CN109563490A - 具有经修饰的糖蛋白b的疱疹病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组疱疹病毒，所述重组疱疹病毒包含异源多肽配体，所述异源多肽配体能够与靶分子结合并且在特定位点处融合至或插入糖蛋白B。所述疱疹病毒可以包含一种以上配体，并且可以通过经修饰的糖蛋白D和/或经修饰的糖蛋白H纳入一种或多种另外的配体。这使得疱疹病毒可以为了治疗目的而靶向细胞和为了病毒生产而靶向细胞。本发明还包括一种含有所述疱疹病毒的药物组合物，所述疱疹病毒用于治疗肿瘤、感染、退行性病症或衰老相关疾病，编码所述gB的核酸和载体，含有所述gB的多肽以及含有所述疱疹病毒、核酸、载体或多肽的细胞。此外，公开了一种用所述疱疹病毒感染细胞的方法或生产所述疱疹病毒的方法。

Description

具有经修饰的糖蛋白B的疱疹病毒
背景技术
产生本发明的工作得到了欧洲研究理事会根据欧盟第七框架计划(FP7/2007-2013)/ERC拨款协议号340060的资助。
尽管医疗保健领域稳步发展，但是无法治疗或无法充分治疗的疾病和病状的负担仍然很高。其中突出的是多种形式的肿瘤，特别是使用放化疗或生物药物或者其组合治疗的肿瘤的转移形式，但取得的成功有限。
肿瘤治疗的另一种疗法是溶瘤病毒疗法，其中复制型病毒感染肿瘤细胞，在肿瘤的细胞之间扩散并且破坏它们。
可以将溶瘤病毒疗法与癌症的免疫疗法联用。因此，可以向患者施用溶瘤病毒和免疫治疗剂，或者溶瘤病毒可以经工程改造以表达细胞因子、趋化因子或者诸如免疫检查点调控因子的分子，其加强宿主对肿瘤的免疫应答。免疫检查点调控因子包括针对CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、KIR、NKG2A、TIM3、TIGIT、CD96、BTLA的抗体或单链抗体，可以单独或联合施用。包括在这一类别中的能够激发针对肿瘤的免疫应答的重组溶瘤病毒是T-VEC，已更名为Talimogene Iaherparepvec(商品名Imlygic)，这是一种经FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤的编码GM-CSF的HSV。
单纯疱疹病毒(HSV)是人类的病原体病毒。在培养时，其感染大量哺乳动物细胞。它是一种通过膜融合进入细胞的包膜病毒，其取决于靶细胞的类型，通过在质膜处的膜融合或通过内吞作用进入细胞。HSV进入靶细胞是一个多步骤过程，需要病毒糖蛋白gD、gH/gL、gC和gB复杂的相互作用和构象改变。这些糖蛋白构成病毒包膜，其是HSV颗粒的最外部结构并且由膜组成。对于细胞进入，gC和gB介导HSV颗粒与细胞表面硫酸乙酰肝素的第一次附着。此后，gD结合至少两种可选的细胞受体，即粘连蛋白-1和HVEM或HVEA，引起gD的构象改变，其启动导致病毒粒子-细胞膜融合的级联事件。由此，中间蛋白gH/gL(异二聚体)被激活，其触发gB以催化膜融合。由此，gB与膜结合并且起到病毒融合剂的作用。
近年来，溶瘤性HSV(o-HSV)已被用作溶瘤剂。由于野生型HSV病毒具有高毒性，因此需要将o-HSV减毒。T-VEC/Imlygic和已经进入临床试验的病毒携带一个或多个HSV基因的缺失，包括编码ICP34.5蛋白的γ134.5基因，该蛋白的作用是阻止被感染细胞中蛋白合成的关闭，还包括编码核糖核苷酸还原酶大亚单位的UL39基因。除了这些病毒所显示出的一些缺点(如不能以高产率生产子代病毒)以外，其还保留了与携带其天然受体的任何细胞结合的能力。因此，对肿瘤细胞进行杀伤的治疗作用被减弱，并且病毒在医疗用途方面可能具有局限性。
克服这些限制的一种方法是对o-HSV进行基因工程改造，使其表现出对肿瘤细胞高度特异性的嗜性(tropism)，并且除此以外并未被减弱。已将这种方法定义为HSV嗜性重新靶向(retargeting)肿瘤特异性受体。
HSV重新靶向癌症特异性受体需要对gD进行基因修饰，以使其具有编码特异性配体的异源序列。用重组病毒感染后，形成在其包膜中携带嵌合的gD-配体糖蛋白替代野生型gD的子代病毒。该配体与在所选定的细胞上特异性表达的分子相互作用，并且能够使重组o-HSV进入所选定的细胞。已成功用于重新靶向HSV的配体的实例为IL13α、uPaR、针对HER2的单链抗体和针对EGFR的单链抗体。
还用gC尝试了通过对糖蛋白进行修饰的重新靶向。插入的配体是EPO和IL13。携带gC-EPO多肽的病毒附着在表达EPO受体的细胞上。然而，这种附着不会导致感染性进入。此外，gC-IL13多肽存在于在gD基因中携带第二个IL13拷贝的病毒中。因而，从这些研究中无法推断gC-IL13是否有助于重新靶向IL13α2受体。
通过对gH进行基因修饰也实现了重新靶向。插入的配体是针对HER2的单链抗体(scFv)，不具有或具有gH基因内的缺失。病毒成功地重新靶向携带HER2受体的细胞(Gatta等，2015)。此外，构建了重组病毒，其含有针对gH中的HER2的scFV和针对成熟gD蛋白中的EGFR的scFv。这导致双重重新靶向携带所述受体的细胞。此外，构建了重组病毒，其含有针对gH中的HER2的scFV和针对成熟gD蛋白中的HER2的scFv。这导致双重重新靶向HER2受体(PCT申请(摘要#P-28，9th International conference on Oncolytic virusTherapeutics，Boston 2015))。
尚未报道过经gB的病毒重新靶向。尽管确认了gB基因内的插入位点，其导致产生膜融合活性保持的可存活病毒突变体(Gallagher等，2014；Lin和Spear，2007；Potel等，2002)，用于分析多肽-gB融合的测定没有预测在插入的多肽是能够结合靶受体的异源肽的情况下，随后产生的重组体是否将有助于gB的融合活性并显示出重新定位(重新靶向)配体靶向的受体的嗜性。最重要的是，本领域的经验预测为重新靶向病毒(包括HSV)的嗜性所做出的任何努力，只有当选择用于修饰(例如，用于插入异源配体)的糖蛋白是病毒嗜性的决定因素时才是成功的。已请求保护了针对HSV gB的受体；其为与gB和gC结合的硫酸乙酰肝素蛋白多糖、髓磷脂相关糖蛋白MAG、配对的免疫球蛋白样2型受体α(PILRα)、DC-SIGN和非肌肉肌球蛋白重链9MYH9/NMHC-IIA。在任何情况下，gB与这些分子之间的相互作用都没有显示出决定HSV的嗜性。因此，PILRα参与HSV进入单核细胞，这是一种通常不被HSV靶向的细胞类型，HSV病毒优先感染表皮和神经细胞。对于其他受体，未研究其在HSV感染中的作用。因此，本领域技术人员不能预期对gB的适宜修饰能够导致对所选择的靶受体重新靶向的嗜性。
本领域需要提供一些其他的重新靶向策略。这种需求源于在同一肿瘤中癌细胞的异质性，藉此细胞表达不同受体，来源于消除癌症干细胞的需求，其可以表达不同于癌细胞的受体库，或者来源于对靶向疗法具有抗性的细胞的大量产生。
本发明描述了具有经修饰的gB蛋白的重组HSV，其将病毒重新靶向需要消除的细胞的受体。
本发明人已经表明，可以构建重组HSV，其包含作为与gB融合的融合蛋白的针对特定细胞受体的多肽配体，藉此由于配体的存在，将HSV重新靶向携带受体的细胞。此外，HSV已显示出保持了感染性，导致其进入携带受体的细胞并杀死被感染的细胞。
发明详述
在下文中，对本发明进行了详细描述。在各个段落中描述了本发明的特征。然而，这并不意味着在一段中描述的特征孤立于其他段落中描述的一个或多个特征。相反，可以将一段中描述的特征与其他段落中描述的一个或多个特征组合。
用于本申请中的术语“包含(comprise/es/ing)”意指“包括/含有”所公开的特征以及未特别提及的其他特征。术语“包含(comprise/es/ing)”还意指“由”所示特征“组成”，因此不包括所示特征以外的其他特征。因此，本发明产品可以由除了所示特征以外的其他特征表征。
在第一个方面，本发明提供了重组疱疹病毒，所述重组疱疹病毒包含异源多肽配体，所述异源多肽配体能够与靶分子结合并且融合至或插入存在于所述疱疹病毒的包膜中的糖蛋白B(gB)，其中所述配体融合至gB，或者其中所述配体在gB无序区域内的任何氨基酸处插入，但是不在如SEQ ID NO:1所示的gB的跨氨基酸77至88的区域内，或同源gB的对应区域内的任何氨基酸处插入，或者其中所述配体在如SEQ ID NO:1所示的gB的跨氨基酸31至77或88至184，优选地氨基酸31至77或88至136或者更优选地31至77或88至108，和/或跨氨基酸409至545，优选地氨基酸459至545，更优选地氨基酸459至497或甚至更优选地氨基酸460至491的区域内，或同源gB的对应区域内的任何氨基酸处插入。
此外，本发明提供了一种重组疱疹病毒，所述重组疱疹病毒包含异源多肽配体，所述异源多肽配体能够与靶分子结合并且插入存在于所述疱疹病毒的包膜中的糖蛋白B(gB)，其中所述配体的长度为5至120个氨基酸并且在如SEQ ID NO:1所示的gB的跨氨基酸77至88的区域内，或同源gB的对应区域内的任何氨基酸处插入。
在其一个实施方式中，疱疹病毒具有与表达或结合所述靶分子的细胞结合的能力，优选地具有与所述细胞膜融合的能力，更优选地具有进入所述细胞的能力，最优选地具有杀死所述细胞的能力。
在其一个实施方式中，靶分子存在于患病细胞上，优选地其中所述患病细胞是肿瘤细胞、感染细胞、退行性病症相关细胞或衰老细胞，或者所述靶分子存在于细胞培养物中存在的细胞上，优选地所述细胞是适于所述疱疹病毒生长的培养细胞，更优选地是批准用于疱疹病毒生长的细胞系，甚至更优选地是Vero、293、293T、HEp-2、HeLa、BHK或RS细胞，最优选地是Vero细胞。
在其一个实施方式中，存在于患病细胞上的所述靶分子是肿瘤相关受体，优选地是EGF受体家族成员，包括HER2、EGFR、EGFRIII、或EGFR3(ERBB3)、EGFRvIII，或MET、FAP、PSMA、CXCR4、CEA、CADC、粘蛋白、叶酸结合蛋白、GD2、VEGF受体1和2、CD20、CD30、CD33、CD52、CD55、整合素家族、IGF1R、Ephrin受体家族、蛋白-酪氨酸激酶(TK)家族、RANKL、TRAILR1、TRAILR2、IL13Rα、UPAR、腱生蛋白、免疫检查点家族调节因子成员，包括PD-1、PD-L1、CTL-A4、TIM-3、LAG3或IDO，肿瘤相关糖蛋白72、神经节苷酯GM2、A33、Lewis Y抗原或MUC1，最优选地是HER2，或者存在于细胞培养物中存在的细胞上的所述靶分子是人造分子，优选地是抗体、抗体衍生物或抗体模拟物，更优选地是单链抗体(scFv)，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的一部分结合的scFv，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的包含SEQID NO:37的部分结合的scFv，甚至更优选地是包含SEQ ID NO:39的scFv，最优选地是SEQID NO:41的序列所示的分子。
在其一个实施方式中，配体是天然多肽或人造多肽，优选地所述配体能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子或存在于患病细胞上的靶分子结合，更优选地所述配体是在细胞上可接近的靶分子的天然配体、能够与所述靶分子结合的天然配体的一部分、天然多肽的一部分、抗体、抗体衍生物、抗体模拟物，甚至更优选地所述配体是能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的天然多肽的一部分或scFv，甚至更优选地所述配体是GCN4酵母转录因子的一部分，例如GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:37的部分，或能够与存在于肿瘤分子上的靶分子结合，优选与HER2结合的scFv，最优选地所述配体是SEQ ID NO:37的序列所示的分子或SEQ ID NO:32所示的scFv。
在其一个实施方式中，所述靶分子是HER2，所述配体是如SEQ ID NO:32所示的scFv，并且所述患病细胞是表达HER2的肿瘤细胞，优选乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、骨肉瘤细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞或唾液腺肿瘤细胞，和/或所述靶分子是具有如SEQ ID NO:41所示的序列的分子，所述配体是SEQ ID NO:37的序列所示的分子，并且所述细胞存在于细胞培养物中且表达SEQ ID NO:41的序列所示的分子。
在其一个实施方式中，一个或多个配体融合至或插入gB，优选地所述gB包含能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的配体和能够与存在于患病细胞上的靶分子结合的配体。
在其一个实施方式中，所述疱疹病毒包含经修饰的gD和/或经修饰的gH，优选地其中所述gB包含能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的配体，并且所述经修饰的gD和/或所述经修饰的gH包含能够与存在于患病细胞上的靶分子结合的配体，最优选地所述gB包含SEQ ID NO:37所示的序列，所述靶分子是具有SEQ ID NO:41所示序列的分子，并且所述细胞存在于细胞培养物中并表达SEQ ID NO:41的序列所示的分子，并且所述经修饰的gD和/或所述经修饰的gH包含SEQ ID NO:32所示的scFv，所述靶分子是HER2，并且所述细胞是表达HER2的肿瘤细胞，优选乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、骨肉瘤细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞或唾液腺肿瘤细胞。
在其一个实施方式中，对于如SEQ ID NO:62所示的成熟gD或同源gD的对应区域，gD被修饰为缺失gD的氨基酸30至38或其子集，优选地所述gD被修饰为缺失氨基酸30和/或氨基酸38，更优选地所述gD被修饰为缺失氨基酸30和氨基酸38。
在其一个实施方式中，对于如SEQ ID NO:62所示的成熟gD或同源gD的对应区域，将异源多肽配体插入gD取代氨基酸30至38或其子集，优选地插入所述异源多肽配体取代氨基酸30或氨基酸38，更优选地插入所述异源多肽配体取代氨基酸38并且缺失氨基酸30。
在其一个实施方式中，所述疱疹病毒编码刺激针对细胞(优选患病细胞)的宿主免疫应答的一种或多种分子。
糖蛋白B(gB)是一种包膜蛋白，其存在于疱疹病毒科病毒的外表面上并且参与病毒与细胞的结合和侵入细胞。在参与细胞进入的糖蛋白中，gB是融合剂，经gD和gH/gL刺激后，gB经历融合-促进构象重排。gB由904个氨基酸组成，包括30个氨基酸的信号肽，696个氨基酸的胞外区，69个氨基酸的跨膜域和109个氨基酸的C-尾。gB属于疱疹病毒科中最高度保守的糖蛋白。在其融合后构象中解析了1型单纯疱疹病毒(HSV)gB的晶体结构；其为三聚体，具有5个结构域(I-V)。结构域I从氨基酸154延伸至363，结构域II从氨基酸142延伸至153以及从氨基酸364延伸至459，接下来是氨基酸460至491的无序区域，结构域III从氨基酸117延伸至133、从氨基酸500延伸至572以及从氨基酸661延伸至699，结构域IV从氨基酸111延伸至116以及从氨基酸573延伸至660，以及结构域V从氨基酸670延伸至725(Heldwein等，2006)。具有无序结构的N-末端区域从氨基酸31延伸至108。还解析了EBV和HCMV的晶体结构，其基本上类似于1型HSV的晶体结构(Backovic等，2009；Burke和Heldwein，2015)。由于其具有独特的结构，疱疹病毒gB属于一类新的病毒膜融合糖蛋白，第III类。不同疱疹病毒的各种gB的核苷酸和氨基酸序列是本领域公知的。仅出于说明性目的，而不限于此，本申请公开的人疱疹病毒1的gB的氨基酸序列参见SEQ ID NO:1。相应的核苷酸序列和氨基酸序列可以从NCBI(国家生物技术信息中心；国家医学图书馆，Bethesda，MD20894，USA；
www.ncbi.nlm.nih.gov)获得，登录号为“基因组”GU734771.1，坐标为52996至55710。
SEQ ID NO:1
gB同源物可见于所有疱疹病毒科的成员中。因此，用于本申请中的术语“糖蛋白B”是指见于疱疹病毒科中的任何gB同源物。另选地，本申请中所提及的gB是指与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性的任何gB。另选地，本申请中所提及的gB是指与SEQ ID NO:1具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％氨基酸同源性的任何gB。本申请中所提及的gB还包括gB的片段。优选地，本申请中所提及的gB包括见于疱疹病毒科中的任何gB，如上文所定义的与SEQID NO:1的序列具有氨基酸同一性的任何gB，以及与SEQ ID NO:1所示的gB具有相同活性的任何gB的片段。更优选地，在病毒进入细胞的过程中，gB经历促进病毒与细胞膜融合的构象变化，以及甚至更优选地，其作为介导病毒与细胞膜融合的融合剂。
用于本申请中的“序列同一性”百分比是指在经最佳比对的两条序列的对应位置中相同的氨基酸残基的百分比。其通过在比较窗中比较两条经最佳比对的序列来确定，其中为了将两条序列进行最佳比对，与参照序列SEQ ID NO:1(其不包含增加或缺失)相比，在比较窗中的氨基酸序列片段可以包含增加或缺失(例如，空位或突出端)。确定在两条序列中出现相同氨基酸残基的位置数以获得匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗中的总位置数，再乘以100得到序列同一性百分比。可以通过Smith和Waterman，1981的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch，1970的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman，1988的相似性检索方法，通过经Karlin和Altschul，1993改进的Karlin和Altschul，1990的算法，或者通过这些算法的计算机化实施(威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.,Madison，WI)或通过观察，来进行用于比较的序列最佳比对。优选地使用GAP和BESTFIT确定最佳比对。通常使用缺省值空位加权5.00和空位加权长度0.30。
用于本申请中的“同源性百分比”是指在两条最佳比对序列的对应位置中同源的氨基酸残基的百分比。除了在计算时还要考虑同源的位置而不仅仅是相同的位置以外，确定两条序列之间的“同源性百分比”的方法与上文所述的确定“同一性百分比”的方法基本上相同。两个同源的氨基酸具有两个相同的或同源的氨基酸。同源的氨基酸残基具有相似的化学-物理性质，例如属于同一族的氨基酸：芳香族(Phe、Trp、Tyr)、酸性(Glu、Asp)、极性(Gln、Asn)、碱性(Lys、Arg、His)、脂肪族(Ala、Leu、lie、Val)、具有羟基基团(Ser、Thr)或具有短侧链(GIy、Ala、Ser、Thr、Met)。预期此类同源氨基酸之间的取代不改变蛋白表型(保守性取代)。
如果gB与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，与SEQ ID NO:1具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸同源性，或者与如SEQ ID NO:1所示的gB具有相同活性，则该gB是“同源的”或“同源物”。优选地，“相同活性”可以理解为gB与细胞受体结合，以及更优选地，在病毒进入细胞的过程中，gB经历促进病毒与细胞膜融合的构象变化，以及甚至更优选地，其作为融合剂。同源物还可以是具有如上所示活性的全长gB的片段。
本发明的嵌合gB(如SEQ ID NO:2所示例的)携带异源多肽配体，从而使病毒除了具有野生型(wt)病毒的gB部分实现的活性以外还具有新的活性。嵌合gB一旦成为重组病毒包膜的一部分，便能够使重组病毒与靶分子结合，并且将重组病毒的嗜性重新靶向至携带配体的所述靶分子的细胞。优选地，嵌合gB经历促进病毒与细胞膜融合的构象变化，以及甚至更优选地，嵌合gB作为融合剂。在与携带配体的靶分子的细胞融合后，重组疱疹病毒进入细胞，被重组疱疹病毒感染的细胞产生由病毒基因组编码的蛋白，包括携带异源多肽配体的嵌合gB。被感染的细胞产生裂解所述细胞的子代病毒，从而将细胞杀死。
用于本申请中的术语“重新靶向”指将本发明的重组疱疹病毒靶向配体的靶分子。然而，重组疱疹病毒仍能靶向未经修饰的疱疹病毒的天然受体。重新靶向与“去靶向(detargeting)”不同，后者指重组疱疹病毒不能再靶向未经修饰的疱疹病毒的天然受体。“去靶向”指重组病毒仅靶向配体的靶分子。
本申请中所指的gB特定氨基酸编号或区域是以gB的“前体”形式为参考的，如SEQID NO:1中所示例的，其包括包含前30个氨基酸的N-末端信号序列。gB的“成熟”形式从SEQID NO:1所示的氨基酸31开始并且延伸至氨基酸904。由于具有不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的gB糖蛋白也包括在本发明中，因而所指的与SEQ ID NO:1相关的特定氨基酸编号或特定氨基酸区域也指对应于SEQ ID NO:1的相应氨基酸编号或区域的同源gB的氨基酸编号或区域。
本申请中所提及的术语“重组”疱疹病毒是指已通过基因重组进行基因工程改造以包含编码异源多肽的另外的核酸序列的疱疹病毒。产生重组疱疹病毒的方法是本领域熟知的(参见例如Sandri-Goldin等，2006)。然而，本发明不仅限于基因工程方法。还可以使用其他方法分别产生异源多肽配体与gB融合的或者异源多肽配体插入gB的疱疹病毒。
用于本申请中的术语“嵌合糖蛋白B”或“嵌合gB”指异源多肽配体与其融合或者其中插入了异源多肽配体的gB。嵌合gB由重组病毒编码，由产生重组病毒的细胞合成，并且掺入病毒粒子的包膜中。通过基因工程产生重组病毒的方法是本领域公知的。用于产生嵌合糖蛋白B的方法是本领域公知的。
本申请中所涉及的术语“疱疹病毒”是指双链DNA病毒疱疹病毒科的成员，其导致潜伏性或裂解性感染。疱疹病毒均具有一个共同的结构，因为其基因组由编码80至200个基因的相对较大的(约100.000至200.000个碱基对)双链线形DNA构成，其被包裹在称为衣壳的二十面体蛋白笼中，衣壳本身被包裹在称为被膜的蛋白层中，被膜含有病毒蛋白和病毒mRNA以及称为包膜的脂质双层膜。这样的整个粒子也称为病毒粒子。术语“疱疹病毒”也指包含一个或多个突变基因的突变的疱疹病毒科成员，例如在实验室中修饰的疱疹病毒。
在一个优选的实施方式中，疱疹病毒选自下组：单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)、水痘带状疱疹病毒(人疱疹病毒3型(HHV-3))、猪α疱疹病毒伪狂犬病病毒(PRV)、黑猩猩α1疱疹病毒(ChHV)、狒狒疱疹病毒2型(HVP2)、猕猴疱疹病毒2型(CeHV2)、恒河猴疱疹病毒1型(MHV1)、猿猴疱疹病毒1型(HVS1)、金丝猴疱疹病毒3型(CalHV3)、猿猴疱疹病毒2型(HVS2)、牛疱疹病毒1型(BoHV-1)、牛疱疹病毒5型(BoHV-5)、马疱疹病毒1型(EHV-1)、马疱疹病毒2型(EHV-2)、马疱疹病毒5型(EHV-5)、犬疱疹病毒1型(CHV-1)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)、鸭肠炎病毒(DEV)、果蝠α疱疹病毒1型(FBAHV1)、牛疱疹病毒2型(BoHV-2)、兔疱疹病毒4型(LHV-4)、马疱疹病毒3型(EHV-3)、马疱疹病毒4型(EHV-4)、马疱疹病毒8型(EHV-8)、马疱疹病毒9型(EHV-9)、猕猴疱疹病毒9型(CeHV-9)、猪疱疹病毒1型(SuHV-1)、马立克氏病病毒(MDV)、马立克氏病病毒血清型2型(MDV2)、隼鸟疱疹病毒1型(FaHV-1)、禽疱疹病毒3型(GaHV-3)、禽疱疹病毒2型(GaHV-2)、肺-眼-气管疾病相关疱疹病毒(LETV)、禽疱疹病毒1型(GaHV-1)、鹦鹉疱疹病毒1型(PsHV-1)、人疱疹病毒8型(HHV-8)、人疱疹病毒4型(HHV-4)、海龟疱疹病毒5型(ChHV5)、侏猴疱疹病毒3型(AtHV3)或吐绶鸡疱疹病毒1型(MeHV-1)。在一个更优选的实施方式中，疱疹病毒是HSV-1或HSV-2，最优选的是HSV-1。
用于本申请中的术语“异源的”是指不由所述疱疹病毒基因组编码的多肽，或者任何其他疱疹病毒的多肽。优选地，术语“异源的”是指与携带配体的靶分子并且将被本发明所述的重组疱疹病毒感染的细胞结合的多肽。异源多肽可以是天然多肽或其一部分，或者是在自然界中不存在的人造多肽。
用于本申请中的术语“多肽”是由通过肽键连接的氨基酸组成的连续的非分支肽链。多肽链的长度没有限制，其范围可以为几个氨基酸(如5个氨基酸)至几百或几千个氨基酸。在本发明中，多肽可以用作配体或用作靶分子。链的长度取决于作为配体或靶分子的起始分子的分子。可以将一条以上多肽链组装成复合物(如抗体)。用于本申请中的术语“多肽”还包括多肽链的组装物。用于本申请中的术语“肽”是短多肽链，通常由少于约50个氨基酸残基组成，优选地由少于约40个氨基酸残基组成，或者更优选地由约10至约30个之间的氨基酸组成。最短长度是5个氨基酸残基。
术语“同源gB的对应区域”是指当使用Smith-Waterman算法以及下述比对参数：MATRIX：BLOSUM62，GAP OPEN：10，GAP EXTEND：0.5时，与如SEQ ID NO:1所示的gB的给定区域对齐的gB的区域。如果进行成对序列比较，这种算法通常是已知的并且是在现有技术中使用的，本领域技术人员知晓如何应用这种算法。如果在使用上述算法和参数时同源gB的序列仅与SEQ ID NO:1给定区域的一个或多个部分对齐，此时术语“对应区域”是指与SEQID NO:1给定区域的部分对齐的区域。在这种情况下，其中插入配体的同源gB中的区域仅包含与SEQ ID NO:1给定区域的部分对齐的氨基酸。术语“对应区域”还可以指与对应的侧翼序列侧接的区域，其中使用上述算法和参数，所述侧翼序列与侧接SEQ ID NO:1区域的序列对齐。这些侧翼序列的长度为至少5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50个氨基酸。可以使用的其他算法是Needleman和Wunsch，1970的算法，Pearson和Lipman，1988的相似性方法，或经Karlin和Altschul，1993改进的Karlin和Altschul，1990的算法，或者这些算法的计算机化实施。
术语“对应氨基酸”是指在对应区域内存在的氨基酸，并且其是比对中SEQ ID NO:1的给定氨基酸的对应物。对应氨基酸在比对中不必然与其SEQ ID NO:1中的对应物相同，只要其存在于对应区域内。
本申请中所提及的配体结合或能够结合细胞表面上可接近的靶分子。优选地，其特异性地结合或能够特异性结合细胞表面上可接近的靶分子，由此术语“特异性结合”是指一种结合反应，其中配体与感兴趣的特定靶分子结合，但是其在生物体中不与细胞上存在的其他分子或者配体可能接触的其他分子大量结合(少于10％)。“特异性结合”靶分子的配体通常对靶分子具有大于约105(例如，106、107、108、109、1010、1011、1012或者更高)摩尔/升的平衡亲和常数。优选地，配体介导病毒与细胞融合的能力，更优选地，其使得病毒随后进入细胞，以及甚至更优选地杀死细胞。应当理解的是，配体对人体无害。而且，配体不是疱疹病毒蛋白，或者不是来源于对疱疹病毒蛋白的修饰。
配体可以是能够与细胞上可接近的靶分子特异性结合的天然或人造多肽配体，优选地其中异源多肽配体能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子或存在于患病细胞上的靶分子结合。天然多肽配体是能够与靶分子结合的天然多肽。因此，配体可以是细胞上可接近的天然靶分子(如受体分子)的天然配体。此类配体的实例可以是细胞因子、趋化因子、免疫检查点阻断剂或生长因子。已知的实例是EGF和IL13。另选地，配体是与靶分子结合的抗体。再另选地，配体是经选择用于与人造靶分子结合的天然多肽，从而将所述靶分子设计为能够与配体结合。天然多肽可以来源于任何生物体，优选来自对人体无害的生物体。例如，天然多肽是真菌或细菌多肽，如来自酵母属(如酿酒酵母)的多肽。天然多肽的实例是GCN4酵母转录因子。人造多肽配体具有非天然存在的氨基酸序列，其功能是与特定靶分子结合。人造多肽配体的序列可以来源于经修饰(包括氨基酸的插入、缺失、替代和/或增加的天然多肽，从而保留对应天然多肽的结合能力。例如，配体可以是上文所提及的天然多肽的一部分，只要所述部分能够与对应的全长多肽结合的靶分子结合即可。另选地，天然多肽经修饰以与对应的天然多肽具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸同一性，从而经修饰的多肽保留对应天然多肽的活性，如与靶分子结合的活性。再另选地，人造多肽配体可以具有274个或更少的氨基酸残基，优选地少于200个氨基酸残基，更优选地少于50个氨基酸残基，甚至更优选地少于40个氨基酸残基，或者甚至更优选地10至30个之间的氨基酸，最优选地20个氨基酸，例如天然多肽的一部分或来自(随机)肽库的肽的一部分。再另选地，多肽是与靶分子结合的抗体衍生物或抗体模拟物。抗体、抗体衍生物或抗体模拟物可以是单特异性的(即，对细胞表面上可接近的一种靶分子具有特异性)或多特异性的(即，对相同或不同细胞表面上可接近的一种以上靶分子具有特异性)，例如双特异性的或三特异性的(例如，Castoldi等，2013，Castoldi等，2012)。通过同时靶向同一细胞上的一种以上靶分子增加了病毒的特异性。如果靶向不同细胞上存在的一种以上靶分子，则可以解决肿瘤的异质性。
本申请中所提及的术语“抗体衍生物”是指包含至少一个抗体可变结构域，但是不包含抗体的总体结构的分子。抗体衍生物仍然能够与靶分子结合。优选地，抗体衍生物介导病毒与细胞融合的能力，更优选地，其使得病毒随后进入细胞，以及甚至更优选地杀死细胞。所述衍生物可以是抗体片段，如Fab、Fab2、scFv、Fv或其部分，或者免疫球蛋白的其他衍生物或组合，如纳米抗体、双体、微抗体、骆驼单域抗体、单结构域或Fab片段、可变区的重链和轻链结构域(如Fd、VL，包括Vλ和Vκ，VH、VHH)以及由至少两个结构环连接的免疫球蛋白结构域的两条β链组成的微结构域。优选地，抗体衍生物是单链抗体，更优选地是scFv，其是由短接头肽连接的免疫球蛋白重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白。VH的N-末端与VL的C-末端连接或者VL的N-末端与VH的C-末端连接。
本申请中所提及的术语“抗体模拟物”是指与抗体一样能够与抗原特异性结合，但是在结构上与抗体无关的有机化合物。其通常是摩尔质量约3至20kDa的人造肽或蛋白。其可以具有治疗或诊断作用。抗体模拟物的非限制性实例是亲和体(affibody)、affilin、affimer、affitin、抗运载蛋白(anticalin)、高亲合性多聚体(avimer)、DARPin、fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体(monobody)、蛋白A的Z结构域、γB结晶、泛素、胱抑素、来自嗜酸热硫化叶菌的Sac7D、脂质运载蛋白、膜受体的A结构域、锚蛋白重复序列模体(ankyrinrepeat motive)、Fyn的SH3结构域、蛋白酶抑制剂的Kunits结构域、纤连蛋白的第10个III型结构域、合成异二价或异多价配体(Josan等，2011，Xu等，2012，Shallal等，2014)。
本申请中所提及的术语“异源多肽配体”或“配体”包括一种或一种以上配体，如2、3或4个配体。这是指重组疱疹病毒可以包含一种配体或者可以包含一种以上配体。存在一种配体使得对一种靶细胞类型实现靶向。如果存在一种以上配体，则配体可以融合至或插入一个gB，位于gB分子中的不同位点上或同一位点上(即，连续地)，或者配体可以融合至或插入不同gB。另选地，如果存在一种以上配体，则gB以外的疱疹病毒的糖蛋白(如gD和/或gH)可以包含第二个或更多个配体。不同配体可以靶向相同靶细胞或不同靶细胞上存在的不同靶分子，优选地靶向不同靶细胞上存在的不同靶分子。与上文类似，本申请中所提及的术语“靶分子”包括一种或一种以上靶分子，如2、3或4种靶分子。因此，重组疱疹病毒可以与一种靶细胞结合或者可以与一种以上靶细胞(如2、3或4种不同细胞)结合。
在本发明的优选实施方式中，异源多肽配体是人造多肽，优选地是scFv，其能够与患病细胞上的天然受体结合，优选地与肿瘤细胞上的天然受体结合，更优选地与表达HER2的肿瘤细胞，如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、骨肉瘤细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞或唾液腺肿瘤细胞上的天然受体结合。在一个更优选的实施方式中，异源多肽配体是能够与HER2结合的scFv。在最优选的实施方式中，异源多肽配体是如SEQ ID NO:32所示的scFv。
在本发明另外的或另选的优选实施方式中，异源多肽配体是人造多肽，优选地是天然多肽的一部分，其能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的人造靶分子结合。配体的长度更优选地少于约50个氨基酸残基，甚至更优选地少于约40个氨基酸残基，甚至更优选地在约10个至约30个氨基酸之间，或者最优选地为20个氨基酸。将配体和靶分子特异性地构建成彼此之间结合。更优选地，异源多肽配体是GCN4酵母转录因子的一部分。甚至更优选地，异源多肽配体是GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:37的部分，最优选地，配体是如SEQ ID NO:37的序列所示的分子。在一个另选的实施方式中，配体可以是如SEQ ID NO:38的序列所示的分子。
在本发明的一个更优选的实施方式中，将如上文所述的优选实施方式的和另选的优选实施方式组合。即，本发明的重组疱疹病毒同时包含两种异源多肽配体，一种能够与患病细胞结合，一种能够与细胞培养物中存在的细胞结合。
作为融合至或插入gB的多肽配体的GCN4酵母转录因子是现有技术(参见例如，Arndt和Fin，1986；Hope和Struhl，1987)。示例性的GCN4酵母转录因子如SEQ ID NO:43所示(UniProtKB–P03069(GCN_YEAST))，其由AJ585687.1(SEQ ID NO:42)编码。本申请中所提及的术语“GCN4酵母转录因子”是指在自然界中存在的任何GCN4酵母转录因子。另选地，本申请中所提及的GCN4酵母转录因子是指与SEQ ID NO:43的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性的任何GCN4酵母转录因子。另选地，本申请中所提及的GCN4酵母转录因子是指与SEQ ID NO:43具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸同源性的任何GCN4酵母转录因子。如果一种GCN4酵母转录因子与SEQ ID NO:43具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，如果其与SEQ ID NO:43具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸同源性，或者其与如SEQ ID NO:43所示的GCN4酵母转录因子具有相同活性，则该GCN4酵母转录因子是“同源性的”或“同源物”。优选地，“相同活性”可以理解为GCN4酵母转录因子与如SEQ ID NO:43所示的GCN4酵母转录因子以相同方式作为转录因子工作。术语“其部分”包括针对其可以产生“其部分”能够结合的靶分子的GCN4酵母转录因子的任何部分。优选地，“其部分”的长度是使得配体长度为274个氨基酸或更小的长度，优选地使得配体长度少于200个氨基酸残基，更优选地少于50个氨基酸残基，甚至更优选地少于40个氨基酸残基，甚至更优选地在约10个至约30个氨基酸之间，或者甚至更优选地为20个氨基酸残基，同时配体可以包含另外的序列，如接头序列。最优选的“其部分”是GCN4酵母转录因子的序列YHLENEVARLKK(SEQ ID NO:38)，其两侧可以各加上一个侧翼wt(野生型)GCN4残基。为了融合至或插入gB，在肽的两侧可以各自再存在一个GS接头。这种构建体在本申请中称为GCN4肽(SEQ ID NO:37)。这种20个氨基酸的肽使得疱疹病毒具有在细胞系中感染和复制的能力，所述细胞系携带与“其部分”结合的靶分子。
在本发明的重组疱疹病毒中，配体可以在gB的氨基酸43和44之间融合至或插入gB，其对应于成熟gB(SEQ ID NO:2)的氨基酸13和14。在此上下文中，本申请中所提及的术语“融合的”或“融合”是指通过肽键直接地或经由肽接头间接地将多肽配体加至gB的N-末端氨基酸。“融合的”或“融合”至N-末端区域不同于“插入”，因为“融合的”或“融合”指加至gB的末端，而“插入”指掺入gB。
本申请中所提及的肽接头用于连接多肽内来自不同来源的多肽序列。此类接头用于将异源多肽配体与糖蛋白B序列连接并使其正确折叠，或者连接异源多肽配体内的配体部分。其还可以用于将配体序列与除gB之外的糖蛋白序列连接。接头的长度通常为1至30个氨基酸之间，优选地为5至25个氨基酸，更优选地为8至20个氨基酸，如8、12或20个氨基酸，并且可以包含任何氨基酸。优选地，其包含氨基酸Gly和/或Ser和/或Thr，更优选地其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个选自下组的氨基酸：Gly、Ser和/或Thr。最优选地，其由氨基酸Gly和/或Ser组成。基于Gly和/或Ser的接头提供了柔性、良好的溶解性以及对蛋白水解作用的抗性。另选地，接头可以不主要包含甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸，而是甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸可以不存在或仅以很小的程度存在。
