KR20210084539A - 치료학적 용도를 위한 조작된 영장류 시스틴/시스테인 분해 효소 - Google Patents

치료학적 용도를 위한 조작된 영장류 시스틴/시스테인 분해 효소 Download PDF

Info

Publication number
KR20210084539A
KR20210084539A KR1020217015692A KR20217015692A KR20210084539A KR 20210084539 A KR20210084539 A KR 20210084539A KR 1020217015692 A KR1020217015692 A KR 1020217015692A KR 20217015692 A KR20217015692 A KR 20217015692A KR 20210084539 A KR20210084539 A KR 20210084539A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
ala
ser
gly
val
Prior art date
Application number
KR1020217015692A
Other languages
English (en)
Inventor
에버렛 스톤
웨이-쳉 루
크리스토스 카라미트로스
Original Assignee
보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 filed Critical 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
Publication of KR20210084539A publication Critical patent/KR20210084539A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y404/00—Carbon-sulfur lyases (4.4)
    • C12Y404/01—Carbon-sulfur lyases (4.4.1)
    • C12Y404/01001—Cystathionine gamma-lyase (4.4.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
    • A61B17/22—Implements for squeezing-off ulcers or the like on the inside of inner organs of the body; Implements for scraping-out cavities of body organs, e.g. bones; Calculus removers; Calculus smashing apparatus; Apparatus for removing obstructions in blood vessels, not otherwise provided for
    • A61B17/225—Implements for squeezing-off ulcers or the like on the inside of inner organs of the body; Implements for scraping-out cavities of body organs, e.g. bones; Calculus removers; Calculus smashing apparatus; Apparatus for removing obstructions in blood vessels, not otherwise provided for for extracorporeal shock wave lithotripsy [ESWL], e.g. by using ultrasonic waves
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid, pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-aminoacids, e.g. alanine, edetic acids [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/401—Proline; Derivatives thereof, e.g. captopril
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

L-시스틴/시스테인 분해 효소 활성을 갖는 단백질의 조작에 관한 방법 및 조성물이 개시된다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고 L-시스틴/시스테인을 분해할 수 있는 변형된 시스타티오닌-γ-리아제가 개시된다. 또한, 상기에서 개시된 변형된 효소 또는 상기 효소를 인코딩하는 핵산을 사용하는 조성물 및 방법이 시스틴뇨증의 치료에 제공된다.

Description

치료학적 용도를 위한 조작된 영장류 시스틴/시스테인 분해 효소
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 10월 26일자로 출원된 미국 가출원 번호 US 62/751,197호의 우선권의 이익을 주장하며, 이의 내용 전체는 본 출원에 참조로 포함된다.
연방 정부 후원 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 부여된 허여 번호 R01 CA189623 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리들을 갖는다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이로써 그 전체가 참조로 포함된다. 2019년 10월 22일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 UTFBP1212WO_ST25.txt로 명명되며, 365 kilobyte의 크기이다.
공동 연구 계약 당사자
본 출원에서 개시되고 청구된 발명은 Aeglea BioTherapeutics, Inc.와 The Board of Regents of The University of Texas System 간의 공동 연구 계약의 범위 내에서 개발되었다.
기술분야
사람 요법에 적합한 높은 시스틴/시스테인 분해 활성을 갖는 재조합으로 조작된 영장류 효소 변이체가 개시된다. L-시스틴과 L-시스테인 둘 다를 고갈시키는 효소에 의한 시스틴뇨증의 치료를 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다.
시스틴뇨증은, 시스틴 (아미노산 시스테인의 이황화물 형태)의 비정상적 배출 및 요로내 시스틴 결정/결석의 형성을 초래하는, 신장 근위 세뇨관의 시스틴 및 이염기성 아미노산 수송체를 인코딩하는 SLC3A1 및 SLC7A9 유전자의 돌연변이에 기인하는 유전성 장애이다. 결손 신장 수송체가 신장 여과 동안 시스틴을 재흡수할 수 없는 유전성 장애인 시스틴뇨증을 앓고 있는 환자에게 이용 가능한 치료제는 거의 없다. 아미노산 L-시스테인의 이황화물 형태인 시스틴은 매우 불용성이며, 시스틴뇨증 환자의 요로에서 고농도에 도달하여 시스틴 결정 및 결석의 형성을 초래한다. 순환 시스틴 수준을 감소시키는 기존 요법은 요로 결석 형성을 부분적으로 예방하지만, 이의 용도를 제한하는 상당한 역 효과를 갖는다.
신장과 방광에서 시스틴 결석 형성을 감소시키고 예방하기 위한 요법이 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 L-시스틴 및 L-시스테인 (본 출원에서 "L-시스틴/시스테인"으로 지칭됨)이 혈청으로부터 효율적으로 분해될 수 있도록 하는 영장류 시스타티오닌-감마-리아제 (cystathionine-gamma-lyase: "CGL") 효소의 조작, 및 사람 요법에 적합한 제형에서 변형된 CGL 효소를 제공하는 것에 관한 것이다. 본래의 효소와 비교하여 낮은 K M 및 높은 촉매 활성 k cat을 나타내는 효소를 개발하기 위해, 이러한 본래의 효소는 선택된 아미노산을 변형시킴으로써 조작되었으며, 이러한 변형은 극적으로 개선된 효소적 특성을 초래한다. 이와 같이, 본 출원에서 기재된 바와 같은 변형된 CGL 효소는 개선된 L-시스틴/시스테인 분해 촉매 활성을 갖는 사람 또는 영장류 폴리펩타이드 서열을 포함하는 신규한 효소를 제공함으로써 당해 분야의 주요 결점을 극복한다. 이러한 효소는 사람 서열로 구성되어 있기 때문에, 불리한 면역 반응을 유발할 가능성이 없다. 이와 같이, 이러한 변형된 효소는 사람 요법에 적합할 수 있으며, 낮은 면역원성을 가질 수 있다.
시스틴을 시스테인-퍼설파이드로 효율적으로 전환시킨 후 유리 시스테인 및 H2S로 붕괴시키는 조작된 사람 시스타티오닌-감마-리아제 (CGL) 효소를 이용하는 방법이 개시되며, 따라서, 이것은 신장 및 요로에서 시스틴 축적 및 결석 형성을 예방함으로써 시스틴뇨증 환자에 대한 적합한 요법이 된다. 또한, 상기 조작된 사람 CGL 효소는 시스테인을 피루베이트, 암모니아 및 황화수소로 전환시켜, 산화되어 시스틴을 형성할 수 있는 시스테인의 양을 사실상 감소시킬 수 있다. 시스틴은 일반적으로 대부분의 세포에서 생산되는 비필수 아미노산이므로, 동물 모델에서 장기간 시스틴 고갈로 인해 유발되는 독성은 없는 것으로 밝혀졌다. 순환 시스틴의 총 수준을 무독성으로 제거하는 시스틴 분해 치료제의 능력은 기존 치료 요법 보다 시스틴 결석 형성을 예방하는 우수한 치료 요법이 될 것이다는 것을 나타낸다.
영장류 CGL 효소로부터 유래된 L-시스틴/시스테인 분해 활성을 갖는 변형된 CGL 효소가 본 출원에서 제공된다. 변형된 CGL 효소는 사람 CGL 효소 (서열 번호 1), 폰고 아벨리이 (Pongo abelii) CGL 효소 (Genbank ID: NP_001124635.1; 서열 번호 2), 마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis) CGL 효소 (Genbank ID: AAW71993.1; 서열 번호 3), 판 트로글로다이테스 (Pan troglodytes) CGL 효소 (Genbank ID: XP_513486.2; 서열 번호 4) 및 판 파니스쿠스 (Pan paniscus) CGL 효소 (Genbank ID: XP_003830652.1; 서열 번호 5)로부터 유래될 수 있다. 상기 본래의 CGL 효소는 화학적 변형, 치환, 삽입, 결실 및/또는 절단과 같은 하나 이상의 다른 변형에 의해 변형될 수 있다.
변형된 CGL 효소는 서열 번호 1~5의 51, 55, 59, 91, 163, 189, 193, 200, 234, 311, 336, 339 및/또는 353번 아미노산 위치에서 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 치환에 의해 변형됨으로써 본래의 영장류 CGL 효소로부터 유래될 수 있다. 이러한 예들에서, 각각의 서열의 첫번째 메티오닌은 1번 아미노산 위치에 상응하며, 각각의 아미노산은 그로부터 순차적으로 넘버링된다. 51번 아미노산 위치의 치환은 트립토판 (W)일 수 있고, 55번은 글루탐산 (E)일 수 있고, 59번은 트레오닌 (T) 또는 이소류신 (I)일 수 있고, 91번은 메티오닌 (M) 또는 세린 (S)일 수 있고, 163번은 아르기닌 (R)일 수 있고, 189번은 세린 (S)일 수 있고, 193번은 글리신 (G) 또는 알라닌 (A)일 수 있고, 200번은 프롤린 (P) 또는 히스티딘 (H)일 수 있고, 234번은 라이신 (K)일 수 있고, 311번은 글리신 (G)일 수 있고, 336번은 아스파르트산 (D)일 수 있고, 339번은 발린 (V)일 수 있고/있거나 353번은 세린 (S)일 수 있다.
변형된 CGL 효소는 서열 번호 6~95에 따른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 변형된 CGL 효소는 생리학적 조건하에 L-시스틴/시스테인을 분해할 수 있다. 상기 변형된 CGL 효소는 적어도 약 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 104, 105, 106 s-1M-1 또는 이들로부터 유도 가능한 임의의 범위의 L-시스틴/시스테인 (k cat/K M)에 대한 촉매 효율을 가질 수 있다. 예시적인 CGL 효소는 L-시스틴에 대해 >104 s-1M-1 및 L-시스테인에 대해 >103 s-1M-1의 촉매 효율을 가질 수 있다.
상기 치환은 사람 CGL의 P193A, T311G, E339V 및 I353S의 조합일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체). 예를 들어, 서열 번호 2에 대한 서열 번호 1에서 I353의 등가 치환은 서열 번호 1에서와 같은 이소류신이 아닌 발린을 변형시킬 것이다. 상기 치환은 사람 CGL의 A200P, T311G, E339V 및 I353S의 조합일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체). 상기 치환은 사람 CGL의 P193A, A200P, T311G, E339V 및 I353S의 조합일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체). 상기 치환은 사람 CGL의 H55E, E59T, L91M, N234K, T336D 및 E339V의 조합일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체). 예를 들어, 서열 번호 2에 대한 서열 번호 1에서 E59의 등가 치환은 서열 번호 1에서와 같은 글루탐산이 아닌 발린을 변형시킬 것이다. 상기 치환은 사람 CGL의 H55E, E59T, L91S, N234K, T336D 및 E339V의 조합일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체). 상기 치환은 사람 CGL의 T189S, P193G, T311G, E339V 및 I353S의 조합일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체). 상기 치환은 사람 CGL의 T163R, T311G, E339V 및 I353S의 조합일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체). 예를 들어, 서열 번호 3에 대한 서열 번호 1에서 T163의 등가 치환은 서열 번호 1에서와 같은 트레오닌이 아닌 발린을 변형시킬 것이다. 상기 치환은 사람 CGL의 A51W, H55E, E59T, T336D 및 E339V의 조합일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체). 상기 치환은 사람 CGL의 H55E, P193A, T311G, T336D, E339V 및 I353S의 조합일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체). 상기 치환은 사람 CGL의 A200H, T311G, E339V 및 I353S의 조합일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체). 상기 치환은 사람 CGL의 T311G, E339V 및 I353S의 조합일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체). 상기 치환은 사람 CGL의 E59I, E339V 및 I353S의 조합일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체). 상기 치환은 사람 CGL의 L91M 및 E339V의 조합일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체). 상기 치환은 사람 CGL의 E339V 및 I353S의 조합일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체). 상기 치환은 사람 CGL의 E339V일 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 동족체).
상기 변형된 폴리펩타이드는 폰고 아벨리이 CGL-P193A-T311G-E339V-V353S 변이체 (서열 번호 24), 폰고 아벨리이 CGL-A200P-T311G-E339V-V353S 변이체 (서열 번호 25), 폰고 아벨리이 CGL-P193A-A200P-T311G-E339V-V353S 변이체 (서열 번호 26), 폰고 아벨리이 CGL-H55E-V59T-L91M-N234K-T336D-E339V 변이체 (서열 번호 27), 폰고 아벨리이 CGL-H55E-V59T-L91S-N234K-T336D-E339V 변이체 (서열 번호 28), 폰고 아벨리이 CGL-T189S-P193G-T311G-E339V-V353S 변이체 (서열 번호 29), 폰고 아벨리이 CGL-T163R-T311G-E339V-V353S 변이체 (서열 번호 30), 폰고 아벨리이 CGL-A51W-H55E-V59T-T336D-E339V 변이체 (서열 번호 31), 폰고 아벨리이 CGL-H55E-P193A-T311G-T336D-E339V-V353S 변이체 (서열 번호 32), 폰고 아벨리이 CGL-A200H-T311G-E339V-V353S 변이체 (서열 번호 33), 폰고 아벨리이 CGL-T311G-E339V-V353S 변이체 (서열 번호 34), 폰고 아벨리이 CGL-V59I-E339V-V353S 변이체 (서열 번호 35), 폰고 아벨리이 CGL-L91M-E339V 변이체 (서열 번호 36), 폰고 아벨리이 CGL-E339V-V353S 변이체 (서열 번호 37) 또는 폰고 아벨리이 CGL-E339V 변이체 (서열 번호 38)일 수 있다.
상기 변형된 폴리펩타이드는 마카카 파시쿨라리스 CGL-P193A-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 42), 마카카 파시쿨라리스 CGL-A200P-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 43), 마카카 파시쿨라리스 CGL-P193A-A200P-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 44), 마카카 파시쿨라리스 CGL-H55E-E59T-L91M-N234K-T336D-E339V 변이체 (서열 번호 45), 마카카 파시쿨라리스 CGL-H55E-E59T-L91S-N234K-T336D-E339V 변이체 (서열 번호 46), 마카카 파시쿨라리스 CGL-T189S-P193G-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 47), 마카카 파시쿨라리스 CGL-V163R-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 48), 마카카 파시쿨라리스 CGL-A51W-H55E-E59T-T336D-E339V 변이체 (서열 번호 49), 마카카 파시쿨라리스 CGL-H55E-P193A-T311G-T336D-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 50), 마카카 파시쿨라리스 CGL-A200H-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 51), 마카카 파시쿨라리스 CGL-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 52), 마카카 파시쿨라리스 CGL-E59I-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 53), 마카카 파시쿨라리스 CGL-L91M-E339V 변이체 (서열 번호 54), 마카카 파시쿨라리스 CGL-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 55) 또는 마카카 파시쿨라리스 CGL-E339V 변이체 (서열 번호 56)일 수 있다.
상기 변형된 폴리펩타이드는 판 트로글로다이테스 CGL-P193A-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 60), 판 트로글로다이테스 CGL-A200P-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 61), 판 트로글로다이테스 CGL-P193A-A200P-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 62), 판 트로글로다이테스 CGL-H55E-E59T-L91M-N234K-T336D-E339V 변이체 (서열 번호 63), 판 트로글로다이테스 CGL-H55E-E59T-L91S-N234K-T336D-E339V 변이체 (서열 번호 64), 판 트로글로다이테스 CGL-T189S-P193G-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 65), 판 트로글로다이테스 CGL-T163R-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 66), 판 트로글로다이테스 CGL-A51W-H55E-E59T-T336D-E339V 변이체 (서열 번호 67), 판 트로글로다이테스 CGL-H55E-P193A-T311G-T336D-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 68), 판 트로글로다이테스 CGL-A200H-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 69), 판 트로글로다이테스 CGL-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 70), 판 트로글로다이테스 CGL-E59I-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 71), 판 트로글로다이테스 CGL-L91M-E339V 변이체 (서열 번호 72), 판 트로글로다이테스 CGL-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 73) 또는 판 트로글로다이테스 CGL-E339V 변이체 (서열 번호 74)일 수 있다.
상기 변형된 폴리펩타이드는 판 파니스쿠스 CGL-P193A-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 78), 판 파니스쿠스 CGL-A200P-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 79), 판 파니스쿠스 CGL-P193A-A200P-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 80), 판 파니스쿠스 CGL-H55E-E59T-L91M-N234K-T336D-E339V 변이체 (서열 번호 81), 판 파니스쿠스 CGL-H55E-E59T-L91S-N234K-T336D-E339V 변이체 (서열 번호 82), 판 파니스쿠스 CGL-T189S-P193G-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 83), 판 파니스쿠스 CGL-T163R-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 84), 판 파니스쿠스 CGL-A51W-H55E-E59T-T336D-E339V 변이체 (서열 번호 85), 판 파니스쿠스 CGL-H55E-P193A-T311G-T336D-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 86), 판 파니스쿠스 CGL-A200H-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 87), 판 파니스쿠스 CGL-T311G-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 88), 판 파니스쿠스 CGL-E59I-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 89), 판 파니스쿠스 CGL-L91M-E339V 변이체 (서열 번호 90), 판 파니스쿠스 CGL-E339V-I353S 변이체 (서열 번호 91) 또는 판 파니스쿠스 CGL-E339V 변이체 (서열 번호 92)일 수 있다.
본 출원에서 논의된 바와 같은 변형된 CGL 효소는 비변형된 CGL 효소 (예를 들어, 본래의 CGL 효소)와 비교하여 특정 백분율의 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형된 CGL 효소는 본래의 영장류 시스타티오나아제 (즉, 시스타티오닌-γ-리아제)일 수 있다. 상기 백분율의 동일성은 변형된 CGL 효소의 비변형된 부분 (서열 번호 1~5의 51, 55, 59, 91, 163, 189, 193, 200, 234, 311, 336, 339 및/또는 353번 아미노산 위치에 임의의 치환을 제외한 변형된 CGL 효소의 서열)과 본래의 CGL 효소 사이의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이로부터 유도 가능한 임의의 범위)일 수 있다. 상기에서 논의된 퍼센트 동일성은 상응하는 CGL 효소의 비변형된 영역과 비교하여 효소의 특정한 변형된 영역에 관한 것일 수 있다는 것도 또한 고려된다. 예를 들어, 변형된 CGL 효소는 동일한 종 또는 교차 종 유래의 비변형된 CGL 효소 또는 본래의 CGL 효소의 것과 비변형된 또는 돌연변이체 기질 인식 부위의 아미노산 서열의 동일성에 기초하여 특징으로 할 수 있는 변형된 또는 돌연변이체 기질 인식 부위를 함유할 수 있다. 예를 들어, 비변형된 사람 CGL 효소와 적어도 90%의 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 변형된 사람 CGL 효소는, 변형된 사람 CGL 효소의 아미노산 중 적어도 90%가 비변형된 사람 CGL 효소의 아미노산과 동일하다는 것을 의미한다.
