CN108472339A

CN108472339A - 利用甲硫氨酸和天冬酰胺消耗对包括人类在内的哺乳动物进行癌症治疗的方法

Info

Publication number: CN108472339A
Application number: CN201780005554.2A
Authority: CN
Inventors: 卡琳·阿格拉; 维利·贝利埃; 法比安·盖伊; 扬·戈德弗兰
Original assignee: Erytech Pharma SA
Current assignee: Phaxiam Therapeutics SA
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2017-01-02
Publication date: 2018-08-31
Anticipated expiration: 2037-01-02
Also published as: EP3187190A1; US20190000941A1; AU2017204678B2; IL260278A; WO2017114966A1; RU2018123666A; CN108472339B; CA3009918A1; ES2881787T3; HK1256155A1; JO3709B1; EP3397272A1; US20220040272A1; KR102268259B1; JP2019500386A; CA3009918C; RU2733389C2; US11141468B2; IL260278B; JP6966451B2

Abstract

本发明涉及一种对包括人类在内的哺乳动物体内的液体和实体癌进行治疗的方法，其中，甲硫氨酸酶在天冬酰胺酶之前施用。本发明还包括在以天冬酰胺酶进行治疗之前，通过饮食方式，或者通过饮食与甲硫氨酸酶施用相结合的方式，产生甲硫氨酸缺乏。甲硫氨酸酶和天冬酰胺酶尤其可以游离形式，聚乙二醇修饰形式或包封于红细胞内的形式使用。

Description

利用甲硫氨酸和天冬酰胺消耗对包括人类在内的哺乳动物进行癌症治疗的方法

技术领域

本发明涉及一种对包括人类在内的哺乳动物进行癌症治疗的新方法，该方法尤其为酶法。本发明还涉及天冬酰胺酶和甲硫氨酸酶在癌症治疗中的新用途。酶疗法旨在使肿瘤“饥饿”，并尤其旨在促进癌症的管理。

背景技术

天冬酰胺酶可水解并消耗天冬酰胺，而天冬酰胺为生成细胞赖以存活的蛋白的一种重要氨基酸。与正常细胞相比，某些癌性淋巴母细胞本身不具备生成天冬酰胺的能力，而是依靠胞外来源合成该蛋白质。因此，天冬酰胺酶可用于治疗白血病(液体癌或血液癌)。在过去的30年中，L-天冬酰胺酶已用于急性淋巴母细胞白血病(ALL)治疗中的联合化疗。ERY-ASP由包封于红细胞内的L-天冬酰胺酶组成。包封可使得L-天冬酰胺酶破坏红细胞内的天冬酰胺，从而防止过敏反应并减少其他不良事件(WO2006/016247，该文献通过引用并入本文)。

甲硫氨酸γ-裂解酶(MGL；EC编号：4.4.1.11；CAS编号：42616-25-1)也称甲硫氨酸酶，是L-甲硫氨酸(Met)这一含硫蛋白原氨基酸代谢中涉及的一种吡多醛依赖性酶。早在20世纪70年代，人们已经就癌症对甲硫氨酸的依赖性有所论及：研究结果发现，将培养基中的甲硫氨酸替换为其前体——高半胱氨酸时，不会对纤维母细胞等正常细胞产生任何影响，但是却导致数种转化或恶性细胞的生长速率放缓。此外，人们已利用可同时在体外和体内显著降低癌细胞增殖并迫使细胞进入凋亡期的甲硫氨酸类似物成功加强了甲硫氨酸饥饿在PC-3前列腺癌细胞内的抗肿瘤作用。补充研究结果显示，通过限制甲硫氨酸依赖性癌细胞内的外源性甲硫氨酸，可阻断细胞周期内S或G2晚期中的细胞分裂。由于甲硫氨酸限制对于癌症的治疗似乎非常有效，因此人们对采用不同来源的MGL酶的治疗方法在肿瘤微环境内的甲硫氨酸消耗情况进行研究，以开发出一种通过包封于红细胞内的MGL在罹患甲硫氨酸依赖性癌症的患者体内实现全身性甲硫氨酸消耗的新型治疗方案(WO2015/121348，该文献通过引用并入本文)。

发明内容

在癌症治疗领域中，目前仍然需要新的或其他治疗方案。

合并用药的效果本质上是无法预测的。一种药物通常会部分或完全抑制另一药物的作用。此处，通过体外研究，对ERY-ASP和ERY-MET的构成酶，即L-天冬酰胺酶和MGL的单用或联用对所选人白血病细胞系(HL-60)的细胞毒性作用进行评价。针对每种药物，均事先分别测定其可实现50％细胞活力抑制的浓度(IC50)。随后，通过试验，对L-天冬酰胺酶和MGL的添加(每种酶的添加量均为IC50剂量)时间之间具有一定间隔(如72小时)的联合治疗(无论以何种顺序联合)优点进行评价。

本发明基于如下惊人的发现：当IC50剂量的MGL添加3天后再添加IC50剂量的L-天冬酰胺酶时，可导致细胞死亡率升高。在白血病模型等液体瘤模型中按相反顺序添加上述两酶时，并未获得这一体外细胞死亡率升高的结果。在胃肿瘤等实体瘤中，上述显著效果得到证实，其中，不但在体外观察到了细胞死亡率的升高，而且还在体内观察到了肿瘤体积的消退。虽然不希望受到理论的约束，但是可以提出如下假说：MGL活性导致的甲硫氨酸缺乏可使得细胞对L-天冬酰胺酶更为敏感，而且这可能与参与细胞周期调控的每种酶的作用具有一定关联。这一发现开辟了采取如下做法的治疗方案：先产生甲硫氨酸缺乏或进行甲硫氨酸酶治疗，然后产生天冬酰胺缺乏或进行天冬酰胺酶治疗。从以下公开内容可知，本发明可包括通过饮食和/或药物施用而对癌症产生有益效果。因此，本发明可将饮食与药物以任何组合的形式联合施用，其中先产生甲硫氨酸缺乏或进行甲硫氨酸酶治疗，然后再产生天冬酰胺缺乏或进行天冬酰胺酶治疗。由于甲硫氨酸酶已知还具有半胱氨酸酶活性，而且天冬酰胺酶已知还具有谷氨酰胺酶活性，因此不能排除甲硫氨酸酶的作用机制中涉及半胱氨酸酶活性，而天冬酰胺酶的作用机制中涉及谷氨酰胺酶活性。

本发明的一个目的在于一种对具有相应需求的哺乳动物体内的癌症进行治疗的方法，该方法包括：先使该哺乳动物产生甲硫氨酸缺乏；然后再使该哺乳动物产生天冬酰胺缺乏。其目的在于，降低癌细胞可获得的甲硫氨酸和天冬酰胺的量。从以上描述可知，甲硫氨酸缺乏可优选通过饮食产生甲硫氨酸缺乏和/或通过施用甲硫氨酸酶的方式产生，而天冬酰胺缺乏可优选通过施用天冬酰胺酶的方式产生。

“产生缺乏”是指充分减少甲硫氨酸或天冬酰胺，以使得癌细胞缺乏足够量的此类氨基酸，从而在癌症治疗中产生有益效果。

“酶治疗”是指，利用酶对相应氨基酸的降解功能及其可能产生的蛋白质或氨基酸合成抑制等其他有益效果或其他机制，使得癌细胞缺乏足够量的该氨基酸。

本发明的一个目的在于一种治疗哺乳动物体内癌症的药物组合物，该药物组合物含有以“甲硫氨酸酶先，天冬酰胺酶后”这一顺序至少序贯施用一次的天冬酰胺酶和甲硫氨酸酶。由于天冬酰胺酶和甲硫氨酸酶分开序贯施用，因此该组合物可以为含不同制剂的一组或一套组合物，或者为按照本发明顺序和频次使用的各组合物。

在本发明各个方面和目的之下，本发明上下文中的“至少一次序贯施用”是指，在治疗疗程或治疗阶段内，可对同一哺乳动物进行一次以上的序贯治疗。然而，其中甲硫氨酸酶的一次或多次施用可早于天冬酰胺酶的一次或多次施用。

本发明的另一目的在于，天冬酰胺酶和甲硫氨酸酶在制备一种药物组合物、多种药物组合物或一组或一套药物组合物(其中的一种药物组合物含甲硫氨酸酶，另一种药物组合物含天冬酰胺酶)中的用途，其中，该一种、多种或一套药物组合物用于治疗哺乳动物体内的癌症，且以“甲硫氨酸酶先，天冬酰胺酶后”这一顺序至少序贯施用一次。

本发明的其他目的在于：

一种含天冬酰胺酶的药物组合物，用于治疗哺乳动物体内的癌症，其中，该组合物施用至已施用甲硫氨酸酶的哺乳动物；

一种含天冬酰胺酶的药物组合物，用于治疗哺乳动物体内的癌症，其中，该组合物施用至已接受可产生甲硫氨酸缺乏的饮食，即已施用缺乏甲硫氨酸的治疗性或非治疗性食物的哺乳动物，本发明意义上的“治疗性食物”是指，在医疗环境下施用并且/或者受管理机构上市许可管辖的食物，尤其为可或不可通过输注施用的液体食物；

一种含甲硫氨酸酶的药物组合物，用于治疗哺乳动物体内的癌症，其中，该组合物施用至将进一步施用天冬酰胺酶的哺乳动物；

一种治疗性或非治疗性的食物组合或饮食，不含甲硫氨酸或基本不含甲硫氨酸，用于在以天冬酰胺酶治疗哺乳动物之前，使得该哺乳动物缺乏甲硫氨酸。

本发明的其他目的在于：

天冬酰胺酶在制备用于治疗哺乳动物体内癌症的药物组合物中的用途，其中，该组合物施用至已施用甲硫氨酸酶的哺乳动物；

天冬酰胺酶在制备用于治疗哺乳动物体内癌症的药物组合物中的用途，其中，该组合物施用至已接受可产生甲硫氨酸缺乏的饮食，即已施用缺乏甲硫氨酸的治疗性或非治疗性食物的哺乳动物；

甲硫氨酸酶在制备用于治疗哺乳动物体内癌症的药物组合物中的用途，其中，该组合物施用至将进一步施用天冬酰胺酶的哺乳动物。

本发明的另一目的在于一套药物组合物，包括：含甲硫氨酸酶或含用于产生甲硫氨酸缺乏的治疗性食物或饮食的药物组合物；以及含天冬酰胺酶的药物组合物，所述各组合物分开包装。所述各组合物序贯施用，其中，甲硫氨酸酶或所述食物/饮食在天冬酰胺酶之前施用。该一套组合物还可内附说明资料，提示各组合物需序贯施用，且甲硫氨酸酶或所述食物/饮食在天冬酰胺酶之前施用。

本发明的另一目的在于一种治疗哺乳动物体内癌症的方法，包括先向哺乳动物施用有效量的甲硫氨酸酶，然后施用有效量的天冬酰胺酶。

本发明的另一目的在于，一种哺乳动物体内癌症的治疗方法，包括先向哺乳动物施用用于产生甲硫氨酸缺乏的治疗性或非治疗性食物或饮食，然后施用有效量的天冬酰胺酶。

本发明的另一目的在于一种对具有低的甲硫氨酸体内可用水平或已接受可产生甲硫氨酸缺乏的治疗性或非治疗性食物或饮食的哺乳动物体内的癌症进行治疗的方法，该方法包括向该哺乳动物施用有效量的天冬酰胺酶。