在本发明的重组疱疹病毒中，配体可以另选地在gB无序区域内的任何氨基酸处插入，从而配体不在如SEQ ID NO:1所示的gB的跨氨基酸77至88的区域内，或同源gB的对应区域内的任何氨基酸处插入。然而，可以将不超过120个氨基酸的较短长度的配体插入如SEQID NO:1所示的gB的跨氨基酸77至88的区域内，或同源gB的对应区域内。本申请中所提及的无序区域意指包含缺乏固定的三级结构的区域，其是非结构化的，且因此不适于在晶体结构中解析。通常，无序区域是延伸的(即，无规则卷曲样)或折叠的(即，熔球样)。在Gallagher等，2014、Heldwein等，2006和Lin等，2007中提及了gB中的无序结构，并且该结构可以存在于HSV gB的N-末端区域(从氨基酸31延伸至108)、中心区域(从氨基酸460延伸至491)和C-末端区域(从氨基酸796延伸至904)(Heldwein等，2006)。所提及的无序的位置是HSV-1gB的氨基酸31至108(N-末端区域)(Lin等，2007)、氨基酸460至491(中心区域)(Heldwein等，2006)和氨基酸796至904(C-末端区域)(Heldwein等，2006，Lin等，2007)。优选地，将配体插入如SEQ ID NO:1所示的gB的跨氨基酸31至108或460至491的区域内，或同源gB的对应区域内的任何氨基酸处。配体不插入如SEQ ID NO:1所示的gB的跨氨基酸77至88的区域内，或同源gB的对应区域内。然而，可以将不超过120个氨基酸的较短长度的配体插入如SEQ ID NO:1所示的gB的跨氨基酸77至88的区域内，或同源gB的对应区域内。
配体可以另选地在如SEQ ID NO:1所示的gB的跨氨基酸31至77或88至184，优选地氨基酸31至77或88至136或更优选地31至77或88至108，或者跨氨基酸409至545，优选地氨基酸459至545，更优选地氨基酸459至497或甚至更优选地氨基酸460至491的区域内，或同源gB的对应区域内的任何氨基酸处插入。而且，可以将不超过120个氨基酸的较短长度的配体插入如SEQ ID NO:1所示的gB的跨氨基酸77至88的区域内，或同源gB的对应区域内。这些区域包括位于gB的无序区域内的氨基酸，然而还包括位于无序区域附近的氨基酸。如上所述，已发现这些区域接纳多肽插入，从而保持gB作为融合剂的能力，所述融合剂介导携带gB的细胞与受体的膜融合(Gallagher等，2014；Lin和Spear，2007；Potel等，2002)。
本申请中所提及的术语“插入的”或“插入”，在表达将所述肽插入gH时，意思是指将多肽配体掺入gB，其中通过肽键直接地或经由一个或多个肽接头(更具体地经由位于插入物的上游和/或下游的肽接头)间接地将要掺入的多肽引入gB的两个氨基酸之间。接头直接与多肽配体连接。还可以把多肽配体与gB的融合视为将多肽配体序列在紧邻gB的氨基酸1之前插入gB前体(如SEQ ID NO:1所示例的或同源gB)；在本申请中将这样的插入称为融合。在本申请中将携带融合或插入的多肽的gB称为嵌合gB。嵌合gB是病毒粒子包膜的一部分。“接头”的定义如上文所述。
插入和融合优选地通过对HSV基因组中的gB基因进行基因工程改造实现。HSV基因组的基因工程改造是本领域已知的，例如但不限于BAC技术。
本发明人已发现在gB氨基酸77至88的区域内的氨基酸处插入异源多肽配体(如SEQ ID NO:3所示例的，其中针对HER2的scFv在氨基酸81和82之间插入)不会导致重组疱疹病毒重新靶向携带所述配体的受体的细胞。本发明人认为没有重新靶向的原因是在该区域内存在富含脯氨酸的区域(PPPPXP)和预测的N-糖基化位点(NAT)。由于脯氨酸破坏蛋白二级结构和/或采用其自身的具有受限制的φ角二级结构，其覆盖其他形式的二级结构(Morgan和Rubistein，2013)，并且由于多脯氨酸螺旋能够引起局部几何形状中的急转弯，该区域中的多脯氨酸伸展可能限制了配体采用的构象。此外，该区域的N-糖基化位点可能屏蔽了配体。因此，配体可能不足以用于与其细胞表面上的受体相互作用。而且，本发明人还发现，如果异源多肽配体的长度较短，则在gB跨氨基酸77至88的区域内的任何氨基酸处插入异源多肽配体均导致重组疱疹病毒重新靶向携带所述配体的受体的细胞。因此，本发明提供了一种重组疱疹病毒，所述重组疱疹病毒包含异源多肽配体，所述异源多肽配体能够与靶分子结合并且插入存在于所述疱疹病毒的包膜中的糖蛋白B(gB)，其中所述配体的长度较短并且在如SEQ ID NO:1所示的gB跨氨基酸77至88的区域内或同源gB的对应区域内的任何氨基酸处插入。“较短长度”指不超过120个氨基酸的长度，如5至120个氨基酸，5至110、5至100、5至90、5至80、5至70、5至60、5至50、5至40、5至30、5至25、10至30、10至20、20至12个氨基酸。优选地，配体的长度为10至30个氨基酸，更优选地配体的长度为12至20个氨基酸，甚至更优选地配体为12或20个氨基酸。插入可以在氨基酸77至88之间的任何氨基酸处，如在氨基酸77、78、79、80、81、82、83、84、85、86或87之后。优选地，配体在氨基酸81和82之间插入。将上文所示长度的配体的任意组合插入上文所述的任何氨基酸之后均导致疱疹病毒重新靶向配体的靶分子。优选地，异源多肽配体可以是能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的天然多肽的一部分，如GCN4酵母转录因子的一部分，如GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:37的部分。最优选地，配体是如SEQ ID NO:37的序列所示的分子。此类配体可以插入跨氨基酸77至88的区域内的任何氨基酸处，优选地在氨基酸81和82之间。最优选地，配体是如SEQ ID NO:37的序列所示的分子，其插入gB的氨基酸81和82之间。氨基酸编号指SEQ ID NO:1或同源gB的对应氨基酸。
用于本申请中的靶分子可以是在细胞表面上可接近的并且可以与异源多肽配体结合的任何分子。靶分子可以是天然分子，如多肽或蛋白、糖脂或糖苷。例如，靶分子可以是受体，如蛋白受体。受体是嵌入细胞膜中的分子，其经由与配体结合接收来自外部的化学信号，引起某些形式的细胞应答。另选地，靶细胞可以是存在于细胞表面上作为药物靶点的分子，如酶、转运蛋白或离子通道。优选地，靶分子存在于患病细胞上或细胞培养物中存在的细胞上。优选的靶分子是如下文所述的以特异或异常的方式天然存在于生物体的患病细胞上的分子。“特异性方式”可以理解为靶分子在患病细胞上过表达，但是其在正常细胞上不表达或仅以很小的程度表达(即，以其在相应正常细胞上通常存在的程度表达)。“异常方式”可以理解为与相应的非患病细胞的相应分子相比，靶分子以突变形式存在于患病细胞上。因此，疱疹病毒重新靶向靶分子(如特异性表达的或突变的靶分子)导致携带靶分子的细胞与未携带靶分子或者以较低水平携带靶分子或携带野生型(未突变的)靶分子的细胞相比具有更高的感染和杀灭率。
另选地，靶分子可以是人造分子。本申请中所提及的术语“人造靶分子”是非天然存在(即具有非天然氨基酸序列)的分子。这样人造分子可以构建成在细胞表面上表达(如例如Douglas等，1999；和Nakamura等，2005中所述的)，或者其可以结合细胞表面。人造靶分子具有起到与特定配体结合作用的非天然存在的氨基酸序列。人造靶分子的实例是抗体衍生物或抗体模拟物。人造靶分子优选地存在于细胞培养物中存在的细胞表面上，所述细胞可以用于生产重组疱疹病毒。存在于细胞培养物中存在的细胞上的优选的人造靶分子是scFv。在人造靶分子的上下文中，术语“人造靶分子”包含抗体，所述抗体可以存在于细胞培养物中存在的细胞上，所述细胞非天然地产生所述抗体。
在一个优选的实施方式中，靶分子是肿瘤相关受体，优选地是EGF受体家族的成员，包括HER2、EGFR、EGFRIII或EGFR3(ERBB3)、EGFRvIII、MET、FAP、PSMA、CXCR4、CEA、CADC、粘蛋白、叶酸结合蛋白、GD2、VEGF受体1和2、CD20、CD30、CD33、CD52、CD55、整合素家族、IGF1R、Ephrin受体家族、蛋白-酪氨酸激酶(TK)家族、RANKL、TRAILR1、TRAILR2、IL13Rα、UPAR、腱生蛋白、PD-1、PD-L1、CTL-A4、其他免疫检查点家族调控因子的成员、肿瘤相关糖蛋白72、神经节苷酯GM2、A33、Lewis Y抗原或MUC1，最优选地是HER2。优选地，靶分子是HER2，其由一些肿瘤细胞(如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、骨肉瘤细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞或唾液腺肿瘤细胞)过表达，但在非恶性组织中以非常低的水平表达。肿瘤相关受体是由肿瘤细胞以特异或异常方式表达的受体。另选地，靶分子是来源于感染了细胞的感染因子(如病原体，例如病毒、细菌或寄生虫)的分子。靶分子在受感染细胞的表面上表达(如来自HBV的HBsAg、来自HIV的gpl20、来自HCV的E1或E2、来自EBV的LMP1或LMP2)。病原体可以导致感染性疾病，如慢性感染性疾病。再另选地，靶分子由退行性病症相关细胞或由衰老细胞表达，如CXCR2或IL-1受体。在另一个优选的实施方式中，靶分子是抗体衍生物，更优选地是scFv，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的部分结合的scFv，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:37的部分结合的scFv，甚至更优选地是包含SEQ ID NO:39的scFv，最优选地是由SEQ ID NO:41的序列所示的分子。
本申请中所提及的术语“细胞”是携带靶分子且能够被本发明的重组疱疹病毒感染的任何细胞。细胞可以是不被需要的并且应当被消除的天然存在的细胞，如患病细胞。患病细胞的实例如下文所示。优选的患病细胞是包含HER2的细胞。另选地，细胞可以是用于生产重组疱疹病毒的细胞。此类细胞可以是能够被本发明的重组疱疹病毒感染并能够生产疱疹病毒的任何细胞。而且，应当避免疱疹病毒在患病细胞中的繁殖，以避免引入患病细胞(如在人体中的肿瘤细胞)的物质，如DNA、RNA和/或蛋白，因此，用于生产疱疹病毒的细胞是在人体中存在时无害的细胞(例如，非患病细胞)。为了生产重组疱疹病毒，细胞存在于细胞培养物中。因此，用于生产重组疱疹病毒的细胞在本申请中称为“细胞培养物中存在的细胞”。因此，细胞可以是适于疱疹病毒生长的培养细胞，优选地，细胞是批准用于疱疹病毒生长的细胞系。此类细胞的实例是Vero、293、293T、HEp-2、HeLa、BHK或RS细胞，优选地是Vero细胞。优选地，细胞培养物中存在的细胞经修饰以表达不由对应的亲代细胞天然表达的靶分子，或者细胞培养物中存在的细胞经修饰并且在其表面上与靶分子结合。更优选地，细胞包含抗体衍生物，甚至更优选地scFv，甚至更优选地能够与GCN4酵母转录因子的一部分结合的scFv，甚至更优选地能够与GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:37的部分结合的scFv，甚至更优选地包含SEQ ID NO:39的scFv，最优选地如SEQ ID NO:41的序列所示的分子，作为靶分子。
“培养的”细胞是存在于本领域已知的维持和增殖的体外细胞培养物中的细胞。培养的细胞在受控条件下生长，通常是在其天然环境以外。通常，培养的细胞来源自多细胞真核生物，特别地为动物细胞。“批准用于疱疹病毒生长的细胞系”意指包括已显示出其能够被疱疹病毒感染(即，病毒进入细胞)并且能够增殖和生产病毒的任何细胞系。细胞系是来源自单一细胞并且含有相同遗传组成的细胞群。优选的用于重组疱疹病毒的增殖和生产的细胞是Vero、293、293T、HEp-2、HeLa、BHK或RS细胞。
用于本申请中的术语“患病细胞”是指对生物体具有负面影响并且因此不被需要的细胞。消灭此类细胞是需要的，因为将其杀死可以挽救生命或增强生物体的健康。在一个优选的实施方式中，患病细胞的特征是异常生长，更优选地，细胞是肿瘤细胞。在一个另选的优选实施方式中，细胞是被感染细胞(如慢性感染的细胞)、退行性病症相关的细胞或衰老细胞。
在肿瘤细胞的情况下，潜在疾病是肿瘤，优选地选自下组：肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/CNS肿瘤、乳腺癌、原发灶不明癌症、卡斯尔曼病、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾癌、喉和下咽癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤-成人软组织癌、皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔姆斯肿瘤。优选的肿瘤疾病是HER2-阳性癌症(如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、头颈癌、骨肉瘤和多形性胶质母细胞瘤)、EGFR-阳性癌症(如头颈癌、多形性胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌和胰腺癌)、EGFR-vIII-阳性癌症(如多形性胶质母细胞瘤)、PSMA-阳性癌症(如前列腺癌)、CD20+阳性淋巴瘤和EBV相关肿瘤(如B细胞淋巴增殖性病症，如伯基特淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤和免疫受损个体中出现的淋巴瘤(移植后和HIV相关的淋巴增殖性病症))、T细胞淋巴增殖性病症、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、淋巴结外鼻型自然杀伤/T细胞淋巴瘤。
在受感染细胞的情况下，潜在疾病是感染性疾病，如慢性感染性疾病，其中感染因子可以是病毒、细菌或寄生虫。实例是结核病、疟疾、慢性病毒性肝炎(HBV、丁型肝炎病毒和HCV)、获得性免疫缺陷综合征(艾滋病，由人类免疫缺陷病毒HIV引起)、EBV相关病症或HCMV相关病症。
在退行性病症相关细胞的情况下，潜在疾病可以是阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化(ASL)、卢伽雷氏(Lou Gehrig)病、骨关节炎、动脉粥样硬化、进行性腓骨肌萎缩病(Charcot Marie Tooth disease)(CMT)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性创伤性脑病、糖尿病、埃勒斯-当洛斯综合征、特发性震颤、弗里德希氏共济失调、亨廷顿病、炎性肠病(IBD)、圆锥角膜、球状角膜、黄斑变性、马凡综合征、多发性硬化、多系统萎缩、肌肉萎缩症、尼曼皮克病、骨质疏松症、帕金森病、进行性核上性麻痹、前列腺炎、色素性视网膜炎、类风湿性关节炎或泰-萨克斯病。术语“退行性病症相关细胞”是指与所述病症有关的细胞，意思是细胞的改变促进疾病的发展或者疾病导致了细胞的改变。破坏所述细胞使疾病得到治疗。
在衰老细胞的情况下，潜在疾病是衰老相关疾病，如(i)称为早衰综合征的罕见遗传性疾病，其特征是过早的老化：沃纳综合征(WS)、布卢姆综合征(BS)、罗斯蒙德-汤姆森综合征(RTS)、科凯恩综合征(CS)、色素性干皮病(XP)、毛发硫营养不良或哈钦森-吉尔福德早衰综合征(HGPS)或(ii)常见年龄相关病症，如肥胖、2型糖尿病、肌肉减少症、骨关节炎、特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病、白内障、神经退行性疾病、系统性自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎或舍格伦综合征)或多发性硬化症。
除了嵌合gB以外，本发明的重组疱疹病毒可以包含经修饰的gD糖蛋白，如WO2009/144755中所公开的，但不限于这些修饰类型。经修饰的gD可以携带成熟gD的氨基酸部分6至38的缺失(如SEQ ID NO:5所示例的；示例性的gD野生型前体序列如SEQ ID NO:4中所示)。另选地，经修饰的gD可以携带其他修饰，其将疱疹病毒的嗜性自天然受体粘连蛋白-1和HVEM去靶向。另选地或除了对疱疹病毒的嗜性去靶向的修饰以外，gD可以编码将疱疹病毒的嗜性变更为所选择的选定受体的另外的序列，所述选定受体是患病细胞上的受体，如HER2受体，如在重组R-LM113(SEQ ID NO:6)中所描述的。gD的修饰通过将如本申请所定义的异源多肽配体融合至或插入gD来实现。除了嵌合gB以外，本发明的重组疱疹病毒可以包含经修饰的gH糖蛋白，其能够将gH重新靶向至靶受体分子，所述经修饰的gH糖蛋白包含如本申请所定义的异源多肽配体。除了嵌合gB以外，本发明的重组疱疹病毒可以包含经修饰的gD和经修饰的gH糖蛋白，如Gatta等，2015所公开的，但不限于这些描述。这两篇文献均通过引用并入本申请。gD和/或gH的修饰将疱疹病毒的嗜性变更为如本申请所定义的患病细胞。
因此，在本发明的一个实施方式中，本发明的重组疱疹病毒包含嵌合gB，所述嵌合gB包含与细胞(如患病细胞(例如表达HER2的细胞)或存在于培养物中的细胞)上可接近的靶分子结合的配体，以及经修饰的gD，其中所述修饰可以缺失氨基酸6至38。另选地或另外地，可以通过插入如本申请所定义的能够将疱疹病毒重新靶向患病细胞的异源多肽配体对gD进行修饰。另外地或另选地，重组疱疹病毒可以包含经修饰的gH，所述经修饰的gH包含如本申请所定义的能够将疱疹病毒重新靶向患病细胞的异源多肽配体。
此外，本发明人已经发现，gD对于如SEQ ID NO:62所示的成熟gD缺失氨基酸30至38或其子集，或者缺失同源gD的对应区域，导致重组疱疹病毒自未经修饰的gD的天然受体去靶向。因此，在本发明的一个实施方式中，重组疱疹病毒包含如本申请所定义的异源多肽配体，所述异源多肽配体融合至或插入如本申请所定义的gB并且重新靶向至所述配体的靶分子，并且包含gD，所述gD对于如SEQ ID NO:62所示的成熟gD缺失氨基酸30至38或其子集，或者缺失同源gD的对应区域，对于如SEQ ID NO:62所示的成熟gD，优选地缺失氨基酸30和/或38或同源gD的对应区域，更优选地缺失氨基酸30和38或同源gD的对应区域。
可以插入如本申请所定义的异源多肽配体替代缺失的氨基酸30至38或其子集，使得重组疱疹病毒自未经修饰的gD的天然受体去靶向并且重新靶向配体的靶分子。除了用异源多肽配体替代子集之外，可以缺失位于氨基酸30至38内的另外的氨基酸或一系列氨基酸。因此，在一个优选的实施方式中，氨基酸30和38缺失并且插入异源多肽配体替代氨基酸30或38。更优选地，氨基酸30和38缺失并且插入异源多肽配体替代氨基酸38。
术语“其子集”指由氨基酸30至38组成的区域中的一个氨基酸或者至少2个，如2、3、4、5、6、7或8个相邻的氨基酸。因此，“其子集”可以指氨基酸30、31、32、33、34、35、36、37或38、30至31、30至32、30至33、30至34、30至35、30至36、30至37、30至38、31至32、31至33、31至34、31至35、31至36、31至37、31至38、32至33、32至34、32至35、32至36、32至37、32至38、33至34、33至35、33至36、33至37、33至38、34至35、34至36、34至37、34至38、35至36、35至37、35至38、36至37、36至38、37至38。术语“子集”可以包含一个或多个子集，如2、3、4或5个子集。例如，“子集”可以包含氨基酸30和氨基酸38，其缺失导致gD中不包含氨基酸30和38。缺失氨基酸30至38的子集或全部导致的gD的粘连蛋白-1结合位点失活从而降低了gD与粘连蛋白-1的结合能力和/或gD的HVEM结合位点失活从而降低了gD与HVEM的结合能力的。例如，如果氨基酸30缺失，则gD的HVEM结合位点失活，同时缺失氨基酸38导致粘连蛋白-1结合位点失活。缺失氨基酸30和38导致HVEM结合位点和粘连蛋白-1结合位点失活。
替代氨基酸30至38或其子集插入的异源多肽配体可以是能够与存在于患病细胞上的靶分子结合的配体，优选地是能够与癌细胞上存在的靶分子结合的scFv，如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、骨肉瘤细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞或唾液腺肿瘤细胞，如HER2，更优选地是如SEQ ID NO:32所示的scFv，其中靶分子是在表达HER2的肿瘤细胞上存在的HER2。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，将能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的异源多肽配体在氨基酸43和44之间插入gB，并且插入能够与存在于患病细胞上的靶分子结合的异源多肽配体，替代gD的氨基酸38，所述gD还缺失氨基酸30。最优选地，能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的异源多肽配体包含如SEQID NO:37所示的序列，靶分子是具有如SEQ ID NO:41所示序列的分子，细胞培养物中存在的细胞表达如SEQ ID NO:41的序列所示的分子，能够与患病细胞上存在的靶分子结合的异源多肽配体包含如SEQ ID NO:32所示的scFv，靶分子是HER2，并且细胞是表达HER2的肿瘤细胞，优选乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、骨肉瘤细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞或唾液腺肿瘤细胞。
此外，公开的是一种重组疱疹病毒，所述重组疱疹病毒包含gD，所述gD对于如SEQID NO:62所示的成熟gD缺失氨基酸30至38或其子集，优选地缺失氨基酸30和/或38，更优选地缺失氨基酸30和38，或者缺失同源gD的对应区域。可以插入如本申请所定义的异源多肽配体替代缺失的氨基酸30至38或其子集，使得重组疱疹病毒自未经修饰的gD的天然受体去靶向并且重新靶向配体的靶分子。除了用异源多肽配体替代缺失的氨基酸或一系列氨基酸之外，可以缺失氨基酸30至38内另外的氨基酸或一系列氨基酸。因此，例如缺失氨基酸30和38并且插入异源多肽配体替代氨基酸30或38。例如，缺失氨基酸30和38并且插入异源多肽配体替代氨基酸38。
关于gD的氨基酸编号是指如SEQ ID NO:62所示的成熟gD或同源gD的对应氨基酸。因此，对于如SEQ ID NO:62所示的成熟gD的氨基酸30对应于如SEQ ID NO:4(前体形式)所示的氨基酸55，对于如SEQ ID NO:62所示的成熟gD的氨基酸38对应于如SEQ ID NO:4(前体形式)所示的氨基酸63。关于gB的氨基酸编号是指如SEQ ID NO:1(前体形式)所示的gB或同源gB的对应氨基酸。
在疱疹病毒科α亚家族的一些成员中发现了gD同源物。因此，本申请中所涉及的术语“同源gD”是指见于疱疹病毒科的gD编码成员中的任何gD同源物。另选地，本申请中所涉及的同源gD是指与SEQ ID NO:4或62的序列分别具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性的任何前体gD或成熟gD。另选地，本申请中所涉及的同源gD是指与SEQ ID NO:4或62分别具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸同源性的任何前体gD或成熟gD。本申请中所涉及的同源gD还包括gD的片段。优选地，本申请中所涉及的同源gD包括见于疱疹病毒科中的任何gD，与SEQ ID NO:4或62的序列分别具有如上文所定义的氨基酸同一性或同源性的任何前体gD或成熟gD，以及与如SEQ ID NO:4或62所示的gD具有相同活性的任何gD的片段。更优选地，在病毒进入细胞的过程中，gD与其受体之一结合，从而甚至更优选地与gH/gL异二聚体相互作用，其甚至更优选地导致富含gD结构域的移出。
另外，本发明的重组疱疹病毒可以编码刺激针对细胞(优选如上文所定义的患病细胞)的宿主免疫应答的一种或多种分子。刺激宿主免疫应答的分子也称为“免疫治疗分子”。因此，本发明的重组疱疹病毒可以是复合的溶瘤和免疫治疗病毒。免疫治疗病毒是编码增强针对细胞的宿主免疫应答的分子的病毒，即刺激宿主免疫应答以使其直接针对细胞的病毒。此类病毒的实例是T-VEC(Liu等，2003)。
除了嵌合gB以外的免疫治疗分子也使得重组病毒能够经由异源多肽配体特异性靶向和杀死细胞，除此之外，还使得重组病毒能够以特异性或非特异性的方式刺激对象的免疫系统。通过重组病毒在对象中表达免疫治疗分子能够诱导免疫应答，其最终导致杀死患病细胞。免疫疗法可以特异性发挥作用，其中免疫治疗分子针对细胞上存在的一种或几种特异性抗原刺激对象的免疫系统。例如，免疫治疗分子可以是针对特异性细胞表面受体(例如，CD20、CD274和CD279)的抗体。一旦与抗原结合，抗体能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，激活补体系统或阻止受体与其配体相互作用。这些均导致细胞死亡。优选的细胞是肿瘤细胞。这种技术是本领域已知和已批准的。有多种批准用于治疗癌症的抗体，包括阿仑单抗、伊匹单抗、纳武单抗、奥法木单抗和利妥昔单抗。另选地，免疫治疗分子可以通过刺激对象的免疫系统而非特异性地发挥作用。特别地，免疫治疗分子的实例是细胞因子、趋化因子或免疫检查点调控因子。例如，一些细胞因子具有增强抗肿瘤活性的能力并且能够用作被动癌症治疗。细胞因子作为免疫治疗分子的用途是本领域已知的。细胞因子的实例是GM-CSF、白介素-2、白介素-12或干扰素-α。GM-CSF用于例如治疗激素难治性前列腺癌或白血病。白介素-2用于例如治疗恶性黑色素瘤和肾细胞癌。IL-12用于胶质母细胞瘤的实验性治疗。干扰素-α例如用于治疗毛细胞白血病、AIDS相关的卡波西肉瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病和恶性黑色素瘤。
本发明的重组疱疹病毒可以是减毒的，例如通过缺失或改变已知减弱病毒毒力的基因，如病毒基因y134.5、UL39和/或ICP47。术语“减毒的”是指毒力减弱或降低的疱疹病毒。优选的是条件性减毒，其中减毒仅影响非患病细胞。更优选地，仅患病细胞(如肿瘤细胞)受到疱疹病毒完全毒力的影响。例如，通过用专门在患病细胞中表达的人基因的启动子(例如，肿瘤细胞中的存活素启动子)取代y134.5、UL39和/或ICP47基因的启动子区，能够实现条件性减毒。用于条件性减毒的进一步修饰可以包括用专门在患病细胞中表达的基因的启动子区(例如，存活素启动子)取代负责IE基因(即刻早期基因(immediate early gene))转录的调控区，如ICP-4启动子区。这种变化将导致条件性复制的HSV，其能够在患病细胞中而非正常细胞中复制。对病毒的另外的修饰可以包括将响应富含于正常细胞而非肿瘤细胞的微RNA(miR)的序列元件插入必需HSV基因(如ICP4)的3’非翻译区。其也产生仅在正常细胞中无法复制的病毒。
在第二个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的重组疱疹病毒和药学上可接受的运载体，任选地另包含刺激针对细胞(优选如上文所定义的患病细胞)的宿主免疫应答的一种或多种分子。本发明的重组疱疹病毒可以用作药物。为了产生药物，疱疹病毒必须为药物剂型，所述药物剂型包含本发明的重组疱疹病毒和成分的混合物，如提供所需特性的药学上可接受的运载体。药物组合物包含本领域技术人员已知的一种或多种适宜的药学上可接受的运载体。药物组合物可以另包含刺激针对细胞的宿主免疫应答的一种或多种分子。刺激针对细胞的宿主免疫应答的一种或多种分子的定义参见上述本发明的第一个方面。
可以制备用于系统、鼻腔、胃肠外、阴道、局部、阴道、瘤内施用的药物组合物。胃肠外施用包括皮下、皮内、肌内、静脉内或腹腔内施用。
药物组合物可以制成各种剂型，包括用于口服施用的固体剂型(如胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒)、用于口服施用的液体剂型(如药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬剂、糖浆剂和酏剂)、可注射制剂(例如无菌可注射水性或油性混悬剂)、用于直肠或阴道施用的组合物(优选栓剂)，以及用于局部或透皮施用的剂型(如软膏、糊剂、乳膏、乳液、凝胶、粉末、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片)。
任何特定对象的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括本发明的重组疱疹病毒的活性，剂型，对象的年龄、体重和性别，治疗持续时间等医药领域熟知的因素。
以单剂量或多剂量向对象施用的本发明化合物的总剂量可以是例如103至1010的量。单剂量组合物可以含有该剂量或其约数以构成日剂量。重组疱疹病毒的剂量可以定义为噬菌斑形成单位(pfu)的数目。剂量的实例包括103、104、105、106、107、108、109或1010。
本发明的重组疱疹病毒用于治疗疾病，其中患病细胞在其表面上表达特异性靶分子，以使得所述靶分子可以从细胞外接近，所述靶分子不是由正常细胞产生的或者是由正常细胞以较低程度产生。正常细胞可以是相应的正常细胞。“相应的”指患病细胞和正常细胞是相同来源的，但是由于疾病产生的影响使得细胞发展成了患病细胞，而同一来源的其他细胞仍是健康的。
在第三个方面，本发明提供了本发明的重组疱疹病毒，任选地与刺激针对细胞(优选如上文所定义的患病细胞)的宿主免疫应答的一种或多种分子联合施用，用于治疗肿瘤、感染、退行性病症或衰老相关疾病。本发明的重组疱疹病毒和刺激针对细胞的宿主免疫应答的分子能够存在于同一药物组合物中或不同药物组合物中。如果其存在于不同药物组合物中，则其可以同时施用或以疱疹病毒先于分子或分子先于疱疹病毒的顺序依次施用。疱疹病毒或分子可以以不同频率和/或在不同时间点施用。然而，联合治疗包含以能够同时治疗疾病的时间间隔和/或时间点施用疱疹病毒和分子。
本发明还公开了一种通过施用药学有效量的本发明的重组疱疹病毒来治疗患有肿瘤、感染、退行性病症或衰老相关病症的对象的方法。
本发明的重组疱疹病毒可以与其他治疗联合向对象施用，所述其他治疗刺激针对细胞(优选患病细胞)的宿主免疫应答和/或用于治疗对象的特定疾病。此类其他治疗可以包括其他药物、化疗、放疗、免疫疗法、联合病毒疗法等。
本发明还公开了本发明的疱疹病毒的用途，任选地与刺激针对细胞(优选患病细胞)的宿主免疫应答的一种或多种分子联合，用于制备用于治疗肿瘤、感染、退行性病症或衰老相关病症的药物组合物的用途。
本发明的重组疱疹病毒治疗的对象优选地是人。
在第四个方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含核酸，所述核酸编码融合了或插入了配体的本发明的嵌合gB。核酸分子可以是本发明的重组疱疹病毒的基因组或其一部分。优选地，核酸分子编码包含gB糖蛋白的信号序列的嵌合gB前体的形式。如果将嵌合gB工程改造为在其N-末端氨基酸处携带配体，则对应的核酸具有插入信号序列最后一个氨基酸与成熟蛋白第一个氨基酸之间的配体的核酸序列。
在第五个方面，本发明提供了一种包含核酸分子的载体。适宜的载体是本领域已知的并且包括质粒、粘粒、人造染色体(例如，细菌、酵母或人)、噬菌体、病毒载体(逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒)，特别是杆状病毒载体或纳米工程改造的物质(例如，有机改性硅酸盐(ormosil))。在一个实施方式中，对载体进行修饰，特别是通过缺失、插入和/或突变一个或多个核酸碱基，以使得其毒力减弱(优选在病毒载体的情况下)，或者使得其在患病细胞中而不在非患病细胞中条件性地复制。例如，缺失γ134.5基因、UL39基因、ICP47基因的一个或全部两个拷贝导致病毒减毒。减毒或减毒的是指毒力减弱或降低的病毒。
而且，本发明包括用仅在患病细胞(例如，肿瘤细胞)中表达的人基因的启动子(例如，肿瘤细胞中的存活素启动子)取代γ134.5基因的启动子区，这将导致在非患病细胞中其为减毒表型而在患病细胞中其为非减毒表型。进一步修饰可以包括用仅在患病细胞中表达的基因的启动子(例如，存活素启动子)取代负责IE基因转录的调控区，如ICP-4启动子区。这种改变将产生能够在患病细胞中而不在正常细胞中复制的条件复制性疱疹病毒。用于病毒子代增殖的细胞培养物的细胞将提供高水平的特异性启动子活化蛋白，以便能够以高病毒产率进行生产。
在第六个方面，本发明提供了一种多肽，所述多肽包含融合了或插入了配体的嵌合gB。
在第七个方面，本发明提供了一种细胞，所述细胞包含重组疱疹病毒、核酸分子，所述核酸分子包含编码具有融合的或插入的配体的本发明的嵌合gB的核酸、包含所述核酸分子的载体，或包含具有融合的或插入的配体的嵌合gB的多肽。优选地，细胞是细胞培养物的细胞。适宜的细胞培养物和培养技术是本领域熟知的(Peterson和Goyal，1988)。
在第八个方面，本发明提供了一种使用本发明的重组疱疹病毒感染细胞的方法。本发明的目的是提供重组疱疹病毒，所述重组疱疹病毒感染对象中不需要的细胞，在其中繁殖，裂解细胞并且从而杀死细胞。用于感染的方法还用于重组疱疹病毒在细胞培养物中存在的细胞中的生长。“感染”指病毒经由病毒表面的膜与细胞膜的融合进入细胞，并且病毒组分(如病毒基因组)释放至细胞中。用病毒感染细胞的方法是本领域已知的，例如通过将病毒与待感染的细胞一起孵育(Florence等，1992；Peterson和Goyal，1988)。“杀死”指由于本发明的疱疹病毒的感染，细胞内病毒颗粒的产生，以及最后通过裂解细胞释放新的病毒颗粒，使得细胞被完全消除。在其表面上携带配体靶分子的细胞(例如，培养物中的细胞)可以用于检测重组疱疹病毒的裂解效力。例如，细胞可以是获取自对象的患病细胞，例如肿瘤细胞。这种细胞被疱疹病毒感染并且由此被疱疹病毒杀死。成功杀死细胞表示重组疱疹病毒具有细胞特异性，以评价消除细胞(如来自对象的肿瘤细胞)的治疗成果。在进一步的实施方式中，还可以自同一对象或从未患有疾病的对照对象获取非患病细胞，即在其表面上不携带配体的靶分子或以较低程度携带靶分子的细胞。通过这种方式，可以检测非患病细胞是否易受重组疱疹病毒感染和/或非患病细胞易受重组疱疹病毒感染的程度。在另一个实施方式中，自对象分离细胞群后(例如，白细胞去除术)，将包含非患病细胞和患病细胞(例如，肿瘤细胞(如白血病细胞))的细胞群(例如，组织(如血液))中的患病细胞杀死。这用于获取不含患病细胞的细胞群，例如不含患病细胞(如白血病细胞)的血液，特别是用于随后将细胞群移植到对象中，优选地移植到细胞群自其分离的同一对象中。例如，在血液和白血病的情况下，这种方法提供了不含肿瘤细胞的血液的回输。使用本发明的重组疱疹病毒杀死细胞的方法可以是体外方法或体内方法。
在第九个方面，本发明提供了一种使用根据权利要求1至9中任意一项所述的疱疹病毒在细胞培养物中存在的细胞中生产重组疱疹病毒的体外方法，优选地其中所述细胞表达或结合作为靶分子的人造分子，更优选地所述靶分子包括抗体、抗体衍生物或抗体模拟物，甚至更优选地是scFv，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的一部分结合的scFv，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:37的部分结合的scFv，甚至更优选地是包含SEQ ID NO:39的scFv，最优选地是如SEQ ID NO:41的序列所示的分子。
本发明的重组疱疹病毒用于感染和杀死人体中的患病细胞的目的。这需要提供疱疹病毒，并因此需要繁殖和生产疱疹病毒。由于应避免疱疹病毒在患病细胞中的繁殖，以避免引入患病细胞(如人体中的肿瘤细胞)的物质，如DNA、RNA和/或蛋白，因而必须将重组疱疹病毒工程改造为还能够感染非患病细胞。这需要将重组疱疹病毒重新靶向至患病细胞用于将其杀死以及重新靶向至非患病细胞用于繁殖。因此，本发明的第九个方面包括用一种以上(如2、3或4种，优选2种)异源多肽配体修饰重组疱疹病毒。配体可以仅由gB构成，但是也可以由gB和gD以及任选地由gH构成。
因此，在第九个方面的一个实施方式中，重组疱疹病毒包含融合至或插入gB的异源多肽配体，其能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合，并且包含另外的融合至或插入gB、gD和/或gH的另外的异源多肽配体，其能够与存在于患病细胞上的靶分子结合。优选地，嵌合gB包含能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的异源多肽配体，并且经修饰的gD和/或gH包含能够与存在于患病细胞上的靶分子结合的异源多肽配体。
用于在细胞中培养疱疹病毒的适宜技术和条件是本领域熟知的(Florence等，1992；Peterson和Goyal，1988)并且包括将疱疹病毒与细胞一起孵育并且从感染细胞培养物的培养基中回收疱疹病毒。生产重组疱疹病毒的细胞携带靶分子，重组疱疹病毒经由异源多肽配体与所述靶分子结合。优选地，靶分子是人造靶分子。特异性地构建人造靶分子以结合异源多肽配体。反之，特异性地选择和构建配体以结合人造靶分子。因此，靶分子可以是不由靶细胞天然产生的抗体、抗体衍生物或抗体模拟物，优选scFv。异源多肽配体可以是天然多肽，优选地是真菌或细菌多肽，如来自酵母菌属(如酿酒酵母)的多肽，或者是人造多肽，如能够与靶分子结合的天然多肽的一部分。细胞可以是适于疱疹病毒生长的任何培养细胞。优选地，细胞是非患病细胞。细胞可以作为细胞系存在或者可以是分离的细胞，优选地细胞作为细胞系存在。细胞系可以是批准用于疱疹病毒生长的细胞系。适宜的细胞系是Vero、293、293T、HEp-2、HeLa、BHK或RS细胞，最优选地是Vero细胞。
“培养的”细胞是存在于本领域已知的维持和增殖的体外细胞培养物中的细胞。培养的细胞在受控条件下生长，通常是在其天然环境以外。通常，培养的细胞来源于多细胞真核生物，特别地为动物细胞。“批准用于疱疹病毒生长的细胞系”意指包括已显示出其能够被疱疹病毒感染(即，病毒进入细胞并且能够增殖和生产病毒)的任何细胞系。细胞系是源自单一细胞并且含有相同遗传组成的细胞群。优选的用于重组疱疹病毒的增殖和生产的细胞是Vero、293、293T、HEp-2、HeLa、BHK或RS细胞。
