JP2019500386A - メチオニン及びアスパラギンの枯渇を利用してヒトをはじめとする哺乳動物を癌に対して処置する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
− メチオニナーゼを投与されていた哺乳動物に投与される、哺乳動物における癌を処置する際の使用のためのアスパラギナーゼを含む医薬組成物、
− 治療食品であるか否かにかかわらずメチオニン欠乏食を施されていた、即ちメチオニン欠乏食品を投与されていた哺乳動物に投与される、哺乳動物における癌を処置する際の使用のためのアスパラギナーゼを含む医薬組成物(本発明の意味における治療食品とは、医療環境で投与される食品及び/又は規制当局による市場許可を受けた食品、特に注入によって投与可能であってもなくてもよい液状の食品を意味する)、
− アスパラギナーゼをさらに投与される予定の哺乳動物に投与される哺乳動物における癌を処置する際の使用のためのメチオニナーゼを含む医薬組成物、
− アスパラギナーゼで哺乳動物を処置する前に該哺乳動物をメチオニンについて欠乏させる際の使用のための、治療食品であるか否かにかかわらずメチオニンを含まない又はメチオニンを実質的に含まない食品組成物若しくは食事、
である。
− メチオニナーゼを投与されていた哺乳動物に投与される、哺乳動物における癌を処置する際の使用のための医薬組成物の調製のためのアスパラギナーゼの使用、
− 治療食品であるか否かにかかわらずメチオニン欠乏食を施されていた、即ちメチオニン欠乏食品を投与されていた哺乳動物における癌を処置する際の使用のための医薬組成物の調製のためのアスパラギナーゼの使用、
− アスパラギナーゼをさらに投与される予定の哺乳動物に投与される哺乳動物における癌を処置する際の使用のための医薬組成物の調製のためのメチオニナーゼの使用、
である。
食事又は1種の薬物での処置期間、及びメチオニン欠乏とアスパラギナーゼ処置の間の遅延時間が、処置、患者の応答、そして重要なこととして薬物又は食事の効果の半減期に応じて変動し得ることを、当業者は本開示から理解するであろう。例えば遊離酵素、ペグ化酵素、及び該酵素を封入した赤血球、或いはその他にマイクロカプセル(例えば、PLA又はPLGA製)若しくはリポソームに結合された、又はこれらの構造の中に封入された酵素など、本発明で用いられる剤形には差が存在し得る。
これらの組成物は、標準技術を利用して哺乳動物に投与され得る。技術及び配合剤は一般に、Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版、Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990(参照により本明細書に援用される)に見出され得る。
一実施形態において、アスパラギナーゼは、赤血球の内部に封入され、該組成物は、医薬的に許容し得る担体又はビヒクル中のこれらの赤血球の懸濁液を含む。
食事中メチオニン制限は、メラノーマ及びグリオーマにおけるシステムスチン療法(E.Thivat et al.,Anticancer Research 2009,29:5235−5240)、又は転移大腸癌の第一選択治療としてのFOLFOX(X.Durando et al.,Oncology 2010,78:205−209)の何れかに関連して提案された。メチオニン制限又は欠乏食は、哺乳動物における遊離メチオニンの完全又は実質的な減少又は排除を誘導するのに充分な時間の、食養生又は該哺乳動物への食品組成物の供給である。
さらにメチオニナーゼは、中でもL−メチオニナーゼ、メチオニンγリアーゼMGLと称され、この化合物は、受付番号EC4.4.1.11及びCAS番号42616−25−1である。本発明により用いられ得るメチオニナーゼ供給源を知るために、とりわけEl Sayed A,Applied Microbiol.Biotechnol.(2010)86:445−467という発行物を挙げることができる。
補因子PLPの存在下では、MGLは、L−メチオニンをαケト酪酸に加水分解して、L−メチオニン1分子あたり1分子のアンモニアを形成する:
L−メチオニン+H2O → メタンチオール+NH4 ++α−ケト酪酸
α−ケトグルタル酸+NH4 ++NADPH → L−グルタミン酸+NADP++H2O
アスパラギナーゼそのものは、CAS番号:9015−68−3が割り当てられている。通常の名称は、アスパラギナーゼであり、これの他の一般的名称は、コラスパーゼ、L−アスパラギナーゼ及びL−アスパラギンアミノヒドロラーゼである。
一実施形態によれば、メチオニナーゼの組成物及び/又はアスパラギナーゼの組成物は、該酵素を封入した赤血球と、医薬的に許容し得るビヒクルと、を含む。好ましくは該赤血球は、処置対象と同じ種の哺乳動物から生成される。該哺乳動物が、ヒトである場合、該赤血球は、好ましくはヒト起源のものである。一実施形態において、該赤血球は、患者自身から得られる。