변형된 CGL 효소는 이종 펩타이드 서열 또는 다당류에 연결될 수 있다. 예를 들어, 변형된 CGL 효소는 융합 단백질로서 이종 펩타이드 서열에 연결될 수 있다. 상기 변형된 CGL 효소는 생체내 반감기를 증가시키기 위해 IgG Fc, 알부민, 알부민 결합 펩타이드 또는 XTEN 폴리펩타이드와 같은 아미노산 서열에 연결될 수 있다. 상기 변형된 CGL 효소는 폴리시알산 중합체에 연결될 수 있다.
혈청 지속성을 증가시키기 위해, 상기 변형된 CGL 효소는 하나 이상의 폴리에테르 분자에 연결될 수 있다. 상기 폴리에테르는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)일 수 있다. 상기 변형된 CGL 효소는 라이신 또는 시스테인과 같은 특정 아미노산 잔기를 통해 PEG에 연결될 수 있다. 치료학적 투여를 위해, 상기 변형된 CGL 효소는 또한 약제학적으로 허용되는 담체 중에 분산될 수 있다.
변형된 CGL 효소를 인코딩하는 핵산이 고려된다. 상기 핵산은 이. 콜라이 (E. coli)와 같은 세균에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 이. 콜라이에서 서열 번호 6~20에서 제공된 변형된 CGL 효소의 발현을 위해 코돈 최적화되는 핵산은 각각 서열 번호 96~110에서 제공되어 있다. 대안으로, 상기 핵산은 진균 (예를 들어, 효모), 곤충 또는 포유 동물에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 이러한 핵산을 함유하는 발현 벡터와 같은 벡터가 추가로 고려된다. 상기 변형된 CGL 효소를 인코딩하는 핵산은 이종 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 변형된 CGL 효소는 벡터 (예를 들어, 유전자 요법 벡터)에 의해 표적 세포에 전달될 수 있다. 이러한 벡터는 재조합 DNA 기술에 의해 변형되어 표적 세포에서 변형된 CGL 인코딩 핵산의 발현을 가능하게 할 수 있다. 이러한 벡터는 비-바이러스성 (예를 들어, 플라스미드) 또는 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 백시니아 바이러스) 기원의 벡터로부터 유래될 수 있다. 비-바이러스 벡터는 세포막을 가로질러 DNA의 진입을 용이하게 하기 위해 제제와 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 비-바이러스 벡터 복합체의 예로는 DNA 및 지질 기반 전달 시스템의 축합을 용이하게 하는 폴리양이온성 제제를 갖는 제형이 포함된다. 지질 기반 전달 시스템의 예로는 핵산의 리포좀 기반 전달이 포함된다.
이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 숙주 세포는 세균 (예를 들어, 이. 콜라이), 진균 세포 (예를 들어, 효모), 곤충 세포 또는 포유 동물 세포일 수 있다.
벡터는 상기 변형된 CGL 효소를 발현하기 위해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 변형된 CGL 효소는 임의의 적합한 방식으로 발현될 수 있다. 상기 변형된 CGL 효소는 단백질이 글라이코실화되도록 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 대안으로, 상기 변형된 CGL 효소는 단백질이 어글라이코실화되도록 (aglycosylated) 숙주 세포에서 발현될 수 있다.
상기 변형된 CGL 효소 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 치료학적 제형이 제공된다. 치료학적 제형은 정맥내로, 진피내로, 동맥내로, 복강내로, 근육내로, 피하로, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 카테터를 통해, 지질 조성물 (예를 들어, 리포좀)로 투여될 수 있다.
시스틴뇨증을 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본래의 영장류 CGL 아미노산 서열 (서열 번호 1~5 참조)에 비해 적어도 하나의 치환을 갖는 단리된 변형된 영장류 CGL 효소 또는 상기 단리된 변형된 영장류 CGL 효소를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 치료학적 유효량의 제형을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 단리된 변형된 영장류 CGL 효소는 서열 번호 6~95 중 어느 하나에 따른 서열을 가질 수 있다. 상기 방법은 상기 대상체의 혈장, 혈청 및/또는 소변에서 시스테인 및/또는 시스틴의 수준을 감소시킬 수 있다.
상기 대상체는 마우스와 같은 임의의 동물일 수 있다. 예를 들어, 상기 대상체는 포유 동물, 설치류, 영장류 또는 사람 환자일 수 있다. 상기 대상체 또는 환자는 상기에서 기재된 조성물로 치료되는 것과 조합하여 L-시스틴/시스테인 제한 식이, 메티오닌 제한 식이 또는 정상 식이로 유지될 수 있다.
상기 대상체는 시스틴뇨증에 대해 이전에 치료를 받았을 수 있으며, 상기 CGL 효소는 시스틴뇨증의 재발을 치료 또는 완화하거나 시스틴뇨증과 관련된 하나 이상의 병태 및/또는 증상을 개선하기 위해 투여된다. 상기 방법은 또한 적어도 제2 요법, 예를 들어, 제2 시스틴뇨 요법, 예를 들어, 식이, 영양 요법 및 충격파 요법의 변형을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 대상체의 요로, 신장 및/또는 방광에서 시스틴 결석의 체적 또는 시스틴 결석의 수를 감소시킬 수 있다. 상기 방법은 상기 대상체의 요로, 신장 및/또는 방광에서 시스틴 결석의 형성을 예방할 수 있다. 상기 방법은 상기 대상체의 소변에서 시스틴 결정의 수를 감소시킬 수 있다. 상기 방법은 상기 대상체의 소변에서 시스틴 결정의 형성을 예방할 수 있다.
이와 같이, 시스틴뇨증을 앓고 있는 환자에서 시스틴 결석의 형성을 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본래의 영장류 CGL 아미노산 서열 (서열 번호 1~5 참조)에 비해 적어도 하나의 치환을 갖는 단리된 변형된 영장류 CGL 효소 또는 상기 단리된 변형된 영장류 CGL 효소를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 치료학적 유효량의 제형을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 단리된 변형된 영장류 CGL 효소는 서열 번호 6~95 중 어느 하나에 따른 서열을 가질 수 있다. 상기 방법은 상기 환자의 신장 및/또는 방광에서 시스틴 결석의 형성을 예방할 수 있다.
변형된 CGL 효소 또는 변형된 CGL 효소를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물은 대상체에서 시스틴뇨증의 치료에 사용하기 위해 제공된다. 시스틴뇨증 환자에 대한 치료학적 적용을 위한 약제의 제조에서 단리 또는 변형된 CGL 효소, 변형된 CGL 효소를 인코딩하는 핵산, 또는 상기 변형된 CGL 효소를 포함하는 조성물의 용도가 제공된다. 상기 변형된 CGL 효소는 본 출원에서 개시된 임의의 변형된 CGL 효소 일 수 있다.
하기가 또한 본 출원에서 제공된다:
1. 본래의 사람 시스타티오닌-γ-리아제 (CGL) 아미노산 서열 (서열 번호 1)에 대해 적어도 다음 치환을 포함하는 단리된 변형된 영장류 CGL 효소로서, 상기 변형된 효소가 시스티나아제 및 시스테이나아제 활성 모두를 가지며, 상기 치환이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소:
(a) 193번 위치에 알라닌, 311번 위치에 글리신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
(b) 200번 위치에 프롤린, 311번 위치에 글리신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
(c) 193번 위치에 알라닌, 200번 위치에 프롤린, 311번 위치에 글리신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
(d) 55번 위치에 글루탐산, 59번 위치에 트레오닌, 91번 위치에 메티오닌, 234번 위치에 라이신, 336번 위치에 아스파르트산 및 339번 위치에 발린;
(e) 55번 위치에 글루탐산, 59번 위치에 트레오닌, 91번 위치에 세린, 234번 위치에 라이신, 336번 위치에 아스파르트산 및 339번 위치에 발린;
(f) 189번 위치에 세린, 193번 위치에 글리신, 311번 위치에 글리신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
(g) 163번 위치에 아르기닌, 311번 위치에 글리신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
(h) 51번 위치에 트립토판, 55번 위치에 글루탐산, 59번 위치에 트레오닌, 336번 위치에 아스파르트산 및 339번 위치에 발린;
(i) 55번 위치에 글루탐산, 193번 위치에 알라닌, 311번 위치에 글리신, 336번 위치에 아스파르트산, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
(j) 200번 위치에 히스티딘, 311번 위치에 글리신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
(k) 311번 위치에 글리신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
(l) 59번 위치에 이소류신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
(m) 91번 위치에 메티오닌 및 339번 위치에 발린; 및
(n) 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린.
2. 양태 1에 있어서, 상기 변형된 CGL 효소가 변형된 폰고 아벨리이 CGL 효소인, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
3. 양태 2에 있어서, 상기 변형된 폰고 아벨리이 CGL 효소가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환을 포함하는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소:
(a) P193A, T311G, E339V 및 V353S;
(b) A200P, T311G, E339V 및 V353S;
(c) P193A, A200P, T311G, E339V 및 V353S;
(d) H55E, V59T, L91M, N234K, T336D 및 E339V;
(e) H55E, V59T, L91S, N234K, T336D 및 E339V;
(f) T189S, P193G, T311G, E339V 및 V353S;
(g) T163R, T311G, E339V 및 V353S;
(h) A51W, H55E, V59T, T336D 및 E339V;
(i) H55E, P193A, T311G, T336D, E339V 및 V353S;
(j) A200H, T311G, E339V 및 V353S;
(k) T311G, E339V 및 V353S;
(l) V59I, E339V 및 V353S;
(m) L91M 및 E339V; 및
(n) E339V 및 V353S.
4. 양태 1에 있어서, 상기 변형된 CGL 효소가 변형된 사람 CGL 효소, 변형된 판 트로글로다이테스 CGL 효소 또는 변형된 판 파니스쿠스 CGL 효소인, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
5. 양태 4에 있어서, 상기 변형된 사람 CGL 효소, 상기 변형된 판 트로글로다이테스 CGL 효소 또는 상기 변형된 판 파니스쿠스 CGL 효소가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환을 포함하는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소:
(a) P193A, T311G, E339V 및 I353S;
(b) A200P, T311G, E339V 및 I353S;
(c) P193A, A200P, T311G, E339V 및 I353S;
(d) H55E, E59T, L91M, N234K, T336D 및 E339V;
(e) H55E, E59T, L91S, N234K, T336D 및 E339V;
(f) T189S, P193G, T311G, E339V 및 I353S;
(g) T163R, T311G, E339V 및 I353S;
(h) A51W, H55E, E59T, T336D 및 E339V;
(i) H55E, P193A, T311G, T336D, E339V 및 I353S;
(j) A200H, T311G, E339V 및 I353S;
(k) T311G, E339V 및 I353S;
(l) E59I, E339V 및 I353S;
(m) L91M 및 E339V; 및
(n) E339V 및 I353S.
6. 양태 1에 있어서, 상기 변형된 CGL 효소가 변형된 마카카 파시쿨라리스 CGL 효소인, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
7. 양태 6에 있어서, 상기 변형된 마카카 파시쿨라리스 CGL 효소가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환을 포함하는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소:
(a) P193A, T311G, E339V 및 I353S;
(b) A200P, T311G, E339V 및 I353S;
(c) P193A, A200P, T311G, E339V 및 I353S;
(d) H55E, E59T, L91M, N234K, T336D 및 E339V;
(e) H55E, E59T, L91S, N234K, T336D 및 E339V;
(f) T189S, P193G, T311G, E339V 및 I353S;
(g) V163R, T311G, E339V 및 I353S;
(h) A51W, H55E, E59T, T336D 및 E339V;
(i) H55E, P193A, T311G, T336D, E339V 및 I353S;
(j) A200H, T311G, E339V 및 I353S;
(k) T311G, E339V 및 I353S;
(l) E59I, E339V 및 I353S;
(m) L91M 및 E339V; 및
(n) E339V 및 I353S.
8. 양태 1 내지 7 중 어느 한 양태에 있어서, 이종 펩타이드 분절 또는 다당류를 추가로 포함하는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
9. 양태 8에 있어서, 상기 이종 펩타이드 분절이 XTEN 펩타이드, IgG Fc, 알부민 또는 알부민 결합 펩타이드인, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
10. 양태 8에 있어서, 상기 다당류가 폴리시알산 중합체를 포함하는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
11. 양태 1 내지 10 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 효소가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 커플링되어 있는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
12. 양태 11에 있어서, 상기 효소가 하나 이상의 라이신 잔기를 통해 상기 PEG에 커플링되어 있는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
13. 양태 1 내지 7 중 어느 한 양태의 효소를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
14. 양태 13에 있어서, 상기 핵산이 세균, 진균, 곤충 또는 포유 동물에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는, 핵산.
15. 양태 14에 있어서, 상기 세균이 이. 콜라이인, 핵산.
16. 양태 15에 있어서, 상기 핵산이 서열 번호 81~95 중 하나에 따른 서열을 포함하는, 핵산.
17. 양태 13 내지 16 중 어느 한 양태의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
18. 양태 13 내지 16 중 어느 한 양태의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
19. 양태 18에 있어서, 상기 숙주 세포가 세균 세포, 진균 세포, 곤충 세포 또는 포유 동물 세포인, 숙주 세포.
20. 양태 1 내지 12 중 어느 한 양태의 효소 또는 양태 13 내지 16 중 어느 한 양태의 핵산을 약제학적으로 허용되는 담체 중에 포함하는 치료학적 제형.
21. 치료학적 유효량의 양태 20의 제형을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 시스틴뇨증을 앓거나 발병할 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법.
22. 양태 21에 있어서, 상기 대상체가 L-시스틴 및/또는 L-시스테인 제한 식이로 유지되는, 방법.
23. 양태 21에 있어서, 상기 대상체가 메티오닌 제한 식이로 유지되는, 방법.
24. 양태 21에 있어서, 상기 대상체가 정상 식이로 유지되는, 방법.
25. 양태 21에 있어서, 상기 대상체가 사람 환자인, 방법.
26. 양태 21에 있어서, 상기 제형이 정맥내로, 동맥내로, 복강내로, 근육내로, 혈관내로, 피하로, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해 또는 카테터를 통해 투여되는, 방법.
27. 양태 21에 있어서, 상기 대상체가 이전에 시스틴뇨증에 대해 치료를 받았으며, 상기 효소가 시스틴뇨증의 재발을 예방하기 위해 투여되는, 방법.
28. 양태 21에 있어서, 적어도 제2 시스틴뇨증 요법을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
29. 양태 28에 있어서, 상기 제2 시스틴뇨증 요법이 수술 요법 또는 충격파 요법인, 방법.
30. 양태 28에 있어서, 상기 제2 시스틴뇨증 요법이 바이카보네이트, 트리스-하이드록시메틸렌-아미노메탄 (트로메타민-E), 아세틸시스테인, D-페니실아민, α-머캅토프로피오닐글리신 및 캅토프릴로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제 또는 약물을 포함하는, 방법.
31. 양태 21에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체의 혈장 및/또는 혈청에서 시스테인 및/또는 시스틴의 수준을 감소시키는, 방법.
32. 양태 21에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체의 소변에서 시스테인 및/또는 시스틴의 수준을 감소시키는, 방법.
33. 양태 21에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체의 요로에서 시스틴 결석의 형성을 예방하는, 방법.
34. 양태 21에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체의 신장에서 시스틴 결석의 형성을 예방하는, 방법.
35. 양태 1에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체의 신장에서 시스틴 결석의 수를 감소시키는, 방법.
36. 시스틴뇨증 환자에 대한 치료학적 적용을 위한 약제를 제조하기 위한, 양태 1 내지 12 중 어느 한 양태의 단리 또는 변형된 CGL 효소, 또는 상기 변형된 CGL 효소를 포함하는 조성물의 용도.
본 출원에서 사용되는 "인코딩하다" 또는 "인코딩하는"이라는 용어는 핵산과 관련하여 통상의 기술자가 본 발명을 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해 사용되지만; 이러한 용어는 각각 "포함하다" 또는 "포함하는"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
특정 구성 요소와 관련하여, 본 출원에서 사용되는 "본질적으로 없는"은, 특정 구성 요소가 조성물로 의도적으로 제형화되지 않았고/않았거나 오염물로서만 또는 미량으로만 존재하는 것을 의미하는 것으로 본 출원에서 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 초래된 특정 구성 요소의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 특정 구성 요소의 양이 표준 분석 방법으로 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
본 출원의 명세서에서 사용되는 "한" 또는 "하나"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본 출원의 청구항(들)에서 사용되는 "한" 또는 "하나"라는 단어는, "~을 포함하는"이라는 단어와 함께 사용될 때, 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 명백하게 대안만을 지칭하는 것으로 명시되지 않거나, 본 개시 내용이 대안만 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 뒷받침하고 있다고 하더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는다면, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본 출원에서 사용되는 "또 다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "약"이라는 용어는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되며, 사용되는 문맥에 따라 어느 정도까지 달라질 것이다. 일반적으로, 약은 기준 값의 +/- 10%인 값의 범위를 포함한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 기재된 방법, 화합물 및 조성물을 추가로 예시하기 위해 포함된다.
도 1 - 서열 번호 1~5의 서열 정렬. 별표는 다양한 변형된 CGL 효소에서 조작된 위치를 나타낸다.
시스테인은 시스타티오닌-β-신타아제 (cystathionine-β-synthase: CBS) 및 시스타티오닌-γ-리아제 (CGL) 효소를 포함하는 황 전환 경로를 통해 필수 아미노산 L-메티오닌으로부터 유래된 호모시스테인으로부터 합성될 수 있으므로 비필수 아미노산으로 간주된다. 따라서, L-시스틴/시스테인의 고갈은 온전한 황 전환 경로를 갖는 정상 조직에 상대적으로 무독성이 될 것으로 예상된다. 보다 높은 k cat/K M으로 L-시스틴/시스테인을 분해하여 잠재적으로 보다 낮은 투약량의 사용을 가능하게 하는 조작된 치료학적 효소가 제공된다. 시스틴뇨증을 치료하기 위해 상기 효소를 사용하는 방법도 또한 제공된다.
