KR102268259B1

KR102268259B1 - 메티오닌 및 아스파라긴 고갈을 이용하여 암에 대해, 인간을 포함한 포유동물을 치료하는 방법

Info

Publication number: KR102268259B1
Application number: KR1020187018561A
Authority: KR
Inventors: 카린 아구에라; 윌리 베를리에; 파비앙 게이; 얀 고드프린
Original assignee: 에리테끄 파르마
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2017-01-02
Publication date: 2021-06-24
Also published as: ES2881787T3; AU2017204678A1; US11141468B2; RU2018123666A; HK1256155A1; CA3009918A1; RU2733389C2; MX2018007933A; SG11201805311XA; JP6966451B2; BR112018013227A2; EP3187190A1; CN108472339A; US20190000941A1; JO3709B1; KR20180097596A; EP3397272A1; RU2018123666A3; CA3009918C; EP3397272B1

Abstract

본 발명은 인간을 포함하는 포유동물에서, 액체 및 고형암을 치료하기 위한 새로운 방법에 관한 것으로, 여기에서 메티오니나제는 아스파라기나제 전에 투여된다. 본 발명은 또한 아스파라기나제 치료에 선행해서, 식이적 메티오닌 박탈, 가능하게는 메티오니나제 투여와 조합된 식이적 메티오닌 박탈의 용도를 포함한다. 메티오니나제와 아스파라기나제는 특히 유리(free) 형태, PEG화된 형태 또는 적혈구에 캡슐화된 형태로 사용될 수 있다.

Description

메티오닌 및 아스파라긴 고갈을 이용하여 암에 대해, 인간을 포함한 포유동물을 치료하는 방법

본 발명은 암에 대한, 인간을 포함한 포유동물의 새로운 치료 방법, 특히 효소적 방법, 및 암 치료에 있어서 아스파라기나제(asparaginase)와 메티오니나제(methioninase)의 새로운 용도에 관한 것이다. 효소요법은 종양을 굶어 죽게하고 특히 암 관리에 도움을 주고자 하는 것이다.

아스파라기나제는 세포 생명에 있어서 필요한 단백질의 생산에 필수적인 아미노산인 아스파라긴을 가수분해하여 고갈시킨다. 현재, 정상 세포와는 대조적으로, 특정 암성 림프아구세포는 이들이 아스파라긴을 자체 생산할 수 있는 능력을 갖고 있지 않으며 이들의 단백질 합성을 위하여 세포외 공급원에 의존한다. 따라서, 상기 효소는 백혈병 (액체 또는 혈액암)을 치료하는데 사용될 수 있다. 이에 따라, L-아스파라기나제는 지난 30년 동안 급성 림프구성 백혈병(ALL)의 치료를 위하여 화학요법 병용법에 사용되었다. ERY-ASP는 적혈구-캡슐화된 L-아스파라기나제로 이루어져 있다. 캡슐화는 L-아스파라기나제가 적혈구 내부의 아스파라긴을 파괴할 수 있도록 하여, 알레르기성 반응을 방지하고 다른 부작용을 감소시킨다 (WO2006/016247, 본원에서 참고로 인용됨).

메티오니나제로도 표시되는, 메티오닌-γ-리아제 (MGL; EC 번호 4.4.1.11; CAS 번호 42616-25-1)는 필수적인, 황-함유 단백질구축(proteinogenic) 아미노산인 L-메티오닌(Met)의 대사에 관여하는 피리독살-의존성 효소이다. 암에서 Met 요구는 1970년대 연구의 목적이었으며; 그런 연구로 컬쳐 배지 중 Met를 이의 전구체인 호모시스테인으로 치환시키는 것은 섬유아세포와 같은 정상세포에 대해서는 충격이 없지만 몇몇 형질전환되거나 악성인 세포의 성장 속도를 둔화시키는 것으로 밝혀졌다. PC-3 전립선암 세포에서, Met 단식(starvation)의 항-종양 효과는 또한 Met 유사체를 사용함으로써 강화되었는데 이는 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 둘다에서 암세포의 증식을 급격하게 둔화시켰으며 세포가 세포자살(apoptosis)하도록 하였다. 상호보완적 연구로 Met-의존성 암세포에서 외인성 Met를 제한하면 세포 주기의 후기 S 또는 G2기에 세포분화를 차단하는 것으로 밝혀졌다. Met 제한이 암치료에 있어서 효과적인 것으로 나타남에 따라, 수개의 공급원으로부터의 MGL 효소를 사용하는 치료적 접근법이 종양 미세환경에서의 Met 고갈에 대해 조사되었다. 상기 목표는 Met-의존성 암을 갖고 있는 환자에서 Met의 전신성 고갈을 위하여 적혈구에 캡슐화된 MGL을 기본으로 하는 새로운 치료적 해법을 개발하는 것이다 (WO2015/121348, 본원에서 참고로 인용됨).

암치료에 있어서 새로운 또는 추가적인 치료적 해법에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

약물 병용 효과는 본질적으로 예측할 수 없다. 흔히, 한 약물이 다른 약물의 효과를 부분적으로 또는 완전히 억제하는 성향이 있다. 선택된 인간 백혈병 세포주(HL-60)에 대한, ERY-ASP와 ERY-MET를 구성하는 효소인, L-아스파라기나제와 MGL의 단독 또는 병용시 세포독성 효과를 평가하기 위한 시험관내 연구가 수행되었다. 별도로 각 약물에 대해, 세포 생존율의 50% 억제를 제공하는 농도(IC50)를 먼저 측정하였다. 이어서, 조합 순서와는 상관없이, 어느 정도, 예를 들어, 72시간, 지연기간을 L-아스파라기나제와 MGL의 첨가 (각 효소에 대한 IC50 투여량) 사이에 추가하였을 때, 조합 치료법의 장점을 평가하기 위한 검사를 수행하였다.

본 발명은 MGL을 IC50 투여량으로 첨가한 다음 3일 후 이어서 L-아스파라기나제를 IC50 투여량으로 첨가함으로써 세포 사멸율이 증가될 수 있다는 놀라운 발견을 기본으로 한다. 효소 첨가의 역행적 디자인(reverse design)은 액체 종양 모델, 즉, 백혈병 모델에서 시험관내 세포 사멸율의 그러한 증가를 허용하지 않았다. 이런 놀랄만한 효과는 고형 종양, 즉, 소화관 종양에서 확인되었으며, 여기서 시험관내 세포 사멸율의 증가와 생체내 종양 용적 축소가 관찰되었다. 이론에 얽매이도록하지 않으면서, MGL 활성에 의해 유도된 메티오닌 박탈은 세포가 L-아스파라기나제에 더욱 감응성이 되도록 할 수 있으며 아마도 세포 사이클 조절에 관여하는 각 효소의 역할과 관련있다고 가설을 세울 수 있다. 이런 발견은 순차적인(sequential) 메티오닌 박탈 또는 메티오니나제 치료법 및 아스파라긴 박탈 또는 아스파라기나제 치료법을 포함한 치료 요법에 대한 방법을 열어준다. 다음 설명으로부터 자명해지는 바와 같이, 본 발명은 암에 대해 유익한 효과를 유도하는 식이(diet) 및/또는 약물 투여를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 메티오닌 박탈 또는 메티오니나제 치료법이 아스파라긴 박탈 또는 아스파라기나제 치료법을 앞서는 임의의 조합으로, 식이 및 약물 투여를 조합할 수 있다. 메티오니나제가 시스테이나제 활성을 가지며, 아스파라기나제가 글루타미나제 활성을 갖는 것으로도 알려져 있기 때문에, 시스테이나제 활성, 글루타미나제 활성, 각각이 메티오니나제, 아스파라기나제 각각의 작용 방식에 관여될 수 있음을 배제할 수 없다.

본 발명의 목적은 치료를 필요로 하는 포유동물에서 암을 치료하는 방법이며, 이 방법은 포유동물에서 메티오닌을 박탈한 다음, 이어서 포유동물에서 아스파라긴을 박탈함을 특징으로 한다. 찾고자 하는 것은 암세포에 이용될 수 있는 메티오닌과 아스파라긴의 양을 감소시키는 것이다. 전술한 내용으로부터 자명한 바와 같이, 메티오닌 박탈은 식이적 메티오닌 박탈 및/또는 메티오니나제 투여를 통하여 성취될 수 있는 반면, 아스파라긴 박탈은 아스파라기나제 투여를 이용하여 바람직하게 성취될 수 있다.

박탈(deprivation)이란, 암을 치료하는데 있어서 유익한 효과를 생산하기에 충분한 메티오닌 또는 아스파라긴 감소를 의미하며, 암세포는 상기 아미노산의 충분한 양을 박탈당하는 것이다.

효소 치료법이란, 효소가 대상이 되는 아미노산을 분해하여 가능하게는 암세포에 대해 충분한 양의 아미노산이 결여되도록 하는 단백질 또는 아미노산 합성 또는 임의의 작용기작(mechanism)의 억제와 같은 다른 유익한 효과를 유도함을 의미한다.

본 발명의 목적은 아스파라기나제 전에 투여될 메티오니나제와 함께 적어도 1회 순차적 투여하기 위한 아스파라기나제와 메티오니나제를 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물이다. 아스파라기나제와 메티오니나제가 별도로 순차적으로 투여되기 때문에, 상기 조성물은 이들의 별개의 제형을 포함하는 세트 또는 키트로 또는 본 발명의 순서 및 빈도에 따라서 사용될 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 양태 또는 목적하에 본 발명의 문맥에서, 적어도 1회의 순차적 투여란 동일한 포유동물이 치료 요법 또는 치료기 중에 1회 이상 순차적으로 처리될 수 있음을 의미한다. 그러나, 1회 또는 수회의 메티오니나제 투여(들)는 1회 또는 수회의 아스파라기나제 투여(들) 전에 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 제약 조성물 또는 제약 조성물들 또는 제약 조성물들의 키트 또는 세트 (하나는 메티오니나제를 포함하고, 다른 하나는 아스파라기나제를 포함함)의 제조를 위한 아스파라기나제와 메티오니나제의 용도이며, 여기서 상기 조성물(들) 또는 키트는 아스파라기나제 전에 투여될 메티오니나제와 함께 적어도 1회 순차적으로 투여하여 포유동물에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은:

- 포유동물에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 아스파라기나제를 포함하는 제약 조성물 (여기서 이 조성물은 메티오니나제가 투여된 포유동물에게 투여된다);

- 포유동물에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 아스파라기나제를 포함하는 제약 조성물 (여기서 이 조성물은 메티오닌 박탈 식이 처리된, 즉, 치료적이거나 아닌 메티오닌 박탈된 식품을 투여한 포유동물에게 투여되며; 본 발명의 의미에서 치료적 식품이란 의과적 환경에서 투여되는 식품 및/또는 규제 기관으로부터 판매 허가을 받은 것, 특히 주입식으로 투여될 수 있거나 되지 않는 액체 식품을 의미한다);

- 포유동물에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 메티오니나제를 포함하는 제약 조성물 (여기서 이 조성물은 아스파라기나제가 추가로 투여될 포유동물에게 투여된다);

- 포유동물을 아스파라기나제로 치료하기 전에, 포유동물로부터 메티오닌을 박탈하는데 사용하기 위하여 메티오닌을 포함하지 않거나 실질적으로 메티오닌을 포함하지 않는, 치료적이거나 아닌, 식품 조성물 또는 식이가다.

본 발명의 다른 목적은:

- 포유동물에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물의 제조를 위한 아스파라기나제의 용도 (여기서, 상기 조성물은 메티오니나제가 투여된 포유동물에게 투여된다);

- 포유동물에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물의 제조를 위한 아스파라기나제의 용도 (여기서, 상기 조성물은 메티오닌 박탈 식이 처리된, 즉, 치료적이거나 아닌 메티오닌 박탈된 식품을 투여한 포유동물에게 투여된다);

- 포유동물에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물의 제조를 위한 메티오니나제의 용도 (여기서, 상기 조성물은 아스파라기나제가 추가로 투여될 포유동물에게 투여된다)이다.

본 발명의 또 다른 목적은 메티오니나제를 함유하는 제약 조성물 또는 메티오닌 박탈을 위한 치료적 식품 또는 식이, 및 아스파라기나제를 함유하는 제약 조성물 (이들 조성물은 별도로 포장되어 있다)을 포함하는 키트이다. 상기 조성물은 아스파라기나제 전에 투여될 메티오니나제 또는 식품/식이과 함께 순차적으로 투여하기 위함이다. 상기 키트는 상기 조성물이 아스파라기나제 전에 투여될 메티오니나제 또는 식품/식이과 함께 순차적으로 투여하기 위한 것임을 표시하는 인쇄물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 포유동물에게 먼저 유효한 양의 메티오니나제를 투여하고 2차로 유효한 양의 아스파라기나제를 투여함을 특징으로 하는, 포유동물에서의 암 치료 방법이다.

본 발명의 또 다른 목적은 포유동물에게 먼저, 메티오닌을 박탈하기 위한, 치료적이거나 아닌 식품 또는 식이를 투여하고, 2차로 유효한 양의 아스파라기나제를 투여함을 특징으로 하는, 포유동물에서의 암 치료 방법이다.

본 발명의 또 다른 목적은 메티오닌 생체이용가능 수준이 낮거나, 치료적이거나 아닌, 메티오닌을 박탈한 식품 또는 식이으로 처리된 포유동물에서의 암 치료 방법으로, 이 방법은 유효한 양의 아스파라기나제를 포유동물에게 투여함을 특징으로 한다.

이들 상이한 목적에서, 메티오니나제 투여와 메티오닌 식이 박탈이 조합될 수 있다.

본 발명은 액체, 즉, 혈액암, 및 고형암을 포함한, 임의의 암에 대해 유익할 수 있다.

본 발명의 구체적인 목적은 아스파라긴 및/또는 메티오닌에 영양요구성인 암의 치료에 본 발명을 적용시키는 것이다.

본 발명의 구체적인 목적은 아스파라긴 및/또는 메티오닌에 영양요구성이 아닌 암의 치료에 본 발명을 적용시키는 것이다.

본 발명은 임의의 포유동물, 특히 인간, 개와 고양이 같은 반려동물 및 말과 같은 스포츠 동물에게 적용시킬 수 있다.

도 1은 상이한 치료 조건하에서의 세포 생존율%를 보여주는 그래프이다.
도 2 및 3은 상이한 치료 조건하에서의 세포 생존율%를 보여주는 그래프이다.
도 4는 시간의 함수에서 중간값으로 개별 종양 용적을 보여주는 그래프이다.

당해 분야의 숙련가는 식이 또는 상기 약물 중 하나를 사용한 치료 지속기간, 및 메티오닌 박탈과 아스파라기나제 치료 사이의 지연기간이 치료, 환자의 반응, 및 중요하게는 상기 약물의 반감기 또는 식이 효과에 따라서 변화될 수 있음을 본 개시내용으로부터 알 수 있을 것이다. 본 발명에서 사용되는 투약 형태, 예를 들면, 유리(free) 효소, PEG화된 효소 및 상기 효소를 캡슐화하는 적혈구, 또는 마이크로캡슐 (예를 들면, PLA 또는 PLGA로 제조된 것) 또는 리포좀에 결합되거나 이들 구조물에 캡슐화된 또 다른 효소에 따라서 차이점이 있을 수 있다.

