138：1786-1790。
TNF-α和IL-2都有助于淋巴细胞寻靶，并且已证明IL-2可诱导天然杀伤(NK)细胞、T细胞及淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞对肿瘤的浸润(可参考，例如，Etter et al.，1998，Cytokine 10：395-403；Reinhardt et al.，1997，Blood 89：3837-46；Chen et al.，1997，J.Neurophathol.Exp.Neurol.56：541-50；Vora et al.，1996，Clin.Exp.Immunol.105：155-62；Luscinskas et al.，1996，J.Immunol.157：326-35；Kjaergaard et al.，1998，Scand.J.Immunol.47，532-540；Johansson et al.，1996，Nat.Immun.15：87-97；和Watanabe et al.，1997，Am.J.Pathol.150：1869-80)。当TNF-α与IL-2都存在时，NK和LAK细胞的溶细胞活性均提高，甚至对TNF-不敏感细胞系的溶细胞活性也有所提高(参考，例如，Ostensen et al.，1987，J.Immunol.138：4185-4191)。但治疗水平的I L-2也表现出对宿主的毒性。
将细胞因子全身给药会产生受剂量限制的毒性作用，这无疑为实现细胞因子在癌症治疗中的作用设置了一道明显的障碍。此外，将细胞因子全身给药会降低同系T细胞的寻靶作用，并由此对抗定向免疫治疗，另外还可导致有害的临床副作用。参考Addison et al.，1998，Gene Ther.5：1400-1409；Albertini et al.，1997，Clin.CancerRes.3：1277-1288；Becker et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7826-7831；Book et al.，1998，J.Neuroimmunol.92：50-59；Cao et al.，1998，J.Cancer Res.Clin Oncol.124：88-92；D’Angelica et al.，1999，Cancer Immunol.Immunother.47：265-271；Deszo et al.，1996，Clin.Cancer Res.2：1543-1552；Kjaergaardet al.，1998，Scand.J.Immunol.47：532-540；Ostensen et al.，1987，J.Immunol.138：4185-4191；和Schirrmacher et al.，1998，Clin.Cancer Res.4：2635-2645。
2.3.细胞因子的递送
近期的试验动物研究和临床研究试图由细胞因子的亚全身给药或其它方法来避免细胞因子的全身毒性和更高剂量给药。目前在鼠模型中已通过基因融合脂质体包裹的TNF-α基因给药方法和能够局限于肿瘤血管系统的聚乙二醇包裹的TNF-α全身给药方法来治疗肉瘤-180肿瘤(见Tsutsumi et al.，1996，Jpn.J.Cancer Res.87：1078-1085)。另外还报道了内皮-单核细胞-激活肽II可促进肿瘤对TNF-α的敏感性(见Marvin et al.，1999，J.Surg.Res.63：248-255；Wu et al.，1996，Cancer Res.59：205-212)。
临床研究发现，用隔离性肢体灌注方法将高剂量的TNF-α与α干扰素或美法仑组合给药于患者可完全根除肿瘤。但是，若在治疗后没能完全去除细胞因子，该技术就会为患者带来很严重的危险。此外，这些处理方法肢体隔离，这本身就会为患者带来危险。可参考Eggermont et al.，1997，Semin.Oncol.24：547-555；Fraker et al.，1995，Cancer J.Sci.Am.1：122-130；Lejeune et al.，1998，Curr.Opin.Immunol.10：573-580；Marvin et al.，1996，J.Surg.Res.63：248-255；Mizuguchi et al.，1998，Cancer Res.58：5725-5730；Tsutsumi et al.，1996，Jpn.J.Cancer Res.87：1078-1085；和Wu et al.，1996，Cancer Res.59：205-212。
根据此前Carrier et al.，1992，J.Immunol.148：1176-81；Saltzman et al.，1997，Cancer Biother.Radiopharm.12：37-45；Saltzman et al.，1997，J.Pediat.Surgery 32：301-306发表的研究结果，可利用沙门氏菌减毒菌株直接将IL-1β(Carrier)和IL-2(Saltzman)递送到沙门氏菌的天然感染部位，肝脏和脾脏，从而充当疫苗菌株或影响肝脏的转移性病灶。Saltzman的研究采用沙门氏菌口服给药的方法，该方法是用GALT(肠相关淋巴组织)吸收细菌并将其运送到肝脏和脾脏。但这些感染只局限于天然感染部位。
2.4.血管发生与肿瘤发生
另一种癌症治疗策略涉及对血管发生进行抑制。血管发生是指原有血管长出新毛细血管的过程。新毛细血管的形成过程是，原有血管的内皮细胞利用基质金属蛋白酶等蛋白水解酶降解其周围的基底膜，增殖，迁移到周围的基质组织内并形成微管道。血管发生过程受负因子与正因子之间的相互作用的严密调控，该过程在成人中一般只限于女性生殖周期和伤口修复(Malonne et al.，1999，Clin.Exp.Metastasis 17：1-14)。有多种人类疾病与血管发生的错误或异常调控有关，其中包括糖尿病性视网膜病、银屑病、类风湿性关节炎、心血管疾病和肿瘤发生(Folkman，1995，Nat.Med.1：27-31)。
血管发生过程对肿瘤的生长和转移至关重要。肿瘤形成可划分为两个阶段，即血管前期和血管期。研究表明，血管前期肿瘤细胞可以象血管期肿瘤细胞那样快速增殖。但血管前期肿瘤很少生长到2-3mm3以上，因为细胞增殖与血管前期肿瘤的低氧特性导致的细胞死亡之间存在一种平衡(Folkman，1995，Nat.Med.1：27-31)。血管前期转变为血管期需要血管发生调控因子的平衡转变，从负因子占优势的净平衡转变为正因子，如成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮细胞生长因子(VECF)占优势的净平衡(Cao，1998，Prog.Mol.Subcell.Biol.20：161-176)。调控因子之间的这种平衡的转变是上调血管生成因子，同时下调抗血管生成因子的结果(Folkman，1995，N.Eng.J.Med.333：1757-1763)。
2.5.抗血管生成因子
推测抗血管生成因子存在的依据是，从一些相关现象来判断，原发性肿瘤通常能抑制其转移灶的生长(Cao，1998，Prog.Mol.Subcell.Biol.20：161-176)。在这些因子中，首先分离出来的是小鼠制管张素，它是原发性Lewis肺癌肿瘤释放到循环系统中的纤溶酶原的一种38kDa蛋白水解片段，该片段可阻碍继发转移灶的生长(O’Reilly et al.，1994，Cell 79：315-328)。在人类中，通过金属弹性蛋白酶对纤溶酶原的有限水解而产生的40、42和45kDa的肽具有与小鼠制管张素类似的抗血管生成活性(O’Reilly et al.，1994，Cell 79：315-328)。纤溶酶原本身不具有这种活性。另外还认为，肿瘤相关巨噬细胞可产生制管张素，因为肿瘤细胞本身不含有可检测的制管张素mRNA。肿瘤细胞分泌的粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)可诱导巨噬细胞表达金属弹性蛋白酶(Dong et al.，1997，Cell 88：801-810)。在某些肿瘤中是由肿瘤细胞直接产生的丝氨酸蛋白酶来催化制管张素的产生，而不是金属弹性蛋白酶(Gately et al.，1997，Cancer Res.56：4887-4890)。以100mg/kg/天的浓度将制管张素给药于患有原发性肿瘤的试验小鼠，则可以在不产生毒性副作用的条件下对肿瘤生长产生强烈的抑制。肿瘤可在制管张素疗法停止后的2周内重新生长，表明该疗法可导致肿瘤退化至休眠状态，而不是完全死亡(O’Reilly etal.，1996，Nat.Med.2：689-692)。
在发现制管张素后，又发现并分离了其他一些血管生成抑制剂，其中包括几种血管生成抑制性肽。kringle 5是一种比制管张素更有效的血管生成抑制剂，它是含有纤溶酶原第5 kringle结构域的一种肽(制管张素含有第1-4 kringle结构域)，其重组形式同样具有活性(Cao et al.，1997，J.Biol.Chem.272：22924-22928)。
内抑素(endostatin)的分离方式与制管张素类似(O’Reilly etal.，1997，Cell 88：1-20)，其来源为鼠血管内皮瘤，而不是Lewis肺癌。这种肽的表观分子量为20kDa，其序列相当于胶原蛋白XVIII的一段称为NC1的C-端区域(O’Reilly et al.，1997，Cell 88：1-20)，该区域在不同的胶原蛋白分子中变化很大(Oh et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：4229-4233；和Rehn et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：4234-4239)。在小鼠中，以0.3mg/kg/天的浓度将重组内抑素给药可抑制Lewi s肺癌转移灶的生长，以20mg/kg/天的浓度给药则可以使原发性肿瘤退化至休眠状态。功能性重组内抑素可通过体外变性和重折叠由包涵体产生，也可通过皮下给药的内抑素包涵体制剂的持续体内释放来产生(O’Reilly et al.，1997，Cell 88：1-20)。作为递送内抑素的替代方法，还可以将内抑素的表达质粒进行肌内给药，该方法在小鼠模型系统中只能部分抑制肿瘤生长(Blezinger et al.，1999，Nat.Biotech.17：343-348)。与此类似，将脂质体复合的内抑素或血管紧张素编码质粒进行静脉内给药的递送方法可部分抑制乳腺癌裸鼠模型中的肿瘤生长(Chen et al.，1999，Cancer Res.59：3308-3312)。
最近发现，Serpin(丝氨酸蛋白酶抑制剂)抗凝血酶的一种C端截短肽具有新的抗血管生成活性(O’Reilly et al.，1999，Science285：1926-1928)。全长的抗凝血酶并非先天具有抗血管生成活性，但其C端活性环区一旦被凝血酶剪切，抗凝血酶即可获得很强的血管生成活性。下文将把这种蛋白水解片段称为抗血管生成性抗凝血酶。
本领域已知的其他血管生成抑制性肽包括，纤连蛋白的一种29kDa的N端蛋白水解片段和一种40kDa的C端蛋白水解片段(Homandberget al.，1985，J.Am.Pathol.120：327-332)；催乳素的一种16kDa的蛋白水解片段(Clapp et al.，1993，Endocrinology133：1292-1299)；血小板因子-4的一种7.8kDa的蛋白水解片段(Guptaet al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7799-7803)。
除了那些已证明具有抗血管生成作用的天然产生的蛋白水解片段之外，对一些相当于已知细胞外基质蛋白特定区域的合成肽也已进行了血管生成抑制活性的评定。已证明可作为功能性内皮细胞抑制剂的合成肽，即作为血管生成抑制剂的合成肽，包括，相当于血小板因子-4的片段的一种13个氨基酸的肽(Maione et al.，1990，Cancer Res.51：2077-2083)；相当于胶原蛋白I的片段的一种14个氨基酸的肽(Tolsma et al.，1993，J.Cell Biol.122：497-511)；相当于血小板反应蛋白I的片段的一种19个氨基酸的肽(Tolsma et al.，1993，J.Cell Biol.122：497-511)；以及相当于SPARC的片段的一种20个氨基酸的肽(Sage et al.，1995，J.Cell.Biochem.57：1329-1334)，这是一种分泌的富含半胱氨酸的细胞外基质糖蛋白，这种糖蛋白在人类黑色素瘤细胞中的表达可导致体外细胞侵袭的减少，而在裸鼠模型体内可导致肿瘤发生能力降低(Ledda et al.，1996，Nature Med.3：171-176)。另外还描述了其他一些可抑制血管生成的少于10个氨基酸残基的肽，这些肽分别相当于层粘连蛋白、纤连蛋白、前胶原和EGF的片段(见Cao，1998，Prog.Mol.Subcell.Biol.20：161-176的综述)。
可抑制血管生成的纤连蛋白小分子肽一般都含有RGD基序。RGD是一种肽基序(Arg-Gly-Asp氨基酸)，蛋白可通过该基序识别并结合整联蛋白分子。生血管性血管均伴有整联蛋白αvβ3的表达，用单克隆抗体抑制该蛋白的活性可阻断血管形成(Brooks et al.，1994，Science264：569-571)。这一点已被研究所证实，该研究表明，给予含有RGD基序的环五肽可抑制玻连蛋白受体型整联蛋白的活性，并可阻断视网膜的新血管形成(Hammes et al.，1996，Nature Medicine 2：529-533)。整联蛋白阻断剂，如环五肽和单克隆抗体，具有抗血管生成作用，该作用可诱导生血管性血管的凋亡，以此来促进肿瘤退化(Brooks et al.，1994，Cell 79：1157-1164)。含有RGD基序和另一种整联蛋白结合基序NGR(Asn-Gln-Arg氨基酸)的肽可表现出明显增强的抗肿瘤活性。
通过抑制另一类细胞表面受体的活性，即抑制尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)受体的活性，也可产生对血管生成的抑制作用。uPA受体一旦与配体结合，即可引发一种蛋白水解级联反应，该级联反应是血管生成过程中基底膜侵袭步骤所必需的。用受体拮抗剂抑制uPA受体可阻碍血管发生、肿瘤生长(Min et al.，1996，Cancer Res.56：2428-2433)和转移(Crowley et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5021-5025)。利用随机肽的噬菌体肽展示技术已鉴定出一些这样的拮抗剂(Goodson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：7129-7133)。另外还鉴定出了显性失活形式的受体配体uPA(Min etal.，1996，Cancer Res.56：2428-2433)。
制管张素、内抑素及其他抗血管生成肽的发现为癌症治疗提供了一种令人兴奋的新方法，但是，用一种或多种这些肽进行治疗的方法并不实用，因为这需要产生大量的肽(以65kg或143 lbs的一般人为例，每天需产生约1.3或6.5g蛋白，从其成本和(或)投入的劳力来考虑很不切实际)，从治疗的持续时间来看也是如此(若要保持肿瘤的退化状态，必须持续用药)。这些肽必须如此大剂量给药的原因主要有两点，第一，大部分肽在血流中被降解，第二，在未被降解的分子中，只有很有限的一部分可以到达肿瘤。因此，若能以更节约成本和更友好的方式将抗血管生成蛋白或肽更有效地递送至肿瘤，将会为肿瘤治疗领域带来非常大的利益。
2.6.细菌素家族
大肠杆菌素E3(此后称为ColE3)是一种细菌素，即具有选择性活性的细菌性蛋白毒素，因为其宿主对该毒素免疫。细菌素可由宿主基因组或质粒编码，其宿主范围可宽可窄，细菌素可以是只含有一个或两个亚基的简单结构，也可以是多亚基结构(Konisky，1982，Ann.Rev.Microbiol.36：125-144)。此外，细菌素的宿主具有抵抗该细菌素的免疫力。这种免疫力可出现在特定宿主群体的所有细胞中，甚至出现在不表达这种细菌素的细胞。
ColE3的细胞毒性来源于其对蛋白合成的抑制(Nomura，1963，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.28：315-324)。ColE3活性的作用对象是细菌核糖体的16S组分，30S及70S核糖体都含有该组分(Bowman et al.，1971，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.68：964-968)，这种活性可导致核糖体降解(Meyhack，1970，Proc.Natl.Acad.Sci.USA)。在RNA酶中，ColE3的活性是很独特的，因为它不会导致RNA全部降解，而是只剪切mRNA分子的末端49个核苷酸，以使rRNA与mRNA分离，并由此抑制翻译。分子中的ColE3残基本身即具有核糖核酸酶活性，不需要另一种蛋白来介导(Saunders，1978，Nature274：113-114)。ColE3还能够穿过靶细胞的内膜和外膜。
天然形式的ColE3是一种60kDa的蛋白复合物，由比率为1∶1的一种50kDa蛋白和一种10kDa蛋白组成，较大的亚基具有核酸酶活性，较小的亚基具有抑制50kDa亚基的功能。因此，50kDa的蛋白可作为一种细胞毒性蛋白(或毒素)，而10kDa的蛋白可作为一种抗毒素。50kDa的亚基至少含有两种功能结构域，即穿越靶细胞膜所必需的N-端区域和具有催化(RNA酶)活性的C-端区域。在宿主生物内，大亚基的活性被小亚基所抑制。一旦该毒素进入靶细胞，则可通过与靶细胞外膜的相互作用使亚基解离(见Konisky，1982，Ann.Rev.Microbiol.36：125-144的综述)。
ColE3大亚基的毒性已被用来阻碍克隆基因在微生物中的侧向扩散。Diaz等人(1994，Mol.Microbiol.13：855-861)分离了ColE3的这两种组分，使小(抗毒性)亚基以染色体整合编码序列的形式表达，大亚基则由质粒表达。带有染色体整合小亚基的细菌对表达ColE3大亚基的质粒免疫，但是若该质粒侧向转移到另一个不含小亚基的接受细胞，该细胞就会被杀死。
大肠杆菌素E3(ColE3)还可表现出对哺乳动物细胞的深度细胞毒性作用(见Smarda et al.，1978，Folia Microbiol.23：272-277)，其中包括对一种白血病细胞模型系统的深度细胞毒性作用(见Fiskaet al.，1979，Experimentia 35：406-407)。ColE3活性的作用对象是哺乳动物80S核糖体的40S亚基(Turnowsky et al.，1973，Biochem.Biophys.Res.Comm.52：327-334)。
2.7.细菌性感染与癌症
在早期的临床观测中报道过一些病例，即细菌性感染患者体内的一些癌出现了退化，见Nauts et al.，1953，Acta Medica.Scandinavica 145：1-102，(Suppl.276)；和Shear，1950，J.A.M.A.142：383-390。此后，Lee et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1847-1851(Lee等人)和Jones et al.，1992，Infect.Immun.60：2475-2480(Jones等人)分离出一些鼠伤寒沙门氏菌突变体，这些突变体与野生型菌株相比，可以有明显更多的菌体侵入离体的HEp-2(人表皮样癌)细胞。这些“高侵袭性”突变体是在适合需氧菌生长的条件下分离获得，而这种条件通常会抑制野生型菌株对HEp-2动物细胞的侵袭能力。但是Lee等人及Jones等人描述的高侵袭性鼠伤寒沙门氏菌具有导致泛侵袭性感染的危险，并且可在癌症患者体内引起广泛的细菌性感染。
Carswell et al.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72：3666-3669证实，在注射卡介苗(BCG)的小鼠中，血清的TNF含量增加，并且TNF阳性血清可导致小鼠体内的Meth A肉瘤和其他移植肿瘤出现坏死。正是由于这些观测结果，目前仍在某些癌症治疗方案中通过BCG注射来对癌症患者进行免疫。有关BCG疗法的综述见Sosnowski，1994，Compr.Ther.20：695-701；Barth and Morton，1995，Cancer 75(Suppl.2)：726-734；Friberg，1993，Med.Oncol.Tumor.Pharmacother.10：31-36。
但是，使用细菌会引起人们的担心，TNF-α介导的脓毒性休克就是主要的担心之一，它可以对宿主产生毒性，或是带来致死性后果(Bone，1992，JAMA 268：3452-3455；Dinarello et al.，1993，JAMA269：1829-1835)。此外，TNF-α会产生受剂量限制的全身毒性，这也成为其有效临床应用的主要障碍。进行修饰以降低这种免疫应答是有用的，因为在这种情况下的TNF-α水平不会产生毒性，所以可采用更有效的治疗载体浓度和(或)疗程。
2.8.定向于肿瘤的细菌
已证明基因工程沙门氏菌可定向于肿瘤，并且具有抗肿瘤活性，能够有效地用于向实体瘤递送单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(KSV TK)等效应剂的基因(Pawelek et al.，WO 96/40238)。
2.9.修饰的细菌脂质A导致对TNF-α的诱导降低
Pawelek等人建议对定向于肿瘤的细菌的脂类成分进行修饰，以通过对产生TNFα的诱导的降低来改变免疫应答(Pawelek et al.，WO96/40238)。Pawelek等人提供了一些方法，用于从红杆菌中分离那些负责产生单磷酰脂A(MLA)的基因。MLA可作为脓毒性休克的一种拮抗剂。Pawelek等人还建议对脂质A的生物合成途径进行遗传修饰，其中包括firA基因的突变，该基因可编码脂质A生物合成途径中的第三种酶，即UDP-3-O(R-30羟基肉豆寇酰)-葡糖胺-酰基转移酶(Kelleyet al.，1993，J.Biol.Chem.268：19866-19874)。Pawelek等人指出，firA基因的突变诱导较低的TNFα水平。
在大肠杆菌中已鉴定出一种负责脂质A末端肉豆寇酰化的msbB(mlt)基因(Engel，et al.，1992，J.Bacteriol.174：6394-6403；Karow and Georgopoulos 1992，J.Bacteriol.174：702-710；Somerville et al.，1996，J.Clin.Invest.97：359-365)。对该基因进行遗传破坏可产生一种稳定的无条件性突变，该突变可降低对TNFα的诱导作用(Somerville et al.，1996，J.Clin.Invest.97：359-365；Somerville WO97/25061)。但这些参考文献并未提出，破坏定向于肿瘤的沙门氏菌载体中的msbB基因会使细菌的毒性降低，并且使细菌对螯合剂更敏感。
用细菌作为基因递送载体牵涉到一些问题，主要是细菌通常能直接杀死正常的哺乳动物细胞，并且能够通过可以对宿主产生毒性的TNFα而过度刺激免疫系统(Bone，1992，JAMA 268：3452-3455；和Dinarello et al.，1993，JAMA 269：1829-1835)。除了这些因素之外，对抗生素的抗性会使处理人体内细菌的存在变得非常复杂(Tschape，1996，D T W Dtsch Tierarztl Wochenschr 1996 103：273-7；Ramoset al.，1996，Enferm Infec.Microbiol.Clin.14：345-51)。
Hone and Powell，WO97/18837(“Hone与Powell”)公开了一些方法，用于产生含有非热源性脂质A或LPS的革兰氏阴性菌。
Maskell，WO98/33923描述了一种在msbB基因中含有一个突变的沙门氏菌突变菌株，该菌株与野生型菌株相比可诱导较低水平的TNFα。
Bermudes et al.，WO99/13053讲述了一些组合物和方法，用于遗传破坏沙门氏菌中的msbB基因，由此产生的沙门氏菌与野生型相比具有较低的TNFα诱导能力和较低的毒性。在某些实施方案中，一些突变沙门氏菌与野生型沙门氏菌相比，对螯合剂的敏感性提高。也可参考Low et al.，1999，Nature Biotech.17：37-47。
在本申请书的第2节或任何章节中引用或标明的所有参考文献都不能解释为承认这些参考文献是本发明的先有技术。
3.发明概述
本发明提供一些方法，用于将一种或多种初级效应分子递送至实体瘤。在一项实施方案中，这些方法可用来递送高水平的一种或多种初级效应分子。详细地说，本发明提供一些方法，用于通过定向于肿瘤的减毒细菌，例如对宿主的毒性降低的沙门氏菌，将全身给药于宿主时会产生毒性或诱导不良作用(如不良的免疫学作用)的初级效应分子局部递送至肿瘤。本发明包括诸如沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌的制备和用途，将其作为载体把一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子递送至适当的作用部位，如实体瘤部位。明确地说，本发明的定向于肿瘤的减毒细菌是经过加工可编码一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子的兼性需氧菌或兼性厌氧菌。
本发明提供定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌经过加工可在实体瘤部位表达初级效应分子的编码核酸分子。在一项特别实施方案中，这种定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种初级效应分子的一种编码核酸分子。在另一项实施方案中，这种定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种或多种初级效应分子的一种或多种编码核酸分子。根据该实施方案，可将单一的细菌菌株加工成能够在实体瘤部位表达一种或多种初级效应分子的一种或多种编码核酸分子。在另一项实施方案中，可将一种以上的定向于肿瘤的减毒细菌菌株加工成能够表达一种或多种初级效应分子的一种或多种编码核酸分子。在该实施方案中，一种方式是采用同种的定向于肿瘤的减毒细菌菌株。另一种方式是采用不同种的定向于肿瘤的减毒细菌菌株(如李斯特菌与沙门氏菌)。
本发明的初级效应分子可用于治疗实体瘤，如癌、黑色素瘤、淋巴瘤或肉瘤。文中使用的“实体瘤的治疗”或“治疗实体瘤”包括，抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长、缩小肿瘤的体积、杀死肿瘤细胞，或防止肿瘤细胞扩散(转移)。在一项特别实施方案中，本发明的初级效应分子可在肿瘤部位诱导一种局部的免疫应答，该免疫应答可抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长、杀死肿瘤细胞，或防止肿瘤细胞扩散到身体的其他部位。因此，这些初级效应分子可提供对肿瘤的治疗作用。
这些初级效应分子可来源于任何已知的生物，其中包括，但不局限于，动物、植物、细菌、真菌，以及原生生物或病毒。在本发明的一项实施方案中，优选采用来源于一种哺乳动物的初级效应分子。在该实施方案中，更优选采用来源于人的初级效应分子。本发明的初级效应分子包括TNF家族成员、抗血管生成因子、细胞毒性多肽或肽、肿瘤抑制性酶，及其功能性片段。
在一项特别实施方案中，本发明的初级效应分子为TNF家族成员或其功能性片段。TNF家族成员的实例包括，但不局限于，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、TNF-α相关凋亡诱导配体(TRAIL)、TNF-α相关激活诱导的细胞因子(TRANCE)、TNF-α相关凋亡弱诱导物(TWEAK)、CD40配体(CD40L)、LT-α(淋巴毒素α)、LT-β(淋巴毒素β)、OX40L(OX40配体)、FasL、CD27L(CD27配体)、CD30L(CD30配体)、4-1BBL、APRIL(一种增殖诱导配体)、LIGHT(由激活的T细胞产生的一种29kDa的II型跨膜蛋白)、TL1(一种肿瘤坏死因子样细胞因子)、TNFSF16、TNFSF17和AITR-L(激活诱导型TNFR家族成员的配体)。在一项优选实施方案中，本发明的初级效应分子为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、TNF-α相关凋亡诱导配体(TRAIL)、TNF-α相关激活诱导的细胞因子(TRANCE)、TNF-α相关凋亡弱诱导物(TWEAK)和CD40配体(CD40L)，或其功能性片段。
在另一项特别实施方案中，本发明的初级效应分子为抗血管生成因子或其功能性片段。抗血管生成因子的实例包括，但不局限于，内抑素、制管张素、apomigren、抗血管生成性抗凝血酶III、纤连蛋白的29kDa N-端蛋白水解片段和40kDa C-端蛋白水解片段、uPA受体拮抗剂、催乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的含有24个氨基酸的抗血管生成性片段、被称为13.40的抗血管生成因子、血小板反应蛋白I的含有22个氨基酸的抗血管生成性肽片段、SPARC的含有20个氨基酸的抗血管生成性肽片段、含有RGD和NGR的肽、层粘连蛋白的抗血管生成性小分子肽、纤连蛋白的抗血管生成性小分子肽、前胶原的抗血管生成性小分子肽、EGF的抗血管生成性小分子肽，以及整联蛋白αvβ3的肽拮抗剂和VEGF受体的肽拮抗剂。在一项优选实施方案中，本发明的初级效应分子为内抑素、apomigren的或血小板反应蛋白I的功能性片段。
在另一项特别实施方案中，本发明的初级效应分子为细胞毒性多肽或肽，或其功能性片段。细胞毒性多肽或肽的实例包括，但不局限于，细菌素家族成员、Vero细胞毒素、细胞毒性坏死因子1(CNF1)、细胞毒性坏死因子2(CNF2)、多杀巴斯德菌毒素(PMT)、假单孢菌内毒素、溶血素、法尼基转移酶的强竞争性抑制剂CAAX四肽、细胞周期蛋白抑制剂、Raf激酶抑制剂、CDC激酶抑制剂、caspases、p53、p16和p21。在一项优选实施方案中，本发明的初级效应分子为细菌素家族成员，条件是该细菌素家族成员不是一种细菌素释放蛋白(BRP)。细菌素家族成员的实例包括，但不局限于，ColE1、ColE1a、ColE1b、ColE2、ColE3、ColE4、ColE5、ColE6、ColE7、ColE8、ColE9、大肠杆菌素A、大肠杆菌素K、大肠杆菌素L、大肠杆菌素M、阴沟肠道菌素DF13、鼠疫菌素A1122、葡萄球菌素1580、丁酸梭菌素7423、脓菌素R1或AP41、巨杆菌素A-216，以及弧菌素。在一项特别实施方案中，本发明的初级效应分子为大肠杆菌素E3。
在另一项特别实施方案中，本发明的初级效应分子为肿瘤抑制性酶或其功能性片段。肿瘤抑制性酶的实例包括，但不局限于，甲硫氨酸酶、天冬酰胺酶、脂酶、磷脂酶、蛋白酶、核糖核酸酶(不包括colE3)、DNA酶和糖苷酶。在一项优选实施方案中，本发明的初级效应分子为甲硫氨酸酶。
本发明还提供一些方法，用于通过沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌将一种或多种初级效应分子和一种或多种次级效应分子以组合方式局部递送至实体瘤部位。在一项特别实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种初级效应分子与一种次级效应分子的一种编码核酸分子。在另一项实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种或多种初级效应分子与一种或多种次级效应分子的一种或多种编码核酸分子。根据该实施方案，可将单一的细菌菌株加工成能够在实体瘤部位表达一种或多种初级效应分子与一种或多种次级效应分子的一种或多种编码核酸分子。在另一项实施方案中，可将一种以上的定向于肿瘤的减毒细菌菌株加工成能够在实体瘤部位表达一种或多种初级效应分子与一种或多种次级效应分子的一种或多种编码核酸分子。在该实施方案中，一种方式是采用同种的定向于肿瘤的减毒细菌菌株。另一种方式是采用不同种的定向于肿瘤的减毒细菌菌株(如李斯特菌与沙门氏菌)。
本发明的次级效应分子提供额外的抗肿瘤治疗活性、促进定向于肿瘤的减毒细菌释放初级效应分子，以及(或者)加强实体瘤部位等作用部位的内化作用。本发明的次级效应分子可含有一种分子(例如一种抗肿瘤蛋白，其中包括，但不局限于，细胞毒素、酶和细菌素；前体药物转化酶；反义分子；核酶；抗原；等等)，该分子可通过本发明的方法与初级效应分子协同递送，以治疗癌、黑色素瘤、淋巴瘤或肉瘤等实体瘤。
这些次级效应分子可来源于任何已知的生物，其中包括，但不局限于，动物、植物、细菌、真菌，以及原生生物或病毒。在本发明的某些实施方案中采用来源于一种细菌或病毒的次级效应分子。在本发明的某些优选实施方案中采用来源于一种细菌的次级效应分子(如BRP)。在本发明的其他一些优选实施方案中采用来源于一种病毒的次级效应分子(如TAT)。在本发明的另一些优选实施方案中采用来源于一种哺乳动物的次级效应分子。在某些优选实施方案中采用来源于人的次级效应分子。
本发明提供一些含有效应分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些效应分子由质粒或可转染核酸编码。在本发明的一项优选实施方案中，使用的定向于肿瘤的减毒细菌为沙门氏菌。当沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌可表达一种以上的效应分子时(如初级效应分子或次级效应分子)，这些效应分子可由相同的质粒或核酸来编码，也可以由一种以上的质粒或核酸来编码。本发明还提供一些含有效应分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些效应分子由整合到细菌基因组中的一种核酸编码。整合的效应分子可以是沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌的内源分子，也可以被引入定向于肿瘤的减毒细菌中(例如引入一种可编码效应分子的核酸，如质粒、可转染核酸、转座子，等等)，使得编码效应分子的该核酸能够整合到定向于肿瘤的减毒细菌的基因组中。本发明提供一种与适当启动子可操作性连接的编码效应分子的核酸分子。与编码效应分子的核酸可操作性连接的启动子可以是同源的(即本身的)，也可以是异源的(即编码效应分子的核酸本身不具有的)。适当启动子的实例包括，但不局限于，Tet启动子、trc、pepT、lac、sulA、pol II(dinA)、ruv、recA、uvrA、uvrB、uvrD、umuDC、lexA、cea、caa、recN和pagC。
本发明还提供一些方法，用于通过定向于肿瘤的减毒细菌将一种或多种含有信号序列及效应分子的融合蛋白进行局部递送。在一项优选实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种或多种融合蛋白的一种或多种编码核酸分子，这些融合蛋白含有一种Omp样蛋白或其部分(如信号序列、前导序列、周质区、跨膜结构域、多跨膜结构域，或其组合，见下文第3.1节对“Omp样蛋白”的定义)，并含有一种效应分子。尽管不受原理的限制，但本发明人认为Omp样蛋白可以将效应分子锚定或粘连于外膜，或可用来使效应分子定位于细菌外膜。在某些实施方案中，本发明的效应分子可加强向细菌外膜的递送。在一项实施方案中，效应分子与Omp样蛋白的融合被用来促进效应分子定位于周质。在其他一些实施方案中，效应分子与Omp样蛋白的融合被用来促进效应分子的释放。Omp样蛋白的实例包括，但不局限于，以下各实例的至少一部分：OmpA、OmpB、OmpC、OmpD、OmpE、OmpF、OmpT、孔蛋白样蛋白、PhoA、PhoE、lamB、β-内酰胺酶、肠毒素、蛋白A、内切葡聚糖酶、肽聚糖相关脂蛋白(PAL)、FepA、FhuA、NmpA、NmpB、NmpC，和一种主要的外膜脂蛋白(如LPP)。在本发明的其他实施方案中，本发明的融合蛋白含有一种蛋白水解性剪切位点。该蛋白水解性剪切位点可以是效应分子的内源位点，也可以是Omp样蛋白的内源位点，也可以是构建到融合蛋白中的蛋白水解性剪切位点。
本发明还提供一些方法，用于通过定向于肿瘤的减毒细菌将一种或多种含有运送肽及效应分子的融合蛋白局部递送至实体瘤。研究表明，在融合蛋白中使用运送肽可利于将目的多肽或肽递送至处在其产生或引入的扩散范围内的几乎所有细胞(可参考，例如，Bayley，1999，Nature Biotechnology 17：1066-1067；Fernandez et al.，1998，Nature Biotechnology 16：418-420；和Derossi et al.，1998，TrendsCell Biol.8：84-87)。因此，将定向于肿瘤的减毒细菌加工成可表达含有运送肽和效应分子的融合蛋白的方法能够提高效应分子被肿瘤细胞内化的能力。在一项特别实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种核酸分子，该核酸分子可编码一种含有运送肽和效应分子的融合蛋白。在另一项实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码一种或多种含有运送肽和效应分子的融合蛋白。这些实施方案中的效应分子可以是初级效应分子，也可以是次级效应分子。运送肽的实例包括，但不局限于，来源于HIV TAT蛋白、触角足同源域(穿透蛋白(penetratin))、卡波西成纤维细胞生长因子(FGF)膜移位序列(MTS)，以及单纯疱疹病毒VP22的肽。
本发明还提供一些方法，用于通过定向于肿瘤的减毒细菌将一种或多种含有信号肽、运送肽及效应分子的融合蛋白局部递送至实体瘤。在一项特别实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码一种或多种含有信号肽、运送肽和效应分子的融合蛋白。该实施方案中的效应分子可以是初级效应分子，也可以是次级效应分子。
本发明还提供一些方法，用于通过定向于肿瘤的减毒细菌将一种或多种含有信号肽、蛋白水解性剪切位点、运送肽及效应分子的融合蛋白局部递送至实体瘤。在一项特别实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码一种或多种含有信号序列、蛋白水解性剪切位点、运送肽和效应分子的融合蛋白。该实施方案中的效应分子可以是初级效应分子，也可以是次级效应分子。
在某些实施方案中，可将单一的细菌菌株加工成能够在实体瘤部位表达本发明所述融合蛋白的一种或多种编码核酸分子。在其他一些实施方案中，可将一种以上的定向于肿瘤的减毒细菌菌株加工成能够在实体瘤部位表达一种或多种本发明所述融合蛋白的一种或多种编码核酸分子。这些实施方案的方式是采用同种的定向于肿瘤的减毒细菌菌株。另一种方式是采用不同种的定向于肿瘤的减毒细菌菌株(如李斯特菌与沙门氏菌)。
本发明还提供一些方法，用于通过定向于肿瘤的减毒细菌将本发明的一种或多种融合蛋白及本发明的一种或多种效应分子局部递送至实体瘤部位。优选的是，与单独表达融合蛋白或单独表达效应分子相比，定向于肿瘤的减毒细菌在实体瘤部位同时表达融合蛋白和效应分子可以提高对肿瘤生长或肿瘤细胞生长的抑制水平。
本发明还提供在沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌中表达一种初级效应分子和任选的一种次级效应分子的方法，其中的细菌具有一种增强释放系统。在本发明的一项优选实施方案中，增强释放与定向于肿瘤的减毒细菌表达一种释放因子有关。在一项实施方案中，该释放允许效应分子从细胞质空间或周质空间释放。释放因子可以是定向于肿瘤的减毒细菌的内源因子，也可以是外源因子(也就是由定向于肿瘤的减毒细菌本身不具有的一种编码分子来编码)。释放因子可以由质粒等核酸来编码，也可以由整合到定向于肿瘤的减毒细菌基因组中的核酸来编码。释放因子可以由编码初级效应分子的同一核酸或质粒来编码，也可以由不同的核酸或质粒来编码。释放因子可以由编码次级效应分子的同一核酸或质粒来编码，也可以由不同的核酸或质粒来编码。在一项优选实施方案中，释放因子为细菌素释放蛋白(BRP)。在一项特别实施方案中，BRP为阴沟肠道菌素DF13质粒的BRP、大肠杆菌素E1-E9质粒的一种BRP，或大肠杆菌素A、N或D质粒的一种BRP。在一项优选实施方案中，使用的BRP为阴沟肠道菌素DF13的BRP(pCloDF13BRP)。在本发明的另一项实施方案中，该增强释放系统包括一种孔蛋白的过度表达。
本发明还提供在沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌中表达本发明的一种融合蛋白的方法，其中的细菌具有一种增强释放系统。在一项特别实施方案中，释放因子的表达是在一种细胞中进行，该细胞还能表达一种含有初级效应分子和Omp样蛋白的融合蛋白。在该实施方案中，释放因子的共表达能够促进该融合蛋白从周质空间释放。
在一项实施方案中，本发明提供一些方法，用于通过定向于肿瘤的减毒细菌的经过修饰的菌株来递送高水平的效应分子或融合蛋白，这些经过修饰的菌株能够在表达效应分子或融合蛋白的同时选择性地积聚在肿瘤内。在一种特定的方法中，定向于肿瘤的减毒细菌的修饰菌株可选择性地增加肿瘤内的效应分子。尽管以下章节为简单起见是以沙门氏菌为参考来进行讲述，但本发明的组合物和方法绝不局限于沙门氏菌，而是还包括其他任何适用的细菌。明确地说，本发明提供一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌可以是兼性需氧菌，也可以是兼性厌氧菌。定向于肿瘤的减毒细菌的实例包括，但不局限于，大肠杆菌，其中包括肠侵袭性大肠杆菌，沙门氏菌、志贺菌、小肠结肠炎耶尔森菌、单核细胞增多性李斯特菌、人型支原体，和链球菌。
本发明还提供一些药用组合物，这些组合物含有一种可药用载体物和一种经过加工而包含一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些核酸分子可编码一种或多种初级效应分子。本发明还提供一些药用组合物，这些组合物含有一种可药用载体和一种经过加工而包含一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些核酸分子可编码一种或多种初级效应分子以及一种或多种次级效应分子。本发明还提供一些药用组合物，这些组合物含有一种可药用载体和一种经过加工而包含一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些核酸分子可编码本发明的一种或多种融合蛋白。此外，本发明还提供一些药用组合物，这些组合物含有一种可药用载体和一种经过修饰而包含一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些核酸分子可编码本发明的一种或多种融合蛋白以及一种或多种效应分子(即初级效应分子或(和)次级效应分子)。在一项优选实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌为沙门氏菌。
本发明的药用组合物可用来治疗实体瘤。实体瘤包括，但不局限于，肉瘤、癌、淋巴瘤和其他实体瘤癌症，其中包括，但不局限于，生殖细胞系肿瘤、中枢神经系统的肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、子宫颈癌、子宫癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、星形细胞瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌和间皮瘤。
本发明还提供一些递送初级效应分子的方法，用于对实体瘤进行治疗，这些方法的步骤包括，将一种药用组合物给药于需要这种治疗的一种动物，优选的是一种哺乳动物，最优选的是人，该组合物含有一种经过加工而包含一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些核酸分子可编码一种或多种初级效应分子。本发明还提供一些递送初级效应分子的方法，用于对实体瘤进行治疗，这些方法的步骤包括，将一种药用组合物给药于需要这种治疗的一种动物，优选的是一种哺乳动物，最优选的是人，该组合物含有一种经过加工而包含一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些核酸分子可编码一种或多种初级效应分子以及一种或多种次级效应分子。本发明还提供一些递送初级效应分子的方法，用于对实体瘤进行治疗，这些方法的步骤包括，将一种药用组合物给药于需要这种治疗的一种动物，优选的是一种哺乳动物，最优选的是人，该组合物含有一种经过加工而包含一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些核酸分子可编码本发明的一种或多种融合蛋白。此外，本发明还提供一些递送初级效应分子的方法，用于对实体瘤进行治疗，这些方法的步骤包括，将一种药用组合物给药于需要这种治疗的一种动物，优选的是一种哺乳动物，最优选的是人，该组合物含有一种经过加工而包含一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些核酸分子可编码本发明的一种或多种融合蛋白以及一种或多种效应分子(即初级效应分子或(和)次级效应分子)。在一项优选实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌为沙门氏菌。在一种特定的方法中，定向于肿瘤的减毒细菌具有一种增强释放系统。
