ES2881787T3 - Agotamiento de metionina y asparagina para usar en el tratamiento contra el cáncer - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica o kit para usarse en el tratamiento de cáncer en un mamífero que comprende asparaginasa y metioninasa durante al menos una administración secuencial, administrándose la metioninasa antes de la asparaginasa.

Description

DESCRIPCION

Agotamiento de metionina y asparagina para usar en el tratamiento contra el cáncer

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una asparaginasa y metioninasa para su uso en un nuevo tratamiento de cáncer. Las terapias enzimáticas están destinadas a privar de alimento a los tumores y ayudar en particular a controlar el cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La asparaginasa hidroliza y agota la asparagina, un aminoácido esencial para la producción de las proteínas necesarias para la vida de las células. Ahora, a diferencia de las células normales, ciertas células linfoblásticas cancerosas no tienen la capacidad de producir su propia asparagina y dependen de fuentes extracelulares para la síntesis de sus proteínas. Por lo tanto, la enzima puede usarse para tratar leucemias (cánceres líquidos o sanguíneos). Por lo tanto, la L-asparaginasa se ha usado en combinación con quimioterapia para el tratamiento de la Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL, por sus siglas en inglés) durante los últimos treinta años. ERY-ASP consiste en L-asparaginasa encapsulada en glóbulos rojos. La encapsulación permite que la L-asparaginasa destruya la asparagina dentro de los glóbulos rojos, previniendo reacciones alérgicas y reduciendo otros eventos adversos (documento WO 2006/016247, incorporado aquí por referencia).

La metionina-Y-liasa (MGL; número de EC 4.4.1.11; número de CAS 42616-25-1), también denominada metioninasa, es una enzima dependiente de piridoxal implicada en el metabolismo de la L-metionina (Met), un aminoácido proteinogénico esencial que contiene azufre. El requisito de Met para el cáncer se propuso en la década de 1970: los estudios revelaron que la sustitución de Met por su precursor homocisteína en medio de cultivo no tiene impacto en las células normales como los fibroblastos, pero conduce a una tasa de crecimiento lento de varias células transformadas o malignas. En las células de cáncer de próstata PC-3, los efectos antitumorales de la privación de Met también se reforzaron mediante el uso de un análogo de Met que redujo drásticamente la proliferación de células cancerosas tanto in vitro como in vivo y obligó a las células a entrar en apoptosis. Los estudios complementarios revelaron que la restricción de Met exógena en células cancerosas dependientes de Met bloquea la división celular en la fase S o G2 tardía del ciclo celular. Como la restricción de Met pareció ser efectiva para el tratamiento de cáncer, se investigó el enfoque terapéutico usando la enzima MGL de varias fuentes para el agotamiento de Met en el microambiente tumoral. El objetivo fue desarrollar una nueva solución terapéutica basada en MGL encapsulada en eritrocitos para el agotamiento sistémico de Met en pacientes que contienen cánceres dependientes de Met (documento WO 2015/121348, incorporado aquí como referencia).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define en las reivindicaciones.

Todavía existe la necesidad de soluciones terapéuticas nuevas o adicionales en el tratamiento de cáncer.

El efecto de la combinación de fármacos es inherentemente impredecible. A menudo existe una propensión de un fármaco a inhibir parcial o completamente los efectos del otro. Se llevaron a cabo estudios in vitro para evaluar los efectos citotóxicos de las enzimas que constituyen ERY-ASP y ERY-MET, L-asparaginasa y MGL, solas o en combinación, en una línea celular de leucemia humana seleccionada (HL-60). Para cada fármaco por separado, se determinó previamente la concentración que da una inhibición del 50% de viabilidad celular (IC50). Luego, se realizaron ensayos para evaluar los beneficios de la combinación de tratamiento cuando se produjo algún retraso, por ejemplo, 72 horas entre las adiciones de L-asparaginasa y MGL (dosis de IC50 para cada enzima), cualquiera que sea el orden de combinación.

La presente invención se basa en la observación sorprendente de que la mortalidad celular podría aumentarse con la adición de MGL a una dosis de IC50 seguida de L-asparaginasa a una dosis de IC50 3 días después. El diseño inverso de la adición de la enzima no permitió obtener dicho aumento de mortalidad celular in vitro en un modelo de tumor líquido, por ejemplo, un modelo de leucemia. Este efecto notable se ha confirmado en un tumor sólido, es decir un tumor gástrico, en donde se observó un aumento de la mortalidad celular in vitro y una regresión del volumen tumoral in vivo. Sin estar dispuestos a estar sujetos a la teoría, puede formularse la hipótesis de que la privación de metionina inducida por la actividad de MGL podría hacer que las células sean más sensibles a la L-asparaginasa y que probablemente haya un vínculo con el papel de cada enzima implicada en la regulación del ciclo celular. Este hallazgo abre el camino a los regímenes de tratamiento que comprenden la privación secuencial de metionina o el tratamiento con metioninasa y la privación de asparagina o el tratamiento con asparaginasa. Como será evidente a partir de la siguiente descripción, la invención puede abarcar la dieta y/o la administración de fármaco que induce el efecto beneficioso sobre el cáncer. Por lo tanto, la invención puede combinar la dieta y la administración de fármaco, en cualquier combinación en la que la privación de metionina o el tratamiento con metioninasa preceda a la privación de asparagina o al tratamiento con asparaginasa. Como también se sabe que la metioninasa tiene una actividad de cisteinasa y que la asparaginasa tiene actividad de glutaminasa, no se puede excluir que una actividad de cisteinasa, una actividad de glutaminasa, respectivamente, pueda estar implicada en el modo de acción de la metioninasa, respectivamente asparaginasa.

Un objeto de la invención es un uso de la composición reivindicada o de un kit para tratar cáncer en un mamífero que lo necesite, el método comprendiendo privar al mamífero de metionina, y luego privar al mamífero de asparagina. Lo que se busca es reducir la cantidad de metionina y asparagina disponible para las células cancerosas. Como será evidente a partir de lo anterior, la privación de metionina se realizará mediante la administración de metioninasa, mientras que la privación de asparagina se realizará mediante la administración de asparaginasa.

Por privación, se entiende una reducción suficiente de metionina o asparagina para producir efectos beneficiosos en el tratamiento de cáncer, privando a las células cancerosas de una cantidad suficiente del aminoácido.

Por tratamiento enzimático, se entiende que la enzima degradará el aminoácido en cuestión y posiblemente inducirá otros efectos beneficiosos tales como la inhibición de la síntesis de proteínas o aminoácidos o cualquier mecanismo que conduzca a la falta de una cantidad suficiente del aminoácido para la célula cancerosa.

Un objeto de la presente invención es una composición farmacéutica para usarse en el tratamiento de cáncer en un mamífero que comprende asparaginasa y metioninasa durante al menos una administración secuencial, administrándose la metioninasa antes de la asparaginasa. Como la asparaginasa y la metioninasa han de administrarse por separado y secuencialmente, puede calificarse la composición de un conjunto o kit que comprende formulaciones separadas de las mismas o de composiciones que se han de usar de acuerdo con el orden y la frecuencia de la invención.

En el contexto de la invención bajo sus diferentes aspectos u objetos, al menos una administración secuencial significa que el mismo mamífero puede tratarse secuencialmente más de una vez durante una terapia o fase de tratamiento. Sin embargo, una o varias administraciones de metioninasa pueden realizarse antes de una o varias administraciones de asparaginasa.

También se divulgan la asparaginasa y metioninasa para su uso en la preparación de una composición farmacéutica o composiciones farmacéuticas o un kit o conjunto de composiciones farmacéuticas (una que contenga metioninasa, otra que contenga asparaginasa), en donde la(s) composición(es) o el kit es para usarse en el tratamiento de cáncer en un mamífero con al menos una administración secuencial, administrándose la metioninasa antes de la asparaginasa, - una composición farmacéutica que comprende asparaginasa para usarse en el tratamiento de cáncer en un mamífero, en donde la composición se ha de administrar a un mamífero al que se ha administrado metioninasa;

- una composición farmacéutica que comprende asparaginasa para usarse en el tratamiento de cáncer en un mamífero, en donde la composición se ha de administrar a un mamífero que ha sido sometido a dieta de privación de metionina, es decir, se le ha administrado un alimento privado de metionina, terapéutico o no; por alimento terapéutico en el sentido de esta invención, se entiende un alimento administrado en un entorno médico y/o sujeto a autorización de comercialización por la Autoridad Reguladora, especialmente un alimento líquido, que puede administrarse o no por infusión;

- una composición farmacéutica que comprende metioninasa para usarse en el tratamiento de cáncer en un mamífero, en donde la composición se ha a administrar a un mamífero al que se administrará adicionalmente asparaginasa;

- una composición alimenticia o dieta, terapéutica o no, que no contiene metionina o sustancialmente nada de metionina para usarse en privar a un mamífero de metionina, antes de tratar al mamífero con asparaginasa

- el uso de asparaginasa para la preparación de una composición farmacéutica para usarse en el tratamiento de cáncer en un mamífero, en donde la composición se ha de administrar a un mamífero al que se ha administrado metioninasa;

- el uso de asparaginasa para la preparación de una composición farmacéutica para usarse en el tratamiento de cáncer en un mamífero, en donde la composición ha de ser administrada a un mamífero que ha sido sometido a dieta de privación de metionina, es decir, se le ha administrado un alimento privado de metionina, o no;

- el uso de metioninasa para la preparación de una composición farmacéutica para usarse en el tratamiento de cáncer en un mamífero, en donde la composición se ha de administrar a un mamífero al que se administrará adicionalmente asparaginasa.

Otro objeto más de la divulgación es un kit que comprende una composición farmacéutica que contiene metioninasa o un alimento o dieta terapéutica para la privación de metionina, y una composición farmacéutica que contiene asparaginasa, las composiciones un mamífero que se ha siendo empacadas por separado. Las composiciones son para administración secuencial con metioninasa o alimentos/dieta que se administran antes de la asparaginasa. El kit puede contener además una hoja de instrucciones que indica que las composiciones son para administración secuencial con metioninasa o alimentos/dieta que se administran antes de la asparaginasa.

Otro aspecto más de la divulgación es un tratamiento de cáncer en un mamífero que comprende administrar a un mamífero primero una cantidad eficiente de metioninasa y en segundo lugar una cantidad eficaz de asparaginasa.

Otro objeto más de la divulgación es un tratamiento de cáncer en un mamífero que comprende administrar a un mamífero primero un alimento o dieta, terapéutico o no, para privar de metionina, y en segundo lugar una cantidad eficaz de asparaginasa.

Otro objeto más de la divulgación es un tratamiento de cáncer en un mamífero que tiene un bajo nivel biodisponible de metionina, o que ha sido sometido a un alimento o dieta, terapéutico o no, que ha sido privado de metionina, el método comprendiendo administrar al mamífero una cantidad eficiente de asparaginasa.

En estos diferentes objetos, se pueden combinar la administración de metioninasa y la privación de la dieta de metionina. La invención puede ser beneficiosa para cualquier tipo de cáncer, incluyendo cánceres líquidos, es decir, hematológicos y cánceres sólidos.

Un objeto específico de la divulgación, los cánceres tratados son auxotróficos a la asparagina y/o a la metionina.

Un objeto específico de la divulgación, los cánceres tratados no son auxotróficos a la asparagina y/o a la metionina. La invención puede aplicarse a cualquier mamífero y especialmente a seres humanos, animales de compañía tales como perros y gatos, y animales de deporte tales como caballos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

El experto en la técnica puede entender a partir de la presente descripción que la duración del tratamiento con uno de los fármacos, y la demora entre la privación de metionina y el tratamiento con asparaginasa, pueden variar dependiendo del tratamiento, de la respuesta del paciente y, de manera importante, de la vida media del fármaco o efecto de la dieta. Puede haber una diferencia dependiendo de la forma de dosificación usada en la invención, por ejemplo, una enzima libre, una enzima pegilada y eritrocitos que encapsulan la enzima, o bien enzima unida a microcápsulas (por ejemplo, hechas de PLA o PLGA) o liposomas o encapsulados en estas estructuras.

En una modalidad preferida de estos diferentes objetos, el retraso entre el final de la administración de metioninasa y el inicio de la administración de asparaginasa se encuentra entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 7 días, en particular entre aproximadamente 3 horas y aproximadamente 6 días, preferiblemente entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 5 días. Preferiblemente, en esta modalidad, la metioninasa está en forma libre o en forma pegilada, y la asparaginasa puede estar bajo cualquiera de las formas descritas en este documento.