在体外方法的一个优选实施方式中，配体是天然多肽的一部分并且优选地长度为274个氨基酸残基或更短，优选地少于200个氨基酸残基，更优选地少于50个氨基酸残基，甚至更优选地少于40个氨基酸残基，以及甚至更优选地在10至30个氨基酸之间，如20个氨基酸，由此该部分使靶分子得以构建并且将疱疹病毒重新靶向携带相应靶分子的细胞。靶分子是能够与天然多肽的一部分结合的抗体衍生物。更优选地，异源多肽配体是GCN4酵母转录因子的一部分，靶分子是能够与所述配体结合的抗体衍生物，并且细胞是经修饰以表达靶分子的细胞。最优选地，异源多肽配体是如SEQ ID NO:37的序列所示的分子，靶分子是如SEQ ID NO:41的序列所示的分子，并且细胞是经修饰以表达如SEQ ID NO:41的序列所示分子的Vero细胞系，在本申请中将其称为Vero GCN4细胞系。
Vero-GCN4细胞系表达GCN4肽的人造受体，其为scFV。Vero-GCN4细胞系用于以下目的：实现对重新靶向HER2阳性细胞并且自天然疱疹病毒受体去靶向的疱疹病毒重组体的培养。因为HER2是癌基因，并且HER2阳性细胞是癌细胞，因此应避免在癌细胞中生长和生产供人用的溶瘤重组疱疹病毒，以避免可能的在人体内偶然引入肿瘤来源物质(DNA、RNA、蛋白)。与此同时，疱疹病毒应能够感染患病细胞。因此，构建Vero-GCN4细胞系和重新靶向HER2的疱疹病毒。Vero-GCN4细胞系表达人造受体，所述人造受体由针对GCN4肽的scFv构成，其与粘连蛋白-1的胞外域2和3、跨膜结构(TM)和C-尾融合。重新靶向HER2的疱疹病毒在gB中表达GCN4肽。因此，重组疱疹病毒同时重新靶向HER2以感染癌细胞，以及重新靶向GCN4肽以感染用于病毒的生长和生产的Vero-GCN4细胞系。
在第九个方面的一个特别优选的实施方式中，gB包含能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的配体，其中所述配体可以是人造多肽，更优选地是天然多肽的一部分，以及甚至更优选地是GCN4酵母转录因子的一部分，并且经修饰的gD和/或经修饰的gH包含能够与存在于患病细胞上的靶分子结合的配体，其中所述靶分子可以是抗体、抗体衍生物或抗体模拟物，甚至更优选地是scFv，以及甚至更优选地是能够与HER2结合的scFv。在最优选的实施方式中，重组疱疹病毒包含嵌合gB，其包含如SEQ ID NO:37的序列所示的分子，并且经修饰的gD和/或gH包含如SEQ ID NO:32所示的scFv。此类疱疹病毒能够感染表达如SEQ ID NO:41的序列所示分子的Vero-GCN4细胞系用于繁殖以及通过存在于肿瘤细胞上的HER2感染肿瘤细胞，用于杀死肿瘤细胞。
在另一个特别优选和最优选的实施方式中，gB包含能够与存在于患病细胞上的靶分子结合的配体，并且gD包含能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的配体。配体、靶分子和细胞的定义如此前章节所述。
附图说明
图1：重组体R-BP901、R-BP903、R-BP909、R-313、R-315、R-317和R-319的基因组排布。(A-G)HSV-1基因组表示为由内部重复序列(IR)括起的线。将由Lox-P-括起的BAC序列和eGFP荧光标记物插入基因间区域UL3-UL4。(A)R-BP903携带gB的AA43-44之间插入的具有下游12Ser-Gly接头的scFv-HER2。(B)R-BP909与R-BP903相同，但还携带用于去靶向目的的自成熟gD的AA 6-38缺失。(C)R-BP901携带gB的AA 81-82之间插入的具有Ser-Gly接头的scFv-HER2。(D)R-313携带非成熟gB的AA 43-44之间插入的具有一个上游和一个下游Ser-Gly接头的GCN4肽，以及替代成熟gD的AA 6-38的具有11个氨基酸长的下游Ser-Gly接头的scFv-HER2。(E)R-315携带非成熟gB的AA 81-82之间插入的具有一个上游和一个下游Ser-Gly接头的GCN4肽，以及替代成熟gD的AA 6-38的具有11个氨基酸长的下游Ser-Gly接头的scFv-HER2。(F)R-317携带非成熟gB的AA 76-77之间插入的具有一个上游和一个下游Ser-Gly接头的GCN4肽，以及替代成熟gD的AA 6-38的具有11个氨基酸长的下游Ser-Gly接头的scFv-HER2。(G)R-319携带非成熟gB的AA 95-96之间插入的具有一个上游和一个下游Ser-Gly接头的GCN4肽，以及替代成熟gD的AA 6-38的具有11个氨基酸长的下游Ser-Gly接头的scFv-HER2。
图2：R-BP901和R-BP909表达嵌合scFv-gB糖蛋白。以3PFU/细胞的输入感染复数用R-BP901、R-BP909或R-LM5感染的SK-OV-3细胞的裂解物进行PAGE。用MAb H1817通过免疫印迹检测gB。左侧的数字表示250K、130K和95K MW标记物的迁移位置。
图3：用重组体R-BP901、R-BP903和R-BP909感染表达单一受体的J细胞。J细胞不表达针对wt-HSV的受体。J-HER2、J-粘连蛋白1、J-HVEM仅表达所示受体。用R-BP903、R-BP909和R-BP901感染所示细胞，并且在感染后24小时用绿色荧光显微镜监测。(A)在该重组体编码wt-gD的情况下，与预期一致，R-BP903感染J-HER2细胞以及J-粘连蛋白和J-HVEM细胞。这种病毒重新靶向HER2并且保持天然的嗜性。(B)由于gD AA 6-38的缺失，R-BP909感染表达HER2作为唯一受体(J-HER2)的细胞，并且未感染J-粘连蛋白和J-HVEM。R-BP909重新靶向HER2并且自HSV-1gD天然受体去靶向。(C)R-BP901未感染J-HER2；这种病毒不重新靶向HER2。
图4：R-BP909特异性地感染HER2+癌细胞。用R-BP909和R-BP903感染所示的HER2-和HER2+癌细胞系。使用荧光显微镜在感染后24小时采集图片。R-BP909感染HER2-阳性癌细胞，而未感染HER2-阴性癌细胞。无论是否表达HER2，R-BP903均感染细胞，这与缺乏去靶向一致。
图5：J-HER2(A)和SK-OV-3(B)细胞中R-BP909进入途径的表征。用HD1、52S、H126MAb预孵育所示病毒，然后使其感染J-HER2或SK-OV-3细胞。指示时用曲妥珠单抗或对照IgG预处理细胞。24小时后通过流式细胞术的方式对感染进行定量。(A)使用曲妥珠单抗和针对gB的MAb H126几乎消除了R-BP909对J-HER2细胞的感染。(B)R-BP909对SK-OV-3细胞的感染被曲妥珠单抗以及针对gB的MAb H126、针对gH的52S所抑制，但是不被针对gD的MAbHD1抑制。通过在gD中插入针对HER2的scFv重新靶向HER2的重组体R-LM113与R-BP909表现相似。
图6：R-BP909以及对照重组体R-VG809(通过gH重新靶向HER2)和R-LM113(通过gD重新靶向HER2)的生长曲线。SK-OV-3细胞用所示重组体以0.1PFU/细胞的输入感染复数进行感染，并且在感染后的指定时间(h)收获。在SK-OV-3细胞中滴定子代病毒。生长曲线表明R-BP909以与R-VG809相似的方式复制，低于R-LM113约一个对数。
图7：R-BP909和R-VG809针对感染的SK-OV-3和MDA-MB-453细胞具有杀灭能力，对HER2-癌细胞缺乏杀灭能力。用所示病毒以2PFU/细胞(MDA-MD-231细胞以0.1PFU/细胞)分别感染HER2阳性SK-OV-3和MDA-MB-453细胞，以及HER2-MDA-MB-231癌细胞。通过AlamarBlue测定对存活率进行定量。R-BP909以与R-VG809相似的效力杀死SK-OV-3和MDA-MB-453细胞。这两种病毒均不能杀死HER2-阴性MDA-MD-231癌细胞，这与其不能感染这些细胞一致。
图8：重组体R-313、R-315、R-317和R-319的感染模式。用所示病毒感染表达wt-HSV、J-HVEM和J-粘连蛋白的受体的wt-Vero、Vero-GCN4R、SK-OV-3、亲代J和J细胞并且在感染后24小时用绿色荧光显微镜进行监测。R-313、R-315、R-317和R-319感染表达HER2(人和猿猴)以及表达GCN4作为受体的细胞，并且由于gD AA 6-38的缺失，未通过粘连蛋白和HVEM感染。所有经工程改造的病毒重新靶向HER2和GCN4并且自HSV-1gD天然受体去靶向。对暴露于曲妥珠单抗(别名赫赛汀)的HER2阳性细胞系中的感染的抑制确证了R-313、R-315、R-317和R-319利用HER2作为进入这些细胞的入口。
图9：R-313、R-315、R-317、R-319以及对照重组体R-LM113(通过gD重新靶向HER-2)和R-LM5(野生型的HSV糖蛋白，具有存在于R-313、R-315、R-317、R-319和R-LM113中的其他基因组修饰)的生长曲线。以0.1PFU/细胞的输入感染复数(根据在相应细胞系中所滴定的)用所示重组体感染Vero-GCN4R和SK-OV-3细胞，并且在感染后的指定时间(h)收集。在SK-OV-3细胞中滴定子代病毒。
图10：R-313、R-315、R-317、R-319以及对照重组体R-LM113和R-LM5在不同细胞系中的植板效率。将复制等份的重组病毒铺板至Vero-GCN4R、wt-Vero和SK-OV-3上。在感染后3天，在荧光显微镜下对噬斑进行评分。
图11：R-313、R-315、R-317和R-319在不同细胞系中的相对噬斑尺寸。A)将复制等份的R-313、R-315、R-317、R-319、R-LM113和R-LM5铺板至Vero-GCN4R、wt-Vero和SK-OV-3上。感染后3天，使用荧光显微镜采集噬斑图像。显示了代表性噬斑。B)对噬斑面积的定量以pxE2示出。
图12：针对GCN4-粘连蛋白受体的嵌合scFv的示意图。受体表示为N-末端前导肽和HA标签序列，随后是位于两个短接头(GA和GSGA接头)之间的针对GCN4的scFv。该分子的第二部分对应于人粘连蛋白-1(PVRL1)残基Met143至Val517，其包含粘连蛋白-1胞外域2和3、TM区段和胞内胞质尾。
图13：Vero-GCN4阳性细胞的稳定性。通过FACS使用针对HA标签的Mab分析scFvGCN4-粘连蛋白受体的表达。图表显示了来自第10、15、30、40代Vero GCN4克隆11.2细胞的阳性细胞百分比。结果：连续传代40次后，人造受体的表达仍是稳定的。
图14：重组体R-321的基因组排布。HSV-1基因组表示为由内部重复序列(IR)括起的线。将Lox-P-括起的BAC序列和eGFP荧光标记物插入基因间区域UL3-UL4。R-321携带成熟gD的AA 30和38的缺失，以及在gD的AA 37之后插入scFv-HER2。R-321携带非成熟gB的AA43-44之间插入的具有一个上游和一个下游Ser-Gly接头的GCN4肽。
图15：重组体R-321的感染模式。用所示病毒感染表达针对wt-HSV、J-HVEM和J-粘连蛋白的受体的wt-Vero、Vero-GCN4R、SK-OV-3、亲代J和J细胞并且在感染后24小时用绿色荧光显微镜进行监测。R-321感染表达HER2(人和猿猴)和GCN4作为受体的细胞，并且不能通过粘连蛋白和HVEM感染，这是gD缺失AA 30和38的结果。R-321重新靶向HER2和GCN4并且自HSV-1gD天然受体去靶向。在暴露于曲妥珠单抗(别名赫赛汀)的HER2-阳性细胞系中感染被抑制，这确证了R-321使用HER2作为进入这些细胞的入口。
图16：R-321以及对照重组体R-LM113(通过gD重新靶向HER-2)和R-LM5(野生型的HSV糖蛋白，具有存在于R-321中的其他基因组修饰)的生长曲线。以0.1PFU/细胞的输入感染复数(根据在相应细胞系中所滴定的)用所示重组体感染Vero-GCN4R和SK-OV-3细胞，并且在感染后的指定时间(h)收集。在SK-OV-3细胞中滴定子代病毒。
序列
SEQ ID NO:1：HSV-1gB野生型前体的氨基酸序列(人疱疹病毒1型F株，GenBank登录号：GU734771.1；位置52996至55710编码gB)。
SEQ ID NO:2：在氨基酸43和44之间插入曲妥珠单抗scFv的gB前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，由构建体R-BP903和R-BP909编码。在scFV插入体的C-末端氨基酸序列与gB的氨基酸44之间引入接头SSGGGSGSGGSG(SEQ ID NO:30)。
SEQ ID NO:3：在氨基酸81和82之间插入曲妥珠单抗scFv的gB前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，由构建体R-BP901编码。在gB的氨基酸81与scFv插入体的N-末端氨基酸序列之间引入接头HSSGGGSG(SEQ ID NO:29)。在scFV插入体的C-末端氨基酸序列与gB的氨基酸82之间引入接头SSGGGSGSGGSG(SEQ ID NO:30)。
SEQ ID NO:4：HSV-1gD野生型前体的氨基酸序列(人疱疹病毒1F株，GenBank登录号ID：GU734771.1；位置138281至139465编码的gD)。
SEQ ID NO:5：缺失成熟gD的氨基酸6至38的HSV-1gD野生型前体(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，由R-BP909编码。
SEQ ID NO:6：在氨基酸30至64之间插入曲妥珠单抗scFv的HSV-1缺失的gD(SEQID NO:5)的氨基酸序列，由构建体R-LM113编码。引入氨基酸EN以插入便于工程改造和筛选的限制性酶切位点。
SEQ ID NO:7：如在R-BP901中的Ser-Gly接头括起的曲妥珠单抗scFv表达盒，其存在于称为pSG-scFvHER2-SG的质粒中，编码SEQ ID NO:3中的插入物。
SEQ ID NO:8：由SEQ ID NO:7编码的氨基酸序列；氨基酸1至8是上游Ser-Gly接头(SEQ ID NO:29)，氨基酸9至116是VL区，氨基酸117至136是连接VL和VH区的接头(SEQ IDNO:31)，氨基酸137至255编码VH区，氨基酸256至267编码下游12Ser-Gly接头(SEQ ID NO:30)。
SEQ ID NO:9：曲妥珠单抗scFv表达盒，存在于称为p-SG-scFvHER2-SG的质粒中，但是缺少R-BP903和R-BP909中8个残基长的上游Ser-Gly接头，其编码SEQ ID NO:2中的插入物。
SEQ ID NO:10：由SEQ ID NO:9编码的氨基酸序列；氨基酸1至108是VL区，氨基酸109至128是连接VL和VH区的接头(SEQ ID NO:31)，氨基酸129至247编码VH区，氨基酸248至259编码下游12Ser-Gly接头(SEQ ID NO:30)。
SEQ ID NO:11：gB43GalKfor
SEQ ID NO:12：gB43GalKrev
SEQ ID NO:13：gB43_sc4D5_for
SEQ ID NO:14：gB43_sc4D5_rev
SEQ ID NO:15：gB81fGALK
SEQ ID NO:16：gB81GALKrev
SEQ ID NO:17：gB81sc4D5f
SEQ ID NO:18：gB81SGr
SEQ ID NO:19：scFv4D5_358_r
SEQ ID NO:20：scFv4D5_315_f
SEQ ID NO:21：gD5_galK_f
SEQ ID NO:22：gD39_galK_r
SEQ ID NO:23：gD_aa5_39_f
SEQ ID NO:24：gD_aa5_39_r
SEQ ID NO:25:galK_129_f
SEQ ID NO:26：galK_417_r
SEQ ID NO:27：gB_ext_for
SEQ ID NO:28：gB_431_rev
SEQ ID NO:29：8Ser-Gly接头
SEQ ID NO:30：12Ser-Gly接头
SEQ ID NO:31：连接VL和VH区的接头
SEQ ID NO:32：曲妥珠单抗scFv
SEQ ID NO:33：GCN4gB_43_44_fB
SEQ ID NO:34：GCN4gB_43_44_rB
SEQ ID NO:35：在氨基酸43和44之间具有插入的GCN4肽的gB前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，由构建体R-313编码。GCN4肽侧接Ser-Gly接头。
SEQ ID NO:36：编码用于重组至gB的具有上游和下游接头的GCN4肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:37：GCN4肽
SEQ ID NO:38：GCN4表位
SEQ ID NO:39：针对GCN4肽的scFv的氨基酸序列
SEQ ID NO:40：编码scFv-GCN4-粘连蛋白1嵌合体的核苷酸序列
SEQ ID NO:41：由SEQ ID NO:40编码的氨基酸序列；能够与GCN4肽结合的scFv的氨基酸序列包含N-末端前导肽、HA标签序列、短GA接头、氨基酸33至275的scFv序列、短GSGA接头和人粘连蛋白-1(PVRL1)残基Met143至Val517
SEQ ID NO:42：Genbank登录号AJ585687.1(编码GCN4酵母转录因子的基因)
SEQ ID NO:43：GCN4酵母转录因子UniProtKB–P03069(GCN_YEAST)的氨基酸序列
SEQ ID NO:44：gB_76_galK_for
SEQ ID NO:45：gB_76_galK_rev
SEQ ID NO:46：gB_76_GCN4_for
SEQ ID NO:47：gB_76_GCN4_rev
SEQ ID NO:48：在氨基酸76和77之间具有插入的GCN4肽的gB前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，由构建体R-317编码。GCN4肽侧接Ser-Gly接头。
SEQ ID NO:49：gB_81_GCN4_for
SEQ ID NO:50：gB_81_GCN4_rev
SEQ ID NO:51：在氨基酸81和82之间具有插入的GCN4肽的gB前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，由构建体R-315编码。GCN4肽侧接Ser-Gly接头。
SEQ ID NO:52：gB_95_galK_for
SEQ ID NO:53：gB_95_galK_rev
SEQ ID NO:54：gB_95_GCN4_for
SEQ ID NO:55：gB_95_GCN4_rev
SEQ ID NO:56：在氨基酸95和96之间具有插入的GCN4肽的gB前体(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，由构建体R-319编码。GCN4肽侧接Ser-Gly接头。
SEQ ID NO:57：gD5_galK_f
SEQ ID NO:58：scFv_galK_rev
SEQ ID NO:59：gDdel30_38for
SEQ ID NO:60：gDdel30_38rev
SEQ ID NO:61：对于成熟gD缺失氨基酸30和38并且在氨基酸37之后插入曲妥珠单抗scFv的gD前体(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，由构建体R-321编码。
SEQ ID NO:62：HSV-1gD野生型成熟形式的氨基酸序列(人疱疹病毒1F株，GenBank登录号ID：GU734771.1)。
实施例
实施例1：HSV重组体的构建，所述重组体表达携带针对HER2的单链抗体(scFv)(scFv-HER2)的基因修饰的gB(R-BP901、R-BP903、R-BP909)，其不具有或具有gD HSV基因中的缺失，并且编码作为报告基因的eGFP或携带GCN4肽(R-313)。
A)R-BP903：在HSV gB的AA(氨基酸)43和44之间插入scFv-HER2。
发明人通过在非成熟gB的AA 43和44(对应于切割信号序列后含AA1-30的成熟gB的AA13和14)之间插入编码曲妥珠单抗scFv的序列，工程改造了R-BP903(该克隆也称为R-903)(图1A)。起始基因组为BAC LM55，其携带插入HSV-1基因组的UL3和UL4之间的LOX-P括起的pBeloBAC11和eGFP序列(Menotti等，2008)。通过galK重组的方法进行工程改造。简言之，通过使用引物gB43GalKfor
GGTGGCGTCGGCGGCTCCGAGTTCCCCCGGCACGCCTGGGGTCGCGGCCGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:11)和gB43GalKrev
GGCCAGGGGCGGGCGGCGCCGGAGTGGCAGGTCCCCCGTTCGCCGCCTGGGTTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:12)，以pGalK作为模板扩增具有针对gB的同源臂的galK表达盒。在携带LM55BAC的SW102细菌中将该表达盒电穿孔。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％半乳糖、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(15mM(NH4)2SO4、100mMKH2PO4、1.8μg FeSO4·H2O，调节至pH7)的平板上对携带galK表达盒的重组克隆进行选择。为排除galK假阳性细菌菌落，还在补充了1％半乳糖和12μg/ml氯霉素的MacConkey琼脂基平板上划线，并且用引物galK_129_f ACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGG(SEQ ID NO:25)和galK_417_r
CATTGCCGCTGATCACCATGTCCACGC(SEQ ID NO:26)，通过菌落PCR进行检验。接下来，通过使用引物gB43_sc4D5_for
GGTGGCGTCGGCGGCTCCGAGTTCCCCCGGCACGCCTGGGGTCGCGGCCGCGTCCGATATCCAGATGACCCAGTCCCCG(SEQ ID NO:13)和gB43_sc4D5_rev
GGCCAGGGGCGGGCGGCGCCGGAGTGGCAGGTCCCCCGTTCGCCGCCTGGGTACCGGATCCACCGGAACCAGAGCC(SEQ ID NO:14)进行退火和延伸，产生具有下文所述的下游Ser-Gly接头(SEQ IDNO:9；编码SEQ ID NO:10)并且由gB的同源臂括起的曲妥珠单抗scFv表达盒。重组基因组编码嵌合gB，其携带针对HER2的scFv，以及一个具有序列SSGGGSGSGGSG(SEQ ID NO:30)的下游Ser-Gly接头和一个VL和VH区之间的具有序列SDMPMADPNRFRGKNLVFHS(SEQ ID NO:31)的接头。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％脱氧-2-半乳糖、0.2％甘油、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(见上文)的平板上对携带galK表达盒的切除和选择的序列(scFv-HER2)的插入的重组克隆进行选择。还用引物gB_ext_for
GAGCGCCCCCGACGGCTGTATCG(SEQ ID NO:27)和gB_431_rev
TTGAAGACCACCGCGATGCCCT(SEQ ID NO:28)，通过菌落PCR检验细菌菌落是否存在选择的序列。
B)R-BP909(图1B)：从R-BP903的成熟gD中缺失AA 6-38。R-BP909(该克隆也称为R-909)与R-BP903相同，其另外携带对应于gD中的AA 6-38的序列的缺失。起始物质是R-BP903BAC基因组。为了产生gD中AA 6-38的缺失，用引物gD5_galK_f TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:21)和gD39_galK_r
ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:22)扩增侧接gD同源臂的galK表达盒。接下来，发明人用合成的双链寡核苷酸替代galK序列，所述合成的双链寡核苷酸由gD_aa5_39f
TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCACATCCAGGCGGGCCTACCGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCCTCCCGAT(SEQ ID NO:23)和gD_aa5_39r
ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGCGCCAAGGCATATTTGCCGCGGACCCCATGGAGGCCCACTATGACGACAA(SEQ ID NO:24)构成。
C)R-BP901(该克隆也称为R-901)(图1C)：在HSV gB的aa 81和82之间插入scFv-HER2。
步骤与上述工程改造R-BP903的gB中的scFv-HER2的步骤相同，区别如下。首先，通过使用引物gB81fGALK
CGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAAACCCACCGCCGCCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:15)和gB81GALKrev
CGCAGGGTGGCGTGGCCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:16)扩增galK表达盒。接下来，由下文所述的Ser-Gly接头和由gB同源臂括起的曲妥珠单抗scFv表达盒作为两个单独的片段(称为片段#1和片段#2)自pSG-ScFvHER2-SG扩增。pSG-ScFvHER2-SG携带由Ser-Gly接头括起的曲妥珠单抗scFv表达盒(SEQ ID NO:7，编码SEQ ID NO:8)。通过使用引物gB81sc4D5f
CGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAAACCCACCGCCGCCGCATAGTAGTGGCGGTGGCTCTGGATCCG(SEQ ID NO:17)和scFv4D5_358_r
GGAAACGGTTCGGATCAGCCATCGG(SEQ ID NO:19)，以p-SG-ScFv-HER2-SG作为模板扩增片段#1。通过使用引物gB81SGr
CGCAGGGTGGCGTGGCCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGACCGGATCCACCGGAACCAGAGCC(SEQ ID NO:18)和scFv4D5_315_f
GGAGATCAAATCGGATATGCCGATGG(SEQ ID NO:20)，以pSG-ScFvHER2-SG作为模板扩增片段#2。对片段#1和#2进行退火和延伸以产生由Ser-Gly接头和gB的同源臂括起的scFv-HER2表达盒。重组基因组携带针对HER2的scFv，其由具有序列HSSGGGSG(SEQ ID NO:29)的上游Ser-Gly接头和具有序列SSGGGSGSGGSG(SEQ ID NO:30)的下游Ser-Gly接头括起。VL和VH之间的接头是SDMPMADPNRFRGKNLVFHS(SEQ ID NO:31)。
D)R-313：在HSV重组体中的HSV gB的AA 43和44之间插入GCN4肽，所述HSV重组体已在gD中AA6-38的缺失中表达scFv-HER2。
发明人通过在非成熟gB的AA 43和44(对应于切割信号序列后含AA1-30的成熟gB的AA13和14)之间插入编码GCN4肽的序列，工程改造了R-313(图1D)。起始基因组为BACLM113，其携带替代gD的AA 6至38的scFv-HER2，插入HSV-1基因组的UL3和UL4之间的LOX-P括起的pBeloBAC11和eGFP序列(Menotti等，2008)。通过galK重组的方法进行工程改造。简言之，为了在gB中插入GCN4肽，以pGalK作为模板，通过使用引物gB43GalKfor
GGTGGCGTCGGCGGCTCCGAGTTCCCCCGGCACGCCTGGGGTCGCGGCCGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:11)和gB43GalKrev
GGCCAGGGGCGGGCGGCGCCGGAGTGGCAGGTCCCCCGTTCGCCGCCTGGGTTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:12)扩增具有gB的同源臂的galK表达盒。在携带BAC LM 113BG的SW102细菌中对该表达盒进行电穿孔。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％半乳糖、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(15mM(NH4)2SO4、100mM KH2PO4、1.8μgFeSO4·H2O，调节至pH7)的平板上对携带galK表达盒的重组克隆进行选择。为排除galK假阳性细菌菌落，还在添加了1％半乳糖和12μg/ml氯霉素的MacConkey琼脂基平板上划线，并且用引物galK_129_f
ACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGG(SEQ ID NO:25)和galK_417_r
CATTGCCGCTGATCACCATGTCCACGC(SEQ ID NO:26)，通过菌落PCR进行检验。接下来，通过使用引物GCN4gB_43_44_fB
GGTGGCGTCGGCGGCTCCGAGTTCCCCCGGCACGCCTGGGGTCGCGGCCGCGGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC(SEQ ID NO:33)和GCN4gB_43_44_rB
GGCCAGGGGCGGGCGGCGCCGGAGTGGCAGGTCCCCCGTTCGCCGCCTGGGTGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(SEQ ID NO:34)进行退火和延伸，产生具有下游和上游Ser-Gly接头并且由gB的同源臂括起的GCN4肽表达盒(SEQ ID NO:36，编码SEQ ID NO:37)，其引入了BamHI核酸内切酶的沉默限制性酶切位点，用于通过限制性分析筛选菌落。重组基因组编码嵌合gB(SEQ ID NO:35)，其携带GCN4肽，所述GCN4肽包括具有序列GS的一个下游和一个上游Ser-Gly接头。在含有补充了1mg/L D-生物素、0.2％脱氧-2-半乳糖、0.2％甘油、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO4·7H2O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(如上文所述)的平板上对携带galK表达盒的切除和选择的序列(GCN4肽)的插入的重组克隆进行选择。用引物gB_ext_for GAGCGCCCCCGACGGCTGTATCG(SEQ ID NO:27)和gB_431_revTTGAAGACCACCGCGATGCCCT(SEQ ID NO:28)，通过菌落PCR检验细菌菌落是否存在选择的序列。
为了重构重组病毒R-BP909，500ng重组BAC DNA通过Lipofectamine 2000(LifeTechnologies)转染至称为R6的gD-互补细胞系(在HSV晚期UL26.5启动子的控制下表达wt-gD的兔皮肤细胞系)(Zhou等，2000)，然后在SK-OV-3细胞中生长。通过绿色荧光监测病毒生长。通过对R-BP909的整个gB以及gD和gH ORF，以及R-BP903和R-BP901的gB中的scFv HER2和插入位点进行测序，来验证重组体的结构。在SK-OV-3细胞中产生并滴定病毒原液。
为了重构重组病毒R-BP901、R-BP903、R-313，通过Lipofectamine 2000(LifeTechnologies)将500ng重组BAC DNA转染至SK-OV-3细胞。通过绿色荧光监测病毒生长。将R-313病毒在SK-OV-3中传代6次，反复冻融以裂解SK-OV-3细胞，随后使其在Vero-GCN4细胞中生长。在Vero-GCN4中产生病毒原液，并且在Vero-GCN4、wt-Vero和SK-OV-3细胞中对其进行滴定。通过对gB中的GCN4和插入位点进行测序来验证重组体R-313的结构。
实施例2：R-BP901和R-BP909的嵌合scFv-HER2-gB表达的验证
用R-BP901、R-BP909以3PFU/细胞的输入感染复数，用R-BP901、R-BP909，以及为了比较，用R-LM5感染SK-OV-3细胞，并在感染后72小时收获。对细胞裂解物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF膜并用针对gB的单克隆抗体(H1817)进行免疫印迹。图2示出了相比于来自R-LM5的wt-gB，来自R-BP901和R-BP909的嵌合scFv-HER2-gB以更慢的电泳迁移率迁移，并且Mr明显为130千道尔顿。箭头指向嵌合和wt gB的迁移位置。左侧数字表示分子量标记物的迁移位置，以千道尔顿表示。
实施例3：用重组体R-BP903、R-BP909和R-BP901感染表达单一受体的J细胞
此前已表明在gD中插入scFv-HER2赋予了重组病毒R-LM113通过HER2受体进入细胞的能力。为了提供证据表明在gB的位置43-44或81-82插入scFV-HER2赋予了通过HER2受体进入细胞的能力，发明人利用了表达HER2作为唯一受体的细胞。亲代J细胞不表达gD的受体，因此不能活化gD并且不被wt-HSV感染。J-HER2细胞转基因表达HER2作为唯一受体。作为对照，发明人使用了J-粘连蛋白和J-HVEM细胞，其转基因表达粘连蛋白-1或HVEM作为受体，并且被wt-HSV感染。所示细胞用R-BP903、R-BP909和R-BP901感染，并且在感染24小时后用绿色荧光显微镜进行监测。
如图3A中所示，R-BP903感染J-HER2细胞。由于R-BP903编码wt-gD，因此J-粘连蛋白和J-HVEM的感染并不令人惊讶。这种病毒重新靶向HER2，并且保持其天然嗜性。
发明人工程改造了一个重组体，其在gB的位置43-44中携带scFv-HER2并且gD缺失其受体结合位点的部分。gD的两个主要受体是粘连蛋白-1和HVEM。gD中HVEM的结合位点对应于AA 1-32。成熟gD中粘连蛋白-1的结合位点分布更广，包括Ig折叠核心和位于AA 35-38、199-201、214-217、219-221之间的部分。发明人自R-BP903成熟gD缺失了AA 6-38区域，即此前自R-LM113缺失的同一区域，通过在成熟gD的AA 5至39之间插入scFv-HER2，HSV重新靶向HER2。上述缺失去除了整个HVEM结合位点和与粘连蛋白-1相互作用的一些残基，包括位于AA 35-38之间的部分。即使缺失了少数与粘连蛋白-1相互作用的AA，R-LM113还是显示自粘连蛋白-1和HVEM去靶向。称为R-BP909的重组病毒不仅不能感染J-HVEM细胞，也不能感染J-粘连蛋白细胞，同时保持了有效感染J-HER2细胞的能力(图3B)。R-BP909的嗜性与R-BP903显著不同(将图3A和图3B进行比较)。发明人总结出，经HER2重新靶向的gB感染R-BP909不需要gD中HVEM和粘连蛋白-1的结合位点，并且因此也不需要受体介导的gD活化。总而言之，R-BP909显示出完全重新定向的嗜性，其经由gB重新靶向HER2受体并且自gD受体去靶向。
携带gB的AA81和82之间的scFv HER2且具有wt gD的重组体R-BP901不能感染J-HER2细胞；这种病毒不重新靶向HER2(图3C)。
实施例4：HER2+和HER2-癌细胞的感染
以5PFU/细胞的输入感染复数(根据在SK-OV-3中所滴定的)，在37℃下用R-BP909和R-BP903感染SK-OV-3、BT-474、MDA-MB-453HER2+癌细胞，HER2-HeLa和MDA-MB-231癌细胞，以及HER2-非癌HaCaT细胞，持续90分钟。感染后24小时用荧光显微镜采集图像。R-BP909感染HER2-阳性癌细胞，而不能感染HER2-阴性细胞。无论细胞是否表达HER2，R-BP903均感染细胞，这与其缺乏去靶向一致(图4)。
实施例5：J-HER2和SK-OV-3中R-BP909进入途径的表征
为了证明R-BP909进入J-HER2细胞通过作为细胞受体的HER2发生，以及为了研究gD在R-BP909进入SK-OV-3细胞的途径中的作用，发明人进行了一系列阻断测定。
此外，使用R-LM5作为对照，其携带wt-gD以及在R-BP909和R-LM113中存在的其他基因组修饰，即插入BAC序列和插入GFP标记物。发明人首先证实了R-BP909的感染通过HER2受体发生。用曲妥珠单抗(针对HER2的MAb，scFv-HER2的来源)或用非免疫小鼠IgG(终浓度28μg/ml)预孵育12孔板中的J-HER2细胞或SK-OV-3细胞单层复制。在37℃下用抗体预孵育1小时后，以5PFU/细胞的输入感染复数(根据在SK-OV-3中所滴定的)，用R-BP909和R-LM113或R-LM5(作为对照)感染细胞。这两种细胞类型的R-BP909感染几乎均被曲妥珠单抗消除，表明R-BP909使用HER2作为进入的入口，并且没有利用进入脱靶途径。R-BP909可以利用HER2作为受体这一发现为能够通过对gB中的异源配体进行工程改造来对HSV的嗜性进行修饰提供了证据。此外，gB重新靶向的HSV R-BP909对J-HER2细胞的感染能够发生在缺乏gD受体的细胞中，不能被其同源受体活化并且不能将活化传递给gB。发明人总结出感染R-BP909不需要具有功能性受体结合位点的gD。这验证了重新靶向的R-BP909使用HER2作为进入J-HER2细胞的入口这一结论。