在上述各种目的中，可将甲硫氨酸酶的施用与通过饮食产生的甲硫氨酸缺乏相结合。

本发明可造福于包括液体癌(即血液癌)和实体癌在内的任何癌症。

本发明的一个具体目的在于本发明在天冬酰胺和/或甲硫氨酸营养缺陷型癌症的治疗中的用途。

本发明的一个具体目的在于本发明在非天冬酰胺和/或非甲硫氨酸营养缺陷型癌症的治疗中的用途。

本发明可适用于任何哺乳动物，尤其人类、狗和猫等伴侣动物以及马等体育运动动物。

具体实施方式

通过本发明，本领域技术人员可理解的是，以饮食或上述药物当中的一种进行治疗的持续时间，以及甲硫氨酸缺乏的产生时间和天冬酰胺酶的治疗时间之间的间隔，可随治疗情况和患者反应而变化，而且更为重要的是，随该药物的半衰期或饮食的效果而变化。本发明随采用的剂型不同，可能会产生一定差异，该剂型例如为游离酶，聚乙二醇修饰酶，包封于红细胞内的酶，或者以其他方式结合于微囊(如由PLA或PLGA制成的微囊)或脂质体上或包封于此类结构内的酶。

在上述各目的的一种优选实施方式中，甲硫氨酸酶的施用完成时间与天冬酰胺酶的施用开始时间之间的间隔为约1小时～约7天，尤其为约3小时～约6天，优选为约1天～约5天。优选地，在该实施方式中，甲硫氨酸酶处于游离形式或聚乙二醇修饰形式，天冬酰胺酶可处于本文所述的任何形式。

在另一实施方式中，甲硫氨酸酶的施用完成时间与天冬酰胺酶的施用开始时间之间的间隔为约1小时～约30天，尤其为约1天～约20天，优选为约1天～约10天。优选地，在该实施方式中，甲硫氨酸酶处于包封形式，优选包封于红细胞内，而天冬酰胺酶可处于本文所述的任何形式。

在另一实施方式中，甲硫氨酸限制的完成时间与天冬酰胺酶的施用开始时间之间的间隔为约1小时～约7天，尤其为约1小时～约3天，优选为约1小时～约1天。天冬酰胺酶可采取本文所述的任何形式。

含游离形式或聚乙二醇修饰形式的酶等的组合物

此类组合物可通过标准技术施用至哺乳动物。其中的各种常用技术和制剂方法如《雷氏药学大全》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第18版(马克出版公司(MackPublishing Co.)，宾夕法尼亚州伊斯顿市，1990年)所述(通过参考并入本文)。

此外，本发明药物组合物内还可掺入药学上可接受的载体和/或赋形剂，以尤其促进甲硫氨酸酶或天冬酰胺酶的施用。适于实际用于本发明的载体例如包括碳酸钙，磷酸钙，乳糖、葡萄糖或蔗糖等各种糖，各种淀粉类载体，纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙二醇及生理上相容的溶剂。生理上相容的溶剂例如包括注射用水(WFI)的无菌溶液、盐溶液及葡萄糖溶液。

本发明药物组合物可通过不同途径施用，包括静脉内、腹腔内、皮下、肌肉内、口服、局部(经皮)或经粘膜施用。对于全身性施用，优选口服施用。对于口服施用，各复合物可例如配制成常规口服剂型，例如胶囊，片剂以及糖浆、酏剂及浓缩滴剂等液体制剂。

或者，也可使用注射(肠胃外施用)，例如肌肉内、静脉内、腹腔内及皮下注射。对于注射，各药物组合物配制成生理盐水，优选配制成生理盐水、汉克氏溶液(Hank’s溶液)或林格氏溶液(Ringer’s溶液)等生理上相容的缓冲液或溶液。此外，所述各复合物可配制成使用前即时重新溶解或悬浮的固体形式。例如，可使用冻干形式的甲硫氨酸酶或天冬酰胺酶。

全身性施用也可通过经粘膜或经皮方式实现。对于经粘膜或经皮施用，制剂中使用与待透过屏障相适合的渗透剂。此类渗透剂为本领域周知之物，而且对于经粘膜施用而言，例如包括胆盐及夫西地酸衍生物。此外，为了促进渗透，还可使用清洁剂。经粘膜施用例如可通过鼻腔喷雾剂、吸入剂(用于肺部给药)、直肠栓剂或阴道栓剂实现。对于局部施用，如本领域中众所周知的一样，各复合物可配置成软膏、油膏、凝胶或乳膏。

本发明还包括，利用植入哺乳动物体内或施加于其上的装置，并例如通过输注或其他途径，输送上述酶。在特定实施方式中，所述装置包括两个腔室或储瓶，其中的一个盛有甲硫氨酸酶，另一个盛有天冬酰胺酶。在该装置中，每一腔室或储瓶均配有用于将酶输送至血液循环中的输送管或其他输送部件，以及由电子电路和相应软件控制的电子阀或电气阀、电子泵或电气泵、或者驱动活塞。在所述电子电路及其软件的控制下，首先优选以一定速率进行预定时长的甲硫氨酸酶输送，然后在等待一段时间后，优选以一定速率进行预定时长的天冬酰胺酶输送。

含包封上述酶的红细胞(血红细胞，RBC)的组合物

在一种实施方式中，天冬酰胺酶包封于红细胞内，而且所述组合物含有由该红细胞悬浮于药学上可接受的载体或载剂内而形成的悬浮液。

在一种实施方式中，甲硫氨酸酶包封于红细胞内，而且所述组合物含由该红细胞悬浮于药学上可接受的载体或载剂内而形成的悬浮液。

在一种实施方式中，天冬酰胺酶在药学上可接受的载体或载剂内为游离形式或聚乙二醇修饰形式(PEG-天冬酰胺酶)。

在一种实施方式中，甲硫氨酸酶在药学上可接受的载体或载剂内为游离形式或或聚乙二醇修饰形式(PEG-甲硫氨酸酶)。

在一种实施方式中，甲硫氨酸酶的施用量为约100IU～约100000IU，尤其为约500IU～约50000IU，优选为约500IU～约5000IU。

在一种实施方式中，天冬酰胺酶的施用量为约500IU～约100000IU，尤其为约1000IU～约50000IU，优选为约5000IU～约30000IU。

在一种实施方式中，所述组合物用于两次或多次，尤其两次或三次序贯施用。

在一种实施方式中，天冬酰胺酶和甲硫氨酸酶按照本发明顺序序贯使用，而且此两酶均包封于红细胞内。

在一种实施方式中，天冬酰胺酶和甲硫氨酸酶按照本发明顺序序贯使用，其中，天冬酰胺酶包封于红细胞内，而甲硫氨酸酶为游离形式或聚乙二醇修饰形式。

在一种实施方式中，天冬酰胺酶和甲硫氨酸酶按照本发明顺序序贯使用，其中，甲硫氨酸酶包封于红细胞内，而天冬酰胺酶为游离形式或聚乙二醇修饰形式。

“包封”是指，所述酶包含于红细胞内部，但可能有少量的酶保留于红细胞的细胞壁内。

饮食性甲硫氨酸限制

之前已有人在黑素瘤和神经胶质瘤的半胱胺亚硝脲疗法(E.Thivat等人，Anticancer Research(《抗癌研究》)，2009年，29卷：5235～5240页)及作为转移性结肠直肠癌一线疗法的FOLFOX(X.Durando等人，Oncology(《肿瘤学》)，2010年，78卷：205～209页)中提出了通过饮食限制甲硫氨酸。限制甲硫氨酸或产生甲硫氨酸缺乏的饮食为通过使哺乳动物在足够长的时间内摄取食物组合而完全消除或大量减少该哺乳动物体内的游离甲硫氨酸的食谱。

该食物可优选为通过肠胃外途径，尤其通过输注给予的液体食物。

此外，通过甲硫氨酸酶产生甲硫氨酸缺乏的目的在于使哺乳动物体内的游离甲硫氨酸大量减少或完全消失。通常，该饮食将甲硫氨酸水平降低为该哺乳动物体内平均水平的30～100％，一般为30～60％。关于此类内容，可参考Thivat(2009年)和Durando(2010年)的著作。

所述食物的给予可在一天或多天内完成，例如在1～7天内完成。

在一种实施方式中，所述食物与甲硫氨酸酶治疗相结合。例如，该食物在甲硫氨酸酶治疗的整个或部分持续时间内给予。

甲硫氨酸酶

甲硫氨酸酶也称为L-甲硫氨酸酶或甲硫氨酸γ-裂解酶(MGL)等，其EC编号为4.4.1.11，CAS编号为42616-25-1。关于可用于本发明的甲硫氨酸酶来源，可尤其举出的是以下发表文献：El Sayed A，Applied Microbiol.Biotechnol.(《应用微生物生物技术》)，2010年，86卷：445～467页。

利用恶臭假单胞菌等细菌中的重组甲硫氨酸酶编码基因，可在大肠杆菌内生产该酶。由此获得的酶称为rMETase，并可以游离形式或聚乙二醇修饰形式(PEG-rMETase)等修饰形式使用(见X.Sun等人，Cancer Research(《癌症研究》)，2003年，63卷，8377～8383页)。该酶也可包封于红细胞内，而且有利地，所述组合物或悬浮液所含红细胞及包封甲硫氨酸酶的量足以向患者提供预定剂量的天冬酰胺酶。

关于各组合物及使用方法，本领域技术人员可参考WO2015/121348。

所述甲硫氨酸酶组合物还可含有该酶的辅因子(即磷酸吡哆醛(PLP))以及/或者其前体，该前体可以为：非磷酸盐前体，如维生素B6的非磷酸盐形式；以及/或者磷酸盐前体，如磷酸吡哆醇(PNP)。

维生素B6以不同形式存在，而且这些形式或为磷酸盐，或为非磷酸盐。其中，磷酸吡哆醇(PNP)、磷酸吡哆醛(PLP)及磷酸吡哆胺(PMP)为其磷酸盐形式，而吡哆醇(PN)、吡多醛(PL)及吡哆胺(PM)为相应的非磷酸盐。维生素B6的非磷酸盐形式可穿过红细胞膜，而其磷酸盐形式难以穿过红细胞膜。各形式在红细胞内的主要转化路径如下：吡哆醇在吡哆醇激酶的作用下转化为磷酸吡哆醇；磷酸吡哆醇在磷酸吡哆醇氧化酶的作用下转化为磷酸吡哆醛；磷酸吡哆醛可在磷酸吡哆醛磷酸酶的作用下转化为可离开红细胞的吡多醛。容易理解的是，在所述组合物的制备方法或储存过程中，上述前体可在红细胞内发生上述转化。

其中，维生素B6的非磷酸盐形式是指维生素B6的三种“同效”形式——吡多醛、吡哆醇和吡哆胺当中的一种，或两种或三种的混合物。其中，优选吡哆醇形式。此外，各同效形式可以为其盐的形式。

所述组合物可含有包封于红细胞内的磷酸吡哆醛。该磷酸吡哆醛可在包封过程中提供，或者部分或全部由其前体在红细胞内形成。该提供或形成的磷酸吡哆醛可与所述酶缔合。因此，所述组合物可含有相应的全酶，如甲硫氨酸酶-磷酸吡哆醛。在该条件下，活性酶的半衰期(例如，以根据其底物在血浆中的消耗时间所测的半衰期)可获得显著增大。本发明组合物可尤其在施用后将酶活性保持24小时以上，更尤其保持1天或1天以上，5天或5天以上，10天或10天以上，或者15天或15天以上。

因此，在一种实施方式中，所述甲硫氨酸酶组合物含有磷酸吡哆醛(PLP)和/或维生素B6的非磷酸盐形式和/或磷酸盐前体，磷酸吡哆醇(PNP)和/或磷酸吡哆胺(PMP)。