En otra modalidad, el retraso entre el final de la administración de metioninasa y el inicio de la administración de asparaginasa está entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 30 días, en particular entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 20 días, preferiblemente entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 10 días. Preferiblemente, en esta modalidad, la metioninasa está encapsulada, preferiblemente en eritrocitos, y la asparaginasa puede estar bajo cualquiera de las formas descritas en este documento.

En otra modalidad más, el retraso entre el final de la restricción de metionina y el inicio de la administración de asparaginasa es entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 7 días, en particular entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 3 días, preferiblemente entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 1 día. La asparaginasa puede estar bajo cualquiera de las formas descritas aquí.

Composiciones que comprenden enzima en forma libre o en forma pegilada, y similares:

Estas composiciones se pueden administrar a un mamífero usando técnicas estándar. Las técnicas y formulaciones en general se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990 (incorporada aquí como referencia).

Los vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables también pueden incorporarse en una composición farmacéutica de conformidad con la invención para facilitar la administración de la metioninasa o asparaginasa particular. Ejemplos de vehículos adecuados para usarse en la práctica de la invención incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares tales como lactosa, glucosa o sacarosa, o tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, polietilenglicoles y disolventes fisiológicamente compatibles. Ejemplos de disolventes fisiológicamente compatibles incluyen soluciones estériles de agua para inyección (WFI, por sus siglas en inglés), solución salina y dextrosa.

Las composiciones farmacéuticas de conformidad con la invención se pueden administrar por diferentes vías, que incluyen administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, oral, tópica (transdérmica) o transmucosal. Para la administración sistémica, se prefiere la administración oral. Para la administración oral, por ejemplo, los compuestos se pueden formular en formas de dosificación oral convencionales tales como cápsulas, tabletas y preparaciones líquidas tales como jarabes, elixires y gotas concentradas.

Alternativamente, se puede usar inyección (administración parenteral), por ejemplo, inyección intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para inyección, las composiciones farmacéuticas se formulan en soluciones líquidas, preferiblemente en reguladores de pH o soluciones fisiológicamente compatibles, tales como solución salina, solución de Hank o solución de Ringer. Además, los compuestos pueden formularse en forma sólida y redisolverse o suspenderse inmediatamente antes de usarse. Por ejemplo, se pueden usar formas liofilizadas de la metioninasa o asparaginasa.

La administración sistémica también se puede lograr por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera que ha de ser penetrar. Dichos penetrantes son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosal, sales biliares y derivados de ácido fusídico. Además, los detergentes pueden usarse para facilitar la penetración. La administración transmucosal, por ejemplo, puede realizarse a través de aerosoles nasales, inhaladores (para administración pulmonar), supositorios rectales o supositorios vaginales. Para la administración tópica, los compuestos se pueden formular en ungüentos, pomadas, geles o cremas, como es bien conocido en la técnica.

La divulgación abarca también el uso de dispositivos implantados o aplicados en el mamífero para administrar la enzima, por ejemplo a través de infusión u otra vía. En una modalidad especial, el dispositivo comprende dos cámaras o viales, uno que contiene metioninasa y el otro que contiene asparaginasa. El dispositivo tiene, para cada cámara o vial, un tubo y similares para suministrar la enzima a la circulación sanguínea, una válvula o bomba electrónica o eléctrica, o un pistón accionado, que es controlado por un circuito electrónico y un software adecuado. El circuito electrónico y su software controlan el suministro de metioninasa primero, durante un período de tiempo predeterminado, preferiblemente a una cierta velocidad, un período de retardo y luego la administración de asparaginasa, durante un período de tiempo predeterminado, preferiblemente a una cierta velocidad.

Composiciones que comprenden eritrocitos (glóbulos rojos o RBC) que encapsulan la enzima:

En una modalidad, la asparaginasa está encapsulada dentro de los eritrocitos y la composición comprende una suspensión de estos eritrocitos en un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la metioninasa se encapsula dentro de los eritrocitos y la composición comprende una suspensión de estos eritrocitos en un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la asparaginasa está en forma libre o en una forma pegilada (PEG-asparaginasa), en un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la metioninasa está en forma libre o en una forma pegilada (PEG-metioninasa), en un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la metioninasa se administra en una cantidad entre aproximadamente 100 y aproximadamente 100,000 IU, en particular entre aproximadamente 500 y aproximadamente 50,000 IU, preferiblemente entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5000 IU.

En una modalidad, la asparaginasa se administra una vez en una cantidad de entre aproximadamente 500 y aproximadamente 100,000 IU, en particular entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 50,000 IU, preferiblemente entre aproximadamente 5000 y aproximadamente 30,000 IU.

En una modalidad, la composición es para usarse para dos o más administraciones secuenciales, especialmente 2 o 3.

En una modalidad, la asparaginasa y la metioninasa se usan secuencialmente de conformidad con la invención, y estas enzimas se encapsulan en eritrocitos.

En una modalidad, la asparaginasa y la metioninasa se usan secuencialmente de conformidad con la invención, con la asparaginasa encapsulada en eritrocitos y la metioninasa en forma libre o bajo una forma pegilada.

En una modalidad, la asparaginasa y la metioninasa se usan secuencialmente de conformidad con la invención, con la metioninasa encapsulada en eritrocitos y la asparaginasa en forma libre o bajo una forma pegilada.

“Encapsulado” significa que la enzima está contenida dentro de los eritrocitos. Sin embargo, es posible que se retenga una pequeña cantidad de enzima dentro de la pared de los eritrocitos.

Metioninasa

La metioninasa también se llama, entre otras, L-metioninasa, Metionina Gamma Liasa MGL; este compuesto recibe el número EC 4.4.1.11 y el número CAS 42616-25-1. Con el fin de conocer las fuentes de metioninasa que se pueden usar de conformidad con la invención, se puede hacer mención en particular a la publicación El Sayed A, Applied Microbiol. Biotechnol. (2010) 86: 445-467.

Se puede producir una metioninasa recombinante en la bacteria Escherichia coli a partir de un gen que codifica la enzima, por ejemplo, de la bacteria Pseudomonas putida. La enzima obtenida de este modo llamada rMETasa puede usarse en forma libre o bajo una forma modificada, por ejemplo, forma pegilada (PEG-rMETasa). Ver X. Sun et al. Cancer Research 2003, 63: 8377-8383. También se puede encapsular en eritrocitos, la composición o suspensión conteniendo ventajosamente una cantidad de eritrocitos y una cantidad de metioninasa encapsulada que es suficiente para administrar al paciente la dosis de asparaginasa que se ha decidido.

El experto en la técnica puede consultar el documento WO 2015/121348 para composiciones y métodos de uso.

La composición de metioninasa puede comprender además el cofactor de la enzima, es decir, PLP, y/o un precursor del mismo, que puede ser un precursor que no es fosfato, tal como una forma que no es fosfato de vitamina B6, y/o un precursor de fosfato tal como como fosfato de piridoxina (PNP).

La vitamina B6 existe en diferentes formas, ya sea fosfato o no de fosfato. El fosfato de piridoxina (PNP), el fosfato de piridoxal (PLP) y el fosfato de piridoxamina (PMP) son las formas de fosfato de la misma. Las formas no fosfatadas correspondientes son piridoxina (PN), piridoxal (PL) y piridoxamina (PM). Las formas sin fosfato de la vitamina B6 pueden atravesar la membrana de los eritrocitos, que las formas de fosfato solo pueden atravesar con dificultad. Según la ruta predominante, la piridoxina (PN) se transforma dentro de los eritrocitos en PNP bajo el efecto de PN-quinasa, el PNP luego se transforma en PLP bajo el efecto de PNP-oxidasa. El PLP luego puede transformarse en piridoxal (PL) bajo el efecto de PLP-fosfatasa y el PL puede dejar los eritrocitos. Se entiende fácilmente que el precursor provisto es capaz de experimentar transformaciones en los eritrocitos durante el método de preparación o durante el almacenamiento de la composición.

Por una forma no fosfatada de vitamina B6, se entenderá aquí uno de los tres “vitámeros” de la vitamina B6 o una mezcla de dos o tres vitámeros: PL, PN y PM. La forma PN es preferida. También pueden estar en forma de sal.

La composición puede comprender PLP encapsulado en eritrocitos. El PLP puede proveerse durante el procedimiento de encapsulación o puede obtenerse total o parcialmente en los eritrocitos de su precursor. El PLP presente o formado puede estar asociado con la enzima. La composición puede por lo tanto comprender la holoenzima correspondiente, por ejemplo, metioninasa-PLP. En estas condiciones, la vida media de la enzima activa, como se observa, por ejemplo, con la duración del agotamiento plasmático de su sustrato, se incrementa considerablemente. La composición de conformidad con la invención da especialmente la posibilidad de preservar la actividad enzimática más allá de 24 horas después de la administración, especialmente a 1, 5, 10 o 15 días o más.

En una modalidad, la composición de metioninasa comprende por lo tanto fosfato de piridoxal (PLP) y/o una forma que no es fosfato de vitamina B6 y/o un precursor de fosfato, fosfato de piridoxina (PNP) y/o fosfato de piridoxamina (PMP).

De acuerdo con una característica, PNP y/o PMP están encapsulados dentro de los eritrocitos dentro de la composición. Este precursor puede ser co-encapsulado con la enzima o ser obtenido total o parcialmente en los eritrocitos de su propio precursor.

La composición comprende especialmente de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 600, especialmente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 100, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 pmol de PLP y/o PNP y/o PMP, encapsulado por litro (L) de glóbulos rojos (eritrocitos).

De acuerdo con una característica, la composición comprende eritrocitos que encapsulan la enzima PLP y PLP y posteriormente un precursor de PLP que no es fosfato, encapsulado en los eritrocitos, presente dentro de los eritrocitos o presente dentro y fuera de los eritrocitos. Este precursor que no es fosfato puede ser PN, PL o PM, preferiblemente PN, o una mezcla de dos o tres de estos compuestos. El precursor que no es fosfato puede estar presente dentro y/o fuera de los eritrocitos. La presencia de este precursor que no es fosfato brinda la posibilidad de alcanzar un nivel de PLP intraeritrocitos especialmente mayor que en ausencia de este precursor que no es fosfato.

En una modalidad, la composición comprende eritrocitos que encapsulan la metioninasa y, además, PLP y uno de sus precursores de fosfato, PNP, PLP y/o PMP. Esta misma composición puede comprender además ventajosamente un precursor que no es fosfato, especialmente PN, como se acaba de describir.

La composición o suspensión contiene ventajosamente una cantidad de eritrocitos y una cantidad de metioninasa encapsulada que es suficiente para administrar al paciente la dosis de metioninasa que se ha decidido.

La composición puede comprender además PLP o un precursor de PLP para la administración simultánea, separada o secuencial con la metioninasa. En una modalidad, la composición comprende metioninasa encapsulada dentro de eritrocitos y un precursor que no es fosfato de PLP para administración separada o secuencial.

De conformidad con una modalidad, la composición comprende (i) una formulación de eritrocitos y un vehículo farmacéuticamente aceptable, los eritrocitos que encapsulando la metioninasa, y (2i) una formulación de vitamina B6 en una forma no fosfatada, preferiblemente PN, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas formulaciones son para administración simultánea, separada o secuencial, y están dedicadas al agotamiento de metionina de conformidad con la invención. El método de uso presentado a continuación detallará los mejores modos de administración. La composición puede estar especialmente en forma de un conjunto o kit, que comprende por separado estas formulaciones. De conformidad con una modalidad, el vehículo farmacéuticamente aceptable en la formulación de eritrocitos es una “solución de conservación” para eritrocitos, es decir, una solución en la que los eritrocitos que encapsulan un ingrediente activo se suspenden en su forma adecuada para almacenarse mientras se espera su inyección. Una solución de conservación comprende preferiblemente al menos un agente que promueve la conservación de los eritrocitos, especialmente seleccionados entre glucosa, dextrosa, adenina y manitol. Posiblemente, la solución de conservación contiene fosfato inorgánico que permite la inhibición de la enzima PLP-fosfatasa intra-eritrocitos.

En una modalidad, la metioninasa encapsulada dentro de los eritrocitos debe administrarse al menos una vez, preferiblemente al menos dos veces antes de que se administre asparaginasa encapsulada en el interior de los eritrocitos, y cada administración de metioninasa debe ser seguida por la administración de un precursor de PLP sin fosfato antes de que la asparaginasa sea administrada.

La actividad de MGL se expresa en IU que corresponde a la cantidad de MGL requerida para liberar un micromol de amoniaco por minuto en las siguientes condiciones.