为了阐明必需糖蛋白、gD、gH/gL以及未经基因工程改造修饰的gB部分的贡献，如所示的，在37℃下用针对gD的MAb HD1(1.5ug/ml)、针对gB的MAb H126(1:2000)、针对gH的MAb 52S(腹水1:25)预孵育病毒粒子1小时，然后使其与细胞吸附90分钟。在MAb HD1的情况下，还检测了HD1加上曲妥珠单抗(别名赫赛汀)的组合。然后去除病毒接种物，并且用含有所示抗体的培养基覆盖细胞。
通过荧光激活细胞分选仪(FACS)对感染进行定量(图5)。针对gB的MAb H126识别gB结构域I中的线形表位，其在Tyr303处具有关键残基。针对gH的MAb 52S不依赖于gL地识别在Ser536和Ala537处具有关键残基连续表位。R-BP909对SK-OV-3和J-HER2细胞的感染均被MAb H126(1:2000)消除(图5A和B)，表明在wt-gB中关键的功能性结构域保留在嵌合体中，以及gH/gL的作用。MAb HD1不能抑制R-BP909和R-LM113感染，这与此前的发现一致(Gatta等，2015)；这些结果支持R-BP909通过gB的方式重新靶向HER2，并且由于成熟gD中的AA 6-38缺失而自粘连蛋白1/HVEM去靶向这一结论。
实施例6：重组体的复制程度
发明人比较了R-BP909与分别通过在gD和gH中插入scFv-HER2重新靶向HER2的重组体R-LM113和R-VG809的复制程度。在SK-OV-3细胞中测量复制，这种细胞表达HER2和粘连蛋白-1/HVEM作为受体。
以输入感染复数0.1PFU/细胞在37℃下感染细胞90分钟；通过酸洗(40mM柠檬酸，10mM KCl，135mM NaCl[pH 3])的方式将未吸附的病毒灭活。在感染后的指定时间(3、24和48小时)冻存复制培养物，并且在SK-OV-3中滴定子代。图6中的结果表示R-BP909以与R-VG809相似的程度复制，低于R-LM113约一个对数。
实施例7：R-BP909和用于比较的R-VG809具有杀死HER2-阳性癌细胞的能力并且缺乏杀死HER2-癌细胞的能力
以8×10E3个细胞/孔将HER2-阳性SK-OV-3和MDA-MB-453以及HER2-阴性MDA-MB-231细胞接种在96孔板中，并且在37℃下暴露于重组体R-BP909、用于比较的R-VG809或假性感染90分钟。SK-OV-3和MDA-MB-453的输入感染复数(根据在对应细胞系中所滴定的)为2PFU/细胞，并且MDA-231细胞的为0.1PFU/细胞。在病毒暴露后的指定时间将Alamar-Blue(10μl/孔，Life Technologies)加入培养基并在37℃下孵育4小时。用GloMax DiscoverSystem(Promega)在560和600nm下读板。对于各时间点，细胞活力表示为感染细胞相对于未感染细胞AlamarBlue减少的百分比，每个样品中排除培养基的单独贡献。感染7天后，R-BP909和R-VG809在HER2-阳性SK-OV-3和MDA-MB-453中导致的细胞毒性的范围为70至90％。这两种病毒均不能杀死HER2-阴性MDA-MD-231癌细胞，这与其不能感染这些细胞一致(图7)。
实施例8：R-313在Vero-GCN4和在癌细胞系SK-OV-3中复制的能力
此前已经发现，插入scFv-HER2替代gD中的AA 6-38使得重组病毒R-LM113重新靶向HER2受体并且自粘连蛋白-1和HVEM两者去靶向。在本发明中，发明人提供了证据，表明携带在gB AA 43-44之间的scFv-HER2的R-BP909显示出完全重新定向的嗜性，其经由gB重新靶向HER2受体。
发明人进一步研究了gB是否是用以通过短肽的方式重新靶向HSV的适宜的糖蛋白，在此通过具有两个侧翼wt GCN4残基和两个GS接头的GCN4酵母转录因子的表位YHLENEVARLKK(SEQ ID NO:38)举例说明，在本申请中将其称为GCN4肽。20个氨基酸的肽应使得R-313具有在Vero-GCN4细胞系中感染和复制的能力，Vero-GCN4细胞系表达由与粘连蛋白-1的胞外域2、3、TM和C-尾融合的针对GCN4的scFv(Zahnd等，2004)构成的人造受体。
为检测R-313的嗜性，发明人利用了猿猴wt-Vero、Vero-GCN4、SK-OV-3和此前已描述的表达或不表达gD的受体的J细胞。用R-313感染所示细胞，并且如所示的，用曲妥珠单抗(别名赫赛汀)预处理细胞(终浓度28μg/ml)。感染后24小时通过绿色荧光显微镜对感染进行监测。
如图8中所示，观察到R-313感染未经处理的Vero-GCN4和Vero-wt，但在存在曲妥珠单抗的情况下，仅观察到对Vero-GCN4的感染。该结果表明R-313能够感染Vero-GCN4。与R-313对wt-Vero细胞的感染不同的是，这种感染不被赫赛汀抑制，表明其实际上是由gB中插入的GCN4肽所介导的。R-313对wt-Vero细胞的感染通过Vero细胞中存在的HER2的猿猴直系同源物发生，因为其实际上被将细胞暴露于赫赛汀所抑制。
如赫赛汀的抑制所证明的，scFv-HER2与gD融合仍使得能够通过HER2感染SK-OV-3细胞。J、J-粘连蛋白和J-HVEM缺乏感染确证了R-LM113已显示出的由于gD的AA 6-38缺失导致的去靶向特征。这一系列结果在一起表明R-313具有通过在gB中融合的GCN4肽感染Vero-GCN4细胞以及通过gD中的HER2感染SK-OV-3细胞的能力。
实施例9：R-313在Vero-GCN4和在SK-OV-3细胞中的复制程度
发明人比较了Vero-GCN4和SK-OV-3细胞中的重组体R-LM113和R-LM5的复制程度与R-313的复制程度。以0.1PFU/细胞的输入感染复数(根据在对应细胞系中所滴定的)在37℃下感染细胞90分钟；通过酸洗(40mM柠檬酸，10mM KCl，135mM NaCl[pH 3])的方式将未吸附的病毒灭活。在感染后的指定时间(3、24和48小时)冻存复制培养物，并且在SK-OV-3中滴定子代。图9中的结果表明R-313以高于R-LM113并与R-LM5相似的程度在Vero-GCN4中复制。R-313能够以与R-LM113相似的程度在SK-OV-3中复制，并且低于R-LM5几乎一个对数。
这些结果在一起表明R-313同时通过GCN4和通过HER2重新靶向。
实施例10：R-313在不同细胞系中的植板效率
对于植板效率实验，用复制等份的R-313的系列稀释物(从10-5至10-10)感染所示细胞单层。感染并去除接种物后，向平板中加入含有琼脂的培养基并且将单层在37℃下孵育3天以形成噬斑。在第3天，在荧光显微镜下对噬斑评分。附图显示R-313在SK-OV-3中的植板效率与在Vero-GCN4中非常相似；其均略高于在wt-Vero细胞中所观察到的，这确证了R-313可以另选地利用gB中工程化引入的GCN4肽和gD中插入的scFv-HER2，以分别进入Vero-GCN4和SK-OV-3细胞。R-313在J-HER2细胞中的植板效率与R-LM113在相同细胞中的植板效率无法区分，表明GCN4肽的插入并非是不利的(图10)。
实施例11：R-313在不同细胞系中的相对噬斑尺寸
为进行嗜斑尺寸测定，将10倍稀释的R-313、R-LM113和R-LM5铺板至Vero-GCN4、wt-Vero和SK-OV-3单层上。用含有琼脂的培养基覆盖感染的单层。3天后，使用荧光显微镜采集图像。代表性的图像表明，在任何检测的细胞系中，R-313形成了比R-LM113更大的嗜斑。反过来，R-LM5形成的嗜斑比R-313形成的嗜斑还要更大(图11)。
实施例12：
A)R-315：在已在gD中AA 6-38的缺失中表达scFv-HER2的HSV重组体中的HSV gB的AA 81和82之间插入GCN4肽。
该方法与上文所述的在R-313的gB中工程化引入GCN4肽的方法相同，差异如下。首先，使用pGalK作为模板，通过引物为gB81fGALK
CGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAAACCCACCGCCGCCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:15)和gB81GALKrev
CGCAGGGTGGCGTGGCCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:16)的方式扩增galK表达盒。接下来，通过使用引物gB_81_GCN4_for
CGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAAACCCACCGCCGCCGGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC(SEQ ID NO:49)和gB_81_GCN4_rev
CGCAGGGTGGCGTGGCCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(SEQ ID NO:50)进行退火和延伸，产生具有下游和上游Ser-Gly接头并且由gB的同源臂括起的GCN4肽表达盒(SEQ ID NO:36，编码SEQ ID NO:37)，其引入了BamHI核酸内切酶的沉默限制性酶切位点，用于通过限制性分析的方式筛选菌落。重组基因组编码嵌合gB(SEQ ID NO:51)，其携带GCN4肽，所述GCN4肽包括序列为GS的一个下游和一个上游Ser-Gly接头。
B)R-317：在已在gD中AA 6-38的缺失中表达scFv-HER2的HSV重组体中的HSV gB的AA 76和77之间插入GCN4肽。
该方法与上文所述的在R-315的gB中工程化引入GCN4肽的方法相同，差异如下。首先，使用pGalK作为模板，通过引物为gB_76_galK_for
GGCCCCGCCCCAACGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAACCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:44)和gB_76_galK_rev
CCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGCGGCGGCGGTGGGTTTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:45)的方式扩增galK表达盒。接下来，通过使用引物gB_76_GCN4_for
GGCCCCGCCCCAACGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC(SEQ ID NO:46)和gB_76_GCN4_rev
CCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGCGGCGGCGGTGGGTTGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(SEQID NO:47)进行退火和延伸，产生具有下游和上游Ser-Gly接头并且由gB的同源臂括起的GCN4肽表达盒(SEQ ID NO:36，编码SEQ ID NO:37)，其引入了BamHI核酸内切酶的沉默限制性酶切位点，用于通过限制性分析的方式筛选菌落。重组基因组编码嵌合gB(SEQ ID NO:48)，其携带GCN4肽，所述GCN4肽包括序列为GS的一个下游和一个上游Ser-Gly接头。
C)R-319：在已在gD中AA 6-38的缺失中表达scFv-HER2的HSV重组体中的HSV gB的AA 95和96之间插入GCN4肽。
该方法与上文所述的在R-317的gB中工程化引入GCN4肽的方法相同，差异如下。首先，使用pGalK作为模板，通过引物为gB_95_galK_for
CGCCGCCGCGCCCCGCCGGCGACAACGCGACCGTCGCCGCGGGCCACGCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:52)和gB_95_galK_rev
GTTTGCATCGGTGTTCTCCGCCTTGATGTCCCGCAGGTGCTCGCGCAGGGTTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:53)扩增galK表达盒。接下来，通过使用引物gB_95_GCN4_for
CGCCGCCGCGCCCCGCCGGCGACAACGCGACCGTCGCCGCGGGCCACGCCGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC
(SEQ ID NO:54)和gB_95_GCN4_rev
GTTTGCATCGGTGTTCTCCGCCTTGATGTCCCGCAGGTGCTCGCGCAGGGTGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(SEQID NO:55)进行退火和延伸，产生具有下游和上游Ser-Gly接头并且由gB的同源臂括起的GCN4肽表达盒(SEQ ID NO:36，编码SEQ ID NO:37)，其引入了BamHI核酸内切酶的沉默限制性酶切位点，用于通过限制性分析筛选菌落。重组基因组编码嵌合gB(SEQ ID NO:56)，其携带GCN4肽，所述GCN4肽包括序列为GS的一个下游和一个上游Ser-Gly接头。
为了重构重组病毒R-BP909，通过Lipofectamine 2000(Life Technologies)将500ng重组BAC DNA转染至称为R6的gD-互补细胞系(在HSV晚期UL26.5启动子的控制下表达wt-gD的家兔皮肤细胞系)(Zhou等，2000)，然后在SK-OV-3细胞中生长。通过绿色荧光监测病毒生长。通过对R-BP909的整个gB以及gD和gH ORF，以及R-BP903和R-BP901的gB中的scFvHER2和插入位点进行测序，对重组体的结构进行验证。我们识别到了重组病毒R-909的gB的一个突变(Y276S)，其不存在于经工程改造的BAC-DNA中。在SK-OV-3细胞中产生并滴定病毒原液。
为了重构重组病毒R-BP901、R-BP903、R-313、R-315、R-317和R-319，通过Lipofectamine 2000(Life Technologies)将500ng重组BAC DNA转染至SK-OV-3细胞。通过绿色荧光监测病毒生长。将R-313病毒在SK-OV-3中传代6次，反复冻融以裂解SK-OV-3细胞，随后使其在Vero-GCN4细胞中生长。在Vero-GCN4中产生病毒原液，并且在Vero-GCN4、wt-Vero和SK-OV-3细胞中对其进行滴定。通过对整个gB进行测序，部分验证了重组体R-313、R-315、R-317和R-319的基因组。
实施例13：R-313、R-315、R-317和R-319在Vero-GCN4R和在癌细胞系SK-OV-3中复制的能力
此前已经表明，插入scFv-HER2替代gD中的AA 6-38使得重组病毒R-LM113重新靶向HER2受体并且自粘连蛋白-1和HVEM二者去靶向。在本发明中，发明人提供了证据，表明携带gB的AA 43-44之间的scFv-HER2的R-BP909显示出完全重新定向的嗜性，其经由gB重新靶向HER2受体。
发明人进一步研究了gB是否是用以通过短肽的方式重新靶向HSV的适宜的糖蛋白，在此通过具有两个侧翼wt GCN4残基和两个GS接头的GCN4酵母转录因子的表位YHLENEVARLKK(SEQ ID NO:38)举例说明，在本申请中将其称为GCN4肽。20个氨基酸的肽应使得R-313、R-315、R-317和R-319具有在Vero-GCN4细胞系中感染和复制的能力，Vero-GCN4细胞系表达由与粘连蛋白-1的胞外域2、3、TM和C-尾融合的针对GCN4的scFv(Zahnd等，2004)构成的人造受体。
为检测R-313、R-315、R-317和R-319的嗜性，发明人利用了猿猴wt-Vero、Vero-GCN4R、SK-OV-3和此前已描述的表达或不表达gD的受体的J细胞。用所示重组体感染所示细胞，并且如所示的，用曲妥珠单抗(别名赫赛汀)预处理细胞(终浓度28μg/ml)。感染后24小时通过绿色荧光显微镜对感染进行监测。
如图8中所示，观察到R-313(板块A)、R-315(板块B)、R-317(板块C)和R-319(板块D)感染未经处理的Vero-GCN4R和Vero-wt，但在存在曲妥珠单抗(别名赫赛汀)的情况下，仅观察到对Vero-GCN4R的感染。该结果表明在gB的不同位置携带GCN4肽插入的所有重组病毒均能够感染Vero-GCN4R。与对wt-Vero细胞的感染不同的是，对Vero-GCN4R的感染不被赫赛汀抑制，表明其实际上是由gB中插入的GCN4肽所介导的。R-313、R-315、R-317和R-319对wt-Vero细胞的感染通过Vero细胞中存在的HER2的猿猴直系同源物发生，因为其实际上被将细胞暴露于赫赛汀所抑制。
如赫赛汀的抑制所证明的，插入gD中的scFv-HER2仍使得能够通过HER2感染SK-OV-3。缺乏对J、J-粘连蛋白和J-HVEM的感染确证了R-LM113已显示出的由于gD的AA 6-38缺失导致的去靶向特征。这一系列结果在一起表明R-313、R-315、R-317和R-319具有通过在gB中插入的GCN4肽感染Vero-GCN4细胞以及通过gD中的HER2感染SK-OV-3细胞的能力。
实施例14：R-313、R-315、R-317和R-319在Vero-GCN4R和在SK-OV-3细胞中的复制程度
发明人在SK-OV-3细胞(图9A)和在Vero-GCN4R(图9B)中比较了R-313、R-315、R-317、R-319与重组体R-LM113和R-LM5的复制程度。以0.1PFU/细胞的输入感染复数(根据在对应细胞系中所滴定的)在37℃下感染细胞90分钟；通过酸洗(40mM柠檬酸，10mM KCl，135mM NaCl[pH 3])的方式将未吸附的病毒灭活。在感染后的指定时间(24和48小时)冻存复制培养物，并且在SK-OV-3中滴定子代。从图9A中可以看出在SK-OV-3中R-315和R-317生长至与R-LM5和R-LM113相似的滴度。相比之下，R-313和R-319的生长低于R-315和R-317约一至两个对数。图9B中的结果表明在Vero-GCN4R中R-313、R-315和R-317以与R-LM113相似的程度复制，并且低于R-LM5一个对数。而R-319的生长低于R-315、R-317和R-319约一至两个对数。
这些结果在一起表明R-313、R-315、R-317和R-319同时通过GCN4和通过HER2重新靶向。
实施例15：R-313、R-315、R-317和R-319在不同细胞系中的植板效率
发明人比较了R-313、R-315、R-317和R-319在不同细胞系中形成噬斑数的能力(图10)。根据在SK-OV-3细胞中所滴定的，将复制等份的含有相同病毒量(50PFU)的R-LM5、R-LM113、R-313、R-315、R-317和R-319铺板至wt-Vero、Vero-GCN4R和SK-OV-3上。用含有琼脂的培养基覆盖感染单层并且在3天后对噬斑数量进行评分。
实验结果表明，与wt-Vero相比，在Vero-GCN4R细胞上在gB中携带GCN4肽插入的所有重组病毒(R-313、R-315、R-317和R-319)而非对照病毒的植板效率更高。所有gB-重组体在Vero-GCN4R和在SK-OV-3细胞中显示出相似的植板效率。
实施例16：R-313、R-315、R-317和R-319在不同细胞系中的相对噬斑尺寸
为了进行噬斑尺寸测定，将10倍稀释的R-313、R-315、R-317和R-319铺板至Vero-GCN4R、wt-Vero和SK-OV-3单层上。用含有琼脂的培养基覆盖感染的单层。3天后，使用荧光显微镜采集图像。代表性的图像表明，在任何检测的细胞系中，R-313、R-315、R-317和R-319形成了比R-LM113更大的嗜斑。R-LM5形成的噬斑还要更大(图11)。为确定噬斑尺寸(图11B)，每种病毒获取5个噬斑的图像。用Nis Elements-Imaging软件(Nikon)测量噬斑面积(pxE2)。每个结果以平均面积±SD表示。
实施例17：R-321：在已在gD中AA 6-38的缺失中表达scFv-HER2并且在gB的AA 43和44之间表达GCN4肽的HSV重组体中重新引入gD的AA 6-29和31-37。
首先，使用pGalK作为模板，通过引物为gD5_galK_f
TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:57)和scFv_galK_rev
GAGGCGGACAGGGAGCTCGGGGACTGGGTCATCTGGATATCGGAATTCTCTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:58)的方式扩增galK表达盒。通过galK重组工程的方式将galK表达盒插入R-313骨架中。接下来，通过使用引物gDdel30_38for
TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGGATGCCTCTCTCAAGATGGCCGACCCCAATCGCTTTCGCGGCAAAGACCTTCCGGTCC(SEQ ID NO:59)和gDdel30_38rev
GAGGCGGACAGGGAGCTCGGGGACTGGGTCATCTGGATATCGGAATTCTCCACGCGCCGGACCCCCGGAGGGGTCAGCTGGTCCAGGACCGGAAGGTCTTTGCCGCGA(SEQ ID NO:60)进行退火和延伸，产生包含gD的AA 6-29和31-37的寡聚物。重组基因组编码嵌合gD(SEQ ID NO:61)，其携带gD的AA 30和38缺失以及在gD的AA 37之后插入scFv-HER2。SEQ ID NO:35显示了具有插入氨基酸43和44之间的GCN4肽的嵌合gB。通过对gD的区域6-37的上游和下游进行测序验证重组BAC的结构。
为了重构重组病毒R-321，通过Lipofectamine 2000(Life Technologies)将500ng重组BAC DNA转染至SK-OV-3细胞。通过绿色荧光监测病毒生长。将R-321病毒在SK-OV-3中传代6次，反复冻融以裂解SK-OV-3细胞，随后使其在Vero-GCN4R细胞中生长。
实施例18：R-321自HSV-1天然受体去靶向
此前已经表明，插入scFv-HER2替代gD的AA 6-38使得重组病毒R-LM113重新靶向HER2受体并且自粘连蛋白-1和HVEM去靶向。在本发明中，发明人提供的证据表明，携带仅gD的AA 30和38的缺失以及在gD的AA 37之后插入scFv-HER2的R-321显示出完全去靶向特征，因为其丧失了通过HSV-1天然受体感染的能力。而且，与R-313一样，R-321携带gB的AA 43和44之间的GCN4肽。
为检测R-321的嗜性，发明人利用了猿猴wt-Vero、Vero-GCN4、SK-OV-3和此前已描述的表达或不表达gD的受体的J细胞。用R-321感染所示细胞，并且如所示的，使用曲妥珠单抗(别名赫赛汀)预处理细胞(终浓度28μg/ml)。感染24小时后通过绿色荧光显微镜对感染进行监测。
J、J-粘连蛋白和J-HVEM缺乏感染(图15)表明R-321由于gD的AA 30和38的缺失而自HSV-1天然受体去靶向。如赫赛汀的抑制所证明的，scFv-HER2与gD融合使得能够通过HER2感染SK-OV-3细胞。如图15中所示，R-321感染未经处理的Vero-GCN4R和Vero-wt，但在存在曲妥珠单抗(别名赫赛汀)的情况下，仅观察到对Vero-GCN4R的感染。该结果表明，与R-313一样，R-321能够感染Vero-GCN4R。与感染wt-Vero细胞不同的是，Vero-GCN4R的感染不被赫赛汀抑制，表明其实际上是由gB中插入的GCN4肽所介导的。R-321的感染通过在Vero细胞中存在的HER2的猿猴直系同源物发生，因为其实际上被将细胞暴露于赫赛汀所抑制。
这些结果在一起表明R-321同时通过GCN4和通过HER2重新靶向，并且由于gD中aa30和38的缺失而自HSV天然受体去靶向。
实施例19：R-321在Vero-GCN4R和在SK-OV-3细胞中的复制程度
发明人在SK-OV-3细胞(图16A)和在Vero-GCN4R细胞(图16B)中比较了R-321与重组体R-LM113和R-LM5的复制程度。以0.1PFU/细胞的输入感染复数(根据在对应细胞系中所滴定的)在37℃下感染细胞90分钟；通过酸洗(40mM柠檬酸，10mM KCl，135mM NaCl[pH 3])的方式将未吸附的病毒灭活。在感染后的指定时间(24和48小时)冻存复制培养物，并且在SK-OV-3中滴定子代。从图16A中可以看出，R-321在SK-OV-3细胞中生长至与R-LM5和R-LM113相似的滴度。图16B中的结果表明R-321在Vero-GCN4R中以高于R-LM113一个对数，并且以与R-LM5相似的程度复制。
实施例20：Vero-GCN4细胞系
Vero GCN4细胞系表达人造嵌合受体，其由与粘连蛋白-1融合的针对GCN4肽的scFv(Zahnd等，2004)构成，其具有如SEQ ID NO:39所示的针对人密码子使用进行优化的序列。GCN4肽是酿酒酵母转录因子GCN4的一部分，该部分mRNA序列如SEQ ID NO 42所示。更详细地，如在pDISPLAY(Invitrogen)载体中，存在N-末端前导肽和HA标签序列。这将确保前导肽有效正确的加工。在HA标签之后，在scFv的上游存在短GA接头。针对GCN4的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。在scFv的C-末端存在短GSGA接头。分子其余部分对应于人粘连蛋白-1(PVRL1)的残基Met143至Val517，其包含粘连蛋白-1胞外域2和3、TM区段和胞内胞质尾(图12)。通过Gene Art体外合成嵌合体，并将其克隆至pcDNA3.1-Hygro_(+)中，结果产生质粒scFv_GCN4_粘连蛋白1嵌合体，其插入物具有如SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列，其编码scFv-GCN4粘连蛋白1嵌合体的氨基酸序列SEQ ID NO:41。
通过Lipofectamine 2000将来自质粒scFv_GCN4_粘连蛋白1嵌合体的DNA转染至Vero细胞(ATCC CCL-81TM)。通过潮霉素(200μg/ml)的方式选择表达针对GCN4肽的人造受体的Vero细胞，随后结合针对HA标签的MAb通过磁珠(Miltenyi)的方式分选。分选的细胞在96孔板(0.5个细胞/孔)中进行单细胞克隆。
通过FACS对单一克隆进行分析，以通过针对HA标签的MAb的方式检测针对GCN4肽的scFv的表达。所选择的克隆是11.2。我们确定在Vero-GCN4细胞系的连续传代期间，人造受体的表达在40次连续传代后仍保持稳定(图13)。
参考文献
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序列表
<110> 大学之母 博洛尼亚大学
<120> 具有经修饰的糖蛋白B的疱疹病毒
<130> U70233PC
<150> EP 16173830.7
<151> 2016-06-09
<160> 62
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 904
<212> PRT
<213> 单纯疱疹病毒1
<400> 1
Met Arg Gln Gly Ala Pro Ala Arg Gly Cys Arg Trp Phe Val Val Trp
1 5 10 15
Ala Leu Leu Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Val Ala Ser Ala Ala Pro
20 25 30
Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Thr
50 55 60
Gly Asp Thr Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Pro Pro
65 70 75 80
Pro Arg Pro Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala Gly His Ala Thr
85 90 95
Leu Arg Glu His Leu Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn Thr Asp Ala Asn
100 105 110
Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val Val Gln Phe Glu
115 120 125
Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln Asn Tyr Thr Glu
130 135 140
Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro Tyr Lys Phe Lys
145 150 155 160
Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln Val Trp Phe Gly
165 170 175
His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ala Pro Val
180 185 190
Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys Gly Val Cys Arg
195 200 205
Ser Thr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr Thr Ala Phe His
210 215 220
Arg Asp Asp His Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro Ala Asn Ala Ala
225 230 235 240
Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp His Thr Thr Asp Leu Lys Tyr Asn Pro
245 250 255
Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr Gly Thr Thr Val Asn Cys Ile
260 265 270
Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr Asp Glu Phe Val
275 280 285
Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr Gly Tyr Arg
290 295 300
Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala Asp Arg Phe Lys
305 310 315 320
Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr Lys Ala Arg Ala
325 330 335
Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe Thr Val
340 345 350
Ala Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys Thr Met Thr Lys
355 360 365
Trp Gln Glu Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr Gly Gly Ser Phe
370 375 380
Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile Ser Thr Thr Phe Thr Thr Asn Leu Thr
385 390 395 400
Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu Gly Asp Cys Ile Gly Lys Asp
405 410 415
Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg Arg Tyr Asn Ala Thr
420 425 430
His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala Asn Gly Gly Phe
435 440 445
Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu Ala Glu Leu Tyr
450 455 460
Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Arg Lys Pro Pro Asn Pro Thr
465 470 475 480
Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val Glu Arg Ile Lys
485 490 495
Thr Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr Tyr Asn His
500 505 510
Ile Gln Arg His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val Ala Ile Ala Trp
515 520 525
Cys Glu Leu Gln Asn His Glu Leu Thr Leu Trp Asn Glu Ala Arg Lys
530 535 540
Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ser Ala Thr Val Gly Arg Arg Val Ser
545 550 555 560
Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser Thr Cys Val Pro Val
565 570 575
Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg Ile Ser Ser Arg
580 585 590
Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe Arg Tyr Glu Asp
595 600 605
Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn Asn Glu Leu Arg
610 615 620
Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly His Arg Arg Tyr
625 630 635 640
Phe Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu Tyr Ala Tyr Ser
645 650 655
His Gln Leu Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser Thr Phe Ile Asp
660 665 670
Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu Asp His Glu Phe Val Pro Leu Glu Val
675 680 685
Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys Asp Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Thr Glu
690 695 700
Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp Leu Arg Phe Ala Asp Ile Asp
705 710 715 720
Thr Val Ile His Ala Asp Ala Asn Ala Ala Met Phe Ala Gly Leu Gly
725 730 735
Ala Phe Phe Glu Gly Met Gly Asp Leu Gly Arg Ala Val Gly Lys Val
740 745 750
Val Met Gly Ile Val Gly Gly Val Val Ser Ala Val Ser Gly Val Ser
755 760 765
Ser Phe Met Ser Asn Pro Phe Gly Ala Leu Ala Val Gly Leu Leu Val
770 775 780
Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Phe Phe Ala Phe Arg Tyr Val Met Arg
785 790 795 800
Leu Gln Ser Asn Pro Met Lys Ala Leu Tyr Pro Leu Thr Thr Lys Glu
805 810 815
Leu Lys Asn Pro Thr Asn Pro Asp Ala Ser Gly Glu Gly Glu Glu Gly
820 825 830
