KR20190020727A - 변형된 당단백질 b를 갖는 헤르페스 바이러스 - Google Patents

변형된 당단백질 b를 갖는 헤르페스 바이러스 Download PDF

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마리아 가브리엘라 캄파델리
빌랴나 페트로빅
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알마마 테르 스투디오룸 유니베르시타‘ 디 볼로냐
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Abstract

본 발명은 표적 분자에 결합할 수 있으며, 특정 부위에서 당단백질 B에 융합되거나 삽입될 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드를 포함하는 재조합 헤르페스 바이러스에 관한 것이다. 헤르페스 바이러스는 하나 이상의 리간드를 포함할 수 있고, 추가의 리간드(들)가 변형된 당단백질 D 및/또는 변형된 당단백질 H로 구성될 수 있다. 이는 헤르페스 바이러스가 치료 목적을 위한 세포, 및 바이러스 생산을 위한 세포를 표적화 할 수 있게 한다. 본 발명은 헤르페스 바이러스, 종양, 감염, 퇴행성 질환 또는 노화 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 헤르페스 바이러스, gB를 암호화하는 핵산 및 벡터, gB를 포함하는 폴리펩티드, 및 헤르페스 바이러스, 핵산, 벡터 또는 폴리펩티드를 포함하는 세포를 포함하는 약학적 조성물을 더 포함한다. 또한, 헤르페스 바이러스로 세포를 감염시키기 위한 또는 헤르페스 바이러스를 생산하기 위한 방법이 개시된다.

Description

변형된 당단백질 B를 갖는 헤르페스 바이러스
본 발명에 이르는 연구는 유럽 연합의 7차 프레임워크 프로그램(FP7/2007-2013)/ERC 지원금 협정(ERC grant agreement) n°340060 하에 유럽 연구 위원회(European Research Council)로부터 자금을 지원받았다.
의료 서비스의 꾸준한 발전에도 불구하고, 치료될 수 없거나 충분히 치료될 수 없는 질병 및 병리의 부담은 여전히 높아지고 있다. 그 중에서도 특출난 것은 수많은 형태의 종양, 특히 화학 방사선 요법 또는 생물학적 약제 또는 이들의 조합으로 치료되지만 성공은 제한적인, 종양의 전이 형태이다.
종양 치료의 대안적인 접근법은 복제가능 바이러스(replication competent virus)가 종양 세포를 감염시키고, 종양 세포 간(cell to cell)에 퍼져 그것들을 파괴하는 종양 용해 바이러스 치료법(oncolytic virotherapy)이다.
종양 용해 바이러스 치료법은 암의 면역요법(immunotherapy)과 조합될 수 있다. 따라서 환자는 종양 용해 바이러스와 면역 요법제(immunotherapeutic agent) 모두가 투여될 수 있거나, 또는 종양 용해 바이러스는 종양에 대한 숙주의 면역 반응을 증가시키는, 사이토카인, 케모카인 또는 면역 체크포인트 조절자(immune checkpoint regulator)와 같은 분자를 발현하도록 조작되었다. 면역 체크포인트 조절자는 CTLA4, PD1, PDL1, LAG3, KIR, NKG2A, TIM3, TIGIT, CD96, BTLA에 대한 항체 또는 단일 사슬 항체를 포함한다. 그것들은 단일 또는 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 종양에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 재조합 종양 용해 바이러스의 카테고리에 포함되는 것은 전이성 흑색종의 치료를 위해 FDA에 의해 승인된, GM-CSF를 암호화하는 HSV인 탈리모겐 라허파럽벡(talimogene laherparepvec)으로 재명명된 T-VEC(상업명 임리직(Imlygic)이다.
단순포진 바이러스(Herpes simplex virus, HSV)는 인간에 대한 병원성 바이러스이다. 배양에서, 이는 많은 수의 포유류 세포를 감염시킨다. 이는 표적 세포 유형에 따라, 원형질막에서 또는 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해, 막 융합에 의해 세포로 들어가는 외피보유 바이러스(enveloped virus)이다. 표적 세포 내로의 HSV의 진입(entry)은 바이러스 당단백질 gD, gH/gL, gC 및 gB의 복잡한 상호작용 및 구조적 변화가 필요한 다단계 프로세스이다. 이들 당단백질은 HSV 입자의 가장 바깥쪽의 구조이며 막으로 이루어지는, 바이러스 외피(envelope)를 구성한다. 세포 진입을 위해, gC 및 gB는 HSV 입자의 세포 표면 헤파란 황산(heparan sulfate)에 대한 첫 번째 부착(attachment)을 매개한다. 그 후, gD는 Nectin-1 및 HVEM 또는 HVEA 중 적어도 두 개의 다른(alternative) 세포 수용체에 결합하여, 비리온(virion)-세포막 융합으로 이어지는 연쇄적 사건을 일으키는 gD에서의 구조적 변화를 야기한다. 그 때문에, 중간(intermediate) 단백질 gH/gL(이종 이량체(heterodimer))이 활성화되어 막 융합을 촉진시키는 gB를 촉발시킨다. 따라서, gB는 막에 결합하여 바이러스성 융합 유도물질(fusogen)로서 작용한다.
종양 용해성 HSV(oncolytic HSV, o-HSV)는 최근 수년간 종양 용해제(oncolytic agent)로서 사용되어왔다. 야생형 HSV 바이러스는 독성이 매우 강하기 때문에, o-HSV는 약독화(attenuated)될 필요가 있다. 임상 시험에 도달한 T-VEC/임리직 및 바이러스는 감염된 세포에서 단백질 합성의 차단(shut off)을 막는 역할을 하는 ICP34.5 단백질을 암호화하는 감마 γ134.5 유전자 및 리보뉴클레오티드 리덕타아제(ribonucleotide reductase)의 큰 서브유닛을 암호화하는 UL39 유전자를 포함하는, 하나 이상의 HSV 유전자의 결실을 갖는다. 자손 바이러스(progeny virus)를 고수율로 생산하지 못하는 것과 같은 이들 바이러스에 의해 나타나는 몇 가지 단점 이외에, 이들은 또한 그들의 천연 수용체를 포함하고 있는 임의의 세포에 결합하는 보존된(preserved) 능력이 있다. 따라서, 종양 세포를 죽이는 치료 효과는 감소되고, 바이러스는 의학 용도에 한계가 있을 수 있다.