En presencia de su cofactor PLP, MGL hidroliza L-metionina en ácido alfa-cetobutírico, formando una molécula de amonio por molécula de L-metionina:

L-metionina H2O ^ metantiol NH4+ ácido alfa-cetobutírico

La dosificación de la actividad de MGL se realiza a 37°C, pH = 8.6, en presencia de 0.26 pg/ml de MGL, 20 nM de PLP y 25 mM de L-metionina, se puede usar una prueba comercialmente disponible (por ejemplo, Kit NH3, diagnóstico de Roche) El método consiste en medir la cinética de producción de amonio entre 5 minutos y 10 minutos de la reacción, cuando se alcanza la actividad máxima (Vmáx) de m Gl . La medición de la producción de amonio se obtiene midiendo la variación de la densidad óptica a 340 nm debido a la oxidación de NADPH a NADP+ por la glutamato deshidrogenasa (GLDH) en presencia de amonio y ácido alfa-cetoglutárico, de la siguiente manera:

Ácido alfa-cetoglutárico NH4+ NADPH ^ ácido L-glutámico NADP+ H2O.

Asparaginasa

La asparaginasa se designa con el número CAS: 9015-68-3. Su nombre habitual es asparaginasa; otros nombres comunes para ésta son: colaspasa, L-asparaginasa y L-asparagina aminohidrolasa.

El término asparaginasa en el sentido de la presente invención cubre la asparaginasa de cualquier origen, puede ser en particular de origen natural o recombinante, y cualquier derivado que incorpore asparaginasa, tal como por ejemplo una forma pegilada o PEG (PEG-asparaginasa), o un fragmento que retiene la actividad de L-asparaginasa. También cubre la asparaginasa cualquiera que sea su origen bacteriano. Por lo tanto, la asparaginasa puede ser del tipo de E. coli, en particular E. coli HAP-A-1-3, del tipo de Erwinia chrysanthemi o del tipo de Wolinella succinogenes. Por “tipo” se entiende que puede obtenerse a partir de un cultivo de la bacteria en cuestión o que puede ser recombinante, en otras palabras, una forma de asparaginasa de esa bacteria obtenida por ingeniería genética. En un modo de implementación preferido, es del tipo E. coli HAP-A-1-3.

Los productos comerciales están disponibles y se pueden usar en este documento: 5000 U Medac, 10000 U Medac®, Oncaspar®. El producto está en forma de polvo, para ser solubilizado antes de usarse en un líquido inyectable o agua. Pueden estar presentes excipientes, tales como fosfato diácido de sodio 1H2O, fosfato monoácido de sodio 7 H2O y/o cloruro de sodio.

El término asparaginasa también cubre sustancias de tipo asparaginasa que, en el sentido de la invención, son enzimas bacterianas que tienen una actividad de L-asparagina aminohidrolasa. A modo de ejemplo, puede citarse la Acinetobacter Glutaminasa-Asparaginasa (AGA).

De conformidad con una modalidad de la invención, la asparaginasa es encapsulada en eritrocitos y la composición o suspensión contiene ventajosamente una cantidad de eritrocitos y una cantidad de asparaginasa encapsulada que es suficiente para administrar al paciente la dosis de asparaginasa que se ha decidido.

Una asparaginasa de una IU se define de manera tan habitual como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 pmol de amoníaco por minuto a pH 7.3 y 37°C de L-asparagina, la cantidad de L-asparaginasa estando en exceso.

Encapsulación en eritrocitos

De conformidad con una modalidad, la composición de metioninasa y/o la composición de asparaginasa comprende eritrocitos que encapsulan la enzima y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, los eritrocitos son obtenidos de un mamífero de la misma especie que el sujeto tratado. Cuando el mamífero es un ser humano, los eritrocitos son preferiblemente de origen humano. En una modalidad, los eritrocitos provienen del propio paciente.

De conformidad con una modalidad, el vehículo farmacéuticamente aceptable es una “solución de conservación” para eritrocitos, es decir, una solución en la que los eritrocitos que encapsulan la enzima se suspenden en su forma adecuada para almacenarse mientras se espera su inyección. Una solución de conservación comprende preferiblemente al menos un agente que promueve la conservación de los eritrocitos, especialmente seleccionados de glucosa, dextrosa, adenina y manitol.

La solución de conservación puede ser una solución acuosa que comprende NaCl, adenina y al menos un compuesto entre glucosa, dextrosa y manitol.

La solución de conservación puede comprender NaCl, adenina y dextrosa, preferiblemente un medio de AS3.

La solución de conservación puede comprender NaCl, adenina, glucosa y manitol, preferiblemente un medio de SAG-manitol o ADsol.

En particular, la composición o suspensión, en una solución de conservación, se caracteriza por un nivel de hemoglobina extracelular mantenido a un nivel igual o inferior a 0.5, en particular 0.3, especialmente 0.2, preferiblemente 0.15, incluso mejor 0.1 g/dl a las 72 hr y conservación a una temperatura comprendida entre 2 y 8°C.

En particular, la composición o suspensión, en una solución de conservación, se caracteriza por un nivel de hemoglobina extracelular mantenido a un nivel igual o inferior a 0.5, en particular 0.3, especialmente 0.2, preferiblemente 0.15, incluso mejor 0.1 g/dl durante un período comprendido entre 24 hr y 20 días, especialmente entre 24 y 72 hr y conservación a una temperatura comprendida entre 2 y 8°C.

El nivel de hemoglobina extracelular se mide ventajosamente por el método de referencia manual descrito en G.B. Blakney y A.J. Dinwoodie, Clin. Biochem. 8, 96-102, 1975. También existen dispositivos automáticos que permiten que esta medición se realice con una sensibilidad que es específica para ellos.

En particular, la composición o suspensión, en una solución de conservación, se caracteriza por una tasa de hemólisis mantenida igual o menor que 2, especialmente 1.5, preferiblemente 1% a 72 hr y conservación a una temperatura comprendida entre 2 y 8°C.

En particular, la composición o suspensión, en una solución de conservación, se caracteriza por una tasa de hemólisis mantenida igual o menor que 2, especialmente 1.5, preferiblemente 1%, durante un período comprendido entre 24 hr y 20 días, especialmente entre 24 y 72 hr y a una temperatura comprendida entre 2 y 8°C.

Métodos de encapsulación

La encapsulación de las enzimas en eritrocitos se puede realizar usando una suspensión de eritrocitos que se pone en contacto con un medio líquido hipotónico que da como resultado la apertura de poros en la membrana de los eritrocitos. Existen tres alternativas en la técnica de lisis-resellado, que son la diálisis hipotónica, el pre-hinchado hipotónico y la dilución hipotónica, todas basadas en la diferencia en la presión osmótica entre el interior y el exterior de los eritrocitos. Se prefiere la diálisis hipotónica.

La suspensión de eritrocitos que encapsulan la enzima se puede obtener especialmente con el siguiente método:

1 - suspender un sedimento de eritrocitos en una solución isotónica a un nivel de hematocrito igual o superior a 65%, enfriando entre 1 y 8°C;

2 - un procedimiento de lisis, a una temperatura mantenida entre 1 y 8°C, que comprende el paso de la suspensión de eritrocitos a un nivel de hematocrito igual o superior a 65% y de una solución de lisis hipotónica enfriada entre 1 y 8°C, en un dispositivo de diálisis, tal como una bobina o un cartucho de diálisis (se prefiere el cartucho);

3 - un procedimiento de encapsulación añadiendo, preferentemente en forma gradual, la enzima que ha de ser encapsulada (especialmente en una solución previamente preparada) en la suspensión antes o durante la lisis, a una temperatura mantenida entre 1 y 8°C; y

4 - un procedimiento de resellado llevado a cabo en presencia de una solución isotónica o hipertónica, ventajosamente hipertónica, a una temperatura más alta, especialmente comprendida entre 30 y 42°C.

En una alternativa preferida, se puede hacer uso del método descrito en el documento WO-A-2006/016247 (documento EP 1773452, que se incorpora aquí como referencia):

1 - suspender un sedimento de eritrocitos en una solución isotónica a un nivel de hematocrito igual o superior al 65%, enfriar entre 1 y 8°C,

2 - medir la fragilidad osmótica de una muestra de eritrocitos de este mismo sedimento,

3 - un procedimiento de lisis, a una temperatura mantenida entre 1 y 8°C, que comprende el paso de la suspensión de eritrocitos a un nivel de hematocrito igual o superior a 65% y de una solución de lisis hipotónica enfriada entre 1 y 8°C, en un dispositivo de diálisis, como una bobina o un cartucho de diálisis (se prefiere el cartucho); los parámetros de lisis se ajustan de acuerdo con la fragilidad osmótica medida anteriormente; especialmente, dependiendo de la fragilidad osmótica medida, se ajusta el flujo de la suspensión de eritrocitos que pasa al dispositivo de diálisis o se ajusta la osmolaridad de la solución de lisis; y

4 - un procedimiento para la encapsulación añadiendo, preferentemente en forma gradual, la enzima que se va a encapsular (especialmente en una solución previamente preparada) en la suspensión antes y durante la lisis, a una temperatura mantenida entre 1 y 8°C; y

5 - un procedimiento de resellado llevado a cabo en presencia de una solución isotónica o hipertónica, ventajosamente hipertónica, a una temperatura más alta, especialmente comprendida entre 30 y 42°C.

Notablemente, para la diálisis, el sedimento de eritrocitos se suspende en una solución isotónica con un alto nivel de hematocrito, igual o superior a 65%, y preferiblemente igual o superior a 70%, y esta suspensión se enfría entre 1 y 8°C, preferiblemente entre 2 y 6°C, generalmente alrededor de 4°C. De conformidad con un método particular, el nivel de hematocrito está comprendido entre 65 y 80%, preferiblemente entre 70 y 80%.

Cuando se mide, la fragilidad osmótica se mide ventajosamente en los eritrocitos justo antes del paso de lisis, en presencia o en ausencia, preferiblemente en presencia de la enzima que se ha de encapsular. Los eritrocitos o la suspensión que los contiene están ventajosamente a una temperatura próxima o idéntica a la temperatura seleccionada para la lisis. De conformidad con otra característica ventajosa de la invención, la medición conducida de la fragilidad osmótica se utiliza rápidamente, es decir, el procedimiento de lisis se lleva a cabo en un tiempo corto después de tomar la muestra. Preferiblemente, este lapso de tiempo entre el muestreo y el comienzo de la lisis es inferior o igual a 30 minutos, aún mejor inferior o igual a 25 e incluso a 20 minutos.

Con respecto a cómo llevar a cabo el procedimiento de lisis-resellado con medición y teniendo en cuenta la fragilidad osmótica, un experto en la técnica puede referirse para más detalles al documento WO-A-2006/016247. Este documento se incorpora aquí como referencia.

Una mejora de esta técnica de encapsulación se describió en el documento WO 2014/180897, al que puede hacer referencia un experto en la técnica y que se incorpora en este documento como referencia. Por tanto, de acuerdo con una modalidad, los eritrocitos que encapsulan la enzima se obtienen mediante un método que comprende la encapsulación del ingrediente activo en el interior de los eritrocitos mediante lisis-resellado, la obtención de una suspensión o de un sedimento que comprende eritrocitos que incorporan la enzima y una solución con una osmolalidad superior o igual a 280 mOsmol/kg, preferiblemente entre aproximadamente 280 y aproximadamente 380 mOsmol/kg, preferiblemente entre aproximadamente 290 y aproximadamente 330 mOsmol/kg, la incubación del sedimento o de la suspensión como tal o después de añadir una solución de incubación, a una osmolalidad superior o igual a 280 mOsmol/kg, en particular entre aproximadamente 280 y aproximadamente 380 mOsmol/kg, preferiblemente entre aproximadamente 290 y aproximadamente 330 mOsmol/kg. La incubación se lleva a cabo especialmente durante un período superior o igual a 30 minutos, en particular superior o igual a 1 hr. Luego se procede con la eliminación del medio líquido de la solución incubada y los eritrocitos obtenidos se suspenden en una solución que permite la inyección de la suspensión en un paciente, preferiblemente una solución de conservación que permite la inyección de la suspensión en un paciente. La osmolalidad indicada es la de la solución en la que los eritrocitos están suspendidos o en un sedimento en el momento relevante.

Por «suspensión de eritrocitos estabilizada», se entiende especialmente una suspensión que tiene un contenido de hemoglobina extracelular que permanece inferior o igual a 0.2 g/dl hasta su uso en seres humanos, este último puede ser intermedio especialmente de 1 a 72 horas después de producir el lote de eritrocitos incorporado el ingrediente activo.

Por «suspensión de eritrocitos estabilizada lista para usar» se entiende la suspensión estabilizada en una solución que permite la inyección en un paciente, especialmente en una solución de conservación. Su hematocrito es generalmente igual o superior a 35%, 40% o 45%.