Gly Asp Phe Asp Glu Ala Lys Leu Ala Glu Ala Arg Glu Met Ile Arg
835 840 845
Tyr Met Ala Leu Val Ser Ala Met Glu Arg Thr Glu His Lys Ala Lys
850 855 860
Lys Lys Gly Thr Ser Ala Leu Leu Ser Ala Lys Val Thr Asp Met Val
865 870 875 880
Met Arg Lys Arg Arg Asn Thr Asn Tyr Thr Gln Val Pro Asn Lys Asp
885 890 895
Gly Asp Ala Asp Glu Asp Asp Leu
900
<210> 2
<211> 1163
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 在氨基酸43和44之间插入曲妥珠单抗scFv的gB前体（SEQ ID NO: 1）的
氨基酸序列，由构建体R-BP903和R-BP909编码。
<400> 2
Met Arg Gln Gly Ala Pro Ala Arg Gly Cys Arg Trp Phe Val Val Trp
1 5 10 15
Ala Leu Leu Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Val Ala Ser Ala Ala Pro
20 25 30
Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Ser Asp Ile Gln Met
35 40 45
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
50 55 60
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr
65 70 75 80
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser
85 90 95
Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly
100 105 110
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln
130 135 140
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn
145 150 155 160
Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser Glu Val Gln Leu Val
165 170 175
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
180 185 190
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val
195 200 205
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro
210 215 220
Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
225 230 235 240
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
245 250 255
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly
260 265 270
Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
275 280 285
Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Thr Gln
290 295 300
Ala Ala Asn Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Pro Gly Pro
305 310 315 320
Ala Pro Thr Gly Asp Thr Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn
325 330 335
Pro Pro Pro Pro Arg Pro Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala Gly
340 345 350
His Ala Thr Leu Arg Glu His Leu Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn Thr
355 360 365
Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val Val
370 375 380
Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln Asn
385 390 395 400
Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro Tyr
405 410 415
Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln Val
420 425 430
Trp Phe Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp Arg
435 440 445
Ala Pro Val Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys Gly
450 455 460
Val Cys Arg Ser Thr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr Thr
465 470 475 480
Ala Phe His Arg Asp Asp His Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro Ala
485 490 495
Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp His Thr Thr Asp Leu Lys
500 505 510
Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr Gly Thr Thr Val
515 520 525
Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr Asp
530 535 540
Glu Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr
545 550 555 560
Gly Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala Asp
565 570 575
Arg Phe Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr Lys
580 585 590
Ala Arg Ala Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys
595 600 605
Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys Thr
610 615 620
Met Thr Lys Trp Gln Glu Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr Gly
625 630 635 640
Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile Ser Thr Thr Phe Thr Thr
645 650 655
Asn Leu Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu Gly Asp Cys Ile
660 665 670
Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg Arg Tyr
675 680 685
Asn Ala Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala Asn
690 695 700
Gly Gly Phe Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu Ala
705 710 715 720
Glu Leu Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Arg Lys Pro Pro
725 730 735
Asn Pro Thr Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val Glu
740 745 750
Arg Ile Lys Thr Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr
755 760 765
Tyr Asn His Ile Gln Arg His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val Ala
770 775 780
Ile Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn His Glu Leu Thr Leu Trp Asn Glu
785 790 795 800
Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ser Ala Thr Val Gly Arg
805 810 815
Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser Thr Cys
820 825 830
Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg Ile
835 840 845
Ser Ser Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe Arg
850 855 860
Tyr Glu Asp Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn Asn
865 870 875 880
Glu Leu Arg Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly His
885 890 895
Arg Arg Tyr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu Tyr
900 905 910
Ala Tyr Ser His Gln Leu Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser Thr
915 920 925
Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu Asp His Glu Phe Val Pro
930 935 940
Leu Glu Val Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys Asp Ser Gly Leu Leu Asp
945 950 955 960
Tyr Thr Glu Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp Leu Arg Phe Ala
965 970 975
Asp Ile Asp Thr Val Ile His Ala Asp Ala Asn Ala Ala Met Phe Ala
980 985 990
Gly Leu Gly Ala Phe Phe Glu Gly Met Gly Asp Leu Gly Arg Ala Val
995 1000 1005
Gly Lys Val Val Met Gly Ile Val Gly Gly Val Val Ser Ala Val
1010 1015 1020
Ser Gly Val Ser Ser Phe Met Ser Asn Pro Phe Gly Ala Leu Ala
1025 1030 1035
Val Gly Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Phe Phe Ala
1040 1045 1050
Phe Arg Tyr Val Met Arg Leu Gln Ser Asn Pro Met Lys Ala Leu
1055 1060 1065
Tyr Pro Leu Thr Thr Lys Glu Leu Lys Asn Pro Thr Asn Pro Asp
1070 1075 1080
Ala Ser Gly Glu Gly Glu Glu Gly Gly Asp Phe Asp Glu Ala Lys
1085 1090 1095
Leu Ala Glu Ala Arg Glu Met Ile Arg Tyr Met Ala Leu Val Ser
1100 1105 1110
Ala Met Glu Arg Thr Glu His Lys Ala Lys Lys Lys Gly Thr Ser
1115 1120 1125
Ala Leu Leu Ser Ala Lys Val Thr Asp Met Val Met Arg Lys Arg
1130 1135 1140
Arg Asn Thr Asn Tyr Thr Gln Val Pro Asn Lys Asp Gly Asp Ala
1145 1150 1155
Asp Glu Asp Asp Leu
1160
<210> 3
<211> 1171
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 在氨基酸81和82之间插入曲妥珠单抗scFv的gB前体（SEQ ID NO: 1）的
氨基酸序列
<400> 3
Met Arg Gln Gly Ala Pro Ala Arg Gly Cys Arg Trp Phe Val Val Trp
1 5 10 15
Ala Leu Leu Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Val Ala Ser Ala Ala Pro
20 25 30
Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Thr
50 55 60
Gly Asp Thr Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Pro Pro
65 70 75 80
Pro His Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
85 90 95
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
100 105 110
Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln
115 120 125
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu
130 135 140
Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp
145 150 155 160
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
165 170 175
Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
180 185 190
Lys Val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe
195 200 205
Arg Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
225 230 235 240
Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln
245 250 255
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn
260 265 270
Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
275 280 285
Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
290 295 300
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly
305 310 315 320
Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
325 330 335
Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Arg Pro Ala Gly
340 345 350
Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala Gly His Ala Thr Leu Arg Glu His Leu
355 360 365
Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn Thr Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro
370 375 380
Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys
385 390 395 400
Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val
405 410 415
Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro Tyr Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr
420 425 430
Lys Asp Val Thr Val Ser Gln Val Trp Phe Gly His Arg Tyr Ser Gln
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr Thr Ala Phe His Arg Asp Asp His Glu
485 490 495
Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro Ala Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser Arg
500 505 510
Gly Trp His Thr Thr Asp Leu Lys Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala
515 520 525
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530 535 540
Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr Asp Glu Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp
545 550 555 560
Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr Gly Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr
565 570 575
Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala Asp Arg Phe Lys Gln Val Asp Gly Phe
580 585 590
Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr Lys Ala Arg Ala Thr Ala Pro Thr Thr
595 600 605
Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Val
610 615 620
Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys Thr Met Thr Lys Trp Gln Glu Val Asp
625 630 635 640
Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser Asp
645 650 655
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660 665 670
Arg Val Asp Leu Gly Asp Cys Ile Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met
675 680 685
Asp Arg Ile Phe Ala Arg Arg Tyr Asn Ala Thr His Ile Lys Val Gly
690 695 700
Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala Asn Gly Gly Phe Leu Ile Ala Tyr Gln
705 710 715 720
Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu Ala Glu Leu Tyr Val Arg Glu His Leu
725 730 735
Arg Glu Gln Ser Arg Lys Pro Pro Asn Pro Thr Pro Pro Pro Pro Gly
740 745 750
Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val Glu Arg Ile Lys Thr Thr Ser Ser Ile
755 760 765
Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr Tyr Asn His Ile Gln Arg His Val
770 775 780
Asn Asp Met Leu Gly Arg Val Ala Ile Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn
785 790 795 800
His Glu Leu Thr Leu Trp Asn Glu Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala
805 810 815
Ile Ala Ser Ala Thr Val Gly Arg Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly
820 825 830
Asp Val Met Ala Val Ser Thr Cys Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val
835 840 845
Ile Val Gln Asn Ser Met Arg Ile Ser Ser Arg Pro Gly Ala Cys Tyr
850 855 860
Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe Arg Tyr Glu Asp Gln Gly Pro Leu Val
865 870 875 880
Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn Asn Glu Leu Arg Leu Thr Arg Asp Ala
885 890 895
Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly His Arg Arg Tyr Phe Thr Phe Gly Gly
900 905 910
Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu Tyr Ala Tyr Ser His Gln Leu Ser Arg
915 920 925
Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser Thr Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr Met
930 935 940
Leu Glu Asp His Glu Phe Val Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg His Glu
945 950 955 960
Ile Lys Asp Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Thr Glu Val Gln Arg Arg Asn
965 970 975
Gln Leu His Asp Leu Arg Phe Ala Asp Ile Asp Thr Val Ile His Ala
980 985 990
Asp Ala Asn Ala Ala Met Phe Ala Gly Leu Gly Ala Phe Phe Glu Gly
995 1000 1005
Met Gly Asp Leu Gly Arg Ala Val Gly Lys Val Val Met Gly Ile
1010 1015 1020
Val Gly Gly Val Val Ser Ala Val Ser Gly Val Ser Ser Phe Met
1025 1030 1035
Ser Asn Pro Phe Gly Ala Leu Ala Val Gly Leu Leu Val Leu Ala
1040 1045 1050
Gly Leu Ala Ala Ala Phe Phe Ala Phe Arg Tyr Val Met Arg Leu
1055 1060 1065
Gln Ser Asn Pro Met Lys Ala Leu Tyr Pro Leu Thr Thr Lys Glu
1070 1075 1080
Leu Lys Asn Pro Thr Asn Pro Asp Ala Ser Gly Glu Gly Glu Glu
1085 1090 1095
Gly Gly Asp Phe Asp Glu Ala Lys Leu Ala Glu Ala Arg Glu Met
1100 1105 1110
Ile Arg Tyr Met Ala Leu Val Ser Ala Met Glu Arg Thr Glu His
1115 1120 1125
Lys Ala Lys Lys Lys Gly Thr Ser Ala Leu Leu Ser Ala Lys Val
1130 1135 1140
Thr Asp Met Val Met Arg Lys Arg Arg Asn Thr Asn Tyr Thr Gln
1145 1150 1155
Val Pro Asn Lys Asp Gly Asp Ala Asp Glu Asp Asp Leu
1160 1165 1170
<210> 4
<211> 394
<212> PRT
<213> 单纯疱疹病毒1
<400> 4
Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val
1 5 10 15
Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala
20 25 30
Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro
35 40 45
Val Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg Arg Val Tyr His
50 55 60
Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile
65 70 75 80
Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu
85 90 95
Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp
100 105 110
Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly
115 120 125
Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser
130 135 140
Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp
145 150 155 160
Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe
165 170 175
Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu
180 185 190
Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His
195 200 205
Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro
210 215 220
Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr Val Asp
225 230 235 240
Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val
245 250 255
Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro
260 265 270
Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala
275 280 285
Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu
290 295 300
Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro Pro Asn Trp His
305 310 315 320
Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr
325 330 335
Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu
340 345 350
Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr
355 360 365
Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg Glu Asp Asp
370 375 380
Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr
385 390
<210> 5
<211> 361
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 缺失氨基酸31-63（对应于成熟gD中的氨基酸6至38）的HSV-1 gD
野生型前体（SEQ ID NO: 4）的氨基酸序列
<400> 5
Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val
1 5 10 15
Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala His Ile
20 25 30
Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr
35 40 45
Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu Asn
50 55 60
Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp Val
65 70 75 80
Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly
85 90 95
Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr
100 105 110
Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp Asn
115 120 125
Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu
130 135 140
Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Val
145 150 155 160
Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His Arg
165 170 175
Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ser
180 185 190
Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr Val Asp Ser
195 200 205
Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val Ala
210 215 220
Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr
225 230 235 240
Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr
245 250 255
Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu
260 265 270
Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro Pro Asn Trp His Ile
275 280 285
Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr Pro
290 295 300
Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu Ala
305 310 315 320
Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr Gln
325 330 335
Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg Glu Asp Asp Gln
340 345 350
Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr
355 360
<210> 6
<211> 621
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 在氨基酸30-64（对应于成熟gD的氨基酸5-39）之间插入曲妥珠单抗
scFv的HSV-1 gD野生型前体（SEQ ID NO: 4）的氨基酸序列
<400> 6
Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val
1 5 10 15
Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Glu Asn
20 25 30
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
35 40 45
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr
50 55 60
Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
100 105 110
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro
115 120 125
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro
130 135 140
Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser
145 150 155 160