在某些实施方案中，经过加工而表达一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌可以与其他已知的癌症疗法协同使用，这些核酸分子可编码一种或多种效应分子和(或)融合蛋白。举例来说，经过加工而表达一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌可以与化疗剂协同使用，这些核酸分子可编码一种或多种效应分子和(或)融合蛋白。化疗剂的实例包括，但不局限于，顺铂、异环磷酰胺、紫杉醇、taxanes、I型拓扑异构酶抑制剂(如CPT-11、托泊替堪、9-AC和GG-211)、gemcitabine、长春瑞宾、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、亚叶酸、长春瑞宾、temodal、紫杉酚、细胞松弛素B、短杆菌肽D、吐根碱、丝裂霉素、鬼臼亚乙苷、tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、二羟基蒽酮、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、苯丙氨酸氮芥、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安，以及嘌呤霉素同系物和环磷酰胺。作为选择，经过加工而表达一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌也可以与放射疗法协同使用，这些核酸分子可编码一种或多种效应分子和(或)融合蛋白。
本发明包括定向于肿瘤的减毒细菌与抗癌剂的序贯给药或伴随给药方法，其中的减毒细菌经过加工可表达一种或多种效应分子和(或)融合蛋白的一种或多种编码核酸分子。本发明包括定向于肿瘤的减毒细菌与抗癌剂的具有附加作用或协同作用的组合方法，其中的减毒细菌经过加工可表达一种或多种效应分子和(或)融合蛋白的一种或多种编码核酸分子。
本发明还包括抗癌剂与经过加工可表达一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌的组合方法，这些核酸分子可编码一种或多种作用部位不同的效应分子和(或)融合蛋白。这种组合方法无论具有协同作用还是具有附加作用，都可以提供一种基于这些治疗剂的双重作用的改进疗法。因此，本发明的新组合疗法与采用两种制剂之一的单制剂疗法相比，可产生更高的疗效。
3.1.定义及缩略语
文中使用的“沙门氏菌”包括所有沙门氏菌物种，其中包括伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。本文还包括不同血清型的沙门氏菌，例如，通常称为鼠伤寒沙门氏菌的鼠伤寒血清型是肠炎沙门氏菌的一个亚群。
类似物：文中使用的术语“类似物”是指与初级效应分子或次级效应分子的功能类似或相同的一种多肽，该多肽并不一定含有与初级效应分子或次级效应分子类似或相同的氨基酸序列，也不一定具有与初级效应分子或次级效应分子类似或相同的结构。具有类似氨基酸序列的多肽是指至少满足以下条件之一的多肽：(a)含有一种氨基酸序列的多肽，该序列与文中描述的初级效应分子或次级效应分子的氨基酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性；(b)由一种核苷酸序列编码的多肽，该序列能够在严格条件下与编码文中所述初级效应分子或次级效应分子的核苷酸序列杂交，并且杂交序列为至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基，或至少150个连续氨基酸残基；以及(c)由一种核苷酸序列编码的多肽，该序列与编码文中所述初级效应分子或次级效应分子的核苷酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性。具有文中所述初级效应分子或次级效应分子的类似结构的多肽是指具有文中所述初级效应分子或次级效应分子的类似二级结构、三级结构或四级结构的多肽。多肽的结构可通过本领域技术人员已知的方法来测定，其中包括，但不局限于，肽测序方法、X-射线晶体学方法、核磁共振方法、圆二色方法和晶体电镜检测方法。
抗血管生成因子：抗血管生成因子是指具有抗血管生成活性的任何蛋白质分子，或编码这种蛋白质分子的核酸。在一项优选实施方案中，使用的抗血管生成因子是一种较大的蛋白的肽片段或剪切片段。
减毒：减毒是指一种使微生物或载体的致病性降低的修饰方法。减毒的最终结果是，当把减毒微生物或载体给药于患者时，毒性及其他副作用的危险性降低。
细菌素：细菌素是指具有特定活性的细菌性蛋白毒素，细菌宿主对该毒素免疫。细菌素可由细菌宿主的基因组或质粒编码，其毒性针对的其他细菌的范围可宽可窄，细菌素可以是只含一个或两个亚基的简单结构，也可以是多亚基结构。此外，表达细菌素的宿主具有抵抗该细菌素的免疫力。
螯合剂敏感性：螯合剂敏感性的定义是，能够影响细菌增殖的有效浓度，或能够降低细菌存活力的浓度，细菌存活力由可再生的集落形成单位(c.f.u.)来确定。
衍生物：在本文的“一种多肽的衍生物”中使用的术语“衍生物”是指一种多肽，这种多肽含有诸如初级效应分子或次级效应分子等多肽的一种被改变的氨基酸序列，改变方法是引入氨基酸残基取代、缺失或添加，或是多肽与任一类型的分子发生共价联接。在本文的“一种初级效应分子或次级效应分子的衍生物”中使用的术语“衍生物”是指被修饰的一种初级效应分子或次级效应分子，修饰方法是，例如，初级效应分子或次级效应分子与任一类型的分子发生共价联接。作为非限定性的实例，可通过诸如蛋白水解性剪切或与一种细胞配体或其他蛋白相连接的方法对初级效应分子或次级效应分子进行修饰。可以用化学修饰方法通过本领域技术人员已知的技术对初级效应分子或次级效应分子的衍生物进行修饰(例如酰化、磷酸化、羧化、糖基化、硒修饰或硫酸化)。此外，初级效应分子或次级效应分子的衍生物可含有一个或多个非经典氨基酸。多肽衍生物可具有与文中所述初级效应分子或次级效应分子类似或相同的功能。在本文的“定向于肿瘤的减毒沙门氏菌突变体msbB-衍生物”中使用的术语“衍生物”是指国际公开WO99/13053的第17页中定义的修饰沙门氏菌msbB-突变体，该专利在此完整引入作为参考。
片段：文中使用的术语“片段”是指含有一种氨基酸序列的肽或多肽，该序列为初级效应分子或次级效应分子的氨基酸序列的至少2个连续氨基酸残基、至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基，或至少250个连续氨基酸残基。
功能性片段：文中使用的术语“功能性片段”是指初级效应分子或次级效应分子的一种片段，该片段可保持初级效应分子或次级效应分子的至少一种功能(如效应分子的酶活性、抗血管生成活性，或抗肿瘤活性)。
融合蛋白：文中使用的术语“融合蛋白”是指一种多肽，这种多肽含有初级效应分子或次级效应分子的一种氨基酸序列，或其功能性片段或衍生物，和一种异源多肽(如非初级效应分子或非次级效应分子)的氨基酸序列。
Omp样蛋白：文中的Omp样蛋白包括任何细菌外膜蛋白或其部分(如信号序列、前导序列、周质区、跨膜结构域、多跨膜结构域，或其组合)。在特别实施方案中，Omp样蛋白至少是OmpA、OmpB、OmpC、OmpD、OmpE、OmpF、OmpT、孔蛋白样蛋白、PhoA、PhoE、lamB、β-内酰胺酶、肠毒素、蛋白A、内切葡聚糖酶、肽聚糖相关脂蛋白(PAL)、FepA、FhuA、NmpA、NmpB、NmpC，或一种主要的外膜脂蛋白(如LPP)等的一部分。
纯化的：文中的“纯化的”定向于肿瘤的减毒细菌菌株基本不含污染性蛋白或氨基酸(如死亡细菌的碎片)或培养基。基本不含污染性蛋白或氨基酸的定向于肿瘤的减毒细菌菌株包括，含有约30％、20％、10％或5％(干重)以下的污染性蛋白或氨基酸的定向于肿瘤的减毒细菌制剂。
释放因子：文中的释放因子包括可促进细菌组分释放的任何蛋白或其功能性部分。在一项实施方案中，使用的释放因子为细菌素释放蛋白。释放因子包括，但不局限于，阴沟肠道菌素DF13质粒编码的细菌素释放蛋白(BRP)、大肠杆菌素E1-E9质粒编码的BRPs，或大肠杆菌素A、N或D质粒编码的BRPs。
脓毒性休克：脓毒性休克是由TNF-α引发、由复合细胞因子级联反应造成的一种内脏衰竭状态。微生物或载体诱导TNF-α的能力可作为一种衡量标准，用来表示其诱导脓毒性休克的相对能力。
定向于肿瘤：定向于肿瘤的定义是，与对应的非癌性细胞或组织相比，可优先定位于相应的癌性靶细胞或组织并复制的能力。因此，沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌可优先附着和(或)感染癌性靶细胞，并且(或者)可在肿瘤环境中保持存活。
毒力：毒力是描述总致病能力的一个相关术语，包括杀死正常细胞的能力或诱导脓毒性休克的能力(见下文的详细定义)。
文中使用的菌株名VNP20009(国际公开WO99/13053)、YS1646和41.2.9可彼此互换，它们都是指美国典型培养物保藏中心中保藏的编号为202165的菌株。文中使用的菌株名YS1456和8.7可彼此互换，它们都是指美国典型培养物保藏中心中保藏的编号为202164的菌株。
参考下文的发明详述、特别实施方案的说明性实施例以及附图可以更全面地了解本发明。
4.附图简述
图1：成熟的人TNF-α编码序列。DNA序列(SEQ ID NO：3)和蛋白序列(SEQ ID NO：4)均给出。
图2：沙门氏菌VNP20009serC-菌株的获得方法。
图3：鼠伤寒沙门氏菌中，由整合到染色体中的trc启动子驱动TNF-α基因表达TNF-α。
图4：与成熟的人TNF-α(第67-543核苷酸)融合的合成OmpA信号序列(第1-63核苷酸)的编码序列。DNA序列(SEQ ID NO：7)和蛋白序列(SEQ ID NO：8)均以融合构建体形式表示。
图5：OmpA/TNF-α融合蛋白在大肠杆菌(JM109菌株)中的周质定位和表达。
图6：与成熟的人TRAIL(第67-801核苷酸)融合的OmpA信号序列(第1-63核苷酸)的编码序列。融合构建体的DNA序列(SEQ ID NO：9)和蛋白序列(SEQ ID NO：10)均表示在图中。
图7：OmpA/TRAIL融合蛋白在大肠杆菌(JM109菌株)中的表达和加工。
图8：成熟(C125A)的人IL-2(第64-462核苷酸)与修饰的OmpA信号序列(第1-63核苷酸)的融合蛋白编码序列。融合构建体的DNA序列(SEQ ID NO：11)和蛋白序列(SEQ ID NO：12)均表示在图中。
图9：与phoA(8L)或ompA(8L)合成信号肽融合的成熟的人IL-2的表达和加工。
图10：与成熟(C125A)的人I L-2(第64-462核苷酸)融合的修饰phoA信号序列(第1-63核苷酸)的编码序列。融合构建体的DNA序列(SEQ ID NO：13)和蛋白序列(SEQ ID NO：14)均表示在图中。
图11：表达成熟形式的人TNF-α的鼠伤寒沙门氏菌减毒菌株的体内抗肿瘤作用。
图12：BRP的表达对体内抗肿瘤作用的影响。该图显示患有B16黑色素瘤的C57BL/6小鼠用(1)PBS对照；(2)VNP20009；和(3)带有含BRP基因的pSW1质粒的VNP20009处理后的平均肿瘤大小随时间的变化。
图13：对沙门氏菌中受pepT启动子调控的β-gal基因表达进行无氧诱导。图13A说明无氧条件对沙门氏菌YS1456菌株及VNP20009菌株的β-gal表达的体外诱导情况。图13B说明表达BRP、β-gal，或BRP与β-gal均表达的VNP20009沙门氏菌对肿瘤和肝细胞内的β-gal的体内诱导情况比较。
图14：对沙门氏菌中受Tet启动子调控的β-gal基因表达进行四环素诱导。剂量-应答曲线表明，对浓度约为0.15μg/ml以下的四环素可产生一种线性应答，更高的浓度则使应答减弱，推测其原因可能是四环素的抗生素功能。
图15：pTrc99a质粒的六聚组氨酸-内抑素(HexaHIS-内抑素)表达。图15A显示转化到沙门氏菌(VNP20009)中的3种独立克隆的HexaHIS-内抑素表达。图15B显示转化到大肠杆菌(DH5α)中的5种独立克隆的HexaHIS-内抑素表达。编号为偶数的泳道显示未诱导培养物的提取物，编号为奇数的诱导显示IPTG诱导的相应培养物的提取物。
图16：YA3334质粒的HexaHIS-内抑素表达：用抗组氨酸抗体进行蛋白质印迹分析，使asd系统(采用trc启动子)中的HexaHIS-内抑素显示出HexaHIS-内抑素的正确大小(～25kD)的条带(1-8道相当于8个独立的克隆)。
图17：表达内抑素的VNP20009细胞对C38鼠结肠癌的作用。该图显示患有C38肿瘤的小鼠用(1)PBS对照；(2)带有空YA3334载体的asd-VNP20009；(3)表达六聚组氨酸-内抑素的asd-VNP20009；和(4)表达六聚组氨酸-内抑素和BRP的VNP20009处理后的平均肿瘤大小随时间的变化。
图18：表达内抑素的VNP20009细胞对DLD1人结肠癌的作用。该图显示患有DLD1肿瘤的裸鼠用(1)PBS对照；(2)带有空YA3334载体的asd-VNP20009；和(3)表达六聚组氨酸-内抑素和BRP的VNP20009处理后的平均肿瘤大小随时间的变化。
图19：表达人内抑素的定向于肿瘤的减毒沙门氏菌的裂解物对内皮细胞的抗增殖活性。该图显示bFGF和相当于8×108个细菌的裂解物对人静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的抑制。对照为含有空pTrc质粒的沙门氏菌。每个数据点为1次典型试验获得的4次测量值的平均数。样品均根据细菌数进行了校正。
图20：表达血小板因子-4肽(血小板因子-4的第47-70氨基酸)和血小板反应蛋白肽(13.40)的定向于肿瘤的减毒沙门氏菌的裂解物对内皮细胞的抗增殖活性。该图显示bFGF和相当于3.2×108个细菌的裂解物对人静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的抑制。对照为含有空pTrc质粒的沙门氏菌。每个数据点为1次典型试验获得的4次测量值的平均数。样品均根据细菌数进行了校正。
图21：pE3.shuttle-1载体的构建。
图22：ColE3-CA38载体(GenBank编号AF129270)的构建。ColE3-CA38载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。Col E3-CA38载体含有5种开放读码框架，分别描述与SEQ ID NO：2-5。
图23：Col E3-CA38/BRP-1载体的构建。
图24：柱状图显示各菌株产生的大肠杆菌素E3的致死单位量。
图25：对暴露于紫外光或x-射线的不同菌株的晕测定。
图26：41.2.9/Col E3对C38鼠结肠癌的作用。
图27：41.2.9/Col/E3对NU/Nu小鼠中的DLD1人结肠癌的抗肿瘤活性。
图28：41.2.9/Col E3对B16鼠黑色素瘤的作用。
图29：表达克隆的大肠杆菌CNF1的沙门氏菌的细胞毒性。
图30：与正常Hela细胞(B)相比，暴露于CNF1的Hela细胞(A)表现出增大和多核现象。
图31：以3’-5’方向显示的pCVD442-msbB载体的msbB部分(如图32所示)，在msbB的中部有一段缺失，并且在其位置含有内部的NotI、PacI、SphI、SfiI、SwaI和DraI多接头(SEQ ID NO：61)。见图32。
图32：用于在DmsbB区域克隆DNA然后插入染色体的pCVD442-msbB载体的限制酶图谱和示意图。msbBdel为DmsbB的5’及3’区域；mob RP4为转移元件，用于将质粒由一种菌株转移到另一种菌株。bla为β-内酰胺酶基因，可赋予对羧苄青霉素和氨苄青霉素等b-内酰胺类抗生素的敏感性。sacB为赋予蔗糖敏感性的基因。
图33：1)pCVD442-Tet-BRP-AB载体，2)在沙门氏菌YS50102中与DmsbB染色体拷贝进行的同源重组，3)在沙门氏菌YS50102中进行的染色体整合，以及随后进行的噬菌体转导至VNP20009株，4)通过蔗糖筛选获得41.2.9-Tet-BRP-AB菌株。oriR6K为质粒复制起始点；mobRP4为转移因子，用于将质粒由一种菌株转移到另一种菌株。amp为β-内酰胺酶基因，可赋予对羧苄青霉素和氨苄青霉素等b-内酰胺类抗生素的敏感性。sacB为赋予蔗糖敏感性的基因。注释：未按比例绘制。
图34：在暴露于SKOV3细胞72小时后，tetBRPAB的第26号克隆和第31号克隆与阳性对照和阴性对照(HSC10和41.2.9)相比的细胞毒性百分率(平均数＝8)。Vero细胞毒素的表达由四环素诱导(见第26和第31号克隆)。经四环素处理(+)；未经四环素处理(-)。细胞毒性百分率的阳性对照为大肠杆菌HSC10菌株。
图35：定向于肿瘤的减毒沙门氏菌在四环素不存在(1A)和存在(1B)情况下在血琼脂上的晕形成情况。经过加工而组成型表达SheA的定向于肿瘤的减毒沙门氏菌在四环素不存在(2A)和存在(2B)情况下的晕形成情况。经过加工而表达可被四环素诱导的SheA的定向于肿瘤的减毒沙门氏菌在四环素不存在(3A)和存在(3B)情况下的晕形成情况。
图36：(A)不含六聚组氨酸标记的TAT-凋亡素融合蛋白的示意图。(B)含有六聚组氨酸标记的TAT-凋亡素融合蛋白的示意图。(C)含有一种OmpA-8L信号序列的TAT-凋亡素融合蛋白的示意图。
图37：TAT-凋亡素融合蛋白的编码序列。DNA序列(SEQ ID NO：57)和蛋白序列(SEQ ID NO：58)均给出。
图38：六聚组氨酸-TAT-凋亡素融合蛋白的编码序列。DNA序列(SEQID NO：59)和蛋白序列(SEQ ID NO：60)均给出。
图39：VNP20009/环磷酰胺组合疗法对C57BL/6小鼠中的M27肺癌生长的作用。
图40：VNP20009/丝裂霉素组合疗法对C57BL/6小鼠中的M27肺癌生长的作用。
图41：VNP20009/顺铂组合疗法对C57BL/6小鼠中的M27肺癌生长的作用。
5.发明详述
本发明使用定向于肿瘤的减毒细菌菌株来向肿瘤递送高水平的治疗性初级效应分子。本发明的优越性在于可避免某些初级效应分子的潜在全身毒性(如TNF-α引起的脓毒性休克)。本发明提供向实体瘤递送一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子的方法。更详细地说，本发明包括诸如沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌的制备和用途，将其作为载体把一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子递送至适当的作用部位，如实体瘤部位。明确地说，本发明的定向于肿瘤的减毒细菌是经过加工可编码一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子的兼性需氧菌或兼性厌氧菌。
基于定向于肿瘤的减毒细菌的所述递送系统可以将一种或多种效应分子递送至实体瘤部位。本发明提供一些安全并且有效的方法，用于通过定向于肿瘤的减毒细菌，例如对宿主的毒性降低的沙门氏菌，将全身给药于宿主时会产生毒性或导致不良副作用(如不良的免疫学影响)的初级效应分子局部递送至肿瘤。本发明还提供通过一种定向于肿瘤的减毒细菌，如沙门氏菌，来递送一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子的组合递送方法。本发明还提供定向于肿瘤的不同减毒细菌的组合递送方法，这些细菌带有一种或多种不同的初级效应分子和(或)一种或多种不同的次级效应分子。
本发明还提供一些方法，用于通过定向于肿瘤的减毒细菌将一种或多种含有效应分子的融合蛋白局部递送至实体瘤部位，这些细菌经过加工可表达所述融合蛋白。在一项实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种含有信号肽和效应分子的融合蛋白。在另一项实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种含有信号序列、蛋白水解性剪切位点和效应分子的融合蛋白。在另一项实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种含有运送肽和效应分子的融合蛋白。在另一项实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种含有信号序列、运送肽和效应分子的融合蛋白。在另外一项实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种含有信号序列、蛋白水解性剪切位点、运送肽和效应分子的融合蛋白。定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种或多种本发明的融合蛋白以及一种或多种本发明的效应分子。
本发明还提供一些药用组合物，这些组合物含有一种可药用载体和一种经过加工而包含一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些核酸分子可编码一种或多种初级效应分子。本发明还提供一些药用组合物，这些组合物含有一种可药用载体和一种经过加工而包含一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些核酸分子可编码一种或多种初级效应分子以及一种或多种次级效应分子。此外，本发明还提供一些药用组合物，这些组合物含有一种可药用载体和一种经过加工而包含一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些核酸分子可编码一种或多种融合蛋白以及一种或多种效应分子。
本发明还提供一些方法，用于对动物体内的实体瘤进行治疗，这些方法的步骤包括，将经过加工可表达一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌给药于需要这种治疗的动物，这些核酸分子可编码一种或多种初级效应分子。本发明还提供一些方法，用于对动物体内的实体瘤进行治疗，这些方法的步骤包括，将经过加工可表达一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌给药于需要这种治疗的动物，这些核酸分子可编码一种或多种初级效应分子以及一种或多种次级效应分子。此外，本发明还提供一些方法，用于对动物体内的实体瘤进行治疗，这些方法的步骤包括，将经过加工而包含一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌给药于需要这种治疗的动物，这些核酸分子可编码一种或多种融合蛋白以及一种或多种效应分子。优选的是该动物为哺乳动物(如狗、猫、马、牛、猴，或猪)，更优选的是该动物为人。实体瘤的实例包括，但不局限于，肉瘤、癌、淋巴瘤和其他实体瘤癌症，其中包括，但不局限于，乳腺癌、前列腺癌、子宫颈癌、子宫癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、星形细胞瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、中枢神经系统癌、生殖细胞系癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌和间皮瘤。
尽管不受任何原理的限制，但本发明人认为，本发明可通过递送含有效应分子的定向于肿瘤的减毒细菌，使该效应分子在肿瘤部位定向表达。
为了解释清除，本发明详述分为以下几个小节：“细菌载体”；“用于肿瘤治疗的初级效应分子”；“与初级效应分子共表达的次级效应分子”；“衍生物和类似物”；“融合蛋白”；“表达载体”；和“用于递送的方法及组合物”。
5.1.细菌载体
任何定向于肿瘤的减毒细菌都可以在本发明的方法中使用。更详细地说，在本发明的方法中使用的定向于肿瘤的减毒细菌为兼性需氧菌或兼性厌氧菌。可在本发明的方法中使用的定向于肿瘤的兼性需氧或兼性厌氧减毒细菌的实例包括，但不局限于，大肠杆菌，其中包括肠侵染性大肠杆菌，沙门氏菌、志贺菌、小肠结肠炎耶尔森菌、单核细胞增多性李斯特菌、人型支原体，和链球菌。
这里对影响减毒性质和定向于肿瘤性质的一些因素进行描述，这些因素可用来构建或筛选适于在本发明的方法中使用的细菌菌株。例如，国际公开WO96/40238的第6.1节描述了定向于肿瘤的细菌的筛选和分离方法，第6.2节描述了细菌减毒的方法，在此均引入作为参考。国际专利申请WO99/13053中还描述了定向于肿瘤的减毒细菌的一些实例，在此均完整引入作为参考。在本发明的某些实施方案中是采用本领域已知的方法来修饰细菌，以将其减毒或高度减毒。
本发明提供一些可作为载体的定向于肿瘤的减毒细菌，用于一种或多种初级效应分子(如TNF家族成员、细胞毒性肽或多肽、肿瘤抑制性酶或抗血管生成因子)的单独递送，或与一种或多种次级效应分子的协同递送。本发明还提供一些可作为载体的定向于肿瘤的减毒细菌，用于本发明的一种或多种融合蛋白的单独递送，或与一种或多种效应分子的协同递送。在本发明的一项优选实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌为沙门氏菌，该细菌经过加工可表达一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码效应分子和(或)融合蛋白。
尽管以下章节特别参考沙门氏菌来进行讲述，但本发明的组合物和方法决不局限于沙门氏菌，而是还包括其他任何适用的细菌。适当的细菌物种包括，但不局限于，大肠杆菌，其中包括肠侵染性大肠杆菌，沙门氏菌、志贺菌、小肠结肠炎耶尔森菌、单核细胞增多性李斯特菌、人型支原体和链球菌，其中，这些细菌为兼性需氧菌或兼性厌氧菌。
5.1.1.沙门氏菌载体
利用本发明讲述的方法可以使任何定向于肿瘤的减毒细菌经过加工而编码一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子，从而产生一种可将本发明的一种或多种效应分子递送至实体瘤的新颖的定向于肿瘤的减毒细菌。此外，利用本发明讲述的方法可以使任何定向于肿瘤的减毒细菌经过加工而编码本发明的一种或多种融合蛋白以及可选的一种或多种效应分子，从而产生一种可将本发明的融合蛋白和效应分子递送至实体瘤的新颖的定向于肿瘤的减毒细菌。
沙门氏菌等细菌是人或动物体内的一种病原体。脓毒症就是由沙门氏菌引起的一种疾病，由于脓毒性休克的发病会导致很高的死亡率，所以该疾病是一个有待解决的重要课题(Bone，1993，ClinicalMicrobiol.Revs.6：57-68)。因此，为了能在本发明中安全地使用沙门氏菌载体，需要对沙门氏菌等细菌载体的致病性毒力进行减毒。在本申请中，减毒包括对微生物载体进行加工以降低该微生物载体的致病性，这与其传统定义相符，此外还要包括对微生物载体进行加工，使所得微生物载体能够以较低的滴度给药于患者，同时仍获得类似于以较高滴度给予原微生物载体的效果。最终结果是有利于减少因把载体给药于患者而导致毒素性休克或其他副作用的风险。这种减毒细菌可采用多种技术来分离。举例来说，实现减毒的方法可以是去除或破坏那些确保细菌在宿主细胞中，尤其是在巨噬细胞和嗜中性粒细胞中存活的毒力因子的编码DNA序列。这种去除或破坏技术已为本领域所熟知，其中包括，例如，同源重组、化学诱变、放射诱变，或转座子诱变。与在巨噬细胞内存活有关的那些毒力因子通常可以随酸化作用等应激信号或巨噬细胞胞饮等宿主细胞防御机制而在巨噬细胞内特异性表达(Fields et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5189-5193)。国际公开WO96/40238的表4列举了一些沙门氏菌毒力因子的实例，这些因子的缺失可以导致减毒。
沙门氏菌等细菌载体的另一种减毒方法是对导致该细菌具有毒性的取代基进行修饰。举例来说，细菌性脓毒症的病理效应主要是由脂多糖(LPS)或内毒素造成。导致这种反应的LPS组分是脂质A(“LA”)。消除或减轻LA的毒性作用即可获得减毒的细菌，因为1)患者产生脓毒性休克的风险降低，并且2)可以耐受更高水平的细菌载体。
沙门氏菌等细菌的LA含量的改变可通过在LPS生物合成途径中引入突变的方法来实现。目前已在沙门氏菌中确定了LPS生物合成途径的几个酶促步骤和调控这些步骤的基因位点(Raetz，1993，J.Bacteriol.175：5745-5753及其参考文献)，另外还发现了相应的一些突变。例如，其中的一个突变firA是UDP-3-O(R-30羟基肉豆寇酰)-胍基乙酸N-酰基转移酶编码基因中的一种突变，这种酶可调节内毒素生物合成的第三个步骤(Kelley et al.，1993，J.Biol.Chem.268：19866-19874)。带有此类突变的细菌菌株可产生一种与野生型脂质A不同的脂质A，这种脂质A含有一个第7脂肪酸和一个棕榈酸(Roy andColeman，1994，J.Bacteriol.176：1639-1646)。Roy和Coleman指出，firA-突变不但能阻断内毒素生物合成的第三个步骤，而且还可以降低脂质A4’激酶的活性，这种酶可调节脂质A生物合成的第6个步骤。
本发明的细菌载体不但被减毒，而且还可以定向于肿瘤，也就是说，与正常组织、非肿瘤或非肿瘤细胞相比，这些细菌可优先附着、感染肿瘤或肿瘤细胞，并且(或者)可在肿瘤或肿瘤细胞中保持存活。国际公开WO96/40238的第6.1节(第25-32页；定向于肿瘤)和第6.2.2节(第43-51页；减毒)描述了一些获得定向于肿瘤的减毒细菌的适当方法，在此均引入作为参考。由于所得载体具有高度特异性和超感染性，因而随着微生物培养物稀释度的增加，在靶肿瘤或靶肿瘤细胞中出现的感染细菌数量与非癌性对应物中出现的感染细菌数量的差距也越来越大，以至于使用更低滴度的微生物载体也可获得阳性结果。国际公开WO96/40238中讲述的技术也可用来产生定向于肿瘤的减毒沙门氏菌或非沙门氏菌载体。
国际公开WO99/13053中描述的msbB-沙门氏菌突变体是带有LPS途径突变的定向于肿瘤的减毒细菌的一个说明性实例，该专利在此引入作为参考；尤其参考第6.1.2节有关msbB-沙门氏菌突变体特性的描述。msbB-沙门氏菌的特性之一是诱导TNF-α应答的能力低于野生型细菌载体。msbB-沙门氏菌诱导的TNF-α表达水平约为野生型沙门氏菌的5％-40％。
利用商品化的测定系统，如酶联免疫测定(ELISA)系统，可以对完整细菌或分离的LPS或纯化的LPS诱导的TNF-α应答进行体外或体内评定。相对活性用每集落形成单位(“c.f.u.”)的TNF-α产量或基于μg/kg的TNF-α产量来判定。每集落形成单位的TNF-α产量越低，表明诱导TNF-α产生的水平越低。在一项优选实施方案中，msbB-沙门氏菌载体经过加工而含有本发明的一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子。
本发明还包括定向于肿瘤的减毒沙门氏菌msbB-突变体的衍生菌的应用。利用本发明讲述的方法可以使定向于肿瘤的减毒沙门氏菌msbB-突变体的衍生菌经过加工而编码一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子，从而产生一种可将本发明的一种或多种效应分子递送至实体瘤的新颖的定向于肿瘤的减毒细菌。
减毒表型的稳定性十分重要，它使该菌株不会在对患者的治疗过程中回复成一种毒力更强的表型。获得这种稳定性的方法可以是，例如，通过染色体水平上的缺失或其他不可回复的突变来破坏毒力基因，而不是通过上位显性方法。
确保减毒表型的另一种方法是用一种以上的减毒方式对细菌进行加工，例如脂质A产生途径中的一种突变，如msbB-突变(WO99/13053)，以及一种或多种营养物或代谢物的一种或多种营养缺陷型突变，如Bochner，1980，J.Bacteriol.143：926-933描述的尿嘧啶生物合成、嘌呤生物合成和精氨酸生物合成的营养缺陷型突变。在一项优选实施方案中，可编码或表达至少一种初级效应分子的定向于肿瘤的msbB-沙门氏菌同时具有嘌呤的营养缺陷型突变。在某些实施方案中，可编码或表达至少一种初级效应分子的定向于肿瘤的减毒细菌还通过AroA、msbB、PurI或SerC的突变进行减毒。在其他实施方案中，可编码或表达至少一种初级效应分子的定向于肿瘤的减毒细菌还通过AroA、msbB、PurI或SerC的缺失进行减毒。
因此，在本发明的方法中可以用任何定向于肿瘤的减毒细菌来表达并向实体瘤递送一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子。在优选实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌被构建成能够表达一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子。此外，在本发明的方法中可以用任何定向于肿瘤的减毒细菌来表达并向实体瘤递送一种或多种融合蛋白以及可选的一种或多种效应分子。在优选实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌被构建成能够表达一种或多种融合蛋白以及可选的一种或多种效应分子。
5.2.用于肿瘤治疗的初级效应分子
本发明提供用沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌递送初级(或可选的次级)效应分子的方法。本发明的效应分子为蛋白质分子(如蛋白，其中包括，但不局限于，肽、多肽、蛋白、翻译后修饰的蛋白，等等)。本发明还提供本发明所述初级效应分子的编码核酸分子。
初级效应分子可来源于任何已知的生物，其中包括，但不局限于，动物、植物、细菌、真菌，以及原生生物和病毒。在本发明的一项优选实施方案中，使用的初级效应分子来源于一种哺乳动物。在一项更优选的实施方案中，使用的初级效应分子来源于人。本发明的初级效应分子包括TNF家族成员、抗血管生成因子、细胞毒性多肽或肽、肿瘤抑制性酶，及其功能性片段。
在一项特别实施方案中，本发明的初级效应分子为TNF家族成员或其功能性片段。TNF家族成员的实例包括，但不局限于，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、TNF-α相关凋亡诱导配体(TRAIL)、TNF-α相关激活诱导的细胞因子(TRANCE)、TNF-α相关凋亡弱诱导物(TWEAK)、CD40配体(CD40L)、LT-α、LT-β、OX40L、CD40L、FasL、CD27L、CD30L、4-1BBL、APRIL、LIGHT、TL1、TNFSF16、TNFSF17和AITR-L。在一项优选实施方案中，本发明的初级效应分子为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、TNF-α相关凋亡诱导配体(TRAIL)、TNF-α相关激活诱导的细胞因子(TRANCE)、TNF-α相关凋亡弱诱导物(TWEAK)和CD40配体(CD40L)，或其功能性片段。有关综述可参考，例如，Kwon，B.et al.，1999，Curr.Opin.Immunol.11：340-345对TNF家族成员的描述。此外，下表1列举了TNF家族的代表性成员的经典命名和标准命名。在本发明的一项优选实施方案中，本发明的初级效应分子为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、TNF-α相关凋亡诱导配体(TRAIL)、TNF-α相关激活诱导的细胞因子(TRANCE)、TNF-α相关凋亡弱诱导物(TWEAK)和CD40配体(CD40L)。
表1
在另一项特别实施方案中，本发明的初级效应分子为抗血管生成因子或其功能性片段。抗血管生成因子的实例包括，但不局限于，内抑素、制管张素、apomigren、抗血管生成性抗凝血酶III、纤连蛋白的29kDa N-端蛋白水解片段和40kDa C-端蛋白水解片段、uPA受体拮抗剂、催乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的含有24个氨基酸的抗血管生成性片段、被称为13.40的抗血管生成因子、血小板反应蛋白I的含有22个氨基酸的抗血管生成性肽片段、SPARC的含有20个氨基酸的抗血管生成性肽片段、含有RGD和NGR的肽、层粘连蛋白的抗血管生成性小分子肽、纤连蛋白的抗血管生成性小分子肽、前胶原的抗血管生成性小分子肽、EGF的抗血管生成性小分子肽，以及整合蛋白αvβ3的肽拮抗剂和VEGF受体的肽拮抗剂。
在本发明的一项优选实施方案中，本发明的初级效应分子为内抑素。天然的内抑素含有胶原蛋白XVIII的C端～180个氨基酸(两种剪接形式的胶原蛋白的编码cDNA的Genbank编号为AF18081和AF18082)。
在本发明的另一项优选实施方案中，本发明的初级效应分子为纤溶酶原片段(纤溶酶原编码序列的Genbank编号为NM_000301和A33096)。制管张素肽本身含有纤溶酶原的四种kringle结构域，kringle 1到kringle 4。研究表明，重组的kringle 1、2和3具有天然肽的抗血管生成特性，kringle 4不具有这种活性(Cao et al.，1996，J.Biol.Chem.271：29461-29467)。因此，本发明的制管张素效应分子含有至少一种，优选至少一种以上选自kringle 1、kringle2和kringle 3的kringle结构域。在一项特别实施方案中，本发明的初级效应分子是选自40kDa同种型、42kDa同种型和45kDa同种型的一种人制管张素分子或其组合。在另一项实施方案中，使用的初级效应分子为纤溶酶原的kringle 5结构域，它是一种比制管张素更有效的血管生成抑制剂(制管张素含有kringle 1-4结构域)。
在本发明的另一项优选实施方案中，本发明的初级效应分子为抗凝血酶III。抗凝血酶III，此后称为抗凝血酶，含有一种可将其连接于血管壁的肝素结合区和一种与凝血酶相互作用的活性位点环。抗凝血酶与肝素的结合可以使该蛋白产生一种构象变化，从而使活性环能够与凝血酶相互作用，导致凝血酶对该环区进行蛋白水解性剪切。该剪切事件可导致抗凝血酶产生另一种构象变化，这种变化(i)可改变凝血酶与抗凝血酶的相互作用部位，并且(ii)使该复合物与肝素分离(Carrell，1999，Science 285：1861-1862及其参考文献)。O’Reilly等人(1999，Science 285：1926-1928)发现，剪切后的抗凝血酶具有很强的抗血管生成活性。因此，在一项实施方案中，本发明的抗血管生成因子为抗血管生成性抗凝血酶。当利用本发明的方法将该蛋白递送至实体瘤时，可以对细菌载体进行加工，使其表达Genbank编号为NM_000488的全长抗凝血酶和一种蛋白水解酶，该蛋白水解酶可催化抗凝血酶的剪切反应，以产生抗血管生成性蛋白。该蛋白水解酶可选自凝血酶、胰弹性蛋白酶和人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。在一项优选实施方案中，使用的蛋白水解酶为胰弹性蛋白酶。功能性胰弹性蛋白酶的重组表达方法见Shirasu所述(Shirasu et al.，1987，J.Biochem.102：1555-1563)。
在本发明的另一项优选实施方案中，本发明的初级效应分子为纤连蛋白的40kDa和(或)29kDa蛋白水解片段。表达这些片段的载体可以用纤连蛋白前体蛋白的全长核酸编码序列(Genbank编号X02761)和关于编码蛋白成熟方法的叙述由常规方法来产生。在一项优选实施方案中，纤连蛋白的40kDa和(或)29kDa片段是以胞质蛋白的形式由trc启动子调控表达，例如可插入到pTrc99A质粒中。
在本发明的另一项优选实施方案中，本发明的初级效应分子为尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)受体的一种拮抗剂。在一种实施方案中，使用的拮抗剂为uPA的显性失活突变体(参考，例如，Crowley et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5021-5025)。在另一种实施方案中，使用的拮抗剂为肽拮抗剂或其融合蛋白(Goodson et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7129-7133)。在又一种实施方案中，使用的拮抗剂为可溶的显性失活uPA受体(Min et al.，1996，CancerRes.56：2428-2433)。
在本发明的另一项优选实施方案中，本发明的初级效应分子为催乳素的16kDa N-端片段，该片段约含有120个氨基酸，或其生物活性片段(催乳素编码序列的Genbank号为NM_000948)。在一项特别实施方案中，该催乳素片段含有一种Cys58-Ser58突变，从而避免该蛋白形成不必要的二硫键交联。
在本发明的另一项优选实施方案中，本发明的初级效应分子为7.8kDa的血小板因子-4片段，在一项特别实施方案中，这种7.8kDa的血小板因子-4片段是以融合蛋白的形式表达，该融合蛋白的氨基端含有大肠杆菌β-葡糖醛酸糖苷酶的前35个氨基酸。在另一项实施方案中，血小板因子-4的肝素结合性赖氨酸被突变成谷氨酸，所得变异蛋白具有很强的抗血管生成活性(Maione et al.，1991，Cancer Res.51：2077-2083)。血小板因子-4编码序列的Genbank编号为NM_002619。
在本发明的另一项优选实施方案中，本发明的初级效应分子为血小板因子-4的含有13个氨基酸的抗血管生成性小分子肽片段、被称为13.40的抗血管生成因子、血小板反应蛋白I的含有22个氨基酸的抗血管生成性肽片段、SPARC的含有20个氨基酸的抗血管生成性肽片段、层粘连蛋白的抗血管生成性小分子肽、纤连蛋白的抗血管生成性小分子肽、前胶原的抗血管生成性小分子肽、EGF的抗血管生成性小分子肽，或整联蛋白αvβ3的小分子肽拮抗剂或VEGF受体的小分子肽拮抗剂。在一项特别实施方案中，这些小分子肽以串联的方式表达，以提高蛋白的稳定性。除VEGF受体拮抗剂(Soker et al.，1993，J.Biol.Chem.272：31582-31588)之外，其余的小分子肽序列由Cao(1998，Prog.Mol.Subcell.Biol.20：161-176)提供。在一项高度优选的实施方案中，使用的小分子肽含有RGD或NGR基序。在某些实施方案中，含有RGD或NGR的肽是在宿主细菌的表面提供，方法是，例如，将读框中的这种肽的编码核酸与一种或多种OmpA细胞外环的编码核酸进行融合。
在另一项特别实施方案中，本发明的初级效应分子为细胞毒性多肽或肽，或其功能性片段。细胞毒性多肽或肽对细胞具有毒性作用或抑制作用，方法是，例如，通过干扰蛋白合成或扰乱细胞周期来抑制细胞的生长。此类产物的作用机制可以是，剪切rRNA或核糖核蛋白、抑制延伸因子、剪切mRNA，或能够减少蛋白合成从而使细胞无法存活的其他机制。
细胞毒性多肽或肽的实例包括，但不局限于，细菌素家族成员、Vero细胞毒素、细胞毒性坏死因子1(CNF1；如大肠杆菌CNF1和费氏弧菌CNF1)、细胞毒性坏死因子2(CNF2)、多杀巴斯德菌毒素(PMT)、溶血素、法尼基转移酶的强竞争性抑制剂CAAX四肽、皂草素、蓖蔴毒蛋白、相思豆毒蛋白、其他核糖体灭活蛋白(RIPs)、假单孢菌外毒素、DNA合成抑制剂、RNA合成抑制剂、蛋白合成抑制剂、反义核酸、其他代谢抑制剂(如DNA酶和核糖核酸酶等DNA或RNA剪切分子、蛋白酶、脂酶、磷脂酶)、前体药物转化酶(如HSV胸腺嘧啶激酶和细菌胞嘧啶脱氨酶)、光激活卟啉、蓖蔴毒蛋白、蓖蔴毒蛋白A链、玉米RIP、gelonin、细胞致死性膨胀毒素、白喉毒素、白喉毒素A链、天花粉蛋白、tritin、美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、Mirabilis抗病毒蛋白(MAP)、Dianthins 32和30、相思豆毒蛋白、monodrin、bryodin、志贺菌毒素、黄瓜籽中的一种蛋白生物合成催化抑制剂(参考，例如，国际申请WO93/24620)、假单孢菌外毒素、大肠杆菌热不稳定毒素、大肠杆菌热稳定毒素、EaggEC稳定毒素-1(EAST)、细胞毒素的生物活性片段，以及本领域技术人员了解的其他细胞毒性多肽或肽。有关大肠杆菌及沙门氏菌毒素的综述可参考，例如，O′Brian and Holmes，ProteinToxins of Escherichia coli and Salmonella in Escherichia andSalmonella.Cellular and Molecular Biology，Neidhardt et al.(eds.)，pp.2788.2802，ASM Press，Washington，D.C.