I. 정의
본 출원에서 사용되는 "효소" 및 "단백질" 및 "폴리펩타이드"라는 용어는 펩타이드 결합을 통해 연결된 아미노산을 포함하는 화합물을 지칭하며, 상호 교환적으로 사용된다.
본 출원에서 사용되는 "융합 단백질"이라는 용어는 비-본래의 방식으로 작동 가능하게 연결된 단백질 또는 단백질 단편을 함유하는 키메라 단백질을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "반감기" (1/2 수명)라는 용어는 시험관내에서 (즉, 세포 배양 배지에서 측정될 때) 또는 생체내에서 (즉, 혈청에서 측정될 때), 예를 들어, 포유 동물에서 주사 후, 절반으로 떨어지는 폴리펩타이드의 농도에 요구되는 시간을 지칭한다. "반감기"를 측정하는 방법은 단백질의 물리적 양이 시간의 함수로서 측정되도록 ELISA 형식에서 사용되는 CGL 또는 PEG에 대해 특이적인 항체의 사용을 포함한다. 반감기를 측정하는 다른 방법은, 3-메틸-2-벤조티아졸리논 하이드라존 (MBTH) 제제에 의한 유도체화 후 반응 생성물인 피루베이트의 검출과 같은, L-시스틴/시스테인의 전환으로 인해 발생하는 임의의 기질의 생성을 검출하는 임의의 검정에 의해 효소 약물의 촉매 활성을 시간 함수로서 측정하는 것을 포함한다.
"작동 가능한 조합으로", "작동 가능한 순서로" 및 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는, 이렇게 기재된 성분이 이의 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 하는 관계에 있는 연결, 예를 들어, 핵산 분자가 주어진 유전자의 전사 및/또는 목적하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있도록 하는 방식으로 핵산 서열의 연결, 또는 융합 단백질이 생산되도록 하는 방식으로 아미노산 서열의 연결을 지칭한다.
"링커"라는 용어는 2개의 상이한 분자를 작동 가능하게 연결하기 위해 분자 브릿지로서의 역할을 하는 화합물 또는 모이어티 (moiety)를 지칭하는 것을 의미하는데, 여기서, 상기 링커의 한 부분은 제1 분자에 작동 가능하게 연결되며, 상기 링커의 또 다른 부분은 제2 분자에 작동 가능하게 연결된다.
"페길화된 (PEGylated)"이라는 용어는 고도의 생체 적합성 및 변형의 용이성을 고려해 볼 때 약물 담체로서 널리 사용되는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과의 콘쥬게이션을 지칭한다. PEG는 화학적 방법을 통해 PEG 쇄의 말단에서 하이드록시기를 통해 활성제에 커플링 (예를 들어, 공유 연결)될 수 있지만, PEG 자체는 분자 당 최대 2개의 활성제로 한정된다. 다른 접근법에서, PEG와 아미노산의 공중합체는 PEG의 생체 적합성을 유지할 수는 있지만 분자 당 수많은 부착점의 추가 이점 (따라서, 보다 큰 약물 부하를 제공함)을 갖고 다양한 적용에 맞게 합성으로 설계될 수 있는 신규한 생체 물질로서 탐색되었다.
"유전자"라는 용어는 폴리펩타이드 또는 그의 전구체의 생산에 필요한 조절 및 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열을 지칭한다. 상기 폴리펩타이드는 전장 코딩 서열에 의해 또는 목적하는 효소 활성이 유지되도록 하는 당해 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 인코딩될 수 있다.
"본래의"이라는 용어는 자연 발생 공급원으로부터 단리될 때 유전자, 유전자 산물 또는 당해 유전자 또는 유전자 산물의 특징의 대표적인 형태 또는 야생형 형태를 지칭한다. 대조적으로, "변형된", "변이체" 또는 "돌연변이체"라는 용어는 본래의 유전자 또는 유전자 산물과 비교될 때 서열 및 기능적 특성 (즉, 변경된 특징)의 변형을 나타내는 유전자 또는 유전자 산물을 지칭하며, 여기서, 상기 변형된 유전자 또는 유전자 산물은 자연적으로 존재하거나 발생하지 않고 유전적으로 조작된다.
"벡터"라는 용어는 핵산 서열이 복제될 수 있는 세포 내로 도입하기 위해 핵산 서열이 삽입될 수 있는 담체 핵산 분자를 지칭하는데 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있는데, 이는 서열이 벡터를 도입하는 세포에 대해 외래적이거나, 서열이 세포내 서열과 상동이지만 서열을 통상적으로 발견할 수 없는 숙주 세포 핵산 내의 위치에 있다는 것을 의미한다. 벡터로는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체 (예를 들어, YAC)가 포함된다. 당해 분야의 통상의 기술자는 표준 재조합 기술 (예를 들어, 둘 다 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Maniatis et al., 1988] 및 [Ausubel et al., 1994] 참조)을 통해 벡터를 작제할 준비가 잘 되어 있을 것이다.
"발현 벡터"라는 용어는 전사될 수 있는 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 유형의 유전자 작제물을 지칭한다. 일부 경우에서, RNA 분자는 이어서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 번역된다. 다른 사례에서, 이러한 서열은, 예를 들어, 안티센스 분자 또는 리보자임의 생산에서 번역되지 않는다. 발현 벡터는 특정 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열을 지칭하는 다양한 "조절 서열"을 함유할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절 서열에 추가하여, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 또한 제공하는 핵산 서열을 함유할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "치료학적 유효량"이라는 용어는 치료학적 효과를 달성하는 방법, 즉, 환자의 순환에서 L-시스틴/시스테인을 약 0~15 μmol/L의 수준으로 고갈시키는 방법에 사용되는 치료학적 조성물 (즉, 변형된 CGL 효소 또는 이러한 효소를 인코딩하는 핵산)의 양을 지칭한다. 본 출원 전체에 걸쳐 사용되는 "치료학적 이득" 또는 "치료학적으로 유효한"이라는 용어는 이러한 병태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 복지를 촉진하거나 증진시키는 모든 것을 지칭한다. 이것은 질환의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도의 감소를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 시스틴뇨증의 치료는 소변 중 시스틴의 농도 감소, 시스틴 결석의 크기 감소, 시스틴 결석의 제거 또는 시스틴 결석의 형성 예방을 포함할 수 있다. 치료학적 조성물의 투여를 위한 투약량 범위는 시스틴뇨증의 증상이 감소되는 목적하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 것들이다. 예를 들어, 치료학적 조성물의 치료학적 유효량은 생리학적으로 허용되는 조성물로 투여될 때 mL 당 약 0.001 내지 약 100 유닛 (U), 바람직하게는 mL 당 약 0.1 U 초과, 보다 바람직하게는 1 U 초과의 변형된 CGL 효소의 혈관내 (혈장) 농도를 달성하기에 충분한 양일 수 있다. 대표적인 투약량은 체중을 기준으로 투여될 수 있으며, 약 1~100 U/킬로그램 (kg)/일, 바람직하게는 약 2~25 U/kg/일, 보다 바람직하게는 약 2~8 U/kg/일의 범위이다. 예시적인 양은 5 U/kg/일 또는 35 U/kg/주일 수 있다. 정상적인 사람 혈청 L-시스틴/시스테인 수준은 약 200 μM이다. 시스틴뇨증 환자에서, 혈청 L-시스틴/시스테인 수준은 신장 시스틴 재흡수의 부족으로 인해 약 절반으로 감소하며, 투약량은 약 0~10 μM의 L-시스틴/시스테인의 혈청 수준을 수득하기 위해 투여될 것이다. 이러한 투약량은 과다 점성 증후군, 폐 부종, 울혈성 심부전 등과 같은 불리한 부작용을 유발할 정도로 많아서는 안된다. 일반적으로, 상기 투약량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질환 정도에 따라 달라질 것이며, 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 상기 투약량은 임의의 합병증의 경우에 주치의에 의해 조정될 수 있다. 상기 투약량은 대상체의 혈청 중 L-시스틴/시스테인 함량이 약 12 내지 24 시간 내에 적어도 50%까지, 적어도 60%까지 및 적어도 70%까지 감소되도록 해야 한다. 상기 투약량은 대상체의 혈청 중 L-시스틴/시스테인 함량이 6 시간 내에 적어도 50% 내지 70% 감소되도록 할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "K M"이라는 용어는 효소에 대한 미카엘리스-멘텐 상수를 지칭하며, 주어진 효소가 효소 촉매 반응에서 최대 속도의 1/2을 초래하는 특정 기질의 농도로서 정의된다. 본 출원에서 사용되는 "k cat"이라는 용어는 각 효소 부위가 단위 시간 당 생성물로 전환되고 상기 효소가 최대 효율로 작용하는 기질 분자의 턴오버 수 또는 수를 지칭한다. 본 출원에서 사용되는 "k cat/K M"이라는 용어는 효소가 기질을 생성물로 얼마나 효율적으로 전환시키는지의 척도인 특이성 상수 (specificity constant)이다.
"시스타티오닌-γ-리아제" (CGL 또는 시스타티오나아제)라는 용어는 시스타티오닌의 시스테인으로의 γ-제거를 촉매하는 임의의 효소를 지칭한다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 또한 시스타티오닌-γ-리아제 (시스타티오닌-감마-리아제)의 영장류 형태, 특히, 시스타티오닌-γ-리아제의 사람 형태를 포함한다.
"치료" 및 "치료하는"은 대상체에 대한 치료제의 투여 또는 적용, 또는 질환 또는 건강 관련 병태의 치료학적 이득을 수득하기 위한 대상체에 대한 절차 또는 양상의 수행을 지칭한다. 예를 들어, 치료는 혈청 L-시스틴/시스테인 수준을 감소시키기 위한 치료학적 유효량의 변형된 CGL 효소의 투여를 포함한다.
"대상체" 및 "환자"는 영장류, 포유 동물 및 척추 동물과 같은 사람 또는 비-사람을 지칭한다.
I. 시스타티오닌-γ-리아제
리아제는 종종 새로운 이중 결합 또는 새로운 고리 구조를 형성하는 다양한 화학 결합의 절단을 촉매하는 효소이다. 예를 들어, 다음 반응을 촉매하는 효소는 리아제일 것이다: ATP→cAMP+PPi. 특정 리아제는 하나의 기질만을 필요로 하는데, 예를 들어, 시스타티오닌-γ-리아제는 L-시스타티오닌을 L-시스스테인, 알파-케토부티레이트 및 암모니아로 전환한다. 신타아제로서 공지된 다른 리아제는 2개의 기질을 필요로 하는데, 예를 들어, 시스타티오닌-β-신타아제는 세린 및 호모시스테인을 축합하여 시스타티오닌을 형성한다.
수많은 피리옥살-5'-포스페이트 (PLP) 의존적 효소는 시스테인, 호모시스테인 및 메티오닌의 대사에 관여하며, 이러한 효소는 시스테인/메티오닌 (Cys/Met) 대사 PLP 의존적 효소로서 명명된 계통적 관련 계열을 형성한다. 이러한 효소는 약 400개의 아미노산의 단백질이며, PLP 기는 폴리펩타이드의 중심 위치에 위치한 라이신 잔기와 내부 알디민을 형성한다. 이러한 계열의 구성원으로는 시스타티오닌-γ-리아제 (CGL), 시스타티오닌-γ-신타아제 (CGS), 시스타티오닌-β-리아제 (CBL), 메티오닌-γ-리아제 (MGL) 및 O-아세틸호모세린 (OAH)/O-아세틸-세린 (OAS) 설프하이드릴라아제(OSHS)가 포함된다. 모든 PLP 의존적 효소에 공통적인 것은 미카엘리스 복합체의 형성에 이어 내부 알디민의 형성을 초래하는 기질의 알디민 전환 (transaldimination)이다. 반응의 추가 과정은 특정 효소의 기질 특이성에 의해 결정된다.
예를 들어, 본 발명자들은 기질 특이성을 변화시키기 위해 특정 돌연변이를 PLP 의존적 리아제 계열 구성원인 시스타티오닌-γ-리아제에 도입하였다. 이러한 방식으로, 변이체는 L-시스틴 및 L-시스테인 모두를 분해하는 증진된 능력으로 생산되었다. 신규한 L-시스틴/시스테인 분해 활성을 생성하기 위한 다른 PLP 의존적 효소의 변형도 또한 고려될 수 있다.
CGL은 포유 동물 황 전환 경로에서 마지막 단계를 촉매하는 4량체이다 (문헌 [Rao et al., 1990]). CGL은 L-시스타티오닌의 L-시스테인, 알파-케토부티레이트 및 암모니아로의 전환을 촉매한다. 피리독살 포스페이트는 이러한 효소의 보결 분자단이다. 단백질 공학은 L-시스테인 및 L-시스틴의 분해에 대해 약한 활성만을 갖는 CGL을 L-시스테인 및 L-시스틴을 고속으로 분해할 수 있는 효소로 전환시키는데 사용되었다 (그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 US 9,481,877).
II. 시스테인 (시스테이나아제) 조작
비-사람 단백질 치료제의 사용에 의해 임상적으로 관찰된 면역원성의 바람직하지 않은 효과로 인해, 치료학적 관련 L-시스틴 및 L-시스테인 분해 활성을 사람 효소내로 조작하는 것 (즉, L-시스틴 및 L-시스테인 모두에 대해 높은 k cat 및 낮은 K M 값을 나타내고 또한 양호한 이러한 2개의 기질에 대해 유리한 특이성을 나타내는 L-시스티나아제 (시스테이나아제) 효소를 조작하는 것)이 바람직하다. 사람은 시스타티오닌-γ-리아제 (hCGL)로 호칭되는 효소를 가지고 있으며, 이의 기능은 포유 동물의 황 전환 경로 (문헌 [Rao et al., 1990])에서 마지막 단계, 즉, L-시스타티오닌의 L-시스테인, α-케토부티레이트 및 암모니아로의 전환을 촉매하는 것이다. 사람 CGL은 또한 L-시스테인 및 이의 이황화물 형태인 L-시스틴을 약하게 분해하여 이를 조작을 위한 이상적인 후보 물질로 만들 수 있다. 구조적으로 및 계통 발생적으로 유도된 돌연변이 유발을 이용하여, hCGL 변이체는 L-시스테인 및 L-시스틴 모두를 효율적으로 가수분해하도록 조작되었다.
비변형된 CGL 효소에 필적하는 적어도 하나의 기능적 활성을 나타내는 변형된 CGL 효소가 기재된다. 변형된 CGL 효소는, 예를 들어, 비변형된 CGL 효소와 비교하여 시스티나아제 (시스테이나아제) 효소 활성과 같은 추가의 이점을 갖는 단백질을 포함한다. 비변형된 단백질 또는 폴리펩티드는 사람 시스타티오닌-γ-리아제와 같은 본래의 시스타티오닌-γ-리아제일 수 있다.
활성의 측정은, 특히, 단백질의 활성과 관련하여, 당해 분야의 통상의 기술자에게 익숙한 검정을 사용하여 달성될 수 있으며, 비교 목적을 위해, 예를 들어, 변형 또는 비변형된 효소의 본래의 및/또는 재조합 버전의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 야생형 사람 CGL은 L-시스테인을 피루베이트, 암모니아 및 H2S로 서서히 분해하고, L-시스틴을 피루베이트, 암모니아 및 티오시스테인으로 전환시킨다 (각각 k cat/K M 약 0.2 s-1 mM-1 및 약 0.8 s-1 mM-1). 티오시스테인은 추가로 L-시스테인 및 H2S로 비효소적으로 분해된다. 따라서, 상기 L-시스틴/시스테인 분해 활성은, 3-메틸-2-벤조티아졸리논 하이드라존 (MBTH) 제제에 의한 유도체화 후 반응 생성물인 피루베이트의 검출과 같은, L-시스틴 및/또는 L-시스테인의 분해로 인해 발생하는 임의의 기질의 생성을 검출하는 임의의 검정에 의해 결정될 수 있다 (문헌 [Takakura et al., 2004]).
변형된 CGL 효소는 L-시스틴/시스테인 분해 활성의 증가에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 비변형된 폴리펩타이드의 기질 인식 부위가 확인될 수 있다. 이러한 확인은 구조 분석 또는 상동성 분석을 기반으로 할 수 있다. 이러한 기질 인식 부위의 변형을 수반하는 돌연변이체의 집단이 생성될 수 있다. 증가된 L-시스틴/시스테인 분해 활성을 갖는 돌연변이체는 돌연변이체 집단으로부터 선택될 수 있다. 목적하는 돌연변이체의 선택은 L-시스틴/시스테인 분해로부터 생성된 부산물 또는 생성물을 검출하는 방법을 포함할 수 있다.
변형된 CGL 효소는 아미노산의 결실 및/또는 치환을 보유할 수 있으며; 따라서, 결실을 갖는 효소, 치환을 갖는 효소 및 결실 및 치환을 갖는 효소는 변형된 CGL 효소이다. 예를 들어, 이러한 변형된 CGL 효소는 삽입물 또는 부가된 아미노산, 예를 들어, 링커를 갖는 단백질 또는 융합 단백질을 추가로 포함할 수 있다. "변형된 결실된 CGL 효소"는 본래의 효소의 하나 이상의 잔기가 결여되어 있지만, 본래의 효소의 특이성 및/또는 활성을 보유할 수 있다. "변형된 결실된 CGL 효소"는 또한 면역원성 또는 항원성을 감소시킬 수 있다. 변형된 결실된 CGL 효소의 예로는 적어도 하나의 항원성 영역, 즉, 특정 유기체, 예를 들어, 변형된 CGL 효소를 투여받을 수 있는 유기체의 유형에서 항원성인 것으로 결정된 효소의 영역으로부터 결실된 아미노산 잔기를 갖는 효소가 있다.
치환 또는 대체 CGL 효소 변이체는 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 또 다른 것에 대한 하나의 아미노산의 교환을 포함할 수 있으며, 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성, 특히, 이의 이펙터 기능 및/또는 생체 이용률을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적이거나 아닐 수 있으며, 즉, 하나의 아미노산은 유사한 크기 및 전하의 것으로 대체된다. 보존적 치환은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 알라닌에서 세린으로의 변경; 아르기닌에서 라이신으로의 변경; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로의 변경; 아스파르테이트에서 글루타메이트로의 변경; 시스테인에서 세린으로의 변경; 글루타민에서 아스파라긴으로의 변경; 글루타메이트에서 아스파르테이트로의 변경; 글리신에서 프롤린으로의 변경; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로의 변경; 이소류신에서 류신 또는 발린으로의 변경; 류신에서 발린 또는 이소류신으로의 변경; 라이신에서 아르기닌으로의 변경; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로의 변경; 페닐알라닌에서 타이로신, 류신 또는 메티오닌으로의 변경; 세린에서 트레오닌으로의 변경; 트레오닌에서 세린으로의 변경; 트립토판에서 타이로신으로의 변경; 타이로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로의 변경; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 변경을 포함한다.