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
165 170 175
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
180 185 190
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
195 200 205
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
210 215 220
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
225 230 235 240
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
245 250 255
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
260 265 270
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Ser His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser
290 295 300
Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser
305 310 315 320
Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala
325 330 335
Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe
340 345 350
Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr
355 360 365
Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gln
370 375 380
Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn
385 390 395 400
Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr
405 410 415
Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile
420 425 430
Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg
435 440 445
Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val
450 455 460
Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln
465 470 475 480
Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro
485 490 495
Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr
500 505 510
Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser
515 520 525
Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro Pro
530 535 540
Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His Pro
545 550 555 560
Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly
565 570 575
Ser Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met Arg
580 585 590
Arg Arg Thr Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg
595 600 605
Glu Asp Asp Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr
610 615 620
<210> 7
<211> 801
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 如在R-BP901中的Ser-Gly接头括起的pSG-ScFvHER2-SG曲妥珠单抗scFv
表达盒
<400> 7
catagtagtg gcggtggctc tggatccgat atccagatga cccagtcccc gagctccctg 60
tccgcctctg tgggcgatag ggtcaccatc acctgccgtg ccagtcagga tgtgaatact 120
gctgtagcct ggtatcaaca gaaaccagga aaagctccga agcttctgat ttactcggca 180
tccttcctct actctggagt cccttctcgc ttctctggta gccgttccgg gacggatttc 240
actctgacca tcagcagtct gcagccggaa gacttcgcaa cttattactg tcagcaacat 300
tatactactc ctcccacgtt cggacagggt accaaggtgg agatcaaatc ggatatgccg 360
atggctgatc cgaaccgttt ccgcggtaag aacctggttt ttcattctga ggttcagctg 420
gtggagtctg gcggtggcct ggtgcagcca gggggctcac tccgtttgtc ctgtgcagct 480
tctggcttca acattaaaga cacctatata cactgggtgc gtcaggcccc gggtaagggc 540
ctggaatggg ttgcaaggat ttatcctacg aatggttata ctagatatgc cgatagcgtc 600
aagggccgtt tcactataag cgcagacaca tccaaaaaca cagcctacct acaaatgaac 660
agcttaagag ctgaggacac tgccgtctat tattgtagcc gctggggagg ggacggcttc 720
tatgctatgg actactgggg tcaaggaaca ctagtcaccg tctcctcgag tggcggtggc 780
tctggttccg gtggatccgg t 801
<210> 8
<211> 267
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 如在R-BP901中的Ser-Gly接头括起的pSG-ScFvHER2-SG曲妥珠单抗scFv
<400> 8
His Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
1 5 10 15
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20 25 30
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
35 40 45
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr
50 55 60
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75 80
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105 110
Val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg
115 120 125
Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
145 150 155 160
Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala
165 170 175
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly
180 185 190
Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala
195 200 205
Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
210 215 220
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe
225 230 235 240
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly
260 265
<210> 9
<211> 777
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> R-BP901中存在的曲妥珠单抗scFv表达盒，但缺少8个残基长的Ser-Gly
上游接头
<400> 9
tccgatatcc agatgaccca gtccccgagc tccctgtccg cctctgtggg cgatagggtc 60
accatcacct gccgtgccag tcaggatgtg aatactgctg tagcctggta tcaacagaaa 120
ccaggaaaag ctccgaagct tctgatttac tcggcatcct tcctctactc tggagtccct 180
tctcgcttct ctggtagccg ttccgggacg gatttcactc tgaccatcag cagtctgcag 240
ccggaagact tcgcaactta ttactgtcag caacattata ctactcctcc cacgttcgga 300
cagggtacca aggtggagat caaatcggat atgccgatgg ctgatccgaa ccgtttccgc 360
ggtaagaacc tggtttttca ttctgaggtt cagctggtgg agtctggcgg tggcctggtg 420
cagccagggg gctcactccg tttgtcctgt gcagcttctg gcttcaacat taaagacacc 480
tatatacact gggtgcgtca ggccccgggt aagggcctgg aatgggttgc aaggatttat 540
cctacgaatg gttatactag atatgccgat agcgtcaagg gccgtttcac tataagcgca 600
gacacatcca aaaacacagc ctacctacaa atgaacagct taagagctga ggacactgcc 660
gtctattatt gtagccgctg gggaggggac ggcttctatg ctatggacta ctggggtcaa 720
ggaacactag tcaccgtctc ctcgagtggc ggtggctctg gttccggtgg atccggt 777
<210> 10
<211> 259
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 具有如在R-BP903和R-BP909中的下游Ser-Gly接头的pSG-ScFvHER2-SG
曲妥珠单抗scFV
<400> 10
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro
100 105 110
Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
145 150 155 160
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Ser Gly
<210> 11
<211> 76
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB43GalKfor
<400> 11
ggtggcgtcg gcggctccga gttcccccgg cacgcctggg gtcgcggccg cgcctgttga 60
caattaatca tcggca 76
<210> 12
<211> 72
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB43GalKrev
<400> 12
ggccaggggc gggcggcgcc ggagtggcag gtcccccgtt cgccgcctgg gttcagcact 60
gtcctgctcc tt 72
<210> 13
<211> 79
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB43_sc4D5_for
<400> 13
ggtggcgtcg gcggctccga gttcccccgg cacgcctggg gtcgcggccg cgtccgatat 60
ccagatgacc cagtccccg 79
<210> 14
<211> 76
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB43_sc4D5_rev
<400> 14
ggccaggggc gggcggcgcc ggagtggcag gtcccccgtt cgccgcctgg gtaccggatc 60
caccggaacc agagcc 76
<210> 15
<211> 77
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB81fGALK
<400> 15
cgggggacac gaaaccgaag aagaacaaaa aaccgaaaaa cccaccgccg ccgcctgttg 60
acaattaatc atcggca 77
<210> 16
<211> 70
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB81GALKrev
<400> 16
cgcagggtgg cgtggcccgc ggcgacggtc gcgttgtcgc cggcggggcg tcagcactgt 60
cctgctcctt 70
<210> 17
<211> 81
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB81sc4D5f
<400> 17
cgggggacac gaaaccgaag aagaacaaaa aaccgaaaaa cccaccgccg ccgcatagta 60
gtggcggtgg ctctggatcc g 81
<210> 18
<211> 74
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB81SGr
<400> 18
cgcagggtgg cgtggcccgc ggcgacggtc gcgttgtcgc cggcggggcg accggatcca 60
ccggaaccag agcc 74
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> scFv4D5_358_r
<400> 19
ggaaacggtt cggatcagcc atcgg 25
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> scFv4D5_315_f
<400> 20
ggagatcaaa tcggatatgc cgatgg 26
<210> 21
<211> 74
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gD5_galK_f
<400> 21
ttgtcgtcat agtgggcctc catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg cctgttgaca 60
attaatcatc ggca 74
<210> 22
<211> 70
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gD39_galK_r
<400> 22
atcgggaggc tggggggctg gaacgggtcc ggtaggcccg cctggatgtg tcagcactgt 60
cctgctcctt 70
<210> 23
<211> 100
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gD_aa5_39_f
<400> 23
ttgtcgtcat agtgggcctc catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg cacatccagg 60
cgggcctacc ggacccgttc cagcccccca gcctcccgat 100
<210> 24
<211> 100
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gD_aa5_39_r
<400> 24
atcgggaggc tggggggctg gaacgggtcc ggtaggcccg cctggatgtg cgccaaggca 60
tatttgccgc ggaccccatg gaggcccact atgacgacaa 100
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> galK_129_f
<400> 25
acaatctctg tttgccaacg catttgg 27
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> galK_417_r
<400> 26
cattgccgct gatcaccatg tccacgc 27
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB_ext_f
<400> 27
gagcgccccc gacggctgta tcg 23
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB_431_r
<400> 28
ttgaagacca ccgcgatgcc ct 22
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 29
His Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 30
Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 31
Ser Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu
1 5 10 15
Val Phe His Ser
20
<210> 32
<211> 246
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 针对HER2的曲妥珠单抗scFv
<400> 32
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro
100 105 110
Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
145 150 155 160
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val
245
<210> 33
<211> 112
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> GCN4gB_43_44_fB
<400> 33
ggtggcgtcg gcggctccga gttcccccgg cacgcctggg gtcgcggccg cgggatccaa 60
gaactaccac ctggagaacg aggtggccag actgaagaag ctggtgggca gc 112
<210> 34
<211> 112
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> GCN4gB_43_44_rB
<400> 34
ggccaggggc gggcggcgcc ggagtggcag gtcccccgtt cgccgcctgg gtgctgccca 60
ccagcttctt cagtctggcc acctcgttct ccaggtggta gttcttggat cc 112
<210> 35
<211> 924
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 在氨基酸43和44之间具有插入的GCN4肽的gB前体（SEQ ID NO: 1）的
氨基酸序列，由构建体R-313编码
<400> 35
Met Arg Gln Gly Ala Pro Ala Arg Gly Cys Arg Trp Phe Val Val Trp
1 5 10 15
Ala Leu Leu Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Val Ala Ser Ala Ala Pro
20 25 30
Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Gly Ser Lys Asn Tyr
35 40 45
His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Ser Thr
50 55 60
Gln Ala Ala Asn Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Pro Gly
65 70 75 80
Pro Ala Pro Thr Gly Asp Thr Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys
85 90 95
Asn Pro Pro Pro Pro Arg Pro Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala
100 105 110
Gly His Ala Thr Leu Arg Glu His Leu Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn
115 120 125
Thr Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val
130 135 140
Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln
145 150 155 160
Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro
165 170 175
Tyr Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln
180 185 190
Val Trp Phe Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp
195 200 205
Arg Ala Pro Val Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys
210 215 220
Gly Val Cys Arg Ser Thr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr
225 230 235 240
Thr Ala Phe His Arg Asp Asp His Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro
245 250 255
Ala Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp His Thr Thr Asp Leu
260 265 270
Lys Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr Gly Thr Thr
275 280 285
Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr
290 295 300
Asp Glu Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe
305 310 315 320
Tyr Gly Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala
325 330 335
Asp Arg Phe Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr
340 345 350
Lys Ala Arg Ala Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro
355 360 365
Lys Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys
370 375 380
Thr Met Thr Lys Trp Gln Glu Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr
385 390 395 400
Gly Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile Ser Thr Thr Phe Thr
405 410 415
Thr Asn Leu Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu Gly Asp Cys
420 425 430
Ile Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg Arg
435 440 445
Tyr Asn Ala Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala
450 455 460
Asn Gly Gly Phe Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu
465 470 475 480
Ala Glu Leu Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Arg Lys Pro
485 490 495
Pro Asn Pro Thr Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val
500 505 510
Glu Arg Ile Lys Thr Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe
515 520 525
Thr Tyr Asn His Ile Gln Arg His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val
530 535 540
Ala Ile Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn His Glu Leu Thr Leu Trp Asn
545 550 555 560
Glu Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ser Ala Thr Val Gly
565 570 575
Arg Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser Thr
580 585 590
Cys Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg
595 600 605
Ile Ser Ser Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe
610 615 620
Arg Tyr Glu Asp Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn
625 630 635 640
Asn Glu Leu Arg Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly
645 650 655
His Arg Arg Tyr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu
660 665 670
Tyr Ala Tyr Ser His Gln Leu Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser
675 680 685
Thr Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu Asp His Glu Phe Val
690 695 700
Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys Asp Ser Gly Leu Leu
705 710 715 720
Asp Tyr Thr Glu Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp Leu Arg Phe
725 730 735
Ala Asp Ile Asp Thr Val Ile His Ala Asp Ala Asn Ala Ala Met Phe
740 745 750
Ala Gly Leu Gly Ala Phe Phe Glu Gly Met Gly Asp Leu Gly Arg Ala
755 760 765
Val Gly Lys Val Val Met Gly Ile Val Gly Gly Val Val Ser Ala Val
770 775 780
Ser Gly Val Ser Ser Phe Met Ser Asn Pro Phe Gly Ala Leu Ala Val
785 790 795 800
Gly Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Phe Phe Ala Phe Arg
805 810 815
Tyr Val Met Arg Leu Gln Ser Asn Pro Met Lys Ala Leu Tyr Pro Leu
820 825 830
Thr Thr Lys Glu Leu Lys Asn Pro Thr Asn Pro Asp Ala Ser Gly Glu
835 840 845
Gly Glu Glu Gly Gly Asp Phe Asp Glu Ala Lys Leu Ala Glu Ala Arg
850 855 860
Glu Met Ile Arg Tyr Met Ala Leu Val Ser Ala Met Glu Arg Thr Glu
865 870 875 880
His Lys Ala Lys Lys Lys Gly Thr Ser Ala Leu Leu Ser Ala Lys Val
885 890 895
Thr Asp Met Val Met Arg Lys Arg Arg Asn Thr Asn Tyr Thr Gln Val
900 905 910
Pro Asn Lys Asp Gly Asp Ala Asp Glu Asp Asp Leu
915 920
<210> 36
<211> 60
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> GCN4肽表达盒
<400> 36
ggatccaaga actaccacct ggagaacgag gtggccagac tgaagaagct ggtgggcagc 60
<210> 37
<211> 20
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> GCN4肽
<400> 37
Gly Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys
1 5 10 15
Leu Val Gly Ser
20
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> GCN4肽
<400> 38
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys
1 5 10
<210> 39
<211> 275
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 针对GCN4肽的scFv的氨基酸序列
<400> 39
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala
20 25 30
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
35 40 45
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
50 55 60
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
65 70 75 80
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
100 105 110
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
115 120 125
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
165 170 175
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
180 185 190
Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
195 200 205
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala
210 215 220
Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
225 230 235 240
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr
245 250 255
Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
260 265 270
Val Ser Ser
275
<210> 40
<211> 1964
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> scFv_GCN4_粘连蛋白1嵌合体的核酸序列
<400> 40
atggaaaccg acacccttct tttgtgggtg cttcttcttt gggtgcccgg gagcaccggg 60
gactacccct acgacgtgcc cgactacgcc ggggctgatg ccgtggtgac ccaggagagc 120
gccttgacca caagccccgg ggagaccgtg accttgacct gtagaagcag cacaggggcc 180
gttacaacct ctaactacgc cagctgggtt caggagaagc ccgaccacct tttcaccgga 240
cttatcggag ggaccaacaa cagagccccc ggggtgcctg ctagattcag cgggagcctt 300
attggggaca aggccgccct taccattacc ggggctcaga ccgaagacga ggctatctac 360
ttctgtgctc tttggtacag caaccattgg gtgttcggag gcgggacaaa gcttacagtg 420
cttggaggcg gtggaggcag cggcggaggt gggtctggtg gagggggctc tgggggaggc 480
ggtagcgacg tgcagcttca gcagagcggg cccgggcttg tggccccctc tcagtctctt 540
agcataacgt gcaccgtgag cgggttcagc cttaccgact atggggttaa ctgggtgaga 600
cagtctcctg ggaaggggct tgagtggttg ggagttatct ggggagacgg aatcaccgac 660
tacaacagcg ccttgaagag cagactttct gtgacaaagg acaactctaa gagccaggtg 720