赤血球への酵素の封入は、低張液体培地と接触して赤血球膜内の細孔を開く赤血球懸濁液を利用して実施されてもよい。溶解−再封技術には、低張透析、低張予備膨潤及び低張希釈という3つの選択肢があり、全てが赤血球の内側と外側の浸透圧差に基づいている。低張透析が、好ましい。
1 − 65%以上のヘマトクリットレベルで、等張溶液中に赤血球ペレットを懸濁させ、+1〜+8℃の間で冷却すること、
2 − +1〜+8℃の間に維持された温度で、コイル又は透析カートリッジなどの透析器具(該カートリッジが好ましい)に、65%以上のヘマトクリットレベルの赤血球と、+1〜+8℃の間の冷却された低張溶解溶液と、の懸濁液を通過させることを含む、溶解手順、
3 − 溶解の前又は溶解の間に、+1〜+8℃の間で維持された温度で、封入される酵素(とりわけ、前述のとおり構成された溶液中の)を該懸濁液に、好ましくは徐々に、添加することによる封入手順、及び
4 − 等張又は高張、有利には高張の溶液の存在下、とりわけ+30〜+42℃の間に含まれる、高温で実施される再封手順。
1 − 65%以上のヘマトクリットレベルで、等張溶液に赤血球ペレットを懸濁させ、+1〜+8℃の間で冷却すること、
2 − この同じペレットからの赤血球試料で浸透圧脆弱性を測定すること。
3 − +1〜+8℃の間に維持された温度で、コイル又は透析カートリッジなどの透析器具(該カートリッジが好ましい)に、65%以上のヘマトクリットレベルの赤血球と+1〜+8℃の間で冷却された低張溶解溶液との懸濁液を通過させることを含む、溶解手順であって、該溶解パラメータがより早期に測定された浸透圧脆弱性に従って調整され、とりわけ測定された浸透圧脆弱性に応じて、透析器具を通過する赤血球懸濁液の流れを調整するか、又は溶解溶液の浸透圧を調整する、溶解手順、
4 − 溶解の前又は溶解の間に、+1〜+8℃の間で維持された温度で、封入される酵素(とりわけ、前述のとおり構成された溶液中の)を該懸濁液に、好ましくは徐々に、添加することによる封入のための手順、及び
5 − 等張又は高張、有利には高張の溶液の存在下、とりわけ+30〜+42℃の間に含まれる、高温で実施される再封手順。
(a)赤血球を低等張培地と接触させること(赤血球の膜の細孔を開かせること)、有効成分と接触させること(赤血球に進入させるため)、とりわけ等張又は高張、有利には高張の培地を用いて、赤血球を再封すること、を含む赤血球の内部に該酵素を封入するステップ、
(b)酵素を取り込んだ赤血球と、280mOsmol/kg以上、特に約280〜約380mOsmol/kgの間、好ましくは約290〜約330mOsmol/kgの間の浸透圧の溶液と、を含む懸濁液又はペレットを獲得又は調製するステップ、
(c)ステップ(b)のペレット又は懸濁液をそのままの状態で、又はインキュベーション溶液を添加した後に、280mOsmol/kg以上、特に約280〜約380mOsmol/kgの間、好ましくは約290〜約330mOsmol/kgの間の浸透圧で30分以上、とりわけ1時間以上の期間、インキュベートするステップ、
(d)該インキュベートされたステップ(c)の懸濁液の液体培地を除去するステップ、
(e)(d)で得られた赤血球を、患者への該懸濁液の注射を可能にする溶液、好ましくは患者への該懸濁液の注射を可能にする保持溶液に懸濁させるステップ。
本発明の方法は、以下の特徴の1つ、複数又は全てをさらに含んでいてもよい:
− 該インキュベーションステップ又はステップ(c)が、約2〜約39℃の間に含まれる温度で、脆弱赤血球の溶解を確実にするのに充分な時間、実施される、
− 該インキュベーションステップ又はステップ(c)が、とりわけ約2〜約10℃の間、特に約2〜約8℃の間に含まれる低温で実施され、約1時間〜約72時間、とりわけ約6時間〜約48時間、好ましくは約19時間〜約30時間持続する、
− 該インキュベーションステップ又はステップ(c)が、約20〜約39℃の間に含まれる高温で、とりわけ室温(25℃±5℃)で実施され、約30分〜約10時間、とりわけ約1時間〜約6時間、好ましくは約2時間〜約4時間持続し、室温よりも高い温度でも操作することが可能であるが、これは、細胞収率、P50及び/又は2,3−DPG量に及ぼす負の影響を有する場合がある、
− 該インキュベーションステップ又はステップ(c)において、該懸濁液が、10〜85%の間、とりわけ40〜80%の間に含まれる初期ヘマトクリットであり、分離からのペレットは、例えば70〜約85%の間のヘマトクリットを有し、又は約40〜70%の間に含まれるヘマトクリットを有する希釈されたペレットが、インキュベートされてもよい、
− 該インキュベーションステップは、該懸濁液の撹拌を含む、
− 該インキュベーションステップは、任意の撹拌を含まない、