根据一个特征，在所述组合物中，红细胞内包封磷酸吡哆醇和/或磷酸吡哆胺。该前体可与所述酶同时包封，或者部分或全部由其自身前体在红细胞内形成。

在所述组合物中，磷酸吡哆醛和/或磷酸吡哆醇和/或磷酸吡哆胺的包封量尤其为每升(L)红细胞(血红细胞)内约0.05～约600微摩尔，更尤其为约0.5～约100微摩尔，优选为约5～约50微摩尔。

根据一个特征，所述组合物含有包封磷酸吡哆醛酶及磷酸吡哆醛的红细胞，以及磷酸吡哆醛的非磷酸盐前体，该前体包封于所述红细胞内，处于该红细胞内部，或同时处于该红细胞的内部和外部。该非磷酸盐前体可以为吡哆醇、吡多醛或吡哆胺，优选吡哆醇，或者为两种或三种此类化合物的混合物。所述非磷酸盐前体可处于所述红细胞的内部和/或外部。在该非磷酸盐前体的存在之下，红细胞内的磷酸吡哆醛可达到远高于不存在该非磷酸盐前体时的水平。

在一种实施方式中，所述组合物含有包封甲硫氨酸酶、磷酸吡哆醛及其一种磷酸盐前体、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆醛和/或磷酸吡哆胺的红细胞。如上所述，该组合物可进一步有利地含有非磷酸盐前体，尤其吡哆醇。

有利地，所述组合物或悬浮液所含的红细胞及包封甲硫氨酸酶的量足以向患者提供预定剂量的甲硫氨酸酶。

因此，所述组合物可进一步含有用于与甲硫氨酸酶同时、分别或序贯施用的磷酸吡哆醛或磷酸吡哆醛前体。在一种实施方式中，该组合物含有包封于红细胞之内的甲硫氨酸酶，以及用于分别或序贯施用的磷酸吡哆醛非磷酸盐前体。

根据一种实施方式，所述组合物含有：(1)红细胞与药学上可接受的载剂的制剂，该红细胞包封有甲硫氨酸酶；以及(2)非磷酸盐形式的维生素B6与药学上可接受的载剂的制剂，该非磷酸盐形式优选为吡哆醇。根据本发明，这些制剂用于同时、分别或序贯施用，并用于消耗甲硫氨酸。下文所述的使用方法将对最佳施用方式进行详细说明。所述组合物可尤其采取将上述两制剂分开包含于其内的一组或一套组合物的形式。根据一种实施方式，所述红细胞制剂内的药学上可接受的载剂为红细胞“保存液”，即将包封活性成分的红细胞以适于保存及注射的形式悬浮于其内的溶液。保存液优选含有至少一种促进红细胞保存的物质，该物质尤其选自葡萄糖、右旋糖、腺嘌呤及甘露醇。此外，该保存液还可含有可抑制红细胞内磷酸吡哆醛磷酸酶的无机磷酸盐。

在一种实施方式中，在施用包封于红细胞内的天冬酰胺酶施用之前，将包封于红细胞内的甲硫氨酸酶至少施用一次，优选至少施用两次，而且每次甲硫氨酸酶施用之后，在天冬酰胺酶施用前，均施用磷酸吡哆醛非磷酸盐前体溶液。

MGL活性的单位为IU，对应于下述条件下每分钟释放1微摩尔氨所需的MGL量。

MGL在其辅因子——磷酸吡哆醛存在的条件下将L-甲硫氨酸水解为α-丁酮酸，其中，每一L-甲硫氨酸分子均产生一分子的铵：

L-甲硫氨酸+H₂O→甲硫醇+NH₄ ⁺+α-丁酮酸

MGL活性剂量的测定条件为：37℃；pH＝8.6；MGL＝0.26μg/mL；磷酸吡哆醛＝20nM；L-甲硫氨酸＝25mM，而且可使用市售产品(如Roche diagnostics公司的NH₃试剂盒)进行测定。

该测定方法包括，在反应开始后5～10分钟的时间段内，即MGL达到最大活性(Vmax)时，测量产铵动力学。其中，通过在340nm的波长下测量谷氨酸脱氢酶(GLDH)在铵和α-酮戊二酸存在的条件下按照下式将NADPH氧化为NADP⁺所导致的光密度变化，测量铵的产生量：

α-酮戊二酸+NH4⁺+NADPH→L-谷氨酸+NADP⁺+H₂O.

天冬酰胺酶

天冬酰胺酶本身的CAS编号为9015-68-3，另一常见名称为门冬酰胺酶，其他通用名为天门冬酰胺酶、L-天冬酰胺酶及L-天冬酰胺氨基水解酶。

本发明意义上的“天冬酰胺酶”一词涵盖任何来源的天冬酰胺酶，尤其天然或重组来源的天冬酰胺酶，并且涵盖任何内含天冬酰胺酶的衍生物，例如聚乙二醇(PEG)修饰形式的天冬酰胺酶(PEG-天冬酰胺酶)或保留L-天冬酰胺酶活性的片段。此外，其还涵盖任何细菌来源的天冬酰胺酶。因此天冬酰胺酶可以为大肠杆菌(尤其大肠杆菌HAP-A-1-3)、菊欧文氏菌或产琥珀酸沃林菌类型的天冬酰胺酶。其中，“类型”是指天冬酰胺酶可从相应细菌的培养物获得，或者天冬酰胺酶可以为重组天冬酰胺酶，即通过基因工程获得的该细菌的天冬酰胺酶形式。在一种优选实施方式中，天冬酰胺酶为大肠杆菌HAP-A-1-3类型的天冬酰胺酶。

在本申请中，可使用如下现成市售产品：5000U10000U 此类产品为粉末形式，使用前须溶于可注射液体或水中。此外，其内可存在一水合磷酸二氢钠、七水合磷酸氢钠和/或氯化钠等赋形剂。

“天冬酰胺酶”一词还涵盖类似于天冬酰胺酶的物质，该物质在本发明意义上为具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的细菌酶。其中，可例如举出的为不动杆菌产谷氨酰胺酶天冬酰胺酶(AGA)。

根据本发明的一种实施方式，天冬酰胺酶包封于红细胞内，而且有利地，所述组合物或悬浮液所含红细胞和包封天冬酰胺酶的量足以向患者提供预定剂量的天冬酰胺酶。

与通常定义相同，一IU单位的天冬酰胺酶为在L-天冬酰胺酶过量存在且pH＝7.3的条件下，令L-天冬酰胺在37℃下每分钟释出1μmol的氨所需的酶量。

红细胞包封

根据一种实施方式，所述甲硫氨酸酶组合物和/或天冬酰胺酶组合物含包封有该酶的红细胞及药学上可接受的载剂。优选地，该红细胞为与治疗对象属于同一物种的哺乳动物所产生的红细胞。当该哺乳动物为人类时，所述红细胞优选为人源红细胞。在一种实施方式中，所述红细胞来自于患者本身。

根据一种实施方式，所述药学上可接受的载剂为红细胞“保存液”，即将包封该酶的红细胞以适于保存及注射的形式悬浮于其内的溶液。保存液优选含有至少一种促进红细胞保存的物质，该物质尤其选自葡萄糖、右旋糖、腺嘌呤及甘露醇。

该保存液可以为含NaCl、腺嘌呤及选自葡萄糖、右旋糖及甘露醇的至少一种化合物的水溶液。

该保存液可含有NaCl、腺嘌呤及右旋糖，优选AS3培养基。

该保存液可含有NaCl、腺嘌呤、葡萄糖及甘露醇，优选SAG-甘露醇或ADsol培养基。

具体而言，当置于保存液内时，所述组合物或悬浮液的特征在于，在2℃～8℃的温度下保存72小时时，胞外血红蛋白水平保持于小于或等于0.5g/dl，尤其小于或等于0.3g/dl，更尤其小于或等于0.2g/dl，优选小于或等于0.15g/dl，更优选小于或等于0.1g/dl的水平。

具体而言，当置于保存液内时，所述组合物或悬浮液的特征在于，在2℃～8℃的温度下保存24小时～20天，尤其24小时～72小时后，胞外血红蛋白水平保持于小于或等于0.5g/dl，尤其小于或等于0.3g/dl，更尤其小于或等于0.2g/dl，优选小于或等于0.15g/dl，更优选小于或等于0.1g/dl的水平。

有利地，所述胞外血红蛋白水平通过如下文献所述手动参考方法测定：G.B.Blakney及A.J.Dinwoodie，Clin.Biochem.(《临床生物化学》)，8卷，96～102页，1975年。此外，还可通过自动测量装置进行测定，此类装置的测量灵敏度取决于装置本身。

具体而言，当置于保存液内时，所述组合物或悬浮液的特征在于，在2℃～8℃的温度下保存72小时时，红细胞溶解率保持为小于或等于2％，尤其小于或等于1.5％，优选小于或等于1％。

具体而言，当置于保存液内时，所述组合物或悬浮液的特征在于，在2℃～8℃的温度下保存24小时～20天，尤其24小时～72小时后，红细胞溶解率保持为小于或等于2％，尤其小于或等于1.5％，优选小于或等于1％。

包封方法

可将红细胞悬浮液与低渗液体介质接触，以打开红细胞膜上的膜孔，从而将上述各酶包封于红细胞内。溶解/再封技术存在三种可选实现方式，即低渗透析、低渗预胀及低渗稀释，这三种方法均基于红细胞内部和外部之间的渗透压差。其中，优选采用低渗透析方式。

包封有酶的红细胞悬浮液尤其可通过如下方法获得：

1–将红细胞沉淀以大于或等于65％的红细胞比容水平悬浮于等渗溶液内，并在+1℃～+8℃的温度下冷却；

2–在保持于+1℃～+8℃的温度下进行溶解步骤，该步骤包括：将红细胞比容水平大于或等于65％的上述红细胞悬浮液及温度为+1℃～+8℃的冷却低渗溶解液通入透析盘管或透析盒等透析装置(优选透析盒)；

3–包封步骤：在溶解前或溶解过程中，在温度保持于+1℃～+8℃的条件下，将待包封的酶(尤其置于事先制备的溶液中)加入(优选逐渐加入)所述悬浮液中；以及

4–在尤其为+30℃～+42℃的更高温度及等渗或高渗溶液存在(高渗更为有利)的条件下，实施再封步骤。

在一种优选的替代实施方式中，可采用WO-A-2006/016247(EP1773452，该文献通过引用并入本文)中描述的方法：

2–测量从上述沉淀制得的红细胞样品的渗透脆性；

3–在保持于+1℃～+8℃的温度下进行溶解步骤，该步骤包括：将红细胞比容水平大于或等于65％的上述红细胞悬浮液及温度为+1℃～+8℃的冷却低渗溶解液通入透析盘管或透析盒等透析装置(优选透析盒)；根据之前所测的渗透脆性，调节溶解参数；尤其根据所测渗透脆性，调节红细胞悬浮液在透析装置中的导入流量，或者调节所述溶解液的渗透压摩尔浓度；

4–包封步骤：在溶解前或溶解过程中，在温度保持于+1℃～+8℃的条件下，将待包封的酶(尤其置于事先制备的溶液中)加入(优选逐渐加入)所述悬浮液中；

5–在尤其为+30℃～+42℃的更高温度及等渗或高渗溶液存在(高渗更为有利)的条件下，实施再封步骤。

对于透析，所述红细胞沉淀尤其悬浮于具有大于或等于65％，优选大于或等于70％的较高红细胞比容水平的等渗溶液，而且该悬浮液在+1℃～+8℃，优选+2℃～+6℃，通常为+4℃的温度下冷却。根据一种特定方法，所述红细胞比容水平为65％～80％，优选70％～80％。