ttccttaaga tgaacagcct tcagagcggg gactctgcca gatactactg cgtgacaggg 780
cttttcgact actggggaca agggaccacc ttgaccgtga gcagcggaag cggagccatg 840
gccaagccca ccaactggat cgaggggaca caggccgtgc ttagagccaa gaaggggcag 900
gacgacaagg ttcttgttgc tacttgcacc agcgccaacg gaaagccccc cagcgtggtg 960
agctgggaga caagattgaa aggggaggcc gagtatcagg agatcagaaa ccctaacggg 1020
accgtgaccg tgatcagcag atacagactt gtgcctagca gagaggccca ccagcagagc 1080
cttgcctgca tcgttaacta ccacatggac agattcaagg agagccttac acttaacgtg 1140
cagtacgaac ccgaggtgac catcgagggg ttcgacggga actggtacct tcagagaatg 1200
gacgtgaagc ttacctgcaa ggccgacgcc aaccctcccg ccaccgagta ccactggacc 1260
acccttaacg ggagccttcc caaaggggtg gaggcccaga acagaaccct tttcttcaag 1320
gggcccatca attacagcct tgccgggacc tacatctgcg aggccaccaa ccccatcggg 1380
accagaagcg gtcaagtgga ggtgaacatc accgagttcc cctacacccc cagcccaccc 1440
gagcacggga gaagagctgg gcccgttccc accgccatca tcggaggggt ggccgggagc 1500
atcttgcttg tgcttatcgt ggtgggtggg attgtggtgg cccttagaag aagaagacat 1560
accttcaaag gggactacag caccaagaag cacgtgtacg ggaacgggta cagcaaggcc 1620
ggaatccctc agcaccatcc acctatggcc cagaaccttc agtaccccga cgacagcgac 1680
gatgagaaga aggctgggcc ccttggtggg agcagctacg aagaggagga agaagaggaa 1740
gagggtggcg gcggtggaga gagaaaagtg ggagggcctc atcccaaata cgacgaggac 1800
gccaagagac cctacttcac cgtggacgag gccgaggcca gacaggacgg gtacggggac 1860
agaacccttg ggtaccagta cgaccccgag cagttggact tggccgagaa catggtgagc 1920
cagaacgacg gaagcttcat ctctaagaag gagtggtacg tgtg 1964
<210> 41
<211> 654
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> scFv_GCN4_粘连蛋白1嵌合体的氨基酸序列
<400> 41
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala
20 25 30
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
35 40 45
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
50 55 60
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
65 70 75 80
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
100 105 110
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
115 120 125
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
165 170 175
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
180 185 190
Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
195 200 205
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala
210 215 220
Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
225 230 235 240
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr
245 250 255
Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
260 265 270
Val Ser Ser Gly Ser Gly Ala Met Ala Lys Pro Thr Asn Trp Ile Glu
275 280 285
Gly Thr Gln Ala Val Leu Arg Ala Lys Lys Gly Gln Asp Asp Lys Val
290 295 300
Leu Val Ala Thr Cys Thr Ser Ala Asn Gly Lys Pro Pro Ser Val Val
305 310 315 320
Ser Trp Glu Thr Arg Leu Lys Gly Glu Ala Glu Tyr Gln Glu Ile Arg
325 330 335
Asn Pro Asn Gly Thr Val Thr Val Ile Ser Arg Tyr Arg Leu Val Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Ala His Gln Gln Ser Leu Ala Cys Ile Val Asn Tyr His
355 360 365
Met Asp Arg Phe Lys Glu Ser Leu Thr Leu Asn Val Gln Tyr Glu Pro
370 375 380
Glu Val Thr Ile Glu Gly Phe Asp Gly Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Met
385 390 395 400
Asp Val Lys Leu Thr Cys Lys Ala Asp Ala Asn Pro Pro Ala Thr Glu
405 410 415
Tyr His Trp Thr Thr Leu Asn Gly Ser Leu Pro Lys Gly Val Glu Ala
420 425 430
Gln Asn Arg Thr Leu Phe Phe Lys Gly Pro Ile Asn Tyr Ser Leu Ala
435 440 445
Gly Thr Tyr Ile Cys Glu Ala Thr Asn Pro Ile Gly Thr Arg Ser Gly
450 455 460
Gln Val Glu Val Asn Ile Thr Glu Phe Pro Tyr Thr Pro Ser Pro Pro
465 470 475 480
Glu His Gly Arg Arg Ala Gly Pro Val Pro Thr Ala Ile Ile Gly Gly
485 490 495
Val Ala Gly Ser Ile Leu Leu Val Leu Ile Val Val Gly Gly Ile Val
500 505 510
Val Ala Leu Arg Arg Arg Arg His Thr Phe Lys Gly Asp Tyr Ser Thr
515 520 525
Lys Lys His Val Tyr Gly Asn Gly Tyr Ser Lys Ala Gly Ile Pro Gln
530 535 540
His His Pro Pro Met Ala Gln Asn Leu Gln Tyr Pro Asp Asp Ser Asp
545 550 555 560
Asp Glu Lys Lys Ala Gly Pro Leu Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Glu Glu
565 570 575
Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Glu Arg Lys Val Gly Gly
580 585 590
Pro His Pro Lys Tyr Asp Glu Asp Ala Lys Arg Pro Tyr Phe Thr Val
595 600 605
Asp Glu Ala Glu Ala Arg Gln Asp Gly Tyr Gly Asp Arg Thr Leu Gly
610 615 620
Tyr Gln Tyr Asp Pro Glu Gln Leu Asp Leu Ala Glu Asn Met Val Ser
625 630 635 640
Gln Asn Asp Gly Ser Phe Ile Ser Lys Lys Glu Trp Tyr Val
645 650
<210> 42
<211> 846
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 42
atgtccgaat atcagccaag tttatttgct ttaaatccaa tgggtttctc accattggat 60
ggttctaaat caaccaacga aaatgtatct gcttccactt ctactgccaa accaatggtt 120
ggccaattga tttttgataa attcatcaag actgaagagg atccaattat caaacaggat 180
accccttcga accttgattt tgattttgct cttccacaaa cggcaactgc acctgatgcc 240
aagaccgttt tgccaattcc ggagctagat gccgctgtag tggaatcttt cttttcgtca 300
agcactgatt caactccaat gtttgagtat gaaaacctag aagacaactc taaagaatgg 360
acatccttgt ttgacaatga cattccagtt accactgacg atgtttcatt ggctgataag 420
gcaattgaat ccactgaaga agtttctctg gtaccatcca atctggaagt ctcgacaact 480
tcattcttac ccactcctgt tctagaagat gctaaactga ctcaaacaag aaaggttaag 540
aaaccaaatt cagtcgttaa gaagtcacat catgttggaa aggatgacga atcgagactg 600
gatcatctag gtgttgttgc ttacaaccgc aaacagcgtt cgattccact ttctccaatt 660
gtgcccgaat ccagtgatcc tgctgctcta aaacgtgcta gaaacactga agccgccagg 720
cgttctcgtg cgagaaagtt gcaaagaatg aaacaacttg aagacaaggt tgaagaattg 780
ctttcgaaaa attatcactt ggaaaatgag gttgccagat taaagaaatt agttggcgaa 840
cgctga 846
<210> 43
<211> 281
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 43
Met Ser Glu Tyr Gln Pro Ser Leu Phe Ala Leu Asn Pro Met Gly Phe
1 5 10 15
Ser Pro Leu Asp Gly Ser Lys Ser Thr Asn Glu Asn Val Ser Ala Ser
20 25 30
Thr Ser Thr Ala Lys Pro Met Val Gly Gln Leu Ile Phe Asp Lys Phe
35 40 45
Ile Lys Thr Glu Glu Asp Pro Ile Ile Lys Gln Asp Thr Pro Ser Asn
50 55 60
Leu Asp Phe Asp Phe Ala Leu Pro Gln Thr Ala Thr Ala Pro Asp Ala
65 70 75 80
Lys Thr Val Leu Pro Ile Pro Glu Leu Asp Asp Ala Val Val Glu Ser
85 90 95
Phe Phe Ser Ser Ser Thr Asp Ser Thr Pro Met Phe Glu Tyr Glu Asn
100 105 110
Leu Glu Asp Asn Ser Lys Glu Trp Thr Ser Leu Phe Asp Asn Asp Ile
115 120 125
Pro Val Thr Thr Asp Asp Val Ser Leu Ala Asp Lys Ala Ile Glu Ser
130 135 140
Thr Glu Glu Val Ser Leu Val Pro Ser Asn Leu Glu Val Ser Thr Thr
145 150 155 160
Ser Phe Leu Pro Thr Pro Val Leu Glu Asp Ala Lys Leu Thr Gln Thr
165 170 175
Arg Lys Val Lys Lys Pro Asn Ser Val Val Lys Lys Ser His His Val
180 185 190
Gly Lys Asp Asp Glu Ser Arg Leu Asp His Leu Gly Val Val Ala Tyr
195 200 205
Asn Arg Lys Gln Arg Ser Ile Pro Leu Ser Pro Ile Val Pro Glu Ser
210 215 220
Ser Asp Pro Ala Ala Leu Lys Arg Ala Arg Asn Thr Glu Ala Ala Arg
225 230 235 240
Arg Ser Arg Ala Arg Lys Leu Gln Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys
245 250 255
Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
260 265 270
Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg
275 280
<210> 44
<211> 75
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB_76_galK_for
<400> 44
ggccccgccc caacggggga cacgaaaccg aagaagaaca aaaaaccgaa acctgttgac 60
aattaatcat cggca 75
<210> 45
<211> 70
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB_76_galK_rev
<400> 45
cccgcggcga cggtcgcgtt gtcgccggcg gggcgcggcg gcggtgggtt tcagcactgt 60
cctgctcctt 70
<210> 46
<211> 111
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB_76_GCN4_for
<400> 46
ggccccgccc caacggggga cacgaaaccg aagaagaaca aaaaaccgaa aggatccaag 60
aactaccacc tggagaacga ggtggccaga ctgaagaagc tggtgggcag c 111
<210> 47
<211> 110
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB_76_GCN4_rev
<400> 47
cccgcggcga cggtcgcgtt gtcgccggcg gggcgcggcg gcggtgggtt gctgcccacc 60
agcttcttca gtctggccac ctcgttctcc aggtggtagt tcttggatcc 110
<210> 48
<211> 924
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 在氨基酸76和77之间具有插入的GCN4肽的gB前体（SEQ ID NO: 1）的
氨基酸序列，由构建体R-317编码
<400> 48
Met Arg Gln Gly Ala Pro Ala Arg Gly Cys Arg Trp Phe Val Val Trp
1 5 10 15
Ala Leu Leu Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Val Ala Ser Ala Ala Pro
20 25 30
Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Thr
50 55 60
Gly Asp Thr Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Gly Ser Lys Asn
65 70 75 80
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Ser
85 90 95
Asn Pro Pro Pro Pro Arg Pro Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala
100 105 110
Gly His Ala Thr Leu Arg Glu His Leu Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn
115 120 125
Thr Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val
130 135 140
Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln
145 150 155 160
Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro
165 170 175
Tyr Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln
180 185 190
Val Trp Phe Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp
195 200 205
Arg Ala Pro Val Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys
210 215 220
Gly Val Cys Arg Ser Thr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr
225 230 235 240
Thr Ala Phe His Arg Asp Asp His Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro
245 250 255
Ala Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp His Thr Thr Asp Leu
260 265 270
Lys Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr Gly Thr Thr
275 280 285
Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr
290 295 300
Asp Glu Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe
305 310 315 320
Tyr Gly Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala
325 330 335
Asp Arg Phe Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr
340 345 350
Lys Ala Arg Ala Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro
355 360 365
Lys Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys
370 375 380
Thr Met Thr Lys Trp Gln Glu Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr
385 390 395 400
Gly Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile Ser Thr Thr Phe Thr
405 410 415
Thr Asn Leu Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu Gly Asp Cys
420 425 430
Ile Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg Arg
435 440 445
Tyr Asn Ala Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala
450 455 460
Asn Gly Gly Phe Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu
465 470 475 480
Ala Glu Leu Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Arg Lys Pro
485 490 495
Pro Asn Pro Thr Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val
500 505 510
Glu Arg Ile Lys Thr Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe
515 520 525
Thr Tyr Asn His Ile Gln Arg His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val
530 535 540
Ala Ile Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn His Glu Leu Thr Leu Trp Asn
545 550 555 560
Glu Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ser Ala Thr Val Gly
565 570 575
Arg Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser Thr
580 585 590
Cys Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg
595 600 605
Ile Ser Ser Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe
610 615 620
Arg Tyr Glu Asp Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn
625 630 635 640
Asn Glu Leu Arg Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly
645 650 655
His Arg Arg Tyr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu
660 665 670
Tyr Ala Tyr Ser His Gln Leu Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser
675 680 685
Thr Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu Asp His Glu Phe Val
690 695 700
Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys Asp Ser Gly Leu Leu
705 710 715 720
Asp Tyr Thr Glu Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp Leu Arg Phe
725 730 735
Ala Asp Ile Asp Thr Val Ile His Ala Asp Ala Asn Ala Ala Met Phe
740 745 750
Ala Gly Leu Gly Ala Phe Phe Glu Gly Met Gly Asp Leu Gly Arg Ala
755 760 765
Val Gly Lys Val Val Met Gly Ile Val Gly Gly Val Val Ser Ala Val
770 775 780
Ser Gly Val Ser Ser Phe Met Ser Asn Pro Phe Gly Ala Leu Ala Val
785 790 795 800
Gly Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Phe Phe Ala Phe Arg
805 810 815
Tyr Val Met Arg Leu Gln Ser Asn Pro Met Lys Ala Leu Tyr Pro Leu
820 825 830
Thr Thr Lys Glu Leu Lys Asn Pro Thr Asn Pro Asp Ala Ser Gly Glu
835 840 845
Gly Glu Glu Gly Gly Asp Phe Asp Glu Ala Lys Leu Ala Glu Ala Arg
850 855 860
Glu Met Ile Arg Tyr Met Ala Leu Val Ser Ala Met Glu Arg Thr Glu
865 870 875 880
His Lys Ala Lys Lys Lys Gly Thr Ser Ala Leu Leu Ser Ala Lys Val
885 890 895
Thr Asp Met Val Met Arg Lys Arg Arg Asn Thr Asn Tyr Thr Gln Val
900 905 910
Pro Asn Lys Asp Gly Asp Ala Asp Glu Asp Asp Leu
915 920
<210> 49
<211> 113
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB_81_GCN4_for
<400> 49
cgggggacac gaaaccgaag aagaacaaaa aaccgaaaaa cccaccgccg ccgggatcca 60
agaactacca cctggagaac gaggtggcca gactgaagaa gctggtgggc agc 113
<210> 50
<211> 110
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB_81_GCN4_rev
<400> 50
cgcagggtgg cgtggcccgc ggcgacggtc gcgttgtcgc cggcggggcg gctgcccacc 60
agcttcttca gtctggccac ctcgttctcc aggtggtagt tcttggatcc 110
<210> 51
<211> 924
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 在氨基酸81和82之间具有插入的GCN4肽的gB前体（SEQ ID NO: 1）的
氨基酸序列，由构建体R-315编码
<400> 51
Met Arg Gln Gly Ala Pro Ala Arg Gly Cys Arg Trp Phe Val Val Trp
1 5 10 15
Ala Leu Leu Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Val Ala Ser Ala Ala Pro
20 25 30
Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Thr
50 55 60
Gly Asp Thr Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Pro Pro
65 70 75 80
Pro Gly Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys
85 90 95
Lys Leu Val Gly Ser Arg Pro Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala
100 105 110
Gly His Ala Thr Leu Arg Glu His Leu Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn
115 120 125
Thr Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val
130 135 140
Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln
145 150 155 160
Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro
165 170 175
Tyr Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln
180 185 190
Val Trp Phe Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp
195 200 205
Arg Ala Pro Val Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys
210 215 220
Gly Val Cys Arg Ser Thr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr
225 230 235 240
Thr Ala Phe His Arg Asp Asp His Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro
245 250 255
Ala Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp His Thr Thr Asp Leu
260 265 270
Lys Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr Gly Thr Thr
275 280 285
Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr
290 295 300
Asp Glu Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe
305 310 315 320
Tyr Gly Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala
325 330 335
Asp Arg Phe Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr
340 345 350
Lys Ala Arg Ala Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro
355 360 365
Lys Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys
370 375 380
Thr Met Thr Lys Trp Gln Glu Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr
385 390 395 400
Gly Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile Ser Thr Thr Phe Thr
405 410 415
Thr Asn Leu Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu Gly Asp Cys
420 425 430
Ile Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg Arg
435 440 445
Tyr Asn Ala Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala
450 455 460
Asn Gly Gly Phe Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu
465 470 475 480
Ala Glu Leu Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Arg Lys Pro
485 490 495
Pro Asn Pro Thr Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val
500 505 510
Glu Arg Ile Lys Thr Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe
515 520 525
Thr Tyr Asn His Ile Gln Arg His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val
530 535 540
Ala Ile Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn His Glu Leu Thr Leu Trp Asn
545 550 555 560
Glu Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ser Ala Thr Val Gly
565 570 575
Arg Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser Thr
580 585 590
Cys Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg
595 600 605
Ile Ser Ser Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe
610 615 620
Arg Tyr Glu Asp Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn
625 630 635 640
Asn Glu Leu Arg Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly
645 650 655
His Arg Arg Tyr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu
660 665 670
Tyr Ala Tyr Ser His Gln Leu Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser
675 680 685
Thr Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu Asp His Glu Phe Val
690 695 700
Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys Asp Ser Gly Leu Leu
705 710 715 720