이들 상이한 목적들의 바람직한 실시양태로, 메티오니나제 투여 말기와 아스파라기나제 투여 개시 사이의 지연기간이 약 1시간 내지 약 7일 사이, 특히 약 3시간 내지 약 6일 사이, 바람직하게는 약 1일 내지 약 5일 사이이다. 바람직하게는, 상기 실시양태에서, 메티오니나제는 유리 형태 또는 PEG화된 형태로 존재하며, 아스파라기나제는 본원에 기재된 임의의 형태로 존재할 수 있다.

다른 실시양태로, 메티오니나제 투여 말기와 아스파라기나제 투여 개시 사이의 지연기간이 약 1시간 내지 약 30일 사이, 특히 약 1일 내지 약 20일 사이, 바람직하게는 약 1일 내지 약 10일 사이이다. 바람직하게는, 상기 실시양태로, 메티오니나제가 캡슐화, 바람직하게는 적혈구에 캡슐화되어 있으며, 아스파라기나제는 본원에 기재된 임의의 형태로 존재할 수 있다.

또 다른 실시양태로, 메티오닌 제한 말기와 아스파라기나제 투여 개시 사이의 지연기간이 약 1시간 내지 약 7일, 특히 약 1시간 내지 약 3일, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 1일 사이이다. 아스파라기나제는 본원에 기새된 임의의 형태 하에 있을 수 있다.

유리 형태 또는 PEG화된 형태 등의 효소를 포함하는 조성물:

이들 조성물은 표준 기법을 사용하여 포유동물에게 투여될 수 있다. 기법 및 제형은 일반적으로 문헌: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.sup.th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990 (본원에서 참고로 인용됨)으로부터 알 수 있다.

제약상 허용되는 담체 및/또는 부형제를 또한 본 발명에 따르는 제약 조성물에 포함시켜 특정의 메티오니나제 또는 아스파라기나제의 투여를 도울 수 있다. 본 발명의 실시에 사용하기에 적합한 담체의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 슈가, 예로서 락토오스, 글루코오스, 또는 슈크로오스, 또는 각종 타입의 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 및 생리학적으로 화합성인 용매가 있다. 생리학적으로 화합성인 용매에는 주사용 물(WFI), 염 용액 및 덱스트로오스의 멸균액이 있다.

본 발명에 따르는 제약 조성물은 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 경구, 국소 (경피적), 또는 점막경유 투여를 포함한 상이한 경로로 투여될 수 있다. 전신적 투여의 경우, 경구적 투여가 바람직하다. 경구적 투여의 경우, 예를 들면, 화합물을 통상의 경구 투여형, 예로서 캡슐, 정제, 및 액체 제제, 예로서 시럽, 엘릭서, 및 농축된 드롭(drops)으로 제형화할 수 있다.

달리, 주사 (비경구적 투여), 예를 들어, 근육내, 정맥내, 복강내, 및 피하 주사가 사용될 수 있다. 주사의 경우, 제약 조성물을 액체 용액, 바람직하게는 생리학적으로 화합성인 완충액 또는 용액, 예로서 염 용액, 행크액(Hank's solution), 또는 링거액(Ringer's solution)으로 제형화된다. 또한, 화합물을 고체 형태로 제형화하여 사용전에 즉시 다시 용해시키거나 현탁시킬 수 있다. 예를 들면, 메티오니나제 또는 아스파라기나제의 동결건조된 형태가 사용될 수 있다.

전신적 투여는 또한 점막경유 또는 경피적 수단에 의해 수행될 수 있다. 점막경유 또는 경피적 투여의 경우, 투과할 방벽에 적합한 침투제가 사용된다. 그러한 침투제는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 점막경유 투여의 경우, 담즙염, 및 퓨시드산 유도체가 있다. 또한, 침투가 용이해지도록 세제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 점막경유 투여는 코 스프레인, 흡입기 (폐 운반용), 직장 좌제, 또는 질 좌제를 통할 수 있다. 국소 투여의 경우, 화합물을 연고, 살브(salve), 겔, 또는 크림으로 제형화할 수 있으며, 당해 분야에 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한 예를 들어, 주입 또는 다른 경로를 통하여 효소를 운반하기 위하여 포유동물에게 이식되거나 인가된 장치의 용도를 포함한다. 특별한 실시양태로, 상기 장치가 2개의 챔버 또는 바이알을 포함하며, 하나는 메티오니나제를 포함하고, 다른 하나는 아스파라기나제를 포함한다. 상기 장치는 각각의 챔버 또는 바이알에 대해, 효소를 혈액 순환에 운반하기 위한 튜브 등, 전자 회로 및 적합한 소프트웨어에 의해 제어되는, 전자 또는 전기적 밸브 또는 펌프, 또는 작동식 피스톤을 가지고 있다. 상기 전자 회로 및 이의 소프트웨어는 먼저 메티오니나제의 운반을 예정된 기간 동안, 바람직하게는 특정의 인출 비율(debit rate), 지연기간으로 제어하고, 이어서 예정된 기간 동안, 바람직하게는 특정의 인출 비율로 아스파라기나제의 운반을 제어한다.

효소를 캡슐화하는 적혈구 (적혈구 세포 또는 RBCs)를 포함하는 조성물:

하나의 실시양태로, 아스파라기나제가 적혈구 내부에 캡슐화되어 있으며 상기 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 비히클 중 이들 적혈구의 현탁액을 포함한다.

하나의 실시양태로, 메티오니나제가 적혈구 내부에 캡슐화되어 있으며 상기 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 비히클 중 이들 적혈구의 현탁액을 포함한다.

하나의 실시양태로, 아스파라기나제가 제약상 허용되는 담체 또는 비히클 중에, 유리 형태로 또는 PEG화된 형태 (PEG-아스파라기나제)로 존재한다.

하나의 실시양태로, 메티오니나제가 제약상 허용되는 담체 또는 비히클 중에, 유리 형태로 또는 PEG화된 형태 (PEG-메티오니나제)로 존재한다.

하나의 실시양태로, 메티오니나제가 약 100 내지 약 100,000 IU, 특히 약 500 내지 약 50,000 IU, 바람직하게는 약 500 내지 약 5000 IU 사이의 양으로 투여된다.

하나의 실시양태로, 아스파라기나제가 약 500 내지 약 100,000 IU, 특히 약 1000 내지 약 50,000 IU, 바람직하게는 약 5000 내지 약 30,000 IU 사이의 양으로 1회 투여된다.

하나의 실시양태로, 상기 조성물은 2회 이상 순차적 투여, 특히 2 또는 3회 사용하기 위한 것이다.

하나의 실시양태로, 아스파라기나제와 메티오니나제가 본 발명에 따라서 순차적으로 사용되며, 이들 효소는 둘다 적혈구내에 캡슐화되어 있다.

하나의 실시양태로, 아스파라기나제와 메티오니나제가 본 발명에 따라서 순차적으로 사용되며, 적혈구에 캡슐화되어 있는 아스파라기나제와 유리 형태 또는 PEG화된 형태인 메티오니나제가 사용된다.

하나의 실시양태로, 아스파라기나제와 메티오니나제가 본 발명에 따라서 순차적으로 사용되며, 적혈구에 캡슐화되어 있는 메티오니나제와 유리 형태 또는 PEG화된 형태인 아스파라기나제가 사용된다.

"캡슐화된"이란 효소가 적혈구 내부에 포함되어 있음을 의미한다. 그러나, 이는 일부 미량의 효소가 적혈구 벽 내에 체류하고 있을 수 있다.

식이적 메티오닌 제한:

식이적 메티오닌 제한은 흑색종 및 신경교종에서 시스테무스틴 요법 (E. Thivat et al., Anticancer Research 2009, 29: 5235-5240) 또는 전이성 대장암의 제1선 요법으로서 FOLFOX (X. Durando et al., Oncology 2010, 78: 205-209)와 함께 제안된 바 있다. 메티오닌 제한 또는 박탈 식이는 포유동물에서 유리(free) 메티오닌의 완전 또는 실질적 감소 또는 제거를 유도하기에 충분한 시간 동안 식품 조성물을 사용한 포유동물 식품 요법 또는 섭식법(feeding)이다.

상기 식품이 바람직하게는 비경구적 경로, 특히 주입을 통하여 투여되는 액체 식품일 수 있다.

또한, 메티오니나제를 사용하는 메티오닌 박탈은 포유동물에서 유리 메티오닌의 완전 또는 실질적인 감소 또는 제거를 유도하는 것을 목표로 한다. 전형적으로, 이런 식이(diet)는 포유동물에서의 평균 수준에 대해 30 내지 100%, 전형적으로 30 내지 60%의 메티오닌 수준으로 감소시키기 위하여 수행된다. 기준(reference)은 Thivat (2009)와 Durando (2010)에 의한 연구에 대해 수행될 수 있다.

상기 식품의 투여는 1일 이상 동안, 예를 들면, 1일 내지 7일 동안 수행될 수 있다.

하나의 실시양태로, 상기 식품을 메티오니나제 치료법과 조합하는데, 예를 들면, 상기 식품을 메티오니나제를 사용하는 전체 치료 기간 또는 일부 기간 동안 투여한다.

메티오니나제

메티오니나제는 또한 그중에서도 특히, L-메티오니나제, 메티오닌 감마 리아제(Methionine Gamma Lyase) MGL을 언급하며; 이 화합물은 수신번호 EC 4.4.1.11과 CAS　번호 42616-25-1이다. 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 메티오니나제 공급원을 알기 위하여, 공개물: El Sayed A, Applied Microbiol. Biotechnol. (2010) 86: 445-467을 특히 언급할 수 있다.

재조합 메티오니나제가 상기 효소에 대해 코드화하는 유전자로부터 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli) 세균으로부터, 예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 세균으로부터 생산될 수 있다. rMETase로 명명된, 이런 방식으로 수득된 효소는 유리 형태로 또는 변형된 형태로, 예를 들면, PEG화된 형태 (PEG-rMETase)로 사용될 수 있다. 참조: X. Sun et al. Cancer Research 2003, 63: 8377-8383. 이는 또한 적혈구내로 캡슐화될 수 있으며, 상기 조성물 또는 현탁액은 일정량의 적혈구와 환자에게 결정된 투여량의 아스파라기나제를 운반하기에 충분한 양의 캡슐화된 메티오니나제를 포함하는 것이 유리하다.

당해 분야의 숙련가는 조성물 및 사용 방법에 대해 문헌: WO 2015/121348을 언급할 수 있다.

메티오니나제의 조성물은 상기 효소의 보조인자, 즉, PLP, 및/또는 비-인산염 전구체, 예로서 비타민 B6의 비-인산염 형태, 및/또는 인산염 전구체, 예로서 피리독신 인산염 (PNP)일 수 있는, 이의 전구체를 추가로 포함할 수 있다.

비타민 B6는 상이한 형태, 인산염 또는 비-인산염으로 존재한다. 피리독신 인산염(PNP), 피리독살 인산염(PLP) 및 피리독사민 인산염(PMP)이 이들의 인산염 형태이다. 대응하는 비-인산염 형태가 피리독신(PN), 피리독살(PL), 및 피리독사민(PM)이다. 비타민 B6의 비-인산염 형태가 적혈구 막을 통과할 수 있으며, 인산염 형태는 어렵게 통과할 수 있다. 주요 경로에 따라서, 피리독신(PN)이 PN-키나제의 효과 하에서 적혈구 내부에서 PNP로 변형되고, 이어서 PNP는 PNP-옥시다제의 효과 하에서 PLP로 변형된다. 이후, PLP는 PLP-포스파타제의 효과 하에서 피리독살(PL)로 변형되고 PL은 적혈구를 떠날 수 있다. 공급된 전구체가 제조 방법 중에 또는 조성물의 보관 중에 적혈구에서 변형을 일으킬 수 있음을 쉽게 알 수 있다.

비타민 B6의 비-인산염 형태란, 본 발명에서 비타민 B6의 3개의 "비타머(vitamer)" : PL, PN 및 PM 중 1개 또는 2개 또는 3개의 비타머의 혼합물을 의미한다. PN 형태가 바람직하다. 이들은 또한 염의 형태로 존재할 수 있다.

상기 조성물은 적혈구에 캡슐화된 PLP를 포함할 수 있다. PLP는 캡슐화 과정 중에 제공될 수 있거나 이의 전구체로부터 적혈구에서 전체적으로 또는 부분적으로 수득될 수 있다. 존재하거나 형성된 PLP는 효소와 회합(association)될 수 있다. 그러므로, 상기 조성물은 대응하는 홀로효소(holoenzyme), 예를 들면 메티오니나제-PLP를 포함할 수 있다. 이러한 조건 하에서, 예를 들어, 효소의 기질의 혈액 고갈 기간으로 관찰한 바, 상기 활성 효소의 반감기가 상당하게 증가된다. 본 발명에 따르는 조성물은 투여 후 24시간 이상, 주로 1일, 5일, 10일 또는 15일 이상 효소 활성을 보존할 가능성을 제공함이 분명하다.

하나의 실시양태로, 메티오니나제의 조성물이 피리독살 인산염(PLP) 및/또는 비타민 B6의 비-인산염 형태 및/또는 인산염 전구체, 피리독신 인산염(PNP) 및/또는 피리독사민 인산염(PMP)을 포함한다.

특징에 따라서, PNP 및/또는 PMP가 조성물내 적혈구 내부에 캡슐화된다. 상기 전구체는 효소와 함께 동시-캡슐화될 수 있거나 그 자체 전구체로부터 적혈구에서 전체적으로 또는 부분적으로 수득될 수 있다.

상기 조성물은 적혈구 세포 (적혈구) 리터(L) 당 캡슐화된, 약 0.05 내지 약 600, 주로 약 0.5 내지 약 100, 바람직하게는 약 5 내지 약 50 μ몰의, PLP 및/또는 PNP 및/또는 PMP를 주로 포함한다.

특징에 따라서, 상기 조성물은 PLP 효소를 캡슐화하는 적혈구와 PLP, 추가로, 적혈구 내부에 존재하거나 적혈구의 내부 및 외부에 존재하는, 적혈구에 캡슐화된, 비-인산염 PLP 전구체를 포함한다. 상기 비-인산염 전구체는 PN, PL 또는 PM, 바람직하게는 PN, 또는 이들 화합물 2개 또는 3개의 혼합물일 수 있다. 상기 비-인산염 전구체는 적혈구의 내부 및/또는 외부에 존재할 수 있다. 상기 비-인산염 전구체의 존재는 상기 비-인산염 전구체의 부재하에서보다 훨씬 더 높은 적혈구-내 PLP 수준에 도달할 가능성을 제공한다.

하나의 실시양태로, 상기 조성물이 메티오니나제를 캡슐화하는 적혈구와 추가로 PLP 및 이의 인산염 전구체인, PNP, PLP 및/또는 PMP 중 하나를 포함한다. 비로 위에 기재된 바와 같은, 상기 조성물이 유리하게는, 비-인산염 전구체, 주로 PN을 추가로 포함할 수 있다.

상기 조성물 또는 현탁액이 유리하게는, 일정량의 적혈구와 결정된 메티오니나제의 투여량을 환자에게 운반하기에 충분한 양의 캡슐화된 메티오니나제를 포함한다.