− 洗浄及び/又はインキュベーションのための溶液として、計量された水性NaCl溶液を、所望の浸透圧を得るために用い、例として溶液は、つまり0.9%のNaClを含んでいてもよく、この溶液はまた、とりわけNaClに加えて、グルコース、とりわけグルコース一水和物、リン酸一ナトリウム二水和物、リン酸二ナトリウム十二水和物を含んでいてもよく、例として組成物は、0.9%のNaCl、0.2%のグルコース一水和物、0.034%のリン酸一ナトリウム二水和物、0.2%のリン酸二ナトリウム十二水和物を含む、
− 最終ステップ又はステップ(e)における洗浄は、保持溶液で実施される、
− 即時使用可能な懸濁液、又は患者に注射され得る懸濁液の該溶液(液体部分)の浸透圧は、約280〜約380mOsmol/kgの間、好ましくは約290〜約330mOsmol/kgの間に含まれる、
− 即時使用可能な懸濁液、又は患者に注射され得る懸濁液のヘマトクリットは、35%以上、40%以上又は45%以上である、
− 洗浄、インキュベーションのためのステップ全てが、保持溶液で実施される、
− ステップ(b)の洗浄溶液及び/又はステップ(e)の洗浄溶液及び保持溶液は、同じ組成のものであり、赤血球の保持を促進する化合物(複数可)を含む、
− 該保持溶液(そして必要に応じて、該洗浄溶液(複数可)又は該インキュベーション溶液)は、NaClと、アデニンと、グルコース、デキストロース及びマンニトールのうちの少なくとも1種の化合物と、を含む水性溶液である、
− 該保持溶液(そして必要に応じて、該洗浄又は該インキュベーション溶液(複数可))は、NaCl、アデニン及びデキストロース、好ましくはAS3培地を含む、
− 該保持溶液(そして必要に応じて、該洗浄又は該インキュベーション溶液(複数可))は、NaCl、アデニン、グルコース及びマンニトール、好ましくはSAG−マンニトール又はADsol培地を含む。
(a)低等張培地と接触させて、赤血球の膜の細孔を開かせること、該酵素を赤血球に進入させるために該酵素と接触させること、等張又は高張の培地を用いて赤血球を再封すること、を含む赤血球の内部に該酵素を封入するステップ。該酵素が赤血球の溶解前に赤血球の懸濁液中に存在してもよく、又は溶解の際若しくは溶解後にさらに添加されてもよいが、必ず再封の前に添加され得ることが留意されなければならない。このステップ(a)の一実施形態において、該方法は、以下のサブステップを含む:
(a1)60又は65%以上のヘマトクリットの赤血球の懸濁液を有するサブステップ、
(a2)この懸濁液中の赤血球の浸透圧脆弱性を測定するサブステップ、
(a3)該赤血球懸濁液を溶解溶液に対する透析器具、とりわけ透析カートリッジに通すこと、(a2)の下で測定された浸透圧脆弱性に応じて、赤血球懸濁液の流れを調整する、又は溶解溶液の流速を調整する、又は溶解溶液の浸透圧を調整すること、を含む有効成分(複数可)の溶解及びインタナリゼーションのための手順のサブステップ、
(a4)赤血球を再封するための手順のサブステップ。
第一の態様において、本発明は、必要とする哺乳動物における癌を処置する方法であって、該哺乳動物をメチオニンについて欠乏させ、その後、特に充分量のアスパラギナーゼを投与することを通して、該哺乳動物をアスパラギンについて欠乏させることを含む、方法である。探求されることは、癌細胞に利用可能なメチオニン及びアスパラギンの量を減少させることである。メチオニン欠乏は、上述の通り、食事のメチオニン欠乏及び/又はメチオニナーゼ投与を通して実施してもよい。
I.略語
CCK−8:Cell Counting Kit−8
DPBS:ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
IMDM:イスコフ改変ダルベッコ培地
MGL:メチオニン−γ−リアーゼ
v/v:容量対容量
II.1. テスト項目
II.1.1. L−アスパラギナーゼ
種類:Medac(登録商標)(ドイツ)、大腸菌L−アスパラギナーゼ 10000IU
1種の濃度のL−アスパラギナーゼ(2.53IU/mL)を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)1Xでの系列希釈により調製した。L−アスパラギナーゼの濃度を11倍希釈して、最終濃度0.23IU/mL(IC50)を得た。
II.1.2. メチオニン−γ−リアーゼ(MGL)
種類:大腸菌内で産生されたP.プチダメチオニン−γ−リアーゼ(MGL)
II.2.1. 種類
名称:HL−60細胞株
種類:ヒト前骨髄球性白血病細胞株(懸濁液)
供給業者及び参照番号:ATCC、CCL−240
II.2.2.培養条件
L−グルタミン培地を含み、20%(v/v)ウシ胎児血清、100IU/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを補充されたIMDMで、細胞を培養した。PO−CELL−002及びPO−CELL−005により、継代培養を実施した。
II.2.3. 比色キット