"생물학적인 기능적 등가물"이라는 용어는 당해 분야에서 널리 이해되며, 본 출원에서 추가로 정의된다. 따라서, 서열 번호 1과 약 90% 이상의 서열 동일성, 또는 본 출원에서 개시된 변형된 CGL 효소의 아미노산 또는 이의 보존적 치환과 동일한 아미노산의 심지어 약 91% 내지 약 99% (92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 포함)를 갖는 CGL 효소 서열이 포함되며, 단, 상기 효소의 생물학적 활성은 측정 가능한 생물학적 활성 파라미터 (예를 들어, L-시스틴 및/또는 L-시스테인의 피루베이트로의 전환)가 본 출원에서 개시된 변형된 CGL 효소의 약 20%, 약 15%, 약 10% 또는 약 5% 이내로 되도록 유지된다. 변형된 CGL 효소는 이의 비변형된 대응물과 생물학적인 기능적 등가물일 수 있다.
아미노산 및 핵산 서열은 추가의 N-말단 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열과 같은 추가의 잔기를 포함할 수 있지만, 여전히 본질적으로, 단백질 발현이 관련되는 생물학적 단백질 활성의 유지를 비롯하여, 서열이 상기에서 제시된 기준을 충족하는 한, 본 출원에서 개시된 서열 중 하나에 제시된 바와 같다. 말단 서열의 부가는, 특히, 예를 들어, 코딩 영역의 5' 또는 3' 부분 중 어느 하나를 플랭킹 (flanking)하는 다양한 비-코딩 서열을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용되거나, 다양한 내부 서열, 즉, 유전자 내에서 발생하는 것으로 공지되어 있는 인트론을 포함할 수 있다.
III. 요법을 위한 효소적 L-시스틴/시스테인 분해
시스틴뇨증은, 시스틴 (아미노산 시스테인의 이황화물 형태)의 비정상적 배출 및 시스틴의 낮은 용해도로 인한 요로내 시스틴 결정/결석의 형성을 초래하는, 신장 근위 세뇨관의 시스틴 및 이염기성 아미노산 수송체를 인코딩하는 SLC3A1 및 SLC7A9 유전자의 돌연변이에 기인하는 유전성 장애이다.
Slc7a9 녹아웃 마우스, Slc3a1 녹아웃 마우스, D140G Slc3a1 돌연변이체 마우스 및 E383K Slc3a1 돌연변이체 마우스를 비롯한 시스틴뇨증의 여러 마우스 모델이 이용 가능하다 (각각 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Feliubadalo et al., 2003]; [Ercolani et al., 2010]; [Peters et al., 2003]; [Livrozet et al., 2014]). 129S2/SvPasCrl로부터의 Slc3a1 게놈 DNA의 서열 분석은 129S2/SvPasCrl 마우스의 엑손 7에서 동형 접합 돌연변이를 나타냈다. A1232G 점 돌연변이는 고도로 보존된 서열에서의 미스센스 돌연변이 (c.1232G>A)이다. A1232G 미스센스 돌연변이의 결과로서, 383번 위치의 글루타민은 라이신 (E383K)으로 치환된다. 이러한 치환은 rBAT의 세포외 부분에 있으며, 129S2/SvPasCrl 마우스에서 rBAT 발현의 손실과 시스틴뇨증의 원인이 된다 (문헌 [Livrozet et al., 2014]). 383번 위치의 글루타민은 다양한 종들 사이에서 고도로 보존된다.
시스틴뇨증 환자는 삶의 질 저하, 시스틴 결석 형성의 평생 위험, 신장 기능의 손상을 가지며, 종종 반복적 수술 개입을 필요로 한다. 결손 신장 수송체가 신장 여과 동안 시스틴을 재흡수할 수 없는 유전성 장애인 시스틴뇨증을 앓고 있는 환자에게 이용 가능한 치료제는 거의 없다. 아미노산 L-시스테인의 이황화물 형태인 시스틴은 매우 불용성이며, 시스틴뇨증 환자의 요로에서 고농도에 도달하여 시스틴 결정 및 결석의 형성을 초래한다. 순환 시스틴 수준을 감소시키는 기존 요법은 요로 결석 형성을 부분적으로 예방하지만, 이의 용도를 제한하는 상당한 역 효과를 갖는다.
시스틴뇨증에 대한 기존 치유 요법은 없으며, 시스틴 용해도를 증가시키고 소변 시스틴 농도를 저하시키는 치료법이 지향된다. 과다 이뇨가 일반적인 치료이지만, 이것은 >4 리터의 물의 일일 소비와 >3 리터의 소변 부피를 필요로 하여 달성하고 유지하기가 어렵다. 작은 티올 분자와 같은 기타 약물 치료는 시스틴과 반응함으로써 기능하므로, 시스틴 보다는 더 가용성이지만 심각한 독성, 예를 들어, 백혈구 감소증, 발진, 열병, 단백뇨 및 신 증후군을 가져 이의 용도를 제한하는 혼합된 이황화물을 형성한다.
본 발명은 시스틴뇨증과 같은 질환을 치료하기 위해 L-시스틴/시스테인을 분해하는 조작된 치료학적 효소를 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 순환에서 시스틴을 제거하며, 이는 시스틴뇨증 환자에서 신장 및 요로 시스틴 결석 형성의 발병률을 임상적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 본 출원에서 기재된 방법은 현재의 시스틴뇨증 약물과 관련된 부작용 없이 검출 수준 이하로 순환 시스틴을 감소시킬 수 있다.
시스테인은 시스타티오닌-β-신타아제 (CBS) 및 시스타티오닌-γ-리아제 (CGL) 효소를 포함하는 황 전환 경로를 통해 필수 아미노산 L-메티오닌으로부터 유래된 호모시스테인으로부터 합성될 수 있으므로 비필수 아미노산으로 간주된다. 따라서, 시스테인의 고갈은 온전한 황 전환 경로를 갖는 정상 조직에 상대적으로 무독성이 될 것으로 예상된다.
상기 폴리펩타이드는 L-시스틴 및/또는 L-시스테인을 고갈시키는 신규한 효소에 의해 시스틴뇨증과 같은 질환의 치료에 사용될 수 있다. L-시스틴/시스테인 분해 활성을 갖는 변형된 CGL을 사용하는 치료 방법이 개시된다. 증가된 치료학적 효능을 위한 L-시스틴/시스테인 분해 활성을 갖는 신규한 효소가 제공된다.
시스틴뇨증을 치료하기 위한 L-시스틴/시스테인 분해 활성을 갖는 변형된 CGL 효소가 제공된다. 변형된 폴리펩타이드는 사람 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있으므로, 사람 환자에게 투여될 때 불리한 면역학적 반응을 예방하고, 반복 투여를 허용하고, 치료학적 효능을 증가시킬 수 있다.
한 예로서, PEG-hCGL-TV는 96 시간에 걸쳐 혈청 시스틴 수준 (> 95%)과 48 시간에 걸쳐 시스테인 수준 (80%)을 급격하게 감소시킬 수 있다. 이것을 측정하기 위해, 6~7 주령의 수컷 FVB/N 마우스 (JAX 001800)에게 50 mg/kg의 PEG-hCGL-TV를 복강내 (i.p.) 주사하고, 혈액 및 혈청 수집을 위해 0, 1, 2, 4 및 6 일차 (그룹 당 n = 5)에 희생시켰다. 혈청 샘플을 10 피코몰 중수소화 시스틴 및 시스테인의 내부 표준 혼합물과 혼합하고, 3 kDa 컷오프의 NANOSEP® OMEGA™ 원심 분리 장치 (Pall Life Biosciences)를 사용하여 한외 여과하였다 (문헌 [Tiziani et al., 2008]; [Tiziani et al., 2013]). 역상 BEH C18, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm 컬럼 (THERMO SCIENTIFIC™ ACCELA® 1250 UPLC, Waters Corporation, USA)을 사용하여 크로마토그래프를 여과된 극성 분획에 대해 수행하고, 전기 분무 이온화가 커플링된 EXACTIVE™ Plus ORBITRAP™ 질량 분광계 (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)에 도입하였다. 데이터는 기기에 제공된 XCALIBUR™ 소프트웨어에 의해 50 내지 700 m/z 질량 범위에서 중심 MS 방식으로 획득되었다.
또한, PEG-hCGL-TV는 약 23 시간의 흡수 T1/2 및 40 ± 7 시간의 제거 T1/2을 나타냈다. 이것을 측정하기 위해, 적절한 혈청 샘플을 항-hCGL 항체 (래빗 항-CTH Sigma # C8248)로 탐색한 후 항-래빗 IgG-플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) (Santa Cruz Biotechnology # sc-2012)를 첨가하고 TYPHOON™ 스캐너 (GE Healthcare)로 488 nm에서 여기에 의해 가시화하는 도트 블롯 밀도 측정 기법을 사용하였다. ImageJ 소프트웨어 (문헌 [Schneider et al., 2012])를 사용하여, 스캐닝된 도트 블롯 상의 샘플의 밀도 측정 값을 동일한 블롯 내에서 PEG-hCGL-TV의 공지된 양의 적정 값과 비교하여 표준 곡선을 제작하고 상대적 혈청 PEG-hCGL-TV 수준을 계산하였다. 이러한 데이터를 혈관외 투여 모델에 피팅 (fitting)하였다 (문헌 [Foye et al., 2007]).
고갈은 포유 동물의 순환의 경우에 생체내에서, 조직 배양 또는 다른 생물학적 배지에서의 L-시스틴 및/또는 L-시스테인 고갈이 바람직한 경우에 시험관내에서, 및 생체액, 세포 또는 조직이 체외에서 조작된 후 환자 포유 동물의 신체로 되돌아 가는 경우에 생체외 절차에서 수행될 수 있다. 순환, 배양 배지, 생체액 또는 세포로부터의 L-시스틴 및/또는 L-시스테인의 고갈은, 처리되는 물질에 접근 가능한 L-시스틴 및/또는 L-시스테인의 양을 감소시키도록 수행되므로, 접촉되는 물질 중 주위 L-시스틴 및/또는 L-시스테인을 분해하도록 L-시스틴- 및/또는 L-시스테인 분해 조건하에 고갈되는 물질을 L-시스틴 및/또는 L-시스테인 분해량의 조작된 효소와 접촉시키는 단계를 포함한다.
L-시스틴 및/또는 L-시스테인 분해 효율은 적용에 따라 광범위하게 변할 수 있으며, 전형적으로는 물질에 존재하는 L-시스틴 및/또는 L-시스테인의 양, 목적하는 고갈률 및 시스티나아제/시스테인나아제 노출에 대한 물질의 내성에 좌우된다. 물질 중의 L-시스틴 및/또는 L-시스테인 수준, 및 따라서 상기 물질로부터의 L-시스틴 및/또는 L-시스테인 고갈률은 당해 분야에 널리 공지된 다양한 화학적 및 생화학적 방법에 의해 용이하게 모니터링될 수 있다. 예시적인 L-시스틴 및/또는 L-시스테인 분해량은 본 출원에서 추가로 기재되며, 예시적인 L-시스틴 및/또는 L-시스테인 분해량은 본 출원에서 추가로 기재되며, 처리되는 물질의 밀리리터 (mL) 당 조작된 시스티나아제/시스테이나아제 0.001 내지 100 유닛 (U), 바람직하게는 약 0.01 내지 10 U, 보다 바람직하게는 조작된 시스티나아제/시스테이나아제 약 0.1 내지 5 U일 수 있다.
L-시스틴 및/또는 L-시스테인 분해 조건은 생물학적 활성이 CGL 효소와 상용 가능한 완충액 및 온도 조건이며, 효소와 상용 가능한 적당한 온도, 염 및 pH 조건, 예를 들어, 생리학적 조건을 포함한다. 예시적인 조건은 약 4~40℃, 약 0.05 내지 0.2 M NaCl에 상응하는 이온 강도 및 약 5 내지 9의 pH를 포함하면서, 생리학적 조건이 포함된다.
생체내 접촉은 정맥내 또는 복강내 주사에 의해 환자에게 변형된 CGL 효소를 포함하는 치료학적 유효량의 생리학적으로 허용되는 조성물을 투여하여 환자내에 존재하는 순환 L-시스틴 및/또는 L-시스테인을 고갈시킴으로써 달성된다.
상기 변형된 CGL 효소는 주사에 의해 또는 시간 경과에 따른 점진적 주입에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 상기 변형된 CGL 효소는 정맥내로, 복강내로, 근육내로, 피하로 투여될 수 있거나, L-시스틴/시스테인을 위한 잠재적인 바이오센서를 함유할 수 있는 카테터에 연결된 펌프에 의해 투여될 수 있다. 시스틴 뇨증의 경우, CGL 효소를 피하로 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
예를 들어, 변형된 CGL 효소를 함유하는 치료학적 조성물은 통상적으로 단위 용량의 주사에 의해 정맥내로 투여된다. "단위 용량"이라는 용어는 치료학적 조성물과 관련하여 사용될 때 대상체에 대해 단일 투약량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 필요한 희석제, 즉, 담체 또는 비히클과 함께 목적하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된 예정량의 활성 물질을 함유한다.
상기 조성물은 투여 제형과 상용 가능한 방식으로 및 치료학적 유효량으로 투여된다. 투여되는 양은 치료되는 대상체, 활성 성분을 이용하는 대상체 시스템의 능력 및 목적하는 치료학적 효과의 정도에 좌우된다. 투여되는 활성 성분의 정확한 필요량은 진료 의사의 판단에 좌우되며, 각각의 개체에 대해 특유하다. 그러나, 전신 적용에 적합한 투여 범위는 본 출원에서 개시되며, 투여 경로에 좌우된다. 초기 투여 및 추가 접종 (booster shot)에 적합한 방법이 또한 고려되며, 초기 투여 후에 후속 주사 또는 다른 투여에 의한 한시간 이상의 간격의 반복 투여가 대표적이다. 예시적인 다중 투여가 본 출원에서 기재되며, 변형된 CGL 효소의 높은 혈청 및 조직 수준 및 정반대로 L-시스틴/시스테인의 낮은 혈청 및 조직 수준을 계속 유지하는 것이 특히 바람직하다. 대안으로, 혈액 중 농도를 생체내 요법에 대해 명시된 범위 내로 유지하기에 충분한 연속적 정맥내 주입이 고려된다.
IV. 컨쥬게이트
제공된 조성물 및 방법은, 예를 들어, 이종 펩타이드 분절 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체와 컨쥬게이트를 형성시킴으로써 개선을 위해 변형된 CGL 효소의 추가 변형을 포함한다. 상기 변형된 CGL 효소는 PEG에 연결되어 효소의 유체역학적 반경을 증가시킴으로써 혈청 지속성 및 반감기를 증가시킬 수 있다. 상기에서 개시된 폴리펩타이드는 세포 상의 외부 수용체 또는 결합 부위에 특이적으로 및 안정적으로 결합하는 능력을 갖는 리간드와 같은 임의의 표적화제 (targeting agent)에 컨쥬게이트될 수 있다 (미국 출원공개 2009/0304666). 상기 PEG는 약 3,000 내지 20,000 달톤의 크기일 수 있으며, 예시적인 크기는 5,000 달톤이다.
A. 융합 단백질
상기 변형된 CGL 효소가 이종 도메인에 N-말단 또는 C-말단에서 연결될 수 있는 융합 단백질이 제공된다. 예를 들어, 융합은 또한 다른 종 유래의 선도 서열을 이용하여 이종 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 가능하게 할 수 있다. 또 다른 유용한 융합은 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 단백질 친화성 태그, 예를 들어, 혈청 알부민 친화성 태그 또는 6개의 히스티딘 잔기, 또는 면역학적 활성 도메인, 예를 들어, 항체 에피토프, 바람직하게는 절단 가능한 에피토프의 부가를 포함한다. 비제한적인 친화성 태그로는 폴리히스티딘, 키틴 결합 단백질 (chitin binding protein: CBP), 말토오스 결합 단백질 (maltose binding protein: MBP) 및 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 (glutathione-S-transferase: GST)가 포함된다.
상기 변형된 CGL 효소는 생체내 반감기를 증가시키는 펩타이드, 예를 들어, XTEN 폴리펩타이드 (문헌 [Schellenberger et al., 2009]), IgG Fc 도메인, 알부민 또는 알부민 결합 펩타이드에 연결될 수 있다.
융합 단백질을 생성하는 방법은 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 완전한 융합 단백질의 드노보 (de novo) 합성에 의해, 또는 이종 도메인을 인코딩하는 DNA 서열의 부착 후 온전한 융합 단백질의 발현에 의해 생산될 수 있다.
모 단백질의 기능적 활성을 회복하는 융합 단백질의 생성은, 나란히 연결된 폴리펩타이드들 사이에 스플라이싱된 펩타이드 링커를 인코딩하는 가교 DNA 분절과 유전자를 연결함으로써 용이하게 될 수 있다. 이러한 링커는 생성된 융합 단백질의 적절한 폴딩을 허용하기에 충분한 길이일 수 있다.
B. 링커
상기 변형된 CGL 효소는 이작용성 가교 결합 시약을 사용하여 화학적으로 컨쥬게이트되거나, 단백질 수준에서 펩타이드 링커와 융합될 수 있다. 이작용성 가교 결합 시약은 친화성 매트릭스의 제조, 다양한 구조의 변형 및 안정화, 리간드 및 수용체 결합 부위의 식별, 및 구조 연구를 비롯한 다양한 목적을 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 적합한 펩타이드 링커는 또한 변형된 CGL 효소, 예를 들어, Gly-Ser 링커를 연결하는데 사용될 수 있다.
2개의 동일한 작용기를 보유하는 동종 이작용성 시약은 동일한 및 상이한 거대 분자 또는 거대 분자의 서브유닛 사이에 가교 결합을 유도하고, 폴리펩타이드 리간드를 이의 특정 결합 부위에 연결할 수 있다. 이종 이작용성 시약은 2개의 상이한 작용기를 함유한다. 상기 2개의 상이한 작용기의 차등 반응성을 이용함으로써, 가교 결합은 선택적으로 및 연속적으로 제어될 수 있다. 상기 이작용성 가교 결합 시약은 이의 작용기, 예를 들어, 아미노-, 설프하이드릴-, 구아니딘-, 인돌-, 카복실-특이적 기의 특이성에 따라 나누어질 수 있다. 이들 중에서, 유리 아미노기에 관한 시약은 이의 상업적 입수 용이성, 합성의 용이성, 적용될 수 있는 온화한 반응 조건 때문에 인기가 있었다.