Por «sedimento de eritrocitos», se entiende un concentrado o concentración de eritrocitos recogidos después de separar los eritrocitos del medio líquido en el que se suspendieron previamente. La separación puede asegurarse por filtración o centrifugación. La centrifugación es el medio generalmente usado para dicha separación. Un sedimento comprende una cierta proporción de medio líquido. Generalmente, el sedimento tiene un hematocrito comprendido entre 70 y 85%.

Por «solución de incubación», se entiende la solución en la que los eritrocitos que encapsulan un ingrediente activo están presentes durante el paso de incubación. La incubación puede realizarse en una amplia gama de hematocritos, especialmente entre 10 y 85% del hematocrito.

Por «eritrocitos frágiles» se entienden los eritrocitos procedentes del procedimiento de incorporación que, una vez suspendidos en una solución de conservación, se lisan cuando la suspensión se conserva entre 2 y 8°C, especialmente después de 1 a 72 hr.

Por «hematocrito inicial», se entiende el hematocrito antes de la pérdida celular debido a la lisis de los eritrocitos frágiles durante la incubación.

El método puede comprender los siguientes pasos:

(a) encapsulación de la enzima dentro de los eritrocitos, que comprende la puesta de los eritrocitos en contacto con un medio hipotónico (que permite la apertura de los poros en la membrana de los eritrocitos), el contacto con el ingrediente activo (para permitir su entrada en los eritrocitos), el resellado de los eritrocitos, en particular por medio de un medio isotónico o hipertónico, ventajosamente hipertónico,

(b) obtener o preparar una suspensión o sedimento que comprende eritrocitos que incorporan la enzima y una solución con una osmolalidad superior o igual a 280 mOsmol/kg, en particular entre aproximadamente 280 y aproximadamente 380 mOsmol/kg, preferiblemente entre aproximadamente 290 y aproximadamente 330 mOsmol/kg, (c) incubar el sedimento o la suspensión del paso (b) como tal o después de añadir una solución de incubación, con una osmolalidad superior o igual a 280 mOsmol/kg, en particular entre aproximadamente 280 y aproximadamente 380 mOsmol/kg, preferiblemente entre aproximadamente 290 y aproximadamente 330 mOsmol/kg, durante un período superior o igual a 30 minutos, especialmente superior o igual a 1 hr,

(d) eliminar el medio líquido de la suspensión incubada del paso (c),

(e) suspender los eritrocitos obtenidos en (d) en una solución que permite la inyección de la suspensión en un paciente, preferiblemente una solución de conservación que permite la inyección de la suspensión en un paciente.

De conformidad con un primer método, el paso siguiente a la encapsulación mediante lisis-resellado, especialmente el paso (b), incluye al menos 1 ciclo de lavado, preferiblemente 2 o 3 ciclos de lavado, por dilución de la suspensión o sedimento obtenido en el paso de lisis-resellado o paso (a) en una solución, con una osmolalidad superior o igual a 280 mOsmol/kg, en particular entre aproximadamente 280 y aproximadamente 380 mOsmol/kg, preferiblemente entre aproximadamente 290 y aproximadamente 330 mOsmol/kg, y luego obtener un sedimento de eritrocitos o una suspensión. Este sedimento o esta suspensión comprende eritrocitos que incorporan la enzima y una solución con una osmolalidad superior o igual a 280 mOsmol/kg, en particular entre aproximadamente 280 y aproximadamente 380 mOsmol/kg, preferiblemente entre aproximadamente 290 y aproximadamente 330 mOsmol/kg. Los siguientes pasos, por ejemplo, (c), (d) y (e) se aplican a continuación.

De conformidad con un segundo método, en el paso de lisis-resellado o paso (a), el resellado de los eritrocitos por medio de un medio isotónico o hipertónico produce la suspensión de eritrocitos que luego pueden estar sujetos a incubación, por ejemplo, la suspensión del paso (b), en una solución con una osmolalidad superior o igual a 280 mOsmol/kg, en particular entre aproximadamente 280 y aproximadamente 380 mOsmol/kg, preferiblemente entre aproximadamente 290 y aproximadamente 330 mOsmol/kg. En otras palabras, el paso de lisis-resellado o paso (a) incluye un paso para resellar los eritrocitos en el que los eritrocitos suspendidos que encapsulan la enzima se mezclan con una solución de resellado isotónica o hipertónica, ventajosamente hipertónica, produciendo una suspensión de eritrocitos con una osmolalidad superior o igual a 280 mOsmol/kg, en particular entre aproximadamente 280 y aproximadamente 380 mOsmol/kg, preferiblemente entre aproximadamente 290 y aproximadamente 330 mOsmol/kg. En este método, el paso de incubación o paso (c) comprende la incubación de la suspensión derivada del resellado. La incubación se lleva a cabo durante un período superior o igual a 30 minutos, especialmente superior o igual a 1 hr. Los siguientes pasos, por ejemplo (d) y (e), se aplican a continuación.

Los pasos posteriores a la lisis-resellado, por ejemplo, (b) a (e), se llevan a cabo en condiciones que dan como resultado la lisis de los eritrocitos frágiles, o de la mayoría de ellos, especialmente más de 50, 60, 70, 80 o 90%, o más. Para ello, es posible actuar en función del período de incubación, la temperatura de incubación y la osmolalidad de la solución en la que se suspenden los eritrocitos. Cuanto mayor es la osmolalidad, mayor es el tiempo de incubación. Por lo tanto, cuanto menor es la osmolalidad, más corta puede ser la incubación para obtener el mismo efecto. Además, cuanto mayor es la temperatura, más corto puede ser el tiempo de incubación, y viceversa. Uno o varios ciclos de lavado permitirán la eliminación de los desechos celulares y la hemoglobina extracelular, así como la enzima extracelular.

De conformidad con la invención, un ciclo de lavado comprende la dilución de la suspensión o sedimento de eritrocitos, y luego la separación entre los eritrocitos y la solución de lavado. Preferiblemente, un paso de lavado comprende preferiblemente 2 o 3 ciclos de dilución-separación. La separación se puede lograr por cualquier medio adecuado, tal como filtración y centrifugación. Se prefiere la centrifugación.

La incubación no está limitada por el hematocrito de la suspensión. De esta manera, puede incubarse una suspensión que tiene un hematocrito inicial comprendido generalmente entre 10 y 85%, especialmente entre 40 y 80%. Esto se conoce como un sedimento de 70% y como una suspensión por debajo de este valor.

El paso de eliminación o paso (d) tiene como objetivo eliminar la porción líquida de la suspensión o del sedimento incubado, a fin de eliminar especialmente los restos celulares y la hemoglobina extracelular, así como, en consecuencia, la enzima extracelular.

De conformidad con un primer método para el paso de eliminación o paso (d), se lleva a cabo la separación, especialmente la centrifugación, siendo esto especialmente aplicable a una suspensión. Esta separación puede ser seguida por uno o varios, por ejemplo 2 o 3 ciclos de lavado, por dilución en una solución isotónica, y luego separación, especialmente por centrifugación.

De conformidad con un segundo método para el paso de eliminación o paso (d), se lleva a cabo la dilución antes de la separación, en particular la centrifugación, que es aplicable a una suspensión o a un sedimento. La dilución puede llevarse a cabo especialmente con una solución de lavado isotónica o con una solución de conservación.

El último paso o paso (e) consiste en preparar la suspensión final de tal manera que se pueda administrar al paciente, sin ningún otro tratamiento.

De conformidad con un primer método para esta paso, se lleva a cabo una dilución del sedimento de eritrocitos desde el paso de eliminación o paso (d) con la solución de inyección, especialmente la solución de conservación.

De conformidad con un segundo método para este paso, uno o varios ciclos para lavar el sedimento de eritrocitos procedentes del paso de eliminación o paso (d) se llevan a cabo con la solución de inyección, especialmente la solución de conservación, mediante dilución seguida de separación. Después del lavado, los eritrocitos son re-suspendidos en la solución de inyección, especialmente la solución de conservación.

El método de la invención puede comprender además una, varias o la totalidad de las siguientes características:

- el paso de incubación o paso (c) se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 2 y aproximadamente 39°C, durante un tiempo suficiente para asegurar la lisis de eritrocitos frágiles;

- el paso o paso de incubación (c) se lleva a cabo a baja temperatura, especialmente comprendida entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10°C, en particular entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8°C, y dura de aproximadamente 1 hr a aproximadamente 72 hr, especialmente de aproximadamente 6 hr a aproximadamente 48 hr, preferiblemente de aproximadamente 19 hr a aproximadamente 30 hr;

- el paso de incubación o paso (c) se realiza a una temperatura superior comprendida entre aproximadamente 20 y aproximadamente 39°C, especialmente a temperatura ambiente (25°C ± 5°C) y dura de aproximadamente 30 min a aproximadamente 10 hr, especialmente de aproximadamente 1 hr a aproximadamente 6 hr, preferiblemente de aproximadamente 2 hr a aproximadamente 4 hr; es posible operar a una temperatura aún mayor que la temperatura ambiente, pero esto puede tener un impacto negativo en el rendimiento celular, P50 y/o el contenido de 2,3-DPG;

- en el paso de incubación o paso (c), la suspensión tiene un hematocrito inicial comprendido entre 10 y 85%, especialmente entre 40 y 80%; se puede incubar un sedimento de separación, que tiene por ejemplo un hematocrito entre 70 y aproximadamente 85%, o un sedimento diluido que tiene un hematocrito comprendido entre aproximadamente 40 y 70%;

- el paso de incubación comprende la agitación de la suspensión;

- el paso de incubación no comprende ninguna agitación;

- como solución para lavado y/o incubación, se usa una solución acuosa medida de NaCl para obtener la osmolalidad deseada; como ejemplo, una solución puede comprender por lo tanto 0.9% de NaCl; esta solución también puede comprender, especialmente además de NaCl, glucosa, especialmente glucosa monohidratada, fosfato monosódico dihidratado, fosfato disódico dodecahidratado; como ejemplo, una composición comprende: 0.9% de NaCl, 0.2% de glucosa monohidratada, 0.034% de fosfato monosódico dihidratado, 0.2% de fosfato disódico dodecahidratado;

- el lavado en el último paso o paso (e) se lleva a cabo con la solución de conservación;

- la osmolalidad de la solución (porción líquida) en la suspensión lista para usar o que puede inyectarse en el paciente está comprendida entre aproximadamente 280 y aproximadamente 380 mOsmol/kg, preferiblemente entre aproximadamente 290 y aproximadamente 330 mOsmol/kg;

- el hematocrito de la suspensión lista para usar o que puede inyectarse en el paciente es igual o superior a 35%, 40% o 45%;

- todos los pasos para lavado, incubación se llevan a cabo con la solución de conservación;

- la solución de lavado del paso (b) y/o la solución de lavado del paso (e) y la solución de conservación son de la misma composición y comprenden compuesto(s) que promueve(n) la conservación de los eritrocitos;

- la solución de conservación (y la(s) solución(es) de lavado o las soluciones de incubación si es necesario) es una solución acuosa que comprende NaCl, adenina y al menos un compuesto entre glucosa, dextrosa y manitol;

- la solución de conservación (y la(s) solución(es) de lavado o incubación si es necesario) comprende NaCl, adenina y dextrosa, preferiblemente un medio de AS3;

- la solución de conservación (y la(s) solución(es) de lavado o incubación, si es necesario) comprenden NaCl, adenina, glucosa y manitol, preferiblemente un medio de SAG-manitol o ADsol.

Los métodos de conformidad con la invención comprenden especialmente el siguiente paso:

(a) encapsular la enzima dentro de los eritrocitos, que comprende el contacto con un medio hipotónico que permite la apertura de los poros en la membrana de los eritrocitos, el contacto con la enzima para permitir su entrada en los eritrocitos, el resellado de los eritrocitos por medio de un medio isotónico o hipertónico. Cabe señalar que la enzima puede estar presente en la suspensión de eritrocitos antes de la lisis de esta última, o además puede agregarse durante la lisis o después de la lisis, pero siempre antes de resellar. En una modalidad de este paso (a), el método comprende los siguientes subpasos:

(a1) tener una suspensión de eritrocitos con un hematocrito igual o superior a 60 o 65%, (a2) medir la fragilidad osmótica de los eritrocitos en esta suspensión,

(a3) un procedimiento para la lisis y la internalización de los ingredientes activos, que comprende el paso de la suspensión de eritrocitos a un dispositivo de diálisis, especialmente un cartucho de diálisis, en contra de una solución de lisis, ajustando el flujo de la suspensión de eritrocitos o ajustando el velocidad de flujo de la solución de lisis o ajustando la osmolaridad de la solución de lisis, dependiendo de la fragilidad osmótica medida en (a2),

(a4) un procedimiento para resellar los eritrocitos.