名称:Cell Counting Kit−8(CCK−8)
供給業者及び参照番号:Fluka 96992
III.1 方法
100μL/ウェル中の細胞15000個を、96ウェル平底プレート5枚に分配した。加えて、各プレートのブランク対照として、2つのウェルに培地を充填した。蒸発及び濃縮を最小限にするために、空のウェルの全てに培地を充填した。0日目(D0)に、IC50濃度のL−アスパラギナーゼ又はMGL 10μLを、対応するウェルに添加した。対照(ブランクウェル及び対照プレート)は、DPBS 1X 10μLを受けた。3日目(D3)に、培地をウェルから除去して、対応するウェルに添加された新しい培地及びDPBS 1X 10μL又はIC50濃度のL−アスパラギナーゼ(それまでにMGLとインキュベートされた細胞の場合)若しくはMGL(それまでにL−アスパラギナーゼとインキュベートされた細胞の場合)10μLと交換した。対照(ブランク及び陽性対照)は、DPBS 1X 10μLを受けた。その後、プレートをインキュベータでさらに3日間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時(D6)に、CCK−8溶液10μLを、PO−CELL−004により各ウェルに添加し、プレートをインキュベータで2時間インキュベートした。その後、光学密度(OD)を、マイクロプレートリーダーを利用して450nmで計測した。
対照は、二重測定で実施した。
III.2.1. ブランクウェル
460nm前後のわずかな天然の吸収が、CCK−8を含む培地で生じる。このバックグランド吸収は、培地、pH、インキュベーション時間及び露光の長さに依存する。したがってブランクウェルを、培地100μL及びL−アスパラギナーゼ又はMGL希釈剤、DPBS 1× 10μLを含有して実施した。これらの対照ウェルの平均吸収を、細胞を含む他のウェルから差し引いた。
III.2.2. 生存率対照(Viability control)(陽性対照)
HL−60細胞株の陽性対照(細胞生存率100%)として、L−アスパラギナーゼ又はMGLを含まず希釈剤(DPBS 1X)10μLを含む培地(100μL)で細胞を培養した。
細胞を含まない培地を、ブランク対照(ODブランク)とした。L−アスパラギナーゼ又はMGLを伴わない細胞を、陽性対照(生存率対照)とした。
生存する細胞の割合%を、以下に示す通り計算した。
IV.1. 内部対照
内部対照は、生データで特定されなければ、容認できるものとした。
IV.2. L−アスパラギナーゼ又はMGL単独でのIC50の計算
薬物単独(MGL又はL−アスパラギナーゼ)での細胞生存率の割合%を、薬物併用の各実験で照査した。
IV.2.1. L−アスパラギナーゼ及びMGLの連続添加
− IC50 L−アスパラギナーゼ(L−アスパラギナーゼのIC50対照)に比較して76%、
− MGL(MGLのIC50対照)に比較して70%、
− 最初にL−アスパラギナーゼをIC50用量で添加した酵素連携に比較して75%、
低下させることが示された。
連続の酵素連携から、IC50用量のMGL添加と、その3日後のIC50用量のL−アスパラギナーゼの添加により、細胞死亡率が上昇することが実証された。しかし逆設計の酵素添加では、そのような結果を得ることができなかった。
L−アスパラギナーゼ(Medac(登録商標)大腸菌L−アスパラギナーゼ)は、透析バッグにおける低張透析の方法によりネズミ赤血球(OF1マウス)に封入される。血液を事前に遠心分離して血漿を除去し、その後、0.9%NaClで3回洗浄する。ヘマトクリットをアスパラギナーゼの存在下で70%に調整し、透析を開始する前に最終濃度400IU/mLの赤血球又は赤血球細胞(RBC)に添加する。透析は、低浸透圧の溶解緩衝液に対して4℃で50分間継続する。ネズミ赤血球をその後、高浸透圧溶液の添加及び37℃で30分間のインキュベーションにより再封する。0.9%NaClでの2回の洗浄及びウシ血清アルブミンBSA(6%)補充Sag−マンニトールでの1回の洗浄の後、赤血球をヘマトクリット50%に調整する。L−アスパラギナーゼを封入した赤血球は、L−アスパRBCと呼称する。封入により、50%ヘマトクリットでアスパラギナーゼ40IU/RC mlの濃度のL−アスパRBCが生成する。
− ヘマトクリット(Ht)
− 平均血球容積(ACV)
− 総ヘモグロビン濃度(ACHC)、及び
− 細胞計数
についてテストする。
国際公開第2006/016247(A)号パンフレットに記載された方法を利用して、L−アスパラギナーゼを封入した赤血球のバッチを生成する。国際公開第2006/016247(A)号パンフレットの教示に従い、浸透圧脆弱性を検討し、それに応じて溶解パラメータを調整する(透析カートリッジ中の赤血球懸濁液の流速を調整する)。該方法をさらに、患者の体重及び投与されるL−アスパラギナーゼの用量を考慮する医師の処方に従って実施する。最終生成物の詳細は、以下の通りである:
− 平均血球容積(MCV):70〜95fL
− 平均血球ヘモグロビン濃度(MCHC):23〜35g/dL
− 細胞外ヘモグロビン≦0.2g/dL懸濁液
− 浸透圧脆弱性≦6g/L NaCl
− 平均血球L−アスパラギナーゼ濃度:78〜146IU/mL
− 細胞外L−アスパラギナーゼ≦総酵素活性の2%
菌株の生成及び高生産性クローンの単離:シュードモナス・プチダのMGLの天然配列(GenBank:D88554.1)を、レアコドンを修飾することにより最適化した(P.プチダから生じた配列を生成株の大腸菌に適合させるため)。翻訳開始の状況を改善するために、他の変更を行った。そして非表現突然変異を実施して、コード配列内の推定細菌プロモーターの一部である3つのエレメント(ボックス−35、ボックス−10及び位置56の転写因子結合部位)を除去した。生成株の大腸菌HMS174(DE3)を、最適化配列を含む発現ベクターpGTPc502_MGL(プロモーターT7)で形質転換して、生成クローンを選択した。生成クローンを、GY培地+0.5%グルコース+カナマイシン中、37℃で6〜8時間(予備培養1)及び16時間(予備培養2)、予備培養する。
以下の表2は、MGLの1つの生成バッチの主な特徴づけを要約している:
2つの方法を用いて得られた生成物を、以下の表4に要約する。
血漿及びバフィコートを除去するために、CD1マウス(Charles River)の全血を1000×g及び4℃で10分間遠心分離する。RCを、0.9%NaCl(v:v)で3回洗浄する。異なる濃度のMGL及びPLPを含む、ヘマトクリット70%の最終懸濁液を得るために、フリーズドライMGLを水で78.7mg/mlの濃度に再懸濁させて、赤血球懸濁液に添加する。その後、該懸濁液を120ml/時の流速で血液透析器に負荷し、逆流での流速15ml/分の低張溶液に対して透析した。該懸濁液をその後、高張溶液で再封し、その後、37℃で30分間インキュベートした。0.9%NaCl、0.2%グルコースで3回洗浄した後、該懸濁液を、6%BSAが補充された保持溶液SAG−マンニトールに取り込んだ。得られた生成物を、D0(調製後2時間以内)及びD1(即ち、2〜8℃での保持の18〜24時間後)で特徴づける。血液学的特徴を、獣医学検査用自動装置(Sysmex、PocH−100iV)で得る。
後に列挙される異なる試験において、完成された生成物のMGL活性を、実施例5に記載された方法で水性溶液中のMGLの外部較正範囲に対してアッセイする。これらの結果を解説した試験と合わせると、完成された生成物のMGl活性が該方法に導入された酵素の量に応じて上昇すること、そして良好な安定性を維持しながら、完成された生成物mlあたりに32IUまでのMGLを封入することが容易に可能であること、が示される。
別の試験において、ネズミの完成された生成物3種RC−MGL−PLP1、RC−MGL−PLP2及びRC−MGL−PLP3を、以下の方法により調製した。
− RC−MGL−PLP2:3mg/ml MGL及び約30μM PLPを含有する懸濁液からのMGL及びPLPの同時封入。完成された生成物を、SAG−マンニトール 6%BSAに取り込んだ。
− RC−MGL−PLP3:この生成物は、3mg/ml MGL及び約124μM PLPを含有する懸濁液からのMGL及びPLPの同時封入から生じる。最終生成物を、SAG−マンニトール 6%BSAに取り込んだ。
− RC−MGL−PLP4:5mg/ml MGL及び約35μM PLPを含有する懸濁液からのMGL及びPLPの同時封入。最終生成物を、SAG−マンニトール 6%BSAに取り込んだ。
− RC−MGL−PLP5:6mg/ml MGL及び約100μM PLPを含有する懸濁液からのMGL及びPLPの同時封入。完成された生成物を、SAG−マンニトール 6%BSAに取り込んだ。
白血球枯渇ヒト赤血球細胞RC(「Etablissement Francais du Sang」により提供)のパウチを、0.9%NaClで3回洗浄の1サイクルに供する(洗浄機Cobe 2991)。3mg/ml MGL及び約30μM PLPを含有するヘマトクリット70%の最終懸濁液(MGLの配合物から生成する)を得るために、フリーズドライMGLを0.7%NaClで再懸濁させて、赤血球懸濁液に添加する。該懸濁液を均質化して、欧州特許第1773452号明細書に記載された方法により封入して進める。再封からの懸濁液をその後、最も脆弱なRCを除去するために、室温で3時間インキュベートする。該懸濁液を0.9%NaCl、0.2%グルコース溶液で3回洗浄し(洗浄機Cobe 2991)、保持溶液(AS−3)80mlで再懸濁する。封入されたMGLレベルを、実施例6と同様にアッセイする。以下の表6を参照されたい。
追加の略語
RPMI:ロズウェルパーク記念研究所培地
I.1. テスト項目
I.1.1. L−アスパラギナーゼ