이러한 한계를 극복하기 위한 하나의 접근법은 종양 세포에 대개 고도의 특이적 친화성(tropism)을 나타내는 o-HSV의 유전자 조작이었으며, 그렇지 않은 경우 약독화되지 않았다. 이 접근법은 종양-특이적 수용체에 대한 HSV 친화성의 리타겟팅(retargeting)으로 정의되었다.
암-특이적 수용체에 대한 HSV의 리타겟팅은 특정 리간드를 암호화하는 이종 서열을 보유하도록 하는 gD의 유전적 변형을 수반한다. 재조합 바이러스로 감염되면, 야생형 gD 대신 그것의 외피에 키메라 gD-리간드 당단백질을 갖는 자손 바이러스가 형성된다. 리간드는 선택된 세포 상에 특이적으로 발현되는 분자와 상호작용하여, 재조합 o-HSV의 선택된 세포 내로의 진입을 가능하게 한다. HSV의 리타겟팅에 성공적으로 사용되었던 리간드의 예는 IL13α, uPaR, HER2에 대한 단일 사슬 항체 및 EGFR에 대한 단일 사슬 항체이다.
당단백질의 변형을 통한 리타겟팅은 gC로도 시도되었다. 삽입된 리간드는 EPO와 IL13이었다. gC-EPO 폴리펩티드를 가지는 바이러스는 EPO 수용체를 발현하는 세포에 부착된다. 그러나 이러한 부착은 감염성 진입(infectious entry)으로 이어지지 않았다. 또한, gC-IL13 폴리펩티드는 gD 유전자에서 IL13의 두 번째 카피를 가지는 바이러스에 존재한다. 따라서, gC-IL13이 IL13 알파2 수용체로 리타겟팅되는데 기여했는지 또는 기여하지 않았는지 여부에 대해서는 이러한 연구로부터 추론할 수 없었다.
gH의 유전자 변형을 통한 리타겟팅 또한 이루어졌다. 삽입된 리간드는 gH 유전자 내에 결실이 있거나 없거나, HER2에 대한 단일 사슬 항체(single-chain antibody, scFv)였다. 바이러스는 HER2 수용체를 가지는 세포에 대해 성공적으로 리타겟팅되었다(Gatta et al., 2015). 또한, gH에 HER2에 대한 scFv를 함유하고 성숙 gD 단백질에 EGFR에 대한 scFv를 함유하는 재조합 바이러스를 제작하였다. 그 결과 수용체를 가지는 세포에 대해 이중(double) 리타겟팅이 가능해졌다. 또한, gH에 HER2에 대한 scFv를 함유하고 성숙 gD 단백질에 HER2에 대한 scFv를 함유하는 재조합 바이러스를 제작하였다. 그 결과 HER2 수용체에 대해 이중 리타겟팅이 가능해졌다(PCT application, Abstract # P-28, 9th International conference on Oncolytic virus Therapeutics, Boston 2015).
gB를 통한 바이러스의 리타겟팅은 보고된 적이 없다. gB 유전자 내의 삽입 부위가 확인되어 보존된 막 융합 활성을 갖는 생존 가능한 바이러스 돌연변이체를 얻었음에도 불구하고(Gallagher et al., 2014; Lin and Spear, 2007; Potel et al., 2002), 폴리펩티드-gB 융합체(fusion)를 분석하는데 사용된 검정법은 - 삽입된 폴리펩티드가 표적 수용체에 결합할 수 있는 이종 펩티드인 경우 - 그 후 얻어지는 재조합체(recombinant)가 gB의 융합 활성에 기여하며, 리간드에 의해 표적화된 수용체에 리타겟팅(re-addressed)된 친화성을 나타내는지의 여부를 예측할 수 없었다. 무엇보다도, 당업계의 경험에 따르면, HSV를 비롯한 바이러스의 친화성을 리타겟팅하려는 어떠한 노력도 변형을 위해, 예를 들어 이종 리간드의 삽입을 위해 선택된 당단백질이 바이러스 친화성의 결정 인자(determinant)인 경우에만 성공적이라고 예측한다. 수용체는 HSV gB를 요구하며; 그것들은 gB와 gC가 결합하는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 미엘린 관련 당단백질 MAG, 한 쌍의 면역글로불린 유사 타입 2 수용체 알파(paired immunoglobulin-like type 2 receptor alpha, PILR알파), DC-SIGN 및 비근육(non-muscle) 미오신 중쇄 9 MYH9/NMHC-IIA이다. 어떠한 경우에도, 이들 분자와 gB의 상호작용은 HSV 친화성을 결정하는 것으로 나타났다. 따라서, PILR알파는 상피세포와 신경세포를 우선적으로 감염시키는 바이러스인 HSV에 의해 주로 표적화되지 않는 세포 유형인 단핵구 세포 내로 HSV를 진입시키는데 참여한다. 다른 수용체의 경우, HSV 감염에서 이들의 역할은 아직 조사되지 않았다. 그러므로 당업계의 전문가는 gB에 대한 적합한 변형이 선택되는 표적 수용체에 대해 친화성을 리타겟팅할 수 있음을 예측할 수 없다.
당업계는 몇 가지 대안적인 리타겟팅 전략을 제공할 필요가 있다. 이러한 필요성은 동일한 종양에서 암세포의 이질성(heterogeneity)에 기인하고, 이에 의해 세포는 상이한 수용체를 발현하며, 암세포의 수용체와는 상이한 수용체의 레파토리(repertoire)를 발현하거나 또는 표적 치료에 내성이 있는 세포의 저항(insurgence)을 나타낼 수 있는 암 줄기세포(stem cell)를 제거할 필요성이 있다.