在一项优选实施方案中，使用的初级效应分子为细菌素家族成员(参考，例如，Konisky，1982，Ann.Rev.Microbiol.36：125-144)，条件是该细菌素家族成员不是一种细菌素释放蛋白(BRP)。细菌素家族成员的实例包括，但不局限于，ColE1、ColE1a、ColE1b、ColE2、ColE3、ColE4、ColE5、ColE6、ColE7、ColE8、ColE9、大肠杆菌素A、大肠杆菌素K、大肠杆菌素L、大肠杆菌素M、阴沟肠道菌素DF13、鼠疫菌素A1122、葡萄球菌素1580、丁酸梭菌素7423、脓菌素R1或AP41、巨杆菌素A-216、微生物素和弧菌素(Jayawardene and Farkas-Himsley，1970，J.Bacteriology Vol.102pp 382-388)。尽管大肠杆菌素A、E1、E2、Ia、Ib、K、L和M也可作为适当的初级效应分子，但最优选的初级效应分子为大肠杆菌素E3或V(参考，例如，Konisky，1982，Ann.Rev.Microbiol.36：125-144)。在该实施方案中，另一种优选的细菌素为阴沟肠道菌素，最优选的是阴沟肠道菌素DF13。
在一项优选实施方案中，使用的初级效应分子为ColE1、ColE2、ColE3、ColE4、ColE5、ColE6、ColE7、ColE8、ColE9。研究表明，大肠杆菌素E3(ColE3)对哺乳动物细胞具有深度细胞毒性作用(Smardaet al.，1978，Folia Microbiol.23：272-277)，其中包括对一种白血病细胞模型系统的深度细胞毒性作用(Fiska et al.，1978，Experimentia 35：406-40)。ColE3细胞毒性是一种通过抑制80S核糖体来终止蛋白合成的功能(Turnowsky et al.，1973，Biochem.Biophys.Res.Comm.52：327-334)。更详细地说，ColE3具有核糖核酸酶活性(Saunders，1978，Nature 274：113-114)。天然形式的ColE3是一种60kDa的蛋白复合物，含有比率为1∶1的一种50kDa蛋白和一种10kDa蛋白，较大的亚基具有核酸酶活性，而较小的亚基具有抑制50kDa亚基的功能。所以50kDa的蛋白可作为一种细胞毒性蛋白(或毒素)，而10kDa的蛋白可作为一种抗毒素。因此，在一项实施方案中，当利用ColE3作为次级效应分子时，可以单独表达或以高于较小亚基的水平表达较大的ColE3亚基或其活性片段。本发明的另一项实施方案是用单一的质粒在沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌中编码ColE3的50kDa毒素和10kDa抗毒素。在该实施方案中，毒素/抗毒素可作为带有质粒的沙门氏菌的一种筛选系统，该系统可通过毒素将质粒缺失的沙门氏菌杀死。在另一项实施方案中，10kDa抗毒素位于染色体上，而colE3毒素位于质粒上，二者彼此分离，从而可阻碍向其他细菌传播(见上文第5.6节)。
在另一项优选实施方案中，使用的初级效应分子为阴沟肠道菌素DF13。阴沟肠道菌素DF13的作用方式与ColE3类似。该蛋白复合物的分子量为67kDa。其单一组分的大小为57kDa和9kDa。DF13具有核糖核酸酶活性，此外还可导致细胞的钾离子渗漏。
在另一项优选实施方案中，使用的初级效应分子为大肠杆菌素V(Pugsley，A.P.and Oudega，B.″Methods for Studying Colicinsand Their Plasmids″in Plasmids，a Practical Approach 1987，ed.By K.G.Hardy；Gilson，L.et al.EMBO J.9：3875-3884)。
在另一项实施方案中，使用的初级效应分子为大肠杆菌素E2(与ColE3结构类似的一种双亚基大肠杆菌素，但具有内切核酸酶活性，而不是核糖核酸酶活性)；可形成离子渗透通道，从而破坏细胞质子运动力并引起细胞死亡的大肠杆菌素A、E1、Ia、Ib或K；可抑制蛋白、DNA及RNA合成的大肠杆菌素L；可改变细胞的渗透环境并导致细胞脓毒的大肠杆菌素M；作用方式与大肠杆菌素B类似的鼠疫菌素A1122；葡萄球菌素1580，一种成孔细菌素；可通过未知的靶作用物而间接抑制RNA、DNA及蛋白合成的丁酸梭菌素7423；可通过呼吸作用与溶质运输的解偶联来杀死细胞的脓菌素P1或类似于噬菌体尾蛋白的蛋白；作用方式类似于大肠杆菌素E2的脓菌素AP41；或能引起细胞内物质渗漏的一种磷脂酶，巨杆菌素A-216(有关细菌素的综述，可参考Konisky，1982，Ann.Rev.Microbiol.36：125-144)；大肠杆菌素A(Pugsley，A.P.andOudega，B.″Methods for Studying Colicins and TheirPlasmids″in Plasmids，a Practical Approach 1987，ed.By K.G.Hardy).
因此，初级效应分子可包括文中描述的或本领域已知的任何细菌素，条件是该细菌素不是一种细菌素释放蛋白。
在另一项特别实施方案中，本发明的初级效应分子为肿瘤抑制性酶或其功能性片段。肿瘤抑制性酶的实例包括，但不局限于，甲硫氨酸酶、天冬酰胺酶、脂酶、磷脂酶、蛋白酶、核糖核酸酶、DNA酶和糖苷酶。在一项优选实施方案中，使用的初级效应分子为甲硫氨酸酶。
本发明的初级效应分子可用于，例如，治疗或预防实体瘤，如癌、黑色素瘤、淋巴瘤或肉瘤。
本发明提供可编码一种初级效应分子的核酸分子。本发明还提供可编码一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子的核酸分子。本发明提供可编码本发明的效应分子并且与一种适当的启动子可操作性连接的核酸。这些编码效应分子的核酸可以和任选的参与转录、翻译、定位、稳定性等等的元件进行可操作性连接。
编码一种初级效应分子的核酸分子的长度约为6-100,000个碱基对。优选的是该核酸的长度约为20-50,000个碱基对。更优选的是该核酸分子的长度约为20-10,000个碱基对。再更优选的是该核酸分子的长度约为20-4000个碱基对。
5.3.与初级效应分子共表达的次级效应分子
在本发明的某些实施方案中，初级效应分子(如TNF家族成员、细胞毒性肽或多肽、抗血管生成因子，或肿瘤抑制性酶)可以在细菌载体中选择性地与另一种分子即次级效应分子共表达。次级效应分子可以提供额外的治疗功能和(或)促进修饰的细菌载体(能够表达至少一种初级效应分子和可选的一种或多种次级效应分子)将内容物释放至周围环境。文中使用的术语“额外的治疗功能”是指，次级效应分子可提供一种对肿瘤的附加或协同作用、细胞抑制作用，或细胞毒性作用，如初级效应分子作用之外的作用。因而次级效应分子可作为一种额外的治疗因子和(或)释放因子来发挥作用。优选的是，无论作为治疗因子还是释放因子(或两者都是)，次级效应分子都可以在预定部位，即肿瘤部位，被优先地或特异性地激活或表达。在某些实施方案中，使用的次级效应分子可具有两种功能，即促进细菌内容物的释放(如通过促进细菌裂解或准裂解)和提供治疗功能(如通过对肿瘤细胞的细胞毒性)。在某些非限制性实施方案中，次级效应分子的细胞毒性可以由患者的免疫系统来介导；而这种次级效应分子可以具有免疫调节剂的作用。
在本发明的某些实施方案中，本发明的定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达至少一种具有抗肿瘤活性的次级效应分子，也就是说，该次级效应分子的表达可导致肿瘤或肿瘤细胞的死亡，或可抑制其生长。
本发明的次级效应分子可以是蛋白分子或核酸分子。核酸分子可以是双链或单链DNA或双链或单链RNA，也可以是三链核酸分子。这些核酸分子可以具有核酶或反义核酸等的作用。
反义核酸是能够以序列特异性方式与mRNA或DNA等核酸结合的寡核苷酸。当反义核酸与含有互补序列的mRNA结合时可阻碍该mRNA翻译(参考，例如，美国专利5,168,053；5,190,931；5,135,917和5,087,617)。三链核酸分子是指能够与双链DNA结合成一种共线三链分子并由此阻碍转录的单链DNA(参考，例如，美国专利5,176,996)。
核酶是一种RNA分子，它能够特异性剪切RNA底物，如mRNA，从而抑制或干扰细胞的生长或表达。至少有5种已知类型的核酶可参与RNA链的剪切和(或)连接。核酶可作用于任何RNA转录体，并能够催化剪切这些转录体(参考，例如，美国专利5,272,262；美国专利5,144,019；和美国专利5,168,053、5,180,818、5,116,742和5,093,246)。
与上文有关初级效应分子的叙述相同，本发明提供的编码次级效应分子或含有次级效应分子的核酸均可操作性连接了一种选定的启动子，并且还可以选择性地与其他参与转录、翻译、定位、稳定性等等的元件进行可操作性连接。此外，次级效应分子的表达可采用与初级效应分子相同的启动子和内部核糖体结合位点，也可以采用与初级效应分子不同的启动子。
编码次级效应分子的核酸分子的长度约为6-100,000个碱基对。优选的是该核酸分子的长度约为20-50,000个碱基对。更优选的是该核酸分子的长度约为20-10,000个碱基对。再更优选的是该核酸分子的长度约为20-4,000个碱基对。
可编码次级效应分子的效应分子核苷酸序列已众所周知(见GenBank)。次级效应分子的编码核酸分子可通过标准方法来分离，如扩增(如PCR)、基因组库或cDNA库的探针杂交、表达库的抗体筛选，或化学合成，或由商品来源或其他来源获得，其中的次级效应分子是一种细胞毒性因子或细胞抑制因子，或其生物活性片段、变异体或衍生物。
用于按文中所述方法使用的核酸分子和寡核苷酸可通过本领域技术人员已知的任何方法来合成(参考，例如，国际公开WO93/01286、美国专利5,218,088；5,175,269；和5,109,124)。可作为反义制剂使用的寡核苷酸及核酶的鉴定方法已为本领域所熟知。
5.3.1.具有额外治疗功能的因子
在本发明的某些实施方案中，本发明的定向于肿瘤的减毒细菌载体可表达至少一种初级效应分子，优选的是该细菌载体为沙门氏菌载体，该细菌载体还可以表达至少一种具有抗肿瘤活性的次级效应分子，也就是说，该次级效应分子的表达可导致肿瘤或肿瘤细胞的死亡，或可抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长或肿瘤细胞的扩散，从而提高初级效应分子的细胞毒性作用或细胞抑制作用。在一项实施方案中，次级效应分子对肿瘤的作用可作为初级效应分子的作用的补充。在一项优选实施方案中，次级效应分子的作用具有超附加或协同性，也就是说，要高于单独给药的初级效应分子和次级效应分子的作用总和。
在某些实施方案中，使用的次级效应分子对细胞具有毒性作用或抑制作用，方法是通过干扰蛋白合成或扰乱细胞周期来抑制细胞的生长。此类产物的作用机制可以是，例如，剪切rRNA或核糖核蛋白、抑制延伸因子、剪切mRNA，或能够减少蛋白合成从而使细胞无法存活的其他机制。这种次级效应分子的实例包括，但不局限于，皂草素、蓖蔴毒蛋白、相思豆毒蛋白和其他核糖体失活蛋白(RIPs)。
在另一项实施方案中，使用的次级效应分子是一种前体药物转化酶或其编码核酸，即能够调节药物的化学性质从而产生一种细胞毒性剂的酶。在Pawelek等人的WO96/40238第33页和表2中列举了一些前体药物转化酶的说明性实例，在此引入作为参考。WO96/40238还讲述了一些方法，用于产生含有这种前体药物转化酶的分泌型融合蛋白。根据本发明，前体药物转化酶如果与BRP(见上文第5.3.2节)等释放因子共表达则可以不是分泌蛋白。在一项特别实施方案中，使用的前体药物转化酶是能够作用于丝裂霉素C和甲基丝裂霉素的细胞色素p450NADPH氧化还原酶(Murray et al.，1994，J.Pharmacol.Exp.Therapeut.270：645-649)。在另一项实施方案中，次级效应分子与BRP等释放因子共表达，并且可导致辅因子(如NADH、NADPH、ATP等)的释放，这些辅因子可提高前体药物转化酶的活性。在该实施方案中，另一种方式是次级效应分子与BRP等释放因子共表达，并且可导致激活药物(例如在细菌胞质或周质中激活，然后由细菌载体释放的一种药物)的释放。
在另一项实施方案中，使用的次级效应分子是诱导型一氧化氮合酶(NOS)或内皮一氧化氮合酶的一种抑制剂。一氧化氮(NO)被认为参与了血管生长的调节以及动脉硬化。NO是由一氧化氮合酶(NOS)作用于L-精氨酸而形成，它可以调节免疫应答、炎性反应和心血管反应。
在另一项实施方案中，使用的次级效应分子可通过抑制参与细胞增殖的蛋白的产生或活性来形成对细胞的毒性作用或抑制作用，如癌基因或生长因子(如bFGF、int-2、hst-1/K-FGF、FGF-5、hst-2/FGF-6、FGF-8)或细胞受体或配体。这种抑制可以在转录或翻译水平上进行(由一种次级效应分子介导，该次级效应分子是一种核酶或三链DNA)，也可以在蛋白活性水平上进行(由一种次级效应分子介导，该次级效应分子是生长因子途径的一种抑制剂，如一种显性失活突变体)。
在另一项实施方案中，使用的次级效应分子是一种细胞因子、趋化因子或免疫调节蛋白，或其编码核酸，如白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-10(IL-10)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)、内皮单核细胞激活蛋白-2(EMAP2)、GM-CSF、IFN-γ、IFN-α、MIP-3α、SLC、MIP-3β或一种MHC基因，如HLA-B7。递送这种免疫调节效应分子可以对免疫系统进行调节，从而提高宿主潜在的抗肿瘤免疫力。作为选择，也可以递送共刺激分子如CD28和CTLA-4的配体B7.1和B7.2的编码核酸分子来增强T细胞介导的免疫。另一种免疫调节剂为α-1，3-半乳糖基转移酶，这种酶在肿瘤细胞上表达可产生补体介导的杀细胞作用。此外，另一种免疫调节剂为肿瘤相关抗原，即由肿瘤细胞特异性表达，而非癌性对应细胞不表达的一种分子，或在肿瘤细胞中的表达水平高于非癌性对应细胞的一种分子。肿瘤相关抗原的说明性实例在Kuby，Immunology，W.H.Freeman and Company，New York，NY，1st Edition(1992)，pp.515-520中有所描述，该文献在此引入作为参考。肿瘤相关抗原的其他实例已为本领域技术人员所了解。
在另一项实施方案中，使用的次级效应分子为Flt-3配体或其编码核酸。在另一项实施方案中，使用的次级效应分子为BRP。
在一项特别实施方案中，当初级效应分子为TNF家族成员时，则次级效应分子不使用TNF家族成员。在另一项特别实施方案中，当初级效应分子是一种抗血管生成因子时，则次级效应分子不使用抗血管生成因子。在另一项特别实施方案中，当次级效应分子是一种细胞毒性肽或多肽时，则次级效应分子不使用细胞毒性肽或多肽。在另一项特别实施方案中，当初级效应分子是一种肿瘤抑制性酶时，则次级效应分子不使用肿瘤抑制性酶。
5.3.2.可促进抗肿瘤效应分子释放到肿瘤环境中的因子
在本发明的其他一些实施方案中，本发明的定向于肿瘤的减毒细菌载体可表达至少一种初级效应分子，优选的是该细菌载体为沙门氏菌载体，该细菌载体还可以表达至少一种次级效应分子，该次级效应分子能够使细菌的细胞膜具有渗透性，或能够促进细胞内成分释放到细胞外环境中，如肿瘤部位，从而加强初级效应分子和(或)次级效应分子的递送。能够使细菌具有渗透性或能够促进释放的这种次级效应分子被称为“释放因子”。在某些实施方案中，释放因子的优点是同时具有抗肿瘤活性。
由本发明的细菌载体表达的释放因子可以是修饰后的定向于肿瘤的减毒细菌的内源因子，也可以是外源因子(例如由定向于肿瘤的减毒细菌本身不具有的一种核酸来编码)。释放因子可以由质粒等核酸来编码，也可以由整合到定向于肿瘤的减毒细菌基因组中的核酸来编码。释放因子可以由编码初级效应分子的同一核酸或质粒来编码，也可以由不同的核酸或质粒来编码。释放因子可以由编码次级效应分子的同一核酸或质粒来编码，也可以由不同的核酸或质粒来编码。在一项实施方案中，释放因子的表达是在一种细胞中进行，该细胞还能表达一种含有初级效应分子和Omp样蛋白的融合蛋白。在该实施方案中，释放因子的共表达能够促进该融合蛋白从周质空间释放。
在一项优选实施方案中，使用的释放因子为细菌素释放蛋白，或BRPs(此后在分类上称为BRP)。本发明使用的BRP可来自本领域已知的任何来源，其中包括，但不局限于，阴沟肠道菌素DF13质粒、大肠杆菌素E1-E9质粒，或大肠杆菌素A、N或D质粒。在一项优选实施方案中，使用的BRP来自阴沟肠道菌素DF13(pCloDF13BRP)。
BRPs通常为45-52个氨基酸的肽，最初合成的是前体分子(PreBRP)，其中含有未被信号内肽酶剪切的信号序列。BRP的活性至少有一部分是由洗涤剂抗性外膜磷脂酶A(P1dA)来介导的，这种活性通常伴有外膜磷脂降解的加强(有关BRPs的综述可参考van der Wal etal.，1995，FEMS Microbiology Review 17：381-399)。在不受原理限制的前提下，BRP可促进周质成分优先释放，但也可检测到较低程度的胞质成分释放。当BRP被适度过表达时可以使细菌膜变得脆弱，从而导致准裂解状态和胞质成分的高度释放。此外，当BRP被超高水平地过表达时可导致细菌细胞裂解，这样就可通过裂解释放来递送细胞内容物。在该实施方案中，BRP的表达可以与BRP活性(如细菌内容物的释放)相关联。例如，超高水平的BRP活性可导致几乎所有的细菌细胞裂解。因此，文中使用的“超高水平的表达”被定义为可导致几乎所有的细菌发生裂解的BRP表达水平。与不表达BRP的对照菌相比，适度的BRP活性可伴有细菌内容物的部分释放或释放加强，但不导致细菌裂解。因此，在该实施方案中，BRP的适度过表达被定义为可加强胞质成分释放但不会导致几乎所有的细菌发生裂解的表达水平。文中使用的“几乎所有的细菌”是指60％以上的细菌，优选的是70％以上的细菌，更优选的是80％以上的细菌，再更优选的是90％以上的细菌，最优选的是90-100％的细菌。
在本发明的一项特别实施方案中，使用的BRP蛋白为pCloDF13BRP突变体，这种突变体的裂解功能已经与蛋白释放功能解偶联，因而可在不导致细菌裂解的情况下加强蛋白的释放(van der Wal et al.，1998，App.Env.Microbiol.64：392-398)。该实施方案可延长细菌载体的蛋白释放，同时可减少将载体频繁给药的要求。在另一项特别实施方案中，本发明的BRP为C-端缩短的pCloDF13BRP，这种BRP不但能引起蛋白释放，还可以导致细胞裂解(Luirink et al.，1989，J.Bacteriol.171：2673-2679)。
在本发明的另一项实施方案中，使用的增强释放系统包括一种孔蛋白的过表达；可参考，例如，Sugawara，E.and Nikaido，H.，1992，J.Biol.Chem.267：2507-11。
在某些实施方案中，当BRP是由本发明的细菌载体表达时，这种BRP可以是修饰后的定向于肿瘤的减毒细菌的内源分子，也可以是外源分子(例如由定向于肿瘤的减毒细菌本身不具有的一种核酸来编码)。BRP可以由质粒等核酸来编码，也可以由整合到定向于肿瘤的减毒细菌基因组中的核酸来编码。BRP可以由编码初级效应分子的同一核酸或质粒来编码，也可以由不同的核酸或质粒来编码。BRP可以由编码次级效应分子的同一核酸或质粒来编码，也可以由不同的核酸或质粒来编码。在一项实施方案中，BRP样蛋白的表达是在一种细胞中进行，该细胞还能表达一种含有效应分子和Omp样蛋白的融合蛋白。在该实施方案中，BRP的共表达能够促进该融合蛋白的释放。
在本发明的一项特别优选实施方案中，BRP的编码核酸是由一种大肠杆菌素质粒来编码。在本发明的另一项特别实施方案中，BRP编码核酸的表达是在天然BRP启动子的调控下进行，该启动子是一种能够在正常宿主内(BRP的正常宿主，阴沟肠球菌)对应激条件(例如紫外光等可导致DNA损伤的条件)起反应的SOS启动子，并且也是沙门氏菌中的部分组成型启动子。在一项优选实施方案中，BRP编码核酸的表达是在pepT启动子的调控下进行，该启动子可以反应于肿瘤环境的无氧性质而被激活(参考，例如，Lombardo et al.，1997，J.Bacteriol.179：1909-17)。
作为选择，使用的启动子也可以是抗生素诱导型启动子，如Tn10转座子的tet启动子。在一项优选实施方案中，使用的tet启动子为单体形式，这种单体可以对存在的四环素或其类似物，如强力霉素和无水四环素，产生全或无的反应，因而可形成一种具有遗传稳定性的开闭开关。在另一项实施方案中，使用的tet启动子为多体形式，例如三体形式。这种多体启动子可以对存在的四环素产生分级的反应，因而可形成一种用于控制效应分子水平的更具有操作性的系统。当利用本发明的定向于肿瘤的减毒细菌对受试者进行处理后，可将适当剂量的四环素给药于该受试者，以诱导启动子的活性。最初描述的tet诱导型表达系统是用于非洲粟酒裂殖酵母(Faryar and Gatz，1992，Current Genetics 21：345-349)等真核系统以及哺乳动物细胞(Langand Feingold，1996，Gene 168：169-171)，而最近的研究使其适用性扩展到细菌细胞。例如，Stieger等人(1999，Gene 226：243-252)已证明，当萤火虫萤光素酶基因与tet启动子可操作性连接后，可通过tet诱导获得80倍的诱导作用。该启动子的优势在于，它可以在极低的四环素水平下被诱导，该水平约为抗生素活性所需剂量的十分之一。
5.4.衍生物和类似物
本发明还包括经过加工可编码或递送一种衍生物的细菌载体，这些衍生物包括，但不局限于，初级效应分子和(或)次级效应分子或其编码核酸的片段、类似物或变异体。这些衍生物、类似物或变异体具有功能活性，例如可表现出全长野生型效应分子的一种或多种功能活性。这种具有预期治疗特性的衍生物、类似物或变异体可用于，例如，抑制肿瘤的生长或肿瘤细胞的扩散(转移)。利用本领域已知的方法，包括本文描述的方法，可以对所需的效应分子的衍生物或类似物的活性进行测定。
详细地说，变异体的制备方法可以是，通过取代、添加(如插入)或去除来改变效应分子的编码序列，使所得分子与野生型效应分子相比具有相同的或更高的抗肿瘤功能。例如，本发明的变异体包括，但不局限于，一级氨基酸序列中含有一种效应分子的全部或部分氨基酸序列，并且该氨基酸序列中含有改变的序列的那些分子，改变序列的残基被功能上等价的在序列中导致沉默改变的氨基酸残基取代，即被改变序列至少含有一个保守取代。
利用本领域已知的方法可以使任何来源于哺乳动物的初级效应分子或次级效应分子的编码核酸经过加工而采用细菌的密码子。优选密码子使用的实例见Current Protocols in Molecular Biology，GreenPublishing Associates，Inc.，and John Wiley & Sons，Inc.NewYork，和Zhang et al.，1991，Gene 105：61-72。
在一项特别实施方案中，初级效应分子或次级效应分子的衍生物、类似物或变异体含有一种核苷酸序列，该序列能够与编码初级效应分子或次级效应分子或其片段的核苷酸序列杂交，杂交条件为严格条件，例如在约45℃的6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与结合到滤膜上的DNA杂交，然后在约50-65℃的0.2×SSC/0.1％SDS中清洗一次或多次，或高度严格条件，例如在约45℃的6×SSC中与结合到滤膜上的核酸杂交，然后在约68℃的0.1×SSC/0.2％SDS中清洗一次或多次，或本领域技术人员已知的其他严格杂交条件(可参考，例如，Ausubel，F.M.et al.，eds.，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.I，Green Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，New York的第6.3.1-6.3.6页和第2.10.3页)。
初级效应分子或次级效应分子的衍生物或类似物包括，但不局限于，含有与初级效应分子或次级效应分子或其片段基本同源的区域的分子(例如，在不同实施方案中，与不含任何插入或缺失的相同长度的氨基酸序列相比，或与对比序列相比，至少有60％或70％或80％或90％或95％的同一性，其中的对比是由本领域已知的计算机同源性比较程序来完成)，或其编码核酸能够在高度严格条件、中度严格条件或低度严格条件下与一种效应分子蛋白的效应分子编码序列杂交的分子。
为了确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的同一性百分率，例如一种初级效应分子序列与另一种已知序列间的同一性百分率，可以将两种序列进行对比，以获得最优的比较结果(例如可以在第一种氨基酸序列或核酸序列中引入空位，以获得与第二种氨基酸序列或核酸序列的最优对比)。然后将对应氨基酸位置或对应核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一种序列的一个位置与第二种序列的对应位置是由相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，这两种分子在该位置相同。两种序列间的同一性百分率是这两种序列共有的相同位置数量的函数(即，同一性百分率＝相同位置的数量/位置(如重叠位置)的总数量×100)。在一项实施方案中，这两种序列的长度相同。
两种序列间的同一性百分率可以用一种数学算法来确定。可用来比较两种序列的数学算法的一个非限制性优选实例是Karlin andAltschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268描述的算法，在Karlin and Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877中对该算法进行了修改。这种算法被整合到Altschul，et al.，1990，J.Mol.Biol.215：403-410描述的NBLAST和XBLAST程序中。以评分＝100、字长＝12为参数用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，即可获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。以评分＝50、字长＝3为参数用XBLAST程序进行BLAST蛋白搜索，即可获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得有空位的对比来进行比较，可以按Altschul et al.，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402所述使用Gapped BLAST程序。作为选择，也可以用PSI-Blast程序进行迭代搜索，以检测分子间的距离关系(Id.)。当使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序时，可以采用这些程序(如XBLAST和NBLAST)各自的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。可用于序列比较的数学算法的另一个非限制性优选实例是Myers and Miller，CABIOS(1989)描述的算法。该算法被整合到ALIGN程序(2.0版本)中，该程序是GCG序列对比软件包的一部分。当利用ALIGN程序进行氨基酸序列比较时，可以采用PAM120权重残基表，并将空位长度罚分设为12，空位罚分设为4。用于序列分析的其他算法已为本领域所熟知，其中包括Torellis and Robotti，1994，Comput.Appl.Biosci.，10：3-5中描述的ADVANCE和ADAM；以及Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-8中描述的FASTA。在FASTA程序中，ktup是一个控制选项，该选项可设置搜索的灵敏度和速度。如果ktup＝2，则是通过寻找对比残基对来发现两种比较序列中的相似区域；如果ktup＝1，则是检测单个排列的氨基酸。比较蛋白序列时可将ktup设为2或1，比较DNA序列时可设为1-6。如果不设定，则比较蛋白序列的默认ktup为2，比较DNA序列的默认ktup为6。有关FASTA程序的其他描述，可参考http://bioweb.pasteur.fr/docs/man/man/fasta.1.thml#sect2，其内容在此引入作为参考。
作为选择，还可以用Higgins et al.，1996，Methods Enzymol.266：383-402描述的CLUSTAL W算法来进行蛋白序列比较。
两种序列间的同一性百分率可以用类似于上文所述的允许空位或不允许空位的技术来确定。在计算同一性百分率时，只计算完全匹配的情况。
初级效应分子或次级效应分子，或其衍生物或类似物可通过本领域已知的不同方法来产生。可产生这些分子的操作可以在核酸水平上进行，也可以在蛋白水平上进行。举例来说，可以用本领域已知的多种策略对，例如，编码例如一种效应分子的一种克隆的效应分子编码序列进行修饰(Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。可以在适当的部位用限制性内切核酸酶将序列剪切，如果需要，还可以进行其他的酶促修饰，然后进行分离和体外连接。当产生一种可编码初级效应分子或次级效应分子的衍生物或类似物的改进型效应分子时，应注意确保改进型效应分子的编码序列在编码所需初级效应分子或次级效应分子活性的效应分子编码序列区中仍能够保持与天然蛋白相同的翻译读框，并且未被翻译终止信号打断。
此外还可以对编码效应分子的核酸序列进行体外或体内突变，以产生和(或)破坏翻译序列、起始序列和(或)终止序列，或在编码区内产生变异，以及(或者)形成新的或破坏原有的限制性内切核酸酶位点，从而有利于其他体外修饰。在一项特别优选实施方案中，一种效应分子的编码核酸序列经过突变可以，例如，产生一种更有效的变异体。本领域已知的任何诱变技术均可以使用，其中包括，但不局限于，化学诱变、体外定点诱变(Hutchinson et al.，1978，J.Biol.Chem.253：6551)、使用
接头(Pharmacia)、用含有突变的引物进行PCR，等等。在一项优选实施方案中，对一种效应分子的一个或多个预测的非必需氨基酸残基进行了保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是指，把氨基酸残基替换成一种所带侧链具有类似电荷的氨基酸残基。本领域已经对所带侧链具有类似电荷的氨基酸残基家族进行了定义。这些家族包括，带有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、带有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、带有不带电荷的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、带有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、带有β分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和带有芳香族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。作为选择，也可以通过，例如，饱和诱变方法在全部或部分编码序列中随机引入突变，然后对所得突变体的生物活性进行筛选，以鉴定出仍具有活性的突变体。诱变完成后，可以表达编码的蛋白，并测定该蛋白的活性。
在另一项实施方案中，本发明的效应分子或融合蛋白经过构建而含有一种蛋白酶切位点。
5.5.融合蛋白
在某些实施方案中，本发明提供以融合蛋白(例如与一种不同的蛋白共价结合)的形式构建的初级效应分子或次级效应分子。本发明提供这些融合蛋白的编码核酸。在本发明的其他一些实施方案中，本发明的融合蛋白编码核酸与一种适当的启动子可操作性连接。
在一项特别实施方案中，效应分子被构建成一种嵌合蛋白或融合蛋白，该蛋白含有一种效应分子或其片段(优选由该效应分子的至少一种结构域或基序组成，或由该效应分子的至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个，或至少100个氨基酸组成)，并且通过肽键在效应分子或其片段的氨基端或羧基端与一种不同蛋白的氨基酸序列连接。在特别实施方案中，融合蛋白含有一种异源多肽或其有活性功能的片段的至少2个、至少6个、至少10个、至少20个、至少30个、至少50个、至少75个，或至少100个连续氨基酸。在一项实施方案中，这种融合蛋白或嵌合蛋白的产生方法是将与一种不同蛋白的编码序列按读框连接的初级效应分子的编码核酸(如TNF-编码序列、抗血管生成因子编码序列、肿瘤抑制性酶编码序列，或细胞毒性多肽编码序列)进行重组表达。这种嵌合产物的制备方法可以是，利用本领域已知的方法将编码所需氨基酸序列的适当核酸序列按适当的读码框彼此连接，并利用本领域众所周知的方法在选定的表达载体中表达该嵌合产物。构建的嵌合核酸可含有与任何异源多肽编码序列融合的一种效应分子的部分编码核酸。有一项特别实施方案涉及一种嵌合蛋白，该蛋白含有初级效应分子或次级效应分子的至少5个、至少10个、至少25个、至少50个，或至少100个氨基酸的一种片段，或含有一种可表现出全长初级效应分子或全长次级效应分子的一种或多种功能活性的片段。
在一项特别实施方案中，使用的融合蛋白含有一种亲和标记，如六聚组氨酸标记或用于纯化、分离、鉴定或表达测定的其他亲和标记。在另一项特别实施方案中，融合蛋白含有一种蛋白酶切位点，如金属蛋白酶切位点或丝氨酸酶切位点。在该实施方案中，有时优选的是在本发明的融合蛋白中构建一种能够在肿瘤部位具有活性的蛋白酶的相应酶切位点。在一些实施方案中，是将效应分子与一种Omp样蛋白或其片段(如信号序列、前导序列、周质区、跨膜结构域、多跨膜结构域，或其组合，见上文第3.1节对“Omp样蛋白”的定义)构建成一种融合蛋白。
在一项优选实施方案中，本发明的效应分子(初级或次级)是以一种具有外膜蛋白(Omp样蛋白)的融合蛋白的形式表达。细菌外膜蛋白是细菌外膜的整合膜蛋白，该蛋白具有多跨膜结构域，并且常连接有一个或多个脂部分。最初表达的外膜蛋白是含有氨基端信号肽的前体形式(pro-Omp)，该信号肽可以将蛋白导向膜，然后在膜上被信号肽酶剪切，从而产生成熟蛋白。在一项实施方案中，是将效应分子与一种Omp样蛋白构建成一种融合蛋白。在该实施方案中，初级效应分子向细菌外膜的递送被加强。尽管不希望受到原理的限制，但本发明人认为Omp样蛋白可作为效应分子与外膜之间的一种锚定物或接接物，或可用来使效应分子定位于细菌外膜。在一项实施方案中，效应分子与Omp样蛋白的融合蛋白被用来促进效应分子定位于周质。在另一项实施方案中，效应分子与Omp样蛋白的融合蛋白被用来促进效应分子的释放。在特别实施方案中，使用的Omp样蛋白至少含有OmpA、OmpB、OmpC、OmpD、OmpE、OmpF、OmpT、孔蛋白样蛋白、PhoA、PhoE、lamB、β-内酰胺酶、一种肠毒素、蛋白A、内切葡聚糖酶、肽聚糖相关脂蛋白(PAL)、FepA、FhuA、NmpA、NmpB、NmpC，或一种主要的外膜脂蛋白(如LPP)等的一部分。在本发明的某些实施方案中，构建的信号序列具有更强的疏水性(例如在信号序列中插入或将其中的氨基酸取代成疏水性氨基酸，如亮氨酸)。说明性实施例见下文的第7.1-7.4节。
在本发明的另一项实施方案中，本发明的融合蛋白含有一种蛋白水解性剪切位点。该蛋白水解性剪切位点可以是效应分子的内源位点，也可以是Omp样蛋白的内源位点，还可以是构建到融合蛋白中的蛋白水解性剪切位点。在某些实施方案中，本发明的Omp样蛋白是含有来自不同蛋白的结构元件的杂合Omp。
在作为举例的实施方案中，Omp样蛋白为OmpA；构建OmpA样融合蛋白的原理也同样适用于其他Omp融合蛋白，但要注意特定Omp样蛋白的构型。
例如，天然OmpA蛋白在其170个氨基酸的N-端蛋白结构域中含有8个反平行跨膜β-链。在每对跨膜结构域之间是细胞外环或细胞内环，这取决于跨膜结构域的插入方向。由155个氨基酸组成的C-端结构域位于细胞内，并可能与充满周质空间的肽聚糖接触。目前已获得了利于产生OmpA融合蛋白的表达载体。例如，Hobom等人(1995，Dev.Biol.Strand.84：255-262)开发了一种载体，该载体含有OmpA开放读码框架，并且在第三或第四细胞外环的编码序列中插入了接头，从而能够按读框插入选定的异源蛋白。
在本发明的一项实施方案中，OmpA融合蛋白的含初级效应分子部分在周质中的表达加强。在该实施方案的一方面，成熟前的融合蛋白在初级效应分子N-端含有信号序列或至少连接了一个OmpA跨膜结构域的信号序列。信号序列被切除，因而成熟蛋白不含信号序列。在该实施方式的另一方面，初级效应分子位于OmpA融合蛋白的N-端，只要融合蛋白具有稳定性，可以改变使用的OmpA跨膜结构域数量，这不会对初级效应分子的定位产生影响。在该实施方式的另一方面，初级效应分子位于OmpA的N-端结构域与C-端结构域之间，这种融合蛋白在周质中被周质蛋白酶剪切后，可形成含有初级效应分子的可溶性周质蛋白。在该实施方案的某些方式中，优选的是表达周质初级效应分子的细菌载体还可以同时表达BRP，因而可促进细菌细胞释放效应分子。
在本发明的另一项实施方案中，OmpA融合蛋白含初级效应分子的部分位于细菌的细胞外表面。在该实施方案的一个方面中，融合蛋白在初级效应分子的N-端含有奇数个或偶数个OmpA跨膜结构域。在另一方面，初级效应分子位于OmpA的两个细胞外环之间，因而可被细菌呈递至肿瘤细胞。在特别实施方案中，本发明提供在细菌外表面表达效应分子融合蛋白的表达质粒。例如，被称为Trc(1pp)ompA的质粒含有trc启动子驱动的与ompA的截短跨膜序列融合的脂多肽(1pp)锚序列。另一实例是被称为TrcompA的质粒，该质粒含有trc启动子驱动的ompA编码信号序列。这些质粒经过构建可含有一种编码本发明的一种或多种效应分子的核酸。
作为选择，还可以在效应分子前或效应分子侧翼构建一些能够被大量存在于肿瘤内的金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶识别的共有剪切位点，用于将这种效应分子释放到肿瘤环境中。蛋白酶切位点是在初级效应分子之前还是在初级效应分子侧翼分别取决于该效应分子是在融合蛋白的末端还是在融合蛋白的内部。
按照用于OmpA的上述策略，可以用任一种Omp样蛋白构建出类似的融合蛋白。在构建这种融合蛋白时，本领域的普通技术人员都明白，Omp样蛋白的效应分子融合部分的选择取决于该效应分子的需要表达部位(如周质、细胞外、与膜结合，等等)。此处描述的有关初级效应分子融合蛋白的构建方法也同样适用于次级效应分子。
在一项优选实施方案中，效应分子是与一种运送肽融合。研究表明，在融合蛋白中使用运送肽有利于将目的多肽或肽递送至处在其产生或引入的扩散范围内的几乎所有细胞(可参考，例如，Bayley，1999，Nature Biotechnology 17：1066-1067；Fernandez et al.，1998，Nature Biotechnology 16：418-420；和Derossi et al.，1998，TrendsCell Biol.8：84-87)。因此，将定向于肿瘤的减毒细菌加工成可表达含有运送肽和效应分子的融合蛋白的方法能够提高效应分子被肿瘤细胞内化的能力。在一项特别实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种核酸分子，该核酸分子可编码一种含有运送肽和效应分子的融合蛋白。在另一项实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码一种或多种含有运送肽和效应分子的融合蛋白。这些实施方案中的效应分子可以是初级效应分子，也可以是次级效应分子。运送肽的实例包括，但不局限于，来源于HIV TAT蛋白的肽、触角足同源域(穿透蛋白)、卡波西成纤维细胞生长因子(FGF)膜移位序列(MTS)、单纯疱疹病毒VP22、多聚组氨酸(如六聚组氨酸；6H)、多聚赖氨酸(如六聚赖氨酸；6K)，以及多聚精氨酸(如六聚精氨酸；6R)(参考，例如，Blanke et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8437-8442)。
在另一项优选实施方案中，融合蛋白含有一种信号肽、一种运送肽和一种效应分子。在该实施方案中，一种方式是定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码一种或多种含有信号序列、运送肽和效应分子的融合蛋白。在这种方式的实施方案中，效应分子可以是初级效应分子，也可以是次级效应分子。
在另一项优选实施方案中，可通过定向于肿瘤的减毒细菌将含有一种信号肽、一种蛋白水解性剪切位点、一种运送肽和一种效应分子的融合蛋白递送至实体瘤。在一项特别实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码一种或多种含有信号序列、蛋白水解性剪切位点、运送肽和效应分子的融合蛋白。该实施方案中的效应分子可以是初级效应分子，也可以是次级效应分子。
在一个非限制性实施例中，是通过在添加来源于HIV TAT、单纯疱疹病毒VP22、触角足同源域、6H、6K和6R的肽来提高大肠杆菌素的活性。可以是C-端、N-端或内部融合。融合位置位于N-端信号序列剪切肽之后的内部融合特别优选。该融合蛋白还可另含有OmpA等N-端信号序列或hlyA等C-端信号序列。
在一项优选实施方案中，效应分子与一种毒素的递送部分融合。已知有多种毒素具有自主递送能力，在这些毒素中有一部分可作为另一部分的递送剂。例如，Ballard et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：12531-12534证明，炭疽防护剂(PA)可介导致死因子(LF)和水肿因子进入哺乳动物细胞的胞质腔，还可以介导与截短形式的LF(LFn；255个氨基酸残基)融合的蛋白的进入。因此，除了在细胞外发挥功能的效应分子外，本发明的效应分子都可以与LFn或其他毒素系统融合，其中包括，但不局限于，白喉毒素A链的第1-193残基(Blanke et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：8437-8442)、霍乱毒素、Vero细胞毒素、大肠杆菌热不稳定毒素(LTs)、大肠杆菌热稳定毒素(STs)、肠溶血素、肠毒素、细胞毒素、EAggEC稳定毒素1(EAST)、CNFs、细胞致死性膨胀毒素、α-溶血素、β-溶血素，以及SheA溶血素(有关综述可参考，例如，O’Brien andHolmes，1996，Protein toxins of Escherichia coli and Salmonella.Cellular and Molecular Biology，Neidhardt et al.(eds)，ASM Press，Washington，D.C.，pp2788-2802)。在一项特别实施方案中，是将初级效应分子与一种毒素的递送部分融合。在另一项特别实施方案中，是将次级效应分子与一种毒素的递送部分融合。
在细菌中表达的融合蛋白的构建方法已为本领域所熟知，这些方法均处在本发明的范围内。(参考，例如，Makrides，S.，1996，Microbiol.Revs 60：512-538，在此完整引入作为参考)
5.6.表达载体