在对红细胞的渗透脆性进行测量的情况下，有利地，在紧接所述溶解步骤之前且在待包封的酶存在或不存在的情况下(优选在待包封的酶存在的情况下)进行该渗透脆性的测量。有利地，所述红细胞或含该红细胞的所述悬浮液的温度与溶解所选用的温度接近或相同。根据本发明的另一有利特征，渗透脆性测量结果被快速使用，也就是说，所述溶解步骤在上述样品取得后的短时间内便即实施。优选地，取样开始时间与溶解开始时间之间的间隔短于或等于30分钟，优选短于或等于25分钟，更优选短于或等于20分钟。

关于如何在实施测量并将渗透脆性考虑在内的情况下进行所述溶解/再封方法的细节，本领域技术人员参考WO-A-2006/016247，该文献通过引用并入本文。

WO2014/180897中描述了上述包封技术的一项改进，本领域技术人员可参考该文献，而且该文献通过引用并入本文。因此，根据一种实施方式，获得上述包封有酶的红细胞的方法包括：通过溶解/再封，将活性成分包封于红细胞内；获得含有内包该酶的红细胞的悬浮液或沉淀，以及渗透压摩尔浓度大于或等于280mOsmol/kg，尤其约280mOsmol/kg～约380mOsmol/kg，优选约290mOsmol/kg～330mOsmol/kg的溶液；以及在大于或等于280mOsmol/kg，尤其约280mOsmol/kg～约380mOsmol/kg，优选约290mOsmol/kg～330mOsmol/kg的渗透压摩尔浓度下，对所述沉淀或悬浮液进行直接温育，或通过加入温育液进行温育。具体而言，该温育持续时间为30分钟或30分钟以上，尤其为1小时或1小时以上。在此之后，去除温育后溶液的液体介质，并将获得的红细胞悬浮于允许所得悬浮液注射至患者体内的溶液，优选允许所得悬浮液注射至患者体内的保存液中。上示渗透压摩尔浓度为内含悬浮或沉淀形式的所述红细胞的溶液在相关时刻的渗透压摩尔浓度。

“稳定红细胞悬浮液”尤其指使用于人体之前胞外血红蛋白含量保持为小于或等于0.2g/dl的悬浮液，每批次含活性成分的红细胞在生产后及使用前之间的时间间隔可尤其为1小时～72小时。

“随时可用的稳定红细胞悬浮液”指允许注射至患者体内的溶液中，尤其保存液中的稳定悬浮液，其红细胞比容通常大于或等于35％，40％或45％。

“红细胞沉淀”是指将悬浮于液体介质内的红细胞分离后收集到的红细胞浓缩物。该分离可通过过滤或离心实现，而且通常通过离心实现。沉淀具有一定比例的液体介质，而且通常具有70％～85％的红细胞比容。

“温育液”是指在温育步骤中承载包封有活性成分的红细胞的溶液。温育可在较宽的红细胞比容范围内进行，尤其在10％～85％的红细胞比容范围内进行。

“脆性红细胞”是指经历所述包封步骤后悬浮于2℃～8℃的保存液中时，尤其在悬浮后1小时～72小时时可能发生溶解的红细胞。

“初始红细胞比容”是指因温育过程中脆性红细胞溶解而发生细胞损失之前的红细胞比容。

上述方法可尤其包括如下步骤：

(1)将所述酶包封于红细胞之内，该步骤包括：使红细胞与低渗介质相接触(以打开红细胞膜上的膜孔)；与活性成分接触(以使其进入红细胞)；红细胞再封，尤其通过等渗或高渗介质进行再封(高渗介质更为有利)；

(2)获得或制备含内包所述酶的红细胞的悬浮液或沉淀，以及渗透压摩尔浓度大于或等于280mOsmol/kg，尤其约280mOsmol/kg～约380mOsmol/kg，优选约290mOsmol/kg～330mOsmol/kg的溶液；

(3)在大于或等于280mOsmol/kg，尤其约280mOsmol/kg～约380mOsmol/kg，优选约290mOsmol/kg～330mOsmol/kg的渗透压摩尔浓度下，将步骤(2)所得的沉淀或悬浮液直接温育或通过加入温育液温育30分钟或30分钟以上，尤其1小时或1小时以上；

(4)去除步骤(3)温育后的悬浮液中的液体介质；

(5)将步骤(4)获得的红细胞悬浮于允许所得悬浮液注射至患者体内的溶液，优选允许所得悬浮液注射至患者体内的保存液中。

根据第一种方式，通过溶解/再封进行包封后的步骤，尤其步骤(2)包括通过先将所述溶解/再封步骤(即步骤(1))获得的悬浮液或沉淀稀释于渗透压摩尔浓度大于或等于280mOsmol/kg，尤其约280mOsmol/kg～约380mOsmol/kg，优选约290mOsmol/kg～330mOsmol/kg的溶液，然后获得红细胞沉淀或悬浮液的方式进行的至少一次洗涤，优选两次或三次洗涤。该沉淀或悬浮液含有内包所述酶的红细胞以及渗透压摩尔浓度大于或等于280mOsmol/kg，尤其约280mOsmol/kg～约380mOsmol/kg，优选约290mOsmol/kg～330mOsmol/kg的溶液。之后，即实施后续步骤，如步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)。

根据第二种方式，在所述溶解/再封步骤(即步骤(1))中，通过以等渗或高渗介质对红细胞进行再封而获得的红细胞悬浮液，如步骤(2)的悬浮液，可随后在渗透压摩尔浓度大于或等于280mOsmol/kg，尤其约280mOsmol/kg～约380mOsmol/kg，优选约290mOsmol/kg～330mOsmol/kg的溶液内温育。也就是说，所述溶解/再封步骤(即步骤(1))包括红细胞再封步骤，其中，将包封有所述酶且处于悬浮状态的红细胞与等渗或高渗再封溶液(高渗较为有利)混合，从而获得渗透压摩尔浓度大于或等于280mOsmol/kg，尤其约280mOsmol/kg～约380mOsmol/kg，优选约290mOsmol/kg～330mOsmol/kg的红细胞悬浮液。在该方法中，所述温育步骤(即步骤(3))包括将从再封步骤获得的悬浮液进行温育。该温育时间为30分钟或30分钟以上，尤其为1小时或1小时以上。之后，即实施后续步骤，如步骤(4)和步骤(5)。

所述溶解/再封步骤之后的各步骤，如步骤(2)～步骤(5)的实施条件使得脆性红细胞发生溶解或使其大部分发生溶解，尤其使50％以上，60％以上，70％以上，80％以上，90％以上或更大比例的脆性红细胞发生溶解。为此目的，可以对温育时间、温育温度及红细胞所悬浮的所述溶液的渗透压摩尔浓度施加作用。由于渗透压摩尔浓度越高，温育时间可越长，因此为了获得相同效果，渗透压摩尔浓度越低，温育时间可越短。此外，温育温度越高，温育时间可越短，反之亦然。在此之后，通过一次或多次洗涤，去除细胞碎片、胞外血红蛋白及胞外酶。

根据本发明，每次洗涤均包括：稀释所述红细胞悬浮液或沉淀；然后将红细胞与洗涤液分离。优选地，洗涤步骤包括两次或三次稀释/分离过程。该分离可通过任何合适的手段实现，例如通过过滤和离心实现，优选通过离心实现。

温育不受悬浮液红细胞比容的限制。因此，初始红细胞比容通常为10％～85％，尤其40％～80％的悬浮液可以进行温育。其中，红细胞比容为70％以上的称为沉淀，而低于此值的为悬浮液。

所述去除步骤(即步骤(4))的目的在于去除所述悬浮液或温育后沉淀中的液体部分，以尤其去除细胞碎片及胞外血红蛋白，并因而去除胞外酶。

根据所述去除步骤(即步骤(4))的第一种方式，尤其通过离心进行分离，该方式尤其适用于悬浮液。分离之后，可进行一次或多次洗涤，例如可进行两次或三次洗涤，该洗涤通过先以等渗溶液进行稀释，然后尤其通过离心进行分离的方式实现。

根据所述去除步骤(即步骤(4))的第二种方式，在尤其通过离心进行的分离之前，先进行稀释，该该方式尤其适用于悬浮液或沉淀。其中，可尤其以等渗洗涤液或保存液进行所述稀释。

所述最终步骤(即步骤(5))包括制备无需其他治疗即可施用至患者的最终悬浮液。

根据该步骤的第一种方式，利用注射液，尤其保存液对所述去除步骤(即步骤(4))获得的红细胞沉淀进行稀释。

根据该步骤的第二种方式，利用注射液，尤其保存液并且通过稀释后分离的方式，对所述去除步骤(即步骤(4))获得的红细胞沉淀进行一次或多次洗涤，并且在洗涤后，将红细胞重新悬浮于注射液，尤其保存液中。

本发明方法可进一步包括以下当中的一个、多个或全部特征：

-所述温育步骤(即步骤(3))在约2℃～约39℃的温度下持续足够长的时间，以保证脆性红细胞的溶解；

-所述温育步骤(即步骤(3))在低温，尤其约2℃～约10℃，更尤其约2℃～约8℃下持续约1小时～约72小时，尤其约6小时～约48小时，优选约19小时～约30小时；

-所述温育步骤(即步骤(3))在约20℃～约39℃的更高温度，尤其在(25℃±5℃)下持续约30分钟～约10小时，尤其约1小时～约6小时，优选约2小时～约4小时；该步骤甚至还可以在高于室温的温度下进行，但是这可对细胞产率、P50以及/或者2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)的含量产生不良影响；

-在所述温育步骤(即步骤(3))中，悬浮液的初始红细胞比容为10％～85％，尤其40％～80％；可以对红细胞比容例如为70％～约85％的分离所获沉淀，或红细胞比容为约40％～70％的稀释后沉淀进行温育；

-所述温育步骤包括对所述悬浮液进行搅拌；

-所述温育步骤不包括任何搅拌；

-已计量的NaCl水溶液作为洗涤和/或温育液用于获得所需的渗透压摩尔浓度；举例而言，该溶液含有0.9％NaCl；该溶液在NaCl之外可尤其含有葡萄糖，更尤其含有一水合葡萄糖、二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠；举例而言，组合物含0.9％NaCl，0.2％的一水合葡萄糖，0.034％的二水合磷酸二氢钠，0.2％的十二水合磷酸氢二钠；

-在所述最终步骤(即步骤(5))中，以保存液进行洗涤；

-所述随时可用(即可注射于患者体内)的悬浮液中的溶液(液体部分)的渗透压摩尔浓度为约280mOsmol/kg～约380mOsmol/kg，优选为约290mOsmol/kg～约330mOsmol/kg；

-所述随时可用(即可注射于患者体内)的悬浮液的红细胞比容大于或等于35％，40％或45％；

-所有的洗涤和温育步骤均采用保存液；

-步骤(2)和/或步骤(5)中的洗涤液和保存液具有相同组成，且含有促进红细胞保存的化合物；

-所述保存液(必要时，连同所述洗涤液或温育液)为含有NaCl，腺嘌呤以及选自葡萄糖、右旋糖和甘露醇的至少一种化合物的水溶液；

-所述保存液(必要时，连同所述洗涤液或温育液)含有NaCl、腺嘌呤和右旋糖，优选AS3培养基；

-所述保存液(必要时，连同所述洗涤液或温育液)含有NaCl、腺嘌呤、葡萄糖及甘露醇，优选SAG-甘露醇或ADsol培养基。

本发明方法尤其包括如下步骤：

(A)将所述酶包封于红细胞之内，该步骤包括：与低渗介质相接触，以打开红细胞膜上的膜孔；与所述酶接触，以使其进入红细胞；通过等渗或高渗介质进行红细胞再封；应该注意的是，所述酶可在红细胞溶解之前便处于所述红细胞悬浮液内，或者也可在溶解过程中或溶解之后加入，但必然在再封之前加入；在步骤(A)的一种实施方式中，该方法包括如下分步骤：