일부 이종 이작용성 가교 결합 시약은 일차 아민 반응기 및 티올 반응기를 함유한다. 또 다른 예에서, 이종 이작용성 가교 결합 시약 및 상기 가교 결합 시약을 사용하는 방법이 기재되어 있다 (그 전문이 본 출원에 구체적으로 참조로 포함되는 미국 특허 US 5,889,155). 상기 가교 결합 시약은 친핵성 히드라지드 잔기를 친전자성 말레이미드 잔기와 조합하여, 하나의 예에서는 알데하이드의 유리 티올에 대한 커플링을 가능하게 한다. 상기 가교 결합 시약은 다양한 작용기를 가교 결합시키기 위해 변형될 수 있다.
추가적으로, 예를 들어, 항체-항원 상호 작용, 아비딘 비오틴 연결, 아미드 연결, 에스테르 연결, 티오에스테르 연결, 에테르 연결, 티오에테르 연결, 포스포에스테르 연결, 포스포르아미드 연결, 무수물 연결, 이황화 연결, 이온성 및 소수성 상호 작용, 이중 특이적 항체 및 항체 단편, 또는 이들의 조합과 같은, 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다른 연결제/커플링제 및/또는 메커니즘은 변형된 CGL 효소들을 조합하는데 사용될 수 있다.
혈액 중에서 합리적인 안정성을 갖는 가교제를 사용하는 것이 바람직하다. 표적화제 및 치료제/예방제를 컨쥬게이트시키기 위해 성공적으로 사용될 수 있는 수많은 유형의 이황화 결합 함유 링커가 공지되어 있다. 입체 장애를 갖는 이황화 결합을 함유하는 링커는 보다 높은 생체내 안정성을 부여하는 것으로 확인될 수 있다. 따라서, 이러한 링커는 연결제의 하나의 그룹이다.
입체 장애를 갖는 가교 링커에 추가하여, 입체 장애가 없는 링커가 또한 사용될 수 있다. 보호된 이황화물을 함유하거나 생성하는 것으로 간주되지 않는 다른 유용한 가교 결합제는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올란을 포함한다 (문헌 [Wawrzynczak and Thorpe, 1987]). 이러한 가교 결합제의 사용은 당해 분야에서 널리 이해되고 있다. 가요성 링커가 또한 사용될 수 있다.
일단 화학적으로 컨쥬게이트되면, 펩타이드는 컨쥬게이트되지 않은 제제 및 기타 오염 물질로부터 컨쥬게이트를 분리하기 위해 정제될 것이다. 임상적으로 유용하게 하는 충분한 순도를 갖는 컨쥬게이트를 제공하는데 사용하기 위한 다수의 정제 기술이 이용 가능하다.
크기 분리, 예를 들어, 겔 여과, 겔 투과 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 기반으로 하는 정제 방법들이 일반적으로 가장 많이 사용될 것이다. 기타 크로마토그래피 기술들, 예를 들어, 블루-세파로오스 분리가 또한 사용될 수 있다. 약한 계면 활성제 (detergent), 예를 들어, 나트륨 N-라우로일-사르코신 (SLS)을 사용하는 것과 같은, 봉입체로부터 융합 단백질을 정제하기 위한 통상적인 방법들이 유용할 수 있다.
C. 페길화 (PEGylation)
변형된 CGL 효소의 페길화에 관한 방법 및 조성물이 개시된다. 예를 들어, 상기 변형된 CGL 효소는 본 출원에서 개시된 방법에 따라 페길화될 수 있다.
페길화는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체 쇄의 또 다른 분자, 일반적으로는 약물 또는 치료학적 단백질에 대한 공유 부착 과정이다. 페길화는 PEG의 반응성 유도체와 표적 거대 분자의 인큐베이션에 의해 일상적으로 달성된다. 약물 또는 치료학적 단백질에 대한 PEG의 공유 부착은 숙주의 면역계로부터 제제를 "차폐" (면역원성 및 항원성 감소)시키거나 제제의 유체역학적 크기 (용액 중의 크기)를 증가시킬 수 있으므로, 신장 제거율을 감소시켜 제제의 순환 기간을 연장시킨다. 페길화는 또한 소수성 약물 및 단백질에 수용해성을 제공할 수 있다.
페길화의 제1 단계는 하나 또는 두 말단에서 PEG 중합체의 적절한 기능성화이다. 동일한 반응성 모이어티로 각 말단에서 활성화되는 PEG는 "동종 이작용성"으로서 공지되는 반면, 존재하는 작용기가 상이한 경우, PEG 유도체는 "이종 이작용성" 또는 "이종 작용성"으로서 지칭된다. PEG 중합체의 화학적으로 활성이거나 활성화된 유도체가 PEG를 목적하는 분자에 부착하기 위해 제조된다.
PEG 유도체에 적합한 작용기의 선택은 PEG에 커플링될 분자 상의 이용 가능한 반응기의 유형에 기초한다. 단백질의 경우, 전형적인 반응성 아미노산으로는 라이신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌 및 타이로신이 포함된다. N-말단 아미노기 및 C-말단 카복실산이 또한 사용될 수 있다.
제1 세대 PEG 유도체를 형성하는데 사용되는 기술은 일반적으로는 PEG 중합체를 하이드록실기, 전형적으로는 무수물, 산 클로라이드, 클로로포르메이트 및 카보네이트와 반응성인 기와 반응시키는 것이다.
페길화의 적용이 더욱 더 발전하고 정교해짐에 따라, 컨쥬게이션을 위한 이종 이작용성 PEG에 대한 수요가 증가해 왔다. 이러한 이종 이작용성 PEG은 2개의 엔터티 (entity)를 연결하는데 매우 유용하며, 여기서, 친수성, 가요성 및 생체 적합성 스페이서가 요구된다. 이종 이작용성 PEG에 바람직한 말단 기는 말레이미드, 비닐 설폰, 피리딜 디설파이드, 아민, 카복실산 및 NHS 에스테르일 수 있다.
가장 일반적인 변형제 또는 링커는 메톡시 PEG (mPEG) 분자를 기반으로 한다. 이의 활성은 알코올 말단에 단백질 변형기를 부가하는 것에 좌우된다. 일부 경우에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG 디올)은 전구체 분자로서 사용된다. 이어서, 상기 디올은 이종 또는 동종 이량체 PEG 연결된 분자를 제조하기 위해 양쪽 말단에서 변형된다.
단백질은 일반적으로 친핵성 부위, 예를 들어, 비양성자화된 티올 (시스테이닐 잔기) 또는 아미노기에서 페길화된다. 시스테이닐 특이적 변형 시약의 예로는 PEG 말레이미드, PEG 요오도아세테이트, PEG 티올 및 PEG 비닐설폰이 포함된다. 4개 모두는 온화한 조건 및 중성 내지 약간 알칼리성 pH하에 강하게 시스테이닐 특이적이지만 각각은 일부 단점을 갖는다. 말레이미드로 형성된 티오에테르는 알칼리성 조건하에 다소 불안정할 수 있으므로, 이러한 링커에 의한 제형화 옵션에 대한 일부 제약이 존재할 수 있다. 요오도 PEG로 형성된 카바모티오에이트 연결은 보다 안정하지만, 유리 요오드는 일부 조건하에 타이로신 잔기를 변형시킬 수 있다. PEG 티올은 단백질 티올과 함께 이황화 결합을 형성하지만, 이러한 연결은 또한 알칼리성 조건하에 불안정할 수 있다. PEG-비닐설폰 반응성은 말레이미드 및 요오도 PEG와 비교하여 비교적 느리지만, 형성된 티오에테르 연결은 상당히 안정하다. 이의 보다 느린 반응 속도는 또한 PEG-비닐설폰 반응을 보다 용이하게 제어하도록 한다.
본래의 시스테이닐 잔기에서의 부위 특이적 페길화는 거의 수행되지 않는데, 이는 이러한 잔기가 일반적으로 이황화 결합의 형태이거나 생물학적 활성을 위해 필요하기 때문이다. 다른 한편으로, 부위 특이적 돌연변이 유발은 티올 특이적 링커를 위한 시스테이닐 페길화 부위를 도입하는데 사용될 수 있다. 시스테인 돌연변이는 상기 페길화 시약에 접근 가능하면서도 페길화 후에도 여전히 생물학적 활성을 갖도록 설계되어야 한다.
아민 특이적 변형제는 PEG NHS 에스테르, PEG 트레실레이트, PEG 알데하이드, PEG 이소티오시아네이트 및 기타 여러가지를 포함한다. 모두는 온화한 조건하에 반응하며 아미노기에 대해 매우 특이적이다. PEG NHS 에스테르는 아마 보다 반응성인 제제들 중 하나이지만; 이의 높은 반응성은 대규모로 페길화 반응을 제어하기 어렵도록 한다. PEG 알데하이드는 아미노기와 이민을 형성하며, 이는 이후 나트륨 시아노보로하이드라이드에 의해 2차 아민으로 환원된다. 나트륨 보로하이드라이드와 달리, 나트륨 시아노보로하이드라이드는 이황화 결합을 환원시키지 않을 것이다. 그러나, 이러한 화학 물질은 매우 독성이며, 특히, 휘발성이 되는 낮은 pH에서, 주의하게 취급해야 한다.
대부분의 단백질 상의 다수의 라이신 잔기로 인해, 부위 특이적 페길화가 어려울 수 있다. 다행스럽게도, 이러한 시약은 비양성자화된 아미노기와 반응하기 때문에, 낮은 pH에서 반응을 실시함으로써 낮은 pK 아미노기에 페길화를 유도하는 것이 가능할 수 있다. 일반적으로, 알파-아미노기의 pK는 라이신 잔기의 엡실론-아미노기보다 더 낮은 1~2 pH 단위이다. pH 7 이하에서 분자를 페길화함으로써, N-말단에 대한 높은 선택성을 흔히 수득할 수 있다. 그러나, 이것은 단백질의 N-말단 부분이 생물학적 활성에 요구되지 않는 경우에만 실현 가능하다. 그런데도, 페길화에 의한 약동학적 이점은 흔히 시험관내 생물 활성의 상당한 손실을 능가하며, 이는 페길화 화학과 관계 없이 훨씬 더 큰 생체내 생물 활성을 갖는 생성물을 생성한다.
페길화 절차를 개발할 때 고려해야 할 몇 가지 파라미터가 존재한다. 다행스럽게도, 일반적으로 최대 4 또는 5개의 파라미터가 존재한다. 페길화 조건의 최적화를 위한 "실험 설계" 접근법이 매우 유용할 수 있다. 티올 특이적 페길화 반응의 경우, 고려할 파라미터는 단백질 농도, PEG 대 단백질 비율 (몰 기준), 온도, pH, 반응 시간, 및 일부 경우들에서는 산소의 배제를 포함한다. (산소는 단백질에 의한 분자간 이황화물 형성에 기여할 수 있으며, 이는 페길화 생성물의 수율을 감소시킬 것이다.) 동일한 요인들이 아민 특이적 변형에 대해 (산소 제외) 고려되어야 하지만, 예외적으로 pH는, 특히, N-말단 아미노기를 표적화할 때, 훨씬 더 중요할 수 있다.
아민 및 티올 특이적 변형 모두의 경우, 반응 조건은 단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 이것은 온도, 단백질 농도 및 pH를 제한할 수 있다. 또한, PEG 링커의 반응성은 페길화 반응을 시작하기 전에 알려져야 한다. 예를 들어, 페길화제가 단지 70% 활성인 경우, 사용되는 PEG의 양은 반드시 단백질 대 PEG 반응 화학양론에서 활성 PEG 분자만이 계수되도록 해야 한다.
V. 단백질 및 펩타이드
변형된 CGL 효소와 같은 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 이러한 펩타이드는 융합 단백질에 포함되거나 상기에서 기재된 바와 같은 제제에 컨쥬게이트될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 단백질 또는 펩타이드는 일반적으로 200개 초과 내지 유전자로부터 번역된 전장 서열 이하의 아미노산의 단백질; 약 100개 초과의 아미노산의 폴리펩타이드; 및/또는 약 3 내지 약 100개의 아미노산의 펩타이드를 지칭하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 편의상, "단백질," "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"라는 용어들은 본 출원에서 상호 교환적으로 사용된다.
따라서, "단백질 또는 펩타이드"라는 용어는 자연 발생 단백질에서 발견되는 20개의 흔한 아미노산 중 적어도 하나, 또는 적어도 하나의 변형 아미노산 또는 비-천연 아미노산를 포함하는 아미노산 서열을 포괄한다.
단백질 또는 펩타이드는 표준 분자 생물학 기술을 통한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현, 천연 공급원으로부터 단백질 또는 펩타이드의 단리, 또는 단백질 또는 펩타이드의 화학적 합성을 비롯한 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술로 제조될 수 있다. 공지된 유전자에 대한 코딩 영역은 본 출원에서 개시된 기법을 사용하거나 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지된 바와 같이 증폭 및/또는 발현될 수 있다. 대안으로, 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드의 다양한 상업적 제제가 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
VI. 핵산 및 벡터
변형된 CGL 효소 또는 변형된 CGL 효소를 함유하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 개시된다. 사용되는 발현 시스템에 따라, 핵산 서열은 통상적인 방법에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 변형된 CGL 효소가 사람 시스타티오나아제로부터 유래되고 이. 콜라이에서 희귀하게 이용되는 다수의 코돈을 함유하는 경우, 이는 발현을 방해할 수 있다. 따라서, 각각의 유전자 또는 이의 변이체는 희귀 코돈이 없는 코돈 서열을 설계하기 위해 자유롭게 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 이. 콜라이 발현에 코돈 최적화될 수 있다. 다양한 벡터도 또한 변형된 CGL 효소와 같은 관심 대상 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 벡터로는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 트랜스포손 또는 리포좀 기반 벡터가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
VII. 숙주 세포
숙주 세포는 변형된 CGL 효소 및 이의 콘주게이트의 발현 및 분비를 허용하도록 형질 전환될 수 있는 임의의 것일 수 있다. 상기 숙주 세포는 세균, 포유 동물 세포, 효모 또는 사상 진균일 수 있다. 다양한 세균으로는 에세리키아 (Escherichia) 및 바실러스 (Bacillus)가 포함된다. 사카로마이세스 (Saccharomyces), 키우이베로마이세스 (Kiuyveromyces), 한세눌라 (Hansenula), 또는 피키아 (Pichia) 속에 속하는 효모가 적절한 숙주 세포로서 사용된다. 다음 속을 비롯한 다양한 종의 사상 진균이 발현 숙주로서 사용될 수 있다: 아스퍼질러스 (Aspergillus), 트리코더마 (Trichoderma), 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 세팔로스포리움 (Cephalosporium), 아클리아 (Achlya), 포도스포라 (Podospora), 엔도티아 (Endothia), 무코르 (Mucor), 코클리오볼루스 (Cochliobolus) 및 피리쿨라리아 (Pyricularia).
이용 가능한 숙주 유기체의 예로는 세균, 예를 들어, 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli) MC1061, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) BRB1의 유도체 (문헌 [Sibakov et al., 1984]), 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) SAI123 (문헌 [Lordanescu, 1975]) 또는 스트렙토코커스 리비단스 (Streptococcus lividans) (문헌 [Hopwood et al., 1985]); 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지에 AH 22 (문헌 [Mellor et al., 1983]) 또는 스키조사카로바이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 및 사상 진균, 예를 들어, 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 아와모리 (Aspergillus nidulans) (문헌 [Ward, 1989]) 또는 트리코더마 리세이 (Trichoderma reesei) (문헌 [Penttila et al., 1987]; [Harkki et al., 1989])가 포함된다.
포유 동물 숙주 세포의 예로는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO-K1; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection: ATCC) 번호 CCL61), 래트 뇌하수체 세포 (GH1; ATCC 번호 CCL82), HeLa S3 세포 (ATCC 번호 CCL2.2), 래트 간암 세포 (H-4-II-E; ATCC 번호 CRL-1548), SV40-형질 전환 원숭이 신장 세포 (COS-1; ATCC 번호 CRL 1650) 및 쥐과 동물 배아 세포 (NIH-3T3; ATCC 번호 CRL-1658)가 포함된다. 상기는 당해 분야에 공지된 다수의 가능한 숙주 유기체를 예시하기 위한 것이며 한정하는 것으로 여겨지지 않는다. 원칙적으로, 분비할 수 있는 모든 숙주는 원핵 생물이든 진핵 생물이든 상관 없이 사용될 수 있다.
상기 변형된 CGL 효소 및/또는 이의 융합 단백질을 발현하는 포유 동물 숙주 세포는 모 세포주를 배양하기 위해 전형적으로 사용되는 조건하에 배양된다. 일반적으로, 세포는 5%~10% 혈청, 예를 들어, 소 태아 혈청으로 전형적으로 보충된, 생리학적 염 및 영양소를 함유하는 표준 배지, 예를 들어, 표준 RPMI, MEM, IMEM 또는 DMEM 중에서 또는 목적하는 세포에 대해 기재된 바와 같이 배양된다. 배양 조건은 또한 표준이며, 예를 들어, 배양물은 목적하는 수준의 단백질이 달성될 때까지 정치 배양 또는 롤러 배양으로 37℃에서 배양된다.
VIII. 단백질 정제
단백질 정제 기술은 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 기술은 한 수준에서 세포, 조직 또는 장기의 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 분획으로의 균질화 및 조악한 분획화를 포함한다. 관심 대상 단백질 또는 폴리펩타이드는 달리 명시되지 않는다면 부분 정제 또는 완전 정제 (또는 균질성으로의 정제)를 달성하기 위해 크로마토그래피 및 전기 영동 기술을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 순수한 펩타이드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 친화성 크로마토그래피, 면역 친화성 크로마토그래피 및 등전점 전기 영동이다. 펩타이드를 정제하는 특히 효율적인 방법은 고속 성능 액체 크로마토그래피 (fast-performance liquid chromatography: FPLC) 또는 심지어 고성능 액체 크로마토그래피 (high-performance liquid chromatography: HPLC)이다.