本发明提供一些经过加工而编码一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子的定向于肿瘤的减毒细菌。本发明提供一些含有效应分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些效应分子由质粒或可转染核酸编码。在本发明的一项优选实施方案中，使用的定向于肿瘤的减毒细菌为沙门氏菌。当沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌可表达一种以上的效应分子时(如初级效应分子或次级效应分子)，这些效应分子可由相同的质粒或核酸来编码，也可由一种以上的质粒或核酸来编码。本发明还提供一些含有效应分子的定向于肿瘤的减毒细菌，这些效应分子由整合到细菌基因组中的核酸分子编码。整合的效应分子可以是沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌的内源分子，也可以被引入定向于肿瘤的减毒细菌中(例如引入一种可编码效应分子的核酸，如质粒、可转染核酸、转座子，等等)，使得编码效应分子的该核酸分子能够整合到定向于肿瘤的减毒细菌的基因组中。在本发明的一项优选实施方案中，使用的定向于肿瘤的减毒细菌为沙门氏菌。本发明提供一种与适当启动子可操作性连接的可编码效应分子的核酸分子。与编码效应分子的核酸可操作性连接的启动子可以是同源的(即本身的)，也可以是异源的(即编码效应分子的核酸本身不具有的)。
编码本发明的效应分子或其功能活性类似物或片段或其他衍生物的核苷酸序列可以被插入到一种适当的表达载体中，例如含有转录或翻泽插入的蛋白编码序列所必需的元件的质粒。转录或翻译的必需信号可以由效应分子和(或)其侧翼区域提供。作为选择，表达载体的构建方法还可以是，利用本领域已知的多种DNA操作方法在可操作的读码阶段将编码目的蛋白的结构DNA序列以及适当的翻译起始信号和终止信号插入到功能性启动子中。通常可参考Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel et al.，1995，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing，New York，NY。这些方法可包括DNA体外重组以及合成技术和体内重组(遗传重组)方法。本发明提供一种与适当启动子可操作性连接的可编码效应分子的核酸分子。
本发明还提供一些经过加工而编码一种或多种融合蛋白以及可选的一种或多种效应分子的定向于肿瘤的减毒细菌。本发明提供一些含有融合蛋白的定向于肿瘤的减毒细菌，这些融合蛋白由质粒或可转染核酸编码。当沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌可表达一种以上的融合蛋白和(或)效应分子(如初级效应分子或次级效应分子)时，这些融合蛋白和(或)效应分子可由相同的质粒或核酸来编码，也可由一种以上的质粒或核酸来编码。本发明还提供一些含有融合蛋白的定向于肿瘤的减毒细菌，这些融合蛋白由整合到细菌基因组中的核酸编码。本发明还提供一种与适当启动子可操作性连接的可编码融合蛋白的核酸分子。编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列可以被插入到一种适当的表达载体中，例如含有转录或翻译插入的蛋白编码序列所必需的元件的质粒。
在本发明的某些特别实施方案中，本发明的表达载体是一种质粒。有大量的质粒适于产生本发明的重组构建体，这些质粒已为本领域技术人员所了解，并且能以商品形式获得。
上述商品化质粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些质粒是将pBR322的“主链”部分与一种适当的启动子和要表达的结构序列相结合。pBR322被认为是一种低拷贝数的质粒。如果要获得高水平的表达，可以采用高拷贝数的质粒，如含有pUC主链的质粒。pUC质粒包括，但不局限于，pUC19(参考，例如，Yanisch-Perron etal.，1985，Gene 33：103-119)和pBluescript(Stratagene)。
作为范例提供的以下质粒都可以与本发明的方法协同使用。细菌：pBs、phagescript、phiX174、pbluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。也可以使用含有pBR322“主链”的商品化质粒，如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些质粒可以与适当的启动子和要表达的结构序列相结合。pCET、pTS(如本文第6节所述)。
在本发明的特别实施方案中，编码效应分子的质粒为pTS-TNF-α质粒、pTS-BRP质粒或pTS-BRPTNF-α质粒，有关这些质粒的描述见本文第6节。
在本发明的一项特别实施方案中，用于分泌到周质空间的含有OmpA信号序列和初级效应分子的本发明所述融合蛋白是由pIN-III-ompA-Hind质粒编码，该质粒含有ompA信号序列的DNA编码序列，该序列位于能够克隆初级效应分子编码序列的接头序列的上游。在一项特别优选实施方案中，pIN-III-ompA-Hind载体的lac诱导型启动子被替换成pepT或tet启动子(参考Rentier-Delrue et al.，(1988)，Nuc.Acids Res.16：8726)。
本发明还提供对效应分子进行转座子介导的染色体整合的方法。只要能将效应分子的编码核酸构建到转座子盒中，本领域已知的任何转座子质粒都可以在本发明的方法中使用。例如，本发明提供一种转座子质粒，该质粒含有一种转座子或微转座子以及MCS。
在本发明的某些实施方案中，本发明的质粒是一种转座子质粒，也就是说，该质粒含有一种转座子，其中插入了目的效应分子的编码序列。转座子质粒含有转座子盒，这些转座子盒能够整合到细菌基因组中。因此，可以将效应分子或其融合蛋白的编码核酸插入到转座子盒中。这样就可以通过转座子盒将转座子插入序列整合到细菌基因组中。效应分子的编码序列可以与一种启动子可操作性连接，也可以不含启动子。当不含启动子时，可选标记的表达由转座子插入部位的细菌基因组启动子驱动。对含有转座子插入序列的细菌菌落进行筛选，以获得可满足本发明要求的表达水平，例如足以促进肿瘤的细胞毒性、郁积或退化的细胞因子表达水平。
在某些实施方案中，使用的转座子质粒除含有转座子外，还在转座子的反向重复区外含有一种可催化转座子插入细菌基因组中的转座酶基因，但该基因不会随转座子一同插入，从而可产生带有稳定转座子插入序列的细菌菌株。
可供本发明使用的转座子包括，但不局限于，Tn7、Tn9、Tn10和Tn5。在一项优选实施方案中，使用的转座子质粒为pNK2883(ATCC)，该质粒在Tn10插入元件外含有氨苄青霉素抗性基因，并且在两个Tn10插入元件之间(如转座子盒内)含有一种或多种效应分子的编码核酸。优选地，在制备构建体时还可以将编码其他元件的额外序列插入到两个Tn10插入元件之间。在特别实施方案中，这些元件可选择性地包括(1)可选标记的无启动子拷贝(如SerC、AroA，等等)，用于筛选含有质粒的阳性细菌；(2)一种BRP基因；(3)适于效应分子使用的一种启动子(如trc)，该启动子与一种或多种初级效应分子(如TNF-α或其融合蛋白，如OmpA-TNF-α融合蛋白)的编码核酸可操作性连接；(4)适于一种或多种效应分子的编码核酸使用的一种终止子。
在一项实施方案中，当对质粒进行适当操作并利用质粒编码的氨苄青霉素抗性特征筛选出含有所需构建体的克隆之后，可以通过质粒的丧失来去除抗生素筛选，然后挑选含有染色体转座子插入序列的菌株(如平铺在选择培养基上)，用于向人类受试者给药。
另一项特别实施方案是采用pTS质粒，该质粒含有一种靶特异性不同的转座酶基因和一种微转座子，这种微转座子含有无启动子serC基因和MCS的编码序列。另一项特别实施方案是采用pTS-BRP质粒，该质粒含有一种靶特异性不同的转座酶基因和一种微转座子，这种微转座子含有无启动子serC基因、烷化剂诱导型细菌素释放因子以及MCS的编码序列。
在一项优选实施方案中，用于筛选转座子介导的染色体整合菌株的转座子质粒中含有：
a)位于转座子插入序列之外(如转座子盒之外)的一种转座酶基因，用于转座子的切除和整合；
b)与细菌菌株缺失的筛选基因(如serC)对应的一种野生型编码序列以及野生型基因的核糖体结合位点和终止子，但缺少启动子。优选的是该序列直接位于左侧TN10转座子插入序列之后；
c)可选的一种核酸序列，该序列位于左右两侧插入序列之间，可编码一种释放促进性核酸(如BRP)；以及
d)位于左右两侧插入序列之间的一种多克隆位点(MCS)，含有质粒中单一的限制性位点，用于插入效应分子。优选的是该MCS直接位于释放增强型核酸(如果使用的话)之后，并且恰好在右侧TN10插入序列之前。
在另一项实施方案中，效应分子在宿主染色体上的随机整合可导致基因中断，由此可确定基因位置是否适用于效应插入。
在另外一项实施方案中，使用的表达载体是一种染色体外质粒，这种质粒能够在不含所需的抗生素筛选基因的条件下保持稳定，也就是说该质粒能够自我维护。在一个非限制性实施例中，可自我维护的表达质粒为沙门氏菌毒力质粒。
举例来说，在本发明的一项实施方案中，质粒筛选系统的维持方法是为沙门氏菌等细菌提供一种原本不具备的功能，并在此基础上清除那些仍不具备这种功能的沙门氏菌，从而筛选出具备这种功能的沙门氏菌。在一项实施方案中，本发明的沙门氏菌是一种营养缺陷型突变体菌株，而表达质粒可以为该突变体提供其缺乏的生物合成酶的功能。在缺乏营养成分的生长培养基上培养这些细胞，只有所需细胞能够在这种培养基上进行代谢，也就是只有包含所述表达质粒的细胞能够进行代谢，从而可筛选出含有这种表达质粒的沙门氏菌。在该实施方案中，高度优选的方式是本发明的沙门氏菌对DAP(中二氨基庚二酸)有必然的需求，最优选的是asd基因缺失。DAP是存在于革兰氏阴性菌周质中的肽聚糖的一种成分，这种成分是细菌外膜保持完整所必需的。DAP缺乏可导致细菌外膜的完整性无法保持，从而引起细菌裂解。asd(β天冬氨酸半醛脱氢酶)基因可编码DAP生物合成途径中的一种酶。缺乏asd功能的革兰氏阴性菌可以在补加有DAP的培养基上生长。带有与一种同源或异源启动子可操作性连接的asd基因序列的质粒，如本发明的表达质粒，可以通过在缺乏DAP的条件下培养不具有asd活性的革兰氏阴性菌的方法来加以筛选(参考，例如，授予Curtiss，的美国专利5,840,483第III部分)。
本领域已知的其他非抗生素型筛选系统也处在本发明的范围内。例如，有一种筛选系统采用的是含有一种稳定毒素和一种稳定性较低的抗毒素的一种质粒，该系统可用来筛选维持有这种质粒的细菌。
在另一项实施方案中，使用的表达载体是一种能够用非抗生素方法进行筛选的染色体外质粒，如一种大肠杆菌素质粒。此处使用的大肠杆菌素质粒至少可编码一种大肠杆菌素毒素和一种抗-大肠杆菌素，大肠杆菌素毒素比抗-大肠杆菌素更加稳定，从而丧失这种大肠杆菌素质粒的所有细菌都会因大肠杆菌素毒素的持久性而被杀死。在一项优选实施方案中，使用的大肠杆菌素毒素为ColE3大亚基，使用的抗-大肠杆菌素为ColE3小亚基。
在本发明的另一项实施方案中，使用的表达载体为λ载体，更明确地说是溶原性λ载体。在一项优选实施方案中，含有λ载体的细菌宿主另含有一种能够在30℃而不是37℃发挥功能的温度敏感型λ阻遏物。因此，该细菌宿主在30℃下生长和进行体内操作时不会表达对细菌具有毒性的初级效应分子和(或)次级效应分子。一旦该细菌菌株被引入受试者，则会因正常体温而将λ阻遏物灭活，同时激活初级效应分子以及可选的次级效应分子的表达。
效应分子编码核酸序列或融合蛋白编码核酸序列的表达可以由另一种核酸序列来调控，从而使效应分子能够在这种重组DNA分子转化的细菌中表达。例如，可以用本领域已知的任何启动子/增强子元件来调控效应分子的表达。启动子/增强子可以是同源的(即自身的)，也可以是异源的(即非自身的)。可用来调控细菌中的效应分子，如细胞因子，或融合蛋白表达的启动子包括，但不局限于，原核启动子，如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)或lac启动子(DeBoer et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25；Scientific American，1980，242：74-94)。本发明还包括其他启动子，其中包括，但不局限于，lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、λPL、trc、pagC、sulA、pol II(dinA)、ruv、recA、uvrA、uvrB、uvrD、umuDC、lexA、cea、caa和recN(参考，例如，Schnarr et al.，1991，Biochimie 73：423-431)。在一项优选实施方案中，使用的启动子为trc(参考，例如，Amann et al.，1988，Gene 69：301-15)。
在一项特别实施方案中，使用的初级效应分子是在SOS-反应性启动子调控下表达的一种大肠杆菌素，该减毒细菌菌株可以用X-射线、紫外线、烷化剂或其他DNA破坏性制剂进行处理，以提高大肠杆菌素的表达。SOS-反应性启动子的实例包括，但不局限于，recA、sulA、umuC、dinA、ruv、uvrA、uvrB、uvrD、lexA、cea、caa、recN，等等。
在另一项优选实施方案中，启动子在肿瘤环境中的活性加强；例如，pepT基因的P1启动子等启动子可以被肿瘤的无氧环境激活。P1启动子的激活取决于FNR转录激活因子(Strauch et al.，1985，J.Bacteriol.156：743-751)。在一项特别实施方案中，使用的P1启动子是一种突变体，该启动子与天然P1启动子相比，可以在无氧条件下被更高水平地诱导，例如pepT200启动子，该启动子对无氧条件的反应活性是由CRP-cAMP诱导，而不是FNR(Lombardo et al.，1997，J.Bacteriol.179：1909-1917)。在另一项实施方案中，使用的是无氧诱导型启动子，如potABCD启动子。potABCD是一种能够在无氧条件下从pepT背驰表达的操纵子(Lombardo et al.，1997，J.Bacteriol.179：1909-1917)，它可以根据本发明的方法加以使用。
作为选择，也可以使用抗生素诱导型启动子，如Tn10转座子的tet启动子。在一项优选实施方案中，使用的tet启动子为多体，如三体。当利用本发明的定向于肿瘤的减毒细菌对受试者进行处理后，将适当剂量的四环素给药于该受试者即可诱导该启动子的活性。最初描述的tet诱导型表达系统是用于非洲粟酒裂殖酵母(Faryar and Gatz，1992，Current Genetics 21：345-349)等真核系统以及哺乳动物细胞(Langand Feingold，1996，Gene 168：169-171)，而最近的研究可使其适用性扩展到细菌细胞。例如，Stieger等人(1999，Gene 226：243-252)已证明，当萤火虫萤光素酶基因与tet启动子可操作性连接后，可通过tet诱导获得80倍的诱导作用。该启动子的优势在于，它可以在极低的四环素水平下被诱导，该水平约为抗生素活性所需剂量的十分之一。
一旦含有效应分子或融合蛋白的质粒被引入定向于肿瘤的减毒细菌，即可通过本领域已知的任何方法对效应分子或融合蛋白的表达进行测定，这些方法包括，但不局限于，生物学活性测定法、酶学活性测定法、RNA印迹分析法，和蛋白印迹分析法。(参考Sambrook et al.，1989，Molecular Biology，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel et al.，1995，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing，NewYork，NY)。
5.7.组合疗法
在某些实施方案中，定向于肿瘤的减毒细菌可以与其他已知的癌症疗法协同用于实体瘤的治疗。在其他一些实施方案中，经过加工而表达一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌可以与其他已知的癌症疗法协同用于实体瘤的治疗，这些核酸分子可编码一种或多种效应分子和(或)融合蛋白。举例来说，经过加工而表达一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌可以与化疗剂协同使用，这些核酸分子可编码一种或多种效应分子和(或)融合蛋白。化疗剂的实例包括，但不局限于，顺铂、异环磷酰胺、taxanes如紫杉醇和paclitaxol、I型拓扑异构酶抑制剂(如CPT-11、托泊替堪、9-AC和GG-211)、gemcitabine、长春瑞宾、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、亚叶酸、长春瑞宾、temodal、细胞松弛素B、短杆菌肽D、吐根碱、丝裂霉素、鬼臼亚乙苷、tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、二羟基蒽酮、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安，以及嘌呤霉素同系物和环磷酰胺。作为选择，经过加工而表达一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌也可以与放射疗法(如γ射线或x射线)协同使用，这些核酸分子可编码一种或多种效应分子和(或)融合蛋白。根据要处理的癌症的类型，可以采用任何射线治疗方案。作为非限定性实例，可以用x射线进行处理；详细地说，可以用兆伏级的高能射线(能量高于1MeV的射线)处理深部肿瘤，用电子束和常电压x射线处理皮肤癌。为了使组织暴露于射线，还可以使用发射γ射线的放射性同位素，如镭、钴或其他元素的放射性同位素。
本发明包括抗癌剂与定向于肿瘤的减毒细菌的序贯给药或伴随给药方法。本发明包括抗癌剂与定向于肿瘤的减毒细菌的具有附加作用或协同作用的组合方法。
本发明还包括一种或多种抗癌剂与一种或多种作用部位不同的定向于肿瘤的减毒细菌的组合方法。这种组合方法无论具有协同作用还是具有附加作用，都可以提供一种基于这些治疗剂的双重作用的改进疗法。因此，本发明的新组合疗法与采用这两种制剂之一的单制剂疗法相比，可产生更高的疗效。
本发明还包括一种抗癌剂与定向于肿瘤的减毒细菌的顺序给药或伴随给药方法，其中的减毒细菌经过加工可表达一种或多种效应分子和(或)融合蛋白的一种或多种编码核酸分子。本发明包括抗癌剂与定向于肿瘤的减毒细菌的具有附加作用或协同作用的组合方法，其中的减毒细菌经过加工可表达一种或多种效应分子和(或)融合蛋白的一种或多种编码核酸分子。
本发明还包括一种或多种抗癌剂与经过加工可表达一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌的组合方法，这些核酸分子可编码一种或多种作用部位不同的效应分子和(或)融合蛋白。这种组合方法无论具有协同作用还是具有附加作用，都可以提供一种基于这些治疗剂的双重作用的改进疗法。因此，本发明的新组合疗法与采用两种制剂之一的单制剂疗法相比，可产生更高的疗效。
5.8.用于递送的方法及组合物
本发明提供一些方法，用于通过对宿主的毒性较低的定向于肿瘤的减毒细菌将一种或多种全身给药于宿主时会产生毒性的初级效应分子局部递送至肿瘤。在一项实施方案中，使用的初级效应分子可用来治疗肉瘤、淋巴瘤、癌或其他实体瘤。在某些非限制性实施方案中，使用的效应分子可用于在肿瘤部位诱导局部的免疫应答。
根据本发明，可以在一些方法中有利地使用含有一种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌载体来抑制患有实体瘤的动物，包括人类患者的肿瘤生长，或缩小其肿瘤体积，或防止肿瘤细胞在体内扩散，其中的核酸分子可编码一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子。
本发明提供一些递送一种或多种初级效应分子的方法，用于对实体瘤进行治疗，这些方法的步骤包括，将一种药用组合物给药于需要这种治疗的动物，该组合物含有一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码与一种或多种适当启动子可操作性连接的一种或多种初级效应分子。本发明还提供一些递送一种或多种初级效应分子的方法，用于对实体瘤进行治疗，这些方法的步骤包括，将一种药用组合物给药于需要这种治疗的动物，该组合物含有一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码与一种或多种适当启动子可操作性连接的一种或多种初级效应分子以及一种或多种次级效应分子。在一项实施方案中，使用的初级效应分子为TNF家族成员、细胞毒性肽或多肽、抗血管生成因子、肿瘤抑制性酶，或其功能性片段。
本发明提供一些递送本发明的一种或多种融合蛋白的方法，用于对实体瘤进行治疗，这些方法的步骤包括，将一种药用组合物给药于需要这种治疗的动物，该组合物含有一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码与一种或多种适当启动子可操作性连接的一种或多种本发明所述融合蛋白。本发明还提供一些递送本发明的一种或多种融合蛋白以及一种或多种效应分子的方法，用于对实体瘤进行治疗，这些方法的步骤包括，将一种药用组合物给药于需要这种治疗的动物，该组合物含有一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码与一种或多种适当启动子可操作性连接的一种或多种本发明所述融合蛋白以及一种或多种效应分子。
在一项优选实施方案中，使用的定向于肿瘤的减毒细菌为沙门氏菌。在另一项实施方案中，使用的定向于肿瘤的减毒细菌具有一种增强释放系统。在一项优选实施方案中，所述动物为哺乳动物。在一项高度优选实施方案中，所述动物为人。
本发明还提供通过一种定向于肿瘤的减毒细菌，如沙门氏菌，来递送一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子的组合递送方法。本发明还提供定向于肿瘤的不同减毒细菌的组合递送方法，这些细菌带有一种或多种不同的初级效应分子和(或)一种或多种不同的次级效应分子。
本发明还提供通过一种定向于肿瘤的减毒细菌，如沙门氏菌，来递送本发明的一种或多种融合蛋白的组合递送方法。本发明还提供通过一种定向于肿瘤的减毒细菌，如沙门氏菌，来递送一种或多种本发明的融合蛋白以及可选的一种或多种本发明的效应分子的组合递送方法。本发明还提供定向于肿瘤的不同减毒细菌的组合递送方法，这些细菌带有一种或多种不同的初级效应分子和(或)可选的一种或多种不同的效应分子。
实体瘤包括，但不局限于，肉瘤、癌和其他实体瘤，其中包括，但不局限于，生殖细胞系肿瘤、中枢神经系统的肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、子宫颈癌、子宫癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、星形细胞瘤、神经胶质瘤、胰膜癌、胃癌、肝癌、结肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌和间皮瘤。优选地，所述受试者是一种动物，其中包括，但不局限于，牛、猪、鸡、狗、猫、马等动物，优选的是哺乳动物，最优选的是人。文中使用的“实体瘤的治疗”包括，但不局限于，抑制肿瘤生长、抑制肿瘤细胞增殖、减小肿瘤体积，或抑制肿瘤细胞扩散到身体的其他部分(转移)。
本发明提供一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码与一种或多种适当启动子可操作性连接的一种或多种初级效应分子。本发明还提供一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码与一种或多种适当启动子可操作性连接的一种或多种初级效应分子和一种或多种次级效应分子。
本发明提供一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码与一种或多种适当启动子可操作性连接的一种或多种本发明所述融合蛋白。本发明提供一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有一种或多种核酸分子，这些核酸分子可编码与一种或多种适当启动子可操作性连接的一种或多种本发明所述融合蛋白和一种或多种效应分子。
本发明还提供一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌。本发明还提供一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子。这些组合物含有治疗有效剂量的一种定向于肿瘤的减毒沙门氏菌载体和一种可药用载体，其中的沙门氏菌载体含有一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子。本发明还提供一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒沙门氏菌，这种减毒沙门氏菌含有一种或多种部分的融合蛋白以及可选的一种或多种效应分子。这些组合物含有治疗有效剂量的一种定向于肿瘤的减毒沙门氏菌载体和一种可药用载体，其中的沙门氏菌载体含有一种或多种本发明的融合蛋白以及可选的一种或多种效应分子。
在一项特别实施方案中，术语“药用的”是指联邦政府或州政府的管理机构批准的，或美国药典或用于动物的，更优选的是用于人的，其他公认药典上列举的。术语“载体”是指稀释剂、佐剂、赋形剂，或用来将治疗剂给药的承载物。这些药用媒介物可以是无菌液体，如水和油，包括来源于石油、动物或植物油或合成的油，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油、橄榄油，等等。当药用组合物是用于静脉内给药时，优选的媒介物是生理盐水。还可以用盐溶液和水溶葡萄糖和甘油溶液作为流体媒介物，特别是作为可注射的溶液。适当的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、甘醇、水、乙醇，等等。如果需要，组合物中还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等形式。口服制剂可含有标准的媒介物，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁，等等。适当药用媒介物的实例在E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中有所描述。这些组合物将含有治疗有效剂量的定向于肿瘤的治疗性纯化减毒细菌，同时含有适当剂量的媒介物，从而可采用适于向患者给药的形式。剂型应该与给药方式相符合。
在一项优选实施方案中，是按照常规方法将组合物作为适于向人类静脉内给药的药用组合物来加以配制。用于静脉内给药的组合物通常是等张的无菌缓冲水溶液。如果需要，组合物中还可包含一种悬浮剂和一种局部麻醉剂，如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。一般而言，各成分可以单独提供，也可以混合后以单位剂量形式提供，例如以冻干粉末或无水浓缩物的形式装在标有活性剂分量的安瓿剂或sachette等密封容器中。当组合物用于灌注给药时，可将其配制在装有药用级无菌水或生理盐水的灌注瓶中。当组合物用于注射给药时，可提供一种装有注射用无菌水或生理盐水的安瓿剂，以便给药前将各成分混合。
可有效治疗或预防实体瘤的本发明所述药用组合物的剂量取决于肿瘤的特性，该剂量可通过标准临床技术来确定。此外，还可以选择性地进行体外测定，以帮助确定最佳的剂量范围。制剂中应使用的确切剂量还取决于给药途径和癌症的严重程度，该剂量应根据医师的判断和患者的状况来加以确定。但适当的剂量范围一般约为1.0-1×1010c.f.u./kg；可选大约1.0-1×108c.f.u./kg；可选大约1×102-1×108c.f.u./kg；可选大约1×104-1×108c.f.u./kg；以及可选大约1×104-1×1010c.f.u./kg。有效剂量可以由体外测试系统或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推获得。
有多种不同的已知递送系统可用于将本发明的药用组合物给药。引入方法包括，但不局限于，真皮内途径、肌内途径、腹膜内途径、静脉内途径、皮下途径、鞘内途径、鼻内途径、硬膜外途径，以及口服途径。引入方法还可以是肿瘤内途径(例如直接给药于肿瘤区域)。
本发明的组合物可通过任何方便的途径进行给药，例如灌注或快速浓注，或由上皮层或粘膜层吸收(如口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等)，也可以与其他生物活性剂一同给药。给药方法可以是全身的，也可以是局部的。此外，还可以通过任何适当的途径将本发明的药用组合物引入中枢神经系统，如室内注射和鞘内注射；用一种脑室内导管可以方便地实现脑室内注射，例如与一种贮器相联接，如Ommaya贮器。也可以采用肺部给药，方法是，例如，使用一种吸入器或喷雾器，并且用一种气雾剂进行配制。
在一项特别实施方案中，可以将本发明的药用组合物局部给药于需要治疗的区域；其实现方法可以是，例如，但不局限于，在手术过程中进行局部灌注、注射、使用一种导管，或使用一种植入物，该植入物可以是多孔材料、无孔材料或胶状材料，其中包括纤维或膜，如sialastic膜。在一项实施方案中，给药方法可以是直接在恶性肿瘤或肿瘤性组织或前肿瘤性组织部位(或形成部位)进行注射。
含有一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子的定向于肿瘤的减毒细菌可以用一种拉释系统来递送。含有本发明的一种或多种融合蛋白以及可选的一种或多种效应分子的定向于肿瘤的减毒细菌也可以用一种控释系统来递送。在一项实施方案中，可以使用一种泵(参考Langer，Supra；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald et al.，1980，Surgery 88：507；和Saudek et al.，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一项实施方案中，可以用聚合材料(可参考Medical Applications ofControlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，BocaRaton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，DrugProduct Design and Performance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；还可以参考Levy et al.，1985，Science 228：190；During et al.，1989，Ann.Neurol.25：351；和Howard et al.，1989，J.Neurosurg.71：105)。在另外一项实施方案中，可以将一种受拉释放系统放在治疗目标的附近，即脑的附近，这样就只需使用全身剂量的一部分(可参考，例如，Goodson，inMedical Applications of Controlled Release，supra，vol.2，pp.115-138(1984))。
其他受控释放系统在Langer(1990，Science 249：1527-1533)的综述中有所描述，这些系统均可用于含有一种或多种初级效应分子以及可选的一种或多种次级效应分子的定向于肿瘤的减毒细菌的给药。
本发明还提供一种药包或药用试剂盒，其中含有一个或多个容器，容器中装有本发明所述药用组合物的一种或多种成分。这些容器还可以选择性地携带一份说明，其形式符合管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构的规定，该说明可反映生产、使用或销售的管理机构已批准将其给药于人类。
本发明还提供一些治疗实体瘤的方法，这些方法的步骤包括，将本发明的一种药用组合物给药于需要这种治疗的动物，并且对该动物实施至少一种已知的其他癌症疗法。在一项特别实施方案中，是将本发明的一种药用组合物和至少一种化疗剂给药于患有实体瘤的动物。化疗剂的实例包括，但不局限于，顺铂、异环磷酰胺、taxanes如紫杉醇和paclitaxol、I型拓扑异构酶抑制剂(如CPT-11、托泊替堪、9-AC和GG-211)、gemcitabine、长春瑞宾、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、亚叶酸、长春瑞宾、temodal、细胞松弛素B、短杆菌肽D、吐根碱、丝裂霉素、鬼臼亚乙苷、tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、二羟基蒽酮、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安，以及嘌呤霉素同系物和环磷酰胺。
本发明包括本发明所述药用组合物与化疗剂等抗癌剂的序贯给药或伴随给药方法。在一项特别实施方案中，本发明的药用组合物是在抗癌剂给药前进行给药(如2小时前、6小时前、12小时前、1天前、4天前、6天前、12天前、14天前、1个月前或数月前)。在另一项特别实施方案中，本发明的药用组合物是在抗癌剂给药后进行给药(如2小时后、6小时后、12小时后、1天后、4天后、6天后、12天后、14天后、1个月后或数月后)。在一项特别实施方案中，本发明的药用组合物是伴随抗癌剂给药。本发明包括抗癌剂与经过加工可编码一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌的组合方法，这些核酸分子可编码一种或多种具有附加作用或协同作用的效应分子和(或)融合蛋白。
本发明还包括抗癌剂与经过加工可表达一种或多种核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌的组合方法，这些核酸分子可编码一种或多种作用部位不同的效应分子和(或)融合蛋白。这种组合方法无论具有协同作用还是具有附加作用，都可以提供一种基于这些治疗剂的双重作用的改进疗法。因此，本发明的新组合疗法与采用两种制剂之一的单制剂疗法相比，可产生更高的疗效。
在一项实施方案中，是将本发明的一种药用组合物给药于患有实体瘤的动物，并且用放射疗法(如γ射线或x射线)对该动物进行处理。在一项特别实施方案中，本发明提供一种方法，用于治疗或预防放射疗法难以控制的肿瘤。本发明的药用组合物可以在进行放射疗法的同时进行给药。作为选择，也可以在本发明所述药用组合物给药后进行放射疗法，优选的是在药用组合物给药至少1小时后、5小时后、12小时后、1天后、1周后、1个月后再进行放射疗法，更优选的则是数月后(如多达3个月后)再进行放射疗法。
可利用本领域已知的任何方法在本发明所述药用组合物给药前、给药的同时，或给药后实施放射治疗。根据要处理的肿瘤的类型，任何放射治疗方案都可以使用。作为非限定性实例，可以用x射线进行处理；详细地说，可以用兆伏级的高能射线(能量高于1MeV的射线)处理深部肿瘤，用电子束和常电压x射线处理皮肤癌。为了使组织暴露于射线，还可以使用发射γ射线的放射性同位素，如镭、钴或其他元素的放射性同位素。
此外，本发明还提供用一种药用组合物替代放射疗法来治疗肿瘤的方法，其中的放射疗法已被证明或可被证明能够对处理的患者产生过高的毒性，也就是可导致无法接受的或无法承受的副作用。
5.9.关于本发明所述药用组合物的治疗或预防实用性的证明
在将本发明的药用组合物用于人类之前，优选的是对其预期的治疗活性或预防活性进行体外测试，然后进行体内测试。例如，可通过体外测试方法来确定是否必须将特定的药用组合物进行给药，这些测试方法包括体外细胞培养测定法，该方法是将患者的组织样品培养在培养基中，并使其暴露于药用组合物，或用其他方式将药用组合物给药，然后观测该组合物对该组织样品的影响。
可以对本发明所述药用组合物使激活免疫细胞增加的能力进行测试，方法是用测试的药用组合物或对照接触免疫细胞，并检测该药用组合物对免疫细胞生物活性的调节(如提高)能力。测试组合物对免疫细胞生物活性的调节能力的评定方法可以是，检测细胞因子或抗原的表达、检测免疫细胞的增殖、检测信号分子的激活、检测免疫细胞的效应功能，或检测免疫细胞的分化。用于测定这些活性的技术已为本领域技术人员所了解。举例来说，可通过3H-胸腺嘧啶核苷掺入测定和锥虫兰细胞计数来检测细胞的增殖。可通过，例如，免疫测定法来检测细胞因子和抗原的表达，其中包括，但不局限于，竞争性测定系统和非竞争性测定系统，这些系统采用的技术有蛋白印迹法、免疫组织化学放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹层”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射性测量法、荧光免疫测定法、蛋白A免疫测定法和FACS分析方法。信号分子的激活可通过，例如，激酶测定法和电泳迁移率分析法(EMSAs)来进行检测。T细胞的效应功能可通过，例如，51Cr释放测定法来加以测量(参考，例如，Palladino et al.，1987，Cancer Res.47：5074-5079和Blachere et al.，1993，J.Immunotherapy 14：352-356)。
可以测试本发明所述药用组合物使患有癌症的动物体内的肿瘤形成降低的能力。还可以测试本发明所述药用组合物缓解与实体瘤相关的一种或多种症状的能力。此外，还可以测试本发明所述药用组合物使患有实体瘤的患者的存活期延长的能力。用于在动物体内分析本发明所述药用组合物的这些功能的技术已为本领域技术人员所了解。
在不同的特别实施方案中，可以用实体瘤相关细胞类型的代表性细胞来进行体外测定，以确定本发明的药用组合物能否对这种类型的细胞产生预期的影响。
在进行人体测试之前，可以在适当的动物模型系统中对用于治疗的本发明所述药用组合物进行测试，其中包括，但不局限于，大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、猪、狗、兔，等等。在向人类给药之前，可以用本领域已知的任何动物模型系统进行体内测试。
下列实施例只作为说明，而不是限制本发明的范围。
6.实施例：由定向于肿瘤的减毒沙门氏菌表达TNF-α
下述实施例说明，含有一种TNF家族成员编码核酸分子的定向于肿瘤的减毒细菌，如沙门氏菌，可以表达该TNF家族成员。
6.1.TNF-α质粒的构建
文中描述的质粒可作为本发明的特别实施方案的说明性实例。本领域的技术人员都很清除，通过本领域已知的方法可以用其他适当的启动子或效应分子替换诸如trc启动子和(或)TNF-α编码核酸等启动子和(或)效应分子编码核酸。
效应分子编码核酸的基于质粒的细菌表达采用trc启动子和Trc99A质粒(可从Pharmacia购买)或TrcHisB质粒(可从InVitrogen购买)。两种质粒都是用NcoI位点作为起始密码子，然后是一个多克隆位点。
6.1.1.pCET质粒
效应分子编码核酸的基于质粒的细菌表达采用双λPL启动子或双λPR启动子，pCET质粒的构建方法如下。用限制性酶ClaI剪切pCE33质粒(Elvin et al.，1990，Gene 87：123-126)，再用绿豆核酸酶使末端钝化，然后用限制性酶BamHI剪切。接着将获得的1.4kb片段连接到pUC19(可从GIBCO购买)的2.1kb SspI/BamHI片段中，即产生pCI质粒。用限制性酶BamHI剪切pCI质粒，再用绿豆核酸酶使末端钝化，然后用限制性酶Af1III剪切。然后将获得的含有微顺反子和终止子的0.6kb片段连接到pCI的3.1kb片段中，即获得pCET质粒。pCET与Trc99A或TrcHisB一样，用NcoI位点作为起始密码子，然后是一个多克隆位点。于30℃培养带有任何包含λPL或λPR启动子的质粒的细菌。
6.1.2.pTS质粒
pTS质粒采用转座子介导的染色体整合方法，并且含有效应分子编码核酸的丝氨酸原养型筛选基因，该质粒的构建方法如下。用限制性酶BamHI剪切pNK2883质粒(可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)购买)，并分离出4.8kb片段。利用PCR方法从鼠伤寒沙门氏菌14028菌株(可从ATCC购买)中分离出鼠伤寒沙门氏菌serC编码核酸，PCR使用的正向引物的序列为GAAGATCTTCCGGAGGAGGGGAAATG(SEQ ID NO：1)，反向引物的序列为CGGGATCCGAGCTCGAGGGCCCGGGAAAGGATCTAAGAAGATCC(SEQ ID NO：2)。用限制性酶BglII和BamHI剪切PCR反应混合物并分离出1.1kb的PCR产物，将该产物连接到pNK2883的4.8kb片段中，即获得被称为pTS的质粒。直接位于serC编码核酸3’端的克隆位点可用来插入效应分子编码核酸。
6.1.3.pTS-TNF-α质粒
有一种质粒(pTS-TNF-α)可以使trc启动子驱动的人TNF-α编码核酸进行pTS介导的染色体整合，该质粒的构建方法如下。ASD质粒PYA272(参考，例如，Curtiss，III的美国专利5,840,483)的复制起始点被colE1质粒(参考，例如，Bazaral and Helsinki，1970，Biochem 9：399-406)的复制起始点替换后就成为PYA3332质粒。用限制性酶NcoI剪切PYA3332质粒，并用绿豆核酸酶使末端钝化。然后用限制性酶HindIII剪切所得的钝末端片段，并分离出3.3kb的DNA片段。然后用限制性酶NdeI剪切图1所示的经大肠杆菌优化的人TNF-α编码核酸(参考Pennica et al.，1984 Nature 312：724-729；和Salztman，et al.，1996，Cancer Biotherapy 11：145-153)，并用T4 DNA聚合酶使末端钝化，然后用限制性酶HindIII剪切。将所得的0.5kb片段连接到PYA3332的3.3kb片段中，即获得Asd34TNF-α质粒。然后用限制性酶BglII剪切Asd34TNF-α质粒，并将编码trc启动子驱动的TNF-α编码核酸的1.1kb片段连接到pTS的BamHI位点中，即获得pTS-TNF-α质粒。
6.1.4.pTS-BRP质粒
pTS-BRP含有经转座子介导而整合到染色体中的BRP编码核酸，并且含有效应分子编码核酸的丝氨酸原养型筛选基因，该质粒的构建方法如下。利用PCR方法从pSW1质粒(可从Bio101，Vista，CA购买)中分离出BRP编码核酸，并克隆到TOPO-TA克隆质粒中(可从InVitrogen，Carlsbad，CA购买)，即获得被称为pBRP#5的质粒，PCR使用的正向引物的序列为CCGACGCGTTGACACCTGAAAACTGGAG(SEQ ID NO：5)，反向引物的序列为CCGACGCGTGAAAGGATCTCAAGAAGATC(SEQ ID NO：6)。用限制性酶ApaI和BamHI剪切pBRP#5质粒，并将获得的含有BRP编码核酸的0.6kb片段连接到proto-pTS的5.9kb ApaI/BamHI片段中，即获得pTS-BRP质粒。BRP编码核酸的5’和3’端的克隆位点可用来插入效应分子编码核酸。
6.1.5.pTS-BRPTNF-α质粒
有一种质粒(pTS-BRPTNF-α)可以使BRP编码核酸和trc启动子驱动的TNF-α编码核酸进行pTS介导的染色体整合，该质粒的构建方法如下。用限制性酶Bgl II剪切上述用于构建pTS-TNF-α的Asd34TNF-α质粒，然后将编码trc启动子驱动的TNF-α编码核酸的1.1kb片段连接到pTS-BRP的Bam HI位点中，即获得pTS-BRPTNF-α质粒。
6.2.将效应分子编码核酸整合到沙门氏菌宿主的染色体中
此处描述的系统采用丝氨酸或甘氨酸的ΔserC-营养缺陷型沙门氏菌菌株，以及整合到染色体的活性转录区后可重建丝氨酸/甘氨酸原养型的质粒。但本领域的技术人员都了解，染色体整合菌的筛选也可以使用其他筛选标记，这些标记也处在本发明的范围内。可参考，例如，Kleckner et al.，1991，Meth.Enzymol.204：139-180。