種類:Medac(登録商標)(ドイツ)、大腸菌L−アスパラギナーゼ 10000IU
I.1.2. メチオニン−γ−リアーゼ(MGL)
種類:大腸菌内で産生されたP.プチダメチオニン−γ−リアーゼ(MGL)
I.2. 細胞株
I.2.1. 種類
名称:NCI−N87細胞株
種類:ヒト胃癌細胞株(接着)
供給業者及び参照番号:ATCC、CRL−5822
I.2.2. 培養条件
I.2.3. 比色キット
名称:Cell Counting Kit−8(CCK−8)
供給業者及び参照番号:Fluka 96992
II.1. 方法
100μL/ウェル中の細胞2500個を、96ウェル平底プレートに分配した(生データのプレート数を参照)。加えて、各プレートのブランク対照として、2つのウェルに培地を充填した。蒸発及び濃縮を最小限にするために、空のウェルの全てに培地を充填した。0日目(D0)に、IC50濃度のL−アスパラギナーゼ又はMGL10μLを、対応するウェルに添加した。対照(ブランクウェル及び対照プレート)は、DPBS 1X 10μLを受けた。4日目(D4)に、培地をウェルから除去して、対応するウェルに添加された新しい培地及びDPBS 1X 10μL又はIC50濃度のL−アスパラギナーゼ(それまでにMGLとインキュベートされた細胞の場合)若しくはMGL(それまでにL−アスパラギナーゼとインキュベートされた細胞の場合)10μLと交換した。対照(ブランク及び陽性対照)は、DPBS 1X 10μLを受けた。その後、プレートをインキュベータでさらに4日間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時(D8)に、CCK−8溶液10μLを、PO−CELL−004により各ウェルに添加し、プレートを4時間インキュベートした。その後、光学密度(OD)を、マイクロプレートリーダーを利用して450nmで計測した。
対照は、二重測定で実施した。
II.2.1. ブランクウェル
先の実施例1の通り。
II.2.2. 生存率対照(陽性対照)
NCI−N87細胞株の陽性対照(細胞生存率100%)として、L−アスパラギナーゼ又はMGLを含まず希釈剤(DPBS 1X)10μLを含む培地(100μL)で、細胞を培養した。
先の実施例1の通り。
III.1. 内部対照
内部対照は、生データで特定されなければ、容認できるものとした。
III.2. L−アスパラギナーゼ又はMGL単独でのIC50の計算
薬物単独(MGL又はL−アスパラギナーゼ)での細胞生存率の割合%を、薬物併用の各実験で照査した。酵素で用いられた本明細書のIC50値が、過去にD4での単回処置で確証されているため、50%の細胞生存率は、テストの半分の時点(D4)で予測される。
III.2.1. L−アスパラギナーゼ及びMGLの連続添加
− IC50 L−アスパラギナーゼ(L−アスパラギナーゼのIC50対照)に比較して55%、
− MGL(MGLのIC50対照)に比較して44%、
− 最初にL−アスパラギナーゼをIC50用量で添加した酵素連携に比較して43%、
低下させることが示された。
連続の酵素連携から、IC50用量のMGL添加と、その4日後のIC50用量のL−アスパラギナーゼの添加により、細胞死亡率が上昇し得ることが実証された。
I. 追加の略語
F12K:ハムF−12のカイン改変培地
II. 操作条件
II.1 テスト項目
II.1.1. L−アスパラギナーゼ
種類:Medac(登録商標)(ドイツ)、大腸菌L−アスパラギナーゼ 10000IU
II.1.2. メチオニン−γ−リアーゼ(MGL)
種類:大腸菌内で産生されたP.プチダメチオニン−γ−リアーゼ(MGL)
II.2. 細胞株
II.2.1. 種類
名称:AGS細胞株
種類:ヒト胃腺癌細胞株(接着)
供給業者及び参照番号:ATCC、CRL−1739
II.2.2. 培養条件
10%(v/v)ウシ胎児血清、100IU/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを補充されたL−グルタミンを含むF12K培地で、細胞を培養した。PO−CELL−002及びPO−CELL−005により継代培養を実施した。
II.2.3. 比色キット
名称:Cell Counting Kit−8(CCK−8)
供給業者及び参照番号:Fluka 96992
III.1. 方法