따라서, 본 조성물은 메티오니나제와 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여하기 위한 PLP 또는 PLP 전구체를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시양태로, 상기 조성물이 적혈구 내부에 캡슐화된 메티오니나제와 별도 또는 순차적 투여를 위한 PLP의 비-인산염 전구체를 포함한다.

하나의 실시양태에 따라서, 상기 조성물이 (i) 적혈구와 제약상 허용되는 비히클 (적혈구는 메티오니나제를 캡슐화한다)의 제제, 및 (2i) 비-인산염 형태, 바람직하게는 PN인 비타민 B6와 제약상 허용되는 비히클의 제제를 포함한다. 이들 제제는 동시, 별도 또는 순차적 투여를 위한 것이며, 본 발명에 따르는 메티오닌 고갈에 전용된다. 이후 제시되는 사용 방법은 최선의 투여 방식을 자세하게 설명할 것이다. 상기 조성물은 주로, 이들 제제를 별도로 포함하는, 세트 또는 키트의 형태로 존재할 수 있다. 하나의 실시양태에 따라서, 적혈구의 제제 중 제약상 허용되는 비히클은 적혈구에 대한 ≪보존 용액(preservation solution)≫, 즉, 활성 성분을 캡슐화하는 적혈구가 이들이 주사될 때까지 대기하는 동안 보존하기에 적합한 이들의 형태로 현탁되어 있는 용액이다. 보존 용액이 바람직하게는, 적혈구의 보존을 증진시키는 물질, 주로 글루코오스, 덱스트로오스, 아데닌 및 만니톨로부터 선택되는 물질 중 적어도 1개를 포함한다. 가능하게는, 상기 보존 용액이 적혈구-내 PLP-포스파타제 효소가 억제되도록 하는 무기 인산염을 포함한다.

하나의 실시양태로, 적혈구 내부에 캡슐화된 메티오니나제가 적혈구 내부에 캡슐화된 아스파라기나제를 투여하기 전에 적어도 1회, 바람직하게는 적어도 2회 투여되며, 각각의 메티오나제 투여에 이어 아스파라기나제가 투여되기 전 PLP의 비-인산염 전구체의 용액이 투여된다.

MGL 활성은 IU로 표시되며 이는 다음과 같은 조건 하에서 분당 암모니아 1 마이크로몰을 방출시키는데 요구되는 MGL의 양에 상응한다.

이의 보조인자 PLP의 존재하에서, MGL은 L-메티오닌을 알파-케토부티르산으로 가수분해하여, L-메티오닌 분자 당 암모늄 분자 1개를 형성시킨다:

L-메티오닌 + H₂O

메탄티올 + NH₄ ⁺ + 알파-케토부티르산

MGL 활성의 투약은 37°C, pH=8.6에서, 0.26 μg/mL의 MGL, 20nM의 PLP 및 25mM의 L-메티오닌의 존재하에서 수행되며, 상업적으로 입수가능한 테스트가 사용될 수 있다 (예를 들면, NH₃ 키트, Roche diagnostics).

이 방법은 MGL의 최대 활성(Vmax)에 도달될 때, 반응 5분 내지 10분 사이의 암모늄 생산의 동역학을 측정하는데 있다. 암모늄 생산의 측정치는 다음과 같이, 암모늄과 알파-케토글루타르산의 존재하에서 글루타메이트 데스하이드로게나제 (GLDH)에 의해 NADPH가 NADP⁺로 산화되는데 기인한 340nm의 광학 밀도에서의 변화량을 측정함으로써 수득된다:

알파-케토글루타르산 + NH4⁺ + NADPH

L-글루탐산 + NADP⁺ + H₂O.

아스파라기나제

아스파라기나제 자체는 CAS 번호: 9015-68-3로 표시된다. 이의 통상적인 명칭은 아스파라기나제이며; 이에 대해 다른 통상명은: 콜라스파제(colaspase), L-아스파라기나제 및 L-아스파라긴 아미노하이드롤라제이다.

본 발명의 의미에 있어서 용어 아스파라기나제는 임의의 기원의 아스파라기나제를 포괄하며, 이는 특히 천연 또는 재조합 기원의 것, 및 예를 들어, PEG화된 또는 PEG 형태 (PEG-아스파라기나제)와 같은, 아스파라기나제를 포함하는 임의의 유도체, 또는 L-아스파라기나제의 활성을 보유하는 단편일 수 있다. 이는 또한 어떤 세균 기원이든 아스파라기나제를 포괄한다. 따라서, 아스파라기나제는 E. coli 타입, 특히 E. coli HAP-A-1-3, 에르위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi) 타입 또는 볼리넬라 숙시노게네스(Wolinella succinogenes) 타입의 것일 수 있다. "타입"은 당해 세균의 컬쳐로부터 수득될 수 있는 것 또는 재조합된 것, 다시 말해서 유전자 조작으로 수득된 세균의 아스파라기나제의 형태일 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 바람직한 실행 방식에서, 이는 E. coli HAP-A-1-3 타입의 것이다.

본 발명에서는 상업적 제품이 입수가능하고 이용될 수 있다: 5000 U Medac, 10000 U Medac®, Oncaspar®. 상기 제품은 주사용 액체 또는 물에 사용전에 용해시키는 분말 형태이다. 인산이수소나트륨 1H₂O, 인산일수소나트륨 7H₂O 및/또는 염화나트륨과 같은 부형제가 존재할 수 있다.

상기 용어 아스파라기나제는 또한 본 발명의 의미에서 L-아스파라긴 아미노하이드롤라제 활성을 가지는 세균성 효소인 아스파라기나제-유사 물질을 포괄한다. 일례로, 아시네토박터 글루타미나제 아스파라기나제 (AGA)가 인용될 수 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따라서, 아스파라기나제가 적혈구내에 캡슐화되며 상기 조성물 또는 현탁액이 유리하게는 일정량의 적혈구와 결정된 아스파라기나제의 투여량을 환자에게 운반하기에 충분한 양의 캡슐화된 아스파라기나제를 포함한다.

1 IU의 아스파라기나제는 통상적으로 pH 7.3 및 37℃에서 L-아스파라긴으로부터 분당 1μmol의 암모니아를 방출시키는데 필요한 효소의 양으로 정의되며, L-아스파라기나제의 양은 과량이다.

적혈구내로의 캡슐화

하나의 실시양태에 따라서, 메티오니나제의 조성물 및/또는 아스파라기나제의 조성물은 상기 효소를 캡슐화하는 적혈구와 제약상 허용되는 비히클을 포함한다. 바람직하게는, 상기 적혈구가 치료되는 개체보다는 동일한 종의 포유동물로부터의 기원하는 것이다. 상기 포유동물이 인간일 경우, 상기 적혈구가 바람직하게는 인간 기원의 것이다. 하나의 실시양태로, 상기 적혈구가 환자 자신으로부터의 것이다.

하나의 실시양태에 따라서, 상기 제약상 허용되는 비히클이 적혈구에 대한 ≪보존 용액≫ 으로, 즉, 효소를 캡슐화하는 적혈구가 이들이 주사될 때까지 대기하는 동안 보관되기에 적합한 이들의 형태로 현탁되어 있는 용액이다. 보존 용액이 바람직하게는, 적혈구의 보존을 증진시키는 물질, 주로 글루코오스, 덱스트로오스, 아데닌 및 만니톨로부터 선택되는 물질 중 적어도 1개를 포함한다.

상기 보존 용액은 NaCl, 아데닌과, 글루코오스, 덱스트로오스 및 만니톨로부터의 화합물 중 적어도 1개를 포함하는 수용액일 수 있다.

상기 보존 용액이 NaCl, 아데닌 및 덱스트로오스, 바람직하게는, AS3 배지를 포함할 수 있다.

상기 보존 용액이 NaCl, 아데닌, 글루코오스 및 만니톨, 바람직하게는, SAG-만니톨 또는 ADsol 배지를 포함할 수 있다.

특히, 보존 용액 중, 조성물 또는 현탁액은 2 내지 8℃ 사이의 온도에서 72시간 보존시 세포외 헤모글로빈 수준이 0.5, 특히 0.3, 주로 0.2, 바람직하게는 0.15, 더욱 좋게는 0.1 g/㎗ 이하의 수준으로 유지됨을 특징으로 한다.

특히, 보존 용액 중, 조성물 또는 현탁액은 2 내지 8℃ 사이의 온도에서 24시간 내지 20일, 주로 24시간 내지 72시간 사이의 기간 동안 보존시 세포외 헤모글로빈 수준이 0.5, 특히 0.3, 주로 0.2, 바람직하게는 0.15, 더욱 좋게는 0.1 g/㎗ 이하의 수준으로 유지됨을 특징으로 한다.

세포외 헤모글로빈 수준은 문헌: G. B. Blakney and A. J. Dinwoodie, Clin. Biochem. 8, 96-102, 1975에 기재되어 있는 매뉴얼 기준 방법으로 측정하는 것이 유리하다. 자동 장치가 또한 있으며 이는 이들에 특이적인 감응성으로 측정될 수 있도록 한다.

특히, 보존 용액 중, 조성물 또는 현탁액은 2 내지 8℃ 사이의 온도에서 72시간 보존시 용혈율이 2, 주로 1.5, 바람직하게는 1% 이하로 유지됨을 특징으로 한다.

특히, 보존 용액 중, 조성물 또는 현탁액은 2 내지 8℃ 사이의 온도에서 24시간 내지 20일, 주로 24시간 내지 72시간 사이의 기간 동안 용혈율이 2, 주로 1.5, 바람직하게는 1% 이하로 유지됨을 특징으로 한다.

캡슐화 방법

효소를 적혈구내로 캡슐화하는 것은 적혈구 현탁액을 저장성(hypotonic) 액체 매질과 접촉시켜 적혈구 막에 기공의 개구부를 생성시키는 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 용해-재밀봉 (lysis-resealing) 기법에 3종의 대안법이 있으며, 이들은 저장성 투석법, 저장성 프리스웰링법 (hypotonic preswelling) 및 저장성 희석법으로, 모두 적혈구의 내부와 외부 사이의 삼투압에서의 차를 기본으로 한다. 저장성 투석법이 바람직하다.

효소를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액은 주로 다음과 같은 방법으로 수득할수 있다:

1 - 적혈구용적율 수준이 65% 이상인 저장성 용액에 적혈구 펠릿을 현탁시키고, +1 내지 +8℃ 사이로 냉각시킴;

2 - +1 내지 +8℃ 사이로 유지되는 온도에서 용해(lysis) 공정, 적혈구용적율 수준이 65% 이상인 적혈구의 현탁액과 +1 내지 +8℃ 사이의 온도로 냉각된 저장성 용해액을, 코일 또는 투석 카트리지와 같은 투석 장치 (카트리지가 바람직하다)에 통과시킴을 특징으로 함;

3 - 용해 전 또는 중에, +1 내지 +8℃ 사이에서 유지되는 온도에서 캡슐화시키고자 하는 효소 (주로 상기 제조된 용액 중)를 상기 현탁액에 첨가, 바람직하게는 점진적으로 첨가함으로써 캡슐화시키는 공정; 및

4 - 등장성 또는 고장성(hypertonic), 유리하게는 고장성 용액의 존재하에, 더 높은 온도, 주로 +30 내지 +42℃ 사이의 온도에서 수행되는 재밀봉 공정.

바람직한 대안으로, WO-A-2006/016247 (EP 1 773　452; 이는 본원에서 참고로 인용된다)에 기재된 방법을 사용하여 수행될 수 있다:

1 - 적혈구 펠릿을 등장성 용액에 적혈구용적율 수준 65% 이상으로 현탁시키고, +1 내지 +8℃ 사이로 냉각시킴;

2 - 이와 동일한 펠릿으로부터의 적혈구 샘플로부터 삼투압취약성을 측정;

3 - +1 내지 +8℃ 사이에서 유지되는 온도에서 용해(lysis) 공정, 적혈구용적율 수준이 65% 이상인 적혈구의 현탁액과 +1 내지 +8℃ 사이의 온도로 냉각된 저장성 용해액을, 코일 또는 투석 카트리지와 같은 투석 장치 (카트리지가 바람직하다)에 통과시킴을 특징으로 함; 용해 파라미터는 상기 측정한 삼투압취약성에 따라서 조절하며; 주로, 상기 측정된 삼투압취약성에 따라서, 투석 장치를 통과하는 적혈구 현탁액의 흐름을 조절하거나 용해액의 삼투압몰농도(osmolarity)를 조절함; 및

4 - 용해 전 또는 중에, +1 내지 +8℃ 사이에서 유지되는 온도에서 캡슐화시키고자 하는 효소 (주로 상기 제조된 용액 중)를 상기 현탁액에 첨가, 바람직하게는 점진적으로 첨가함으로써 캡슐화시키는 공정; 및

5 - 등장성 또는 고장성, 유리하게는 고장성 용액의 존재하에, 더 높은 온도, 주로 +30 내지 +42℃ 사이의 온도에서 수행되는 재밀봉 공정.

주로, 투석의 경우, 적혈구 펠릿을 65% 이상, 바람직하게는 70% 이상인, 높은 적혈구용적율 수준을 갖는 등장성 용액에 현탁시키고, 상기 현탁액을 +1 내지 +8℃ 사이, 바람직하게는 +2 내지 +6℃ 사이, 전형적으로 대략 +4℃로 냉각시킨다. 특정 방법에 따라서, 적혈구용적율 수준이 65 내지 80%, 바람직하게는 70 내지 80% 사이임을 특징으로 한다.

삼투압취약성을 측정할 때, 이는 용해 단계 직전의 적혈구에 대해, 캡슐화시키고자 하는 효소의 존재 또는 부재하에서, 바람직하게는 존재하에서 측정하는 것이 유리하다. 적혈구 또는 이를 함유하는 현탁액은 용해를 위하여 선택된 온도에 가까운 온도, 또는 이와 동일한 온도인 것이 유리하다. 본 발명의 다른 유리한 특징에 따라서, 삼투압취약성에 대해 수행된 상기 측정치를 신속하게 이용하는데, 즉, 용해 공정은 시료를 채취한 후 단시간내에 수행한다. 바람직하게는, 시료채취와 용해 개시 사이의 지연 시간은 30분 이하, 더욱 좋게는 25분 이하, 심지어 20분 까지이다.

삼투압취약성을 측정하고 이를 고려한 용해-재밀봉 공정을 수행하는 방법에 대한 더욱 상세한 내용에 대해서 당해 분야의 숙련가는 WO-A-2006/016247를 언급할 수 있다. 이 문헌은 본원에서 참고로 인용된다.

상기 캡슐화 기법의 개량법이 WO 2014/180897에 기재되어 있으며, 이에 대해 당해 분야의 숙련가가 언급할 수 있으며 이는 본원에서 참고로 인용된다. 따라서, 하나의 실시양태에 따라서, 효소를 캡슐화하는 적혈구는 용해-재밀봉법에 의해 활성 성분을 적혈구 내부에 캡슐화하는 단계, 효소가 포함되어 있는 적혈구를 포함하는 현탁액 또는 펠릿과 삼투압몰농도가 280 mOsmol/kg 이상, 특히 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg 사이, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg 사이인 용액을 수득하는 단계, 상기 펠릿 또는 현탁액을 그대로 또는 배양 용액 (incubation solution)을 280 mOsmol/kg 이상, 특히 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg 사이, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg 사이의 삼투압몰농도로 첨가 후 배양시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다. 배양은 주로 30분 이상, 특히 1시간 이상의 기간 동안 수행된다. 이어서, 상기 배양된 용액의 액체 매질을 제거하고 현탁액이 환자에게 주사되도록, 수득한 적혈구를 용액에 현탁시키는데, 상기 현탁액이 환자에게 주사되도록 하는 보존 용액이 바람직하다. 상기 표시된 삼투압몰농도는 적혈구가 현탁되어 있는 용액 또는 관련 순간의 펠릿의 것이다.