有多种本领域熟知的方法可用来将含有效应分子编码核酸的pTS或pTS-BRP质粒引入serC-沙门氏菌菌株，其中包括化学转化法和电穿孔法。引入效应分子编码核酸后，在含有氨苄青霉素的生长培养基中将沙门氏菌至少培养2小时，更优选的是培养6小时或更长时间。然后将细菌放在可筛选丝氨酸原养型细菌的培养基中。Atlas，R.M.“微生物培养基手册”L.C.Parks，ed.CRC Press，Boca Raton，Florida，1993。含有染色体整合效应分子编码核酸的细菌可以在这种选择培养基上生长。然后如下所述测定效应分子编码核酸的表达。效应分子编码核酸的表达可通过本领域技术人员已知的任何几种方法来测量，如酶学活性、生物活性、RNA印迹分析，或蛋白印迹分析。
6.2.1.由沙门氏菌表达的TNF-α的递送与表达
如上文所述将trc启动子驱动的TNF-α编码核酸插入到pTS-BRP的BamHI位点中，即获得pTS-BRPTNF-α质粒。利用本领域的常规方法将pTS-BRPTNF-α质粒电穿孔到鼠伤寒沙门氏菌减毒菌株VNP20009菌株中(参考国际专利WO99/13053)，该菌株被构建成serC-缺陷型，因而其基因型为ΔmsbB、ΔpurI、ΔserC(图2)。尽管不受原理的限制，但这种质粒整合到该细菌的基因组中后可以使serC编码核酸激活，从而产生serC+表型。因此，将电穿孔后的细菌铺在补加有腺嘌呤的M56琼脂平板上，即可筛选出带有染色体整合TNF-α编码核酸的细菌。细菌的进一步鉴定显示其丧失了氨苄青霉素抗性，这表示质粒已丧失，并且基于质粒的TNF-α表达也随之丧失。
为了对定向于肿瘤的细菌的TNF-α表达进行检测和定量，将带有染色体整合TNF-α编码核酸的沙门氏菌培养过夜，然后取培养物样品进行蛋白印迹分析测定。图3特别显示一种代表性的氨苄青霉素敏感性serC+克隆的TNF-α表达，该克隆被称为pTS-BRPTNF-α克隆2。蛋白印迹分析结果表明，3.9×107cfu的pTS-BRPTNF-α克隆2细菌(第1泳道)表达了50ng以上的TNF-α蛋白(第5泳道)，说明TNF-α的表达水平高于10ng/107细菌。因此，沙门氏菌中由trc启动子驱动的染色体整合TNF-α编码核酸成功地表达出人TNF-α。
7.实施例：表达OMPA融合蛋白的定向于肿瘤的减毒细菌
蛋白与不同信号肽融合后的周质定位与使用的信号肽和蛋白都有关。例如，信号肽与蛋白的氨基端融合可以使该蛋白定位于细菌的周质腔。尽管不受原理的限制，但本发明人认为周质定位可促进细菌成分(如蛋白)的释放，因为该成分只需跨越单层膜即可被释放到周围环境中。相比之下，胞质定位的成分需要跨越细菌的内膜和外膜才能被释放到周围环境中。此外，某些蛋白的周质定位还对其生物活性有利。
有多种本领域已知的方法可用于将本发明的效应分子导向周质。该实施例说明，ompA信号肽与TNF-α、TRAIL(与TNF-α相关的凋亡诱导配体)和白介素-2等效应分子的氨基端融合可以使这些蛋白定位于周质并随后被加工。
7.1.OMPA-TNF-α融合蛋白的加工
利用全细胞裂解物的蛋白印迹分析方法检测四种不同克隆的TNF-α表达，这四种克隆都可以在JM109细菌中进行基于质粒的trc启动子驱动的ompA-TNF-α融合蛋白表达。周质定位的证明方法是，前体融合蛋白可以被定位于周质的一种信号肽酶剪切成成熟的TNF-α。用IPTG诱导后，所有四种克隆的TNF-α过表达都使TNF-α表现为约20kd的二条迁移线(图5，第4-7泳道)，这两条线相当于未加工的和加工的形式。为便于比较，用一种带有染色体整合TNF-α编码核酸并能够表达成熟(加工)形式TNF-α的沙门氏菌菌株作为阳性对照(图5，第3泳道)。在不含TNF-α编码核酸的细菌中未检测到TNF-α表达(图5，第2泳道)。
这些结果说明，成熟形式的人TNF-α蛋白与大肠杆菌ompA信号肽的融合蛋白(如图4所示)在大肠杆菌中表达时可导致周质定位和加工。此外，还不知道一种分泌蛋白的过表达是否会因为压制正常的分泌装置而对宿主细菌产生毒性。加工形式的ompA-TNF-α的该表达结果则表明，正常的分泌装置可以容纳高水平的分泌蛋白表达。
7.2.OMPA-TRAIL融合蛋白的加工
将ompA信号肽使TNF家族成员定位于周质的能力扩展到另一种TNF家族成员TRAIL(与TNF-α相关的凋亡诱导配体)。在这些实验中，是将表达成熟形式人TRAIL(hTRAIL)的trc启动子驱动的TRAIL编码核酸与ompA信号肽的编码序列相融合(如图6所示)。共检测了两种不同的ompA/TRAIL连接形式，一种可编码一个NcoI位点，另一种可编码一个NdeI位点(参考图6的含有NdeI的序列)。图7显示两种类型的克隆的蛋白印迹分析结果。蛋白印迹分析采用的是一种抗hTRAIL抗体，其结果表明，采用NcoI连接方式的ompA-TRAIL在细菌中过表达后，可同时产生加工形式的(282kd)和未加工形式的(30.2kd)hTRAIL(图7，第2-4泳道)，而采用NdeI连接方式的ompA-TRAIL在细菌中过表达后只产生加工形式的hTRAIL(图7，第4-7泳道)，这说明NdeI连接方式可获得更有效的加工。
这些结果说明，成熟形式的人TRAIL蛋白与大肠杆菌ompA信号肽的融合蛋白可导致周质定位和加工。此外，还不知道分泌蛋白的过表达是否会因为压制正常的分泌装置而对宿主细菌产生毒性。加工形式的ompA-TRAIL的该表达结果则表明，正常的分泌装置可以容纳高水平的分泌蛋白表达。
7.3.OMPA(8L)-IL-2融合蛋白的加工
以融合蛋白形式表达一种次级效应分子(IL-2)。将成熟(C125A)hIL-2与上文用于TNF-α和TRAIL的野生型ompA信号肽融合不会引起对IL-2的加工。为了检测人IL-2效应分子的周质定位和加工，将成熟形式的人(C125A)IL-2与表示为ompA(8L)的一种ompA修饰信号肽相融合，如图8所示。这种ompA修饰信号肽的改进方法是，用图8所示的氨基酸替换ompA信号肽中的第6-17位氨基酸。图9显示其表达和加工的检测结果(第6和第7泳道)。每个泳道代表一个单克隆。蛋白印迹分析的结果表明，使用ompA(8L)信号肽可导致基本彻底的加工(图9，第6和第7泳道)。
7.4.PHOA(8L)-IL-2融合蛋白的加工
检测人IL-2的另一种融合蛋白的周质定位和加工，并与第7.3节的融合蛋白进行比较。进行表达和加工检测的是图10所示的成熟形式的人(C125A)IL-2与phoA修饰信号肽的融合蛋白，该融合蛋白表示为phoA(8L)。图9显示其表达和加工的检测结果。使用phoA(8L)合成信号肽可导致部分加工(图9，第4和第5泳道)，而使用ompA(8L)信号肽可导致更彻底的加工(图9，第6和第7泳道)。
这些结果表明IL-2的定位和加工可以用不同的信号肽来提供。这些结果还说明，蛋白与不同信号肽融合后的周质定位与使用的信号肽和蛋白都有关。
这些融合蛋白的研究结果表明，可通过与OmpA或PhoA等蛋白信号肽融合的方法使IL-2等本发明的次级效应分子表达并定位于细菌周质。本领域的普通技术人员都明白，还可以用其他信号肽来实现效应分子的周质定位。本领域的普通技术人员还知道，可以用本发明的其他效应分子替代这些实施例中描述的效应分子。
8.实施例：表达成熟形式TNF-α的沙门氏菌(ΔMSBB，ΔPURI)的抗肿 瘤作用
下述实施例说明，含有一种初级效应分子(如一种TNF家族成员)的编码核酸的定向于肿瘤的减毒细菌可以将这种初级效应分子递送至哺乳动物的肿瘤，并且可导致肿瘤体积减小。
在特定时期的鼠结肠38癌模型中评定TNF-α表达使鼠伤寒沙门氏菌的抗肿瘤作用提高的能力。这些实验是把结肠38肿瘤的1mm3肿瘤碎片移植到C57BL/6小鼠中，使肿瘤生长到平均大小约0.3g，此时将这些动物随机分组(n＝10)并进行如下处理：1)不处理；2)鼠伤寒沙门氏菌(ΔmsbB、ΔpurI、serC-)(亲代菌株)；和3)pTS-BRPTNF-α(上述的克隆2)。各组小鼠或是不处理，或是接受1×106cfu适当菌株的单次静脉内注射。从细菌接种时开始，每周测量肿瘤大小。
在注射可表达TNF-α的定向于肿瘤的减毒沙门氏菌的一组中，处理后第2周即表现出明显的肿瘤退化，在处理后的4周内发现6只小鼠的肿瘤完全退化(图11)。在不处理组中，肿瘤的大小逐渐增加，而在亲代鼠伤寒沙门氏菌(ΔmsbB、ΔpurI、serC-)菌株处理的一组中，处理后第3-第4周之间表现出肿瘤的部分退化，此后，肿瘤的大小逐渐增加(图11)。
这些结果说明，定向于肿瘤的减毒沙门氏菌能够表达并向肿瘤递送TNF家族成员等效应分子。这种沙门氏菌可用于肿瘤的治疗，并且与不表达TNF家族成员的亲代沙门氏菌菌株相比可促进肿瘤的退化。
由染色体整合核酸表达TNF-α的沙门氏菌能够使肿瘤完全退化，这说明染色体整合的效应分子编码核酸可以进行生物学意义上的有效表达。
9.实施例：由表达BRP的细菌加强核酸分子的递送
为了证明BRP活性可促进沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌的质粒释放，对一种定向于肿瘤的减毒沙门氏菌菌株进行构建，使其含有位于质粒上的BRP，并且含有另一种作为释放标记的质粒(带有AMP标记的pTrc99a)。为了测定BRP的活性，利用常规方法将含BRP或不含BRP的沙门氏菌培养在培养基中。再通过离心或过滤清除所得上清液中存留的任何细菌，然后将澄清的上清液添加到处于感受态的细胞中，并进行转化反应。然后将这些“接受”细胞平铺在LB amp上，以观测AMP标记质粒的摄取量。若BRP使AMP抗性菌落的数量增加，则说明表达BRP的菌株把更多的质粒释放到培养基中。结果总结于下表2：
表2
| 质粒 | Amp菌落/转化体的平均数 |
| pTrc99a | 125 |
| pTrc99a+BRP(pSW1) | 383 |
这些结果说明，BRP的存在使分泌到培养基中的amp质粒数量增加。因此，用表达BRP的细胞的上清液对“接受细胞”进行转化可获得更多的菌落。这些结果表明，BRP加强了次级效应分子的释放，其中包括核酸质粒的释放。因而这些结果说明BRP可用于质粒释放或DNA递送。此外，这些沙门氏菌菌株能够表达BRP，能够递送DNA，并且可保持群体的复制能力。
10.实施例：BRP的表达不会降低定向于肿瘤的减毒沙门氏菌的肿瘤导 向或肿瘤抑制能力
下述实施例说明，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可协同表达BRP和一种或多种效应分子，并且可以在不抑制细菌的肿瘤导向能力的条件下促进效应分子向肿瘤的递送。
将B16黑色素瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的右侧后肋，以获得实体瘤模型。肿瘤移植的方法是，通过胰蛋白酶消化由烧瓶分离细胞，清洗，并2.5×106细胞/ml的浓度悬浮在磷酸缓冲盐溶液中。第0天，取0.2ml细胞悬浮液试样进行注射，总量为5×105个细胞/鼠。移植约10天后，肿瘤的体积达到150-200mm3，此时将小鼠随机分成3组，每组10只，每组小鼠接受不同的处理。对照组(图12的曲线1)接受0.2ml PBS。另一组的每只小鼠接受0.2ml含有2×106c.f.u.的定向于肿瘤的减毒沙门氏菌菌株VNP20009(图12的曲线2)。第三组的每只小鼠接受0.2ml含有2×106c.f.u.的定向于肿瘤的减毒沙门氏菌菌株，该菌株含有一种质粒，该质粒含有BRP基因，该基因受其天然启动子调控(图12的曲线3)。BRP基因在大肠杆菌中是一种SOS诱导型基因，但是在不受原理限制的条件下，本发明人认为该基因在沙门氏菌中是一种部分组成型基因，可以产生低水平或中等水平的BRP蛋白，这种水平可以被肿瘤环境的SOS特性进一步提高。用表达BRP的VNP20009沙门氏菌或不表达BRP的VNP20009沙门氏菌注射的小鼠可表现出几乎相同的抗肿瘤反应，这说明BRP的表达没有改变这些沙门氏菌的存活能力或肿瘤导向能力。BRP表达和HSV-胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)表达对定向于肿瘤的减毒沙门氏菌的影响恰好相反，HSV-TK的表达可导致VNP20009的肿瘤抑制能力丧失(Pawelek etal.，1997，Cancer Res.57：4537-4544)。因此，该BRP系统无需改变即可用来提高初级效应分子和(或)次级效应分子向肿瘤的递送。
11.实施例：pepT启动子表达载体
该实施例说明，编码β-gal等报告基因的一种核酸分子能够在pepT启动子的调拉下在沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌的体外和体内表达。
11.1.pepT-BRP-βGAL表达质粒的构建
pepT启动子的克隆方法是，对来源于野生型鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)分离菌落的该区域进行PCR扩增，使用的引物如下：
正向引物：5’-AGT CTA GAC AAT CAG GCG AAG AAC GG-3’(SEQ IDNO：15)
反向引物：5’AGC CAT GGA GTC ACC CTC ACT TTT C-3’(SEQ ID NO：16)。
PCR的条件包括1个循环：95℃5分钟；35个循环：95℃1分钟，65℃1分钟，72℃2分钟；1个循环：72℃10分钟。将PCR产物克隆到PCR2.1克隆载体中(Invitrogen，Carlsbad，California)，即形成PepT/PCR2.1。
用NcoI和XbaI消化PepT/PCR2.1载体。凝集分离出pepT片段，并将其连接到已用相同的酶消化的β-gal Zterm载体中。Zterm(Genbank Bankit临时编号296495)是一种无启动子的β-gal质粒，其产生方法是βGal可读框克隆到pUC19中。所得质粒称为pepT-βGAL。
11.2.pepT-βGAL的体外表达及pepT-βGAL的活性测量
在无氧或有氧条件下将带有pepT-βGAL的沙门氏菌菌株YS1456(图13A的CC14；用于菌株的基因装配，参考WO96/40238)或VNP20009(图13A的CC16)培养至OD600为～0.5-0.8。利用Birge and Low(1974，J.Mol.Biol.83：447-457)的方法测量β-gal活性。结果显示于图13A，该结果说明这些细菌在无氧条件下生长可诱导出的14-24倍的β-gal活性。
11.3.pepT-βGAL的体内表达及pepT-βGAL的活性测量
用含有pepT-βgal表达质粒或一种BRP表达质粒(BIO101的pSW1(Vista，California)，该质粒含有pCloDF13BRP编码序列，该序列受其天然启动子调控)的沙门氏菌YS1456菌株细胞，或这两种质粒均包含的沙门氏菌YS1456菌株细胞对患有肿瘤的小鼠进行静脉内注射。注射5天后，将肿瘤和肝脏匀浆并分离出细菌，用于证明pepT-βgal质粒和(或)BRP质粒的存在不会干扰这些细菌的肿瘤导向能力。此外还测量肿瘤和肝脏匀浆物的βgal活性，用于确定能否在体内测量到βgal活性，以及pepT启动子是否在肿瘤的无氧环境中被诱导。结果显示于图13B，这些结果表明在肿瘤环境中获得了极高水平的pepT启动子活性。与背景水平相比，肝脏中的βgal表达水平没有明显的提高，其原因可能是pepT启动子在肝脏的有氧环境中活性较低，并且(或者)细菌载体的肝脏导向能力较弱。
12.实施例：四环素诱导型表达系统
该实施例说明，编码β-gal等报告基因的一种核酸分子能够在tet启动子的调控下在沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌中表达。
通过PCR扩增从TN10微转座子中克隆tet启动子，使用的引物如下：
正向引物：5’-GGA TCC TTA AGA CCC ACT TTC ACA TTT AAG T-3’(SEQ ID NO：17)
反向引物：5’-GGT TCC ATG GTT CAC TTT TCT CTA TCA C-3’(SEQID NO：18)。
PCR条件如下：1个循环：95℃5分钟；35个循环：95℃1分钟，60℃1分钟，72℃2分钟；以及1个循环：72℃10分钟。
凝集分离出～400bp的PCR片段，并将其克隆到PCR2.1载体中(Invitrogen)。用NcoI和BamHI消化PCR2.1/tet启动子载体。凝集分离出～400bp的tet启动子片段，并将其连接到已用相同的两种酶消化的无启动子的β-gal载体Zterm中。用连接混合物进行转化，并将转化的细菌铺在四环素/X-gal平板上。根据蓝颜色分离出阳性菌落。制备几个阳性菌落的提取物，并在含有四环素的条件下用Birge andLow(1974，J.Mol.Biol.83：447-457)的方法测定β-gal活性。分离出一种克隆，并测定在四环素的一种浓度范围内的β-gal表达。测定结果显示于图14，该结果说明四环素可诱导出剂量依赖性的β-gal活性。
13.实施例：表达内抑素的定向于肿瘤的减毒沙门氏菌对肿瘤生长的 抑制
下述实施例说明表达内抑素的定向于肿瘤的减毒沙门氏菌的产生方法和这种沙门氏菌对肿瘤的体内治疗效果。
13.1.内抑素表达质粒的构建
利用PCR方法从人胎盘cDNA库中扩增出内抑素，使用的引物如下：
正向引物：5’-GTG TCC ATG GGG CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAG-3’(SEQ ID NO：19)
反向引物：5’-ACA CGA GCT CCT ACT TGG AGG CAG TCA TGA AGC T-3’(SEQ ID NO：20)。
将所得PCR称为克隆到PCR2.1载体中(Invitrogen)。以构建的上述质粒为模板PCR扩增出六聚组氨酸-内抑素，使用的引物如下：
正向引物：5’-GTG TCC ATC GCT CGG CGG GCA AGT GTC GGG ACT GACCAT CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC CAC CGC GAC TTC-3’(SEQ ID NO：21)
反向引物：5’-GTG CGG ATC CCT ACT TGG AGG CAG TCA TGA AGC TG-3’(SEQ ID NO：22)。
PCR扩增的条件包括1个循环：95℃5分钟；30个循环：95℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟；以及1个循环：72℃10分钟。
所得产物是一种含有NcoI(5’)和BamHI(3’)限制性位点的DNA片段，该片段可编码氨基端含有MARRASVGTDHHHHHH肽序列(SEQ ID NO：23)的人内抑素。
用NcoI和BamHI消化PCR产物，凝集分离出550bp的产物，并将其连接到已用相同的酶剪切的pTrc99A载体中。将连接反应的产物转化到大肠杆菌DH5α和定向于肿瘤的减毒沙门氏菌VNP20009菌株中。
还将六聚组氨酸编码序列克隆到表达载体YA3334的NcoI/BamHI片段中。asd质粒PYA272(Curtiss III，美国专利5,840,483)的复制起始点被colE1(Bazaral and Helsinki，1970，Biochem 9：399-406)的复制起始点替换后就是PYA3334质粒。分离出阳性克隆产生的质粒DNA，并将其转化到沙门氏菌8324菌株中，该菌株是含有asd突变的VNP20009。该菌株是根据Curtiss III(美国专利5,840,483)描述的方法产生的。
13.2.由定向于肿瘤的减毒沙门氏菌进行内抑素的体外表达
将含有pTrc99A-六聚组氨酸-内抑素质粒的不同沙门氏菌VNP20009和大肠杆菌DH5α菌株培养至对数中期(O.D.600～0.6-0.8)，此时将各培养物分成两份，一份用0.1mM IPTG诱导trc启动子活性，另一份不加IPTG。再培养3个小时，然后制备细菌提取物，并利用抗-组氨酸抗体(Clontech，Palo Alto，California)进行蛋白印迹分析，以证明六聚组氨酸-内抑素的表达。图15A和15B显示的蛋白印迹结果分别证明了大肠杆菌DH5α和沙门氏菌VNP20009中的pTrc99A-六聚组氨酸-内抑素(HexHIS-内抑素)表达。trc启动子在缺乏IPTG的情况下不显示活性，但该启动子在沙门氏菌中具有组成型活性。六聚组氨酸-内抑素表现为约25kD的单一条带，这与该融合蛋白的推导分子量相符。
用trc启动子调控表达的YA3334质粒也可以类似地表达六聚组氨酸-内抑素融合蛋白。用抗-组氨酸抗体可以检测到具有25kDa的推导分子量的一种蛋白，该结果显示于图16。图16中的所有细菌培养物样品都用0.1mM IPTG诱导了3个小时。
13.3.表达内抑素的定向于肿瘤的减毒沙门氏菌对C38鼠结肠癌的疗 效
用2×2×2mm3的结肠38肿瘤碎片对9周龄的雌性C57BL/6小鼠进行皮下移植。当肿瘤的体积达到1000mm3时，取出肿瘤并切成2×2×2mm3的小块。再将小块连续传代几次，然后把获得的2×2×2mm3小块皮下移植到雌性C57BL/6小鼠的右肋。移植约24天后，肿瘤的体积达到150-200mm3，此时将小鼠随机分成6组，每组10只，每组小鼠接受不同的处理。对照组接受0.2ml PBS。另一对照组接受0.2ml含有1×106c.f.u.的定向于肿瘤的减毒沙门氏菌VNP20009菌株，该菌株带有对照asd质粒，即上文第5.6节描述的不含插入序列的asd质粒。第一试验组接受0.2ml含有1×106c.f.u.的一种VNP20009菌株，该菌株可表达一种位于asd质粒上的六聚组氨酸-内抑素融合蛋白。第二试验组接受另一种VNP20009菌株，该菌株含有与第一试验组相同的表达构建体，并且还可以表达BRP。
图17显示的实验结果显示六聚组氨酸-内抑素表达VNP20009菌株的肿瘤抑制效力。处理60天后，用内抑素表达VNP20009沙门氏菌处理的小鼠的中位肿瘤大小约为对照小鼠的13％，并且比含有空载体的VNP20009沙门氏菌处理的小鼠低30％以上。在存活的小鼠中，有许多小鼠表现为肿瘤大小的净变化值很低，这说明肿瘤生长的停滞，有一只小鼠表现出肿瘤的明显退化。O’Reilly等人(1997，Cell88：277-285)发现，内抑素可以在包涵体中积累，所以该处理方法的不完全穿透性或效率不足是这种内抑素递送系统不完善的最可能原因。BRP的表达可以提高这种内抑素递送系统的效率。BRP表达受其天然启动子调控，这种启动子在细菌中通常表现为一种SOS反应。实验表明，BRP的表达可以使小鼠的平均肿瘤体积降低到对照小鼠平均肿瘤体积的约6％。此外，在用六聚组氨酸-内抑素和BRP处理的小鼠中，有几只小鼠表现为肿瘤体积随时间延长而显著减小，这些肿瘤的体积退化为原肿瘤体积的约10％或更低。BRP的作用可能有两方面：一是BRP本身具有抗肿瘤活性，二是BRP可促进周质成分释放，同时在一定程度上促进胞质成分的释放，其中包括内抑素，从而可避免这种蛋白在包涵体中积累。
13.4.表达内抑素的定向于肿瘤的减毒沙门氏菌对DLD人结肠癌的疗 效
将生长至对数期的DLD1细胞培养物进行胰蛋白酶消化，用PBS清洗，然后在PBS中形成5×107细胞/ml的悬浮液。从单细胞悬浮液中取0.1ml试样，其中含有5×106个细胞，将试样皮下注射到9周龄的雌性裸鼠(Charles River的Nu/Nu-CD1)的右肋。将小鼠随机分成3组，每组10只，然后在注射后10-15天或肿瘤体积达到200-400mm3时进行分期。
第一组小鼠为对照组，每只小鼠接受0.3ml的PBS注射。第二组小鼠接受0.3ml含有1×106c.f.u.的定向于肿瘤的减毒沙门氏菌VNP20009菌株，该菌株带有对照asd质粒。第三组小鼠接受0.3ml含有1×106c.f.u.的定向于肿瘤的减毒沙门氏菌VNP20009菌株，该菌株含有一种asd质粒，该质粒可表达六聚组氨酸-内抑素融合蛋白和BRP。对肿瘤进行监控并每周测量两次。图18是经过这三种处理后的肿瘤体积的示意图，该结果说明由定向于肿瘤的减毒沙门氏菌表达的六聚组氨酸-内抑素对DLD1人结肠癌的抑制作用。
带有PYA3332空质粒的VNP20009不能明显抑制肿瘤的生长。而表达内抑素和BRP的VNP20009能够抑制肿瘤的生长。这些结果说明，内抑素与BRP的组合可提高带有PYA3332载体的VNP20009(8324菌株)的抗肿瘤活性。
14.实施例：由定向于肿瘤的减毒沙门氏菌表达抗血管生成因子
下述实施例说明对沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌进行加工的方法，这些细菌经过加工可表达抗血管生成因子、血小板反应蛋白AHR、血小板因子-4和apomigren。
14.1.构建含有血小板反应蛋白AHR核酸编码序列的质粒
对肽序列TiP13.40：AYRWRLSHRPKTGFIRVVMYEG(SEQ ID NO：24)进行反向设计和密码子优化，用于在沙门氏菌中表达，该序列相当于血小板反应蛋白的抗血管生成同源区(AHR)(参考，例如，专利申请C07K-14/78)，所得DNA序列为：GCG TAC CGC TGG CGC CTG TCC CAT CGCCCG AAA ACC GGC TTT ATC CGC GTG GTG ATG TAC GAA GGC(SEQ ID NO：25)。用互补寡核苷酸(Oligo13：40-1和Oligo13：40-2)合成这种肽。在5’端添加一段OMPA加工区编码序列和一种SpeI限制性位点。在3’端添加终止密码子和BamHI限制性位点。将两种寡核苷酸退火，以产生双链DNA片段。用SpeI/BamHI剪切该DNA片段，然后与SpeI/BamHI剪切的pTrc801IL2载体相连接，即产生含有全长OmpA修饰前导序列的pTrc801-13.40质粒。该序列被加工后可产生全长13.40血小板反应蛋白肽。
Oligo 13.40-1：
5’
gtggcgcaggcgGCGTACCGCTGGCGCCTGTCCCATCGCCCGAAAACCGGCTTTATCCGCGTGGTGATGTACGAAGGCTAA
3’(SEQ ID NO：26)
Oligo 13.40-2：
5’
TTAGCCTTCGTACATCACCACGCGGATAAAGCCGGTTTTCGGGCGATGGGACAGGCGCCAGCGGTACGCcgcctgcgccac 
3’(SEQ ID NO：27)
(斜体字为限制性位点，加下划线的为OmpA加工的识别位点)
14.2.构建含有编码血小板因子-4肽(47-70)的核酸序列的质粒
对含有血小板因子-4(PF-4；参考，例如，Maione et al.，1990，Science 247：77-79和Jouan et al.，1999，Blood 94：984-993)的C-端第47-70位氨基酸残基的肽进行密码子优化，用于在沙门氏菌中表达。这种肽，如下所示，含有一种使PF-4对CFU-GM祖细胞具有抑制活性的DLQ基序，并且含有一种碱性氨基酸簇，它是一种主要肝素结合区。
血小板因子-4：
EAEEDGDLQCLCVKTTSQVRPRHITSLEVIKAGPHCPTAQLIATL
(SEQID NO：28)
信号肽＝加下划线的黑体字
Lys 61、62、65、66＝主要肝素结合区(黑体字)
DLQ(7-9，54-56)＝对CFU-GM祖细胞的抑制活性(黑体字)
用互补寡核苷酸(Oligo PF4-1和Oligo PF4-2)合成这种肽，在5’端添加一段OmpA加工区编码序列和一种SpeI限制性位点。在3’端添加终止密码子和BamHI限制性位点。将两种寡核苷酸退火，以产生双链DNA片段。将限制性消化后的该DNA片段与SpeI/BamHI消化的pTrc801载体相连接，即产生pTrc801-PF4质粒。该序列被加工后可产生全长PF-4(47-70)肽。
Oligo PF4-1
5’
gtggcgcaggcgAACGGCCGCAAAATCTGCCTGGACCTGCAGGCGCCGCTGTAC人AAAAAATCATCAAAAAACTGCTGGAAAGCTAAgcg3’(SEQ IDNO：29)
Oligo PF4-2
5′
TTAGCTTTCCAGCAGTTTTTTGATGATTTTTTTGTACAGCGGCGCCTGCAGGTCCAGGCAGATTTTGCGGCCGTTcgcctgcgccac 
3’(SEQ ID NO：30)
(斜体字为限制性位点，加下划线的为OmpA加工识别位点)
14.3.构建含有编码apomigren的核酸序列的质粒
抗血管生成性apomigren肽
(IYSFDGRDIMTDPSWPQKVIWHGSSPHGVRLVDNYCEAWRTADTAVTGLASPLSTGKILDQKAYSCANRLIVLCIENSFMTDARK(SEQ ID NO：31)；参考，例如，国际专利WO99/29856)相当于restin的C-端，它是胶原蛋白XV的一种蛋白水解片段。设计寡核苷酸(Oligo Apom5F和Oligo Apom6F)，用于从人cDNA中扩增该DNA片段。在5’端添加一段OmpA加工区编码序列和一种SpeI限制性位点。在3’端添加终止密码子和BamHI限制性位点。
Oligo Apom5F：5′-
gtggcgcaggcgATATACTCCTTTGATGGTCG-3′(SEQID NO：32)
Oligo Apom6R：5′-
TTACTTCCTAGCGTCTGTCATGAAACTG-3′(SEQ IDNO：33)
(斜体字为限制性位点，加下划线的为OmpA加工的识别位点)
以胎盘cDNA为模板用PCR方法获得具有正确大小的一种片段。用SpeI/BamHI剪切该PCR产物，然后与SpeI/BamHI消化的含有OmpA修饰信号序列的pTrc801载体相连接，即产生pTrc801-Apom质粒。该序列被加工后可产生Apomigren肽。
14.4.由沙门氏菌产生的抗血管生成肽抑制内皮细胞增殖
将pTrcOmpA-内抑素、pTrc801-PF4和pTrc801-13.40质粒电穿孔到定向于肿瘤的减毒沙门氏菌VNP20009菌株中。筛选出表达pTrcOmpA-内抑素、pTrc801-PF4和pTrc801-13.40的沙门氏菌菌株，并按Feldman et al.，2000，Cancer Res.60：1503-1506和Blezingeret al.，1999，Nature Biotech.17：343-348所述测定其抗增殖活性。将5ml单菌落培养物培养4小时。把细胞沉淀重悬于1/20体积的含有100mg/ml庆大霉素的HUVEC培养基中，并连续进行3次冻/融循环，即获得细胞裂解物。离心并用0.2mm针筒式滤器过滤除菌，以使裂解物澄清。将10、25或50ml裂解物添加到含有人静脉内皮细胞(HUVECs)和100ml基本培养基、2％FCS和10ng/ml FGF的96孔板中。对照采用含有pTrc空质粒的沙门氏菌。将板保温72小时，并用MST测定法(Mosman et al.，1983，J.Immunol.Methods 65：55-63)进行增殖测量。
图19和20中显示的初步结果表明，沙门氏菌表达的血小板因子-4肽(PF4-2)、血小板反应蛋白肽13.40(13.40-3)和内抑素似乎具有40-60％的抗增殖活性。
15.实施例：由定向于肿瘤的减毒沙门氏菌表达细菌素家族成员
该实施例说明，含有一种细菌素家族成员编码核酸的定向于肿瘤的减毒细菌，如沙门氏菌，可以表达该细菌素家族成员。
15.1.COLE3质粒的构建
文中描述的质粒可作为本发明的特别实施方案的说明性实例。本领域的技术人员都很清除，通过本领域已知的方法可以用其他适当的启动子或效应分子替换诸如trc启动子和(或)细菌素编码核酸等启动子和(或)效应分子编码核酸。
15.1.1.pE3.shuttle-1中间载体质粒
pE3.shuttle-1是一种中间载体，可用于将含有多克隆位点和具有克隆/筛选作用的lacZ片段的盒创建到ColE3-CA38质粒载体中。为便于将BRP克隆到E3中，首先把BRP克隆到一种中间穿梭载体上(图21)。该载体含有一种lacZ片段，可用于在乳糖上从染色体lacZ含有突变的细菌菌株中筛选克隆。然后将BRP片段作为含有lacZα互补片段的一种盒克隆到E3质粒的SmaI位点中(图22)。该步骤可借助lacZ片段来筛选插入序列(即Lac+)。尽管天然E 3质粒不含抗生素筛选标记(图23)，但可以用晕测定法(K.G.Hardy，“质粒实用方法”，1987，ed.中的Pugsley，A.P.and Oudega，B.“大肠杆菌素及其质粒的研究方法”；Gilson，L.et al.EMBO J.9：3875-3884))对质粒的存在情况进行筛选。这种穿梭载体有利于将BRP克隆到E3质粒上，而且对任何能够与E3或E3/BRP连接的DNA都是如此。然后将新产生的E3/BRP质粒转化到41.2.9中，并进行活性测试。晕形成测定的初步结果说明，质粒上的BRP不会干扰这种菌株的E3产生。为了确定41.2.9 E3/BRP是否比41.2.9 E3具有更高的活性，对各菌株产生的E3致死单位量进行测定(图24)。41.2.9E3/BRP产生的致死单位量比41.2.9E3高100％，这说明该菌株具有比41.2.9E3更高的活性。
15.1.2.用于测量E3活性的晕“穿刺”测定法
将敏感型测试菌株(SK522)培养至OD600为0.8。在3ml预热的(～55℃)的LB软琼脂中添加100μl测试菌株(用于100×15mm平皿)，并快速倒在LB琼脂平板上。将平板温和振荡以使覆盖物在平板上均匀铺展，然后使琼脂凝固10-15分钟。用牙签挑取用于E3活性测定的大肠杆菌或沙门氏菌菌株，并“穿刺”到琼脂中。然后于37℃将琼脂平板倒置培养过夜。第二天，在E3穿刺位置周围会出现晕或亮区，这是因为分泌的大肠杆菌素E3杀死了敏感型细菌。还可以用烷化剂(如丝裂霉素)、紫外线或X-射线等多种SOS-诱导物中的任一种对菌落做进一步诱导，以提高E3的产量或分泌量。
图25显示一次晕测定的结果。在生长有一种敏感型菌株菌苔的培养皿中，当一种细菌菌株分泌大肠杆菌素时，分泌的大肠杆菌素可向外扩散并杀死菌苔中包含的细菌，这些细菌裂解后即形成一个亮区或晕。晕的大小与大肠杆菌素的分泌量相关。图25显示多种菌株的测定结果。在不含colE3-CA38质粒的菌株周围没有观测到晕。这些沙门氏菌菌株可以在不诱导的情况下产生大肠杆菌素。另外还可以看出，经过不同类型的诱导后(即烷化剂、紫外线，X-射线)，所有晕的大小都呈剂量依赖性地增加。
15.1.3.用于选择性E3克隆的覆盖测定法
将不同稀释度(最高1∶10,000)的转化体铺在LB上，37℃培养2小时。然后按上文晕测定部分的描述制备敏感型测试菌株，并将其覆盖在软琼脂上。使平板凝固10分钟，然后于37℃倒置培养过夜。第二天即出现小亮区(类似于嗜菌斑)，在亮区的中间有一个(或多个)小菌落。
15.1.4.“噬斑”或晕纯化测定法
然后用无菌巴斯德吸管分离出位于上述覆盖琼脂的亮区中心的小菌落。当一个晕中没有可见菌落或有多个菌落时，可以用无菌巴斯德吸管挑出整个晕。将挑出的菌落或晕转移到500μl LB中。进行不同程度的稀释(最高1∶10,000)，并重新铺在LB琼脂上，然后于37℃培养2小时。再用上述的敏感型测试菌覆盖。第二天，所有的或几乎所有的菌落周围都应出现晕。
16.实施例：体内注射E3，并测定沙门氏菌中的质粒存留百分率
下述实施例说明，colE3-CA38质粒可以存留在活体沙门氏菌中。
该研究使用的是41.29(或41.2.9E3-CA38)注射30天后的两只小鼠的肿瘤匀浆物和肝脏匀浆物。在以下的描述中，L＝肝脏，T＝肿瘤。将所有四种匀浆物铺平板，以产生CFU，挑取菌落并进行msbB PCR分析和大肠杆菌素产量测定。用四种匀浆物获得与41.2.9类似的菌落的几乎纯净的培养物。各挑出5个菌落用于大肠杆菌素和PCR分析。由于在41.2.9E3肝脏匀浆物的平板中似乎混合有产大肠杆菌素群体和不产大肠杆菌素群体，所以再从41.2.9E3T平板和L平板中挑30个菌落用于进一步分析。根据这些结果，再从41.2.9E3的肿瘤平板和肝脏平板中挑取100个菌落，用于大肠杆菌素产量及msbB PCR测定。由综合数据计算出质粒的分布和存留率。
E3体内注射及沙门氏菌中质粒存留百分率的测定结果显示于下表3。
表3
| 组织 | CFU/ml | 组织重量 | CFU/ml | 大肠杆菌素阳性数 | msbB PCR中的阳性百分率 | 质粒存留百分率 |
| 41.29L | 1.07E+03 | 1.33 | 4.02E+03 | 0/5 | 100％ | n/a |
| 41.29T | 1.26e+07 | 0.26 | 2.42E+08 | 0/5 | 100％ | n/a |
| 41.29E3L | 1.15E+04 | 2.34 | 2.46E+04 | 87/135 | 100％ | 64.44 |
| 41.29E3T | 1.09e+06 | 0.35 | 1.56E+07 | 134/135 | 100％ | 99.26 |
为了能在体内发挥作用，并将其他基因携带至体内的肿瘤部位，colE3质粒必须有效地存留在体内。该实验的结果令人惊奇并且十分有益，由于效应剂的目标是肿瘤，因而对肝脏本身的影响会比较低。
17.实施例：不同41.2.9.菌株在M27肺肿瘤模型中的肿瘤定向
下述实施例可说明41.2.9 colE3、41.2.9 colE3BRP以及41.2.9colE3 BRP-m(修饰的BRP)沙门氏菌菌株的肿瘤导向能力。
将下表4列举的沙门氏菌菌株注射到患有M27肺肿瘤的动物中，并在第7天将这些动物处死。次日，测量器官重量并计算出cfu/g。将肿瘤和肝脏匀浆并铺在msbB上，以测定集落形成单位(c.f.u.)。在第1、第2、第4和第6组中，积累在肿瘤内的菌株都约为4×108cfu/g，而在肝脏中的聚集量各不相同，范围是6×104-4×106cfu/g。各组数据的平均cfu/g总结于表4。所有菌株都表现出良好的肿瘤聚集作用(高于108cfu/g组织)，并且在肿瘤和肝脏中聚集的比率都呈阳性。由BRP colE3获得的比率最高，但不一定比其他所有可用的菌株都高。E3和E3BRP菌株在肿瘤内的聚集水平算比较高，在肿瘤和肝脏中积累的比率为100-200∶1。
表4
| 组别 | 菌株 | 肿瘤(T)肝脏(L) | cfu/g组织 | 比率(肿瘤∶肝脏) |
| 1 | 41.2.9/E3 | T | 5.1±1.1×108 | 131∶1 |
| 1 | 41.2.9/E3 | L | 3.9±3.6×106 | |
| 2 | 41.2.9/E3BRP | T | 4.6±2.7×108 | 209∶1 |
| 2 | 41.2.9/E3BRP | L | 2.2±1.3×106 | |
| 61 | 41.2.9/E3BRPm | T | 3.5±0.15×108 | 90∶1 |
| 61 | 41.2.9/E3BRPm | L | 3.9±3.6×106 |
BRPm是指在第96位(G突变成A，导致甘氨酸变为精氨酸)和第114位(T突变为A，导致丝氨酸变为苏氨酸)含有点突变的一种修饰BRP。BRPm突变体不再引起准裂解，但仍能够使细菌分泌蛋白(van derVal，F.，Koningstein，G.，Ten Hagen，C.M.，Oudega，B.and Luirink，J.(1998)通过大肠杆菌对细菌素释放蛋白(BRP)介导的蛋白释放进行优化：来源于pCloDF13的BRP基因的随机诱变使致死性和准裂解与蛋白释放解偶联。Applied and Environmental Microbiology vol.64pp 392-398)。
18.实施例：41.2.9/COLE3对C38鼠结肠癌的疗效
下述实施例说明41.2.9/ColE3对C38鼠结肠癌生长的抑制能力。
将结肠38肿瘤碎片(2×2×2mm3)移植到C57BL/6小鼠(雌性，9周龄)的皮下。当肿瘤的体积达到1,000mm3时，在无菌条件下从小鼠中取出肿瘤并切成小块(约2×2×2mm3/块)，将上述过程重复5次。用肿瘤移植针把小块移植到小鼠右肋的皮下，此时间记为肿瘤移植第0天。
当肿瘤体积达到150-200mm3时，用沙门氏菌对小鼠进行随机给药，此时间记为沙门氏菌给药第0天。室温下将冷冻保存的41.2.9和41.2.9/ColE3融解，分别用PBS稀释至终浓度为7.5×106cfu/ml。第0天时，按照指定组别用0.2ml细菌悬浮液试样(1.5×106CFU/鼠)对小鼠进行静脉内给药。将细菌悬浮液稀释成1×103CFU，然后铺在平板上并保温过夜，以确定给药的细菌数。每周对肿瘤进行两次测量，直到实验结束。每组(ColE3)解剖3个肿瘤并进行处理，以确定cfu和肿瘤存留情况。
组：
| 小鼠 | ||
| 1. | 不处理对照 | 8 |
| 2. | 41.2.9(1.5×106/鼠) | 8 |
| 3. | 41.2.9/ColE3(1.5×106/鼠) | 8 |
41.2.9/ColE3对C38鼠结肠癌的作用结果显示于图26。这些数据说明，静脉内注射VNP20009(41.2.9)的小鼠能够显著抑制C38鼠结肠癌的生长。此外，用含有ColE3质粒的VNP20009处理的小鼠可表现出肿瘤退化(即实验结束时的肿瘤比开始时小)。
19.实施例：VNP20009/COLE3对裸鼠中的DLD1人结肠癌的抗肿瘤活 性
下述实施例说明，沙门氏菌突变体VNP20009/ColE3(41.2.9/ColE3)与沙门氏菌突变体41.2.9相比具有更高的抑制DLD1人结肠癌生长的能力。
通过胰蛋白酶消化取出生长至对数期的DLD1细胞，用PBS清洗，并在PBS中重悬为5×107细胞/ml。第0天时，将单细胞悬浮液(0.1ml)注射到裸鼠(雌性Nu/Nu-CD1，9周龄；Charles River)的右肋皮下(5×106细胞/鼠)。肿瘤移植约10-15天后，当肿瘤体积达到300-400mm3时，将小鼠以每组10只进行随机分组并分期。1天以前需计算沙门氏菌突变体41.2.9和41.2.9/ColE3的CFU。将细菌(41.2.9和41.2.9/ColE3)稀释成1×107CFU/ml。在指定的天数时，用0.2ml细菌悬浮液试样(2×106CFU/鼠)对小鼠进行静脉内注射。将细菌悬浮液稀释成1×103CFU，各溶液取100μl铺在msbB平板上并保温过夜。
第二天对细菌菌落计数。每周对肿瘤进行两次测量。
组：
| 小鼠 | ||
| 1. | 不处理对照(PBS) | 10 |
| 2. | 41.2.9(2×106/鼠) | 10 |
| 3. | 41.2.9/ColE3(2×106/鼠) | 10 |
41.2.9/ColE3对裸鼠中DLD1人结肠癌的抗肿瘤活性结果显示于图27。含有大肠杆菌素E3的41.2.9菌株可表现出比41.2.9菌株更高的活性。
20.实施例：41.2.9/COLE3对C57BL/6小鼠中的B16鼠黑色素瘤的疗 效
下述实施例说明沙门氏菌突变体41.2.9/ColE3对B16-F10黑色素瘤生长的抑制能力。
通过胰蛋白酶消化取出生长至对数期的B16-F10细胞，用PBS清洗，并在PBS中重悬为5×106细胞/ml。第0天时，将单细胞悬浮液(0.1ml)注射到C57BL/6小鼠(雌性，9周龄)的右肋皮下(5×105细胞/鼠)。第9天，当肿瘤体积达到150-200mm3时，将小鼠随机分组，每组10只。室温下将冷冻保存的沙门氏菌克隆41.2.9和41.2.9/ColE3融解，分别用PBS稀释至终浓度为7.5×106cfu/ml。第9天时，按照指定组别用0.2ml细菌悬浮液试样(1.5×106CFU/鼠)对小鼠进行静脉内给药。将细菌悬浮液稀释成1×103CFU，然后铺在msbB平板上并保温过夜，以确定给药的细菌cfu数。每周对肿瘤进行两次测量，直到实验结束。
组：
| 小鼠 | ||
| 1. | 不处理对照 | 10 |
| 3. | 41.2.9(1.5×106/鼠) | 10 |
| 5. | 41.2.9/ColE3(1.5×106/鼠) | 10 |
41.2.9/ColE3对小鼠中B16鼠黑色素瘤的作用结果显示于图28。这些数据说明，静脉内注射41.2.9(41.2.9)的小鼠能够显著抑制B16鼠黑色素瘤的生长。此外，用41.2.9/ColE3处理的小鼠与只用41.2.9处理的小鼠相比，可在早期时点(37天以前)表现出肿瘤尺寸的明显减小。这一发现极为重要，因为肿瘤尺寸越小，对其他疗法(例如化疗剂和X-射线等辐射)就越敏感。