본 발명은 바이러스를 제거될 필요가 있는 세포의 수용체로 리타겟팅하는 변형된 gB 단백질을 갖는 재조합 HSV를 기술한다.
본 발명자들은 gB와의 융합 단백질로서 특정 세포 수용체에 대한 폴리펩티드 리간드를 포함하는 재조합 HSV를 제조할 수 있으며, 이로 인해 리간드의 존재 때문에 HSV가 수용체를 가지는 세포로 리타겟팅됨을 보여 주었다. 또한, HSV는 감염성을 유지하며, 수용체를 가지는 세포 안으로 들어가 감염된 세포를 죽이는 것으로 밝혀졌다.
도 1: 재조합 R-BP901, R-BP903, R-BP909, R-313, R-315, R-317 및 R-319의 게놈 배열. (A-G) HSV-1 게놈은 내부 반복(internal repeat, IR)에 의해 개재되는(bracketed) 선으로 나타낸다. Lox-P 사이에 개재된 BAC 서열과 eGFP 형광 마커는 유전자간 부위(intergenic region) UL3 - UL4에 삽입된다. A) R-BP903은 gB의 AA 43-44 사이에 하류(downstream) 12 Ser-Gly 링커를 갖는 scFv-HER2의 삽입물(insertion)를 가진다. B) R-BP909는 R-BP903과 동일하지만, 디타겟팅을 위해 성숙 gD에 AA 6-38의 결실을 추가로 가진다. C) R-BP901은 gB의 AA 81-82 사이에 Ser-Gly 링커를 갖는 scFV-HER2의 삽입물을 가진다. D) R-313은 미성숙 gB의 AA 43-44 사이에 하나의 상류(upstream) Ser-Gly 링커와 하나의 하류 Ser-Gly 링커를 갖는 GCN4 펩티드의 삽입물 및 성숙 gD의 AA 6-38 대신 11개의 아미노산 길이 링커인 하류 Ser-Gly를 갖는 scFv-HER2를 가진다. E) R-315는 미성숙 gB의 AA 81-82 사이에 하나의 상류 Ser-Gly 링커와 하나의 하류 Ser-Gly 링커를 갖는 GCN4 펩티드의 삽입물 및 성숙 gD의 AA 6-38 대신 11개의 아미노산 길이 링커인 하류 Ser-Gly 링커를 갖는 scFv-HER2를 가진다. F) R-317은 미성숙 gB의 AA 76-66 사이에 하나의 상류 Ser-Gly 링커와 하나의 하류 Ser-Gly 링커를 갖는 GCN4 펩티드 및 성숙 gD의 AA 6-38 대신 11개의 아미노산 길이 링커인 하류 Ser-Gly를 갖는 scFv-HER2를 가진다. G) R-319는 미성숙 gB의 AA 95-96 사이에 하나의 상류 Ser-Gly 링커와 하나의 하류 Ser-Gly 링커를 갖는 GCN4 펩티드 및 성숙 gD의 AA 6-38 대신 11개의 아미노산 길이 링커인 하류 Ser-Gly를 갖는 scFv-HER2를 가진다.
도 2: R-BP901 및 R-BP909는 키메라 scFv-gB 당단백질을 발현한다. 3 PFU/세포의 감염 다중도(multiplicity of infection)의 투입량(input)으로 R-BP901, R-BP909 또는 R-LM5를 이용하여 감염된 SK-OV-3 세포의 용해물(lysate)에 PAGE를 실시하였다. MAb H1817을 이용한 면역 블롯(immunoblot)으로 gB를 검출하였다. 왼쪽의 숫자는 250 K, 130 K 및 95 K MW 마커의 이동 위치를 나타낸다.
도 3: 재조합 R-BP901, R-BP903 및 R-BP909를 이용한, 단일 수용체를 발현하는 J 세포의 감염. J 세포는 wt-HSV에 대한 수용체를 발현하지 않는다. J-HER2, J-Nectin1, J-HVEM은 지시된 수용체만을 발현한다. 지시된 세포를 R-BP903, R-BP909 및 R-BP901로 감염시키고, 감염 24시간 후 녹색 형광현미경 검사로 관찰하였다. (A) R-BP903에 감염된 J-HER2 세포뿐만 아니라 J-Nectin 및 J-HVEM 또한 이 재조합체가 wt-gD를 암호화하는 것을 고려하면 그러할 것으로 예상된다. 이 바이러스는 HER2로 리타겟팅되며, 천연의 친화성을 유지한다. (B) R-BP909는 유일한(sole) 수용체(J-HER2)로서 HER2를 발현하고, AA 6-38의 gD 결실의 결과로 J-Nectin 및 J-HVEM은 감염시키지 못하는 세포를 감염시킨다. R-BP909는 HER2로 리타겟팅되고, HSV-1 gD 천연 수용체로부터 디타겟팅된다. (C) R-BP901은 J-HER2를 감염시키지 못하며; 이 바이러스는 HER2로 리타겟팅되지 않는다.
도 4: R-BP909는 HER2+ 암세포를 특이적으로 감염시킨다. 지시된 HER2- 및 HER2+ 암 세포주는 R-BP909 및 R-BP303으로 감염시켰다. 형광현미경 하에서 감염 24시간 후 사진을 찍었다. R-BP909는 HER2-양성 암세포를 감염시키고, HER2-음성 암세포는 감염시키지 못한다. R-BP903은 디타겟팅의 결여에 따라 HER2의 발현과 무관하게 세포를 감염시킨다.
도 5: J-HER2 (A) 및 SK-OV-3 (B) 세포에서 R-BP909 진입 경로의 특성. 지시된 바이러스를 HD1, 52S, H126 MAb와 함께 전배양한 다음, J-HER2 또는 SK-OV-3 세포를 감염시켰다. 지시되면, 세포를 트라스투주맙 또는 대조군 IgG로 미리 처리하였다. 24시간 후 유세포 분석법(flow cytometry)으로 감염을 정량화하였다. (A) J-HER2 세포의 R-BP909 감염은 트라스투주맙에 의해, 그리고 gB에 대한 MAb H126에 의해 거의 사라졌다. (B) SK-OV-3 세포의 R-BP909 감염은 트라스투주맙에 의해, 그리고 gB에 대한 MAb H126, gH에 대한 52S에 의해 억제되지만, gD에 대한 MAb HD1에 의해서는 억제되지 않는다. gD에서 HER2에 scFv를 삽입하여 HER2로 리타겟팅된 재조합 R-LM113은 R-BP909와 유사한 거동을 보였다.