≪ 안정화된 적혈구 현탁액 ≫ 이란, 주로, 적혈구 현탁액이 인간에 사용될 때까지 세포외 헤모글로빈이 0.2 g/㎗ 이하로 남아있는 세포외 헤모글로빈 함량을 갖는 현탁액을 의미하며, 나중의 것은 활성 성분을 포함하는 적혈구 배치(batch)를 생산한 후 주로 1시간부터 72시간까지 사이(intervening)를 둘 수 있다.

≪ 즉시-사용 안정화된 적혈구 현탁액 ≫ 이란, 환자에게 주사되도록 하는 용액, 주로 보존 용액 중에 안정화된 현탁액을 의미한다. 이의 적혈구용적율은 일반적으로 35%, 40% or 45% 이상이다.

≪ 적혈구 펠릿 ≫ 이란, 적혈구를 미리 현탁시킨 액체 매질의 적혈구를 분리시킨 후 수집된 적혈구의 농축물 또는 농도를 의미한다. 상기 분리는 여과에 의해 또는 원심분리에 의해 확실해질 수 있다. 원심분리는 그러한 분리를 위하여 일반적으로 사용되는 수단이다. 펠릿은 특정 비율의 액체 매질을 포함한다. 일반적으로, 상기 펠릿의 적혈구용적율은 70 내지 85% 사이이다.

≪ 배양 용액 ≫ 이란, 활성 성분을 캡슐화하는 적혈구가 배양 단계 중에 존재하는 용액을 의미한다. 상기 배양은 큰 범위의 적혈구용적율, 주로 10 내지 85%의 적혈구용적율에 걸쳐서 수행될 수 있다.

≪ 취약한(fragile) 적혈구 ≫ 란, 포함 공정(incorporation procedure)으로부터 나오는 적혈구를 의미하는 것으로, 이는 일단 보존 용액에 현탁되며, 현탁액을 2 내지 8℃ 사이에서 보존할 때, 주로 1 내지 72시간 후 동결될 수 있다.

≪ 초기 적혈구용적율 ≫ 이란, 배양 중 취약한 적혈구의 용해에 기인한 세포 소실 전의 적혈구용적율을 의미한다.

상기 방법은 주로 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다:

(a) 효소를 적혈구 내부에 캡슐화하는 단계, 이는 적혈구를 저장성 매질과 접촉시키는 단계 (적혈구 막에 기공이 열리도록 한다), 활성 성분과 접촉시키는 단계 (활성 성분이 적혈구에 들어가도록 하기 위함), 주로 등장성 또는 고장성 매질, 유리하게는 고장성 매질을 사용하여 적혈구를 재밀봉시키는 단계를 포함함,

(b) 효소를 포함하고 있는 적혈구를 포함하는 현탁액 또는 펠릿과 삼투압몰농도가 280 mOsmol/kg 이상, 특히 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg 사이, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg 사이인 용액을 수득하거나 제조하는 단계,

(c) 상기 단계(b)의 펠릿 또는 현탁액을 그대로 또는 배양 용액을 280 mOsmol/kg 이상, 특히 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg 사이, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg 사이의 삼투압몰농도로 첨가 후, 30분 이상, 주로 1시간 이상의 기간 동안 배양하는 단계,

(d) 단계(c)의 배양된 현탁액의 액체 매질을 제거하는 단계,

(e) 단계(d)하에 수득한 적혈구를 현탁액이 환자에게 주사되도록 하는 용액, 바람직하게는 현탁액이 환자에게 주사되도록 하는 보존 용액에 현탁시키는 단계.

첫번째 방법에 따라서, 용해-재밀봉, 주로 단계 (b)에 의한 캡슐화 이후의 단계는 용해-재밀봉 단계 또는 단계 (a)에서 수득한 현탁액 또는 펠릿을 280 mOsmol/kg 이상, 특히 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg 사이, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg 사이의 삼투압몰농도로 용액에 희석시킨 다음, 적혈구의 펠릿 또는 현탁액을 수득함으로써, 적어도 1회의 세척 사이클, 바람직하게는 2회 또는 3회의 세척 사이클을 포함한다. 상기 펠릿 또는 상기 현탁액은 효소를 포함하고 있는 적혈구와 삼투압몰농도가 280 mOsmol/kg 이상, 특히 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg 사이, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg 사이인 용액을 포함한다. 이어서, 다음 단계, 예를 들면, (c), (d) 및 (e)가 도입된다.

두번째 방법에 따라서, 용해-재밀봉 단계 또는 단계(a)에서, 등장성 또는 고장성 매질을 사용하여 적혈구를 재밀봉함으로써 적혈구의 현탁액, 예를 들면, 단계 (b)의 현탁액이 생산되는데, 이는 이후 삼투압몰농도가 280 mOsmol/kg 이상, 특히 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg 사이, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg 사이인 용액에서 배양시킬 수 있다. 다시 말해서, 용해-재밀봉 단계 또는 단계 (a)는 효소를 캡슐화하는 현탁된 적혈구가 등장성 또는 고장성 재밀봉 용액, 유리하게는 고장성 용액과 혼합되어 있는 적혈구를 재밀봉하여, 삼투압몰농도가 280 mOsmol/kg 이상, 특히 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg 사이, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg 사이인 적혈구의 현탁액을 생산하는 단계를 포함한다. 이 방법에서, 배양 단계 또는 단계(c)는 상기 재밀봉 단계로부터 나오는 현탁액을 배양시키는 것이다. 상기 배양 단계는 30분 이상, 주로 1시간 이상의 기간 동안 수행된다. 이어서, 다음 단계, 예를 들면, (d) 및 (e)가 도입된다.

상기 용해-재밀봉 단계 이후의 단계, 예를 드면, (b) 내지 (e)를 취약한 적혈구, 또는 이들 중 대부분을, 주로 50, 60, 70, 80 또는 90% 이상 용해시키는 조건하에서 수행한다. 이를 수행하기 위하여, 배양 기간, 배양 온도 및 적혈구가 현탁되어 있는 용액의 삼투압몰농도에 대해 조치를 취할 수 있다. 삼투압몰농도가 더 높으면 높을수록, 배양 시간이 더 길어질 수 있다. 따라서, 동일한 효과를 수득하기 위해서는, 삼투압몰농도가 더 낮을수록 , 배양은 더 짧아질 수 있다. 또한, 온도가 더 높을수록, 배양 시간이 더 짧아질 수 있으며, 역으로도 가능하다. 이어서 1회 또는 수회의 세척 사이클에 의해 세포 부스러기와 세포외 헤모글로빈, 뿐만 아니라 세포외 효소가 제거될 것이다.

본 발명에 따라서, 세척 사이클은 적혈구의 현탁액 또는 펠릿의 희석, 및 이어서 적혈구와 세척액 분리를 포함한다. 바람직하게는, 세척 단계가 2회 또는 3회의 희석-분리 사이클을 포함하는 것이 바람직하다. 분리는 임의의 적합한 수단, 예로서 여과 및 원심분리에 의해 수행될 수 있다. 원심분리가 바람직하다.

배양은 현탁액의 적혈구용적율에 의해 제한되지 않는다. 이 방법에서는, 초기 적혈구용적율이 일반적으로 10 내지 85%, 주로 40 내지 80%인 현탁액이 배양될 수 있다. 이는 더 정확하게 70%로부터의 펠릿 및 이 값 이하의 현탁액으로 불리워진다.

상기 제거 단계 또는 단계 (d)는 상기 현탁액 또는 상기 배양된 펠릿의 액체 부분을 제거하여, 주로 세포 부스러기와 세포외 헤모글로빈, 뿐만 아니라 결과적으로 세포외 효소를 제거하는 것을 목적으로 한다.

상기 제거 단계 또는 단계 (d)에 대한 첫번째 방법에 따라서, 분리, 주로 원심분리가 수행되며, 이는 주로 현탁액에 적용될 수 있다. 상기 분리에 이어서 등장성 용액에 희석시킨 다음, 분리, 주로 원심분리에 의한 분리에 의해, 1회 또는 수회, 예를 들면, 2회 또는 3회의 세척 사이클이 뒤따를 수 있다.

상기 제거 단계 또는 단계 (d)에 대한 두번째 방법에 따라서, 분리, 주로 원심분리 단계 전에 희석 단계가 수행되며, 이는 현탁액 또는 펠릿에 적용될 수 있다. 상기 희석은 주로 등장성 세척액 또는 보존 용액을 사용하여 수행될 수 있다.

최종 단계 또는 단계 (e)는 임의의 다른 처리를 하지 않고, 환자에게 투여될 수 있도록 최종 현탁액을 제조하는 것이다.

상기 단계에 대한 첫번째 방법에 따라서, 상기 제거 단계 또는 단계 (d)로부터의 적혈구 펠릿의 희석은 주사용액, 주로 보존 용액을 사용하여 수행된다.

상기 단계에 대한 두번째 방법에 따라서, 상기 제거 단계 또는 단계 (d)로부터 발생하는 적혈구 펠릿을 세척하기 위한 1회 또는 수회의 사이클이 주사 용액, 주로 보존 용액을 사용하여, 희석에 이어 분리시킴으로써 수행된다. 세척 후, 적혈구를 주사 용액, 주로 보존 용액에 다시 현탁시킨다.

본 발명의 방법은 또한, 하기 특징 중 1개, 수개 또는 전부를 포함할 수 있다:

- 배양 단계 또는 단계 (c)는 취약한 적혈구가 확실히 용해되기에 충분한 시간에 걸쳐서, 약 2 내지 약 39℃ 사이의 온도에서 수행한다;

- 배양 단계 또는 단계 (c)는 저온, 주로 약 2 내지 약 10℃ 사이, 특히 약 2 내지 약 8℃ 사이의 온도에서 수행하고, 약 1시간 내지 약 72시간, 주로 약 6시간 내지 약 48시간, 바람직하게는 약 19시간 내지 약 30시간 동안 지속한다;

- 배양 단계 또는 단계 (c)는 약 20 내지 약 39℃ 사이의 더 높은 온도, 주로 실온 (25℃ ± 5℃)에서 수행하고 약 30분 내지 약 10시간, 주로 약 1시간 내지 약 6시간, 바람직하게는 약 2시간 내지 약 4시간 동안 지속하고; 심지어 실온보다 더 높은 온도에서 수행될 수 있지만, 이는 세포 수율, P50 및/또는 2,3-DPG 함량에 네가티브 영향을 줄 수 있다;

- 배양 단계 또는 단계 (c)에서, 현탁액의 적혈구용적율은 10 내지 85% 사이, 주로 40 내지 80% 사이에 있다; 적혈구용적율이 70 내지 약 85% 사이인, 분리 단계로부터의 펠릿, 또는 적혈구용적율이 약 40 내지 70% 사이인, 희석된 펠릿을 배양시킬 수 있다;

- 배양 단계는 현탁액의 교반 단계를 포함한다;

- 배양 단계는 어떠한 교반도 포함하지 않는다;

- 세척 및/또는 배양용 용액으로서, 목적하는 삼투압몰농도를 얻기 위하여 계량된 NaCl 수용액이 사용된다; 따라서, 일례로서, 용액이 NaCl을 0.9% 포함할 수 있다; 이 용액은 또한 NaCl 외에 주로, 글루코오스, 주로 글루코오스 일수화물, 인산일나트륨 이수화물, 인산이나트륨 십이수화물을 포함할 수 있다; 일례로서, 조성물이 0.9%의 NaCl, 0.2%의 글루코오스 일수화물, 0.034%의 인산일나트륨 이수화물, 0.2%의 인산이나트륨 십이수화물을 포함한다;

- 최종 단계 또는 단계 (e)에서의 세척은 보존 용액을 사용하여 수행된다;

- 즉시-사용 현탁액 또는 환자에게 주사될 수 있는 용액 (액체 부분)의 삼투압몰농도는 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg 사이, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg 사이이다;

- 즉시-사용 또는 환자에게 주사될 수 있는 현탁액의 적혈구용적율은 35%, 40% 또는 45% 이상이다;

- 세척, 배양을 위한 모든 단계는 보존 용액을 사용하여 수행한다;

- 단계 (b)의 세척 용액 및/또는 단계 (e)의 세척 용액 및 보존 용액은 동일한 조성을 가지며 적혈구의 보존을 증진하는 화합물(들)을 포함한다;

- 보존 용액 (및 필요에 따라 세척 용액(들) 또는 배양 용액)은 NaCl, 아데닌과, 글루코오스, 덱스트로오스 및 만니톨로부터의 화합물 적어도 1종을 포함하는 수용액이다;

- 보존 용액 (및 필요에 따라 세척 용액(들) 또는 배양 용액)은 NaCl, 아데닌 및 덱스트로오스, 바람직하게는 AS3 배지를 포함한다;

- 보존 용액 (및 필요에 따라 세척 용액(들) 또는 배양 용액)은 NaCl, 아데닌, 글루코오스 및 만니톨, 바람직하게는 SAG-만니톨 또는 ADsol 배지를 포함한다.

본 발명에 따르는 방법은 주로 다음 단계를 포함한다:

(a) 효소를 적혈구 내부에 캡슐화하는 단계로, 이는 적혈구의 막에 기공이 열리도록 하는 저장성 매질과 접촉시키는 단계, 효소가 적혈구 안으로 들어갈 수 있도록 효소와 접촉시키는 단계, 등장성 또는 고장성 매질을 사용하여 적혈구를 재밀봉시키는 단계를 포함한다. 효소의 용해 전에 효소가 적혈구의 현탁액에 존재할 수 있거나, 추가로 용해 전 또는 용해 후, 하지만 항상 재밀봉 전에 첨가될 수 있음을 알아야 한다. 상기 단계 (a)의 하나의 실시양태로, 상기 방법이 다음과 같은 서브(sub)-단계를 포함한다:

(a1) 적혈구 현탁액의 적혈구용적율이 60 또는 65% 이상이 되도록 하는 단계,

(a2) 상기 현탁액 중 적혈구의 삼투압취약성을 측정하는 단계,

(a3) 활성 성분(들)을 용해시키고 내재화시키기 위한 공정, 이는 적혈구 현탁액을 투석 장치, 주로 투석 키트리지에 용해 용액과 반대로 통과시키고, (a2)하에서 측정된 삼투압취약성에 따라서, 적혈구 현탁액의 흐름을 조절하거나 용해 용액의 유속을 조절하거나 용해 용액의 삼투압몰농도를 조절하는 것을 포함함,

(a4) 적혈구를 재밀봉하기 위한 공정.

사용 방법

첫번째 양태로, 본 발명은 치료를 필요로 하는 포유동물에서 암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 포유동물로부터 메티오닌을 박탈한 다음, 포유동물로부터 아스파라긴을, 특히 충분한 양의 아스파라기나제의 투여를 통하여 박탈함을 특징으로 한다. 추구하는 것은 암세포가 이용할 수 있는 메티오닌과 아스파라긴의 양을 감소시키는 것이다. 메티오닌 박탈은 상기 언급한 바와 같이 식이적 메티오닌 박탈 및/또는 메티오니나제 투여를 통하여 수행될 수 있다.