Asp Tyr Thr Glu Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp Leu Arg Phe
725 730 735
Ala Asp Ile Asp Thr Val Ile His Ala Asp Ala Asn Ala Ala Met Phe
740 745 750
Ala Gly Leu Gly Ala Phe Phe Glu Gly Met Gly Asp Leu Gly Arg Ala
755 760 765
Val Gly Lys Val Val Met Gly Ile Val Gly Gly Val Val Ser Ala Val
770 775 780
Ser Gly Val Ser Ser Phe Met Ser Asn Pro Phe Gly Ala Leu Ala Val
785 790 795 800
Gly Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Phe Phe Ala Phe Arg
805 810 815
Tyr Val Met Arg Leu Gln Ser Asn Pro Met Lys Ala Leu Tyr Pro Leu
820 825 830
Thr Thr Lys Glu Leu Lys Asn Pro Thr Asn Pro Asp Ala Ser Gly Glu
835 840 845
Gly Glu Glu Gly Gly Asp Phe Asp Glu Ala Lys Leu Ala Glu Ala Arg
850 855 860
Glu Met Ile Arg Tyr Met Ala Leu Val Ser Ala Met Glu Arg Thr Glu
865 870 875 880
His Lys Ala Lys Lys Lys Gly Thr Ser Ala Leu Leu Ser Ala Lys Val
885 890 895
Thr Asp Met Val Met Arg Lys Arg Arg Asn Thr Asn Tyr Thr Gln Val
900 905 910
Pro Asn Lys Asp Gly Asp Ala Asp Glu Asp Asp Leu
915 920
<210> 52
<211> 74
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB_95_galK_for
<400> 52
cgccgccgcg ccccgccggc gacaacgcga ccgtcgccgc gggccacgcc cctgttgaca 60
attaatcatc ggca 74
<210> 53
<211> 71
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB_95_galK_rev
<400> 53
gtttgcatcg gtgttctccg ccttgatgtc ccgcaggtgc tcgcgcaggg ttcagcactg 60
tcctgctcct t 71
<210> 54
<211> 110
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB_95_GCN4_for
<400> 54
cgccgccgcg ccccgccggc gacaacgcga ccgtcgccgc gggccacgcc ggatccaaga 60
actaccacct ggagaacgag gtggccagac tgaagaagct ggtgggcagc 110
<210> 55
<211> 111
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gB_95_GCN4_rev
<400> 55
gtttgcatcg gtgttctccg ccttgatgtc ccgcaggtgc tcgcgcaggg tgctgcccac 60
cagcttcttc agtctggcca cctcgttctc caggtggtag ttcttggatc c 111
<210> 56
<211> 924
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 在氨基酸95和96之间具有插入的GCN4肽的gB前体（SEQ ID NO: 1）的
氨基酸序列，由构建体R-319编码
<400> 56
Met Arg Gln Gly Ala Pro Ala Arg Gly Cys Arg Trp Phe Val Val Trp
1 5 10 15
Ala Leu Leu Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Val Ala Ser Ala Ala Pro
20 25 30
Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Thr
50 55 60
Gly Asp Thr Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Pro Pro
65 70 75 80
Pro Arg Pro Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala Gly His Ala Gly
85 90 95
Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu
100 105 110
Val Gly Ser Thr Leu Arg Glu His Leu Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn
115 120 125
Thr Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val
130 135 140
Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln
145 150 155 160
Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro
165 170 175
Tyr Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln
180 185 190
Val Trp Phe Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp
195 200 205
Arg Ala Pro Val Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys
210 215 220
Gly Val Cys Arg Ser Thr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr
225 230 235 240
Thr Ala Phe His Arg Asp Asp His Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro
245 250 255
Ala Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp His Thr Thr Asp Leu
260 265 270
Lys Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr Gly Thr Thr
275 280 285
Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr
290 295 300
Asp Glu Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe
305 310 315 320
Tyr Gly Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala
325 330 335
Asp Arg Phe Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr
340 345 350
Lys Ala Arg Ala Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro
355 360 365
Lys Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys
370 375 380
Thr Met Thr Lys Trp Gln Glu Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr
385 390 395 400
Gly Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile Ser Thr Thr Phe Thr
405 410 415
Thr Asn Leu Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu Gly Asp Cys
420 425 430
Ile Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg Arg
435 440 445
Tyr Asn Ala Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala
450 455 460
Asn Gly Gly Phe Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu
465 470 475 480
Ala Glu Leu Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Arg Lys Pro
485 490 495
Pro Asn Pro Thr Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val
500 505 510
Glu Arg Ile Lys Thr Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe
515 520 525
Thr Tyr Asn His Ile Gln Arg His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val
530 535 540
Ala Ile Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn His Glu Leu Thr Leu Trp Asn
545 550 555 560
Glu Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ser Ala Thr Val Gly
565 570 575
Arg Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser Thr
580 585 590
Cys Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg
595 600 605
Ile Ser Ser Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe
610 615 620
Arg Tyr Glu Asp Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn
625 630 635 640
Asn Glu Leu Arg Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly
645 650 655
His Arg Arg Tyr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu
660 665 670
Tyr Ala Tyr Ser His Gln Leu Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser
675 680 685
Thr Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu Asp His Glu Phe Val
690 695 700
Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys Asp Ser Gly Leu Leu
705 710 715 720
Asp Tyr Thr Glu Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp Leu Arg Phe
725 730 735
Ala Asp Ile Asp Thr Val Ile His Ala Asp Ala Asn Ala Ala Met Phe
740 745 750
Ala Gly Leu Gly Ala Phe Phe Glu Gly Met Gly Asp Leu Gly Arg Ala
755 760 765
Val Gly Lys Val Val Met Gly Ile Val Gly Gly Val Val Ser Ala Val
770 775 780
Ser Gly Val Ser Ser Phe Met Ser Asn Pro Phe Gly Ala Leu Ala Val
785 790 795 800
Gly Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Phe Phe Ala Phe Arg
805 810 815
Tyr Val Met Arg Leu Gln Ser Asn Pro Met Lys Ala Leu Tyr Pro Leu
820 825 830
Thr Thr Lys Glu Leu Lys Asn Pro Thr Asn Pro Asp Ala Ser Gly Glu
835 840 845
Gly Glu Glu Gly Gly Asp Phe Asp Glu Ala Lys Leu Ala Glu Ala Arg
850 855 860
Glu Met Ile Arg Tyr Met Ala Leu Val Ser Ala Met Glu Arg Thr Glu
865 870 875 880
His Lys Ala Lys Lys Lys Gly Thr Ser Ala Leu Leu Ser Ala Lys Val
885 890 895
Thr Asp Met Val Met Arg Lys Arg Arg Asn Thr Asn Tyr Thr Gln Val
900 905 910
Pro Asn Lys Asp Gly Asp Ala Asp Glu Asp Asp Leu
915 920
<210> 57
<211> 74
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gD5_galK_f
<400> 57
ttgtcgtcat agtgggcctc catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg cctgttgaca 60
attaatcatc ggca 74
<210> 58
<211> 70
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> scFv_galK_rev
<400> 58
gaggcggaca gggagctcgg ggactgggtc atctggatat cggaattctc tcagcactgt 60
cctgctcctt 70
<210> 59
<211> 108
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gDdel30_38for
<400> 59
ttgtcgtcat agtgggcctc catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctc 60
tcaagatggc cgaccccaat cgctttcgcg gcaaagacct tccggtcc 108
<210> 60
<211> 108
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> gDdel30_38rev
<400> 60
gaggcggaca gggagctcgg ggactgggtc atctggatat cggaattctc cacgcgccgg 60
acccccggag gggtcagctg gtccaggacc ggaaggtctt tgccgcga 108
<210> 61
<211> 652
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 对于成熟gD缺失氨基酸30和38缺失并且对于成熟gD在氨基酸37之后插
入曲妥珠单抗scFv的gD前体（SEQ ID NO: 4）的氨基酸序列，由构建体
R-321编码
<400> 61
Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val
1 5 10 15
Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala
20 25 30
Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro
35 40 45
Val Leu Asp Gln Leu Thr Pro Pro Gly Val Arg Arg Val Glu Asn Ser
50 55 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
65 70 75 80
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
85 90 95
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
100 105 110
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
115 120 125
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
130 135 140
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
145 150 155 160
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro Met
165 170 175
Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser Glu
180 185 190
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
195 200 205
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
210 215 220
Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
225 230 235 240
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
245 250 255
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
260 265 270
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
275 280 285
Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
290 295 300
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly
305 310 315 320
Ser His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Leu
325 330 335
Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val
340 345 350
Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala Ser
355 360 365
Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg
370 375 380
Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu
385 390 395 400
Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro
405 410 415
Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu
420 425 430
Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu
435 440 445
Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu
450 455 460
Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile
465 470 475 480
Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr
485 490 495
Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg
500 505 510
Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys
515 520 525
Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro
530 535 540
Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala
545 550 555 560
Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro Pro Asn
565 570 575
Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His Pro Pro
580 585 590
Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly Ser
595 600 605
Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met Arg Arg
610 615 620
Arg Thr Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg Glu
625 630 635 640
Asp Asp Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr
645 650
<210> 62
<211> 369
<212> PRT
<213> 单纯疱疹病毒1
<400> 62
Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg
1 5 10 15
Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro Val Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro
20 25 30
Gly Val Arg Arg Val Tyr His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe
35 40 45
Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg
50 55 60
Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile
65 70 75 80
Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr
85 90 95
Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val
100 105 110
Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro
115 120 125
Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val
130 135 140
Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr
145 150 155 160
Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile
165 170 175
Thr Gln Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala
180 185 190
Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr
195 200 205
Gln Gln Gly Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile
210 215 220
Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly
225 230 235 240
Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu
245 250 255
Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro
275 280 285
Gln Ile Pro Pro Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr
290 295 300
Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly
305 310 315 320
Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val
325 330 335
Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu
340 345 350
Pro His Ile Arg Glu Asp Asp Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe
355 360 365
Tyr

Claims (21)

1.一种重组疱疹病毒，所述重组疱疹病毒包含异源多肽配体，所述异源多肽配体能够与靶分子结合并且融合至或插入存在于所述疱疹病毒的包膜中的糖蛋白B(gB)，
其中所述配体融合至gB，或者
其中所述配体在gB无序区域内的任何氨基酸处插入，但是不在如SEQ ID NO:1所示的gB的跨氨基酸77至88的区域内，或同源gB的对应区域内的任何氨基酸处插入，或者
其中所述配体在如SEQ ID NO:1所示的gB的跨氨基酸31至77或88至184，优选地氨基酸31至77或88至136或者更优选地31至77或88至108，和/或跨氨基酸409至545，优选地氨基酸459至545，更优选地氨基酸459至497或甚至更优选地氨基酸460至491的区域内，或同源gB的对应区域内的任何氨基酸处插入。
2.一种重组疱疹病毒，所述重组疱疹病毒包含异源多肽配体，所述异源多肽配体能够与靶分子结合并且插入存在于所述疱疹病毒的包膜中的糖蛋白B(gB)，
其中所述配体的长度为5至120个氨基酸并且在如SEQ ID NO:1所示的gB的跨氨基酸77至88的区域内，或同源gB的对应区域内的任何氨基酸处插入。
3.根据权利要求1或2所述的疱疹病毒，其中所述疱疹病毒具有与表达或结合所述靶分子的细胞结合的能力，优选地具有与所述细胞膜融合的能力，更优选地具有进入所述细胞的能力，最优选地具有杀死所述细胞的能力。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的疱疹病毒，其中所述靶分子存在于患病细胞上，优选地其中所述患病细胞是肿瘤细胞、感染细胞、退行性病症相关细胞或衰老细胞，或者
其中所述靶分子存在于细胞培养物中存在的细胞上，优选地其中所述细胞是适于所述疱疹病毒生长的培养细胞，更优选地是批准用于疱疹病毒生长的细胞系，甚至更优选地是Vero、293、293T、HEp-2、HeLa、BHK或RS细胞，最优选地是Vero细胞。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的疱疹病毒，其中存在于患病细胞上的所述靶分子是肿瘤相关受体，优选地是EGF受体家族成员，包括HER2、EGFR、EGFRIII、或EGFR3(ERBB3)、EGFRvIII，或MET、FAP、PSMA、CXCR4、CEA、CADC、粘蛋白、叶酸结合蛋白、GD2、VEGF受体1和2、CD20、CD30、CD33、CD52、CD55、整合素家族、IGF1R、Ephrin受体家族、蛋白-酪氨酸激酶(TK)家族、RANKL、TRAILR1、TRAILR2、IL13Rα、UPAR、腱生蛋白、免疫检查点家族调节因子成员，包括PD-1、PD-L1、CTL-A4、TIM-3、LAG3或IDO，肿瘤相关糖蛋白72、神经节苷酯GM2、A33、Lewis Y抗原或MUC1，最优选地是HER2，或者
其中存在于细胞培养物中存在的细胞上的所述靶分子是人造分子，优选地是抗体、抗体衍生物或抗体模拟物，更优选地是单链抗体(scFv)，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的一部分结合的scFv，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:37的部分结合的scFv，甚至更优选地是包含SEQ ID NO:39的scFv，最优选地是SEQ ID NO:41的序列所示的分子。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的疱疹病毒，其中所述配体是天然多肽或人造多肽
优选地其中所述配体能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子或存在于患病细胞上的靶分子结合
更优选地其中所述配体是在细胞上可接近的靶分子的天然配体、能够与所述靶分子结合的天然配体的一部分、天然多肽的一部分、抗体、抗体衍生物、抗体模拟物更优选地其中所述配体是能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的天然多肽的一部分或scFv
甚至更优选地其中所述配体是GCN4酵母转录因子的一部分，例如GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:37的部分，或能够与存在于肿瘤分子上的靶分子结合，优选地与HER2结合的scFv，
最优选地其中所述配体是SEQ ID NO:37的序列所示的分子或SEQ ID NO:32所示的scFv。
7.根据权利要求4至6中任意一项所述的疱疹病毒，其中所述靶分子是HER2，所述配体是如SEQ ID NO:32所示的scFv，并且所述患病细胞是表达HER2的肿瘤细胞，优选乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、骨肉瘤细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞或唾液腺肿瘤细胞，和/或
其中所述靶分子是具有如SEQ ID NO:41所示的序列的分子，所述配体是SEQ ID NO:37的序列所示的分子，并且所述细胞存在于细胞培养物中且表达SEQ ID NO:41的序列所示的分子。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的疱疹病毒，其中一个或多个配体融合至或插入gB，
优选地其中所述gB包含能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的配体和能够与存在于患病细胞上的靶分子结合的配体。
9.根据权利要求1至8中任意一项所述的疱疹病毒，其中所述疱疹病毒包含经修饰的gD和/或经修饰的gH
优选地其中所述gB包含能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的配体，并且所述经修饰的gD和/或所述经修饰的gH包含能够与存在于患病细胞上的靶分子结合的配体，
最优选地其中所述gB包含SEQ ID NO:37所示的序列，所述靶分子是具有SEQ ID NO:41所示序列的分子，并且所述细胞存在于细胞培养物中并表达SEQ ID NO:41的序列所示的分子，并且所述经修饰的gD和/或所述经修饰的gH包含SEQ ID NO:32所示的scFv，所述靶分子是HER2，并且所述细胞是表达HER2的肿瘤细胞，优选乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、骨肉瘤细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞或唾液腺肿瘤细胞。
10.根据权利要求9所述的疱疹病毒，其中对于如SEQ ID NO:62所示的成熟gD或同源gD的对应区域，所述gD被修饰为缺失gD的氨基酸30至38或其子集，优选地其中所述gD被修饰为缺失氨基酸30和/或氨基酸38，更优选地其中所述gD被修饰为缺失氨基酸30和氨基酸38。
11.根据权利要求10所述的疱疹病毒，对于如SEQ ID NO:62所示的成熟gD或同源gD的对应区域，将异源多肽配体插入gD取代氨基酸30至38或其子集，优选地其中插入所述异源多肽配体取代氨基酸30或氨基酸38，更优选地其中插入所述异源多肽配体取代氨基酸38并且缺失氨基酸30。
12.根据权利要求1至11中任意一项所述的疱疹病毒，其中所述疱疹病毒编码刺激针对细胞(优选患病细胞)的宿主免疫应答的一种或多种分子。
13.药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至12中任意一项所述的疱疹病毒和药学上可接受的运载体，任选地另包含刺激针对细胞(优选患病细胞)的宿主免疫应答的一种或多种分子。
14.根据权利要求1至12中任意一项所述的疱疹病毒，任选地与刺激针对细胞(优选患病细胞)的宿主免疫应答的一种或多种分子联合施用，用于治疗肿瘤、感染、退行性病症或衰老相关疾病。
15.一种核酸分子，所述核酸分子包含核酸，所述核酸编码如权利要求1至9中任意一项所定义的融合了或插入了所述配体的gB。
16.一种载体，所述载体包含根据权利要求15所述的核酸分子。
17.一种多肽，所述多肽包含如权利要求1至9中任意一项所定义的融合了或插入了所述配体的gB。
18.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求1至12中任意一项所述的疱疹病毒，根据权利要求15所述的核酸分子，根据权利要求16所述的载体或根据权利要求17所述的多肽。
19.一种使用根据权利要求1至12中任意一项所述的疱疹病毒感染细胞的方法。
20.一种使用根据权利要求1至12中任意一项所述的疱疹病毒在细胞培养物中存在的细胞中生产重组疱疹病毒的体外方法，优选地其中所述细胞表达或结合作为靶分子的人造分子，更优选地所述靶分子包括抗体、抗体衍生物或抗体模拟物，甚至更优选地是scFv，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的一部分结合的scFv，甚至更优选地是能够与GCN4酵母转录因子的包含SEQ ID NO:37的部分结合的scFv，甚至更优选地是包含SEQ ID NO:39的scFv，最优选地是SEQ ID NO:41的序列所示的分子。
21.根据权利要求20所述的体外方法，其中所述重组疱疹病毒包含能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的配体，以及能够与存在于患病细胞上的靶分子结合的另外的配体
优选地其中所述gB包含能够与存在于细胞培养物中存在的细胞上的靶分子结合的配体，并且经修饰的gD和/或gH包含能够与存在于患病细胞上的靶分子结合的配体，
最优选地其中所述gB包含SEQ ID NO:37所示的序列，所述靶分子是SEQ ID NO:41的序列所示的分子，并且所述细胞存在于细胞培养物中并表达SEQ ID NO:41的序列所示的分子，并且所述经修饰的gD和/或gH包含SEQ ID NO:32所示的scFv，所述靶分子是HER2，并且所述细胞是表达HER2的肿瘤细胞，优选乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、骨肉瘤细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞或唾液腺肿瘤细胞。
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