(A1)使红细胞悬浮液的红细胞比容大于或等于60％或65％；

(A2)测量该悬浮液内红细胞的渗透脆性；

(A3)活性成分的溶解和内化步骤，该步骤包括：将所述红细胞悬浮液以与溶解液相反的方向通入透析装置，尤其透析盒内；根据步骤(A2)中所测的渗透脆性，调节所述红细胞悬浮液的流量，或者调节所述溶解液的流量，或者调节该溶解液的渗透压摩尔浓度；

(A4)红细胞再封步骤。

使用方法

在第一方面，本发明为一种对具有相应需求的哺乳动物体内的癌症进行治疗的方法，该方法包括：先使该哺乳动物产生甲硫氨酸缺乏；然后再使该哺乳动物产生天冬酰胺缺乏，尤其通过施用足量的天冬酰胺酶而使其产生天冬酰胺缺乏。其目的在于，降低癌细胞可获得的甲硫氨酸和天冬酰胺的量。如上所述，甲硫氨酸缺乏可通过饮食和/或甲硫氨酸酶的施用产生。

在第二方面，本发明为一种对具有相应需求的哺乳动物体内的癌症进行治疗的方法，该方法包括：向所述具有相应需求的哺乳动物序贯施用，尤其注射含甲硫氨酸酶的组合物以及含天冬酰胺酶的组合物。

序贯施用、甲硫氨酸缺乏的产生和/或甲硫氨酸酶的施用与天冬酰胺酶的施用之间的间隔时间、剂量、重复施用及药物组合物的形式(游离形式、聚乙二醇修饰形式和/或内包酶的红细胞(RBC)悬浮液形式)如上所述，且适用于该使用方法。

在一种实施方式中，甲硫氨酸酶(如游离形式、聚乙二醇修饰形式或包封形式)施用一次或多次。

在另一实施方式中，在施用天冬酰胺酶之前，施用一次以上的游离或聚乙二醇修饰甲硫氨酸酶，例如，向所述哺乳动物施用两次或更多次(如三次、四次、五次)的甲硫氨酸酶，该不同次数的施用通常在不同日份内完成，例如每日施用。

在一种实施方式中，向所述患者施用有效剂量的甲硫氨酸酶辅因子。该辅因子可在甲硫氨酸酶施用前或施用后施用，或与其同时施用。在一种实施方式中，该辅因子与甲硫氨酸酶处于同一组合物内。在另一实施方式中，该辅因子通过另一组合物施用。

在一种实施方式中，甲硫氨酸酶以包封于红细胞内的形式施用，而且辅因子既可同样为包封形式，也可为游离于溶液内的形式。在一种优选实施方式中，所述辅因子溶于药学上可接受的载剂内，而且为维生素B6的非磷酸盐形式，优选吡哆醇。该维生素B6非磷酸盐形式的溶液可通过注射或口服途径施用，或者也可通过任何其他途径施用。在一种实施方式中，该溶液在每次注射包封甲硫氨酸酶后一次或多次施用，例如在每次注射后的1～10小时施用。优选地，该溶液在甲硫氨酸酶治疗期间或甲硫氨酸酶在血液循环中保持活性(取决于其半衰期)期间，有利地每天施用一次，或者每天施用两次或更多次。在甲硫氨酸酶包封于红细胞内的情况下，所述溶解状态的辅因子可在10～30天内每天施用至少一次。

在一种实施方式中，天冬酰胺酶以游离、聚乙二醇修饰或包封的形式施用一次或多次。

在另一实施方式中，天冬酰胺酶以游离或聚乙二醇修饰的形式施用一次以上，例如向所述哺乳动物施用两次或更多次(如三次、四次、五次)的甲硫氨酸酶，该不同次数的施用通常在不同日份内完成，例如每日施用。

在一种实施方式中，所述甲硫氨酸酶和/或天冬酰胺酶为粉末形式，而且该使用方法包括，在将其施用至所述哺乳动物之前，将其溶解于药学上可接受的溶液或液体内。

在一种实施方式中，使用如上所述的装置。如此，所述癌症治疗方法包括，将上述装置植入所述哺乳动物体内或放置于其上，该哺乳动物尤其为人类。该植入或放置步骤可包括将所述输送管与血管连接，或者与已经设置到位的导管等连接。该方法还包括，随后启动所述装置，以使其根据其软件按照本发明方法所编的程序进行序贯输送。

有利地，处于保存液内且包封甲硫氨酸酶或天冬酰胺酶的所述红细胞悬浮液可随时使用，并优选可具有较低的胞外血红蛋白水平，尤其为符合FDA推荐值的水平。

在第一实施方式中，向哺乳动物患者，尤其人类患者注射包封所述活性成分的红细胞悬浮液，该红细胞悬浮液于注射前1～72小时，尤其10～72小时制备。该悬浮液的血细胞比容为40％或40％以上，而且处于保存液内。所述胞外血红蛋白水平为0.5g/dl或0.5g/dl以下，尤其为0.3g/dl或0.3g/dl以下，更尤其为0.2g/dl或0.2g/dl以下，优选为0.15g/dl或0.15g/dl以下，更优选为0.1g/dl或0.1g/dl以下，而且/或者红细胞溶解率为2％或2％以下，尤其1.5％或1.5％以下，优选1％或1％以下。所述悬浮液在注射前不进行洗涤或其他治疗。

在另一实施方式中，该方法包括如下步骤：提供压积红细胞；将其以60％、65％或更高的血细胞比容悬浮于生理缓冲液中；通过溶解和再封步骤，将上述活性成分包封于所述红细胞内；将所获得的红细胞进行温育；洗涤后者，并获得最终的红细胞悬浮液。该悬浮液的血细胞比容为40％或40％以上，而且处于保存液内。该悬浮液贮存于2℃～8℃的温度下。该最终悬浮液在制备后1小时～72小时，优选24小时～72小时注射于所述哺乳动物患者，尤其人类患者体内。该悬浮液的胞外血红蛋白水平为0.5g/dl或0.5g/dl以下，尤其为0.3g/dl或0.3g/dl以下，更尤其为0.2g/dl或0.2g/dl以下，优选为0.15g/dl或0.15g/dl以下，更优选为0.1g/dl或0.1g/dl以下，而且/或者红细胞溶解率为2％或2％以下，尤其1.5％或1.5％以下，优选1％或1％以下。该悬浮液在注射前不进行洗涤或其他治疗。

各组合物、各套组合物及各方法的目的在于治疗天冬酰胺和/或甲硫氨酸营养缺陷型液体(血液)瘤及实体瘤。其中，可举出的例如为白血病(急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病)及胃癌(四期胃癌、胃腺癌)。

以下，通过非限制性实施方式，对本发明进行更加详细的描述。

图1为不同治疗条件下的细胞活力百分比图。

图2和图3为不同治疗条件下的细胞活力百分比图。

图4为个体肿瘤体积中值随时间的变化图。

实施例1

一、缩写

CCK-8：细胞计数试剂盒-8

DPBS：杜氏磷酸盐缓冲液

IMDM：伊氏改良型杜氏培养基

MGL：甲硫氨酸γ-裂解酶

v/v：体积/体积

二、操作条件

2.1试验项目

2.1.1L-天冬酰胺酶

说明：(德国)，大肠杆菌L-天冬酰胺酶10000IU

通过以1倍杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)进行连续稀释，制备一定浓度(2.53IU/mL)的L-天冬酰胺酶，然后将该浓度的L-天冬酰胺酶稀释11倍，获得最终浓度为0.23IU/mL(IC50)的L-天冬酰胺酶。

2.1.2甲硫氨酸γ-裂解酶(MGL)

说明：大肠杆菌中制得的恶臭假单胞菌甲硫氨酸γ-裂解酶(MGL)。

通过以1倍杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)进行连续稀释，制备一定浓度(2.09IU/mL)的MGL，然后将该浓度的MGL稀释11倍，获得最终浓度为0.19IU/mL(IC50)的MGL。

2.2细胞系

2.2.1说明

名称：HL-60细胞系

描述：人早幼粒细胞白血病细胞系(悬浮液)

供应商及参考编号：ATCC，CCL-240

2.2.2培养条件

在加有L-谷氨酰胺的IMDM培养基中培养细胞，该培养基内还补充有20％(v/v)的胎牛血清，100IU/mL的青霉素以及100μg/mL的链霉素。此外，还根据PO-CELL-002及PO-CELL-005进行传代培养。

2.2.3比色试剂盒

名称：细胞计数试剂盒-8(CCK-8)

供应商及参考编号：Fluka 96992

原理：CCK-8试剂含有高度水溶性的四唑盐WST-8。细胞内的脱氢酶还原WST-8，从而生成可溶于组织培养基中的黄色产物(甲)。细胞内脱氢酶的活性所产生的甲染料的量与活细胞的数目成正比。

比色试验根据PO-CELL-004实施。

三、细胞毒性测定

3.1方法

将15000个细胞以100μL/孔分配至五个96孔平底板中，而且每个孔板上均有两个添加培养基的板孔，用作空白对照。此外，为了减少蒸发和冷凝，所有空的板孔也都添加培养基。在第0天(D0)，在相应板孔中加入10μL的IC50浓度L-天冬酰胺酶或MGL，而对照品(空白板孔及对照孔板)中加入10μL的1倍DPBS。在第3天(D3)，将培养基从各板孔中移除并以新鲜培养基取代，而且在相应板孔中加入10μL的1倍DPBS或10μL的IC50浓度L-天冬酰胺酶(对于之前以MGL温育的细胞)或MGL(对于之前以L-天冬酰胺酶温育的细胞)，同时对照品(空白对照及阳性对照)中加入10μL的1倍DPBS。随后，将各孔板在培养箱内另外温育3天。温育结束(D6)后，根据PO-CELL-004，向每个板孔内添加10μL的CCK-8溶液，并将各孔板在培养箱内温育2个小时。在此之后，利用酶标仪在450nm处测定光密度(OD)。

3.2内部对照

各对照品均进行两组平行试验。

3.2.1空白板孔

以CCK-8测定时，培养基中会在460nm处发生微弱的自然吸光。这一背景吸光度取决于培养基、pH值、温育时间以及曝光时间。因此，对分别含有100μL的培养基及10μL的用于对L-天冬酰胺酶或MGL进行稀释的1倍DPBS进行吸光度测定，然后从含有细胞的其他板孔的吸光度测量结果中减去此类对照板孔的平均吸光度。

3.2.2活力对照(阳性对照)

将在既不含L-天冬酰胺酶，也不含MGL，但是含10μL稀释剂(即1倍DPBS)的培养基(100μL)中培养的细胞用作HL-60细胞系(100％细胞活力)的阳性对照。

3.3细胞活力测定

不含细胞的培养基作为空白对照(OD_空白)，既不含L-天冬酰胺酶，也不含MGL的细胞用作阳性对照(活力对照)。

则活细胞百分比按下式计算：

*：以L-天冬酰胺酶及MGL处理的细胞

**：未以L-天冬酰胺酶及MGL处理的细胞

该计算由酶标仪的控制软件Gen 5自动实施，而且所有光密度值均自动减除上述两空白板孔的平均光密度(OD)。细胞活力计算用于序贯处理。

四、结果

4.1内部对照

原始数据中未指出的均为可接受的内部对照。

4.2L-天冬酰胺酶或MGL单酶处理的IC50计算

在每一药物组合试验中，均将单酶药物(MGL或L-天冬酰胺酶)处理的细胞活力百分比作为对照。

4.2.1L-天冬酰胺酶和MGL的序贯添加

实施一次平行两组的L-天冬酰胺酶和MGL序贯处理试验，其中，采用所有的质量控制手段(空白对照和阳性对照)。细胞活力百分比的计算详情及图形表现形式如表1和图1所示。