두번째 양태로, 본 발명은 치료를 필요로 하는 포유동물에서 암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 치료를 필요로 하는 포유동물에게, 메티오니나제를 포함하는 조성물, 이어서 아스파라기나제를 함유하는 조성물을 투여, 특히 주사함을 특징으로 한다.

순차적 투여, 메티오닌 박탈 및/또는 메티오니나제 투여와 아스파라기나제 투여 사이의 지연기간, 복용량, 반복식 투여 및 제약 조성물의 형태 (효소를 캡슐화하는 적혈구(RBCs)의 유리 형태, PEG화된 형태 및/또는 현탁액)는 상기에서 상세하게 설명되었으며 사용 방법에도 적용된다.

하나의 실시양태로, 메티오니나제 (유리 형태, PEG화된 형태 또는 캡슐화된 것)를 1회 이상 투여한다.

다른 실시양태로, 유리 또는 PEG화된 메티오니나제를 아스파라기나제 투여 전에 1회 이상 투여하며, 예를 들면 2회 이상 (예, 3회, 4회, 5회) 투여량의 메티오니나제를 포유동물에게, 전형적으로는 다른 날, 예를 들면 매일 투여한다.

하나의 실시양태로, 유효량의, 메티오니나제의 보조인자를 환자에게 투여한다. 이는 메티오니나제 투여 전, 동시에 또는 후에 투여할 수 있다. 하나의 실시양태로, 메티오니나제를 제외한 동일 조성물로 존재한다. 다른 실시양태로, 이는 별개의 조성물로 투여된다.

하나의 실시양태로, 적혈구 내에 캡슐화되어 있는 메티오니나제가 투여되며, 보조인자도 캡슐화될 수 있거나 보조인자가 용액 중에 유리 형태로 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태로, 상기 보조인자가 제약상 허용되는 비히클 중의 용액에 존재하며 비타민 B6의 비-인산염 형태, 바람직하게는 PN이다. 비-인산염 형태의 비타민 B6의 상기 용액은 주사 또는 경구적 경로에 의해, 또는 임의의 다른 경로를 통하여 투여될 수 있다. 하나의 실시양태로, 상기 용액이 캡슐화된 메티오니나제의 각 주사 후, 예를 들면 1 내지 10시간 후 1회 이상 투여한다. 바람직하게는, 상기 용액을 메티오니나제 치료 중 또는 혈류내 메티오니나제 활성의 지속기간중에 (이의 반감기에 따라), 일일 1회, 또는 달리 일일 2회 이상 투여하는 것이 유리하다. 적혈구 내부에 캡슐화되어 있는 메티오니나제의 경우, 용액 중의 보조인자는 10 내지 30일간의 기간 중 적어도 일일 1회 투여될 수 있다.

하나의 실시양태로, 유리 형태, PEG화된 형태 또는 캡슐화된 형태 하의 아스파라기나제를 1회 이상 투여한다.

다른 실시양태로, 유리 또는 PEG화된 아스파라기나제를 1회 이상 투여하는데, 예를 들면, 2회 이상 (예, 3회, 4회, 5회) 투여량의 아스파라기나제를 포유동물에게, 전형적으로 다른 날에, 예를 들면, 매일 투여한다.

하나의 실시양태로, 메티오니나제 및/또는 아스파라기나제가 분말 형태이며 사용 방법은 포유동물에게 투여하기 전 제약상 허용되는 용액 또는 액체에 이를 가용화시킴을 특징으로 한다.

하나의 실시양태로, 상기 기재된 바와 같은 장치를 사용한다. 따라서, 암 치료 방법은 포유동물, 특히 인간에 상기 기재된 바와 같은 장치를 이식하거나 배치하는 것을 특징으로 한다. 상기 이식 또는 배치는 혈관 또는 카테테르 등 이미 있던 자리에 연결하는 것을 포함할 수 있다. 이어서, 이 방법은 본 발명의 방법에 따라서 장치의 소프트웨어의 프로그램에 따라 순차적 운반을 위하여 장치를 작동개시하는 것을 포함할 수 있다.

유리하게는, 보존 용액 중 메티오니나제 또는 아스파라기나제를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액이 특히 FDA 권고사항에 따르는, 낮은 세포외 헤모글로빈 수준을 가질 수 있다.

첫번째 실시양태로, 포유동물, 특히 인간 환자에게 주사 전 1 내지 72시간 사이, 특히 10 내지 72시간 사이에 제조된 활성 성분을 캡슐화하는 RBC의 현탁액을 주사한다. 상기 현탁액의 적혈구용적율은 40% 이상이다. 이는 보존 용액에 포함되어 있다. 세포외 헤모글로빈 수준은 0.5 이하, 특히 0.3 이하, 더욱 특히 0.2 이하, 바람직하게는 0.15 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 g/㎗ 이하이고/이거나 용혈율이 2 이하, 특히 1.5 이하, 바람직하게는 1% 이하이다. 상기 현탁액은 주사 전에 세척 또는 유사한 방법으로 처리하지 않는다.

다른 실시양태로, 이 방법은 포장된 적혈구 세포를 제공하는 단계, 이를 생리적 완충액 중의 현탁액에 60 또는 65% 이상의 적혈구용적율로 넣는 단계, 활성 성분을 이들 RBC에 용해와 재밀봉 공정을 사용하여 캡슐화하는 단계, 수득한 RBC를 배양하는 단계, 이를 세척하는 단계 및 RBC의 최종 현탁액을 수집하는 단계를 포함한다. 상기 현탁액의 적혈구용적율은 40% 이상이다. 이는 보존 용액에 포함되어 있다. 상기 현탁액은 2 내지 8℃ 사이의 온도에서 보관한다. 상기 최종 현탁액을 포유동물, 특히 인간 환자에게 현탁액 제조 후 1시간 내지 72시간 사이, 바람직하게는 24시간 내지 72시간 사이에 주사한다. 상기 현탁액의 세포외 헤모글로빈 수준은 0.5 이하, 특히 0.3 이하, 더욱 특히 0.2 이하, 바람직하게는 0.15 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 g/㎗ 이하이고/이거나 이의 용혈율은 2 이하, 특히 1.5 이하, 바람직하게는 1% 이하이다. 상기 현탁액은 주사 전에 세척 또는 유사한 방법으로 처리하지 않는다.

조성물, 키트 및 방법은 아스파라긴 및/또는 메티오니나제에 대한 영양요구성 액체(혈액학적) 및 고형 종양의 치료를 목적으로 한다. 예로서, 백혈병 (급성 골수성 백혈병, 급성 전-골수성 백혈병) 및 위암 (암종 단계 IV, 선종)을 언급할 수 있다.

이제, 본 발명은 하기와 같은 비-제한 실시양태를 사용하여 추가로 상세하게 설명될 것이다.

실시예 1

I. 약어

CCK-8: 세포 계수 키트-8

DPBS: 듈베코의 인산염-완충된 염수(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)

IMDM: 이스코프의 개량된 듈베코(Iscove's Modified Dulbecco's)

MGL: 메티오닌-γ-리아제

v/v: 용적 대 용적

II. 작업 조건

II.1 테스트 아이템

II.1.1 L-아스파라기나제

설명: Medac^®(Germany), E. Coli L-아스파라기나제 10 000 IU

L-아스파라기나제의 농도 하나 (2.53 IU/mL)는 듈베코 인산염 완충된 염수 (DPBS) 1X에서 연속 희석법으로 제조한다. L-아스파라기나제의 농도를 11배 희석하여 0.23 IU/mL (IC50)의 최종 농도를 수득한다.

II.1.2 메티오닌-γ-리아제(MGL)

설명: E. Coli에서 생산된 P. Putida 메티오닌-γ-리아제

MGL의 농도 하나 (2.09 IU/mL)는 듈베코 인산염 완충된 염수 (DPBS) 1X에서 연속 희석법으로 제조한다. MGL의 농도를 11배 희석하여 0.19 IU/mL (IC50)의 최종 농도를 수득한다.

II.2 세포주

II.2.1 설명

명칭: HL-60 세포주

설명: 인간 전-골수성 백혈병 세포주 (현탁액)

공급자 및 참조번호: ATCC, CCL-240

II.2.2 배양 조건

세포를 L-글루타민 배지가 있고 20%(v/v)의 태소 혈청, 100 IU/mL의 페니실린 및 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신이 보충된 IMDM 배지에서 배양시킨다. 서브배양(subculturing)은 PO-CELL-002 및 PO-CELL-005에 따라서 수행한다.

II.2.3 비색 키트(colorimetric kit)

명칭: 세포 계수 키트 Kit-8 (CCK-8)

공급자 및 참조번호: Fluka 96992

원리: CCK-8 시약은 고도의 수용성 테트라졸륨 염WST-8을 포함한다. WST-8은 세포내의 데하이드로게나아제에 의해 환원되어 노란색의 생성물 (포르마잔)을 생산하는데 이는 조직 배양 배지에 가용성이다. 세포내 데하이드로게나아제의 활성에 의해 생성되는 포르마잔 염료의 양은 살아있는 세포의 수에 직접 비례한다.

비색 시험은 PO-CELL-004에 따라서 수행한다.

III. 세포독성 검사

III.1 방법

100 ㎕ 중 15,000개의 세포/웰로 5개의 96개-웰 평저 플레이트에 분배한다. 또한, 2개의 웰에 각 플레이트에 대한 블랭크 대조용 컬쳐 배지를 채운다. 비어있는 모든 웰에 컬쳐 배지를 채워 증발과 응결(condensation)을 최소화한다. 0일째 (D0)에, 10㎕의 IC50 농도의 L-아스파라기나제 또는 MGL을 대응하는 웰에 첨가한다. 대조물 (블랭크 웰과 대조용 플레이트)에는 10㎕의 DPBS 1X를 공급한다. 3일째 (D3)에, 웰로부터 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체한 다음 10㎕의 DPBS 1X 또는 10㎕의 IC50 농도의 L-아스파라기나제 (MGL과 미리 배양시킨 세포의 경우) 또는 MGL (L-아스파라기나제와 미리 배양시킨 세포의 경우)을 대응하는 웰에 첨가한다. 대조물 (블랭크와 포지티브 대조군)에는 10㎕의 DPBS 1X를 공급한다. 이어서, 플레이트를 3일 이상 배양기에서 배양시킨다. 배양 기간 말기에 (D6), 10㎕의 CCK-8 용액을 PO-CELL-004에 따라서 각 웰에 첨가하고 플레이트를 2시간 동안 배양기에서 배양시킨다. 이후, 미세플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서의 광학밀도 (OD)를 측정한다.

III.2 내부 대조(internal controls)

대조는 2중으로 수행한다.

III.2.1 블랭크 웰

CCK-8이 있는 컬쳐 배지에서는 대략 460 nm에서 약간의 자발성 흡광이 일어난다. 이런 배경 흡광은 컬쳐 배지, pH, 배양 시간 및 광에 대한 노출 시간에 따른다. 따라서, 블랭크 웰에 100㎕의 컬쳐 배지와 10㎕의 L-아스파라기나제 또는 MGL 희석제, DPBS 1X를 포함시킨다. 이들 대조군 웰의 평균 흡광을, 세포를 함유하는 다른 웰로부터 뺀다.

III.2.2 생존성 대조 (포지티브 대조군)

HL-60 세포주 (100% 세포 생존성)에 대한 포지티브 대조로서, 세포를 L-아스파라기나제 뿐만 아니라 MGL이 없지만, 10㎕의 희석제 (DPBS 1X)가 들어 있는 컬쳐 배지 (100㎕)에서 배양시킨다.

III.3 세포 생존성 측정

세포가 없는 컬쳐 배지가 블랭크 대조군 (OD 블랭크)을 구성한다. L-아스파라기나제 뿐만 아니라 MGL이 없는 세포는 포지티브 대조군 (생존성 대조군)을 구성한다.

살아있는 세포의 퍼센트는 하기 나타낸 바와 같이 계산한다:

OD_L-aspa+MGL* - OD_Blank / OD_{생존성-대조군**} - OD_Blank×100

* L-아스파라기나제와 MGL로 처리한 세포

** L-아스파라기나제와 MGL로 처리하지 않은 세포

계산은 미세플레이트 판독기를 조정하는 Gen 5 소프트웨어를 통하여 자동적으로 수행된다. 2개의 블랭크 웰의 평균 광학밀도 (OD)는 모든 광학밀도로부터 자동적으로 뺄셈된다. 세포 생존성의 계산은 순차적 처리에 대해 실현된다.

IV. 결과

IV.1 내부 대조

내부 대조는 원시 데이터에 명시되지 않았을 때 적용될 수 있다.

IV.2 L-아스파라기나제 또는 MGL 단독에 대한 IC50 계산

단독 약물 (MGL 또는 L-아스파라기나제)인 경우의 세포 생존성 퍼센트는 약물 조합의 각 실험에서 조절된다.

IV.2.1 L-아스파라기나제와 MGL의 순차적 첨가

L-아스파라기나제와 MGL의 순차적 처리에 의한 실험은 2중 데이터로 1회 수행한다. 모든 품질 대조군 (블랭크 및 포지티브 대조군)이 실험에 채택된다. 세포 생존성% 계산의 세부사항과 그래프식 표현이 하기 표 1과 도 1에 제시된다.

대조군과 효소 포함(association)에 대한 세포 생존성%

	D6에서의 세포 생존성%
	평균	SD
세포 단독	100	25
세포 + IC50 L-aspa D0	34	0
세포 + IC50 MGL D0	27	8
세포 + IC50 L-aspa D0 + IC50 MGL D3	32	15
세포 + IC50 MGL D0 +IC50 L-aspa D3	8	2

결과는 IC50 투여량의 L-아스파라기나제 첨가 전 IC50 투여량의 MGL이 첨가된 효소 포함 (도 1에서 적색)이 다음과 같이 세포 생존성을 감소시킴을 표시한다:- 76%, L-아스파라기나제 (L-아스파라기나제에 대한 IC50 대조군)와 비교,

- 70%, MGL (MGL에 대한 IC50 대조군)과 비교,

- 75%,먼저 IC50 투여량으로 첨가된 L-아스파라기나제를 사용한 효소 포함과 비교.

아직, 역순의 효소 포함은 그러한 결과를 제시하지 않으며, 효소 단독 (대조군)인 경우와 비교할 때 세포 생존성에 대한 상기 포함의 이득이 없다.

V. 결론

순차적인 효소 포함은 세포 사멸율이 IC50 투여량으로 L-아스파라기나제 첨가한지 3일 후 IC50 투여량으로 MGL 첨가시 증가될 수 있음을 증명한다. 아직, 효소 첨가의 역행적 디자인은 그러한 결과가 수득되도록 하지 않았다.