도 6: R-BP909의 생장 곡선 및 대조군 재조합 R-VG809(gH를 통해 HER2로 리타겟팅 됨)와 R-LM113(gD를 통해 HER2로 리타겟팅 됨)의 생장 곡선. 0.1 PFU/세포의 다중 감염도 투입량으로 지시된 재조합체를 이용하여 SK-OV-3 세포를 감염시키고, 감염 후 지시된 시간(h)에 수확하였다. 자손 바이러스를 SK-OV-3 세포에서 적정(titrated)하였다. 생장 곡선은 R-BP909가 R-VG908와 유사한 방식으로, R-LM113보다 약 1 로그 적은 양으로 복제됨을 보여준다.
도 7: 감염된 SK-OV-3 및 MDA-MB-453 세포에 대한 R-BP909 및 R-VG809의 사멸 능력, 및 HER2- 암세포에 대한 사멸 능력의 결여. HER2-양성 SK-OV-3과 MDA-MB-453 세포, 및 HER2- MDA-MB-231 암세포를 각각 2 PFU/세포(MDA-MD-231 세포에 대해서는 0.1 PFU/세포)로 지시된 바이러스를 이용하여 감염시켰다. AlamarBlue 검정법으로 생존력을 정량화하였다. R-BP909는 SK-OV-3 세포 및 MDA-MB-453 세포를 R-VG908과 유사한 효율로 사멸시킨다. 두 바이러스 모두 HER2- 음성 MDA-MD-231 암세포를 사멸시키지 못하였으며, 이는 이들 세포를 감염시킬 수 없다는 것과 일치한다.
도 8: 재조합 R-313, R-315, R-317 및 R-319의 감염 패턴. wt-HSV, J-HVEM 및 N-Nectin에 대한 수용체를 발현하는 wt-Vero, Vero-GCN4R, SK-OV-3, 모(parental) J 세포 및 J 세포를 지시된 바이러스로 감염시키고, 감염 24시간 후 녹색 형광 현미경으로 관찰하였다. R-313, R-315, R-317 및 R-319는 수용체로서 HER2(인간 및 원숭이 모두) 및 GCN4를 발현하고, gD의 AA 6-38의 결실의 결과로서 Nectin 및 HVEM을 통해 감염시키지 못하는 세포를 감염시킨다. 조작된 바이러스 모두 HER2 및 GCN4로 리타겟팅되고, HSV-1 gD 천연 수용체로부터 디타겟팅된다. 트라스투주맙(허셉틴(Herceptin)으로도 불림)에 노출된 HER2-양성 세포주에서의 감염의 억제는 R-313, R-315, R-317 및 R-319가 이들 세포에서 HER2를 진입의 입구(portal)로서 사용한다는 것을 확인시켜준다.
도 9: R-313, R-315, R-317, R-319의 생장 곡선, 및 대조군 재조합 R-LM113(gD를 통해 HER2로 리타겟팅됨)과 R-LM5(HSV 당단백질에 대한 wt 및 R-313, R-315, R-317, R-319 및 R-LM113에 존재하는 다른 게놈 변형을 가짐)의 생장 곡선. 0.1 PFU/세포의 다중 감염도 투입량(각각 세포주에서 적정된 바와 같음)으로 지시된 재조합체를 이용하여 Vero-GCN4R 및 SK-OV-3 세포를 감염시키고, 감염 후 지시된 시간(h)에 수확하였다. SK-OV-3 세포에서 자손 바이러스를 적정하였다.
도 10: 상이한 세포주에서 R-313, R-315, R-317, R-319의 평판 배양 효율(plating efficiency), 및 대조군 재조합 R-LM113과 R-LM5의 평판 배양 효율. 재조합 바이러스의 복제 분취액(aliquot)을 Vero-GCN4R, wt-Vero 및 SK-OV-3에 평판 도말하였다. 감염 3일 후, 형광 현미경 하에서 플라크의 수를 세었다.
도 11: 상이한 세포주에서 R-313, R-315, R-317 및 R-319의 상대적 플라크 크기. A) R-313, R-315, R-317, R-319, R-LM113 및 R-LM5의 복제 분취액을 Vero-GCN4R, wt-Vero 및 SK-OV-3에 평판 도말하였다. 감염 3일 후 형광 현미경 하에서 플라크의 사진을 찍었다. 대표적인 플라크를 나타낸다. B) 플라크 영역의 정량은 pxE2로 나타낸다.
도 12: GCN4-Nectin 수용체에 대한 키메라 scFv의 개략도. 수용체는 N-말단 리더 펩티드 및 HA 태그 서열을 제공하며, 이어서 GCN4에 대한 scFv를 두 개의 짧은 링커 GA 및 GSGA 링커 사이에 위치시킨다. 분자의 두 번째 부분은 Nectin-1 세포 외 도메인 2와 3, TM 분절(segment) 및 세포 내 세포질 꼬리를 포함하는 인간 Nectin-1(PVRL1) 잔기 Met143 내지 Val517에 상응한다.
도 13: Vero-GCN4 양성 세포의 안정성. scFv GCN4-Nectin 수용체의 발현은 HA 태그에 대한 Mab에 의해 FACS로 분석되었다. 도표는 계대(passage) 10, 15, 30, 40에서 Vero GCN4 클로 11.2 세포로부터의 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 결과: 인공 수용체의 발현은 40의 연속 계대 후에도 안정하게 유지된다.