Usos médicos

En un primer aspecto, la invención consiste en privar al mamífero de metionina, y luego privar al mamífero de asparagina, especialmente a través de la administración de asparaginasa en cantidad suficiente. Lo que se busca es reducir la cantidad de metionina y asparagina disponible para las células cancerosas. La privación de metionina puede realizarse como se mencionó anteriormente a través de la administración de metioninasa.

En un segundo aspecto, la invención es tratar el cáncer en un mamífero que lo necesita, comprendiendo administrar, especialmente inyectar, al mamífero que lo necesita, una composición que comprende metioninasa y luego una composición que contiene asparaginasa.

La administración secuencial, el retraso entre la privación de metionina y/o la administración de metioninasa y la administración de asparaginasa, dosificaciones, administraciones repetidas y formas de composiciones farmacéuticas (forma libre, forma pegilada y/o suspensión de eritrocitos (RBC) que encapsulan la enzima) se han detallado anteriormente y se aplican a los métodos de uso.

En una modalidad, la metioninasa (por ejemplo, en forma libre, forma pegilada o encapsulada) se administra una vez o más.

En otra modalidad, la metioninasa libre o pegilada se administra más de una vez antes de la administración de asparaginasa, por ejemplo, dos o más (por ejemplo, 3, 4, 5) dosis de metioninasa se administran al mamífero, generalmente en días diferentes, por ejemplo diariamente.

En una modalidad, se administra una cantidad eficaz del cofactor de metioninasa al paciente. Se puede administrar antes, al mismo tiempo o después de la administración de metioninasa. En una modalidad, está presente en la misma composición que la metioninasa. En otra modalidad, se administra en una composición separada.

En una modalidad, se realiza la administración de metioninasa encapsulada en eritrocitos, y el cofactor también se puede encapsular o el cofactor puede estar en forma libre en una solución. En una modalidad preferida, el cofactor está en solución en un vehículo farmacéuticamente aceptable y es una forma no fosfatada de vitamina B6, preferiblemente PN. Esta solución de vitamina B6 sin fosfato se puede administrar por inyección o vía oral, o por cualquier otra vía. En una modalidad, la solución se administra una vez o más después de cada inyección de metioninasa encapsulada, por ejemplo entre 1 y 10 horas después. Preferiblemente, la solución se administra ventajosamente una vez al día, o bien dos veces o más por día, durante el tiempo del tratamiento con metioninasa o la duración de la actividad de la metioninasa en la circulación sanguínea (dependiendo de la vida media de la misma). Con la metioninasa encapsulada en el interior de los eritrocitos, el cofactor en solución se puede administrar al menos una vez al día durante entre 10 y 30 días.

En una modalidad, la asparaginasa en forma libre, forma pegilada o encapsulada se administra una vez o más.

En otra modalidad, la asparaginasa libre o pegilada se administra más de una vez, por ejemplo, se administran al mamífero dos o más (por ejemplo, 3, 4, 5) dosis de asparaginasa, generalmente en días diferentes, por ejemplo, diariamente.

En una modalidad, la metioninasa y/o asparaginasa está en forma de polvo y el método de uso comprende la solubilización del mismo en una solución o líquido farmacéuticamente aceptable antes de la administración al mamífero.

En una modalidad, se hace uso de un dispositivo como se describió anteriormente. Por lo tanto, el tratamiento de cáncer comprende la implantación o colocación sobre el mamífero, especialmente el ser humano, de un dispositivo como el descrito. La implantación o colocación puede comprender la conexión de los tubos a un vaso sanguíneo o a un catéter y similar que ya está en su lugar. El dispositivo se puso entonces en marcha para su administración secuencial de acuerdo con una programación de su software de acuerdo con el tratamiento de la invención.

Ventajosamente, la suspensión de eritrocitos que encapsula metioninasa o asparaginasa en solución de conservación está lista para usarse, y preferiblemente puede tener un bajo nivel de hemoglobina extracelular, que se ajusta en particular a las recomendaciones de la FDA.

En una primera modalidad, la inyección se administra a un mamífero, especialmente a un paciente humano, de una suspensión de RBC que encapsula el ingrediente activo preparado entre 1 y 72 hr, en particular entre 10 y 72 hr antes de la inyección. El hematocrito de esta suspensión es 40% o más. Está contenido en una solución de conservación. El nivel de hemoglobina extracelular es 0.5 o inferior, en particular 0.3 o inferior, muy particularmente 0.2 o inferior, preferiblemente 0.15 o inferior, muy preferiblemente 0.1 g/dl o inferior, y/o la tasa de hemólisis es 2 o inferior, en particular 1.5 o inferior, preferiblemente 1% o inferior. La suspensión no está sujeta a lavado o similar antes de la inyección.

En otra modalidad, este método comprende los pasos de proveer glóbulos rojos empacados, colocándolas en suspensión en regulador de pH fisiológico a un hematocrito de 60 o 65% o superior, encapsulando el ingrediente activo en estos RBC usando procedimiento de lisis y resellado, incubando los RBC obtenidos, lavando estos últimos y recogiendo una suspensión final de glóbulos rojos. El hematocrito de la suspensión es 40% o más. Está contenido en una solución de conservación. Esta suspensión se almacena a una temperatura entre 2 y 8°C. Esta suspensión final se inyecta en el mamífero, especialmente en un paciente humano entre 1 hr y 72 hr, preferiblemente entre 24 y 72 hr después de la preparación de la suspensión. El nivel de hemoglobina extracelular de esta suspensión es 0.5 o inferior, en particular 0.3 o inferior, muy particularmente 0.2 o inferior, preferiblemente 0.15 o inferior, muy preferiblemente aún 0.1 g/dl o menos y/o su tasa de hemólisis es 2 o inferior, en particular 1.5, o inferior preferiblemente 1% o inferior. La suspensión no está sujeta a lavado o similar antes de la inyección.

Las composiciones tienen como objetivo el tratamiento de tumores líquidos (hematológicos) y sólidos auxótrofos para asparagina y/o metioninasa. Como ejemplos de leucemia se pueden citar (leucemia mieloide aguda, leucemia promielocítica aguda) y cáncer gástrico (carcinoma en estadio IV, adenocarcinoma).

La invención se describirá ahora con más detalle mediante las siguientes realizaciones no limitantes.

La figura 1 es un gráfico que muestra el % de viabilidad celular en diferentes condiciones de tratamiento.

Las figuras 2 y 3 son gráficos que muestran el % de viabilidad celular bajo diferentes condiciones de condiciones de tratamiento.

La figura 4 es un gráfico que muestra el volumen tumoral individual con la mediana en función del tiempo.

Ejemplo 1

I. Abreviaturas

CCK-8: Conteo de células kit-8

DPBS: solución salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco

IMDM: Dulbecco modificado por Iscove

MGL: metionina-Y-liasa

v/v: volumen a volumen

II. Condiciones de operación

11.1 Artículo de prueba

11.1.1. L-asparaginasa

Descripción: Medac® (Alemania), L-asparaginasa de E. coli, 10000 IU

Se preparó una concentración de L-asparaginasa (2.53 IU/ml) mediante diluciones en serie en solución salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco (DPBS) 1 X. La concentración de L-asparaginasa se diluyó 11 veces para obtener una concentración final de 0.23 IU/ml (IC50)

11.1.2. Metionina-Y-liasa (MGL)

Descripción: metionina-Y-liasa (MGL) de P. putida producida en E. coli.

Se preparó una concentración de MGL (2.09 IU/ml) mediante diluciones en serie en solución salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco (DPBS) 1 X. La concentración de MGL se diluyó 11 veces para obtener una concentración final de 0.19 IU/ml (IC50).

11.2 Líneas celulares

11.2.1. Descripción

Nombre: línea celular HL-60

Descripción: Línea celular de leucemia promielocítica humana (suspensión)

Proveedor y número de referencia: ATCC, CCL-240

11.2.2. Condiciones culturales

Las células se cultivaron en un IMDM con medio L-glutamina y se suplementaron con 20% (v/v) de suero de bovino fetal, 100 IU/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. El subcultivo se realizó de acuerdo con PO-CELL-002 y PO-CELL-005.

II.2.3. Kit colorimétrico

Nombre: Conteo de células Kit-8 (CCK-8)

Proveedor y número de referencia: Fluka 96992

Principio: el reactivo CCK-8 contiene una sal de tetrazolio altamente soluble en agua WST-8. WST-8 es reducido por deshidrogenasas en las células para dar un producto de color amarillo (formazano) que es soluble en el medio de cultivo de tejido. La cantidad del colorante de formazano generado por la actividad de las deshidrogenasas en las células es directamente proporcional al número de células vivas.

La prueba colorimétrica se realizó de acuerdo con PO-CELL-004.

III. Ensayo de citotoxicidad

III.1 Método

Se dispensaron quince mil células en 100 pL/pozo en cinco placas de fondo plano de 96 pozos. Además, se llenaron 2 pozos con medio de cultivo para control de testigo en cada placa. Todos los pozos vacíos se llenaron con medio de cultivo para reducir al mínimo la evaporación y la condensación. El día 0 (DO), se añadieron 10 pL de concentraciones IC50 de L-asparaginasa o MGL a los pozos correspondientes. Los controles (pozos con testigo y placa de control) recibieron 10 pL de DPBS 1 X. El día 3 (D3), se retiró el medio de los pozos y se reemplazó por medio nuevo y 10 pL de DPBS 1 X o 10 pL de concentraciones IC50 de L-asparaginasa (para células previamente incubadas con MGL) o MGL (para células previamente incubadas con L-asparaginasa) añadidas a los pozos correspondientes. Los controles (testigo y control positivo) recibieron 10 pL de DPBS 1 X. Luego, las placas se incubaron durante 3 días más en la incubadora. Al final del período de incubación (D6), se añadieron 10 pL de solución de CCK-8 a cada pozo de acuerdo con PO-CELL-004 y las placas se incubaron durante 2 horas en la incubadora. La densidad óptica (DO) se determinó luego a 450 nm usando un lector de microplacas.

III.2 Controles internos

Los controles se realizaron por duplicado.

III.2.1. Pozos en blanco

Se produce una ligera absorbancia espontánea alrededor de 460 nm en el medio de cultivo con CCK-8. La absorbancia de fondo depende del medio de cultivo, el pH, el tiempo de incubación y la duración de la exposición a la luz. Por lo tanto, se realizaron pozos con testigo que contenían 100 pL de medio de cultivo y 10 pL de L-asparaginasa o diluyente de MGL, DPBS 1 X. La absorción promedio de estos pozos control se restó a los otros pozos que contenían células.

III.2.2. Control de viabilidad (control positivo)

Como control positivo para la línea celular HL-60 (100% de viabilidad celular), las células se cultivaron en el medio de cultivo (100 pL) sin L-asparaginasa ni MGL, pero con 10 pL del diluyente (DPBS 1 X).

III.3 Determinación de viabilidad celular

El medio de cultivo sin células constituyó controles testigo (DO Testigo). Las células sin L-asparaginasa ni MGL constituyeron controles positivos (control de viabilidad).

El porcentaje de células vivas se calculó como se muestra a continuación:

DOL-aspa+MGL* - DOTestigo

------------------------------------------------------------- X 100

DOviabilidad-control** - DOTestigo

*: células con tratamiento con L-asparaginasa y MGL

**: células sin tratamiento con L-asparaginasa y MGL

Los cálculos se realizaron automáticamente a través del software Gen 5 que conduce el lector de microplacas. La densidad óptica media (DO) de los 2 pozos con testigo se restó automáticamente de todas las densidades ópticas. Los cálculos de la viabilidad celular se realizaron para el tratamiento secuencial.

IV. Resultados

IV.1 Control interno

Los controles internos fueron aceptables cuando no se especificaron en datos brutos.

I V.2 Cálculos IC50 con L-asparaginasa o MGL solo

Los porcentajes de viabilidad celular con fármaco solo (MGL o L-asparaginasa) se controlaron en cada experimento de combinación de fármacos,

IV.2.1. Adición secuencial de L-asparaginasa y MGL

El experimento con tratamiento secuencial de L-asparaginasa y MGL se realizó una vez con datos duplicados. Todos los controles de calidad (control de testigo y positivo) fueron aceptados en experimentos. Los detalles de % de los cálculos de viabilidad celular y la representación gráfica se presentan a continuación en la Tabla 1 y en la Figura 1.

Tabla 1: % de viabilidad celular para controles y asociación de enzimas

Los resultados indicaron que la asociación de enzimas con MGL añadida a la dosis de IC50 antes de la adición de L-asparaginasa a la dosis de IC50 (en rojo en la Figura 1) permitió reducir la viabilidad celular de:

- 76% en comparación con IC50 L-asparaginasa (control de IC50 para L-asparaginasa),

- 70% en comparación con MGL (control IC50 para MGL),

- 75% en comparación con la asociación enzimática con L-asparaginasa añadida en primer lugar a la dosis de IC50. Sin embargo, el orden inverso de asociación de la enzimas no dio esos resultados, sin beneficios de la asociación sobre viabilidad celular en comparación con las enzimas solas (controles).