21.实施例：与BRP结合的41.2.9/E3的抗肿瘤作用
下述实施例说明，BRP和E3在沙门氏菌突变体41.2.9中的共表达可提高该突变体的抗肿瘤作用。
BRP和E3在沙门氏菌突变体41.2.9中的共表达可提高该细菌在体外的E3分泌量。如果BRP能够提高沙门氏菌在体内的E3分泌量，则可以断定细胞外E3的增加使其更易于接触肿瘤细胞，并由此提高对这些细胞的细胞毒性。在该实验中共测试4组动物(每组10只)：
| 组号 | 处理方法 |
| 1 | 对照(不处理) |
| 2 | 41.2.9 |
| 3 | 41.2.9/E3 |
| 4 | 41.2.9/E3/BRP |
该实验使用的模型是人肺癌HTB177系。第1天时，将细胞移植到小鼠的肋部皮下。第14天时，当肿瘤达到约500mm3，用1×106cfu的上表所述菌株对动物进行静脉内注射，第1组则注射生理盐水。每周测量肿瘤体积，直到第24天。表5显示的结果说明，尽管41.2.9本身能够抑制肿瘤生长(抑制40％)，但与E3组合后可以使抗肿瘤效力提高(63％)。而在该模型中使用含有E3及BRP的菌株可以进一步提高抗肿瘤效力(与不处理对照相比可抑制67％)，这种抑制作用的增强在早期时点尤其明显(表5)。
表5：与不处理对照相比的肿瘤生长抑制百分率
| 菌株 | 第17天 | 第20天 | 第24天 |
| 41.2.9 | 50 | 38 | 40 |
| 41.2.9/E3 | 63 | 58 | 63 |
| 41.2.9/E3/BRP | 97 | 82 | 67 |
结论是，与不处理的对照和只用41.2.9/E3处理相比，用含有细胞毒性大肠杆菌素E3及增强释放系统BRP的沙门氏菌处理可提高抗肿瘤效力。
22.实施例：含有大肠杆菌素E3的沙门氏菌与X线治疗相结合
下述实施例说明，与只用X-线处理相比，用41.2.9和2次X-线组合处理可明显延长小鼠的存活时间。
进度表如下：第0天，利用B16F10黑色素瘤给药(5×105细胞/鼠)的方法将肿瘤移植到100只C57B6雌性小鼠(5-7周龄)的右侧腹部皮下。第8天，注射含有大肠杆菌素E 3的沙门氏菌41.2.9，并在第12和第26天进行x-线处理。
表6显示用含有大肠杆菌素E3的沙门氏菌及x-射线组合处理的结果。
表6
| 类型 | n＝() | 长至1g的天数 | 平均 | T/C |
| 假处理15Gy | (6) | 12，12，18，18，18，21 | 17 | 1.0 |
| J 15Gyx射线12dpt，26dpt | (9) | 14，14，18，21，25，35，35，67，67 | 33 | 1.9 |
| K 41.2.9+15Gyx射线12dpt，26dpt回归#1，2 | (9) | 21，28，35，35，56，60，60，60，67 | 47 | 2.8 |
| L 41.2.9/E3+15Gyx射线12dpt，26dpt回归d32 | (9) | 28，39，53，56，56，60，67，74，78 | 57 | 3.3 |
这些数据说明，与只用X-线处理相比，用41.2.9和2次X-线组合处理可明显延长小鼠的存活时间。与41.2.9和2次X-射线组合处理相比，用E3处理可进一步延长小鼠的存活时间。
23.实施例：由定向于肿瘤的细菌表达细胞毒性坏死因子
下述实施例说明，定向于肿瘤的细菌可以表达大肠杆菌细胞毒性坏死因子1(CNF1)。
细胞毒性坏死因子包括，但不局限于，大肠杆菌细胞毒性坏死因子1(CNF1；Falbo et al.，1993，Infect.Immun.61：4904-4914)、费氏弧菌CNF2(Lin et al.，1998，Biochem.Biophys.Res.Comm.250：462-465)和大肠杆菌细胞毒性坏死因子2(CNF2；Sugai et al.，1999，Infect.Immun.67：6550-6557)。CNF家族还包括多杀巴斯德菌毒素(PMT)，该毒素与CNF2的N-端部分有27％的残基完全相同，并且有80％的保守残基(Oswald et al.，1994，Proc.Acad.Sci.USA91：3814-3818)。
利用标准PCR方法从大肠杆菌J96(ATCC700336)中克隆出CNF1，使用的引物为(正向)5’-GTGTCATGAAAATGGGTAACCAATGGCAAC-3’(SEQID NO：35)和(反向)5’-CACAGA GCTCGCGCTAACAAAACAGCACAAGGGAG-3’(SEQ ID NO：36)。获得的产物约为3100bp，将该产物克隆到用于蛋白表达的pTrc99a的NcoI和SacI位点中，并用大肠杆菌作为DNA克隆宿主进行DNA测序。DNA测序是在Yale University KeckBiotechnology laboratory用标准方法进行。DNA测序的结果证明该PCR克隆产物是在3065个碱基对中含有6个次要变异的CNF1。
将CNF1质粒电穿孔到大肠杆菌DNA克隆宿主DH5α和沙门氏菌YS1646菌株中(国际专利WO99/13053)。利用标准的LDH测定法(Promega，Madison，WI，
)检测大肠杆菌DNA克隆宿主和沙门氏菌YS1649菌株中的CNF1表达。图29显示，含CNF质粒的存在可以使细胞毒性加强。后来的测定结果表明，带有含CNF质粒的沙门氏菌还可以表现出CNF1的其他已知特性，如多核化作用(Rycke etal.，1990，J.Clin.Microbiol.28：694-699)。利用光学显微镜观测暴露于CNF1的Hela细胞的细胞核。图30的结果清除地表明，含有CNF1的沙门氏菌可导致预期的多核化及细胞增大。
24.实施例：由定向于肿瘤的细菌表达Vero细胞毒素
下述实施例说明，经过加工而表达Vero细胞毒素AB的定向于肿瘤的细菌可以产生具有细胞毒性的Vero细胞毒素AB。
Vero细胞毒素(又名HSC10毒素、Shiga毒素、志贺样毒素、志贺菌毒素)。该毒素分离自能够产生大肠杆菌素的大肠杆菌HSC10菌株，起初认为它是大肠杆菌素(Farkas-Himsley et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.92(15)：6996-7000)。很早以前就发现该毒素具有抗肿瘤活性，尤其是对卵巢癌和脑肿瘤，但是只发现纯化制品具有这种抗肿瘤活性，而不是完整的活细菌。
利用基于已发表序列的引物从大肠杆菌HSC10(ATCC55227)中克隆出Vero细胞毒素，并通过在Yale Keck生物技术中心用标准DNA测序技术进行DNA测序来加以证明。Vero细胞毒素的表达采用了受四环素诱导型启动子调控的BRP基因和含有Vero细胞毒素A亚基和B亚基的多顺反子。利用msbB基因将这种四环素诱导型BRP Vero细胞毒素AB克隆到一种用于染色体整合的载体中。
24.1.载体的构建
24.1.1.AB的扩增与克隆
利用PCR方法产生Vero细胞毒素AB(AB)，使用的引物如下：H19B-7：正向引物：5’-GTGTCCATGGCTAAAACATTATTAATAGCTGCATCGC-3’(SEQ ID NO：37)；和
QSTX-R1：反向引物：5’-GTGTCTGCAGAACTGACTGAATTGAGATG-3’(SEQ IDNO：38)
这些引物还含有外部NcoI(5’)及PstI(3’)限制性内切核酸酶位点，用于克隆到ptrc99a的NcoI和PstI位点中。
24.1.2.TetBRP的扩增和克隆
将TetBRP-AB构建到中间载体pSP72-F6/R6中.利用PCR方法产生TetBRP，使用的引物如下：Tet-5’：正向引物5’-GTGTAGATCTTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTG-3’(SEQ ID NO：39)和BRP-TET-3’：反向引物5’-CACAGGATCCTTACTGAACCGCGATCCCCG-3’(SEQ ID NO：40)。这些引物含有BglII(5’)和BamHI(3’)限制性内切核酸酶位点，用于克隆到pSP72-F6/R6载体的BglII和BamHI位点中。
24.1.3.将AB亚克隆到pSP72-F6/R6-TetBRP中
用BamHI和AvaI限制性内切核酸酶消化ptrc99A-AB，以获得AB，用于插入到同样被BamHI和AvaI限制性内切核酸酶消化的pSP72-F6/R6-TetBRP中。pSP72F6/R6载体含有多种限制性内切核酸酶位点，可用来克隆与lacZ-α反向互补的部分β-gal基因。在0.8％1×TAE琼脂糖凝胶上分析载体(pSP72F6/R6-TetBRP)和AB插入序列，然后用Qiagen凝胶提取试剂盒进行纯化。用T4连接酶连接载体和插入序列，再用热休克法转化到大肠杆菌DH5α细胞中。然后将细胞铺在含有100μg/ml Amp和40μg/ml X-gal的LB平板上。筛选具有氨苄青霉素抗性和功能性β-gal基因(阳性集落呈蓝色)的阳性克隆。
24.1.4.将TetBRP-AB亚克隆到pCDV442中
用NotI和SfiI限制性内切核酸酶消化pSP72F6/R6-TetBRP-AB，用于亚克隆到同样被NotI和SfiI限制性内切酶消化的pCVD442载体中。
24.1.5.msbB染色体载体
利用自杀载体pCVD442(Donnenberg and Kaper，1991，Infectionand Immunity 59：4310-4317)构建一种能够通过DmsbB基因与VNP20009菌株(在国际专利WO99/13053中又名YS1626)的染色体进行同源重组的载体。在VNP20009中存在msbB 5’和3’端区域的部分缺失，设计PCR引物以分别产生这两种产物(msbB-5’：正向5’-GTG TGAGCT CGA TCA ACC AGC AAG CCG TTA ACC CTC TGA C-3’(SEQ ID NO：41)和反向5’-GTG TGC ATG CGG GGG GCC ATA TAG GCC GGG GAT TTAAAT GCA AAC GTC CGC CGA AAC GCC GAC GCA C-3’(SEQ ID NO：42)；以及msbB-3’：正向5’-GTG TGC ATG CGG GGT TAA TTA AGG GGG CGG CCGCGT GGT ATT GGT TGA ACC GAC GGT GCT CAT GAC ATC GC-3’(SEQ IDNO：43)和反向5’-GTG TCT CGA GGA TAT CAT TCT GGC CTC TGA CGTTGT G-3’(SEQ ID NO：44))。这些引物还含有外部SacI(5’)和AvaI(3’)限制性内切核酸酶位点，可用来克隆到pCVD442的SacI和SalI位点中，当这两种片段通过普通的SphI位点连接后，可产生内部的NotI、PacI、SphI、SfiI、SwaI和DraI，可用于将DNA片段克隆到DmsbB中，以获得不含抗生素抗性的稳定染色体整合(图31)。该载体被称为pCVD442-msbB(参考图32和图33)。
为了把Tet-BRP-AB克隆到pCVD442-msbB中，将Tet-BRP-AB质粒DNA限制性消化并纯化出适当的DNA，再用T4连接酶将两种成分连接。然后用连接反应物转化DH5 1pir，并根据Tet-BRP-AB的存在和取向筛选菌落。将Tet-BRP-AB转化到SM101pir菌株中(Donnenberg and Kaper，1991，见上文)，所得质粒称为pCVD442-Tet-BRP-AB。利用PCR方法筛选含有Tet-BRP-AB基因的SM101pir菌落，并挑选一个pCVD442-Tet-BRP-AB的阳性SM101pir菌落作为与沙门氏菌菌株结合的供体。利用标准方法(Davis，R.W.，Botstein，D.，and Roth，J.R.1980，Advanced Bacterial Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor)将含有pCVD442-Tet-BRP-AB的SM101pir与沙门氏菌YS50101菌株(四环素抗性YS82菌株(Low etal.，1999，见上文)的一种天然衍生物，具有更强的Difco MacConkey琼脂抗性)结合，并在含有50μg/ml羧苄青霉素(carb)和300μg/ml链霉素(strep)的平板上进行筛选。PCR检测所得YS50102-pCVD442-Tet-BRP-AB克隆中的pCVD442-Tet-BRP-AB基因。
24.2.将染色体整合pCVD442-Tet-BRP-AB转移到41.2.9(YS1646) 中，以产生41.2.9-Tet-BRP-AB菌株
以YS50102-Tet-BRP-AB菌株为供体，用噬菌体P22(HT105/1int-201突变体；Davis et al.，1980)进行转导，使41.2.9获得羧苄青霉素抗性。利用pCVD442上存在的bla和sacB基因筛选含有DmsbB和DmsbB-Tet-BRP-AB基因的carbr(或ampr)sucg菌株，该菌株称为41.2.9-pCVD-Tet-BRP-AB-1(图33，#3)。将41.2.9-Tet-BRP-AB-1菌株铺在LB蔗糖平板上，以筛选不含DmsbB基因但保留DmsbB-Tet-BRP-AB基因的sucrcarbg衍生物，这里采用上文Donnenberg and Kaper，1991的方法，只是LB-蔗糖琼脂平板中不含NaCl，而且是将平板保温于30℃。当这些平板上长出菌落后，将其按原有网格转移到msbB平板上，并将复制物平铺在含有羧苄青霉素或蔗糖的平板上，以检测不含抗生素和蔗糖标记的克隆。用PCR方法验证所得克隆中存在Tet-BRP-AB基因。如此获得的衍生物含有染色体整合Tet-BRP-AB，而且不具有蔗糖敏感型和羧苄青霉素抗性，这种菌株称为41.2.9-Tet-BRP-Vero细胞毒素AB。
利用标准的LDH细胞毒性测定法(
Promega，Madison，Wisconsin)对41.2.9-Tet-BRP-Vero细胞毒素AB的细胞毒性进行体外检测。图34显示的结果说明表达Vero细胞毒素的克隆26和克隆31的毒性特性。与不用四环素处理相比，用四环素处理后的克隆26和克隆31具有明显更高的细胞毒性百分率。
25.实施例：由定向于肿瘤的细菌表达溶血素
下述实施例说明，定向于肿瘤的细菌经过加工可以组成型或诱导型表达溶血素等溶血蛋白。
众所周知，溶血素是能够裂解红细胞的细胞毒性蛋白(参考，例如，Beutin，1991，Med.Microbiol.Immunol 180：167-182)。SheA(Genbank编号ECO238954)是大多数野生型大肠杆菌中都存在的一种非正常表达的沉默溶血素(Fernandez et al.，1998，FEMS MicriobiolLett 168：85-90)。在标准PCR条件下从野生型大肠杆菌(2507菌株，Yale University E.coli Genetic Stock Center)中克隆出SheA(又名hlyE；Genbank编号U57430)，使用的引物如下：(正向)5’-TTTTTTCCAT GGCTATTATG ACTGAAATCG TTGCAGATAA AACGG-3’(SEQ IDNO：45)和(反向)5’-TTTTTTAAGC TTCCCGGGTC AGACTTCAGG TACCTCAAGAGTGTC-3’(SEQ ID NO：46)。将正确大小的PCR产物克隆到ptrc99a(Pharmacia)的NcoI和HindIII位点中，使其受部分组成型trc启动子调控。另外还将PCR产物克隆到用NcoI和EcoRV剪切的tet-bgal-Z-term载体中(见上文所述)。用质粒转化大肠杆菌DH5α(Gibco)，然后铺在添加或不添加0.2μg/ml四环素的血琼脂上(含有5％羊血的胰胨豆胨琼脂，Biomerieux，Lombard，IL)。挑取在菌落周围含有表示溶血的清亮晕的阳性菌落。对阳性菌落进行标准的质粒纯化，然后用质粒转化沙门氏菌YS501并再此进行晕筛选。
图35(2A和2B)显示trc99a构建体的组成型晕形成，此时添加或不添加四环素都可观测到晕。图35(3A和3B)显示四环素启动子驱动SheA的四环素依赖型晕形成，此时不添加四环素则不形成晕。这些结果说明，定向于肿瘤的细菌即可以组成型表达溶血蛋白，也可以诱导型表达溶血蛋白。
26.实施例：由定向于肿瘤的细菌表达甲硫氨酸酶
下述实施例说明，沙门氏菌等定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达甲硫氨酸酶。
甲硫氨酸酶是降解甲硫氨酸的一种酶，甲硫氨酸是肿瘤生长所需的一种必需氨基酸。利用纯化甲硫氨酸酶给药或编码甲硫氨酸酶的DNA或病毒载体的给药来抑制肿瘤生长的方法已有所描述(Xu and Tan的国际专利WO00/29589)。但Xu and Tan没有提到用肿瘤特异性细菌载体递送甲硫氨酸酶的方法，也没有指出用纯化蛋白进行治疗需要使用大量的甲硫氨酸酶。可将甲硫氨酸酶直接递送至肿瘤的新方法是用定向于肿瘤的细菌来表达这种酶。
利用下述引物产生Genbank编号L43133的Pneudomas putida甲硫氨酸酶：
正向：METH-XHOI 5’-CCGCTCGAGATGCACGGCTCCAACAAGCTCCCA-3’(SEQ IDNO：47)；和
反向：METH-BAM 5’-CGCGGATCCTTAGGCACTCGCCTTGAGTGCCTG-3’(SEQ IDNO：48)
通过PCR方法以假单孢菌单菌落为模板用上述引物扩增出甲硫氨酸酶序列，PCR的条件如下：1个循环：94℃5分钟，然后是35个循环：94℃1分钟，60℃1分钟，72℃2分钟。PCR反应的最终扩增步骤是72℃，10分钟。在0.8％1×TAE琼脂糖凝胶上分析PCR产物，并鉴定具有甲硫氨酸酶预期大小(～1196bp)的PCR产物。从胶上切下这条带，然后用Qiagen凝胶提取试剂盒进行纯化。
用限制性酶XhoI和BamHI消化pSP72载体和上述凝胶分离纯化的甲硫氨酸酶基因。然后在0.8％1×TAE琼脂糖凝胶上对消化的载体和甲硫氨酸酶基因进行分析。从凝胶上切下相当于线性化载体和甲硫氨酸酶消化基因的消化产物，并用Qiagen凝胶抽提试剂盒进行纯化。用T4连接酶连接线性化载体和插入序列(甲硫氨酸酶)。再用热休克法将连接混合物转化到大肠杆菌DH5α细胞中。然后将恢复的细胞铺在含有100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养基上，以筛选含有完整pSP72载体的细胞。挑取Amp抗性菌落，并用Qiagen mini-prep试剂盒制备质粒，然后用EcoRI和BspHI限制性酶进行消化，以证实含甲硫氨酸酶基因pSP72载体的存在。将第9号克隆送至Yale sequencyingFacility，Yale University School of Medicine进行测序。测序时采用SP6(正向)和T7(反向)测序引物。结果表明，除终止密码子TGA在PCR时被改为TAA外，其余序列与发表的甲硫氨酸酶序列100％匹配。
甲硫氨酸酶活性的测定可采用Hori et al.，1996，CancerResearch 56：2116-2122中描述的甲硫氨酸酶测定法。
27.实施例：以TAT融合体形式在定向于肿瘤的减毒细菌中表达凋亡 素蛋白
下述实施例说明，定向于肿瘤的减毒细菌经过加工可表达和分泌含有效应分子和诸如TAT、触角足同源域、VP22及卡波西FGF MTS等运送肽的融合蛋白。
27.1.TAT-凋亡素载体的构建
已知由腺病毒载体递送的金丝雀病毒(CAV)蛋白凋亡素可诱导肿瘤细胞的凋亡(参考，例如，Noteborn et al.，1999，Gene Therapy6：882-892)。
将凋亡素蛋白与来自人免疫缺陷病毒(HIV)TAT蛋白的一种肽融合，以产生一种能够在沙门氏菌细胞质中转录，然后可被运输到肿瘤细胞的细胞核从而引起凋亡的蛋白(参考，例如，Schwartze et al.，1999，Science 285：1569-1572)。另外还发现，TAT蛋白融合体与多聚组氨酸(六聚组氨酸)融合后仍具有功能，而多聚组氨酸能够增加正电荷，从而有利于蛋白纯化(Schwartze et al.，1999，见上文)，所以还产生了含有六聚组氨酸和不含六聚组氨酸的TAT-凋亡素融合蛋白(图36A和B)。此外，还可以产生含有OmpA-8L信号序列和不含OmpA-8L信号序列的TAT-凋亡素融合蛋白(图36A和C)。
利用重叠寡核苷酸组装凋亡素和六聚组氨酸凋亡素。PCR产生凋亡素的编码核酸序列，使用的寡核苷酸如下：
TAP1：5’-GATCCCATGG CTTATGGCAG AAAAAAACGC CGTCAGCGCCGTCGCATGAA CGCGCTGCAG GAAGATACCC CGCCGGGCCC GTCCACCGTGTTTCGCCCGC CG-3’(SEQ ID NO：49)
TAP2：5’-GGGACAGGGT GATGGTGATG CCCGCGATGC CGATGCGGATTTCGCGGCAA TGCGGGGTTT CCAGCGGGCG GGAGGAGGTC GGCGGGCGAAACACGGTGGA CGG-3’(SEQ ID NO：50)
TAP3：5’-GGCATCGCGG GCATCACCAT CACCCTGTCC CTGTGCGGCTGCGCGAACGC GCGCGCGCCG ACCCTGCGCT CCGCGACCGC GGATAACTCCGAAAACACCG GC-3’(SEQ ID NO：51)
TAP4：5’-GCGATATTCG GACGGATCGC AGGAGCGTTT TTTGGACGGCGGTTTCGGCT GATCGGTGCG CAGATCCGGG ACGTTTTTAA AGCCGGTGTTTICGG AGTTA TCCGCGGTCG C-3’(SEQ ID NO：52)
TAP5：5’-CCTGCGATCC GTCCGAATAT CGCGTCTCCG AACTGAAAGAATCCCTGATC ACCACCACCC CGTCCCGCCC GCGCACCGCC CGCCGCTGCATCCGCCTCTG AAAGCTTCAT G-3’(SEQ ID NO：53)
TAP6：5’-CATGAAGCTT TCAGAGGCGG ATGCAGCGGC GGGCGGTGCG C-3’(SEQ ID NO：54)
用TAP 2-TAP6寡核苷酸和TAP6H1寡核苷酸(5’-GATCCCATGGCTCATCACCA TCACCACCAT TATGGCCGCA AAAAACGCCG TCAGCGCCGTCGCATGAACG CGCTGCAGGA AGATACCCCG CCGGGCCC-3’；SEQ ID NO：55)产生含有六聚组氨酸的TAT-凋亡素融合蛋白的编码核酸序列。通过PCR方法用TAP6寡核苷酸和omp8LF1寡核苷酸(5’-GATCCCATGG CTAAAAAGACGGCTCTGGCG CTTCTGCTCT TGCTGTTAGC GCTGACTAGT GTAGCGCAGGCCTATGGCCG CAAAAAACGC CGTCAGCGCC-3’；SEQ ID NO：56)从TAP1-TAP6的PCR产物中获得含有OmpA8L的TAT-凋亡素融合蛋白的编码核酸序列。
将每种寡核苷酸配成浓度为4μM的储液。反应采用预混的PCR反应珠(Pharmacia，Ready-to-go beads)，每种寡核苷酸使用2μl。PCR反应包括1个循环：95℃5分钟；35个循环：95℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟；和1个循环：72℃10分钟。然后对PCR反应产物进行酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，重溶于水，并用NcoI和HindIII进行限制性消化。利用凝胶电泳方法对限制性消化的PCR产物进行分析，从凝胶上切下具有正确大小的产物(TAT-凋亡素和六聚组氨酸-TAT-凋亡素分别约为420bp和450bp)，然后用标准的分子生物学技术进行分离。将这些产物与NcoI和HindIII消化的ptrc99a(Pharmacia)连接，即获得ptrc99a-TAT-凋亡素构建体。获得的DNA序列分别为正确的TAT-凋亡素(图37)和六聚组氨酸-TAT-凋亡素(图38)。
27.2.TAT-凋亡素分泌和摄取的证明
通过本领域已知的标准方法(如热休克或电穿孔方法)用ptrc99a-TAT-凋亡素构建体转化定向于肿瘤的减毒细菌，然后在培养基中进行培养。利用本领域技术人员已知的技术(如蛋白印迹分析或ELISA)检测细菌培养物上清液中是否存在TAT-凋亡素。若证实细菌培养物的上清液中存在TAT-凋亡素，则将细菌培养物的上清液与哺乳动物细胞(如NIG3T3、CHO、293和293T细胞)共保温，并利用本领域技术人员已知的凋亡素测定法证实细胞中存在TAT-凋亡素。
27.3.肿瘤内TAT-凋亡素摄取的证明
用经过加工而表达TAT-凋亡素或凋亡素的定向于肿瘤的减毒细菌对B16肿瘤模型进行静脉内给药。将细菌给药数天后，处死小鼠并测定器官重量。利用本领域技术人员已知的凋亡测定方法(如DNA分梯和荧光素原位细胞死亡检测试剂盒(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany))检测肿瘤内TAT-凋亡素或凋亡素的存在和定位。此外还测定肿瘤的大小，以确定TAT-凋亡素的抗肿瘤活性。另外还将肿瘤匀浆并铺板培养，以测定集落形成定位(c.f.u.)。
28.实施例：VNP20009与化疗剂的组合对小鼠中M27肺癌生长的效力
下述实施例说明，定向于肿瘤的减毒细菌与化疗剂的组合给药可以协同抑制或加成抑制肺癌等实体瘤的生长。
28.1.VNP20009与环磷酰胺的组合或VNP20009与丝裂霉素C的组合对 小鼠中M27肺癌生长的效力
于37℃将液氮保存的M27鼠肺癌细胞(1×106/ml×1ml)快速融解，使其恢复，然后于37℃、5％CO2的条件下培养在10ml含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM培养基中。在细胞两次传代后，将对数期的M27细胞通过胰蛋白酶消化进行分离，1×PBS清洗，然后以2.5×106细胞/ml的浓度重悬在1×PBS中，用于植入肿瘤。第0天，将M27细胞悬浮液植入100只C57BL/6小鼠(雌性，8周龄，20g；5×105细胞/鼠)的右肋皮下。将小鼠随机分成10组，每组10只。
通过标准的稀释方法用1×PBS将沙门氏菌VNP20009菌株稀释至5×106CFU/ml。第12天时，按照下表6用0.2ml稀释的沙门氏菌(1×106CFU/鼠)对每只小鼠进行静脉内给药。为了确定细菌的实际注射量，将5×106CFU/ml的细菌悬浮液进一步稀释到1×103CFU/ml，并铺在营养琼脂上(MsbB平板；国际专利WO99/13053)。第二天对形成的菌落计数。
按照下表7用丝裂霉素C(Sigma)和环磷酰胺(Sigma)对小鼠进行给药。第22天时，对组合给药组进行丝裂霉素C的2次给药，但只用丝裂霉素C处理的组由于肿瘤过大而没有2次给药。当在VNP20009+环磷酰胺处理组中观测到严重的毒性反应时，对只用VNP20009处理或用VNP20009+化疗剂处理的各组小鼠进行200mpk的Cipro(Bayer Inc.，West Haven，CT)处理。每周2次测量肿瘤体积，直到实验结束。每天观察动物的行为、外观和死亡率。小鼠始终保持在清洁的恒温实验室中。动物窝垫每周更换2次，并且为小鼠提供充足的食物和饮用水。
表7
| 组别 | 小鼠数量 |
| 不处理对照 | 10 |
| 3mpk，丝裂霉素C，i.v.，第15天 | 10 |
| 5mpk，丝裂霉素C，i.v.，第15天 | 10 |
| 150mpk，环磷酰胺，i.p.，第15天 | 10 |
| 200mpk，环磷酰胺，i.p.，第15天 | 10 |
| VNP20009，1×106/鼠，i.v.，第12天 | 10 |
| VNP20009，1×106/鼠，i.v.，第12天+3mpk，丝裂霉素C，i.v.，第15和第22天 | 10 |
| VNP20009，1×106/鼠，i.v.，第12天+5mpk，丝裂霉素C，i.v.，第15和第22天 | 10 |
| VNP20009，1×106/鼠，i.v.，第12天+150mpk环磷酰胺，i.p.，第15天 | 10 |
| VNP20009，1×106/鼠，i.v.，第12天+200mpk环磷酰胺，i.p.，第15天 | 10 |
如图39所示，VNP20009+环磷酰胺组合处理对M27肺癌生长的抑制要强于只用VNP20009或只用环磷酰胺处理。如图40所示，VNP20009+丝裂霉素C组合处理对M27肺癌生长的抑制要强于只用丝裂霉素C处理。但VNP20009+丝裂霉素C组合处理对M27肺癌生长的抑制并不强于只用VNP20009处理(图40)。这些结果表明，定向于肿瘤的减毒细菌与化疗剂的组合给药可以协同抑制或加成抑制肺癌等实体瘤的生长。
28.2.VNP20009与顺铂的组合对小鼠中M27肺癌生长的效力
于37℃将液氮保存的M27鼠肺癌细胞(1×106/ml×1ml)快速融解，使其恢复，然后于37℃、5％CO2的条件下培养在25ml含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM培养基中。在细胞两次传代后，将对数期的M27细胞(约90-95％的饱和度)通过胰蛋白酶消化进行分离，1×PBS清洗，然后以2.5×106细胞/ml的浓度重悬在1×PBS中，用于植入肿瘤。第0天，将M27细胞悬浮液(0.2ml)植入36只C57BL/6小鼠(雌性，8周龄，20g；5×105细胞/鼠)的右肋皮下。将小鼠随机分组，每组9只。
通过标准的稀释方法用1×PBS将沙门氏菌VNP20009菌株稀释至5×106CFU/ml。第12天时，按照下表8用0.2ml沙门氏菌(1×106CFU/鼠)对每只小鼠进行尾部静脉给药。为了确定细菌的实际注射量，将5×106CFU/ml的细菌悬浮液进一步稀释到1×103CFU/ml，并铺在MsBb平板上。第二天对形成的菌落计数。
第14天时，也就是细菌注射2天后，将顺铂给药于小鼠(下表8)。给药前用正常的生理盐水将顺铂稀释成0.5mg/ml。每周2次测量肿瘤体积，直到实验结束。每天观察动物的行为、外观和死亡率。小鼠始终保持在清洁的恒温实验室中。动物的窝垫每周更换2次，并且为小鼠提供充足的食物和饮用水。
表8
| 组别 | 小鼠数量 |
| 对照(不处理) | 9 |
| VNP20009，1×106/鼠，i.v.，第12天 | 9 |
| 5mpk顺铂，i.p.qw×2，第14和第19天 | 9 |
| VNP20009，1×106/鼠，i.v.，第12天+5mpk顺铂，i.p.qw×2，第14、第19和第33天 | 9 |
如图41所示，VNP20009+顺铂组合处理对M27肺癌生长的抑制要强于只用VNP20009或只用顺铂处理。这些结果表明，定向于肿瘤的减毒细菌与顺铂等化疗剂的组合给药可以协同抑制或加成抑制肺癌等实体瘤的生长。
本发明的范围并不局限于文中描述的特别实施方案。实际上，本领域的技术人员从上文的描述和附图中可以看出，本发明除上文所述之外还有多种不同的变化。这些变化将被包括在所附权利要求的范围之内。
文中引用了很多出版物，其公开内容均完整引入，以供参考。
序列表
<110>维昂药品公司
<120>用于将效应分子定向递送至肿瘤的组合物及方法
<130>8002-059-001
<140>
<141>
<150>60/157,581
<151>1999-10-04
<150>60/157,637
<151>1999-10-04
<160>61
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>1
gaagatcttc cggaggaggg gaaatg 26
<210>2
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>2
cgggatccga gctcgagggc ccgggaaagg atctaagaag atcc 44
<210>3
<211>477
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(474)
<400>3
atg gta cgt agc tcc tct cgc act ccg tcc gat aag ccg gtt gct cat 48
Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His
1 5 10 15
gta gtt gct aac cct cag gca gaa ggt cag ctg cag tgg ctg aac cgt 96
Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
20 25 30
cgc gct aac gcc ctg ctg gca aac ggc gtt gag ctc cgt gat aac cag 144
Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln
35 40 45
ctc gtg gta cct tct gaa ggt ctg tac ctg atc tat tct caa gta ctg 192
Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu
50 55 60
ttc aag ggt cag ggc tgc ccg tcg act cat gtt ctg ctg act cac acc 240
Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr
65 70 75 80
atc agc cgt att gct gta tct tac cag acc aaa gtt aac ctg ctg agc 288
Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser
85 90 95
gct atc aag tct ccg tgc cag cgt gaa act ccc gag ggt gca gaa gcg 336
Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
100 105 110
aaa cca tgg tat gaa ccg atc tac ctg ggt ggc gta ttt caa ctg gag 384
Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu
115 120 125
aaa ggt gac cgt ctg tcc gca gaa atc aac cgt cct gac tat cta gat 432
Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp
130 135 140
ttc gct gaa tct ggc cag gtg tac ttc ggt att atc gca ctg 474
Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
taa 477
<210>4
<211>158
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His
1 5 10 15
Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
20 25 30
Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln
35 40 45
Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu
50 55 60
Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr
65 70 75 80
Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser
85 90 95
Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
100 105 110
Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu
115 120 125
Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp
130 135 140
Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>5
ccgacgcgtt gacacctgaa aactggag 28
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>6
ccgacgcgtg aaaggatc tc aagaagatc 29
<210>7
<211>543
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合构建体
<221>CDS
<222>(1)...(540)
<400>7
atg aaa aag aca gct atc gcg att gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct 48
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
acc gta gcg cag gcc cat atg gta cgt agc tcc tct cgc act ccg tcc 96
Thr Val Ala Gln Ala His Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser
20 25 30
gat aag ccg gtt gct cat gta gtt gct aac cct cag gca gaa ggt cag 144
Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln
35 40 45
ctg cag tgg ctg aac cgt cgc gct aac gcc ctg ctg gca aac ggc gtt 192
Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val
50 55 60
gag ctc cgt gat aac cag ctc gtg gta cct tct gaa ggt ctg tac ctg 240
Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu
65 70 75 80
atc tat tct caa gta ctg ttc aag ggt cag ggc tgc ccg tcg act cat 288
Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His
85 90 95
gtt ctg ctg act cac acc atc agc cgt att gct gta tct tac cag acc 336
Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr
100 105 110
aaa gtt aac ctg ctg agc gct atc aag tct ccg tgc cag cgt gaa act 384
Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr
115 120 125
ccc gag ggt gca gaa gcg aaa cca tgg tat gaa ccg atc tac ctg ggt 432
Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly
130 135 140
ggc gta ttt caa ctg gag aaa ggt gac cgt ctg tcc gca gaa atc aac 480
Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn
145 150 155 160
cgt cct gac tat cta gat ttc gct gaa tct ggc cag gtg tac ttc ggt 528
Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly
165 170 175
att atc gca ctg taa 543
Ile Ile Ala Leu
180
<210>8
<211>180
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>融合构建体
<400>8
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala His Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser
20 25 30
Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln
35 40 45
Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val
50 55 60
Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His
85 90 95
Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr
100 105 110
Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr
115 120 125
Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly
130 135 140
Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn
145 150 155 160
Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly
165 170 175
Ile Ile Ala Leu
180
<210>9
<211>801
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合构建体
<221>CDS
<222>(1)...(798)
<400>9
atg aaa aag aca gct atc gcg att gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct 48
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
acc gta gcg cag gcc cat atg gct aac gag ctg aag cag atg cag gac 96
Thr Val Ala Gln Ala His Met Ala Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp
20 25 30
aag tac tcc aaa agt ggc att gct tgt ttc tta aaa gaa gat gac agt 144
Lys Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser
35 40 45