100μL/ウェル中の細胞1000個を、96ウェル平底プレートに分配した(生データのプレート数を参照)。加えて、各プレートのブランク対照として、2つのウェルに培地を充填した。蒸発及び濃縮を最小限にするために、空のウェルの全てに培地を充填した。0日目(D0)に、10μLのIC50濃度のL−アスパラギナーゼ又はMGLを、対応するウェルに添加した。対照(ブランクウェル及び対照プレート)は、DPBS 1X 10μLを受けた。4日目(D4)に、培地をウェルから除去して、対応するウェルに添加された新しい培地及びDPBS 1X 10μL又は10μLのIC50濃度のL−アスパラギナーゼ(それまでにMGLとインキュベートされた細胞の場合)若しくはMGL(それまでにL−アスパラギナーゼとインキュベートされた細胞の場合)と交換した。対照(ブランク及び陽性対照)は、DPBS 1X 10μLを受けた。その後、プレートをインキュベータでさらに4日間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時(D8)に、CCK−8溶液10μLを、PO−CELL−004により各ウェルに添加し、プレートを4時間インキュベートした。その後、光学密度(OD)を、マイクロプレートリーダーを利用して450nmで計測した。
III.2. 内部対照
対照は、二重測定で実施した。
III.2.1. ブランクウェル
先の実施例1の通り。
III.2.2. 生存率対照(陽性対照)
III.3. 細胞生存率の計測
先の実施例1の通り。
IV.1. 内部対照
内部対照は、生データで特定されなければ、容認できるものとした。
IV.2. L−アスパラギナーゼ又はMGL単独でのIC50の計算
IV.2.1. L−アスパラギナーゼ及びMGLの連続添加
L−アスパラギナーゼ及びMGLの連続処置を含む実験を、二重測定データで2回実施した。全ての品質対照(ブランク及び陽性対照)を、実験で受けた。
− IC50 L−アスパラギナーゼ(L−アスパラギナーゼのIC50対照)に比較して22%、
− MGL(MGLのIC50対照)に比較して26%、
− 最初にIC50用量で添加されたL−アスパラギナーゼでの酵素連携に比較して10%、
低下させることが示された。
連続の酵素連携から、IC50用量のMGL添加と、その4日後のIC50用量のL−アスパラギナーゼの添加により、細胞死亡率が上昇し得ることが実証された。
I. 追加の略語
A.M.:午前
ERY−ASP:赤血球細胞に封入されたL−アスパラギナーゼ
ERY−MET:赤血球細胞に封入されたメチオニンγリアーゼ
IG:胃内注射(強制経口投与)
IU:μmol/分に対応する国際単位
IV:静脈内
ND:測定されず
PN:ピリドキシン
TGI:腫瘍成長阻害
この試験の目的は、メチオニナーゼ負荷赤血球(ERY−MET)とL−アスパラギナーゼ負荷赤血球(ERY−ASP)との組み合わせが、NCI−N87胃腫瘍皮下異種移植片マウスモデルにおいてERY−MET単独で観察された抗腫瘍活性を改善し得るか否かを決定することである。
NCI−N87細胞を、ERYTECH Pharmaで培養し、注射用のDPBS 1×中の5×107細胞/mLで調製した。雌NMRIヌードマウス10又は12匹の4群(群1、2、3及び4)に、該細胞株を一定濃度5×106細胞/μLで皮下注射した。ERY−MET及びERY−ASP注射を、それぞれ108IU/kg(8mL/kg)及び200IU/kg(4〜5.4mL/kg)で注射した(I.V.経路)。群2は、ERY−METの注射を3回、7、14及び21日目に受けた。群3(ERY−ASP/ERY−MET)は、ERY−ASPの注射を7日目に1回、その後ERY−METの注射を21及び28日目に2回受けた。群4(ERY−MET/ERY−ASP)は、ERY−METの注射を7及び14日目に2回、その後ERY−ASPの注射を21日目に1回受けた。群1は、ERY−MET(SAG−マンニトール/血漿)の保持溶液を8mL/kgで7、14及び21日目に投与された。
ERY−MET/ERY−ASPの組み合わせに関連する腫瘍体積減少は、ERY−MET群で観察されたものと異なるようであり、実際にD37では、ビヒクルを与えられたマウス(対照)は、平均腫瘍体積441.5±56.6mm3を有したが、ERY−METマウスは、平均腫瘍体積298.3±36.2mm3を示し、ERY−MET/ERY−ASPマウスは、平均腫瘍体積189.7±29.8mm3を示し、それぞれ平均腫瘍体積減少率37%及び57%に対応した。腫瘍成長阻害の割合%(TGI*)は、以下の式に従って酵素連携ERY−MET/ERY−ASP 対 対照(ビヒクル群)又はERY−MET群について計算した:
2つの投与スケジュール:1−ERY−ASP(D7)−ERY−MET(D21/D28)及び2−ERY−MET(D7/D15)−ERY−ASP(D21)で、ERY−METをERY−ASPと組み合わせた。ERY−METをERY−ASPの前に投与した場合(2回)、ERY−MET単独に比較した陽性反応が現れるようである。結果のこの有意性は、個々の腫瘍体積測定についてD37に0.0001よりも低いP値を得ることにより裏づけられる。
Claims (25)
- アスパラギナーゼの前にメチオニナーゼが投与される少なくとも1回の連続投与のためにアスパラギナーゼ及びメチオニナーゼを含む、哺乳動物における癌を処置する際の使用のための医薬組成物又はキット。
- メチオニナーゼ及びアスパラギナーゼが、遊離形態、ペグ化形態又は赤血球の内部に封入されている、請求項1に記載の使用のための組成物。