V. Conclusión

La asociación secuencial de enzimas demostró que la mortalidad celular podría aumentarse con la adición de MGL a la dosis de IC50, seguido 3 días después por la adición de L-asparaginasa a la dosis de IC50. Sin embargo, el diseño inverso de la adición de la enzima no permitió obtener esos resultados.

Se puede suponer que la privación de Met inducida por la actividad de la enzima MGL hace que las células de leucemia HL-60 sean más sensibles a la actividad de L-asparaginasa. Además, las funciones de L-asparaginasa y MGL deben discutirse teniendo en cuenta su efecto respectivo conocido. De hecho, se sabe que la L-asparaginasa desencadena la apoptosis en células de leucemia (Ueno et al., 1997), por lo tanto, probablemente podría desempeñar un papel de agente citotóxico. Sabiendo que MGL bloquea la división celular en la fase S o G2 del ciclo celular, probablemente actúa más como un agente citostático.

Ejemplo 2: Método para la encapsulación de L-asparaginasa en eritrocitos de murinos

La L-asparaginasa (L-asparaginasa de E. Coli, Medac®) se encapsula en eritrocitos de murinos (ratones OF1) mediante el método de diálisis hipotónica en una bolsa de diálisis. La sangre se centrifuga de antemano para eliminar el plasma, y luego se lava tres veces con 0.9% de NaCl. El hematocrito se ajusta a 70% en presencia de la asparaginasa, se añade a una concentración final de 400 IU/ml de eritrocitos o glóbulos rojos (RBC) antes de iniciar la diálisis. La diálisis dura 50 minutos a 4°C frente a un regulador de pH de lisis de baja osmolaridad. Los eritrocitos de murinos se vuelven a sellar mediante la adición de una solución de alta osmolaridad y se incuban 30 minutos a 37°C. Después de dos lavados con 0.9% de NaCl y un lavado con Sag-manitol suplementado con albúmina de suero de bovino b Sa (6%), los eritrocitos se ajustan al hematocrito de 50%. Los eritrocitos que encapsulan la L-asparaginasa se denominan L-Aspa RBC. La encapsulación genera L-Aspa RBC a una concentración de 40 IU de asparaginasa/ml de RC a un hematocrito de 50%. Durante el procedimiento de encapsulación, la sangre entera, los RBC lavados, los RBC mezclados con la L-asparaginasa (antes de la diálisis) y los RBC cargados con L-asparaginasa (después de la diálisis) se analizan para determinar:

- hematocrito (Ht)

- volumen corpuscular promedio (ACV)

- concentración de hemoglobina corpuscular promedio (ACHC)

- concentración total de hemoglobina y

- conteo de células.

Se retiran alícuotas de las suspensiones celulares antes y después de la diálisis hipotónica para medir la actividad de la enzima L-asparaginasa. La estimación de la L-asparaginasa se realizó de acuerdo con el protocolo publicado en: Orsonneau et al., Ann Biol Clin, 62: 568-572.

Ejemplo 3: Encapsulación de L-asparaqinasa en eritrocitos humanos

El método descrito en el documento WO-A-2006/016247 se usa para producir un lote de eritrocitos que encapsula L-asparaginasa. De conformidad con las enseñanzas del documento WO-A-2006/016247, se considera la fragilidad osmótica y los parámetros de lisis se ajustan en consecuencia (se ajusta la velocidad de flujo de la suspensión de eritrocitos en el cartucho de diálisis). El método se realiza además de conformidad con la prescripción del médico, que tiene en cuenta el peso del paciente y la dosis de L-asparaginasa que se administrará. Las especificaciones del producto final son las siguientes:

- volumen corpuscular medio (MCV): 70-95 fL

- concentración de hemoglobina corpuscular promedio (MCHC): 23-35 g/dL

- Hemoglobina extracelular < 0.2 g/dL de suspensión

- fragilidad osmótica < 6 g/L de NaCl

- concentración de L-asparaginasa corpuscular promedio: 78-146 IU/mL

- L-asparaginasa extracelular < 2% de la actividad enzimática total.

La suspensión de eritrocitos así obtenida se llama GRASPA® y se menciona en la literatura.

Ejemplo 4. Método para obtener y caracterizar Metionina Gamma Liasa (MGL)

Producción de la cepa y aislamiento de un clon hiper-productor: la secuencia natural de MGL de Pseudomonas putida (GenBank: D88554.1) se optimizó modificando codones raros (para adaptar la secuencia derivada de P. putida a la cepa de producción Escherichia coli). Se han realizado otros cambios para mejorar el contexto del inicio de la traducción. Finalmente, se realizaron mutaciones silenciosas para eliminar tres elementos que son parte de un promotor bacteriano putativo en la secuencia codificante (casilla -35, casilla -10 y un sitio de unión de un factor de transcripción en la posición 56). La cepa de producción E. coli HMS174 (DE3) se transformó con el vector de expresión pGTPc502_MGL (promotor T7) que contenía la secuencia optimizada y se seleccionó un clon productor. El clon productor se cultiva previamente en un medio GY 0.5% de glucosa kanamicina durante 6-8 hr (pre-cultivo 1) y 16 hr (pre-cultivo 2) a 37°C.

Fermentación: la producción se logra luego en un fermentador con medio GY, con agitación, presión y pH controlados del pre-cultivo 2 a una densidad óptica de 0.02. La fase de crecimiento (a 37°C) tiene lugar hasta que se obtiene una densidad óptica de 10 y la inducción de expresión se logra a 28°C añadiendo 1 mM de IPTG en el medio de cultivo. El sedimento celular se cosecha 20 hr después de la inducción en dos fases: el caldo celular se concentra 5-10 veces después de pasar sobre una fibra hueca de 500 kDa y luego el sedimento celular se recupera por centrifugación a 15900 x g y luego se almacena a -20°C.

Purificación: El sedimento celular se descongela y se suspende en regulador de pH de lisis (7 v/p). La lisis se realiza a 10°C en tres pasos mediante homogeneización a alta presión (un paso a 1000 bares, y luego dos pasos a 600 bares). El lisado celular luego se somete a clarificación a 10°C añadiendo 0.2% de PEI y centrifugación a 15900 x g. La fracción soluble luego se esteriliza en 0.2 pm antes de la precipitación con sulfato de amonio (60% de saturación) a 6°C, durante 20 hr. Se llevan a cabo dos pasos de cristalización en el sedimento re-solubilizado usando regulador de pH de solubilización, el primer paso de cristalización se realiza mediante la adición de PEG-6000 a 10% (concentración final) y sulfato de amonio a 10% de saturación, y la segunda cristalización luego se realiza mediante la adición de PEG-6000 a 12% de concentración final y 0.2 M de NaCl (concentración final) a 30°C. Los sedimentos que contienen la proteína MGL se recogen en cada paso después de la centrifugación a 15900 x g. El sedimento que contiene la proteína MGL se re­ suspende en un regulador de pH de solubilización y se pasa sobre un filtro de 0.45 pm antes de someterse a dos cromatografías de intercambio aniónico (DEAE sepharose FF). La proteína purificada se somete luego a un paso de pulido y se pasa por una cápsula de cromatografía Q de membrana para eliminar los diferentes contaminantes (endotoxinas, proteína de la célula hospedera HCP, ADN residual). Finalmente, la proteína MGL purificada se concentra a 40 mg/ml y se diafiltra en regulador de pH de formulación usando un casete de filtración de flujo tangencial de corte de 10 kDa. La sustancia luego se forma en alicuotas a ~50 mg de proteína por vial, finalmente se liofiliza bajo presión y temperatura controladas, y se almacena a -80°C.

Caracterización: la actividad específica de la enzima se determina midiendo el NH3 producido como se describe en el documento WO 2015/121348. La pureza está determinada por SDS-PAGE. El nivel de PLP después de ser absorbido en agua se evaluó de acuerdo con el método descrito en el documento WO 2015/121348. La osmolaridad se mide con un osmómetro (Micro-Osmometer Loser Type 15).

La siguiente Tabla 2 resume las principales características de un lote de MGL producido:

Discusión del método de producción. El método para purificar el MGL descrito en el documento WO 2015/121348 se establece sobre la base del método detallado en la patente EP 0978560 B1 y de la publicación asociada (Takakura et al., Appl Microbiol Biotechnol 2006). Esta selección se explica por la simplicidad y la robustez del paso de cristalización que se describe como particularmente práctico y fácilmente adaptable a producciones a gran escala de acuerdo con los autores. Este paso se basa en el uso de PEG6000 y de sulfato de amonio después de calentar la solución de MGL obtenida después de la lisis/clarificación y remoción de impurezas mediante los pasos de adición de PEG6000/sulfato de amonio. El otro punto notable de este paso es la posibilidad de obtener rápidamente un alto nivel de pureza durante el paso para remover las impurezas logrando la centrifugación después del tratamiento de la solución de MGL con PEG6000. Las impurezas se encuentran nuevamente en el sedimento de centrifugación, el MGL se encuentra en su mayoría en solución en el sobrenadante. Debido a esta pureza, el paso de la solución de MGL en un solo paso de cromatografía sobre una columna de intercambio aniónico (DEAE), asociada a un paso de purificación por filtración en gel en una columna de sephacryl S200 HR, ofrece la posibilidad de obtener una proteína purificada.

Al establecer el método patentado para pruebas a pequeña escala, parecía que los resultados obtenidos no podían reproducirse. De conformidad con la patente EP 0978560 B1, al final del paso para remover las impurezas (tratamiento con PEG6000/sulfato de amonio y centrifugación), la enzima MGL se encuentra en su mayoría en la fracción soluble, la centrifugación provoca la remoción de las impurezas en el sedimento. Durante las pruebas a pequeña escala llevadas a cabo de acuerdo con el método descrito en el documento EP 0978560 B1, la proteína MGL nuevamente se encuentra en su mayoría (-80%) en el sedimento de centrifugación. La tabla 3 siguiente enumera el porcentaje de MGL evaluado por densitometría en gel de SDS-PAGE en fracciones solubles.

Este resultado inesperado, por lo tanto, condujo a la optimización del método patentado: 1) operando desde el gránulo de centrifugación que contiene MGL, 2) llevando a cabo dos pasos de cristalización sucesivos para mejorar la remoción de las impurezas después de cargar en una columna DEAE, 3) optimizando la cromatografía en una columna DEAE.

Para este último paso, se encuentra que la resina DEAE sepharose FF finalmente no es un intercambiador suficientemente fuerte en el regulador de pH probado y las condiciones de pH. Después de diferentes pruebas de optimización adicionales, la selección se dirigió finalmente a 1) el reemplazo del regulador de pH de fosfato usado en el método inicial con regulador de pH Tris pH 7.6 para mejorar la solidez del método y 2) llevar a cabo un segundo pase en DEAE para sustancialmente mejorar el nivel de endotoxinas y la pureza de las proteínas sin pérdida de MGL (0.8 UE/mg según Takakura et al., 2006 frente a 0.57 UE/mg para el método modificado).

Finalmente, para obtener un método compatible con los requerimientos para la producción de GMP a gran escala, se añadió un paso de pulido sobre una membrana Q para reducir las endotoxinas residuales y los niveles de HCP. Este último paso de pulido evita la implementación de la cromatografía de filtración en gel S200, que es un paso difícil de usar en los procesos de producción a escala industrial (costo y duración de la cromatografía).

El producto obtenido se resume en la siguiente Tabla 4 usando los dos métodos.

$después de sephacryl S-200 HR (EP 978560) o después de Membrana Q (método de la invención).

Ejemplo 5. Co-encapsulación de MGL y PLP en eritrocitos de murinos

Sangre completa de ratones CD1 (Charles River) se centrifuga a 1000 x g, durante 10 minutos, a 4°C para remover el plasma y la capa leucocitaria. Los RC se lavan tres veces con 0.9% de NaCl (v:v). El MGL liofilizado se re-suspende en agua a una concentración de 78.7 mg/ml y se agrega a la suspensión de eritrocitos para obtener una suspensión final con un hematocrito de 70%, que contiene diferentes concentraciones de MGL y del PLP. La suspensión se cargó entonces en un hemodializador a una velocidad de flujo de 120 ml/hr y se dializó contra una solución hipotónica a una velocidad de flujo de 15 ml/min como contracorriente. La suspensión se volvió a sellar con una solución hipertónica y luego se incubó durante 30 minutos a 37°C. Después de tres lavados en 0.9% de NaCl, 0.2% de glucosa, la suspensión se recogió en una solución de conservación SAG-manitol suplementada con 6% de BSA. Los productos obtenidos se caracterizan por D0 (dentro de las 2 hr siguientes a su preparación) y en D1 (es decir, después de ~ 18hr-24hr de conservación a 2-8°C). Las características hematológicas se obtienen con un analizador hematológico veterinario (Sysmex, PocH-100iV).