tat tgg gac ccc aat gac gaa gag agt atg aac agc ccc tgc tgg caa 192
Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln
50 55 60
gtc aag tgg caa ctc cgt cag ctc gtt aga aag atg att ttg aga acc 240
Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr
65 70 75 80
tct gag gaa acc att tct aca gtt caa gaa aag caa caa aat att tct 288
Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser
85 90 95
ccc cta gtg aga gaa aga ggt cct cag aga gta gca gct cac ata act 336
Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr
100 105 110
ggg acc aga gga aga agc aac aca ttg tct tct cca aac tcc aag aat 384
Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn
115 120 125
gaa aag gct ctg ggc cgc aaa ata aac tcc tgg gaa tca tca agg agt 432
Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser
130 135 140
ggg cat tca ttc ctg agc aac ttg cac ttg agg aat ggt gaa ctg gtc 480
Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val
145 150 155 160
atc cat gaa aaa ggg ttt tac tac atc tat tcc caa aca tac ttt cga 528
Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg
165 170 175
ttt cag gag gaa ata aaa gaa aac aca aag aac gac aaa caa atg gtc 576
Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val
180 185 190
caa tat att tac aaa tac aca agt tat cct gac cct ata ttg ttg atg 624
Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met
195 200 205
aaa agt gct aga aat agt tgt tgg tct aaa gat gca gaa tat gga ctc 672
Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu
210 215 220
tat tcc atc tat caa ggg gga ata ttt gag ctt aag gaa aat gac aga 720
Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg
225 230 235 240
att ttt gtt tct gta aca aat gag cac ttg ata gac atg gac cat gaa 768
Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu
245 250 255
gcc agt ttt ttc ggg gcc ttt tta gtt ggc taa 801
Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
260 265
<210>10
<211>266
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>融合构建体
<400>10
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala His Met Ala Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp
20 25 30
Lys Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser
35 40 45
Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln
50 55 60
Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr
65 70 75 80
Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser
85 90 95
Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr
100 105 110
Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn
115 120 125
Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser
130 135 140
Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val
145 150 155 160
Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg
165 170 175
Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val
180 185 190
Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met
195 200 205
Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu
210 215 220
Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg
225 230 235 240
Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu
245 250 255
Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
260 265
<210>11
<211>465
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合构建体
<221>CDS
<222>(1)...(462)
<400>11
atg aaa aag acg gct ctg gcg ctt ctg ctc ttg ctg tta gcg ctg act 48
Met Lys Lys Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Thr
1 5 10 15
agt gta gcg cag gcc gct cct act agc tcg agc act aag aaa act caa 96
Ser Val Ala Gln Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln
20 25 30
ctg caa ttg gag cat ctg ctg ctg gat ctg cag atg att ctg aat ggc 144
Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly
35 40 45
atc aat aac tac aag aac cct aag ctg act cgc atg ctg act ttc aaa 192
Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys
50 55 60
ttc tac atg ccg aaa aag gct acc gag ctc aaa cat ctc cag tgc ctg 240
Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu
65 70 75 80
gaa gag gaa ctg aag ccg ctg gag gaa gta ctt aac ctg gca cag tct 288
Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser
85 90 95
aag aac ttc cac ctg cgt ccg cgt gac ctg atc tcc aac atc aat gta 336
Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val
100 105 110
atc gtt ctt gag ctg aag gga tcc gaa acc acc ttc atg tgc gaa tac 384
Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr
115 120 125
gct gac gaa acc gcc acc att gtg gag ttc ctg aac cgt tgg atc acc 432
Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr
130 135 140
ttt gcc caa tcg atc att agc acg tta act taa 465
Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210>12
<211>154
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>融合构建体
<400>12
Met Lys Lys Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Thr
1 5 10 15
Ser Val Ala Gln Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln
20 25 30
Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly
35 40 45
Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys
50 55 60
Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu
65 70 75 80
Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser
85 90 95
Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val
100 105 110
Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr
115 120 125
Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr
130 135 140
PheAla Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210>13
<211>465
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合构建体
<221>CDS
<222>(1)...(462)
<400>13
atg aaa cag tcg act ctg gcg ctt ctg ctc ttg ctg tta gcg ctg act 48
Met Lys Gln Ser Thr Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Thr
1 5 10 15
agt gtg gcc aaa gcg gct cct act agc tcg agc act aag aaa act caa 96
Ser Val Ala Lys Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln
20 25 30
ctg caa ttg gag cat ctg ctg ctg gatctg cag atg att ctg aat ggc 144
Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly
35 40 45
atc aat aac tac aag aac cct aag ctg act cgc atg ctg act ttc aaa 192
Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys
50 55 60
ttc tac atg ccg aaa aag gct acc gag ctc aaa cat ctc cag tgc ctg 240
Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu
65 70 75 80
gaa gag gaa ctg aag ccg ctg gag gaa gta ctt aac ctg gca cag tct 288
Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser
85 90 95
aag aac ttc cac ctg cgt ccg cgt gac ctg atc tcc aac atc aat gta 336
Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val
100 105 110
atc gtt ctt gag ctg aag gga tcc gaa acc acc ttc atg tgc gaa tac 384
Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr
115 120 125
gct gac gaa acc gcc acc att gtg gag ttc ctg aac cgt tgg atc acc 432
Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr
130 135 140
ttt gcc caa tcg atc attagc acg tta act taa 465
Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210>14
<211>154
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>融合构建体
<400>14
Met Lys Gln Ser Thr Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Thr
1 5 10 15
Ser Val Ala Lys Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln
20 25 30
Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly
35 40 45
Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys
50 55 60
Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu
65 70 75 80
Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser
85 90 95
Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val
100 105 110
Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr
115 120 125
Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr
130 135 140
Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210>15
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>15
agtctagaca atcaggcgaa gaacgg 26
<210>16
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>16
agccatggag tcaccctcac ttttc 25
<210>17
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>17
ggatccttaa gacccacttt cacatttaag t 31
<210>18
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>18
ggttccatgg ttcacttttc tctatcac 28
<210>19
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>19
gtgtccatgg ggcacagcca ccgcgacttc cag 33
<210>20
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>20
acacgagctc ctacttggag gcagtcatga agct 34
<210>21
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>21
gtgtccatgg ctcggcgggc aagtgtcggg actgaccatc atcatcatca tcatcacagc 60
caccgcgact tc 72
<210>22
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>22
gtgcggatcc ctacttggag gcagtcatga agctg 35
<210>23
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>23
Met Ala Arg Arg Ala Ser Val Gly Thr Asp His His His His His His
1 5 10 15
<210>24
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>TiP 13.40的肽序列
<400>24
Ala Tyr Arg Trp Arg Leu Ser His Arg Pro Lys Thr Gly Phe Ile Arg
1 5 10 15
Val Val Met Tyr Glu Gly
20
<210>25
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码TiP13.40的核苷酸序列
<400>25
gcgtaccgct ggcgcctgtc ccatcgcccg aaaaccggct ttatccgcgt ggtgatgtac 60
gaaggc 66
<210>26
<211>101
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>26
gtgtactagt gtggcgcagg cggcgtaccg ctggcgcctg tcccatcgcc cgaaaaccgg 60
ctttatccgc gtggtgatgt acgaaggcta aggatccgcg c 101
<210>27
<211>101
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>27
gcgcggatcc ttagccttcg tacatcacca cgcggataaa gccggttttc gggcgatggg 60
acaggcgcca gcggtacgcc gcctgcgcca cactagtaca c 101
<210>28
<211>101
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>28
Met Ser Ser Ala Ala Gly Phe Cys Ala Ser Arg Pro Gly Leu Leu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val Val Ala Phe Ala Ser Ala Glu
20 25 30
Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gln Cys Leu Cys Val Lys Thr Thr Ser
35 40 45
Gln Val Arg Pro Arg His Ile Thr Ser Leu Glu Val Ile Lys Ala Gly
50 55 60
Pro His Cys Pro Thr Ala Gln Leu Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg
65 70 75 80
Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys
85 90 95
Lys Leu Leu Glu Ser
100
<210>29
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>29
cttcactagt gtggcgcagg cgaacggccg caaaatctgc ctggacctgc aggcgccgct 60
gtacaaaaaa atcatcaaaa aactgctgga aagctaagga tccgcg 106
<210>30
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>30
cgcggatcct tagctttcca gcagtttttt gatgattttt ttgtacagcg gcgcctgcag 60
gtccaggcag attttgcggc cgttcgcctg cgccacacta gtgaag 106
<210>31
<211>85
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>31
Ile Tyr Ser Phe Asp Gly Arg Asp Ile Met Thr Asp Pro Ser Trp Pro
1 5 10 15
Gln Lys Val Ile Trp His Gly Ser Ser Pro His Gly Val Arg Leu Val
20 25 30
Asp Asn Tyr Cys Glu Ala Trp Arg Thr Ala Asp Thr Ala Val Thr Gly
35 40 45
Leu Ala Ser Pro Leu Ser Thr Gly Lys Ile Leu Asp Gln Lys Ala Tyr
50 55 60
Ser Cys Ala Asn Arg Leu Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met
65 70 75 80
Thr Asp Ala Arg Lys
85
<210>32
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>32
ggcttcacta gtgtggcgca ggcgatatac tcctttgatg gtcg 44
<210>33
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>33
cgcggatcct tacttcctag cgtctgtcat gaaactg 37
<210>34
<211>7117
<212>DNA
<213>大肠杆菌(E.coli)
<400>34
cccgggcact tccggggcat gagtatgtga tatccggggc tgcaccccgg accccgccaa 60
cacatcacgg gccacaaaat tttttgtggc ccgctctgcg ttttctaagt gttatccctc 120
ctgatttcta aaaaattttc cacctgaact tgacagaaaa aacgatgacg agtacttttt 180
gatctgtaca taaacccagt ggttttatgt acagtattaa tcgtgtaatc aattgtttta 240
acgcttaaaa gagggaattt ttatgagcgg tggcgatgga cgcggccata acacgggcgc 300
gcatagcaca agtggtaaca ttaatggtgg cccgaccggg cttggtgtag gtggtggtgc 360
ttctgatggc tccggatgga gttcggaaaa taacccgtgg ggtggtggtt ccggtagcgg 420
cattcactgg ggtggtggtt ccggtcatgg taatggcggg gggaatggta attccggtgg 480
tggttcggga acaggcggta atctgtcagc agtagctgcg ccagtggcat ttggttttcc 540
ggcactttcc actccaggag ctggcggtct ggcggtcagt atttcagcgg gagcattatc 600
ggcagctatt gctgatatta tggctgccct gaaaggaccg tttaaatttg gtctttgggg 660
ggtggcttta tatggtgtat tgccatcaca aatagcgaaa gatgacccca atatgatgtc 720
aaagattgtg acgtcattac ccgcagatga tattactgaa tcacctgtca gttcattacc 780
tctcgataag gcaacagtaa acgtaaatgt tcgtgttgtt gatgatgtaa aagacgagcg 840
acagaatatt tcggttgttt caggtgttcc gatgagtgtt ccggtggttg atgcaaaacc 900
taccgaacgt ccgggtgttt ttacggcatc aattccaggt gcacctgttc tgaatatttc 960
agttaataac agtacgccag cagtacagac attaagccca ggtgttacaa ataatactga 1020
taaggatgtt cgcccggcag gatttactca gggtggtaat accagggatg cagttattcg 1080
attcccgaag gacagcggtc ataatgccgt atatgtttca gtgagtgatg ttcttagccc 1140
tgaccaggta aaacaacgtc aagatgaaga aaatcgccgt cagcaggaat gggatgctac 1200
gcatccggtt gaagcggctg agcgaaatta tgaacgcgcg cgtgcagagc tgaatcaggc 1260
aaatgaagat gttgccagaa atcaggagcg acaggctaaa gctgttcagg tttataattc 1320
gcgtaaaagc gaacttgatg cagcgaataa aactcttgct gatgcaatag ctgaaataaa 1380
acaatttaat cgatttgccc atgacccaat ggctggcggt cacagaatgt ggcaaatggc 1440
cgggcttaaa gcccagcggg cgcagacgga tgtaaataat aagcaggctg catttgatgc 1500
tgctgcaaaa gagaagtcag atgctgatgc tgcattgagt tctgctatgg aaagcaggaa 1560
gaagaaagaa gataagaaaa ggagtgctga aaataattta aacgatgaaa agaataagcc 1620
cagaaaaggt tttaaagatt acgggcatga ttatcatcca gctccgaaaa ctgagaatat 1680
taaagggctt ggtgatctta agcctgggat accaaaaaca ccaaagcaga atggtggtgg 1740
aaaacgcaag cgctggactg gagataaagg gcgtaagatt tatgagtggg attctcagca 1800
tggtgagctt gaggggtatc gtgccagtga tggtcagcat cttggctcat ttgaccctaa 1860
aacaggcaat cagttgaaag gtccagatcc gaaacgaaat atcaagaaat atctttgaga 1920
ggaagttatg ggacttaaat tggatttaac ttggtttgat aaaagtacag aagattttaa 1980
gggtgaggag tattcaaaag attttggaga tgacggttca gttatggaaa gtctaggtgt 2040
gccttttaag gataatgtta ataacggttg ctttgatgtt atagctgaat gggtaccttt 2100
gctacaacca tactttaatc atcaaattga tatttccgat aatgagtatt ttgtttcgtt 2160
tgattatcgt gatggtgatt ggtgatcaaa tattatcagg gatgagttga tatacgggct 2220
tctagtgttc atggatgaac gctggagcct ccaaatgtag aaatgttata ttttttattg 2280
agttcttggt tataattgct ccgcaatgat ttaaataagc attatttaaa acattctcag 2340
gagaggtgaa ggtggagcta aaaaaaagta ttggtgatta cactgaaacc gaattcaaaa 2400
aatttattga agacatcatc aattgtgaag gtgatgaaaa aaaacaggat gataacctcg 2460
agtattttat aaatgttact gagcatccta gtggttctga tctgatttat tacccagaag 2520
gtaataatga tggtagccct gaaggtgtta ttaaagagat taaagaatgg cgagccgcta 2580
acggtaagtc aggatttaaa cagggctgaa atatgaatgc cggttgttta tggatgaatg 2640
gctggcattc tttcacaaca aggagtcgtt atgaaaaaaa taacagggat tattttattg 2700
cttcttgcag tcattattct gtctgcatgt caggcaaact atatccggga tgttcagggc 2760
gggaccgtat ctccgtcatc aacagctgaa gtgaccggat tagcaacgca gtaacccgaa 2820
atcctctttg acaaaaacaa agcgtgtcag gctgattctg atgcgctttt tttttgaaat 2880
gtcacaaaaa ttccatgtgg gagatgggat ctaaaatcct cgtgcagaac tttccatcca 2940
gggggagaaa acttgtcgtt ttgagccgtt cggtgttcag aacgcacgaa accgatcgcg 3000
cgcatcgctt tcgtgaatag ttatgcaggc ccctgaaaac gattctgacg cgttttttcg 3060
gttttgcctg gtgttttcct gtctttttgc gttttttgcg tcagaacgcg tctgagggcg 3120
ttttaagggg tgcgtacaac gggagttatg gtaaatggat cggtttttcg ggaaggatcg 3180
acaggatttg ccgttgggtg tagtgtaagc gactgaaaaa caaacgcccc gtaaatcgtg 3240
ctctcaccgc caagattgat cacgaaatta cagggcgccg ggttccgcgt ttcccgatgg 3300
gaaagcgcgg ttagttaaac tgtgtaccga gagaaatcgt atcacatgag cgccgtactt 3360
caacgcttca gggaaaaatt accgcacaaa ccgtactgta cgaacgattt cgcgtacggc 3420
gttcgcattc tgccgaaaaa cattgccatt cttgcccgtt tcatccagca gaaccagcca 3480
catgcactgt actggcttcc ctttgacgtg gaccggacgg gggcatcaat cgactggagc 3540
gaccggaatt gtccggcccc gaacatcacc gtaaaaaatc cccgtaacgg gcacgcgcat 3600
ctgctctacg cgctcgccct tcctgtgaga actgcgccgg atgcatcggc ttcggcgctc 3660
agatacgctg ccgctattga gcgtgcgttg tgtgaaaaac tgggcgcgga tgtgaattac 3720
agcggcctga tctgcaaaaa tccgtgccac cctgaatggc aggaagtgga atggcgcgag 3780
gaaccctaca ctctcgacga actggctgat tatctcgatt tgagcgcctc agcgcgccgt 3840
agcgtcgata aaaattacgg gctggggcga aactgctatc tgttcgaaaa gggccgtaaa 3900
tgggcttacc gggctattcg tcagggctgg ccggcattct cacaatggct tgatgcggtg 3960
attcagcgtg tcgaaatgta caacgcatcg ctccccgttc cgctttcacc tcctgaatgt 4020
cgggctattg gcaagagtat tgcgaaatac acgcacagga acttcacgcc ggaaactttc 4080
gcacagtatg tggctgatac gcacacgcca gaaattcagg ctacacgcgg tcgcaagggc 4140
ggttctaagt ctaagcgcgg cacagtagct acatcagcac gcacgctgaa accttgggag 4200
aaattaggga tcagtcgcgc ctggtattac caactgaaaa aacgaggtct cgtagagtag 4260
accaaataag cctatatcag ataacagcgc ctttttggcg cctttttgag cagcttggtt 4320
tgttgctatt tccctcgttg aatcccgcaa tggcgcggct ttccgcatga ttgaggtggt 4380
agcgctcgcc gcagtctcat gaccgagcgt agcgagcgaa tgagcgagga agcgcaaagg 4440
cgtccggtgg tgcatgtggc acttacgcgc cggggcttag tggttctgcg gtttcgccgg 4500
tggtctgggt agcttctcca gctcgttaat cagcggttgt agtcggttca catccacctg 4560
tcttgtgact tcctttcgca gaaactggag caggaacgca cgcagttgcg cttcttccgg 4620
cctccgtacc cttgccagca tggctgcccc cacaatgact ttttgcgccg tgtccaggct 4680
tcggctcttc gccttcaggc gctgtaatct ggcctcagct tcggcaatct tctgttcgag 4740
tgttctgctc atttcgtgac tccgtgcgcg gtgaaaaatc gcattttagc gcgtcactgg 4800
tagtttaaaa actaaactgg cataatgcac ggcacatcac gaagtgcgca cttatacaat 4860
ctccacttcg tttcgattgt gtgcggtctg cgacgctaaa agaaaacggc aaaaaggcat 4920
tacggcagaa atggcgattt atcatctcag catgaaaatc atttcgcgaa aaaacggcta 4980
cagtgctgtt gcttctgctg cctaccgttc cggctctgtc atacccgatg accgtaccgg 5040
attaatccac gattacaccc gtaaacgcgg cgttgatgat gcggtcattc tcacccctgc 5100
gaatgcaccg tcctggtgtg ttgaccgttc cgttctttgg aatgcggtcg agaaagccga 5160
acagcgccgg aactcccagc tggcaaggga ggttgaactc gccattcccc gtgagatttc 5220
ccgcgaggcc gcacgggaga ccgttctcgc tttgtccggg aaaactttgt cagtcggggc 5280
atgattgccg atgtggcgtt ccatcacatg gaccggacca atccccatgc gcacatcatg 5340
ctgaccacga gagctgtcgg ggaaacggga ttcgcaggaa aggtcaggga tggaacgacc 5400
gggcactcgc cgagacgtgg cgcgcatcat gggctgacca tgcgaacaga gcgcttgcga 5460
acgccggcta ccaggaagag atagaccatc gttcatacga gcgtcaggga ctggagaaag 5520
cgccggcctt cacctcggaa aggctgcctg tgcgatggaa aaacggggaa tggaaacaga 5580
acgcggtgag cagaaccgtc tgattaacag ccttaacctg gaaatacagg tttcccgcac 5640
gcagcttgct ctcaggacgg ttcaggaaac gcagcgtaag cgggaactca gcgatgctgc 5700
acgtcgtgca gtggaagccc ttaacctgac cattcccgct gcgaatgcct cagcggatac 5760
cctgcgggaa ttcattgcca cgctgccgca ggaatgcggg aacgcgtggg agatgacccc 5820
ggagttcctg gcgatgagcg ggaaggtgaa cgacatcgaa cgtgagggga atgcgctgct 5880
gaaagagcag gccattctcg aaaaggagat gaccggactc aaaaaagcac gccctgtcgc 5940
gtcccttctg tcagagattc ccctgatgac atgggctgaa ccggaatacc gcaaaagaca 6000
actccgtttc ttggaaactc gggaaacaga ttgaatctct tcgccgcacc tacagggccg 6060
tgaaagaacg ggacattccc gcccgtcgtc aggcctttga aacgcagtgg aatacgtgga 6120
ttgcgccgga atggcagagc tgaaagaaaa actgtcagca cgggaagcgg agcggcgcag 6180
ggaggagccc gaagcggaag cgcgccggaa ggaacaggag catgaggcgc ggctgaaacg 6240
tcatgataac caccgtctga gccgtgaaac ggcattagtc ggggttatta cggagctggg 6300
gcgtgccaga gagccgggaa cgggcaggat aacccgctac atgatgttga gtaacagagc 6360
cggagaattc acggtatggg gtgatgagct ggcgcattac ccccagagtg ttcatgaccc 6420
ggtgaatgtt tacctgtcgc caggcggggc tgtgatggtc tcggatatac gtgagggaat 6480
gccagaatct catgagacga tggcgcggcc tgagcgtgtg agaatgtatt ccggtgcgac 6540
ggtccggcat gtactggaac agatgcgcca ggggtggccc tcttacggtt ttccggcgct 6600
gccgcatcac tggccggata atttttattt cagcgacgac cgcaggcccg tagcctctcc 6660
gctgccgtct gcgcaccggg tggacgtcac cgcttatgcg gcaccggagc aactcatgcc 6720
cgttgtattt tcgacagagc gaaacagcag gacgctgaat ctgctgttgt gcaaagggcc 6780
ggaggaagtg cttgtcggat ttgtgcgcca ggaggacggg ctgcgtcccg ttcttgcgct 6840
tccgtcgccg gattacagtc atctgatggt cagcaccatc acggagaacg gggtatgcct 6900