정제된 단백질 또는 펩타이드는 다른 성분으로부터 단리 가능한 조성물을 지칭하는 것으로 의도되며, 여기서, 상기 단백질 또는 펩타이드는 자연적으로 수득 가능한 상태에 비해 어느 정도까지 정제된다. 따라서, 단리 또는 정제된 단백질 또는 펩타이드는 또한 자연적으로 발생할 수 있는 환경으로부터 자유로운 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 일반적으로, "정제된"은 다양한 다른 성분을 제거하기 위해 분획화되고 이의 조성물이 이의 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 단백질 또는 펩타이드 조성물을 지칭할 것이다. "실질적으로 정제된"이라는 용어가 사용되는 경우, 이러한 용어는 단백질 또는 펩타이드가 조성물의 주요 성분을 형성하는 조성물, 예를 들어, 조성물 중에 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상의 단백질을 구성하는 조성물을 지칭할 것이다.
단백질 정제에 사용하기에 적합한 다양한 기술은 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이들로는, 예를 들어, 황산 암모늄, PEG, 항체 등에 의한 침전, 또는 열 변성에 이어서 원심 분리; 크로마토그래피 단계, 예를 들어, 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록시아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 등전점 전기 영동; 겔 전기 영동; 및 이들 및 다른 기술의 조합이 포함된다. 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서가 변경되거나, 특정 단계가 생략될 수 있으며 여전히 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩타이드의 제조에 적합한 방법을 초래한다고 여겨진다.
단백질 또는 펩타이드의 정제 정도를 정량화하기 위한 다양한 방법은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이들로는, 예를 들어, 활성 분획의 비활성 (specific activity)을 측정하는 것, 또는 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS/PAGE) 분석에 의해 분획 중 폴리펩타이드의 양을 평가하는 것이 포함된다. 분획의 순도를 평가하기에 바람직한 방법은 분획의 비활성을 계산하고, 이를 초기 추출물의 비활성과 비교하고, 그에 따른 순도를 계산하고, "~배 정제 수치"로 평가된다. 물론, 활성 양을 나타내는데 사용되는 실제 단위는 정제를 따르기 위해 선택된 특정 검정 기술, 및 발현된 단백질 또는 펩타이드가 검출 가능한 활성을 나타내는지 여부에 좌우될 것이다.
단백질 또는 펩타이드가 항상 가장 정제된 상태로 제공될 것이라는 일반적인 요건은 없다. 실제로, 실질적으로 덜 정제된 생성물이 유용성을 가질 수 있다는 것이 고려된다. 부분 정제는 보다 적은 정제 단계를 조합하여 사용하거나 동일한 일반 정제 계획의 상이한 형태를 이용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 장치를 사용하여 수행되는 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 일반적으로 저압 크로마토그래피 시스템을 이용하는 동일한 기술보다 더 큰 "~배" 정제를 초래할 수 있는 것으로 인식된다. 보다 낮은 상대 정제도를 나타내는 방법은 단백질 산물의 총 회수에서 또는 발현된 단백질의 활성의 유지에서 이점을 가질 수 있다.
단백질 또는 펩타이드, 예를 들어, 변형된 CGL 효소, 이러한 변형된 CGL 효소를 함유하는 융합 단백질, 또는 페길화 후의 변형된 CGL 효소는 단리 또는 정제될 수 있다. 예를 들어, His 태그 또는 친화성 에피토프는 정제를 용이하게 하기 위해 이러한 변형된 CGL 효소 중에 포함될 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 단리되는 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 분자 사이의 특정 친화성에 의존하는 크로마토그래피 절차이다. 이것은 수용체-리간드 유형의 상호 작용이다. 컬럼 물질은 결합 파트너 중 하나를 불용성 매트릭스에 공유적으로 커플링시킴으로써 합성된다. 그 다음, 컬럼 물질은 용액으로부터 물질을 특이적으로 흡착할 수 있다. 용출은 결합이 일어나지 않을 조건 (예를 들어, 변경된 pH, 이온 강도, 온도 등)으로 조건을 변경함으로써 일어난다. 상기 매트릭스는 분자를 임의의 상당한 정도로 흡수하지 않고 광범위한 화학적, 물리적 및 열적 안정성을 갖는 물질이어야 한다. 상기 리간드는 결합 특성에 영향을 미치지 않는 방식으로 커플링되어야 한다. 상기 리간드는 또한 비교적 단단한 결합을 제공해야 한다. 샘플 또는 리간드를 파괴하지 않으면서 물질을 용출하는 것이 가능해야 한다.
크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography: SEC)는 용액 중의 분자가 이의 크기 또는 보다 기술적인 관점에서, 이의 유체역학적 부피에 기초하여 분리되는 크로마토그래피 방법이다. 이것은 일반적으로 단백질 및 산업용 중합체와 같은 거대 분자 또는 거대 분자 복합체에 적용된다. 전형적으로, 수용액을 사용하여 컬럼을 통해 샘플을 운반할 때, 이러한 기술은 유기 용매가 이동상으로 사용될 때 사용되는 겔 투과 크로마토그래피와 대조적으로 겔 여과 크로마토그래피로서 공지되어 있다.
SEC의 기본 원리는 상이한 크기의 입자가 상이한 속도로 고정상을 통해 용출 (여과)될 것이라는 것이다. 이것은 크기에 기초하여 입자 용액의 분리를 초래한다. 모든 입자가 동시에 또는 거의 동시에 로딩된다면, 동일한 크기의 입자는 함께 용출되어야 한다. 각각의 크기 배제 컬럼은 분리될 수 있는 분자량의 범위를 갖는다. 배제 한계는 이러한 범위의 상단에서의 분자량을 한정하며, 분자가 너무 커서 고정상에 포획될 수 없는 경우이다. 투과 한계는 분리 범위의 하단에서의 분자량을 한정하며, 충분히 작은 크기의 분자가 고정상의 기공 내로 완전히 침투할 수 있고, 이러한 질량 이하의 모든 분자가 너무 작아서 단일 밴드로서 용출되는 경우이다.
고성능 액체 크로마토그래피 (또는 고압 액체 크로마토그래피, HPLC)는 화합물을 분리, 식별 및 정량하기 위해 생화학 및 분석 화학에서 빈번하게 사용되는 컬럼 크로마토그래피의 한 형태이다. HPLC는 크로마토그래피 팩킹 물질 (고정상)을 보유하는 컬럼, 이러한 컬럼을 통해 이동상(들)을 이동시키는 펌프 및 분자의 체류 시간을 보여주는 검출기를 이용한다. 체류 시간은 고정상, 분석되는 분자 및 사용된 용매(들) 사이의 상호 작용에 따라 달라진다.
IX. 치료학적 조성물
사람 시스타티오닌-γ-리아제 유전자는 이. 콜라이에서 드물게 사용되며 발현을 방해할 수 있는 다중 코돈을 함유한다. 따라서, 이. 콜라이에서 단백질 발현을 최적화하기 위해, 각 유전자는 DNA-Works 소프트웨어를 사용하여 설계된 코돈 최적화된 올리고뉴클레오타이드와 조립될 수 있다 (문헌 [Hoover et al., 2002]). 각각의 작제물은 클로닝을 단순화하기 위해 N-말단 NcoI 제한 부위, 인프레임 N-말단 His6 태그 및 C-말단 EcoRI 부위를 함유할 수 있다. pET28a 벡터 (Novagen)에 클로닝한 후, 50 μg/mL 카나마이신을 함유하는 터리픽 브로쓰 (Terrific Broth:TB) 배지를 사용하여 진탕기 플라스크에서 250 rpm으로 37℃에서 약 0.5~0.6의 OD600에 도달할 때까지 적절한 변형된 CGL 발현 벡터를 함유하는 이. 콜라이 (BL21)를 성장시킬 수 있다. 이 시점에서, 배양물을 25℃에서 진탕기로 스위칭하고, 0.5 mM IPTG로 유도하고, 추가로 12시간 동안 단백질을 발현시키도록 할 수 있다. 그 다음, 세포 펠렛을 원심 분리에 의해 수집하고, IMAC 완충액 (10 mM NaPO4/10 mM 이미다졸/300 mM NaCl, pH 8) 중에 재현탁시킬 수 있다. 프렌치 프레스 세포 파쇄기에 의해 또는 고압 균질화기에 의해 용해한 후, 용해물을 4℃에서 20,000 x g로 20분 동안 원심 분리하고, 생성된 상청액을 니켈 IMAC 컬럼 (비드 크기 45~165 μm, Qiagen)에 적용하고, 0.1% TRITON® 114를 함유하는 IMAC 완충액으로 광범위하게 (90~100 컬럼 부피) 세척하고, 10~20 컬럼 부피의 IMAC 완충액으로 세척한 다음, IMAC 용출 완충액 (50 mM NaPO4/250 mM 이미다졸/300 mM NaCl, pH 8)으로 용출시킬 수 있다. 정제된 단백질을 10,000 MWCO (분자량 컷오프) 여과 장치 (Amicon)를 사용하여 pH 8.3에서 100 mM NaPO4 완충액으로 완충액 교환을 실시하였다. 그 다음, 효소를 함유하는 분획을 25℃에서 1 시간 동안 10 mM 피리독살-5'-포스페이트 (PLP)와 함께 인큐베이션할 수 있다. 그 다음, 메톡시 PEG 석신이미딜 카복시메틸 에스테르 5000 MW (JenKem Technology)를 변형된 CGL 효소에 80:1 몰비로 첨가하고, 일정한 교반하에 25℃에서 1 시간 동안 반응하도록 하였다. 100,000 MWCO 여과 장치 (Amicon)를 사용하여, 생성된 혼합물을 광범위하게 완충액 교환 (10% 글리세롤 함유 PBS)하고 0.2 마이크론 주사기 필터 (VWR)로 살균하였다. 그 다음, 효소 분취량을 액체 질소에서 급속 냉동시키고, -80℃에 보관할 수 있다. 이러한 방식으로 정제된 상기 변형된 CGL 효소 변이체는 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의해 평가될 때 >95%로 균질해야 한다. 수율은 6 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 20 mM 포스페이트 완충액, pH 6.5의 최종 완충액 농도에서 계산된 흡광 계수, λ280 = 29,870 M-1cm-1에 기초하여 계산될 수 있다 (문헌 [Gill and von Hippel, 1989]). 투구게 아메바 세포 용해물 (Limulus Amebocyte Lysate: LAL) 키트를 사용하여, PEG화된 변형된 CGL 효소를 지질 다당류 (lipopolysaccharide: LPS) 함량에 대해 분석할 수 있다.
치료학적 제제의 특정 성질에 관한 어떠한 제한도 의도되지 않는다. 예를 들어, 이러한 조성물은 생리학적으로 내약성이 있는 액체, 겔 또는 고형 담체, 희석제 및 부형제와 함께 제형 중에 제공될 수 있다. 이러한 치료학적 제제가 다른 치료제와 유사한 방식으로 가축과 같은 수의학 용도 및 사람에서의 임상 용도를 위해 포유 동물에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료학적 효능에 요구되는 투약량은 사용 유형 및 투여 방식 뿐만 아니라 개별 대상체의 특수한 요건에 따라 달라질 것이다.
이러한 조성물은 전형적으로는 주사제로서 사용하기 위해 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조된다. 적합한 희석제 및 부형제로는, 예를 들어, 물, 염수, 덱스트로오스, 글리세롤 등 및 이들의 조합이 있다. 또한, 경우에 따라, 상기 조성물은 소량의 보조 물질, 예를 들어, 습윤제, 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제를 포함한다.
임상 적용이 고려되는 경우, 의도되는 적용에 적절한 형태로 단백질, 항체 및 약물을 포함하는 치료학적 조성물을 제조하는 것이 필요할 수 있다. 일반적으로, 치료학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 용해되거나 분산되는 유효량의 하나 이상의 변형된 CGL 효소 또는 추가의 제제를 포함할 수 있다. "치료학적 또는 치료학적으로 허용되는"이라는 문구는, 경우에 따라, 예를 들어, 사람과 같은 동물에게 투여될 때 불리한 알러지성 또는 기타 유해 반응을 생성하지 않는 분자 엔터티 및 조성물을 지칭한다. 본 출원에서 개시된 방법으로 단리된 하나 이상의 변형된 CGL 효소를 함유하는 치료학적 조성물 또는 추가의 활성 성분의 제조는 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990]에 예시되는 바와 같이 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 또한, 동물 (예를 들어, 사람) 투여의 경우, 제제는 FDA 생물학적 표준 사무국 (FDA Office of Biological Standards)에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 하는 것으로 이해될 것이다.
본 출원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"로는, 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이 (예를 들어, 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990] 참조), 임의의 모든 용매, 분산매, 계면 활성제, 산화 방지제, 보존제 (예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 기타 물질 및 이들의 조합이 포함된다. 지금까지 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 상용 가능하지 않는 것을 제외하고는, 치료학적 조성물 중 이의 용도가 고려된다.
이러한 조성물은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이 피하로, 정맥내로, 동맥내로, 복강내로, 근육내로, 주사로, 주입으로, 연속 주입으로, 카테터를 통해, 지질 조성물 (예를 들어, 리포좀)로 또는 다른 방법으로, 상기의 것들의 임의의 조합으로 투여될 수 있다 (예를 들어, 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990] 참조).
상기 변형된 폴리펩타이드는 유리 염기, 중성, 양성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 치료학적으로 허용되는 염으로는 산 부가 염, 예를 들어, 단백질성 조성물의 유리 아미노기로 형성되는 것들 또는, 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산으로 형성되는 것들이 포함된다. 유리 카복실기로 형성된 염은 또한, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 제2철과 같은 무기 염기; 또는, 예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형화시, 용액은 치료학적으로 유효한 양으로 투여 제형과 상용 가능한 방식으로 투여될 것이다. 상기 제형은 비경구 투여용으로 제형화된 것, 예를 들어, 폐로의 전달을 위한 주사 용액 또는 에어로졸, 또는 영양 투여용으로 제형화된 것, 예를 들어, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투여 형태로 투여될 수 있다.
투여에 적합한 개시된 조성물은 불활성 희석제의 존재 유무하에 약제학적으로 허용되는 담체 중에 제공될 수 있다. 지금까지 임의의 통상적인 매질, 제제, 희석제 또는 담체가 수여자 또는 이에 함유된 조성물의 치료학적 효과에 유해한 것을 제외하고는, 본 방법을 실시하는데 사용하기 위한 투여 가능한 조성물 중에 사용하는 것이 적절하다. 담체 또는 희석제의 예로는 지방, 오일, 물, 식염수, 지질, 리포좀 등, 또는 이들의 조합이 포함된다. 상기 조성물은 또한 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키기 위해 다양한 산화 방지제를 포함할 수 있다. 추가적으로, 미생물 작용의 방지는 보존제, 예를 들어, 파라벤 (예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 이루어질 수 있다.
개시된 조성물은 임의의 편리하고 실제적인 방식, 즉, 용액화, 현탁화, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡수 등으로 담체와 조합된.
동물 환자에게 투여되는 조성물의 실제 투약량은 물리학적 및 생리학적 인자들, 예를 들어, 체중, 병태의 중증도, 치료되는 질환의 유형, 이전 또는 동시의 치료학적 개입, 환자의 특발증 및 투여 경로에 의해 결정될 수 있다. 투약량 및 투여 경로에 따라, 바람직한 투약량 및/또는 치료학적 유효량의 투여 횟수는 대상체의 반응에 따라 달라질 수 있다. 투여 담당 진료 의사는 임의의 경우에서 조성물 중 활성 성분(들)의 농도 및 개별 대상체에 대한 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.
치료학적 조성물은, 예를 들어, 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 활성 화합물은 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는, 예를 들어, 약 25% 내지 약 60%, 및 여기서 유도 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 당연히, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물 중 활성 화합물(들)의 양은 적합한 투약량이 화합물의 임의의 소정의 단위 용량에서 수득되는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체 이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 유통 기한 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항과 같은 요인들은 이러한 치료학적 제형을 제조하는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 것이며, 이와 같이, 다양한 투약량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
용량은 또한 투여 당 약 500 마이크로그램/kg 체중, 약 1 밀리그램/kg 체중, 약 5 밀리그램/kg 체중, 약 10 밀리그램/kg 체중, 약 50 밀리그램/kg 체중, 약 100 밀리그램/kg 체중, 약 750 밀리그램/kg 체중 또는 그 이상 및 여기서 유도 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 용량이 매주 투여되는 경우, 용량은 5 mg/kg 체중, 즉, 예를 들어, 70 kg 대상체에 대해 단백질 350 mg의 양으로 존재할 수 있다.
X. 조합 치료
본 출원에서 제공된 조성물 및 방법은 변형된 CGL 효소를 제2 또는 추가의 요법과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 이러한 요법은 시스틴/시스테인 의존성과 관련되는 임의의 질환의 치료에 적용될 수 있다. 예를 들어, 상기 질환은 시스틴뇨증일 수 있다.
조합 요법은 치료학적 또는 보호적 효과를 증진시키고/거나 또 다른 요법의 치료학적 효과를 증가시킨다. 치료학적 및 예방적 방법 및 조성물은 요로내 시스틴 결석의 제거 또는 요로, 신장 및/또는 방광 내 시스틴 결석 형성의 예방과 같은 목적하는 효과를 달성하는데 효과적인 조합된 양으로 제공될 수 있다. 이러한 과정은 변형된 CGL 효소 및 제2 요법을 모두 투여하는 것을 포함할 수 있다. 조직, 장기 또는 세포는 하나 이상의 제제 (즉, 변형된 CGL 효소 또는 제2 제제)를 포함하는 하나 이상의 조성물 또는 약리학적 제형(들)에 노출될 수 있거나, 조직, 장기 및/또는 세포는 둘 이상의 별개 조성물 또는 제형과 접촉될 수 있으며, 여기서, 하나의 조성물은 1) 변형된 CGL 효소, 2) 제2 제제 또는 3) 변형된 CGL 효소와 제2 제제 둘 다를 제공한다. 조합 요법은 충격파 요법 또는 수술 요법과 함께 사용될 수 있다.
세포에 적용될 때의 "접촉되는" 및 "노출되는"이라는 용어는, 치료학적 작제물이 표적 장기에 전달되거나 표적 세포와 직접 병치되어 배치되는 과정을 기술하기 위해 본 출원에서 사용된다. 예를 들어, 결석 용해를 달성하기 위해, 2개의 제제는 결석을 용해시키거나 결석 형성 또는 재형성을 방지하는데 효과적인 조합된 양으로 세포에 전달된다.