表1：对照品及双酶联用时的细胞活力百分比

结果表明，当以先添加IC50剂量的MGL，然后添加IC50剂量的L-天冬酰胺酶这一方式(图1中红色柱)进行双酶联用时的细胞活力：

-比仅添加IC50剂量的L-天冬酰胺酶时(L-天冬酰胺酶的IC50对照)的细胞活力下降76％；

-比仅添加IC50剂量的MGL(MGL的IC50对照)的细胞活力下降70％；

-比以先添加IC50剂量的L-天冬酰胺酶这一方式进行双酶联用时的细胞活力下降75％。

此外，两酶添加顺序相反的双酶联用并未获得上述结果，与单酶添加的情况相比，该双酶联用在降低细胞活力方面并未产生任何益处。

五、结论

上述双酶序贯联用的结果证明，当在添加IC50剂量的MGL三天后，再添加IC50剂量的L-天冬酰胺酶时，可导致更高的细胞死亡率。然而，当此两酶以相反顺序添加时，未获得上述结果。

因此，我们可以提出如下假说：MGL酶活性导致的甲硫氨酸缺乏使得HL-60白血病细胞对L-天冬酰胺酶的活性更加敏感。此外，考虑到L-天冬酰胺酶和MGL各自具有相应的已知效果，因此还需要对其所起到的作用加以探讨。事实上，L-天冬酰胺酶已知能够引发白血病细胞凋亡(Ueno等人，1997年)，因此其可能起着细胞毒性剂的作用。MGL已知可阻断细胞周期中S期或G2期内的细胞分裂，因此其在可能更大成份上起到细胞生长抑制剂的作用。

实施例2：L-天冬酰胺酶在小鼠红细胞内的包封方法

通过透析袋内低渗透析法，将L-天冬酰胺酶(大肠杆菌L-天冬酰胺酶)包封至小鼠红细胞(OF1小鼠)内。血液预先通过离心去除血浆，然后以0.9％NaCl洗涤三次。在透析前，将血细胞比容在天冬酰胺酶存在的条件下调节至70％，以使得红细胞(即血红细胞，RBC)的最终浓度为400IU/ml。该透析在低渗溶解缓冲液中进行，并在4℃下持续50分钟。然后，通过加入高渗溶液并在37℃下温育30分钟的方式，将所述小鼠红细胞再封。在以0.9％NaCl洗涤两次且以补充有牛血清白蛋白(BSA，6％)的SAG-甘露醇洗涤一次之后，将红细胞的血细胞比容调节至50％。将L-天冬酰胺酶包封在内的红细胞称为“L-天冬酰胺酶红细胞”。通过该包封制备L-天冬酰胺酶红细胞的浓度条件为：每1毫升红细胞(血细胞比容＝50％)内40IU天冬酰胺酶。

在上述包封过程中，针对全血、洗涤后的红细胞、与L-天冬酰胺酶混合后的红细胞(透析前)及载有L-天冬酰胺酶的红细胞(透析后)当中的每一者，均测定其如下参数：

-血细胞比容(Ht)

-平均红细胞体积(ACV)

-平均红细胞血红蛋白浓度(ACHC)

-血红蛋白总浓度

-细胞数。

在低渗透析前后，均抽取细胞悬浮液试样，测定L-天冬酰胺酶酶的活性，并按照如下文献中公开的方案进行L-天冬酰胺酶算：Orsonneau等人，Ann Biol Clin(《临床生物学》)，62卷：568～572页。

实施例3：L-天冬酰胺酶在人红细胞内的包封

通过WO-A-2006/016247中描述的方法，制得一批次包封天冬酰胺酶的红细胞，根据WO-A-2006/016247的描述内容，对渗透脆性加以考虑，并对各溶解参数进行相应调节(调节红细胞悬浮液流入透析盒内的流量)。此外，该方法还遵照医生的处方，将患者体重和待施用的L-天冬酰胺酶的剂量考虑在内。最终产品的规格参数如下：

-平均红细胞体积(MCV)：70～95fL

-平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)：23～35g/dl

-每分升(dL)悬浮液内的胞外血红蛋白量≤0.2g

-渗透脆性≤6g/L(NaCl)

-红细胞内L-天冬酰胺酶平均浓度：78～146IU/mL

-胞外L-天冬酰胺酶在总酶活性中的占比≤2％。

如上述文献所述，该方法下获得的红细胞悬浮液称为

实施例4：甲硫氨酸γ-裂解酶(MGL)的制备与表征方法

菌株的生产及高产克隆的分离：通过罕用密码子修饰对恶臭假单胞菌的天然MGL序列(GenBank：D88554.1)进行优化，以使源自恶臭假单胞菌的该序列能够适应生产性大肠杆菌菌株，此外，还通过其他改动，改善转译起始条件。最后，通过沉默突变，去除作为编码序列中公认的细菌启动子的一部分的三个要素(box-35，box-10及56位的转录因子结合位点)。之后，以内含所述优化序列的表达载体pGTPc502_MGL(启动子T7)转化生产性大肠杆菌菌株HMS174(DE3)，并选出生产性克隆。随后，在补充有0.5％葡萄糖和卡那霉素的GY培养基中对该生产性克隆进行6～8小时的预培养(预培养1)及16小时的37℃预培养(预培养2)。

发酵：将预培养2的GY培养基(光密度为0.02)在发酵罐中发酵，并同时进行搅拌及压力和pH值控制。当光密度达到10时，进入生长阶段(37℃下)，此时通过加入1mM的IPTG诱发表达。诱发后20小时，分两步收集细胞沉淀物：使细胞培养液通过500kDa的中空纤维后浓缩5～10次；通过15900×g离心回收细胞沉淀，并将其在-20℃下保存。

纯化：将上述细胞沉淀解冻后悬浮于溶解缓冲液(7v/w)中。在10℃下，通过高压均化，分三步进行溶解(其中第一步的压力为1000巴，后两步的压力为600巴)。之后，通过10℃下加入0.2％的PEI及15900×g离心，将细胞溶解物澄清化。对可溶部分进行0.2μm过滤灭菌后，在6℃下以硫酸铵(60％饱和度)沉淀20小时以上。将沉淀物以增溶缓冲液重新溶解后，分两步进行结晶：第一步通过添加10％(最终浓度)的PEG-6000及饱和度为10％的硫酸铵实现结晶；第二步通过添加12％(最终浓度)的PEG-6000及0.2M(最终浓度)的NaCl在30℃下实现结晶。随后，进行15900×g离心，并在每一步中均收集含MGL蛋白质的沉淀。将该含MGL蛋白质的沉淀重新悬浮于增溶缓冲液后，进行0.45μm过滤，并实施两次阴离子交换层析(DEAE琼脂糖凝胶FF)。将纯化后的蛋白质精制后，令其通过Q膜层析囊，从而去除各种杂质(内毒素、宿主细胞蛋白质(HCP)、残余DNA)。最后，将纯化后的MGL蛋白质浓缩至40mg/ml，并利用10kDa截止切向流过滤盒在制剂缓冲液中对其进行渗滤。在此之后，将所得蛋白物质分为约50mg的各份，在预定压力和温度下冻干，在-80℃下保存。

表征：按照WO2015/121348中描述的方法，通过测量NH₃生成量，测定该酶的比活性。此外，还通过SDS-PAGE测定纯度，根据WO2015/121348中描述的方法估算溶于水中后的磷酸吡哆醛水平，并利用渗透压计(Micro-Osmometer Loser Type 15)测量渗透压摩尔浓度。

下表2总结了所生产的一个批次的MGL的主要特性：

上述生产方法的讨论：WO2015/121348公开的上述MGL纯化方法基于专利EP0978560B1及相应发表文献(Takakura等人，Applied Microbiol.Biotechnol.(《应用微生物生物技术》)，2016年)中描述的方法。之所以选择该方法的原因在于其结晶步骤的简单性和稳健性，而且根据该文献作者的描述，此步骤极其实用且易于应用至大规模生产。该步骤基于对经溶解/澄清化及以PEG6000/硫酸铵去除杂质而获得的MGL溶液进行加热后，对PEG6000和硫酸铵的使用。该步骤另外值得注意的一点是，在通过对经PEG6000处理的MGL溶液进行离心而去除杂质的步骤当中，可快速获得较高的纯度水平。其中，杂质再次进入离心沉淀中，而MGL则大部分位于上清溶液中。得益于这一高纯度，后续只需以阴离子交换柱(DEAE)对该MGL溶液进行一次层析，并辅以Sephacryl-S200HR柱凝胶过滤，便可获得纯化蛋白质。

当将上述专利方法应用于小规模试验中时，似乎并不能重现上述结果。根据专利EP0978560B1，在杂质去除步骤(通过加入PEG6000/硫酸铵及离心)完成时，MGL酶大部分处于可溶部分中，而离心使得杂质位于沉淀内。然而，在根据EP0978560B1所述方法进行小规模试验时，MGL蛋白质却大部分(约80％)处于离心沉淀中。下表3所列为以SDS-PAGE凝胶实施的密度法所测得的可溶部分内MGL百分比。

鉴于这一意外结果，我们对上述专利方法进行了如下改进：1)以含MGL的所述离心沉淀为起始操作对象；2)连续进行两个结晶步骤，以提高DEAE柱的杂质去除效果；3)对DEAE柱层析进行优化。

对于上述最后一步，我们最终发现，DEAE琼脂糖凝胶FF树脂在所采用的缓冲液和pH条件下的离子交换效果不足。在额外实施了一系列优化试验后，我们最终做出如下选择：1)以pH＝7.6的Tris缓冲液替代最初的磷酸盐缓冲液，以提高该方法的稳健性；2)增加一次DEAE层析，以在不损失MGL(按照Takakura等人在2006年发布的方法为0.8EU/mg，而改进后方法为0.57EU/mg)的同时，大幅提高内毒素水平及蛋白质纯度。

最后，为了获得能够满足大规模GMP生产要求的方法，我们还增加了Q膜精制步骤，以降低残留内毒素及HCP水平。作为最后一步的该精制步骤可使该方法免于采用工业规模生产过程中难于实现的S200凝胶过滤层析(鉴于层析成本和持续时间)。

上述两方法所获得的产品总结于下表4。

^$Sephacryl-S200HR处理后(EP978560方法)或Q膜处理后(本发明方法)

实施例5：MGL和磷酸吡哆醛在小鼠红细胞内的共同包封

将CD1小鼠(Charles River公司)的全血在4℃下进行1000×g离心10分钟，以去除血浆和血沉棕黄层，并以0.9％NaCl(v:v)将红细胞洗涤三次。将冻干MGL以78.7mg/ml的浓度重新悬浮于水中，并将该悬浮液加入红细胞悬浮液中，以获得红细胞比容为70％且含不同浓度MGL和磷酸吡哆醛的最终悬浮液。随后，将该悬浮液以120ml/h的流量在血液透析器内进行透析，其中，以流量为15ml/min的低渗溶液作为逆流透析液。透析后，以高渗溶液对所述悬浮液进行再封，然后在37℃下温育30分钟。通过0.9％NaCl+0.2％葡萄糖溶液洗涤三次后，将悬浮液溶于由补充有6％的BSA的SAG-甘露醇形成的保存液内。所得产物在第0天(制备后2小时以内)及第1天(即在2～8℃下保存约18小时～24h小时后)进行表征。其后，以兽医自动测试装置(Sysmex公司PocH-100iV)获取血液学特征。