도 14: 재조합 R-321의 게놈 배열. HSV-1 게놈은 내부 반복(IR)에 의해 개재되는 선으로 나타낸다. Lox-P 사이에 개재된 BAC 서열과 eGFP 형광 마커는 유전자간 부위 UL3 - UL4에 삽입된다. R-321은 성숙 gD의 AA 30 및 38의 결실 및 gD AA 37 이후의 scFv-HER2의 삽입물을 가진다. R-321은 미성숙 gB의 AA 43-44 사이에 하나의 상류 Ser-Gly 링커와 하나의 하류 Ser-Gly 링커를 갖는 GCN4 펩티드의 삽입물을 가진다.
도 15: 재조합 R-321의 감염 패턴. wt-HSV, J-HVEM 및 N-Nectin에 대한 수용체를 발현하는 wt-Vero, Vero-GCN4R, SK-OV-3, 모(parental) J 세포 및 J 세포를 지시된 바이러스로 감염시키고, 감염 24시간 후 녹색 형광 현미경으로 관찰하였다. R-321은 수용체로서 HER2(인간 및 원숭이 모두) 및 GCN4를 발현하고, gD의 AA 30 및 38의 결실의 결과로서 Nectin 및 HVEM을 통해 감염시키지 못하는 세포를 감염시킨다. R-321은 HER2 및 GCN4로 리타겟팅되고, HSV-1 gD 천연 수용체로부터 디타겟팅된다. 트라스투주맙(허셉틴(Herceptin)으로도 불림)에 노출된 HER2-양성 세포주에서의 감염의 억제는 R-321이 이들 세포에서 HER2를 진입의 입구(portal)로서 사용한다는 것을 확인시켜준다.
도 16: R-321의 생장 곡선, 및 대조군 재조합 R-LM113(gD를 통해 HER2로 리타겟팅됨)과 R-LM5(HSV 당단백질에 대한 wt 및 R-321에 존재하는 다른 게놈 변형을 가짐)의 생장 곡선. 0.1 PFU/세포의 다중 감염도 투입량(각각 세포주에서 적정된 바와 같음)으로 지시된 재조합체를 이용하여 Vero-GCN4R 및 SK-OV-3 세포를 감염시키고, 감염 후 지시된 시간(h)에 수확하였다. SK-OV-3 세포에서 자손 바이러스를 적정하였다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 특징은 개별 단락으로 기술된다. 그러나 이는 단락에 기술된 특징이 다른 단락에 기술된 특징 또는 특징들과 분리되어 있음을 의미하는 것은 아니다. 오히려, 단락에 기술된 특징은 다른 단락에 기술된 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "포함하다/포함하는"은 구체적으로 언급되지 않은 개시된 특징 및 추가 특징을 "포함하는" 것을 의미한다. 용어 "포함하다/포함하는"은 또한 지시되는 특징으로 "구성되는/이루어지는" 것을 의미하므로, 지시되는 특징을 제외한 추가의 특징을 포함하지 않는다. 따라서 본 발명의 제품은 지시된 바와 같은 특징 이외에 부가적인 특징을 특징으로 할 수 있다.
첫 번째 양상에서, 본 발명은 표적 분자에 결합할 수 있으며 헤르페스 바이러스의 외피에 존재하는 당단백질 B(glycoprotein B, gB)에 융합되거나 또는 삽입될 수 있는 이종(heterologous) 폴리펩티드 리간드를 포함하는 재조합 헤르페스 바이러스를 제공하며, 여기에서 리간드는 gB에 융합되거나, 또는 여기에서 리간드는 gB의 무질서(disordered) 영역 내의 임의의 아미노산에 삽입되지만, 서열번호 1에 따른 gB의 아미노산 77 내지 88에 걸친 영역 내 또는 상동(homologous) gB의 상응하는 영역 내의 임의의 아미노산에는 삽입되지 않거나, 또는 여기에서 리간드는 서열번호 1에 따른 gB의 아미노산 31 내지 77 또는 88 내지 184, 바람직하게는 아미노산 31 내지 77 또는 88 내지 136, 또는 더욱 바람직하게는 31 내지 77 또는 88 내지 108에 걸친 영역 내, 및/또는 아미노산 409 내지 545, 바람직하게는 아미노산 459 내지 545, 또는 더욱 바람직하게는 아미노산 459 내지 497, 또는 여전히 더욱 바람직하게는 아미노산 460 내지 491에 걸친 영역 내, 또는 상동 gB의 상응하는 영역 내의 임의의 아미노산에 삽입된다.
또한, 본 발명은 표적 분자에 결합할 수 있으며 헤르페스 바이러스의 외피에 존재하는 당단백질 B(gB)에 삽입될 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드를 포함하는 재조합 헤르페스 바이러스를 제공하며, 여기에서 리간드는 5 내지 120개의 아미노산 길이를 가지며, 서열번호 1에 따른 gB의 아미노산 77 내지 88에 걸친 영역 내 또는 상동 gB의 상응하는 영역 내의 임의의 아미노산에 삽입된다.
이의 구현예에서, 헤르페스 바이러스는 표적 분자를 발현하거나 또는 이에 결합하는 세포에 결합하는 능력, 바람직하게는 세포와 융합하는 능력, 더욱 바람직하게는 세포에 들어가는 능력, 가장 바람직하게는 세포를 죽이는 능력을 갖는다.
이의 구현예에서, 표적 분자는 질병 세포(diseased cell) 상에 존재하며, 바람직하게는 질병 세포는 종양 세포, 감염된 세포, 퇴행성 장애 관련 세포 또는 노화 세포이거나, 또는 표적 분자는 세포 배양물(cell culture)에 존재하는 세포 상에 존재하며, 바람직하게는 세포는 헤르페스 바이러스의 성장에 적합한 배양된 세포, 더욱 바람직하게는 헤르페스 바이러스 성장을 위해 승인된 세포주(cell line), 보다 더욱 바람직하게는 Vero, 293, 293T, HEp-2, HeLa, BHK 또는 RS 세포, 가장 바람직하게는 Vero 세포이다.