ggcaggttac ggagaagcta taaaccatga tgcggatact ccgtacccac cggaaccgca 6960
cctgatgcag ttccggctca aaggccatca tgacaggctt ttggctgctg tccacaaacc 7020
ggaagagatg ccggattatc tcttccgtca actcggtttt aatcagacct ggcatgagtg 7080
gaagcgggac gaacagcaca ggcaacaaca acgccgc 7117
<210>35
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>35
gtgtcatgaa aatgggtaac caatggcaac 30
<210>36
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>36
cacagagctc gcgctaacaa aacagcacaa gggag 35
<210>37
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>37
gtgtccatgg ctaaaacatt attaatagct gcatcgc 37
<210>38
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>38
gtgtctgcag aactgactga attgagatg 29
<210>39
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>39
gtgtagatct ttaagaccca ctttcacatt taagttg 37
<210>40
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>40
cacaggatcc ttactgaacc gcgatccccg 30
<210>41
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>41
gtgtgagctc gatcaaccag caagccgtta accctctgac 40
<210>42
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>42
gtgtgcatgc ggggggccat ataggccggg gatttaaatg caaacgtccg ccgaaacgcc 60
gacgcac 67
<210>43
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>43
gtgtgcatgc ggggttaatt aagggggcgg ccgcgtggta ttggttgaac cgacggtgct 60
catgacatcg c 71
<210>44
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>44
gtgtctcgag gatatcattc tggcctctga cgttgtg 37
<210>45
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>45
ttttttccat ggctattatg actgaaatcg ttgcagataa aacgg 45
<210>46
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>46
ttttttaagc ttcccgggtc agacttcagg tacctcaaag agtgtc 46
<210>47
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>47
ccgctcgaga tgcacggctc caacaagctc cca 33
<210>48
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>48
cgcggatcct taggcactcg ccttgagtgc ctg 33
<210>49
<211>102
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>49
gatcccatgg cttatggcag aaaaaaacgc cgtcagcgcc gtcgcatgaa cgcgctgcag 60
gaagataccc cgccgggccc gtccaccgtg tttcgcccgc cg 102
<210>50
<211>103
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>50
gggacagggt gatggtgatg cccgcgatgc cgatgcggat ttcgcggcaa tgcggggttt 60
ccagcgggcg ggaggaggtc ggcgggcgaa acacggtgga cgg 103
<210>51
<211>102
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>51
ggcatcgcgg gcatcaccat caccctgtcc ctgtgcggct gcgcgaacgc gcgcgcgccg 60
accctgcgct ccgcgaccgc ggataactcc gaaaacaccg gc 102
<210>52
<211>111
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>52
gcgatattcg gacggatcgc aggagcgttt tttggacggc ggtttcggct gatcggtgcg 60
cagatccggg acgtttttaa agccggtgtt ttcggagtta tccgcggtcg c 111
<210>53
<211>111
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>53
cctgcgatcc gtccgaatat cgcgtctccg aactgaaaga atccctgatc accaccaccc 60
cgtcccgccc gcgcaccgcc cgccgctgca tccgcctctg aaagcttcat g 111
<210>54
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>54
catgaagctt tcagaggcgg atgcagcggc gggcggtgcg c 41
<210>55
<211>98
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>55
gatcccatgg ctcatcacca tcaccaccat tatggccgca aaaaacgccg tcagcgccgt 60
cgcatgaacg cgctgcagga agataccccg ccgggccc 98
<210>56
<211>100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>56
gatcccatgg ctaaaaagac ggctctggcg cttctgctct tgctgttagc gctgactagt 60
gtagcgcagg cctatggccg caaaaaacgc cgtcagcgcc 100
<210>57
<211>551
<212>DNA
<213>噬菌体
<220>
<221>CDS
<222>(7)...(408)
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(1)
<223>n＝a，c，g，or t
<400>57
nagacc atg gct tat ggc aga aaa aaa aga aga cag aga aga aga atg 48
Met Ala Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met
1 5 10
aac gcg ctg cag gaa gat acc ccg ccg ggc ccg tcc acc gtg ttt cgc 96
Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe Arg
15 20 25 30
ccg ccg acc tcc tcc cgc ccg ctg gaa acc ccg cat tgc cgc gaa atc 144
Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu Ile
35 40 45
cgc atc ggc atc gcg ggc atc acc atc acc ctg tcc ctg tgc ggc tgc 192
Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly Cys
50 55 60
gcg aac gcg cgc gcg ccg acc ctg cgc tcc gcg acc gcg gat aac tcc 240
Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn Ser
65 70 75
gaa aac acc ggc ttt aaa aac gtc ccg gat ctg cgc acc gat cag ccg 288
Glu Asn Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln Pro
80 85 90
aaa ccg ccg tcc aaa aaa cgc tcc tgc gat ccg tcc gaa tat cgc gtc 336
Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg Val
95 100 105 110
tcc gaa ctg aaa gaa tcc ctg atc acc acc acc ccg tcc cgc ccg cgc 384
Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro Arg
115 120 125
acc gcc cgc cgc tgc atc cgc ctc tgaaagcttg gctgttttgg cggatgagag 438
Thr Ala Arg Arg Cys Ile Arg Leu
130
aagattttca gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat 498
ttgcctggcg gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc aga 551
<210>58
<211>134
<212>PRT
<213>噬菌体
<400>58
Met Ala Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln ArgArg Arg Met Asn Ala
1 5 10 15
Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe Arg Pro Pro
20 25 30
Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu Ile Arg Ile
35 40 45
Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly Cys Ala Asn
50 55 60
Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn Ser Glu Asn
65 70 75 80
Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln Pro Lys Pro
85 90 95
Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg Val Ser Glu
100 105 110
Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro Arg Thr Ala
115 120 125
Arg Arg Cys Ile Arg Leu
130
<210>59
<211>444
<212>DNA
<213>噬菌体
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)...(1)
<223>n＝a，c，g，or t
<221>CDS
<222>(7)...(427)
<400>59
nagacc atg gct cat cac cat cac cac cat tat ggc cgc aaa aaa cgc 48
Met Ala His His His His His His Tyr Gly Arg Lys Lys Arg
1 5 10
cgt cag cgc cgt cgc atg aac gcg ctg cag gaa gat acc ccg ccg ggc 96
Arg Gln Arg Arg Arg Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly
15 20 25 30
ccg tcc acc gtg ttt cgc ccg ccg acc tcc tcc cgc ccg ctg gaa acc 144
Pro Ser Thr Val Phe Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr
35 40 45
ccg cat tgc cgc gaa atc cgc atc ggc atc gcg ggc atc acc atc acc 192
Pro His Cys Arg Glu Ile Arg Ile Gly IIe Ala Gly Ile Thr Ile Thr
50 55 60
ctg tcc ctg tgc ggc tgc gcg aac gcg cgc gcg ccg acc ctg cgc tcc 240
Leu Ser Leu Cys Gly Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser
65 70 75
gcg acc gcg gat aac tcc gaa aac acc ggc ttt aaa aac gtc ccg gat 288
Ala Thr Ala Asp Asn Ser Glu Asn Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp
80 85 90
ctg cgc acc gat cag ccg aaa ccg ccg tcc aaa aaa cgc tcc tgc gat 336
Leu Arg Thr Asp Gln Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp
95 100 105 110
ccg tcc gaa tat cgc gtc tcc gaa ctg aaa gaa tcc ctg atc acc acc 384
Pro Ser Glu Tyr Arg Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr
115 120 125
acc ccg tcc cgc ccg cgc acc gcc cgc cgc tgc atc cgc ctc t 427
Thr Pro Ser Arg Pro Arg Thr Ala Arg Arg Cys Ile Arg Leu
130 135 140
gaaagcttgg ctgtttt 444
<210>60
<211>140
<212>PRT
<213>噬菌体
<400>60
Met Ala His His His His His His Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln
1 5 10 15
Arg Arg Arg Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser
20 25 30
Thr Val Phe Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His
35 40 45
Cys Arg Glu Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser
50 55 60
Leu Cys Gly Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr
65 70 75 80
Ala Asp Asn Ser Glu Asn Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg
85 90 95
Thr Asp Gln Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser
100 105 110
Glu Tyr Arg Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro
115 120 125
Ser Arg Pro Arg Thr Ala Arg Arg Cys Ile Arg Leu
130 135 140
<210>61
<211>1565
<212>DNA
<213>沙门氏菌(Salmonella)
<400>61
gatatcattc tggcctctga cgttgtgatg gtcgcacgtg gcgatctggg cgttgaaatc 60
ggcgatccgg agctggttgg tatccagaaa gcgctgattc gccgtgcgcg tcagctaaac 120
cgcgcagtca tcaccgcaac gcaaatgatg gagtcgatga tcaccaaccc gatgccgacc 180
cgtgcggaag tgatggacgt ggcgaacgcc gtcctggatg gcacggatgc ggttatgctg 240
tctgccgaaa ccgcagccgg tcagtatcct tctgaaaccg ttgccgcaat ggcgcgcgtc 300
tgcctgggcg cagaaaaaat ccccagcatc aatgtgtcta aacaccgtct cgacgtgcag 360
ttcgacaacg ttgaagaagc cattgccatg tctgcgatgt atgcggcaaa ccatctgaaa 420
ggcgttaccg cgatcatcac catgacggaa tccggtcgta ccgcgctaat gacttcccgt 480
atcagctccg gcctgccgat tttcgccatg tcgcgccatg aacgcacgct gaacctgacc 540
gcgctctatc gcggagtaac gccggtgcat tttgatagcg cggctgatgg cgttgtcgcg 600
gcacatgaag ctgttaatct gctgcgcgat aaagggtatc tggtttccgg cgacctggtt 660
atcgtgaccc agggcgatgt catgagcacc gtcggttcaa ccaataccac gcggccgccc 720
ccttaattaa ccccgcatgc ggggggccat ataggccggg gatttaaatg caaacgtccg 780
ccgaaacgcc gacgcactgt gttccagata tagtcaaaaa ccggattacc ctgattatga 840
aacatcgccg ccattttttg cccctgagag gccatcagca tggctggaat gtcgacgccc 900
cagccatgcg gtacgagaaa aatgactttt tcgtcgttac gacgcatctc ctcgataatc 960
tccagacctt cccagtcaac acgctgttga atttttttcg gaccgcgcat cgccaactca 1020
gccatcatcg ccattgcctg tggcgcggtg gcgaacatct catcgacaat cgcttcgcgc 1080
tcagcttcgc tacgctgcgg aaagcacaac gacagattaa ttagcgcccg gcgacgagaa 1140
ctcttcccca gccgtccggc aaaacgcccc agcgtcgcca gcaaagggtc gcggaatgat 1200
gccggtgtta atgcgatccc cgccattgcc gccgcgccca accaggcgcc ccaatactgt 1260
ggatagcgaa aggatttttc gaattcaggg atatactcac tattattttt tttggtttcc 1320
atgcttttcc agggtctgct gacgcgaaaa ggaattgtga atagtgtagc gacgtctgcg 1380
tctcacacaa aacaaaaaag ccggcacaca tcgcgtaccg gctctgtcag cgcatttgtt 1440
aatcgaagcg cagttgcggc agaacctctt tcacctgtgc caggtattca cgacgatctg 1500
accccgtcag accttccgtg cgcggcaatt ttgctgtcag agggttaacg gcttgctggt 1560
tgatc 1565
Claims (99)
1.一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种初级效应分子，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌。
2.一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种初级效应分子以及一种或多种次级效应分子，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌。
3.权利要求1或2的定向于肿瘤的减毒细菌，其中至少一种初级效应分子是TNF家族成员。
4.权利要求3的定向于肿瘤的减毒细菌，其中TNF家族成员为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、TNF-α相关凋亡诱导配体(TRAIL)、TNF-α相关激活诱导的细胞因子(TRANCE)、TNF-α相关凋亡弱诱导物(TWEAK)、CD40配体(CD40L)、LT-α、LT-β、OX40L、CD40L、FasL、CD27L、CD30L、4-1BBL、APRIL、LIGHT、TL1、TNFSF16、TNFSF17或AITR-L。
5.权利要求1或2的定向于肿瘤的减毒细菌，其中至少一种初级效应分子是抗血管生成因子。
6.权利要求5的定向于肿瘤的减毒细菌，其中抗血管生成因子为内抑素、制管张素、抗血管生成性抗凝血酶III、纤连蛋白的29kDa N-端蛋白水解片段和40kDa C-端蛋白水解片段、uPA受体拮抗剂、催乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的含有24个氨基酸的抗血管生成性片段、被称为13.40的抗血管生成因子、血小板反应蛋白I的含有22个氨基酸的抗血管生成性肽片段、SPARC的含有20个氨基酸的抗血管生成性肽片段、含有RGD和NGR的肽、层粘连蛋白的抗血管生成性小分子肽、纤连蛋白的抗血管生成性小分子肽、前胶原的抗血管生成性小分子肽、EGF的抗血管生成性小分子肽，以及整联蛋白αvβ3的肽拮抗剂或VEGF受体的肽拮抗剂。
7.权利要求1或2的定向于肿瘤的减毒细菌，其中至少一种初级效应分子是细菌素家族成员，条件是该细菌素不是BRP。
8.权利要求7的定向于肿瘤的减毒细菌，其中细菌素家族成员为ColE1、ColE1a、ColE1b、ColE2、ColE3、ColE4、ColE5、ColE6、ColE7、ColE8、ColE9、大肠杆菌素A、大肠杆菌素K、大肠杆菌素L、大肠杆菌素M、阴沟肠道菌素DF13、鼠疫菌素A1122、葡萄球菌素1580、丁酸梭菌素7423、脓菌素R1或AP41、巨杆菌素A-216、弧菌素、或微生物素M15。
9.权利要求1或2的定向于肿瘤的减毒细菌，其中初级效应分子是肿瘤抑制性酶。
10.权利要求9的定向于肿瘤的减毒细菌，其中肿瘤抑制性酶为甲硫氨酸酶、天冬酰胺酶、脂酶、磷脂酶、蛋白酶、DNA酶或糖苷酶。
11.权利要求1或2的定向于肿瘤的减毒细菌，其中初级效应分子是溶血素、Vero细胞毒素、CNF1、CNF2或PMT。
12.权利要求1或2的定向于肿瘤的减毒细菌，其中初级效应分子来源于动物、植物、细菌、或病毒。
13.权利要求2的定向于肿瘤的减毒细菌，其中次级效应分子是免疫调节剂、抗肿瘤蛋白、前体药物转化酶、反义分子、核酶、或抗原。
14.权利要求1或2的定向于肿瘤的减毒细菌，其中定向于肿瘤的减毒细菌为沙门氏菌。
15.权利要求1的定向于肿瘤的减毒细菌，其中定向于肿瘤的减毒细菌另含有一种增强释放系统。
16.权利要求2的定向于肿瘤的减毒细菌，其中次级效应分子是细菌素释放因子(BRP)。
17.一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种融合蛋白，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌，并且所述融合蛋白含有一种信号序列和一种效应分子。
18.一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种融合蛋白，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌，并且所述融合蛋白含有一种运送肽和一种效应分子。
19.权利要求18的定向于肿瘤的减毒细菌，其中融合蛋白另含有一种信号序列。
20.权利要求17或19的定向于肿瘤的减毒细菌，其中信号序列是一种OmpA样蛋白。
21.权利要求18或19的定向于肿瘤的减毒细菌，其中运送肽来源于HIV TAT蛋白、触角足同源域(穿透蛋白)、卡波西成纤维细胞生长因子(FGF)膜移位序列(MTS)、单纯疱疹病毒VP22、六聚组氨酸、六聚赖氨酸、或六聚精氨酸。
22.权利要求17、18或19的定向于肿瘤的减毒细菌，其中效应分子是初级效应分子或次级效应分子。
23.权利要求17、18或19的定向于肿瘤的减毒细菌，其中定向于肿瘤的减毒细菌另含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子可编码一种或多种效应分子。
24.权利要求23的定向于肿瘤的减毒细菌，其中效应分子是初级效应分子或次级效应分子。
25.一种药用组合物，该组合物含有可药用载体和定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种初级效应分子，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌。
26.一种药用组合物，该组合物含有可药用载体和定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种初级效应分子以及一种或多种次级效应分子，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌。
27.权利要求25或26的药用组合物，其中至少一种初级效应分子是TNF家族成员。
28.权利要求27的药用组合物，其中TNF家族成员为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、TNF-α相关凋亡诱导配体(TRAIL)、TNF-α相关激活诱导的细胞因子(TRANCE)、TNF-α相关凋亡弱诱导物(TWEAK)、CD40配体(CD40L)、LT-α、LT-β、OX40L、CD40L、FasL、CD27L、CD30L、4-1BBL、APRIL、LIGHT、TL1、TNFSF16、TNFSF17或AITR-L。
29.权利要求25或26的药用组合物，其中至少一种初级效应分子是抗血管生成因子。
30.权利要求29的药用组合物，其中抗血管生成因子为内抑素、制管张素、抗血管生成性抗凝血酶III、纤连蛋白的29kDa N-端蛋白水解片段和40kDa C-端蛋白水解片段、uPA受体拮抗剂、催乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的含有24个氨基酸的抗血管生成性片段、被称为13.40的抗血管生成因子、血小板反应蛋白I的含有22个氨基酸的抗血管生成性肽片段、SPARC的含有20个氨基酸的抗血管生成性肽片段、含有RGD和NGR的肽、层粘连蛋白的抗血管生成性小分子肽、纤连蛋白的抗血管生成性小分子肽、前胶原的抗血管生成性小分子肽、EGF的抗血管生成性小分子肽，以及整联蛋白αvβ3的肽拮抗剂或VEGF受体的肽拮抗剂。
31.权利要求25或26的药用组合物，其中至少一种初级效应分子是细菌素家族成员，条件是该细菌素不是BRP。
32.权利要求31的药用组合物，其中细菌素家族成员为ColE1、ColE1a、ColE1b、ColE2、ColE3、ColE4、ColE5、ColE6、ColE7、ColE8、ColE9、大肠杆菌素A、大肠杆菌素K、大肠杆菌素L、大肠杆菌素M、阴沟肠道菌素DF13、鼠疫菌素A1122、葡萄球菌素1580、丁酸梭菌素7423、脓菌素R1或AP41、巨杆菌素A-216、弧菌素、或微生物素M15。
33.权利要求25或26的药用组合物，其中至少一种初级效应分子是肿瘤抑制性酶。
34.权利要求33的药用组合物，其中肿瘤抑制性酶为甲硫氨酸酶、天冬酰胺酶、脂酶、磷脂酶、蛋白酶、DNA酶或糖苷酶。
35.权利要求25或26的药用组合物，其中至少一种初级效应分子是溶血素、Vero细胞毒素、CNF1、CNF2、或PMT。
36.权利要求25或26的药用组合物，其中初级效应分子来源于动物、植物、细菌、或病毒。
37.权利要求26的药用组合物，其中次级效应分子是免疫调节剂、抗肿瘤蛋白、前体药物转化酶、反义分子、核酶、或抗原。
38.权利要求25或26的药用组合物，其中定向于肿瘤的减毒细菌为沙门氏菌。
39.权利要求25的药用组合物，其中定向于肿瘤的减毒细菌另含有一种增强释放系统。
40.权利要求26的药用组合物，其中次级效应分子是细菌素释放因子。
41.一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种融合蛋白，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌，并且所述融合蛋白含有信号序列和效应分子。
42.一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种融合蛋白，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌，并且所述融合蛋白含有运送肽和效应分子。
43.权利要求42的药用组合物，其中融合蛋白另含有一种信号序列。
44.权利要求41或43的药用组合物，其中信号序列是一种OmpA样蛋白。
45.权利要求42或43的药用组合物，其中运送肽来源于HIV TAT蛋白、触角足同源域(穿透蛋白)、卡波西成纤维细胞生长因子(FGF)膜移位序列(MTS)、单纯疱疹病毒VP22、六聚组氨酸、六聚赖氨酸、或六聚精氨酸。
46.权利要求41、42或43的药用组合物，其中效应分子是初级效应分子或次级效应分子。
47.权利要求41、42或43的药用组合物，其中定向于肿瘤的减毒细菌另含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子可编码一种或多种效应分子。
48.用于将治疗实体瘤癌症的一种或多种初级效应分子递送至需要这种治疗的受试者的方法，该方法包括给予一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种初级效应分子，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌。
49.用于将治疗实体瘤癌症的一种或多种初级效应分子以及一种或多种次级效应分子递送至需要这种治疗的受试者的方法，该方法包括给予一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种初级效应分子以及一种或多种次级效应分子，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌。
50.权利要求48或49的方法，其中至少一种初级效应分子是TNF家族成员。
51.权利要求50的方法，其中TNF家族成员为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、TNF-α相关凋亡诱导配体(TRAIL)、TNF-α相关激活诱导的细胞因子(TRANCE)、TNF-α相关凋亡弱诱导物(TWEAK)、CD40配体(CD40L)、LT-α、LT-β、OX40L、CD40L、FasL、CD27L、CD30L、4-1BBL、APRIL、LIGHT、TL1、TNFSF16、TNFSF17或AITR-L。
52.权利要求48或49的方法，其中至少一种初级效应分子是抗血管生成因子。
53.权利要求52的方法，其中抗血管生成因子为内抑素、制管张素、抗血管生成性抗凝血酶III、纤连蛋白的29kDa N-端蛋白水解片段和40kDa C-端蛋白水解片段、uPA受体拮抗剂、催乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的含有24个氨基酸的抗血管生成性片段、被称为13.40的抗血管生成因子、血小板反应蛋白I的含有22个氨基酸的抗血管生成性肽片段、SPARC的含有20个氨基酸的抗血管生成性肽片段、含有RGD和NGR的肽、层粘连蛋白的抗血管生成性小分子肽、纤连蛋白的抗血管生成性小分子肽、前胶原的抗血管生成性小分子肽、EGF的抗血管生成性小分子肽，以及整联蛋白αvβ3的肽拮抗剂或VEGF受体的肽拮抗剂。
54.权利要求48或49的方法，其中至少一种初级效应分子是细菌素家族成员，条件是该细菌素不是BRP。
55.权利要求54的方法，其中细菌素家族成员为ColE1、ColE1a、ColE1b、ColE2、ColE3、ColE4、ColE5、ColE6、ColE7、ColE8、ColE9、大肠杆菌素A、大肠杆菌素K、大肠杆菌素L、大肠杆菌素M、阴沟肠道菌素DF13、鼠疫菌素A1122、葡萄球菌素1580、丁酸梭菌素7423、脓菌素R1或AP41、巨杆菌素A-216、弧菌素、或微生物素M15。
56.权利要求48或49的方法，其中至少一种初级效应分子是肿瘤抑制性酶。
57.权利要求56的方法，其中肿瘤抑制性酶为甲硫氨酸酶、天冬酰胺酶、脂酶、磷脂酶、蛋白酶、DNA酶或糖苷酶。
58.权利要求48或49的方法，其中至少一种初级效应分子是溶血素、Vero细胞毒素、CNF1、CNF2、或PMT。
59.权利要求48或49的方法，其中初级效应分子来源于动物、植物、细菌、或病毒。
60.权利要求49的方法，其中至少一种次级效应分子是抗肿瘤蛋白、前体药物转化酶、反义分子、核酶、或抗原。
61.权利要求48或49的方法，其中定向于肿瘤的减毒细菌为沙门氏菌。
62.权利要求48的方法，其中定向于肿瘤的减毒细菌另含有一种增强释放系统。
63.权利要求49的方法，其中次级效应分子是细菌素释放因子。
64.用于将治疗实体瘤癌症的一种或多种融合蛋白递送至需要这种治疗的受试者的方法，该方法包括给予一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子可编码一种或多种融合蛋白，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌，并且所述融合蛋白含有一种信号序列和一种效应分子。
65.用于将治疗实体瘤癌症的一种或多种融合蛋白递送至需要这种治疗的受试者的方法，该方法包括给予一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子可编码一种或多种融合蛋白，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌，并且所述融合蛋白含有一种运送肽和一种效应分子。
66.权利要求65的方法，其中融合蛋白另含有一种信号序列。
67.权利要求64或66的方法，其中信号序列是一种OmpA样蛋白。
68.权利要求65或66的方法，其中运送肽来源于HIV TAT蛋白、触角足同源域(穿透蛋白)、卡波西成纤维细胞生长因子(FGF)膜移位序列(MTS)、单纯疱疹病毒VP22、六聚组氨酸、六聚赖氨酸、或六聚精氨酸。
69.权利要求64、65或66的方法，其中效应分子是初级效应分子或次级效应分子。
70.权利要求64、65或66的方法，其中定向于肿瘤的减毒细菌另含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种效应分子。
71.用于治疗动物体内的实体瘤癌症的方法，该方法包括给予一种或多种化疗剂以及一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种初级效应分子，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌。
72.用于治疗动物体内的实体瘤癌症的方法，该方法包括给予一种或多种化疗剂以及一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种初级效应分子以及一种或多种次级效应分子，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌。
73.权利要求71或72的方法，其中至少一种初级效应分子是TNF家族成员。
74.权利要求73的方法，其中TNF家族成员为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、TNF-α相关凋亡诱导配体(TRAIL)、TNF-α相关激活诱导的细胞因子(TRANCE)、TNF-α相关凋亡弱诱导物(TWEAK)、CD40配体(CD40L)、LT-α、LT-β、OX40L、CD40L、FasL、CD27L、CD30L、4-1BBL、APRIL、LIGHT、TL1、TNFSF16、TNFSF17或AITR-L。
75.权利要求71或72的方法，其中至少一种初级效应分子是一种抗血管生成因子。
76.权利要求75的方法，其中抗血管生成因子为内抑素、制管张素、抗血管生成性抗凝血酶III、纤连蛋白的29kDa N-端蛋白水解片段和40kDa C-端蛋白水解片段、uPA受体拮抗剂、催乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的含有24个氨基酸的抗血管生成性片段、被称为13.40的抗血管生成因子、血小板反应蛋白I的含有22个氨基酸的抗血管生成性肽片段、SPARC的含有20个氨基酸的抗血管生成性肽片段、含有RGD和NGR的肽、层粘连蛋白的抗血管生成性小分子肽、纤连蛋白的抗血管生成性小分子肽、前胶原的抗血管生成性小分子肽、EGF的抗血管生成性小分子肽，以及整联蛋白αvβ3的肽拮抗剂或VEGF受体的肽拮抗剂。
77.权利要求71或72的方法，其中至少一种初级效应分子是细菌素家族成员，条件是该细菌素不是BRP。
78.权利要求77的方法，其中细菌素家族成员为ColE1、ColE1a、ColE1b、ColE2、ColE3、ColE4、ColE5、ColE6、ColE7、ColE8、ColE9、大肠杆菌素A、大肠杆菌素K、大肠杆菌素L、大肠杆菌素M、阴沟肠道菌素DF13、鼠疫菌素A1122、葡萄球菌素1580、丁酸梭菌素7423、脓菌素R1或AP41、巨杆菌素A-216、弧菌素、或微生物素M15。
79.权利要求71或72的方法，其中至少一种初级效应分子是肿瘤抑制性酶。
80.权利要求79的方法，其中肿瘤抑制性酶为甲硫氨酸酶、天冬酰胺酶、脂酶、磷脂酶、蛋白酶、DNA酶或糖苷酶。
81.权利要求71或72的方法，其中至少一种初级效应分子是溶血素、Vero细胞毒素、CNF1、CNF2、或PMT。
82.权利要求71或72的方法，其中初级效应分子来源于动物、植物、细菌、或病毒。
83.权利要求82的方法，其中次级效应分子是免疫调节剂、抗肿瘤蛋白、前体药物转化酶、反义分子、核酶，或抗原。
84.权利要求71或72的方法，其中定向于肿瘤的减毒细菌为沙门氏菌。
85.权利要求71的方法，其中定向于肿瘤的减毒细菌另含有一种增强释放系统。
86.权利要求72的方法，其中次级效应分子是细菌素释放因子。
87.用于治疗动物体内的实体瘤癌症的方法，该方法包括给予一种或多种化疗剂以及一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种融合蛋白，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌，并且所述融合蛋白含有一种信号序列和一种效应分子。
88.用于治疗动物体内的实体瘤癌症的方法，该方法包括给予一种或多种化疗剂以及一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌，该细菌含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种融合蛋白，其中，所述定向于肿瘤的减毒细菌是一种兼性需氧菌或兼性厌氧菌，并且所述融合蛋白含有一种运送肽和一种效应分子。
89.权利要求88的方法，其中融合蛋白另含有一种信号序列。
90.权利要求87或89的方法，其中信号序列是一种OmpA样蛋白。
91.权利要求88或89的方法，其中运送肽来源于HIV TAT蛋白、触角足同源域(穿透蛋白)、卡波西成纤维细胞生长因子(FGF)膜转移位序列(MTS)、单纯疱疹病毒VP22、六聚组氨酸、六聚赖氨酸、或六聚精氨酸。
92.权利要求87、88或89的方法，其中的效应分子是一种初级效应分子或次级效应分子。
93.权利要求87、88或89的方法，其中定向于肿瘤的减毒细菌另含有与一种或多种启动子可操作性连接的一种或多种核酸分子，所述核酸分子可编码一种或多种效应分子。
94.用于治疗动物体内的实体瘤癌症的方法，该方法包括给予一种或多种化疗剂以及一种药用组合物，该组合物含有一种可药用载体和一种定向于肿瘤的减毒细菌。
95.一种融合蛋白，该融合蛋白含有一种OmpA样蛋白和一种效应分子。
96.一种融合蛋白，该融合蛋白含有一种信号序列、一种运送肽和一种效应分子。
97.权利要求96的融合蛋白，其中信号序列是一种OmpA样蛋白。
98.权利要求96的融合蛋白，其中运送肽来源于HIV TAT蛋白、触角足同源域(穿透蛋白)、卡波西成纤维细胞生长因子(FGF)膜转移序列(MTS)、单纯疱疹病毒VP22、六聚组氨酸、六聚赖氨酸、或六聚精氨酸。
99.权利要求95或96的融合蛋白，其中效应分子是初级效应分子或次级效应分子。
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