Resultados:

En los diferentes estudios mencionados a continuación, la actividad de MGL en los productos terminados se analiza con el método descrito en el ejemplo 5 contra un intervalo de calibración externo de MGL en solución acuosa. Estos resultados, combinados con estudios explicativos, muestran que la actividad de MGL en los productos terminados aumenta con la cantidad de enzima introducida en el método y que es fácilmente posible encapsular hasta 32 IU de MGL por ml de producto terminado a la vez que se mantiene una buena estabilidad.

En otro estudio, tres productos terminados de murinos RC-MGL-PLP 1, RC-MGL-PLP2 y RC-MGL-PLP3 se prepararon de acuerdo con los siguientes métodos:

- RC-MGL-PLP1: co-encapsulación de MGL y de PLP a partir de una suspensión que contenía 3 mg/ml de MGL y ~30 pM de PLP. El producto final se recogió en SAG-manitol, 6% de BSA suplementado con 10 pM de PLP final.

- RC-MGL-PLP2: co-encapsulación de MGL y de PLP a partir de una suspensión que contenía 3 mg/ml de MGL y ~30 pM de PLP. El producto final se recogió en SAG-manitol 6% de BSA.

- RC-MGL-PLP3: este producto se deriva de un co-encapsulación de MGL y PLP a partir de una suspensión que contenía 3 mg/ml de MGL y ~124 pM de PLP. El producto final se recogió en SAG-Manitol 6% de BSA.

En un tercer estudio, un producto terminado de murino RC-MGL-PLP4 se preparó a partir de un nuevo lote de MGL de acuerdo con los siguientes métodos:

- RC-MGL-PLP4: co-encapsulación de MGL y PLP a partir de una suspensión que contenía 5 mg/ml de MGL y ~35 pM de PLP. El producto final se recogió en SAG-manitol 6% de BSA.

Finalmente, en un cuarto estudio, un producto de murino RC-MGL-PLP5 se preparó a partir de un tercer lote de MGL de acuerdo con los siguientes métodos:

- RC-MGL-PLP5: co-encapsulación de MGL y PLP a partir de una suspensión que contenía 6 mg/ml de MGL y ~100 pM de PLP. El producto final se recogió en SAG-manitol 6% de BSA.

Las características hematológicas y bioquímicas de los tres productos terminados en D0 (después de su preparación) se detallan en la tabla 5 siguiente. Los rendimientos de encapsulación son satisfactorios y varían entre 18.6% y 30.5%.

*Calculado a partir de la actividad específica de cada lote.

Ejemplo 6. Producción de CR humanos que encapsulan metionina Gamma liasa y PLP de acuerdo con el método industrial

Una bolsa de glóbulos rojos RC humanos con leucocitos agotados (provistos por el “Etablissement Franpais du Sang”) es sometida a un ciclo de tres lavados con 0.9% de NaCl (lavado Cobe 2991). El MGL liofilizado se re-suspende con 0.7% de NaCl y se agrega a la suspensión de eritrocitos para obtener una suspensión final con un hematocrito del 70%, que contiene 3 mg/ml de MGL y ~30 pM de PLP (derivado de la formulación de MGL). La suspensión se homogeneiza y se procede con la encapsulación de acuerdo con del método descrito en el documento EP 1773 452. La suspensión del resellado se incuba luego durante 3 hr a temperatura ambiente para remover los RC más frágiles. La suspensión se lava tres veces con 0.9% de NaCl, solución 0.2% de glucosa (lavado Cobe 2991) y luego se re-suspende con 80 ml de solución de conservación (AS-3). El nivel de MGL encapsulado se prueba como en el Ejemplo 6, ver la Tabla 6 siguiente.

Ejemplo 7

Abreviaturas adicionales

RPMI: Medio del Le Roswell Park Memorial

I. Condiciones de operación

1.1 Elemento de prueba

1.1.1. L-asparaginasa

Descripción: Medac® (Alemania), L-asparaginasa de E coli, 10000 IU.

Se preparó una concentración de L-asparaginasa (2,2 IU/ml) mediante diluciones en serie en solución salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco (DPBS) 1 X. La concentración de L-asparaginasa se diluyó 11 veces para obtener una concentración final de 0.20 IU/ml (IC50)

1.1.2. Metionina-v-liasa (MGL)

Descripción: metionina-y-liasa (MGL) de P. putida producida en E. Coli.

Se preparó una concentración de MGL (3.85 IU/ml) mediante diluciones en serie en solución salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco (DPBS) 1 X. La concentración de MGL se diluyó 11 veces para obtener una concentración final de 0.35 IU/ml (IC50).

1.2 Líneas celulares

1.2.1. Descripción

Nombre: Línea celular NCI-N87

Descripción: Línea celular de carcinoma gástrico humano (adherente)

Proveedor y número de referencia: ATCC, CRL-5822

1.2.2. Condiciones de cultivo

Las células se cultivaron en un medio RPMI suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal, 100 IU/ml de penicilina y 100 |jg/ml de estreptomicina. El subcultivo se realizó de acuerdo con PO-CELL-002 y PO-CELL-005.

I.2.3. Kit colorimétrico

Nombre: Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

Proveedor y número de referencia: Fluka 96992

Principio: el reactivo CCK-8 contiene una sal de tetrazolio altamente soluble en agua WST-8. WST-8 se reduce por las deshidrogenasas en las células para dar un producto de color amarillo (formazano) que es soluble en el medio de cultivo de tejido. La cantidad del colorante de formazano generado por la actividad de las deshidrogenasas en las células es directamente proporcional al número de células vivas. La prueba colorimétrica se realizó de acuerdo con PO-CELL-004. II. Ensayo de citotoxicidad

II .1 Método

Se dispensaron dos mil quinientas células en 100 pL/pozo en placas de fondo plano de 96 pozos (véase el número de placas en datos brutos). Además, se llenaron dos pozos con medio de cultivo para control de testigo en cada placa. Todos los pozos vacíos se llenaron con medio de cultivo para reducir al mínimo la evaporación y la condensación. El día 0 (D0), se añadieron 10 pL de concentraciones IC50 de L-asparaginasa o MGL a los pozos correspondientes. Los controles (pozos con testigo y placa de control) recibieron 10 pL de DPBS 1 X. El día 4 (D4), se removió el medio de los pozos y se reemplazó por medio nuevo y 10 pL de DPBS 1 X o 10 pL de concentraciones de IC50 de L-asparaginasa (para células previamente incubadas con MGL) o MGL (para células previamente incubadas con L-asparaginasa) se añadieron a los pozos correspondientes. Los controles (testigo y control positivo) recibieron 10 pL de DPBS 1 X. Luego, las placas se incubaron durante 4 días más en la incubadora. Al final del período de incubación (D8), se añadieron 10 pL de solución de CCK-8 a cada pozo de acuerdo con PO-CELL-004 y las placas se incubaron durante 4 horas. La densidad óptica (DO) se determinó luego a 450 nm usando un lector de microplacas.

II.2 Controles internos

Los controles se realizaron por duplicado.

11.2.1. Pozos con testigo

Como se indicó anteriormente en el Ejemplo 1.

11.2.2. Control de viabilidad (control positivo)

Como control positivo para la línea celular NCI-N87 (100% de viabilidad celular), las células se cultivaron en el medio de cultivo (100 pL) sin L-asparaginasa ni MGL, pero con 10 pL del diluyente (DPBS 1 X).

II. 3 Determinación de viabilidad celular

Como se indicó anteriormente en el Ejemplo 1.

III. Resultados

III.1 Control interno

Los controles internos fueron aceptables cuando no se especificaron en datos brutos.

III.2 Cálculos de IC50 con L-asparaginasa o MGL solo

Los porcentajes de viabilidad celular con fármaco solo (MGL o L-asparaginasa) se controlaron en cada experimento de combinación de fármacos. Se espera un 50% de la viabilidad celular a la mitad de la prueba (D4) porque el valor de IC50 usado aquí para las enzimas se validó previamente en un solo tratamiento en D4.

III.2.1. Adición secuencial de L-asparaginasa y MGL

El experimento con el tratamiento secuencial de L-asparaginasa y MGL se realizó dos veces con datos duplicados. Todos los controles de calidad (testigo y control positivo) fueron aceptados en los experimentos.

Los detalles del % de los cálculos de viabilidad celular y la representación gráfica se presentan a continuación en la Tabla 7 y la Figura 2.

Tabla 7: % de viabilidad celular para controles y asociación de enzimas

Los resultados indicaron que la asociación de la enzima con MGL añadida a la dosis de IC50 antes de la adición de L-asparaginasa a la dosis de IC50 (véase Figura 2) permitió reducir la viabilidad celular de:

- 55% en comparación con IC50 de L-asparaginasa (IC50 de control para L-asparaginasa),

- 44% en comparación con MGL (IC50 de control para MGL),

- 43% en comparación con la asociación enzimática con L-asparaginasa añadida en primer lugar a la dosis de IC50. IV. Conclusión

La asociación secuencial de enzimas demostró que la mortalidad celular se pudo aumentar con la adición de MGL a la dosis de IC50, seguido 4 días después por la adición de L-asparaginasa a la dosis de IC50.

Los inventores pueden formular la hipótesis de que la privación de Met inducida por la actividad de la enzima MGL hace que las células gástricas de NCI-N87 sean más sensibles a la actividad de L-asparaginasa. Además, las funciones de L-asparaginasa y MGL deben discutirse teniendo en cuenta su efecto respectivo conocido. De hecho, se sabe que la L-asparaginasa desencadena la apoptosis en células de leucemia (Ueno et al., 1997), por lo tanto, probablemente podría desempeñar un papel de agente citotóxico. MGL que se sabe que bloquea la división celular en la fase S o G2 del ciclo celular, probablemente actúa más como un agente citostático.

Ejemplo 8

I. Abreviaturas adicionales

F12K: modificación de Kaighn del F-12 de Ham

II. Condiciones de operación

11.1 Elemento de prueba

11.1.1. L-asparaginasa

Descripción: Medac® (Alemania), L-asparaginasa de E. coli 10000 IU.

Se preparó una concentración de L-asparaginasa (2.97 IU/ml) mediante diluciones en serie en solución salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco (DPBS) 1 X. La concentración de L-asparaginasa se diluyó 11 veces para obtener una concentración final de 0.27 IU/ml (IC50)

11.1.2. Metionina-v-liasa (MGL)

Descripción: metionina-y-liasa (MGL) de P. putida producida en E. Coli.

Se preparó una concentración de MGL (1.43 IU/ml) mediante diluciones en serie en solución salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco (DPBS) 1 X. La concentración de MGL se diluyó 11 veces para obtener una concentración final de 0.13 IU/ml (IC50).

11.2 Líneas celulares

II.2.1. Descripción

Nombre: línea celular AGS

Descripción: Línea celular de adenocarcinoma gástrico humano (adherente)

Proveedor y número de referencia: ATCC, CRL-1739

II.2.2. Condiciones de cultivo

Las células se cultivaron en un medio F12K con L-glutamina suplementada con 10% (v/v) de suero de bovino fetal, 100 IU/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. El subcultivo se realizó de acuerdo con PO-CELL-002 y PO-CELL-005. II.2.3. Kit colorimétrico

Nombre: Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

Proveedor y referencia: Fluka 96992

Principio: el reactivo CCK-8 contiene una sal de tetrazolio altamente soluble en agua WST-8. WST-8 es reducido por las deshidrogenasas en las células para dar un producto de color amarillo (formazano) que es soluble en el medio de cultivo de tejido. La cantidad del colorante de formazano generado por la actividad de las deshidrogenasas en las células es directamente proporcional al número de células vivas. La prueba colorimétrica se realizó de acuerdo con PO-CELL-004. III. Prueba de citotoxicidad

111.1 Método

Se dispensaron mil células en 100 pL/pozo en placas de fondo plano de 96 pozos (véase el número de placas en datos brutos). Además, se llenaron dos pozos con medio de cultivo para control de testigo en cada placa. Todos los pozos vacíos se llenaron con medio de cultivo para reducir al mínimo la evaporación y la condensación. El día 0 (D0), se añadieron 10 pL de concentraciones IC50 de L-asparaginasa o MGL a los pozos correspondientes. Los controles (pozos con testigo y placa de control) recibieron 10 pL de DPBS 1 X. El día 4 (D4), se removió el medio de los pozos y se reemplazó por medio nuevo y 10 pL de DPBS 1 X o 10 pL de concentraciones IC50 de L-asparaginasa (para las células previamente incubadas con MGL) o MGL (para las células previamente incubadas con L-asparaginasa) añadidas a los pozos correspondientes. Los controles (testigo y control positivo) recibieron 10 pL de DPBS 1 X. Luego, las placas se incubaron durante 4 días más en la incubadora. Al final del período de incubación (D8), se añadieron 10 pL de solución de CCK-8 a cada pozo de acuerdo con PO-CELL-004 y las placas se incubaron durante 4 horas. La densidad óptica (DO) se determinó luego a 450 nm usando un lector de microplacas.