이의 구현예에서, 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자는 종양 관련 수용체, 바람직하게는 HER2, EGFR, EGFRIII 또는 EGFR3 (ERBB3), EGFRvIII을 포함하는 EGF 수용체 패밀리의 구성원(member), 또는 MET, FAP, PSMA, CXCR4, CEA, CADC, 뮤신, 엽산 결합 단백질(Folate-binding protein), GD2, VEGF 수용체 1 및 2, CD20, CD30, CD33, CD52, CD55, 인테그린 패밀리, IGF1R, 에프린(Ephrin) 수용체 패밀리, 단백질-티로신 키나아제(protein-tyrosine kinase, TK) 패밀리, RANKL, TRAILR1, TRAILR2, IL13R알파, UPAR, 테나신(Tenascin), PD-1, PD-L1, CTL-A4, TIM-3, LAG3 또는 IDO를 포함하는 면역 체크포인트 패밀리 수용체의 구성원, 종양 관련 당단백질 72, 강글리오사이드(gangioside) GM2, A33, 루이스 Y 항체 또는 MUC1, 가장 바람직하게는 HER2이고, 또는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자는 인공(artificial) 분자, 바람직하게는 항체, 항체 유도체(derivative) 또는 항체 모방체(mimetic), 더욱 바람직하게는 단일-사슬 항체(scFv), 여전히 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자(GCN4 yeast transcription factor)의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 37로 구성되는 GCN4 효모 전자 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 39로 구성되는 scFv, 가장 바람직하게는 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자이다.
이의 구현예에서, 리간드는 천연 폴리펩티드 또는 인공 폴리펩티드이며, 바람직하게는 리간드는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 또는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있고, 더욱 바람직하게는 리간드는 세포에 접근 가능한 표적 분자의 천연 리간드, 표적 분자에 결합할 수 있는 천연 리간드의 일부, 천연 폴리펩티드의 일부, 항체, 항체 유도체, 항체 모방체이고, 여전히 더욱 바람직하게는 리간드는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 천연 폴리펩티드의 일부 또는 scFv이고, 여전히 더욱 바람직하게는 리간드는 서열번호 37로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부와 같은 GCN4 효모 전자 인자의 일부 또는 종양 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 scFv, 바람직하게는 HER2이고, 가장 바람직하게는 리간드는 서열번호 37의 서열로 표시되는 분자 또는 서열번호 32로 표시되는 scFv이다.
이의 구현예에서, 표적 분자는 HER2이고, 리간드는 서열번호 32로 표시되는 scFv이고, 질병 세포는 HER2를 발현하는 종양 세포, 바람직하게는 유방암(breast cancer) 세포, 난소암(ovary cancer) 세포, 위암(stomach cancer) 세포, 폐암(lung cancer) 세포, 두경부암(head and neck cancer) 세포, 골육종(osteosarcoma) 세포, 다형성 신경교모종(glioblastoma multiforme) 세포 또는 침샘 종양(salivary gland tumor) 세포이고/이거나, 표적 분자는 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자이고, 리간드는 서열번호 37의 서열로 표시되는 분자이고, 세포는 세포 배양물에 존재하며 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자를 발현한다.
이의 구현예에서, 하나 이상의 리간드는 gB에 융합되거나 삽입되고, 바람직하게는 gB는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드 및 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함한다.
이의 구현예에서, 헤르페스 바이러스는 변형된 gD 및/또는 변형된 gH를 포함하며, 바람직하게는 여기에서 gB는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하고, 변형된 gD 및/또는 변형된 gH는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하고, 가장 바람직하게는 gB는 서열번호 37로 표시되는 서열을 포함하고, 표적 분자는 서열번호 41로 표시되는 서열을 갖는 분자이고, 세포는 세포 배양물에 존재하며 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자를 발현하고, 변형된 gD 및/또는 변형된 gH는 서열번호 32로 표시되는 scFv를 포함하고, 표적 분자는 HER2이고, 세포는 HER2를 발현하는 종양 세포, 바람직하게는 유방암 세포, 난소암 세포, 위암 세포, 폐암 세포, 두경부암 세포, 골육종 세포, 다형성 신경교모종 세포 또는 침샘 종양 세포이다.
이의 구현예에서, gD는 gD의 아미노산 30 내지 38 또는 이의 서브셋의 결실을 가지도록 변형되고, 바람직하게는 gD는 아미노산 30 및/또는 아미노산 38의 결실을 가지도록 변형되고, 더욱 바람직하게는 gD는 서열번호 62에 따른 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 영역에 대하여 아미노산 30 및 아미노산 38의 결실을 가지도록 변형된다.
이의 구현예에서, 이종 폴리펩티드 리간드는 아미노산 30 내지 38 또는 이의 서브셋 대신 gD에 삽입되고, 바람직하게는 이종 폴리펩티드 리간드는 아미노산 30 또는 아미노산 38 대신 삽입되고, 더욱 바람직하게는 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 62에 따른 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 영역에 대하여 아미노산 38 대신 삽입되고, 아미노산 30은 결실된다.
이의 구현예에서, 헤르페스 바이러스는 세포, 바람직하게는 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 자극하는 하나 이상의 분자(들)를 암호화한다.