结果：

在下文所述的各项不同研究中，利用实施例5所述方法，并参照MGL水溶液外部校准范围，对最终产品内的MGL活性进行测定。这些测定结果与解释性研究结果共同表明，最终产品中的MGL活性随方法中引入的该酶的量的增大而增大，而且每毫升最终产品内可轻松地包封高达32IU的MGL，并同时保持良好的稳定性。

在另一项研究中，根据如下方法制备三种小鼠最终产品：RC-MGL-PLP1，RC-MGL-PLP 2及RC-MGL-PLP 3。

-RC-MGL-PLP1：通过以含3mg/ml MGL及约30μM磷酸吡哆醛的悬浮液进行MGL和磷酸吡哆醛的共同包封而得。该最终产品溶于补充有6％BSA及最终浓度10μM的磷酸吡哆醛的SAG-甘露醇中。

-RC-MGL-PLP 2：通过以含3mg/ml MGL及约30μM磷酸吡哆醛的悬浮液进行MGL和磷酸吡哆醛的共同包封而得。该最终产品溶于补充有6％BSA的SAG-甘露醇中。

-RC-MGL-PLP 3：通过以含3mg/ml MGL及约124μM磷酸吡哆醛的悬浮液进行MGL和磷酸吡哆醛的共同包封而得。该最终产品溶于补充有6％BSA的SAG-甘露醇中。

在第三项研究中，按照如下方法，以另外一批次的MGL制备小鼠最终产品RC-MGL-PLP 4：

-RC-MGL-PLP 4：通过以含5mg/ml MGL及约35μM磷酸吡哆醛的悬浮液进行MGL和磷酸吡哆醛的共同包封而得。该最终产品溶于补充有6％BSA的SAG-甘露醇中。

最后，在第四项研究中，按照如下方法，以第三批次的MGL制备小鼠最终产品RC-MGL-PLP 5：

-RC-MGL-PLP 5：通过以含6mg/ml MGL及约100μM磷酸吡哆醛的悬浮液进行MGL和磷酸吡哆醛的共同包封而得。该最终产品溶于补充有6％BSA的SAG-甘露醇中。

上述三类最终产品在第0天(制备后)的血液学和生物化学特性示于下表5。如该表所示，各产品均获得了令人满足的包封产率，其值为18.6％～30.5％。

*根据每一批次的比活性的计算值

实施例6：按照工业方法生产包封甲硫氨酸γ-裂解酶及磷酸吡哆醛的人红细胞

将一袋去除白细胞的人红细胞(RC)(由法国血液服务机构(Etablissementdu Sang)提供)以0.9％NaCl洗涤三次(清洗器Cobe 2991)。将冻干MGL以0.7％NaCl重新悬浮，并将该悬浮液加入红细胞悬浮液中，以获得红细胞比容为70％且含3mg/mlMGL及约30μM磷酸吡哆醛(源自MGL制剂)的最终悬浮液。将该悬浮液混匀后，按照EP1773452所述方法进行包封。随后，将再封后的悬浮液在室温下温育3小时，以除去最为脆弱的红细胞。将该悬浮液以0.9％NaCl+0.2％葡萄糖溶液(清洗器Cobe 2991)洗涤三次后，重新悬浮于80ml保存液(AS-3)内。下表6所示为按照实施例6方法测定的MGL包封水平。

实施例7

新增缩写

RPMI：罗斯威尔帕克纪念研究所培养基

一、操作条件

1.1试验项目

1.1.1L-天冬酰胺酶

说明：(德国)，大肠杆菌L-天冬酰胺酶10000IU。

通过以1倍杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)进行连续稀释，制备一定浓度(2.2IU/mL)的L-天冬酰胺酶，然后将该浓度的L-天冬酰胺酶稀释11倍，获得最终浓度为0.20IU/mL(IC50)的L-天冬酰胺酶。

1.1.2甲硫氨酸γ-裂解酶(MGL)

通过以1倍杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)进行连续稀释，制备一定浓度(3.85IU/mL)的MGL，然后将该浓度的MGL稀释11倍，获得最终浓度为0.35IU/mL(IC50)的MGL。

1.2细胞系

1.2.1说明

名称：NCI-N87细胞系

描述：人胃癌细胞系(贴壁)

供应商及参考编号：ATCC，CRL-5822

1.2.2培养条件

在加有10％(v/v)胎牛血清、100IU/mL青霉素及100μg/mL链霉素的RPMI培养基中培养细胞。此外，还根据PO-CELL-002及PO-CELL-005进行传代培养。

1.2.3比色试剂盒

名称：细胞计数试剂盒-8(CCK-8)

供应商及参考编号：Fluka 96992

比色试验根据PO-CELL-004实施。

二、细胞毒性测定

2.1方法

将2500个细胞以100μL/孔分配至96孔平底板(孔板数参见原始数据)中，而且每个孔板上均有两个添加培养基的板孔，用作空白对照。此外，为了减少蒸发和冷凝，所有空的板孔也都添加培养基。在第0天(D0)，在相应板孔中加入10μL的IC50浓度L-天冬酰胺酶或MGL，而对照品(空白板孔及对照孔板)中加入10μL的1倍DPBS。在第4天(D4)，将培养基从各板孔中移除并以新鲜培养基取代，而且在相应板孔中加入10μL的1倍DPBS或10μL的IC50浓度L-天冬酰胺酶(对于之前以MGL温育的细胞)或MGL(对于之前以L-天冬酰胺酶温育的细胞)，同时对照品(空白对照及阳性对照)中加入10μL的1倍DPBS。随后，将各孔板在培养箱内另外温育4天。温育结束(D8)后，根据PO-CELL-004，向每个板孔内添加10μL的CCK-8溶液，并将各孔板在培养箱内温育4个小时。在此之后，利用酶标仪在450nm处测定光密度(OD)。

2.2内部对照

各对照品均进行两组平行试验。

2.2.1空白板孔

与以上实施例1同。

2.2.2活力对照(阳性对照)

将在既不含L-天冬酰胺酶，也不含MGL，但是含10μL稀释剂(即1倍DPBS)的培养基(100μL)中培养的细胞用作NCI-N87细胞系(100％细胞活力)的阳性对照。

2.3细胞活力测定

与以上实施例1同。

三、结果

3.1内部对照

原始数据中未指出的均为可接受的内部对照。

3.2L-天冬酰胺酶或MGL单酶处理的IC50计算

在每一药物组合试验中，均将药物单独(MGL或L-天冬酰胺酶)处理的细胞活力百分比作为对照。由于此处所用各酶的IC50值已在第4天的单酶处理中得到验证，因此试验半程(第4天)时的细胞活力应该为50％。

3.2.1L-天冬酰胺酶和MGL的序贯添加

平行实施两次L-天冬酰胺酶和MGL序贯处理试验，其中，采用所有的质量控制手段(空白对照和阳性对照)。

细胞活力百分比的计算详情及图形表现形式如表7和图2所示。

表7：对照品及双酶联用时的细胞活力百分比

结果表明，当以先添加IC50剂量的MGL，然后添加IC50剂量的L-天冬酰胺酶这一方式(见图1)进行双酶联用时的细胞活力：

-比仅添加IC50剂量的L-天冬酰胺酶时(L-天冬酰胺酶的IC50对照)的细胞活力下降55％；

-比仅添加IC50剂量的MGL(MGL的IC50对照)的细胞活力下降44％；

-比以先添加IC50剂量的L-天冬酰胺酶这一方式进行双酶联用时的细胞活力下降43％。

四、结论

上述双酶序贯联用的结果证明，当在添加IC50剂量的MGL四天后，再添加IC50剂量的L-天冬酰胺酶时，可导致更高的细胞死亡率。

我们可以提出如下假说：MGL酶活性导致的甲硫氨酸缺乏使得NCI-N87胃癌细胞对L-天冬酰胺酶的活性更加敏感。此外，考虑到L-天冬酰胺酶和MGL各自具有相应的已知效果，因此还需要对其所起到的作用加以探讨。事实上，L-天冬酰胺酶已知能够引发白血病细胞凋亡(Ueno等人，1997年)，因此其可能起着细胞毒性剂的作用。MGL已知可阻断细胞周期中S期或G2期内的细胞分裂，因此其在可能更大成份上起到细胞生长抑制剂的作用。

实施例8

一、新增缩写

F12K：凯氏改良型汉氏F-12培养基

二、操作条件

2.1试验项目

2.1.1L-天冬酰胺酶

说明：(德国)，大肠杆菌L-天冬酰胺酶10000IU。

通过以1倍杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)进行连续稀释，制备一定浓度(2.97IU/mL)的L-天冬酰胺酶，然后将该浓度的L-天冬酰胺酶稀释11倍，获得最终浓度为0.27IU/mL(IC50)的L-天冬酰胺酶。

2.1.2甲硫氨酸γ-裂解酶(MGL)

通过以1倍杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)进行连续稀释，制备一定浓度(1.43IU/mL)的MGL，然后将该浓度的MGL稀释11倍，获得最终浓度为0.13IU/mL(IC50)的MGL。

2.2细胞系

2.2.1说明

名称：AGS细胞系

描述：人胃癌细胞系(贴壁)

供应商及参考编号：ATCC，CRL-1739

2.2.2培养条件

在加有10％(v/v)胎牛血清、100IU/mL青霉素及100μg/mL链霉素的F12K培养基中培养细胞。此外，还根据PO-CELL-002及PO-CELL-005进行传代培养。

2.2.3比色试剂盒

名称：细胞计数试剂盒-8(CCK-8)

供应商及参考编号：Fluka 96992

三、细胞毒性测定

3.1方法

将1000个细胞以100μL/孔分配至96孔平底板(孔板数参见原始数据)中，而且每个孔板上均有两个添加培养基的板孔，用作空白对照。此外，为了减少蒸发和冷凝，所有空的板孔也都添加培养基。在第0天(D0)，在相应板孔中加入10μL的IC50浓度L-天冬酰胺酶或MGL，而对照品(空白板孔及对照孔板)中加入10μL的1倍DPBS。在第4天(D4)，将培养基从各板孔中移除并以新鲜培养基取代，而且在相应板孔中加入10μL的1倍DPBS或10μL的IC50浓度L-天冬酰胺酶(对于之前以MGL温育的细胞)或MGL(对于之前以L-天冬酰胺酶温育的细胞)，同时对照品(空白对照及阳性对照)中加入10μL的1倍DPBS。随后，将各孔板在培养箱内另外温育4天。温育结束(D8)后，根据PO-CELL-004，向每个板孔内添加10μL的CCK-8溶液，并将各孔板在培养箱内温育4个小时。在此之后，利用酶标仪在450nm处测定光密度(OD)。

3.2内部对照

各对照品均进行两组平行试验。

3.2.1空白板孔

与以上实施例1同。

3.2.2活力对照(阳性对照)

将在既不含L-天冬酰胺酶，也不含MGL，但是含10μL稀释剂(即1倍DPBS)的培养基(100μL)中培养的细胞用作AGS细胞系(100％细胞活力)的阳性对照。

3.3细胞活力的测定

与以上实施例1同

四、结果

4.1内部对照

原始数据中未指出的均为可接受的内部对照。

4.2L-天冬酰胺酶或MGL单酶处理的IC50计算

在每一药物组合试验中，均将药物单独(MGL或L-天冬酰胺酶)处理的细胞活力百分比作为对照。由于此处所用各酶的IC50值已在第4天的单酶处理中得到验证，因此试验半程(第4天)时的细胞活力应为50％。