III.2 Controles internos

Los controles se realizaron por duplicado.

111.2.1. Pozos con testigo

Como se indicó anteriormente en el Ejemplo 1.

111.2.2. Control de viabilidad (control positivo)

Como control positivo para la línea celular AGS (100% de viabilidad celular), las células se cultivaron en el medio de cultivo (100 pL) sin L-asparaginasa ni MGL, pero con 10 pL del diluyente (DPBS 1 X).

III.3 Determinación de viabilidad celular

Como se indicó anteriormente en el Ejemplo 1.

IV. Resultados

IV.1 Control interno

Los controles internos fueron aceptables cuando no se especificaron en datos brutos.

IV.2 Cálculos de IC50 con L-asparaginasa o MGL solo

Los porcentajes de viabilidad celular con fármaco solo (MGL o L-asparaginasa) se controlaron en cada experimento de combinación de fármacos. Se espera un 50% de la viabilidad celular a la mitad de la prueba (D4) porque el valor de IC50 usado aquí para las enzimas se validó previamente en un solo tratamiento en D4.

IV.2.1. Adición secuencial de L-asparaginasa y MGL

El experimento con el tratamiento secuencial de L-asparaginasa y MGL se realizó dos veces con datos duplicados. Todos los controles de calidad (testigo y control positivo) fueron aceptados en los experimentos.

Los detalles del % de los cálculos de viabilidad celular y la representación gráfica se presentan a continuación en la tabla 8 y la figura 3.

Tabla 8: % de viabilidad celular para controles y asociación de enzimas

Los resultados indicaron que la asociación de la enzima con MGL añadida a la dosis de IC50 antes de la adición de L-asparaginasa a la dosis de IC50 (véase Figura 3) permitió reducir la viabilidad celular de:

- 22% en comparación con IC50 de L-asparaginasa (control de IC50 para L-asparaginasa),

- 26% en comparación con MGL (control de IC50 para MGL),

- 10% en comparación con la asociación enzimática con L-asparaginasa agregada en primer lugar a la dosis de IC50. Además, para la precisión aquí, el control de IC50 para L-asparaginasa o MGL (usado y validado inicialmente en D4) regresó al 100% de la viabilidad celular después de 8 días de cultivo con la renovación de los medios en D4/mitad de la prueba. De hecho, las células viables restantes en D4 pudieron volver a crecer con la adición de nutrientes “nuevos”. Los resultados se ajustaron a los controles de IC50 (enzima sola) alcanzando el 50% de la viabilidad celular en D4.

V. Conclusión

La asociación secuencial de enzimas demostró que la mortalidad celular se pudo aumentar con la adición de MGL a la dosis de IC50, seguido 4 días después por la adición de L-asparaginasa a la dosis de IC50.

Los inventores pueden suponer que la privación de Met inducida por la actividad de la enzima MGL hace que las células gástricas AGS sean más sensibles a la actividad L-asparaginasa. Además, las funciones de L-asparaginasa y MGL deben discutirse teniendo en cuenta su efecto respectivo conocido. De hecho, se sabe que la L-asparaginasa desencadena la apoptosis en células de leucemia (Ueno et al., 1997), por lo tanto, probablemente podría desempeñar un papel de agente citotóxico. Se sabe que MGL que bloquea la división celular en la fase S o G2 del ciclo celular, probablemente actúa más como un agente citostático.

Ejemplo 9

I. Abreviaturas adicionales

A.M.: Antes del medio día

ERY-ASP: L-asparaginasa encapsulada en glóbulos rojos

ERY-MET: Metionina gamma-liasa encapsulada en glóbulos rojos

IG: Inyección intragástrica (alimentación forzada)

IU: Unidad Internacional correspondiente a pmol/min

IV: intravenoso

ND: no determinado

PN: Piridoxina

TGI: Inhibición del crecimiento tumoral

II. Objetivo del estudio in vivo

El objetivo de este estudio es determinar si la combinación de eritrocitos cargados con metioninasa (ERY-MET) con eritrocitos cargados con L-asparaginasa (ERY-ASP) puede mejorar la actividad antitumoral observada con ERY-MET solo en un tumor gástrico NCI-N87 modelo de ratón de xenoinjerto subcutáneo.

III. Condiciones de operación

Las células NCI-N87 se cultivaron en ERYTECH Pharma y se prepararon a 5.107 células/mL en DPBS 1 X para inyección. Cuatro grupos de 10 o 12 ratones desnudos NMRI hembra (grupos 1,2, 3 y 4) se inyectaron por vía subcutánea con la línea celular a la concentración fija de 5.106/100 gL. Se administraron inyecciones de ERY-MET y ERY-ASP (vía IV) respectivamente a 108 IU/kg (8 ml/kg) y 200 IU/kg (4-5.4 mL/kg). El Grupo 2 recibió 3 inyecciones de ERY-MET en los días 7, 14 y 21. El grupo 3 (ERY-ASP/e Ry -MET) recibió 1 inyección de e Ry -ASP el día 7 y luego, 2 inyecciones de ERY-MET los días 21 y 28. El grupo 4 (ERY-MET/ERY-ASP) recibió 2 inyecciones de ERY-MET los días 7 y 14 y luego 1 inyección de ERY-ASP el día 21. El grupo 1 se administró con la solución conservante de ERY-MET (SAG manitol/plasma) a 8 mL/kg los días 7, 14 y 21.

Las administraciones orales (alimentación forzada) del cofactor PN se realizaron 6 horas después de cada inyección de ERY-MET (Día 7 6h, Día 15 6h, Día 21 6h para el grupo 2, Día 21 6h, Día 28 6h para el grupo 3; Día 7 6h, Día 15 6h para el grupo 4) y una vez al día (A.M.) para los otros días (sin administración de ERY-MET) hasta el Día 20 (para el grupo 4), Día 27 (para el grupo 2) o Día 34 (para el grupo 3).

IV. Resultados

La regresión del volumen del tumor asociada a la combinación ERY-MET/ERY-ASP pareció diferente a la observada para el brazo ERY-MET; de hecho, en D37, los ratones con ERY-MET mostraron un volumen de tumor medio de 298.3 ± 36.2 mm3 y los ratones con ERY-MET/ERY-ASP mostraron un volumen de tumor medio de 189.7 ± 29.8 mm3, correspondientes respectivamente a 37% y 57% de reducción del volumen de tumor medio mientras que los ratones que recibieron vehículo (control) tuvieron un volumen de tumoral promedio de 441.5 ± 56.6 mm3. Se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (TGI*) para la asociación de enzimas ERY-MET/ERY-ASP versus control (grupo de vehículo) o versus el grupo ERY-MET de acuerdo con la siguiente fórmula:

Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 9 siguiente:

Tabla 9: Cálculos de TGI para la asociación ERY-MET/ERY-ASP

** No determinado (no relevante) debido a una disparidad de medición de volumen bajo al comienzo del estudio (D7 es el primer punto de tiempo de la medición del volumen del tumor).

Con el fin de evaluar la importancia entre los grupos y la eficiencia del tratamiento con ERY-MET/ERY-ASP en comparación con ERY-MET solo en tumores gástricos NCI-N87, se realizó una prueba ANOVA de dos vías con el software GraphPad Prism (versión 5.04) sobre mediciones de crecimiento tumoral. Análisis que compara el tratamiento con vehículo (control), ERY-MET y ERY-MET/ERY-ASP indicando la significancia entre grupos en D37 con un valor de P inferior a 0.0001 (véase Figura 4) que revela la eficacia de la combinación ERY-MET/ERY-ASP 16 días después de las últimas inyecciones para el tratamiento contra tumores gástricos. Con el esquema inverso de administración del tratamiento con ERY-ASP/ERY-MET en comparación con el ERY-MET solo en los tumores gástricos NCI-N87, la prueba de ANOVA de dos vías (véase Figura 4) no reveló ninguna significancia entre los grupos para tres puntos temporales de seguimiento (D7/D20/D37) con un valor P > 0.05.

V. Conclusión

ERY-MET se combinó con ERY-ASP con 2 esquemas de administraciones: 1-ERY-ASP (D7)-ERY-MET (D21/D28) y 2-ERY-MET (D7/D15)-ERY-ASP (D21). La respuesta positiva en comparación con ERY-MET solo parece haberse producido cuando ERY-MET se administró (dos veces) antes de ERY-ASP. Esta significancia del resultado se ve respaldada por la obtención de un valor de P inferior a 0.0001 en D37 en la medición del volumen del tumor individual.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica o kit para usarse en el tratamiento de cáncer en un mamífero que comprende asparaginasa y metioninasa durante al menos una administración secuencial, administrándose la metioninasa antes de la asparaginasa.

2. La composición para usarse, según la reivindicación 1, en la que la metioninasa y la asparaginasa están en forma libre, forma pegilada o encapsuladas dentro de eritrocitos.

3. La composición para usarse, según la reivindicación 1, en la que la metioninasa está en forma libre o está pegilada y el retraso entre el final de la administración de metioninasa y el inicio de la administración de asparaginasa está entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 7 días, en particular entre aproximadamente 3 horas y aproximadamente 6 días, preferiblemente entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 5 días.

4. La composición para usarse, según la reivindicación 1, en la que la metioninasa está encapsulada en eritrocitos y el retraso entre el final de la administración de metioninasa y el inicio de la administración de asparaginasa es entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 30 días, en particular entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 20 días, preferiblemente entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 10 días.

5. La composición para usarse, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la metioninasa se administra una o más veces en una cantidad de entre aproximadamente 100 y aproximadamente 100.000 IU, en particular entre aproximadamente 500 y aproximadamente 50.000 IU, preferiblemente entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5.000 IU.

6. La composición para usarse según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la asparaginasa se administra una o más veces en una cantidad de entre aproximadamente 500 y aproximadamente 100.000 IU, en particular entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 50.000 IU, preferiblemente entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 30.000 IU.

7. Una composición farmacéutica que comprende asparaginasa para usarse en el tratamiento de cáncer en un mamífero al que se ha administrado metioninasa, en la que el retraso entre el final de la administración de metioninasa y el inicio de la administración de asparaginasa está entre 1 hora y 30 días aproximadamente.

8. La composición para usarse, según la reivindicación 7, en la que la metioninasa está en forma libre o pegilada y el retraso entre la administración de metioninasa y asparaginasa es entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 7 días, en particular entre aproximadamente 3 horas y aproximadamente 6 días, preferiblemente entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 5 días.

9. La composición para usarse, según la reivindicación 7, en la que la metioninasa está encapsulada dentro de eritrocitos y el retraso entre el final de la administración de metioninasa y el inicio de la administración de asparaginasa es entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 30 días, en particular entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 20 días, preferiblemente entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 10 días.

10. La composición para usarse, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que la metioninasa se administra una o más veces en una cantidad de entre aproximadamente 100 y aproximadamente 100.000 IU, en particular entre aproximadamente 500 y aproximadamente 50.000 IU, preferiblemente entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5.000 IU.

11. La composición para usarse, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en la que la asparaginasa se administra una o más veces en una cantidad de entre aproximadamente 500 y aproximadamente 100.000 IU, en particular entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 50.000 IU, preferiblemente entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 30.000 IU.

12. La composición para usarse, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además fosfato de piridoxal (PLP) o un precursor de fosfato de piridoxal (PLP) para administración simultánea, separada o secuencial con la metioninasa.

13. La composición para usarse, según la reivindicación 12, que comprende metioninasa encapsulada en el interior de eritrocitos y un precursor de fosfato de piridoxal (PLP) que no es de fosfato para administración separada o secuencial.

14. La composición para usarse, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la metioninasa encapsulada en los eritrocitos se administra al menos una o dos veces antes de que se administre asparaginasa encapsulada en el interior de los eritrocitos, y cada administración de metioninasa es seguida por la administración de una solución de precursor de fosfato de piridoxal (PLP) que no es de fosfato antes de que se administre la asparaginasa.

15. La composición para usarse, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para tratar tumores líquidos o sólidos en particular, la leucemia o el cáncer gástrico.

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