당단백질 B(gB)는 헤르페스 바이러스과(herpesviridae)의 외부 표면상에 존재하며, 바이러스의 세포에의 결합 및 세포 내로의 침입에 관여하는 외피 단백질이다. 세포 진입에 관여하는 당단백질 중에서, gB는 gD 및 gH/gL을 통한 자극시 융합-촉진 구조적 재배치(fusion-promoting conformational rearrangement)를 겪는 융합 유도물질이다. gB는 30개의 아미노산 신호 펩티드, 696개의 아미노산 엑토도메인(ectodomain), 69개의 아미노산 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 109개의 아미노산 C-꼬리(C-tail)을 포함하는 904개의 아미노산으로 구성된다. gB는 헤르페스 바이러스과 패밀리에 걸쳐 가장 고도로 보존된 당단백질에 속한다. 단순포진 바이러스(HSV) 타입 1 gB의 결정(crystal) 구조는 그것의 융합 후(post-fusion) 형태에서 밝혀졌으며; 이는 5개의 구조적 도메인(I-V)을 갖는 삼량체(trimer)이다. 도메인 I은 아미노산 154 내지 363까지이고, 도메인 II는 아미노산 142 내지 153 및 364 내지 459, 이어서 아미노산 460 내지 491의 무질서 영역까지이고, 도메인 III은 아미노산 117 내지 133, 500 내지 572 및 661 내지 669까지이고, 도메인 IV는 아미노산 111 내지 116 및 573 내지 660까지이고, 도메인 V는 아미노산 670 내지 725까지이다(Heldwein et al., 2006). 무질서한 구조를 갖는 N-말단 영역은 아미노산 31 내지 108까지이다. EBV 및 HCMV의 결정 구조 또한 밝혀졌으며, 이는 본질적으로 HSV 타입 1의 결정 구조와 유사하다(Backovic et al., 2009; Burke and Heldwein, 2015). 이의 독특한 구조로 인해, 헤르페스 바이러스 gB는 바이러스 막 융합 당단백질의 새로운 분류인 분류 III에 속한다. 상이한 헤르페스 바이러스의 다양한 gB의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 단지 예시적인 목적으로, 이에 제한되지 않고, 서열번호 1로서 본원에 개시된 인간 헤르페스 바이러스 1의 gB의 아미노산 서열을 참조한다. 상응하는 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 미국 국립생물공학정보센터(National Centre for Biotechnology Information(NCBI); National Library of Medicine, Bethesda, MD20894, USA; www.ncbi.nlm.nih.gov)의 "Genome"에서 등록 번호(accession number) GU734771.1의 좌표 52996 내지 55710으로부터 입수 가능하다.
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서열번호 1
gB 상동체(homolog)는 헤르페스 바이러스과의 모든 구성원에서 발견되었다. 따라서 본원에 언급된 용어 "당단백질 B"는 헤르페스 바이러스과에서 발견되는 임의의 gB 상동체를 말한다. 대안적으로, 본원에 언급된 gB는 서열번호 1의 서열과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 동일성(identity)을 가지는 임의의 gB를 말한다. 대안적으로, 본원에 언급된 gB는 서열번호 1과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 상동성(homology)을 가지는 임의의 gB를 말한다. 본원에 언급된 gB는 또한 gB의 단편을 포함한다. 바람직하게는, 헤르페스 바이러스과에서 발견되는 임의의 gB, 상기 정의된 바와 같이 서열번호 1의 서열에 대해 아미노산 동일성을 가지는 임의의 gB, 및 gB의 임의의 단편을 포함하는 본원에 언급된 gB는 서열번호 1에 따른 gB와 동일한 활성을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 바이러스의 세포 내로의 진입 과정 동안, gB는 세포의 막과 바이러스의 융합을 촉진하는 구조적 변화를 겪으며, 여전히 더욱 바람직하게는, 이는 세포막과 함께 바이러스의 융합을 매개하는 융합 유도물질로서 작용한다.
본원에 사용된 "서열 동일성"의 백분율은 두 개의 최적으로 정렬된(aligned) 서열에서 상응하는 위치에서의 동일한 아미노산 잔기의 백분율을 말한다. 이는 비교 창(comparison window)에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기에서 비교 창의 아미노산 서열의 단편은 두 개의 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열(reference sequence)인 서열번호 1(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실(예를 들어, 갭(gap) 또는 오버행(overhang))을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열에서 동일한 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 창에서의 위치의 총수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 1981년 Smith 및 Waterman의 로컬 상동성 알고리즘에 의해, 1970년 Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 1988년 Pearson 및 Lipman의 유사도 검색 방법에 의해, 1993년 Karlin 및 Altschul에 의해 변경된 1990년 karlin 및 Altschul의 알고리즘에 의해, 또는 이들 알고리즘의 전산화된 실행(computerized implementation)(위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지, 유전자 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, GCG), 575 Science Dr., Madison, WI에 있는 GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 검색(inspection)에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로, 갭 가중치(gap weight)에 대해 5.00의 디폴트값 및 갭 가중치 길이(gap weight length)에 대해 0.30이 사용된다.
본원에 사용된 "상동성 백분율"은 두 개의 최적으로 정렬된 서열에서 상응하는 위치에 상동인 아미노산 잔기의 백분율을 말한다. 두 서열 간의 "상동성 백분율"은 계산상 상동인 위치뿐만 아니라 동일한 위치 또한 고려된다는 사실을 제외하고는, "동일성 백분율"의 결정과 관련하여 상기 기술된 것과 실질적으로 동일한 방식으로 정해진다. 두 개의 상동 아미노산은 두 개의 동일하거나 상동인 아미노산을 가진다. 상동 아미노산 잔기는 유사한 화학-물리적 특징을 가지며, 예를 들어 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr), 산성 아미노산(Glu, Asp), 극성 아미노산(Gln, Asn), 염기성 아미노산(Lys, Arg, His), 지방족 아미노산(Ala, Leu, Lie, Val), 수산기를 갖는 아미노산(Ser, Thr) 또는 짧은 곁사슬을 갖는 아미노산(Gly, Ala, Ser, Thr, Met)등 같은 그룹에 속하는 아미노산을 들 수 있다. 이러한 상동 아미노산 사이의 치환은 단백질 표현형(phenotype)을 변화시키지 않는(보존적(conservative) 치환) 것으로 예측된다.
gB는 서열번호 1에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 가지는 경우, 서열번호 1에 대하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 상동성을 가지는 경우, 또는 서열번호 1에 따른 gB와 동일한 활성을 가지는 경우 "상동(homologous)"이거나 "상동체(homolog)"이다. 바람직하게는, "동일한 활성"은 gB가 세포 수용체에 결합하고, 더욱 바람직하게는 바이러스의 세포 내로의 진입 과정 동안, gB가 세포막과 바이러스의 융합을 촉진하는 구조적 변화를 겪으며, 여전히 더욱 바람직하게는 gB가 융합 유도물질로서 작용한다는 의미로 이해될 수 있다. 상동체는 또한 상기 나타낸 바와 같은 활성을 가지는 전장(full length) gB의 단편일 수 있다.