4.2.1L-天冬酰胺酶和MGL的序贯添加

细胞活力百分比的计算详情及图形表现形式如表8和图3所示。

表8：对照品及双酶联用时的细胞活力百分比

结果表明，当以先添加IC50剂量的MGL，然后添加IC50剂量的L-天冬酰胺酶这一方式(见图3)进行双酶联用时的细胞活力：

-比仅添加IC50剂量的L-天冬酰胺酶时(L-天冬酰胺酶的IC50对照)的细胞活力下降22％；

-比仅添加IC50剂量的MGL(MGL的IC50对照)的细胞活力下降26％；

-比以先添加IC50剂量的L-天冬酰胺酶这一方式进行双酶联用时的细胞活力下降10％。

此外，此处为了精确性，通过在试验第4天(半程)更新培养基后培养8天的方式，将L-天冬酰胺酶或MGL的IC50对照(最初在第4天验证及使用)的细胞活力恢复至100％。事实上，第4天时仍保持活力的细胞可在新添加的“新鲜”营养物的作用下重新生长。结果与在第4天达到50％细胞活力的IC50对照(仅酶)相一致。

五、结论

我们可以提出如下假说：MGL酶活性导致的甲硫氨酸缺乏使得AGS胃癌细胞对L-天冬酰胺酶的活性更加敏感。此外，考虑到L-天冬酰胺酶和MGL各自具有相应的已知效果，因此还需要对其所起到的作用加以探讨。事实上，L-天冬酰胺酶已知能够引发白血病细胞凋亡(Ueno等人，1997年)，因此其可能起着细胞毒性剂的作用。MGL已知可阻断细胞周期中S期或G2期内的细胞分裂，因此其在可能更大成份上起到细胞生长抑制剂的作用。

实施例9

一、新增缩写

A.M.：上午

ERY-ASP：包封于红细胞内的L-天冬酰胺酶

ERY-MET：包封于红细胞内的甲硫氨酸γ-裂解酶

IG：灌胃(管饲法)

IU：对应于μmol/分钟的国际单位

IV：静脉内

ND：未测得

PN：吡哆醇

TGI：肿瘤生长抑制

二、体内研究的目的

该研究的目的在于确定，载甲硫氨酸酶的红细胞(ERY-MET)与载L-天冬酰胺酶的红细胞(ERY-ASP)联用时，能否像单独使用ERY-MET时一样，在NCI-N87胃肿瘤皮下异种移植小鼠模型中提高抗肿瘤活性。

三、操作条件

在ERYTECH Pharma公司中，将NCI-N87细胞以5×10⁷个细胞/mL的浓度培养于用于注射的1倍DPBS内。将上述细胞系以5×10⁶个/100μL的固定浓度皮下注射于4组(第1、2、3、4组)雌性NMRI裸鼠体内，每组10只或12只。ERY-MET和ERY-ASP分别以108IU/kg(8mL/kg)及200IU/kg(4～5.4mL/kg)的浓度注射施用。第2组在第7天、第14天和第21天注射三次ERY-MET；第3组(ERY-ASP/ERY-MET组)在第7天注射一次ERY-ASP，在第21天和第28天注射两次ERY-MET；第4组(ERY-MET/ERY-ASP组)在第7天和第14天注射两次ERY-MET，在第21天注射一次ERY-ASP。第1组在第7天、第14天和第21天施用8mL/kg的ERY-MET保存液(SAG-甘露醇/血浆)。

每次ERY-MET注射6小时后(对于第2组：第7天+6小时、第15天+6小时、第21天+6小时；对于第3组：第21天+6小时、第28天+6小时；对于第4组：第7天+6小时、第15天+6小时)均以口服(管饲法)施用吡哆醇辅因子，而且在第20天(对于第4组)、第27天(对于第2组)或第34天(对于第3组)之前的其他天数(未施用ERY-MET的天数)均每天施用一次。

四、结果

ERY-MET/ERY-ASP联用方式下的肿瘤体积消退情况与ERY-MET施用方式呈现不同。事实上，在第37天，ERY-MET组小鼠的平均肿瘤体积为298.3±36.2mm³，ERY-MET/ERY-ASP组小鼠的平均肿瘤体积为189.7±29.8mm³，相应的平均肿瘤体积减小率分别为37％和57％，而施用载剂的小鼠(对照组)的平均肿瘤体积为441.5±56.6mm³。根据下式计算ERY-MET/ERY-ASP双酶联用组相对于对照组(载剂组)及ERY-MET组的肿瘤生长抑制(TGI*)百分比：

结果如表9所示：

表9：ERY-MET/ERY-ASP双酶联用的TGI计算结果

**因研究开始(第7天为肿瘤体积测量的第一时间点)时体积测量结果差异太小而未测得(无相关性)。

为了评价各组之间的显著性以及ERY-MET/ERY-ASP治疗与ERY-MET单酶治疗对NCI-N87胃肿瘤的有效性，使用GraphPad Prism软件(版本5.04)对肿瘤生长测量值进行双向ANOVA检验。对载剂(对照组)、ERY-MET及ERY-MET/ERY-ASP治疗的比较分析表明，各组之间在第37天具有显著差异(P<0.0001，见图4)，说明ERY-MET/ERY-ASP双酶联用在最后一次注射后16天对胃肿瘤具有治疗效力。此外，根据该双向ANOVA检验，相反施用顺序的ERY-ASP/ERY-MET双酶联用与ERY-MET单酶在NCI-N87胃肿瘤的治疗方面在三个后续跟踪时间点(第7/20/37天)上的各组之间均无显著差异(P>0.05，见图4)。

五、结论

ERY-MET与ERY-ASP按照如下两种方式联合施用：1)ERY-ASP(第7天)—ERY-MET(第21/28天)；2)ERY-MET(第7/15天)—ERY-ASP(第21天)。在ERY-MET先于ERY-ASP施用(两次)的方式中，似乎出现了与ERY-MET单独施用相比的阳性应答。第37天的个体肿瘤体积测量结果分析的P值小于0.0001这一点证实上述两者之间存在显著差异。

Claims

1.一种或一套用于治疗哺乳动物体内癌症的药物组合物，包括至少序贯施用一次的天冬酰胺酶和甲硫氨酸酶，其中，甲硫氨酸酶在天冬酰胺酶之前施用。

2.根据权利要求1所述的用于该用途的组合物，其特征在于，甲硫氨酸酶和天冬酰胺酶处于游离形式、聚乙二醇修饰形式或包封于红细胞内的形式。

3.根据权利要求1所述的用于该用途的组合物，其特征在于，甲硫氨酸酶处于游离形式或聚乙二醇修饰形式，而且甲硫氨酸酶的施用完成时间与天冬酰胺酶的施用开始时间之间的间隔为约1小时和约7天之间，尤其为约3小时和约6天之间，优选为约1天和约5天之间。

4.根据权利要求1所述的用于该用途的组合物，其特征在于，甲硫氨酸酶包封于红细胞内，而且甲硫氨酸酶的施用完成时间与天冬酰胺酶的施用开始时间之间的间隔为约1小时和约30天之间，尤其为约1天和约20天之间，优选为约1天和约10天之间。

5.根据前述权利要求中任一项所述的用于该用途的组合物，其特征在于，甲硫氨酸酶以约100IU和约100000IU之间，尤其约500IU和约50000IU之间，优选约500IU和约5000IU之间的量施用一次或多次。

6.根据前述权利要求中任一项所述的用于该用途的组合物，其特征在于，天冬酰胺酶以介于约500IU和约100000IU之间，尤其约1000IU和约50000IU之间，优选约5000IU和约30000IU之间的量施用一次或多次。

7.一种含天冬酰胺酶的药物组合物，用于治疗已施用甲硫氨酸酶的哺乳动物体内的癌症。

8.根据权利要求7所述的用于该用途的组合物，其特征在于，甲硫氨酸酶处于游离形式或聚乙二醇修饰形式，而且甲硫氨酸酶的施用时间与天冬酰胺酶的施用时间之间的间隔为约1小时和约7天之间，尤其为约3小时和约6天之间，优选为约1天和约5天之间。

9.根据权利要求7所述的用于该用途的组合物，其特征在于，甲硫氨酸酶包封于红细胞内，而且甲硫氨酸酶的施用完成时间与天冬酰胺酶的施用开始时间之间的间隔为约1小时和约30天之间，尤其为约1天和约20天之间，优选为约1天和约10天之间。

10.根据权利要求7～9中任一项所述的用于该用途的组合物，其特征在于，甲硫氨酸酶以约100IU和约100000IU之间，尤其约500IU和约50000IU之间，优选约500IU和约5000IU之间的量施用一次或多次。

11.根据权利要求7～10中任一项所述的用于该用途的组合物，其特征在于，天冬酰胺酶以约500IU和约100000IU之间，尤其约1000IU和约50000IU之间，优选约5000IU和约30000IU之间的量施用一次或多次。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的用于该用途的组合物，其特征在于，还包括与所述甲硫氨酸酶同时、分开或序贯施用的磷酸吡哆醛或磷酸吡哆醛前体。

13.根据权利要求12所述的用于该用途的组合物，其特征在于，包括包封于红细胞内的甲硫氨酸酶以及分开或序贯施用的磷酸吡哆醛非磷酸盐前体。

14.根据权利要求1～11中任一项所述的用于该用途的组合物，其特征在于，包封于红细胞内的甲硫氨酸酶在包封于红细胞内的天冬酰胺酶施用之前至少施用一次或两次，而且每次施用甲硫氨酸酶之后，均在天冬酰胺酶施用之前施用磷酸吡哆醛非磷酸盐前体溶液。

15.根据前述权利要求中任一项所述的用于该用途的组合物，其特征在于，用于治疗液体瘤或实体瘤。

16.根据权利要求15所述的用于该用途的组合物，其特征在于，用于治疗白血病或胃癌。

17.一种对具有相应需求的哺乳动物体内的癌症进行治疗的方法，其特征在于，该方法包括向具有相应需求的该哺乳动物，先施用含甲硫氨酸酶的组合物，然后施用含天冬酰胺酶的组合物。

18.一种对具有相应需求的哺乳动物体内的癌症进行治疗的方法，其特征在于，该方法包括向具有相应需求的该哺乳动物，先施用含包封于红细胞内的甲硫氨酸酶的组合物，然后施用含包封于红细胞内的天冬酰胺酶的组合物。

19.根据权利要求18所述方法，其特征在于，甲硫氨酸酶的施用完成时间与天冬酰胺酶的施用开始时间之间的间隔为1小时和30天之间。

20.根据权利要求18所述方法，其特征在于，甲硫氨酸酶以100IU和100000IU之间的量施用一次或多次。

21.根据权利要求18所述方法，其特征在于，天冬酰胺酶以500IU和100000IU之间的量施用一次或多次。

22.根据权利要求18所述方法，其特征在于，包封于红细胞内的甲硫氨酸酶在包封于红细胞内的天冬酰胺酶施用之前至少施用一次或两次，而且甲硫氨酸酶的每次施用均伴随着在天冬酰胺酶施用之前进行磷酸吡哆醛或磷酸吡哆醛前体的施用。

23.根据权利要求22所述方法，其特征在于，每次施用被包封的甲硫氨酸酶之后，均施用一次或多次磷酸吡哆醛非磷酸盐前体溶液。

24.根据权利要求23所述方法，其特征在于，在甲硫氨酸酶的治疗过程中，每天施用一次、两次或更多次的磷酸吡哆醛非磷酸盐前体溶液。

25.根据权利要求18所述方法，其特征在于，所述癌症为白血病或胃癌。