변형된 CGL 효소는 제2 시스틴뇨증 치료와 관련하여 이전에, 도중에, 이후에 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 동시 내지 수분, 수일, 수주의 범위의 간격으로 이루어질 수 있다. 상기 변형된 CGL 효소가 제2 시스틴뇨증 치료와 완전히 별개로 환자에게 제공될 때, 일반적으로 상당한 기간이 각각의 전달 시간 사이에 경과하지 않도록 하여 2개의 치료제가 여전히 환자에게 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록 보장할 것이다. 이러한 경우, 환자에게 상기 변형된 CGL 효소 및 제2 시스틴뇨증 요법을 서로 약 12 내지 24 시간 또는 72 시간 이내에 또는 서로 약 6~12시간 이내에 제공할 수 있다. 일부 상황에서, 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 각각의 투여 사이에 경과하는 경우, 치료 기간을 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 변형된 CGL은 1일 내지 90일 (이러한 범위는 개입일을 포함함) 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 날에 제공될 수 있으며, 또 다른 치료는 1일 내지 90일 (이러한 범위는 개입일을 포함함) 또는 이들의 조합 중 어느 날에 제공될 수 있다. 하루 (24 시간) 이내에, 환자는 치료제(들)의 하나 또는 다중 투여를 제공받을 수 있다. 치료 과정 후에, 어떠한 치료제도 투여되지 않는 기간이 존재할 수 있다. 이러한 기간은 환자의 상태, 예를 들어, 예후, 강도, 건강 등에 따라 1~7 일 및/또는 1~5 주 및/또는 1~12 개월 (이러한 범위는 개입일을 포함함) 지속될 수 있다. 치료 주기는 필요에 따라 반복될 수 있다.
다양한 조합이 이용될 수 있다. 하기 예의 경우, 변형된 CGL 효소는 "A"이며, 제2 시스틴뇨증 요법은 "B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
환자에 대한 임의의 화합물 또는 요법의 투여는 존재하는 경우 요법의 독성을 고려하여 이러한 화합물의 투여에 대한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 따라서, 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계가 존재할 수 있다.
A. 수술
시스틴 결석의 제거를 위한 가장 일반적인 방법 중 하나는 경피적 신쇄석술이며, 여기서, 키홀 절개가 등에서 이루어지며, 신장경이 결석을 파괴하고 제거하는데 사용된다. 이러한 수술은 개방 수술보다 덜 침습적이지만, 2 내지 3일의 입원 기간과 수주간의 회복 기간과 함께 정기적 또는 척추 마취가 일반적으로 필요하다.
B. 충격파 요법
시스틴뇨증 환자는 종종 자신의 생애 동안 결석 형성 및 수술의 재발성 에피소드를 갖는다. 결석 파쇄를 위한 고에너지 충격파를 사용하는 충격파 쇄석술은 1.5 cm 보다 작은 시스틴 결석 치료에 사용될 수 있다. 시스틴 결석은 모든 요로 결석 중 가장 견고하며, 쇄석술은 일반적으로 이것을 파쇄하는데 비효과적이다. 그러나, 보다 작은 시스틴 결석은 쇄석술로 파쇄될 수 있는데, 이는 보다 높은 에너지의 보다 빈번한 충격이 사용될 수 있기 때문이다.
C. 약물 요법
시스틴 결석 관련 의학적 병태에 대한 약물 요법은 시스틴 이황화 결합을 파괴하고, 보다 가용성의 혼합된 이황화물 또는 시스테인 자체를 형성하기 위해 D-페니실아민, α-머캅토프로피오닐 글리신 (Thiola®) 및 캅토프릴과 같은 티올 함유 약물의 사용을 포함한다. 그러나, 이러한 약물은 위장 불내성, 발진 및 관절통과 같은 다양한 불쾌한 부작용을 환자에게 빈번하게 제공한다 (문헌 [Sakhaee and Sutton, 1996]).
D. 기타 방법
시스틴 결석을 제거하기 위한 추가의 치료 과정은 일반적으로 결석 형성의 위험을 감소시키기 위해 요로 시스틴 수준의 관리를 포함한다. 이러한 관리 방법은 물 섭취의 실질적 증가 (이렇게 함으로써 소변 부피와 가용화될 수 있는 시스틴의 양을 증가시킴), 시스틴의 대사성 전구체인 메티오닌 및 나트륨의 식이 제한, 및 칼륨 시트레이트의 경구 투여에 의해, 소변의 pH를 증가시켜 시스틴의 용해도를 증가시키는 것을 포함한다.
비수술 및 최소 침습 경로인 추가의 시스틴 결석 치료 방법은 화학 용해 (chemodissolution)로도 또한 공지된 결석의 화학적 용해를 위한 신루설치술 카테터를 통한 화학 용액의 신장으로의 전달을 포함한다. 나트륨 바이카보네이트 및 pH 10에서의 유기 완충액 트리스-하이드록시메틸렌-아미노메탄 (트로메타민-E)을 비롯한 다양한 화학 용해제가 이러한 기술에서 사용되었으며, 둘 다는 시스틴 결석을 용해시키기 위해 강 알칼리성 환경을 제공하는 역할을 한다. 아세틸시스테인은 또한 화학 용해에 빈번하게 사용되며, 시스틴 이황화물을 파괴하고, 보다 가용성의 이황화물을 형성하여 D-페니실아민 및 티올라®와 유사한 방식으로 결석을 용해시킨다. 그러나, 이러한 용해 방법은 시스틴 결석의 처리에 있어 제한적인 역할을 하는데, 이는 이러한 화학 용해제가 느리게 수행되고 전형적으로는 결석을 용해시키는데 수주 내지 수개월 걸리기 때문이다 (문헌 [Ng and Streem, 2001]).
XI. 키트
치료학적 키트와 같은 키트가 제공된다. 예를 들어, 키트는 본 출원에서 기재된 바와 같은 하나 이상의 치료학적 조성물 및 임의로 이의 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 이러한 조성물의 투여를 수행하기 위한 하나 이상의 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 키트는 치료학적 조성물 및 당해 조성물을 표적 조직에 직접 정맥내 주사하기 위한 카테터를 포함할 수 있다. 키트는 전달 장치와 함께 사용하기 위한, 치료학적 조성물로서 임의로 제형화되거나 감암 동결 건조된 변형된 CGL 효소의 예비 충전된 앰풀을 포함할 수 있다.
키트는 라벨을 갖는 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알 및 테스트 튜브가 포함된다. 상기 용기들은 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 상기에서 기재된 바와 같은, 치료학적 또는 비치료학적 용도에 효과적인 변형된 CGL 효소를 포함하는 조성물을 보유할 수 있다. 상기 용기 상의 라벨은 상기 조성물이 특정 요법 또는 비치료학적 용도에 사용된다는 것을 나타낼 수 있으며, 또한 상기에서 기재된 바와 같은 생체내 또는 시험관내 사용에 대한 목적을 나타낼 수도 있다. 키트는 전형적으로는 상기에서 기재된 용기와, 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 설명서를 갖는 패키지 삽입물을 비롯한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 물질을 포함하는 하나 이상의 다른 용기를 포함할 것이다.
XII. 실시예
하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시형태를 입증하기 위해 포함된다. 당해 분야의 통상의 기술자라면, 하기 실시예들에 개시되는 기술들이 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 밝혀진 기술들을 나타내기 때문에, 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것을 인식해야 한다. 그러나, 당해 분야의 통상의 기술자라면, 본 개시 내용을 고려하여, 수많은 변경이 개시된 특정 실시 형태에서 이루어질 수 있으며 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고도 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 인식해야 한다.
실시예 1 - 시스티나아제/시스테이나아제 활성에 대한 96-웰 플레이트 스크리닝
시스테이나아제 효소는 L-시스테인을 피루베이트, 암모니아 및 H2S로 분해하고, L-시스틴을 피루베이트, 암모니아 및 티오시스테인으로 전환시킨다 (각각 k cat/K M 약 0.2 mM-1s-1 및 0.5 mM-1s-1) (티오시스테인은 추가로 L-시스테인 및 H2S로 비효소적으로 분해된다). 3-메틸-2-벤조티아졸리논 하이드라존 (MBTH)을 사용하는 피루베이트 검출을 위한 비색 검정 (문헌 [Takakura et al., 2004])을, 작은 라이브러리를 스크리닝하고 가장 큰 시스틴 및/또는 시스테인 리아제 활성을 갖는 클론의 순위를 매기기 위해 96-웰 플레이트 형식으로 확장하였다. 이러한 플레이트 스크리닝은 돌연변이 유발성 라이브러리로부터 최대 활성 클론을 선택하는 손쉬운 방법을 제공한다.
돌연변이된 hCGL 또는 hCGL 대조군을 함유하는 단일 콜로니를, 50 μg/mL 카나마이신을 함유하는 100 μL의 TB 배지/웰을 함유하는 96-웰 배양 플레이트에 선택하였다. 그 다음, 이러한 배양물을 37℃에서 플레이트 진탕기 상에 12 시간 동안 성장시켰다. 25℃로 냉각시킨 후, 50 μg/mL 카나마이신 및 1 mM IPTG를 함유하는 100 μL의 배지/웰을 추가로 첨가하였다. 25℃에서 16 시간 동안 진탕하면서 발현을 수행한 후, 100 μL의 배양물/웰을 96-웰 검정 플레이트에 옮겼다. 그 다음, 검정 플레이트를 원심 분리하여 세포를 펠렛화하고, 배지를 제거하고, B-PER 단백질 추출 시약 (Pierce) 100 μL/웰을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 원심 분리로 용해물을 제거한 후, 90 μL의 상청액을 His-Sorb 플레이트 (Qiagen)의 각 웰에 옮기고, 3 시간 동안 천천히 교반하면서 10℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 생성된 상청액을 버리고, 각 웰에 200 μL PBS를 첨가하고 플레이트를 4℃에서 15분 동안 천천히 교반하고 세척 완충액을 흡인 제거하여 플레이트를 총 3회 세척하였다. 그 다음, 0.5 mM 시스틴을 함유하는 반응 완충액 100 μL을 His-Sorb 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 50 μL의 반응물을 별도의 96-웰 플레이트에 옮긴 후, 150 μL의 MBTH 작업 용액/웰을 첨가하여 유도체화하였다. 그 다음, 플레이트를 50℃에서 40분 동안 가열하고, 냉각 후 미세 역가 플레이트 판독기로 λ= 320 nm에서 판독하였다. 모 대조군 보다 더 큰 활성을 나타내는 클론을 추가의 특성화를 위해 선택하였다.
실시예 2 - 조작된 사람 시스테이나아제의 돌연변이된 라이브러리의 작제
구조 분석 및 계통 발생 분석은 A51, E59, L91, T163, V166, T189, P193, A200, N234, T311, E339, I353, K361 및 N362 잔기가 시스테이나아제 매개성 시스틴 분해에서 역할을 할 수 있다는 것을 시사하였다. 다양한 축퇴성 코돈 포화 돌연변이 유발 라이브러리를 중첩 확장 PCR에 의해 이러한 위치에서 작제하였다. 생성된 PCR 산물을 NcoI 및 EcoRI로 분해하고, T4 DNA 리가아제로 pET28a 벡터에 연결하였다. 연결물을 이. 콜라이 (BL21-DE3)에 직접 형질 전환하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 후속 스크리닝 실험에 사용하기 위해 LB-카나마이신 플레이트 상에 플레이팅하였다. 모든 라이브러리를 이론적 크기의 2배 초과로 스크리닝하였다. 모 대조군 반응과 비교하여 증진된 활성을 나타내는 클론을 단리하고 서열을 결정하여 돌연변이를 확인하였다.
실시예 3 - 시스테이나아제 변이체의 발현 및 정제
96-웰 플레이트 스크리닝에서 증진된 활성을 나타내는 시스테이나아제 변이체를, 0.5~0.6의 OD600에 도달할 때까지 진탕기 플라스크에서 250 rpm으로 50 μg/mL 카나마이신을 함유하는 터리픽 브로쓰 (TB) 배지에서 배양하였다. 이 시점에서, 배양물을 25℃에서 진탕기로 스위칭하고, 0.5 mM IPTG로 유도하고, 추가로 12시간 동안 단백질을 발현시키도록 하였다. 그 다음, 세포 펠렛을 원심 분리에 의해 수집하고, IMAC 완충액 (10 mM NaPO4/10 mM 이미다졸/300 mM NaCl, pH 8) 중에 재현탁시켰다. 프렌치 프레스 세포에 의한 용해 후, 용해물을 4℃에서 20,000 x g로 20분 동안 원심 분리하고, 생성된 상청액을 니켈 IMAC 컬럼에 적용하고, 10~20 컬럼 부피의 IMAC 완충액으로 세척한 다음, IMAC 용출 완충액 (50 mM NaPO4/250 mM 이미다졸/300 mM NaCl, pH 8)으로 용출시켰다. 그 다음, 효소를 함유하는 분획을 25℃에서 1 시간 동안 5 mM 피리독살 포스페이트 (PLP)와 함께 인큐베이션하였다. 10,000 MWCO 원심 분리 필터 장치 (Amicon)를 사용하여, 단백질을 100 mM PBS, 10% 글리세롤, pH 7.3 용액에 수회 완충액 교환하였다. 시스테이나아제 변이체 효소의 분취량을 생물리학적 특성에 대해 즉시 분석하거나 액체 질소에서 급속 냉동시키고 -80℃에 보관하였다. 이러한 방식으로 정제된 상기 hCGL-변이체 효소는 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의해 평가될 때 >95%로 균질하였다.
실시예 4 - 동력학을 결정하기 위한 커플링된 락테이트 데하이드로게나아제 검정
시스테이나아제 변이체의 정상 상태 동력학 파라미터를 결정하기 위해, 커플링된 연속 분광 광도 검정을 개발하였다. 본 검정은 보조 효소, 즉, 락테이트 데하이드로게나아제 (LDH)에 의한 시스틴과의 시스테이나아제 촉매 반응에 의해 생성된 피루베이트의 이용에 좌우된다. LDH는 피루베이트의 존재하에 NADH를 산화시켜 락테이트와 NAD+를 화학양론적으로 생성한다. NADH의 산화는 피루베이트에 비례하며, 이것은 결국 시스테이나아제 효소의 활성에 비례한다. 광범위한 시스틴 농도를 사용하는 시간의 함수로서 340 nm에서 분광 광도계로 NADH의 소실을 모니터링하였으며, 기질의 10% 고갈 (초기 속도 조건) 전에 흔적 (trace)의 선형 부분을 사용하여 반응 속도를 계산하였다. 기질 농도 의존적 관찰 속도를 반응에 사용된 효소 농도로 정규화하고, 이어서 기질 농도의 함수로서 플롯팅하였다. 생성된 데이터를 정상 상태 파라미터의 계산을 위해 미카엘리스-멘텐 식에 피팅하였다. NADH에 대한 몰 흡광도 흡광 계수 (6.22 mM-1 cm-1)를 사용하여 NADH 흡광도의 절대 농도로의 변환을 계산하였다. 정상 상태 동력학 파라미터를 결정하기 위해 본 검정을 사용하여 변이체를 테스트하였으며, 생성된 k cat/K M 값을 병행 검정된 기준 시스테이나아제 변이체 (hCGL-H55E-E59T-T336D-E339V; 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 미국 출원 번호 15/977,246 참조)의 값과 직접 비교하였다. 다수의 변이체는 시스테인을 분해하기 위해 k cat/K M의 증가를 나타냈다 (표 1, k cat/K M에 대한 배수 개선).