본 발명자들은 MGL 효소 활성에 의해 유도된 Met 박탈은 HL-60 백혈병 세포가 L-아스파라기나제 활성에 더욱 감응성이 되도록 한다고 가설을 세울 수 있다. 또한, L-아스파라기나제와 MGL의 역할은 이들의 알려져 있는 개별 효과를 고려하여 논의되어야 한다. 사실, L-아스파라기나제는 백혈병 세포에서 세포자살을 유도하는 것으로 알려져 있으며 (Ueno et al., 1997), 따라서, 이는 아마도 세포독성제의 역할을 할 수 있을 것이다. 세포 사이클의 S 또는 G2기에 세포 분화를 차단하는 것으로 알려져 있는 MGL은 아마도 세포성장억제제(cytostatic agent)로 더욱 작용할 것이다.

실시예 2: 쥐의 적혈구에 L-아스파라기나제를 캡슐화시키는 방법

L-아스파라기나제 (Medac® E. Coli L-아스파라기나제)를 투석백에서의 저장성 투석법에 의해 쥐의 적혈구(OF1 마우스)에 캡슐화시킨다. 혈액은 미리 원심분리시켜 혈장을 제거한 다음, 0.9% NaCl로 3회 세척한다. 적혈구용적율은 아스파라기나제의 존재하에서 70%로 조절하고, 투석을 시작하기 전에 적혈구 또는 적색혈액 세포(RBC)를 400 IU/mL의 최종 농도로 첨가한다. 투석은 삼투압몰농도가 낮은 용해 완충액에 대해서 4℃에서 50분간 지속한다. 이어서, 높은 삼투압몰농도 용액의 첨가와 37℃에서 30분간의 배양을 통하여 쥐의 적혈구가 방출된다. 0.9% NaCl을 사용하여 2회 세척 및 태소 혈청 알부민 BSA (6%)가 보충된 Sag-만니톨을 사용하여 1회 세척 후, 적혈구의 적혈구용적율이 50%로 조절된다. L-아스파라기나제를 캡슐화하는 적혈구를 L-Aspa RBC로 명명한다. 상기 캡슐화에 의해 적혈구용적율이 50%인 RC mL 당 40 IU의 아스파라기나제의 농도로 L-Aspa RBC가 생성된다.

캡슐화 공정 중, 전혈, 세척된 RBC, L-아스파라기나제와 혼합된 RBC (투석 전) 및 L-아스파라기나제가 부하된 RBC (투석 후)를 하기에 대해 테스트한다:

- 적혈구용적율(Ht)

- 평균 혈구 용적(ACV)

- 평균 혈구 헤모글로빈 농도(ACHC)

- 총 헤모글로빈 농도 및

- 세포 계수(cell count).

L-아스파라기나제 효소 활성의 측정을 위하여 저장성 투석 전 및 후에 상기 세포 현탁액으로부터 분취량을 취한다. L-아스파라기나제의 평가는 문헌: Orsonneau et al., Ann Biol Clin, 62: 568-572에 공개된 프로토콜에 따라서 수행한다.

실시예 3: 인간 적혈구에 L-아스파라기나제를 캡슐화

WO-A-2006/016247에 기재된 방법을 사용하여 L-아스파라기나제를 캡슐화하는 적혈구 배치를 생산한다. WO-A-2006/016247의 교시에 따라서, 삼투압취약성을 고려하고 이에 따라 용해 파라미터를 조절한다 (투석 카트리지에서의 적혈구 현탁액의 유속을 조절한다). 의사 처방에 따라서 상기 방법을 추가로 수행하는데, 환자의 체중과 투여할 L-아스파라기나제의 투여량을 고려한다. 최종 생성물의 사양은 다음과 같다:

- 평균 혈구 용적 (MCV): 70-95 fL

- 평균 혈구 헤모글로빈 농도 (MCHC): 23-35 g/dL

- 세포외 헤모글로빈 ≤ 0.2 g/현탁액 dL

- 삼투압취약성 ≤= 6 g/L의 NaCl

- 평균 혈구 L-아스파라기나제 농도: 78-146 IU/mL

- 세포외 L-아스파라기나제 ≤ 2%의 총 효소 활성

상기 수득된 적혈구 현탁액은 GRASPA®라 불리워지며 문헌에 언급되어 있다.

실시예 4. 메티오닌 감마 리아제(MGL)의 수득 방법 및 특징화

균주의 생산 및 과잉-생산 클론의 단리: 희귀 코돈을 개량하여 Pseudomonas putida (GenBank: D88554.1)의 MGL의 천연 서열을 최적화한다 (P. putida로부터 기원하는 서열을 생산 균주 Escherichia coli에 맞추기 위하여). 번역개시 배경을 개선하기 위하여 다르게 변화시킨다. 마지막으로, 코드화 서열 중 추정되는 세균 프로모터의 일부인 요소 3개 (box -35, box -10 및 56번 위치에서의 전사인자의 결합 부위)를 제거하기 위하여 사일런트 돌연변이를 수행한다. 생산 균주 E. coli HMS174 (DE3)를 상기 최적화된 서열을 포함하는 발현 벡터 pGTPc502_MGL (프로모터 T7)로 형질전환시키고 생산 클론을 선택한다. 상기 생산 클론을 GY 배지 + 0.5% 글루코오스 + 가나마이신에서 6-8시간 (프리-컬쳐 1) 및 16시간 (프리-컬쳐 2) 동안 37℃에서 예비-배양한다.

발효(fermentation): 이어서, GY 배지가 들어 있는 발효기에서, 교반시키며, 프리-컬쳐 2로부터 압력과 pH를 조절하면서 0.02의 광학밀도로 생산한다. 성장기 (37℃에서)는 광학밀도가 10에 도달할 때까지 일어나며 28℃에서 1 mM IPTG를 상기 컬쳐 배지에 첨가함으로써 발현이 유도된다. 2개의 기(phase)에서 유도한지 20시간 후 세포 침전물을 수확하고; 500 kDa 중공섬유에 통과시킨 후 세포액(cell broth)을 5-10배 농축시킨 다음 15900 x g에서 원심분리시켜 세포 펠릿을 회수한 다음 -20℃에 보관한다.

정제: 상기 세포 펠릿을 해동시키고 용해 완충액 (7 v/w)에 현탁시킨다. 용해는 고압 균질화기를 사용하여 3개의 단계 (한 단계는 1000 bar, 이어서 2개의 단계는 600 bar에서)로 10℃에서 수행한다. 이어서, 0.2% PEI를 첨가하고 15900 x g에 10℃에서 원심분리시켜 세포 용액물을 청정화시킨다. 이어서, 20시간에 걸쳐, 6℃에서 황산암모늄 (60% 포화도)으로 침전시키기 전에 0.2㎛로 가용성 분획을 멸균시킨다. 가용화 완충액을 사용하여 재-가용화된 침전물에 대해 2개의 결정화 단계를 수행하는데, 첫번째 결정화 단계는 10% (최종 농도)로 PEG-6000 및 10% 포화도로 황산암모늄을 첨가하여 실행하고, 이어서, 두번째 결정화는 12% 최종 농도로 PEG-6000과 0.2M NaCl (최종 농도)를 첨가하여 30℃에서 수행한다. 15900 x g에서 원심분리시킨 후 MGL 단백질을 함유하는 펠릿을 각 단계에서 수확한다. MGL 단백질을 함유하는 펠릿을 가용화 완충액에 다시 현탁시키고 음이온 교환 크로마토그래피 (DEAE 세파로오스 FF)로 2회 수행하기 전에 0.45 ㎛ 필터에 통과시킨다. 이어서, 상기 정제된 단백질을 연마 단계(polishing step)에 도입시키고 상이한 오염물질 (내독소, HCP 숙주 세포 단백질, 잔여 DNA)을 제거하기 위하여 Q 막 크로마토그래피 캡슐에 통과시킨다. 마지막으로, 상기 정제된 MGL 단백질을 40 mg/mL로 농축시키고 10 kDa 컷-오프 탄젠트 흐름 여과 카세트를 사용하여 제형화 완충액에 투석여과한다. 이어서, 바이알 당 대략 50 mg의 단백질로 물질을 분취하고, 궁극적으로 제어되는 압력과 온도하에서 동결-건조시켜, -80℃에 보관한다.

특징화: 상기 효소의 특이적 활성은 WO 2015/121348에 기재된 바와 같이 상기 생산된 NH₃를 측정함으로써 측정한다. 순도는 SDS-PAGE로 측정한다. 물에 흡수시킨 후 PLP 수준은 WO 2015/121348에 기재된 방법에 따라서 평가한다. 삼투압몰농도는 삼투압계 (Micro-Osmometer Loser Type 15)로 측정한다.

하기 표 2에는 생산된 배치 중 하나의 MGL의 주요 특징이 요약되어 있다:

	P. putida의 MGL
제형	동결-건조 (튜브당 양: 49.2mg) 625㎕의 물에 흡수시킨 후 특징: 78.7 mg/ml, ~622 μM의 PLP, 50 mM의 Na 인산염, pH 7.2, 삼투압몰농도 300 mOsmol/kg
특이적 활성	13.2 IU/mg
순도	>98%

생산 방법의 논의. WO 2015/121348에 기재된 MGL 정제 방법은 특허 EP 0 978 560 B1과 관련 공보 (Takakura et al., Appl Microbiol Biotechnol 2006)에 기재된 방법을 기본으로 확립된 것이다. 이런 선택은 결정화 단계의 단순성과 강인성(robustness)으로 설명되며 이는 저자들에 따르면 특히 실용적이고 대규모 생산에 용이하게 맞출 수 있는 것으로 기재되어 있다. 이 단계는 가열 후 PEG6000과 황산암모늄을 사용하는 것을 기본으로 하며 용해/청정화 및 PEG6000/황산암모늄 첨가 단계에 의해 불순물을 제거한 후 MGL 용액을 수득한다. 상기 단계의 다른 주목할만한 점은 MGL 용액을 PEG6000으로 처리한 다음 원심분리를 수행함으로써 불순물을 제거하기 위한 단계 중 높은 순도 수준을 신속하게 수득할 가능성이다. 불순물은 펠릿의 원심분리에서 다시 발견되며, MGL은 상등액 중의 용액에서 대부분 발견된다. 이런 순도 때문에, 세파크릴 S200 HR 컬럼에서의 겔 여과에 의한 정제 단계와 연결되어 있는, 음이온 교환기 컬럼 (DEAE) 상에서의 단일 크로마토그래피 단계에 상기 MGL 용액을 통과시키면, 정제된 단백질을 수득할 가능성이 있다.상기 특허된 방법을 소규모 테스트용으로 맞출때, 수득한 결과는 재현될 수 없는 것으로 나타났다. 특허 EP 0 978 560 B1에 따라서, 불순물을 제거하기 위한 단계 (PEG6000/황산암모늄으로 처리 및 원심분리) 말기에, MGL 효소는 가용성 분획에서 대부분 발견되며, 원심분리는 펠릿 중의 불순물이 제거되는 원인이 된다. EP 0 978 560 B1에 기재된 방법에 따라서 수행되는 소규모 테스트 중, MGL 단백질은 원심분리 펠릿에서 대부분 (∼80%) 다시 발견된다. 하기 표 3에는 SDS-PAGE 겔 상에서의 덴시토메트리(densitometry)에 의해 평가되는 가용성 분획 중 MGL의 퍼센트가 기재되어 있다.

정제	가용성 분획 중 MGL 퍼센트	평균
테스트 번호 1	11%	17%
테스트 번호 2	23%	17%

따라서, 이런 예측치못한 결과는 상기 특허된 방법을 1) MGL을 함유하는 원심분리 펠릿으로부터 조작, 2) DEAE 컬럼에 부하한 후 불순물을 제거를 향상시키기 위하여 2개의 연속 결정화 단계를 수행, 3) DEAE 컬럼 상에서의 크로마토그래피를 최적화함으로써 최적화시켰다.상기 마지막 단계의 경우, DEAE 세파로오스 FF 수지가 최종적으로 테스트된 완충액과 pH 조건에서 충분히 강한 교환기가 아닌 것으로 밝혀졌다. 다른 추가의 최적화 테스트 후, 선택은 최종적으로 1) 이 방법의 강인성을 증진시키기 위하여 초기 방법에서 사용되는 인산염 완충액을 Tris 완충액 pH 7.6으로 대체하고 2) MGL의 어떠한 소실도 없이 내독소 수준과 단백질 순도를 실질적으로 개선하기 위하여 DEAE 상에 2차로 통과시키도록 지시된다 (Takakura 등에 따르면 0.8 EU/mg 대 개량된 방법의 경우 0.57 EU/mg).

마지막으로, 대규모 GMP 생산에 대한 요구조건에 화합할 수 있는 방법을 얻기 위하여, 멤브레인 Q에서의 연마(polishing) 단계가 추가되어 잔류하는 내독소와 HCP 수준을 감소시킨다. 상기 마지막 연마 단계는 S200 겔 여과 크로마토그래피 수행을 피하게 되는데, 상기 겔 여과 크로마토그래피는 공업용 규모의 생산 공정에 사용되기에 어려운 단계이다 (상기 크로마토그래피의 비용과 기간).

상기 2가지 방법을 사용하여 수득한 생성물이 하기 표 4에 요약되어 있다.

	특허 EP 978 560 B1		적용 방법
단계	효소의 양 (g)	수율 (%)	효소의 양 (g)	수율 (%)
DEAE 전 가용화된 펠릿	125	100	70	100
농축된 용액^$	80	64	46	65

^$포스트 세파크릴 S-200 HR (EP 978 560) 또는 포스트 멤브레인 Q (본 발명의 방법).

실시예 5. 쥐의 적혈구내로 MGL과 PLP를 동시-캡슐화

CD1 마우스 (Charles River)의 전혈을 1000 x g로 10분간, 4℃에서 원심분리시켜 혈장과 버피코트(buffy coat)를 제거한다. 상기 RC를 0.9% NaCl (v:v)로 3회 세척한다. 동결-건조된 MGL을 물에 78.7　mg/mL의 농도로 다시-현탁시키고 적혈구 현탁액에 첨가하여, 상이한 농도의 MGL과 PLP를 함유하는, 적혈구용적율이 70%인 최종 현탁액을 수득한다. 이어서, 상기 현탁액을 혈액투석기에 120 mL/시간의 유속으로 부하하고 저장성 용액에 대해 15 mL/분의 유속으로 역류로 투석한다. 이어서, 상기 현탁액을 고장성 용액으로 재밀봉한 다음 30분간 37℃에서 배양시킨다. 0.9% NaCl, 0.2% 글루코오스로 3회 세척한 후, 상기 현탁액을 6% BSA가 보충된 보존 용액 SAG-만니톨에 흡수시킨다. 상기 수득한 생성물을 D0 (이들의 제조 후 2시간 이내) 및 D1 (즉, 2-8℃에서 ~18시간-24시간 보존한 후)에서 특징화한다. 혈액학적 특징은 수의과용 자동화기기 (Sysmex, PocH-100iV)로 수득한다.

결과:

이후 언급되는 다른 연구에서, 최종 처리된 생성물에서의 MGL 활성을 수용액 중 MGL의 외부 보정 범위에 대해 실시예 5에 기재된 방법으로 검사한다. 설명하기 위한 연구와 함께, 이들 결과는 최종 처리된 생성물에서의 MGL 활성이 상기 방법에 도입된 효소의 양에 따라 증가하며 이는 양호한 안정성을 유지하면서 최종 마무리된 생성물 mL 당 32 IU의 MGL까지 용이하게 캡슐화시킬 수 있음을 보여준다.