- メチオニナーゼが、遊離形態であるか、又はペグ化されており、メチオニナーゼ投与の終了とアスパラギナーゼ投与の開始の間の遅延時間が、約1時間〜約7日の間、特に約3時間〜約6日の間、好ましくは約1日〜約5日の間である、請求項1に記載の使用のための組成物。
- メチオニナーゼが、赤血球に封入されており、メチオニナーゼ投与の終了とアスパラギナーゼ投与の開始の間の遅延時間が、約1時間〜約30日の間、特に約1日〜約20日の間、好ましくは約1日〜約10日の間である、請求項1に記載の使用のための組成物。
- メチオニナーゼが、約100〜約100000IUの間、特に約500〜約50000IUの間、好ましくは約500〜約5000IUの間の量で1回又は複数回投与される、請求項1から4の何れか一項に記載の使用のための組成物。
- アスパラギナーゼが、約500〜約100000IUの間、特に約1000〜約50000IUの間、好ましくは約5000〜約30000IUの間の量で1回又は複数回投与される、請求項1から5の何れか一項に記載の使用のための組成物。
- メチオニナーゼを投与された哺乳動物において癌を処置する際の使用のためのアスパラギナーゼを含む医薬組成物。
- メチオニナーゼが、遊離形態又はペグ化形態であり、メチオニナーゼ投与とアスパラギナーゼ投与の間の遅延時間が、約1時間〜約7日の間、特に約3時間〜約6日の間、好ましくは約1日〜約5日の間である、請求項7に記載の使用のための組成物。
- メチオニナーゼが、赤血球の内部に封入されており、メチオニナーゼ投与の終了とアスパラギナーゼ投与の開始の間の遅延時間が、約1時間〜約30日の間、特に約1日〜約20日の間、好ましくは約1日〜約10日の間である、請求項7に記載の使用のための組成物。
- メチオニナーゼが、約100〜約100000IUの間、特に約500〜約50000IUの間、好ましくは約500〜約5000IUの間の量で1回又は複数回投与される、請求項7から9の何れか一項に記載の使用のための組成物。
- アスパラギナーゼが、約500〜約100000IUの間、特に約1000〜約50000IUの間、好ましくは約5000〜約30000IUの間の量で1回又は複数回投与される、請求項7から10の何れか一項に記載の使用のための組成物。
- メチオニナーゼと同時の、別個の、又は連続した投与のために、PLP又はPLP前駆体をさらに含む、請求項1から11の何れか一項に記載の使用のための組成物。
- 別個の又は連続した投与のために、赤血球の内部に封入されたメチオニナーゼと、PLPの非リン酸エステル前駆体と、を含む、請求項12に記載の使用のための組成物。
- 赤血球の内部に封入されたアスパラギナーゼが投与される前に、赤血球の内部に封入されたメチオニナーゼが少なくとも1回又は2回投与され、各メチオニナーゼ投与の後、アスパラギナーゼが投与される前にPLPの非リン酸エステル前駆体の溶液の投与がある、請求項1から11の何れか一項に記載の使用のための組成物。
- 液性又は固形腫瘍を処置するための、請求項1から14の何れか一項に記載の使用のための組成物。
- 白血病又は胃癌を処置するための、請求項15に記載の使用のための組成物。
- 必要とする哺乳動物における癌を処置するための方法であって、前記必要とする哺乳動物に、メチオニナーゼを含む組成物を投与し、そしてその後、アスパラギナーゼを含有する組成物を投与することを含む、方法。
- 必要とする哺乳動物における癌を処置するための方法であって、前記必要とする哺乳動物に、赤血球の内部に封入されたメチオニナーゼを含む組成物を投与し、そしてその後、赤血球の内部に封入されたアスパラギナーゼを含有する組成物を投与することを含む、方法。
- メチオニナーゼ投与の終了とアスパラギナーゼ投与の開始の間の遅延時間が、1時間〜30日の間である、請求項18に記載の方法。
- メチオニナーゼが、100〜100000IUの間の量で1回又は複数回投与される、請求項18に記載の方法。
- アスパラギナーゼが、500〜100000IUの間の量で1回又は複数回投与される、請求項18に記載の方法。
- 赤血球の内部に封入されたアスパラギナーゼが投与される前に、赤血球の内部に封入されたメチオニナーゼが少なくとも1回又は2回投与され、アスパラギナーゼが投与される前に、各メチオニナーゼ投与がPLP又はPLP前駆体の投与を伴う、請求項18に記載の方法。
- PLPの非リン酸エステル前駆体の溶液が、封入されたメチオニナーゼの各投与後に1回又は複数回投与される、請求項22に記載の方法。
- PLPの非リン酸エステル前駆体の溶液が、メチオニナーゼ処置の期間に1日1回、又は1日に2回以上投与される、請求項23に記載の方法。
- 前記癌が、白血病又は胃癌である、請求項18に記載の方法。
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