Figure pct00001
* * *
본 출원에서 개시되고 청구된 모든 방법들은 본 개시 내용을 고려하여 과도한 실험없이 만들어지고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시형태의 관점에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본 출원에 기재된 방법들, 이들의 단계들 또는 이들의 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 한, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 제제가 본 출원에서 기재된 제제를 대체할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 당해 분야의 통상의 기술자들에게 자명한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고 문헌
하기 참고 문헌들은, 본 출원에서 제시된 것들을 보완하는 예시적인 절차 또는 기타 세부 사항을 제공하는 정도까지, 본 출원에 참조로 구체적으로 포함된다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
<110> Board of Regents, The University of Texas System <120> ENGINEERED PRIMATE CYSTINE/CYSTEINE DEGRADING ENZYMES FOR THERAPEUTIC USES <130> UTFB.P1212WO <140> not yet assigned <141> 2019-10-25 <150> US 62/751,197 <151> 2018-10-26 <160> 110 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 405 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 2 <211> 405 <212> PRT <213> Pongo abelii <400> 2 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Val Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 3 <211> 405 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 3 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 4 <211> 405 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 4 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 5 <211> 405 <212> PRT <213> Pan paniscus <400> 5 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 6 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 6 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 7 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 7 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Pro Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 8 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 8 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Pro Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 9 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 9 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 10 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 10 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 11 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 11 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Ser Phe Met Ser 180 185 190 Gly Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 12 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 12 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Arg Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 13 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 13 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Trp Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 14 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 14 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 15 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 15 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu His Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 16 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 16 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 17 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 17 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Ile Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 18 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 18 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 19 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 19 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 20 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 20 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 21 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 21 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 22 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 22 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 23 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 23 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 24 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 24 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 25 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 25 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Pro Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 26 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 26 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Pro Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 27 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 27 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Val Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 28 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 28 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Val Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 29 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 29 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Ser Phe Met Ser 180 185 190 Gly Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 30 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 30 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Arg Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 31 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 31 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Trp Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Val Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 32 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 32 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 33 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 33 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu His Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 34 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 34 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 35 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 35 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Ile Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 36 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 36 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Val Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 37 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 37 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 38 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 38 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Val Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 39 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 39 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Val Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 40 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 40 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Val Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 41 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 41 Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Val Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 42 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 42 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 43 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 43 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Pro Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 44 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 44 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Pro Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 45 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 45 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Lys Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 46 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 46 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Lys Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 47 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 47 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Ser Phe Met Ser 180 185 190 Gly Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 48 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 48 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Arg Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 49 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 49 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Trp Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 50 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 50 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 51 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 51 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu His Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 52 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 52 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 53 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 53 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Ile Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 54 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 54 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 55 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 55 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 56 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 56 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 57 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 57 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 58 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 58 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 59 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 59 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Ala Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Val Leu Lys Met Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys Arg Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Asn 405 <210> 60 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 60 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 61 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 61 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Pro Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 62 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 62 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Pro Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 63 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 63 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 64 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 64 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 65 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 65 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Ser Phe Met Ser 180 185 190 Gly Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 66 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 66 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Arg Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 67 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 67 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Trp Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 68 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 68 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 69 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 69 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu His Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 70 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 70 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 71 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 71 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Ile Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 72 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 72 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 73 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 73 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 74 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 74 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 75 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 75 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 76 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 76 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 77 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 77 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 78 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 78 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 79 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 79 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Pro Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 80 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 80 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Pro Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 81 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 81 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 82 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 82 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 83 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 83 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Ser Phe Met Ser 180 185 190 Gly Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 84 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 84 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Arg Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 85 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 85 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Trp Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 86 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 86 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Ala Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 87 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 87 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu His Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 88 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 88 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 89 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 89 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Ile Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 90 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 90 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 91 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 91 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 92 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 92 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 93 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 93 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 94 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 94 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 95 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered protein <400> 95 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln Glu Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Asp 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 96 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 96 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccagggc tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt gcgccgggcc agcatagcgg ttttgaatat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga ctggcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caatcgttat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgaccc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taataccttc atgagcgcgt acttccagcg tccgctggcg 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata atcgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc ggcggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttaccct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccagca tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218 <210> 97 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 97 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccaagga tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt gcgccgggcc agcatagcgg ttttgaatat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga ctggcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caatcgttat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgaccc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taataccttc atgagcccgt acttccagcg tccgctgccg 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata atcgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc ggcggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttaccct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccagca tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218 <210> 98 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 98 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccaagga tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt gcgccgggcc agcatagcgg ttttgaatat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga ctggcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caatcgttat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgaccc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taataccttc atgagcgcct acttccagcg tccgctgccg 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata atcgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc ggcggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttaccct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccagca tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218 <210> 99 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 99 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccaagga tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt gcgccgggcc aggagagcgg ttttacctat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga atggcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caataggtat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgaccc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taataccttc atgagcccgt acttccagcg tccgctggcg 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata aacgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc accggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttgatct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccatta tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218 <210> 100 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 100 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccaagga tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt gcgccgggcc aggagagcgg ttttacctat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga agcgcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caataggtat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgaccc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taataccttc atgagcccgt acttccagcg tccgctggcg 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata aacgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc accggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttgatct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccatta tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218 <210> 101 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 101 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccagggc tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt gcgccgggcc agcatagcgg ttttgaatat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga ctggcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caatcgttat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgaccc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taatagcttc atgagcggct acttccagcg tccgctggcg 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata atcgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc ggcggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttaccct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccagca tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218 <210> 102 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 102 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccagggc tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt gcgccgggcc agcatagcgg ttttgaatat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga ctggcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caatcgttat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgcgcc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taataccttc atgagcccgt acttccagcg tccgctggcg 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata atcgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc ggcggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttaccct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccagca tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218 <210> 103 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 103 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccaagga tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt tggccgggcc aggagagcgg ttttacctat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga ttggcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caataggtat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgaccc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taataccttc atgagcccgt acttccagcg tccgctggcg 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata atcgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc accggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttgatct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccatta tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218 <210> 104 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 104 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccagggc tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt gcgccgggcc aggagagcgg ttttgaatat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga ctggcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caatcgttat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgaccc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taataccttc atgagcgcct acttccagcg tccgctggcg 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata atcgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc ggcggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttgatct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccagca tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218 <210> 105 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 105 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccaagga tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt gcgccgggcc agcatagcgg ttttgaatat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga ctggcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caatcgttat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgaccc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taataccttc atgagcccgt acttccagcg tccgctgcat 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata atcgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc ggcggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttaccct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccagca tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218 <210> 106 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 106 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccagggc tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt gcgccgggcc agcatagcgg ttttgaatat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga ctggcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caatcgttat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgaccc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taataccttc atgagcccgt acttccagcg tccgctggcg 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata atcgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc ggcggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttaccct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccagca tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218 <210> 107 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 107 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccagggc tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt gcgccgggcc agcatagcgg ttttatttat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga ctggcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caatcgttat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgaccc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taataccttc atgagcccgt acttccagcg tccgctggcg 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata atcgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc accggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttaccct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccagca tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218 <210> 108 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 108 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccagggc tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt gcgccgggcc agcatagcgg ttttgaatat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga atggcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caatcgttat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgaccc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taataccttc atgagcccgt acttccagcg tccgctggcg 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata atcgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc accggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttaccct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccatta tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218 <210> 109 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 109 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccagggc tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt gcgccgggcc agcatagcgg ttttgaatat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga ctggcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caatcgttat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgaccc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taataccttc atgagcccgt acttccagcg tccgctggcg 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata atcgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc accggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttaccct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccagca tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218 <210> 110 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered nucleic acid <400> 110 atgcaggaaa aggatgcgag ctcccagggc tttcttccgc atttccagca ttttgcgacg 60 caggcgatac acgtgggcca agacccggaa cagtggacgt cgcgtgcggt tgtaccgccg 120 attagcctga gcacgacctt taaacaaggt gcgccgggcc agcatagcgg ttttgaatat 180 agccgtagcg gcaatcccac acggaattgc ctggagaagg cggtggcggc tctggacggc 240 gcgaagtatt gccttgcgtt tgcgagcgga ctggcggcca ccgtgaccat tacccacctg 300 cttaaggctg gggaccagat tatttgcatg gatgatgtgt atggtgggac caatcgttat 360 ttccgtcagg tggcgagcga gttcggcctg aagatatcct ttgtcgactg ctcgaagatc 420 aagctgttag aggcagcgat tacgccggaa acaaaacttg tgtggataga aaccccgacg 480 aacccgaccc agaaagtgat tgacattgaa ggctgcgccc acattgtgca taaacacggc 540 gatatcatcc tggtcgtgga taataccttc atgagcccgt acttccagcg tccgctggcg 600 cttggcgccg acattagcat gtattcggcg accaagtata tgaacggcca tagcgacgtt 660 gtcatgggcc tggtgagcgt gaattgcgag agcctgcata atcgtctgcg ttttctgcaa 720 aattcgcttg gagcggtgcc gagcccgatc gattgctatc tgtgcaatcg tgggctgaag 780 actctgcatg tgcggatgga gaaacatttt aagaatggca tggctgtggc gcagtttctg 840 gaaagcaatc cgtgggtgga aaaagttatc tacccgggac tgcccagcca cccgcagcat 900 gaactggtca aacgtcagtg cacaggttgc accggcatgg tgaccttcta tatcaagggc 960 accctgcaac acgccgaaat ctttctgaaa aacctgaaac tgtttaccct ggcagtgagc 1020 ttgggcggct ttgaaagcct tgctgaactg ccggccatta tgactcatgc ctccgtgttg 1080 aaaaatgatc gtgatgttct gggcataagc gataccctga ttcgcctgtc cgtaggactg 1140 gaagatgaag aagatctgct ggaggatctg gatcaggcgc tgaaagcggc ccatccccca 1200 tcgggaagcc acagttga 1218

Claims (36)

  1. 본래의 사람 시스타티오닌-γ-리아제 (CGL) 아미노산 서열 (서열 번호 1)에 대해 적어도 하기 치환을 포함하는 단리된 변형된 영장류 CGL 효소로서, 상기 변형된 효소가 시스티나아제 및 시스테이나아제 활성 모두를 가지며, 상기 치환이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소:
    (a) 193번 위치에 알라닌, 311번 위치에 글리신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
    (b) 200번 위치에 프롤린, 311번 위치에 글리신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
    (c) 193번 위치에 알라닌, 200번 위치에 프롤린, 311번 위치에 글리신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
    (d) 55번 위치에 글루탐산, 59번 위치에 트레오닌, 91번 위치에 메티오닌, 234번 위치에 라이신, 336번 위치에 아스파르트산 및 339번 위치에 발린;
    (e) 55번 위치에 글루탐산, 59번 위치에 트레오닌, 91번 위치에 세린, 234번 위치에 라이신, 336번 위치에 아스파르트산 및 339번 위치에 발린;
    (f) 189번 위치에 세린, 193번 위치에 글리신, 311번 위치에 글리신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
    (g) 163번 위치에 아르기닌, 311번 위치에 글리신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
    (h) 51번 위치에 트립토판, 55번 위치에 글루탐산, 59번 위치에 트레오닌, 336번 위치에 아스파르트산 및 339번 위치에 발린;
    (i) 55번 위치에 글루탐산, 193번 위치에 알라닌, 311번 위치에 글리신, 336번 위치에 아스파르트산, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
    (j) 200번 위치에 히스티딘, 311번 위치에 글리신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
    (k) 311번 위치에 글리신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
    (l) 59번 위치에 이소류신, 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린;
    (m) 91번 위치에 메티오닌 및 339번 위치에 발린; 및
    (n) 339번 위치에 발린 및 353번 위치에 세린.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변형된 CGL 효소가 변형된 폰고 아벨리이 (Pongo abelii) CGL 효소인, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
  3. 제2항에 있어서, 상기 변형된 폰고 아벨리이 CGL 효소가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환을 포함하는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소:
    (a) P193A, T311G, E339V 및 V353S;
    (b) A200P, T311G, E339V 및 V353S;
    (c) P193A, A200P, T311G, E339V 및 V353S;
    (d) H55E, V59T, L91M, N234K, T336D 및 E339V;
    (e) H55E, V59T, L91S, N234K, T336D 및 E339V;
    (f) T189S, P193G, T311G, E339V 및 V353S;
    (g) T163R, T311G, E339V 및 V353S;
    (h) A51W, H55E, V59T, T336D 및 E339V;
    (i) H55E, P193A, T311G, T336D, E339V 및 V353S;
    (j) A200H, T311G, E339V 및 V353S;
    (k) T311G, E339V 및 V353S;
    (l) V59I, E339V 및 V353S;
    (m) L91M 및 E339V; 및
    (n) E339V 및 V353S.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변형된 CGL 효소가 변형된 사람 CGL 효소, 변형된 판 트로글로다이테스 (Pan troglodytes) CGL 효소 또는 변형된 판 파니스쿠스 (Pan paniscu) CGL 효소인, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
  5. 제4항에 있어서, 상기 변형된 사람 CGL 효소, 상기 변형된 판 트로글로다이테스 CGL 효소 또는 상기 변형된 판 파니스쿠스 CGL 효소가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환을 포함하는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소:
    (a) P193A, T311G, E339V 및 I353S;
    (b) A200P, T311G, E339V 및 I353S;
    (c) P193A, A200P, T311G, E339V 및 I353S;
    (d) H55E, E59T, L91M, N234K, T336D 및 E339V;
    (e) H55E, E59T, L91S, N234K, T336D 및 E339V;
    (f) T189S, P193G, T311G, E339V 및 I353S;
    (g) T163R, T311G, E339V 및 I353S;
    (h) A51W, H55E, E59T, T336D 및 E339V;
    (i) H55E, P193A, T311G, T336D, E339V 및 I353S;
    (j) A200H, T311G, E339V 및 I353S;
    (k) T311G, E339V 및 I353S;
    (l) E59I, E339V 및 I353S;
    (m) L91M 및 E339V; 및
    (n) E339V 및 I353S.
  6. 제1항에 있어서, 상기 변형된 CGL 효소가 변형된 마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis) CGL 효소인, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
  7. 제6항에 있어서, 상기 변형된 마카카 파시쿨라리스 CGL 효소가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환을 포함하는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소:
    (a) P193A, T311G, E339V 및 I353S;
    (b) A200P, T311G, E339V 및 I353S;
    (c) P193A, A200P, T311G, E339V 및 I353S;
    (d) H55E, E59T, L91M, N234K, T336D 및 E339V;
    (e) H55E, E59T, L91S, N234K, T336D 및 E339V;
    (f) T189S, P193G, T311G, E339V 및 I353S;
    (g) V163R, T311G, E339V 및 I353S;
    (h) A51W, H55E, E59T, T336D 및 E339V;
    (i) H55E, P193A, T311G, T336D, E339V 및 I353S;
    (j) A200H, T311G, E339V 및 I353S;
    (k) T311G, E339V 및 I353S;
    (l) E59I, E339V 및 I353S;
    (m) L91M 및 E339V; 및
    (n) E339V 및 I353S.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 펩타이드 분절 또는 다당류를 추가로 포함하는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
  9. 제8항에 있어서, 상기 이종 펩타이드 분절이 XTEN 펩타이드, IgG Fc, 알부민 또는 알부민 결합 펩타이드인, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
  10. 제8항에 있어서, 상기 다당류가 폴리시알산 중합체를 포함하는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 커플링되어 있는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
  12. 제11항에 있어서, 상기 효소가 하나 이상의 라이신 잔기를 통해 상기 PEG에 커플링되어 있는, 단리된 변형된 영장류 CGL 효소.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 효소를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  14. 제13항에 있어서, 상기 핵산이 세균, 진균, 곤충 또는 포유 동물에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는, 핵산.
  15. 제14항에 있어서, 상기 세균이 이. 콜라이 (E. coli)인, 핵산.
  16. 제15항에 있어서, 상기 핵산이 서열 번호 81~95 중 하나에 따른 서열을 포함하는, 핵산.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  18. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 숙주 세포가 세균 세포, 진균 세포, 곤충 세포 또는 포유 동물 세포인, 숙주 세포.
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 효소 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산을 약제학적으로 허용되는 담체 중에 포함하는 치료학적 제형.
  21. 치료학적 유효량의 제20항의 제형을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 시스틴뇨증을 앓거나 발병할 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 대상체가 L-시스틴 및/또는 L-시스테인 제한 식이로 유지되는, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 대상체가 메티오닌 제한 식이로 유지되는, 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 대상체가 정상 식이로 유지되는, 방법.
  25. 제21항에 있어서, 상기 대상체가 사람 환자인, 방법.
  26. 제21항에 있어서, 상기 제형이 정맥내로, 동맥내로, 복강내로, 근육내로, 혈관내로, 피하로, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해 또는 카테터를 통해 투여되는, 방법.
  27. 제21항에 있어서, 상기 대상체가 이전에 시스틴뇨증에 대해 치료를 받았으며, 상기 효소가 시스틴뇨증의 재발을 예방하기 위해 투여되는, 방법.
  28. 제21항에 있어서, 적어도 제2 시스틴뇨증 요법을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제2 시스틴뇨증 요법이 수술 요법 또는 충격파 요법인, 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 제2 시스틴뇨증 요법이 바이카보네이트, 트리스-하이드록시메틸렌-아미노메탄 (트로메타민-E), 아세틸시스테인, D-페니실아민, α-머캅토프로피오닐글리신 및 캅토프릴로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제 또는 약물을 포함하는, 방법.
  31. 제21항에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체의 혈장 및/또는 혈청에서 시스테인 및/또는 시스틴의 수준을 감소시키는, 방법.
  32. 제21항에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체의 소변에서 시스테인 및/또는 시스틴의 수준을 감소시키는, 방법.
  33. 제21항에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체의 요로에서 시스틴 결석의 형성을 예방하는, 방법.
  34. 제21항에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체의 신장에서 시스틴 결석의 형성을 예방하는, 방법.
  35. 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체의 신장에서 시스틴 결석의 수를 감소시키는, 방법.
  36. 시스틴뇨증 환자에 대한 치료학적 적용을 위한 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리 또는 변형된 CGL 효소, 또는 상기 변형된 CGL 효소를 포함하는 조성물의 용도.
KR1020217015692A 2018-10-26 2019-10-25 치료학적 용도를 위한 조작된 영장류 시스틴/시스테인 분해 효소 KR20210084539A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862751197P 2018-10-26 2018-10-26
US62/751,197 2018-10-26
PCT/US2019/058021 WO2020086937A1 (en) 2018-10-26 2019-10-25 Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes for therapeutic uses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210084539A true KR20210084539A (ko) 2021-07-07

Family

ID=70331739

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217015692A KR20210084539A (ko) 2018-10-26 2019-10-25 치료학적 용도를 위한 조작된 영장류 시스틴/시스테인 분해 효소

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20210380962A1 (ko)
EP (1) EP3870081A4 (ko)
JP (1) JP2022505689A (ko)
KR (1) KR20210084539A (ko)
CN (1) CN113260324A (ko)
AR (1) AR116866A1 (ko)
AU (1) AU2019363606A1 (ko)
BR (1) BR112021007687A2 (ko)
CA (1) CA3117046A1 (ko)
CO (1) CO2021006432A2 (ko)
IL (1) IL282626A (ko)
MX (1) MX2021004754A (ko)
SG (1) SG11202104205XA (ko)
TW (1) TW202029967A (ko)
WO (1) WO2020086937A1 (ko)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060275279A1 (en) * 2005-06-06 2006-12-07 Rozzell J D Methods for dissolving cystine stones and reducing cystine in urine
AU2011212885B2 (en) * 2010-02-04 2015-10-01 Aemase, Inc. Engineered enzymes with methionine-gamma-lyase enzymes and pharmacological preparations thereof
CA2922550C (en) * 2013-08-29 2022-12-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered primate l-methioninase for therapeutic purposes
EP3039137B1 (en) * 2013-08-29 2019-07-31 Board of Regents, The University of Texas System Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes as antineogenic agents
EP3187190A1 (en) * 2015-12-31 2017-07-05 Erytech Pharma Method of treating a mammal, including human, against cancer using methionine and asparagine depletion
WO2018209211A1 (en) * 2017-05-12 2018-11-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes for therapeutic uses

Also Published As

Publication number Publication date
AR116866A1 (es) 2021-06-23
SG11202104205XA (en) 2021-05-28
TW202029967A (zh) 2020-08-16
MX2021004754A (es) 2021-06-08
CA3117046A1 (en) 2020-04-30
WO2020086937A1 (en) 2020-04-30
BR112021007687A2 (pt) 2021-08-10
EP3870081A4 (en) 2023-01-18
CN113260324A (zh) 2021-08-13
AU2019363606A1 (en) 2021-05-20
IL282626A (en) 2021-06-30
JP2022505689A (ja) 2022-01-14
CO2021006432A2 (es) 2021-06-10
US20210380962A1 (en) 2021-12-09
EP3870081A1 (en) 2021-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11584949B2 (en) Engineered enzymes with methionine-gamma-lyase enzymes and pharmacological preparations thereof
US20210386838A1 (en) Human-enzyme mediated depletion of homocysteine for treating patients with hyperhomocysteinemia and homocystinuria
US20180008681A1 (en) Human-enzyme mediated depletion of cystine for treating patients with cystinuria
KR20210084539A (ko) 치료학적 용도를 위한 조작된 영장류 시스틴/시스테인 분해 효소
JP2023535537A (ja) シスタチオニン－ガンマ－リアーゼを使用するホモシスチン尿症及び高ホモシステイン血症の治療