다른 연구에서는, 3개의 쥐의 최종 처리된 생성물 RC-MGL-PLP1, RC-MGL-PLP2 및 RC-MGL-PLP3를 다음과 같은 방법에 따라서 제조하였다:

- RC-MGL-PLP1: 3 mg/mL의 MGL과 ~30μM의 PLP를 함유하는 현탁액으로부터 MGL과 PLP를 동시-캡슐화시킴. 최종 생성물을 SAG-만니톨, 최종 10μM의 PLP가 보충된 6% BSA에 흡수시킨다.

- RC-MGL-PLP2: 3 mg/mL의 MGL과 ~30μM의 PLP를 함유하는 현탁액으로부터 MGL과 PLP를 동시-캡슐화시킴. 최종 생성물을 SAG-만니톨 6% BSA에 흡수시킨다.

- RC-MGL-PLP3: 이 생성물은 3 mg/mL의 MGL과 ~124μM의 PLP를 함유하는 현탁액으로부터 MGL과 PLP를 동시-캡슐화시키는 것으로부터 생성된다. 최종 생성물을 SAG-만니톨 6% BSA에 흡수시킨다.

세번째 연구에서는, 쥐의 최종 처리된 생성물 RC-MGL-PLP4를 하기 방법에 따라서 MGL의 새로운 배치로부터 제조한다:

- RC-MGL-PLP4: 5 mg/mL의 MGL과 ~35μM의 PLP를 함유하는 현탁액으로부터 MGL과 PLP를 동시-캡슐화시킴. 최종 처리된 생성물을 SAG-만니톨 6% BSA에 흡수시킨다.

마지막으로, 네번째 연구에서는, 쥐의 생성물 RC-MGL-PLP5를 다음과 같은 방법에 따라서 MGL의 세번째 배치로부터 제조한다:

- RC-MGL-PLP5: 6 mg/mL의 MGL과 ~100μM의 PLP를 함유하는 현탁액으로부터 MGL과 PLP를 동시-캡슐화시킴. 최종 처리된 생성물을 SAG-만니톨 6% BSA에 흡수시킨다.

상기 3개의 최종 처리된 생성물의 D0 (이들의 제조 후)에서의 혈액학적 및 생화학적 특징이 하기 표 5에 상세하게 기재되어 있다. 캡슐화 수율이 만족스러우며 18.6%에서 30.5%까지 변화된다.

		RC-MGL-PLP1	RC-MGL-PLP2	RC-MGL-PLP3	RC-MGL-PLP4	RC-MGL-PLP5
혈액학적 데이터	적혈구용적율 (%)	50.0	49.6	50.0	50.0	50.0
	혈구 용적 (fl)	46.3	46.5	46.8	42.4	45.6
	혈구 헤모글로빈 (g/dl)	24.7	24.0	24.2	27.4	25.1
	RC 농도 (10⁶/㎕)	6.5	6.9	6.6	7.2	6.0
	총 헤모글로빈 (g/dl)	14.8	15.4	15.0	16.6	13.8
	세포외 Hb (g/dl)	0.1	0.1	0.1	0.2	0.05
mgl	MGL의 내부-적혈구 농도 (mg/RC의ml)	0.97	0.94	0.79	1.01	1.36
	MGL의 내부-적혈구 활성 (IU/RC의 ml)*	12.8	12.4	8.8	5.0	8.6
	세포외 활성 (%)	0.92%	0.97%	1.32%	1.18%	2.23%
	세포내 활성 (%)	99.08%	99.03%	98.68%	98.82%	97.77%
	MGL의 캡슐화 수율 (%)	18.6%	30.5%	22.6%	19.4%	22.7%

PLP	PLP의 내부-적혈구 농도 (㎛ol/l of RC)	ND	13.4	71.4	10.2	ND
	세포내 PLP 분획 (%)	ND	99.5	98.7	98.1	ND
	세포외 PLP 분획 (%)	ND	0.5	1.3	1.92	ND
	PLP 캡슐화 수율 (%)	ND	44.8	57.4	30.7	ND

^*각 배치의 특이적 활성으로부터 계산됨.

실시예 6. 공업적 방법에 따라서 메티오닌 감마 리아제와 PLP를 캡슐화하는 인간 RC의 제조

백혈구-고갈된 인간의 적혈구 세포 RC의 파우치 ("Etabissement Francaos du Sang"에 의해 제공됨)를 0.9% NaCl을 사용하는 세척 사이클로 3회 처리한다 (washer Cobe 2991). 동결-건조된 MGL을 0.7% NaCl을 사용하여 재-현탁시키고 상기 적혈구 현탁액에 가하여 적혈구용적율이 70%이고, 3 mg/mL의 MGL과 ~30 μM의 PLP를 함유하는 최종 현탁액을 수득한다 (MGL의 조제로부터 생성됨). 상기 현탁액을 균질화시키고 EP　1　773　452에 기재된 방법에 따라서 캡슐화시킨다. 이어서, 재밀봉으로부터의 현탁액을 3시간 동안 실온에서 배양시켜 가장 취약한 RC를 제거한다. 상기 현탁액을 0.9% NaCl, 0.2% 글루코오스 용액으로 3회 세척하고 (washer Cobe 2991), 이어서 80mL의 보존 용액 (AS-3)으로 다시-현탁시킨다. 캡슐화된 MGL 수준을 실시예 6에서와 같이 검사하며, 하기 표 6을 참조한다.

	J0	J1	J7
적혈구용적율 (%)	52.0	51.6	52.7
혈구 용적 (fl)	91.0	92.0	88.0
혈구 헤모글로빈 (g/dl)	30.3	29.8	31.6
RC 농도 (10⁶/㎕)	6.00	5.92	5.98
총 헤모글로빈 (g/dl)	16.4	16.2	16.6
세포외 Hb (g/dl)	0.119	0.197	0.280
삼투압취약성 (g/l)	1.17
용혈 (%)	0.7%	1.2%	1.7%
총 MGL 농도 (mg/ml)	0.36	0.35
MGL 상등액 농도 (mg/ml)	0.01	0.01
MGL 내부-적혈구 농도 (mg/ml, 100% Ht)	0.68	0.67
세포외 활성 (%)	1.3%	1.4%
세포내 활성 (%)	98.7%	98.6%
캡슐화 수율 (%)	19.7%

실시예 7

추가 약어

RPMI: 르로스웰 파크 메모리얼 연구소 배지(Le Roswell park memorial institute medium)

I. 작업 조건

I.1 테스트 아이템

I.1.1 L-아스파라기나제

설명: Medac^®(Germany), E. Coli L-아스파라기나제 10 000 IU

L-아스파라기나제의 농도 하나 (2.2 IU/mL)는 듈베코 인산염 완충된 염수 (DPBS) 1X에서 연속 희석법으로 제조한다. L-아스파라기나제의 농도를 11배 희석하여 0.20 IU/mL (IC50)의 최종 농도를 수득한다.

I.1.2 메티오닌-γ-리아제(MGL)

설명: E. Coli에서 생산된 P. Putida 메티오닌-γ-리아제(MGL)

MGL의 농도 하나 (3.85 IU/mL)는 듈베코 인산염 완충된 염수 (DPBS) 1X에서 연속 희석법으로 제조한다. MGL의 농도를 11배 희석하여 0.35 IU/mL (IC50)의 최종 농도를 수득한다.

I.2 세포주

I.2.1 설명

명칭: NCI-N87 세포주

설명: 인간 위암종 세포주 (접착성)

공급자 및 참조번호: ATCC, CRL-5822

I.2.2 배양 조건

세포를 10%(v/v)의 태소 혈청, 100 IU/mL의 페니실린 및 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지에서 배양시킨다. 서브배양은 PO-CELL-002 및 PO-CELL-005에 따라서 수행한다.

I.2.3 비색 키트(colorimetric kit)

명칭: 세포 계수 키트 Kit-8 (CCK-8)

공급자 및 참조번호: Fluka 96992

원리: CCK-8 시약은 고도의 수용성 테트라졸륨 염 WST-8을 포함한다. WST-8은 세포내의 데하이드로게나아제에 의해 환원되어 노란색의 생성물 (포르마잔)을 생산하는데 이는 조직 배양 배지에 가용성이다. 세포내 데하이드로게나아제의 활성에 의해 생성되는 포르마잔 염료의 양은 살아있는 세포의 수에 직접 비례한다.

비색 시험은 PO-CELL-004에 따라서 수행한다.

II. 세포독성 검사

II.1 방법

100 ㎕ 중 2,500개의 세포/웰로 96개-웰 평저 플레이트 (원시 데이터에서의 플레이트 개수 참조)에 분배한다. 또한, 2개의 웰에 각 플레이트에 대한 블랭크 대조를 위하여 컬쳐 배지를 채운다. 비어있는 모든 웰에 컬쳐 배지를 채워 증발과 응결을 최소화한다. 0일째 (D0)에, 10㎕의 IC50 농도의 L-아스파라기나제 또는 MGL을 대응하는 웰에 첨가한다. 대조물 (블랭크 웰과 대조용 플레이트)에는 10㎕의 DPBS 1X를 공급한다. 4일째 (D4)에, 웰로부터 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체한 다음 10㎕의 DPBS 1X 또는 10㎕의 IC50 농도의 L-아스파라기나제 (MGL과 미리 배양시킨 세포의 경우) 또는 MGL (L-아스파라기나제와 미리 배양시킨 세포의 경우)을 대응하는 웰에 첨가한다. 대조물 (블랭크와 포지티브 대조군)에는 10㎕의 DPBS 1X를 공급한다. 이어서, 플레이트를 4일 이상 배양기에서 배양시킨다. 배양 기간 말기 (D8)에, 10㎕의 CCK-8 용액을 PO-CELL-004에 따라서 각 웰에 첨가하고 플레이트를 4시간 동안 배양시킨다. 이후, 미세플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서의 광학밀도 (OD)를 측정한다.

II.2 내부 대조

대조는 2중으로 수행한다.

II.2.1 블랭크 웰

상기 실시예 1에서와 같음.

II.2.2 생존성 대조 (포지티브 대조군)

NCI-N87 세포주 (100% 세포 생존성)에 대한 포지티브 대조로서, 세포를 L-아스파라기나제 뿐만 아니라 MGL이 없지만, 10㎕의 희석제 (DPBS 1X)가 들어 있는 컬쳐 배지 (100㎕)에서 배양시킨다.

II.3 세포 생존성 측정

상기 실시예 1에서와 같음.

III. 결과

III.1 내부 대조

III.2 L-아스파라기나제 또는 MGL 단독에 대한 IC50 계산

단독 약물 (MGL 또는 L-아스파라기나제)인 경우의 세포 생존성 퍼센트는 약물 조합의 각 실험에서 대조된다. 효소들에 대해 여기서 사용되는 IC50 값이 D4에 단독 치료에서 이미 증명되었기 때문에 50%의 세포 생존성은 테스트 절반 기간 (D4)에 기대된다.

III.2.1 L-아스파라기나제와 MGL의 순차적 첨가

L-아스파라기나제와 MGL의 순차적 처리에 의한 실험은 2중 데이터로 2회 수행한다. 모든 품질 대조군 (블랭크 및 포지티브 대조군)이 실험에 채택된다.

세포 생존성% 계산의 세부사항과 그래프식 표현이 하기 표 7과 도 2에 제시된다.

대조군과 효소 포함(association)에 대한 세포 생존성%

	D8에서의 세포 생존성%
	평균	SD
세포 단독	100	0
세포 + IC50 L-aspa D0	56	8
세포 + IC50 MGL D0	45	4
세포 + IC50 L-aspa D0 + IC50 MGL D3	44	0
세포 + IC50 MGL D0 +IC50 L-aspa D3	25	6

결과는 IC50 투여량의 L-아스파라기나제 첨가 전 IC50 투여량의 MGL이 첨가된 효소 포함 (도 2 참조)이 다음과 같이 세포 생존성을 감소시킴을 표시한다:- 55%, L-아스파라기나제 (L-아스파라기나제에 대한 IC50 대조군)와 비교,

- 44%, MGL (MGL에 대한 IC50 대조군)과 비교,

- 43%,먼저 IC50 투여량으로 첨가된 L-아스파라기나제를 사용한 효소 포함과 비교.

IV. 결론

순차적인 효소 포함은 세포 사멸율이 IC50 투여량으로 L-아스파라기나제 첨가한지 4일 후 IC50 투여량으로 MGL 첨가시 증가될 수 있음을 증명한다.

본 발명자들은 MGL 효소 활성에 의해 유도된 Met 박탈은 NCI-N87 위 세포가 L-아스파라기나제 활성에 더욱 감응성이 되도록 한다고 가설을 세울 수 있다. 또한, L-아스파라기나제와 MGL의 역할은 이들의 알려져 있는 개별 효과를 고려하여 논의되어야 한다. 사실, L-아스파라기나제는 백혈병 세포에서 세포자살을 유도하는 것으로 알려져 있으며 (Ueno et al., 1997), 따라서, 이는 아마도 세포독성제의 역할을 할 수 있을 것이다. 세포 사이클의 S 또는 G2기에 세포 분화를 차단하는 것으로 알려져 있는 MGL은 아마도 세포성장억제제로 작용할 것이다.

실시예 8

I.추가 약어

F12K: 햄의 F-12의 칸 개량 (Kaighn's modification of ham's F-12)

II. 작업 조건

II.1 테스트 아이템

II.1.1 L-아스파라기나제

설명: Medac^®(Germany), E. Coli L-아스파라기나제 10 000 IU

L-아스파라기나제의 농도 하나 (2.97 IU/mL)는 듈베코 인산염 완충된 염수 (DPBS) 1X에서 연속 희석법으로 제조한다. L-아스파라기나제의 농도를 11배 희석하여 0.27 IU/mL (IC50)의 최종 농도를 수득한다.

II.1.2 메티오닌-γ-리아제(MGL)

설명: E. Coli에서 생산된 P. Putida 메티오닌-γ-리아제(MGL)

MGL의 농도 하나 (1.43 IU/mL)는 듈베코 인산염 완충된 염수 (DPBS) 1X에서 연속 희석법으로 제조한다. MGL의 농도를 11배 희석하여 0.13 IU/mL (IC50)의 최종 농도를 수득한다.

II.2 세포주

II.2.1 설명

명칭: AGS 세포주

설명: 인간 위 선종 세포주 (접착성)

공급자 및 참조번호: ATCC, CRL-1739

II.2.2 배양 조건

세포를 10%(v/v)의 태소 혈청, 100 IU/mL의 페니실린 및 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신이 보충된 F12K 배지에서 배양시킨다. 서브배양은 PO-CELL-002 및 PO-CELL-005에 따라서 수행한다.

II.2.3 비색 키트(colorimetric kit)

명칭: 세포 계수 키트 Kit-8 (CCK-8)

공급자 및 참조번호: Fluka 96992

비색 시험은 PO-CELL-004에 따라서 수행한다.

III. 세포독성 검사

III.1 방법

100 ㎕ 중 1,500개의 세포/웰로 96개-웰 평저 플레이트 (원시 데이터에서의 플레이트 개수 참조)에 분배한다. 또한, 2개의 웰에 각 플레이트에 대해 블랭크 대조를 위해 컬쳐 배지를 채운다. 비어있는 모든 웰에 컬쳐 배지를 채워 증발과 응결을 최소화한다. 0일째 (D0)에, 10㎕의 IC50 농도의 L-아스파라기나제 또는 MGL을 대응하는 웰에 첨가한다. 대조물 (블랭크 웰과 대조용 플레이트)에는 10㎕의 DPBS 1X를 공급한다. 4일째 (D4)에, 웰로부터 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체한 다음 10㎕의 DPBS 1X 또는 10㎕의 IC50 농도의 L-아스파라기나제 (MGL과 미리 배양시킨 세포의 경우) 또는 MGL (L-아스파라기나제와 미리 배양시킨 세포의 경우)을 대응하는 웰에 첨가한다. 대조물 (블랭크와 포지티브 대조군)에는 10㎕의 DPBS 1X를 공급한다. 이어서, 플레이트를 4일 이상 배양기에서 배양시킨다. 배양 기간 말기 (D8)에, 10㎕의 CCK-8 용액을 PO-CELL-004에 따라서 각 웰에 첨가하고 플레이트를 4시간 동안 배양기에서 배양시킨다. 이후, 미세플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서의 광학밀도 (OD)를 측정한다.

III.2 내부 대조

대조는 2중으로 수행한다.

III.2.1 블랭크 웰

상기 실시예 1에서와 같음.

III.2.2 생존성 대조 (포지티브 대조군)

AGS 세포주 (100% 세포 생존성)에 대한 포지티브 대조로서, 세포를 L-아스파라기나제 뿐만 아니라 MGL이 없지만, 10㎕의 희석제 (DPBS 1X)가 들어 있는 컬쳐 배지 (100㎕)에서 배양시킨다.

III.3 세포 생존성 측정

상기 실시예 1에서와 같음.

IV. 결과

IV.1 내부 대조

IV.2 L-아스파라기나제 또는 MGL 단독에 대한 IC50 계산

IV.2.1 L-아스파라기나제와 MGL의 순차적 첨가

세포 생존성% 계산의 세부사항과 그래프식 표현이 하기 표 8과 도 3에 제시된다.

대조군과 효소 포함(association)에 대한 세포 생존성%

	D8에서의 세포 생존성%
	평균	SD
세포 단독	100	4
세포 + IC50 L-aspa D0	101	1
세포 + IC50 MGL D0	106	1
세포 + IC50 L-aspa D0 + IC50 MGL D3	88	2
세포 + IC50 MGL D0 +IC50 L-aspa D3	79	6

결과는 IC50 투여량의 L-아스파라기나제 첨가 전 IC50 투여량의 MGL이 첨가된 효소 포함 (도 3 참조)이 다음과 같이 세포 생존성을 감소시킴을 표시한다:- 22%, L-아스파라기나제 (L-아스파라기나제에 대한 IC50 대조군)와 비교,

- 26%, MGL (MGL에 대한 IC50 대조군)과 비교,

- 10%,먼저 IC50 투여량으로 첨가된 L-아스파라기나제를 사용한 효소 포함과 비교.

또한, 여기서 정밀함을 위하여, L-아스파라기나제 또는 MGL에 대한 IC50 대조 (먼저 D4에서 사용되고 증명된 것)을 D4/테스트의 중반에 새로운 배지를 사용하여 8일 후 세포 생존성 100% 회복되었다. 사실, D4에 남아있는 생존 세포는 "신선한" 영양물을 첨가함으로써 다시-성장할 수 있다. 결과는 IC50 대조군 (효소 단독)에 대해 D4에 세포 생존성이 50%에 도달함을 확인시켜준다.

V. 결론

본 발명자들은 MGL 효소 활성에 의해 유도된 Met 고갈은 AGS 위 세포가 L-아스파라기나제 활성에 더욱 감응성이 되도록 한다고 가설을 세울 수 있다. 또한, L-아스파라기나제와 MGL의 역할은 이들의 알려져 있는 개별 효과를 고려하여 논의되어야 한다. 사실, L-아스파라기나제는 백혈병 세포에서 세포자살을 유도하는 것으로 알려져 있으며 (Ueno et al., 1997), 따라서, 이는 아마도 세포독성제의 역할을 할 수 있을 것이다. 세포 사이클의 S 또는 G2기에 세포 분화를 차단하는 것으로 알려져 있는 MGL은 아마도 세포성장억제제로 작용할 것이다.

실시예 9

I. 추가 약어

A.M.: 오전

ERY-ASP: 적혈구 세포내에 캡슐화된 L-아스파라기나제

ERY-MET: 적혈구 세포내에 캡슐화된 메티오닌 감마-리아제

IG: 위내주사 (개비지: gavage)

IU: μmol/분에 상응하는 국제단위

IV :정맥내

ND: 측정되지 않음

PN: 피리독신

TGI: 종양 성장 억제

II. 생체내 연구의 목적

본 연구의 목적은 메티오니나제-부하된 적혈구 (ERY-MET)와 L-아스파라기나제-부하된 적혈구 (ERY-ASP)의 조합이 NCI-N87 위암 피하 이종이식 마우스 모델에서 ERY-MET 단독의 경우 관측되는 항종양 활성을 향상시킬 수 있는지 측정하는 것이다.

III. 작업 조건

NCI-N87 세포를 ERYTECH Pharma에서 배양하여 주사를 위하여 DPBS 1X에 5.10⁷ 개 세포/mL로 제조한다. 4개 그룹의 10 또는 12마리의 암컷 누드 마우스 (그룹 1, 2, 3 및 4)에게 5.10⁶/100㎕의 고정 농도로 세포주를 피하 주사한다. ERY-MET와 ERY-ASP 주사를 각각 108IU/kg (8mL/kg) 및 200IU/kg (4-5.4mL/kg)로 투여한다 (I.V. 경로). 그룹 2에게는 7일, 14일 및 21일에 ERY-MET를 3회 주사한다. 그룹 3 (ERY-ASP/ERY-MET)에게는 7일에 ERY-ASP를 1회 주사한 다음, 21일 및 28일에 ERY-MET를 2회 주사한다. 그룹 4 (ERY-MET/ERY-ASP)에게는 7일 및 14일에 ERY-MET를 2회 주사한 다음 21일에 ERY-ASP를 1회 주사한다. 그룹 1에게는 7일, 14일 및 21일에 ERY-MET의 보존성 용액 (SAG 만니톨/혈장)을 8 mL/kg으로 투여한다.

PN 보조인자의 경구 투여 (개비지)는 각각의 ERY-MET 주사 6시간 후 (그룹 2의 경우, 7+6h, Day 15+6h, Day 21+6h; 그룹 3의 경우, Day 21+6h, Day 28+6h; 그룹 4의 경우, Day 7+6h, Day 15+6h) 및 다른 날들의 경우 (ERY-MET 투여없음) Day 20 (그룹 4의 경우), Day 27 (그룹 2의 경우) 또는 Day 34 (그룹 3의 경우)까지 일일 1회 (A.M.) 수행한다.

IV. 결과

ERY-MET/ERY-ASP 조합과 관련한 종양 용적 축소는 ERY-MET arm에 대해 관찰되는 것과 다른 것으로 나타났다; 사실, D37에, 마우스 ERY-MET의 평균 종양 용적은 298.3 ± 36.2mm³인 것으로 나타났으며 마우스 ERY-MET/ERY-ASP의 평균 종양 용적은 189.7 ± 29.8mm³인 것으로 나타났는데, 이는 각각 평균 종양 용적의 37% 및 58% 감소인 한편, 비히클을 공급한 마우스 (대조군)의 평균 종양 용적은 441.5 ± 56.6mm³이었다. 종양 성장 억제 (TGI*) 퍼센트는 하기 식에 따라서 효소 포함 ERY-MET/ERY-ASP vs 대조군 (비히클 그룹) 또는 vs ERY-MET 그룹에 대해 계산한다:

결과는 하기 표 9에 제시한다:

ERY/MET/ERY-ASP 연합에 대한 TGI 계산

ERY-MET/ ERY-ASP 치료에 대한 TGI%	vs 대조군	vs ERY-MET 단독
Day 7	ND**	ND**
Day 20	41%	33%
Day 37	57%	36%

**연구 시작할 때 낮은 용적 측정 디스패리티(disparity)로 인하여 측정하지 않음 (관련없음) (D7은 종양 용적 측정의 첫번째 시점이다).

그룹 간의 유의성과 NCI-N87 위암에 대한 ERY-MET 단독과 비교한 ERY-MET/ERY-ASP 치료의 효과를 평가하기 위하여, 종양 성장 측정의 경우 GraphPad Prism 소프트웨어 (version 5.04)로 2차-방식 ANOVA 테스트를 수행한다. 비히클 (대조군), ERY-MET 및 ERY-MET/ERY-ASP 치료를 비교하는 분석은 D37에 그룹 간에 0.0001보다 작은 P 값으로 유의성이 있는 것으로 나타났으며 (도 4 참조) 이는 위의 종양에 대한 치료를 위한 마지막 주사 후 16일에 ERY-MET/ERY-ASP 조합 효과가 밝혀진 것이다. NCI-N87 위암에 대한 ERY-MET 단독과 비교한 ERY-MET/ERY-ASP 치료의 역행적 투여 계획의 경우, 2차-방식 ANOVA 테스트 (도 4 참조)로 P 값 >0.05로 이후의 3개의 시점 (D7/D20/D37)에 대해 그룹 간에 유의성이 없는 것으로 밝혀졌다.

V. 결론

ERY-MET를 2개의 투여 계획: 1-ERY-ASP (D7)-ERY-MET (D21/D28) 및 2-ERY-MET (D7/D15)-ERY-ASP (D21)으로 ERY-ASP와 조합하였다. ERY-MET 단독인 경우와 비교하여 포지티브 반응은 ERY-ASP 전에 ERY-MET를 투여하였을 때 (2회) 나타나는 것 같다. 이런 결과의 유의성은 개별적인 종양 용적 측정에 대해 D37에 0.0001보다 작은 P 값을 수득함으로써 지지된다.

Claims

아스파라기나제(asparaginase) 전에 메티오니나제(methioninase)를 적어도 1회 순차적으로 투여하기 위한, 아스파라기나제와 메티오니나제를 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물로서, 메티오니나제 투여 말기와 아스파라기나제 투여 개시 사이의 지연기간(delay)이 1시간 내지 30일 사이인, 제약 조성물.
제1항에 있어서, 메티오니나제와 아스파라기나제가 유리(free) 형태, PEG화된 형태 또는 적혈구내에 캡슐화된 형태로 존재하는, 제약 조성물.
제1항에 있어서, 메티오니나제가 유리 형태로 있거나 PEG화되어 있고 메티오니나제 투여 말기와 아스파라기나제 투여 개시 사이의 지연기간(delay)이 1시간 내지 7일 사이, 3시간 내지 6일 사이, 또는 1일 내지 5일 사이인, 제약 조성물.
제1항에 있어서, 메티오니나제가 적혈구에 캡슐화되어 있고 메티오니나제 투여 말기와 아스파라기나제 투여 개시 사이의 지연기간이 1시간 내지 30일 사이, 1일 내지 20일 사이, 또는 1일 내지 10일 사이인, 제약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 메티오니나제를 1회 이상, 100 내지 100,000 IU 사이, 500 내지 50,000 IU 사이, 또는 500 내지 5000 IU 사이의 양으로 투여하는, 제약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파라기나제를 1회 이상, 500 내지 100,000 IU 사이, 1000 내지 50,000 IU 사이, 또는 5000 내지 30,000 IU 사이의 양으로 투여하는, 제약 조성물.
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제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
메티오니나제와 동시, 별개 또는 순차(sequential) 투여를 위하여 PLP(pyridoxal phosphate) 또는 PLP 전구체를 추가로 포함하는, 제약 조성물.
제12항에 있어서,
적혈구 내부에 캡슐화된 메티오니나제와, 별개 또는 순차 투여를 위한 PLP의 비-인산염 전구체를 포함하는, 제약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
적혈구 내부에 캡슐화된 메티오니나제를 적혈구 내부에 캡슐화된 아스파라기나제가 투여되기 전에 적어도 1회 또는 2회 투여하고, 각각의 메티오니나제는 아스파라기나제 투여 전 PLP(pyridoxal phosphate)의 비-인산염 전구체의 용액이 투여된 다음 투여되는, 제약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 또는 고형 종양을 치료하기 위한, 제약 조성물.
제15항에 있어서, 백혈병 또는 위암을 치료하기 위한, 제약 조성물.
치료를 필요로 하는 비-인간 포유동물에서 암을 치료하는 방법으로서,
치료를 필요로 하는 비-인간 포유동물에게, 메티오니나제를 포함하는 조성물, 및 이어서 아스파라기나제를 포함하는 조성물을 투여하며,
메티오니나제 투여 말기와 아스파라기나제 투여 개시 사이에는 지연기간이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
치료를 필요로 하는 비-인간 포유동물에서 암을 치료하는 방법으로서,
치료를 필요로 하는 비-인간 포유동물에게, 적혈구 내부에 캡슐화된 메티오니나제를 포함하는 조성물, 및 이어서 적혈구 내부에 캡슐화된 아스파라기나제를 포함하는 조성물을 투여하며,
메티오니나제 투여 말기와 아스파라기나제 투여 개시 사이에는 지연기간이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 메티오니나제 투여 말기와 아스파라기나제 투여 개시 사이의 지연기간이 1시간 내지 30일 사이인 방법.
제18항 또는 제19항에 있어서, 메티오니나제를 1회 이상 100 내지 100,000 IU 사이의 양으로 투여하는 방법.
제18항 또는 제19항에 있어서, 아스파라기나제를 1회 이상 500 내지 100,000 IU 사이의 양으로 투여하는 방법.
제18항 또는 제19항에 있어서, 적혈구 내부에 캡슐화된 메티오니나제를 적혈구 내부에 캡슐화된 아스파라기나제가 투여되기 전에 적어도 1회 또는 2회 투여하고, 각각의 메티오니나제 투여는 아스파라기나제가 투여되기 전에 PLP(pyridoxal phosphate) 또는 PLP의 전구체의 투여와 동반되는 방법.
제22항에 있어서, PLP의 비-인산염 전구체를 캡슐화된 메티오니나제의 각 투여 후 1회 이상 투여하는 방법.
제23항에 있어서, PLP의 비-인산염 전구체를, 메티오니나제 치료 기간 중에, 일일 1회, 또는 2회 이상 투여하는 방법.
제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 암이 백혈병 또는 위암인 방법.
아스파라기나제(asparaginase) 전에 메티오니나제(methioninase)를 적어도 1회 순차적으로 투여하기 위한, 아스파라기나제와 메티오니나제를 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 키트로서, 메티오니나제 투여 말기와 아스파라기나제 투여 개시 사이의 지연기간은 1시간 내지 30일 사이인, 제약 키트.
제26항에 있어서,
메티오니나제가 유리 형태로 있거나 PEG화되어 있는 경우, 메티오니나제 투여 말기와 아스파라기나제 투여 개시 사이의 지연기간은 1시간 내지 7일 사이, 3시간 내지 6일 사이, 또는 1일 내지 5일 사이이거나; 또는
메티오니나제가 적혈구에 캡슐화되어 있는 경우, 메티오니나제 투여 말기와 아스파라기나제 투여 개시 사이의 지연기간이 1시간 내지 30일 사이, 1일 내지 20일 사이, 또는 1일 내지 10일 사이인, 제약 키트.