본 발명의 키메라(chimeric) gB(서열번호 2로 예시됨)는 이종 폴리펩티드 리간드를 가지며, 이에 의해 gB 부분이 야생형(wt) 바이러스에 대해 수행하는 활성에 더하여 바이러스에 새로운 활성이 부여된다. 일단 키메라 gB가 재조합 바이러스의 외피의 일부가 되면, 재조합 바이러스의 표적 분자에 대한 결합이 가능해지고, 재조합 바이러스의 친화성을 리간드의 표적 분자를 가지는 세포로 리타겟팅한다. 바람직하게는, 키메라 gB는 세포막과 바이러스의 융합을 촉진하는 구조적 변화를 겪고, 여전히 더욱 바람직하게는 키메라 gB는 융합 유도물질로서 작용한다. 리간드의 표적 분자를 가지는 세포와의 융합 후, 재조합 헤르페스 바이러스는 세포에 들어가고, 재조합 헤르페스 바이러스에 의해 감염된 세포는 이종 폴리펩티드 리간드를 보유하는 키메라 gB를 비롯한 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 단백질을 생산한다. 감염된 세포는 세포를 용해하여 죽이는 자손(progeny) 바이러스를 생산한다.
본원에서 사용된 용어 "리타겟팅(retargeting)"은 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스가 리간드의 표적 분자를 표적으로 한다는 것을 의미한다. 그러나 재조합 헤르페스 바이러스는 여전히 비변형 헤르페스 바이러스의 천연 수용체를 표적으로 할 수 있다. 리타겟팅은 재조합 헤르페스 바이러스가 비변형 헤르페스 바이러스의 천연 수용체를 더 이상 표적으로 할 수 없음을 의미하는 "디타겟팅(detargeting)"과는 다르다.
본원에 사용된 gB의 특정 아미노산의 수 또는 영역의 표시는 처음 30개의 아미노산을 포함하는 N-말단 신호 서열을 포함하는, 서열번호 1로 예시된 바와 같은 gB의 "전구체(precursor)" 형태를 나타낸다. gB의 "성숙" 형태는 서열번호 1의 아미노산 31에서 시작하여 아미노산 904까지를 포함한다. 서열번호 1과 상이한 아미노산 서열을 갖는 gB 당단백질 또한 본 발명에 포함되므로, 서열번호 1과 관련된 특정 아미노산의 수 또는 특정 아미노산 영역 또한 상동 gB의 아미노산의 수 또는 영역을 의미하며, 이는 서열번호 1의 각각의 아미노산의 수 또는 영역에 상응한다.
본원에 언급된 용어 "재조합(recombinant)" 헤르페스 바이러스는 이종 폴리펩티드를 암호화하는 추가의 핵산 서열을 포함하도록 유전자 재조합에 의해 유전적으로 조작된 헤르페스 바이러스를 말한다. 재조합 헤르페스 바이러스를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Sandri-Goldin et al., 2006을 참조). 그러나, 본 발명은 유전공학 방법에 한정되지 않는다. 또한, gB에 각각 이종 폴리펩티드 리간드가 융합되거나 삽입된 헤르페스 바이러스를 생산하기 위하여 다른 방법도 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "키메라 당단백질 B" 또는 "키메라 gB" 또는 "키메라 gB"는 이종 폴리펩티드 리간드가 gB에 융합되거나 삽입된 gB를 의미한다. 키메라 gB는 재조합 바이러스에 의해 암호화되고, 재조합 바이러스를 생산하는 세포를 이용하여 합성되며, 비리온(virion)의 외피에 통합된다. 유전공학에 의해 재조합 바이러스를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 키메라 당단백질 B를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본원에 언급된 용어 "헤르페스 바이러스"는 헤르페스 바이러스과의 이중-나선 DNA 바이러스의 구성원을 말하며, 이는 잠복성(latent) 또는 용균성(lytic) 감염을 일으킨다. 헤르페스 바이러스는 모두 그 게놈이 80 내지 200개의 유전자를 암호화하는 상대적으로 큰(약 100,000 내지 200,000 염기쌍), 이중 나선의 선형 DNA로 이루어지며, 그 자체가 바이러스 단백질과 바이러스 mRNA를 모두 함유하고 있는 표피(tegument)라 불리는 단백질 층과 외피(envelope)라 불리는 지질 이중층 막으로 싸여진, 캡시드(capsid)라 불리는 20면체(icosahedral) 단백질 케이지에 싸여있다는 점에서 공통의 구조를 공유한다. 이 전체 입자는 또한 비리온으로도 알려져 있다. 용어 "헤르페스 바이러스"는 또한 예를 들어, 실험실에서 변형된 헤르페스 바이러스와 같은 하나 이상의 돌연변이 된 유전자를 포함하는 돌연변이 된 헤르페스 바이러스과의 구성원을 말한다.
바람직한 구현예에서, 헤르페스 바이러스는 단순포진 바이러스 1(Herpes Simplex Virus 1, HSV-1), 단순포진 바이러스 2(Herpes Simplex Virus 2, HSV-2), 대상포진 바이러스(Varicella Zoster Virus)(인간 헤르페스 바이러스 3(human herpesvirus 3, HHV-3)), 돼지 알파헤르페스 바이러스(swine alphaherpesvirus)인 가성광견병 바이러스(Pseudorabiesvirus, PRV), 침팬지 알파1 헤르페스 바이러스(Chimpanzee alpha1 herpesvirus, ChHV), 파핀 헤르페스 바이러스 2(Papiine herpesvirus 2, HVP2), 세르코피테신 헤르페스 바이러스 2(Cercopithecine herpesvirus 2, CeHV2), 마카신 헤르페스 바이러스 1(Macacine herpesvirus 1, MHV1), 사이미린 헤르페스 바이러스 1(Saimiriine herpesvirus 1, HVS1), 칼리트리신 헤르페스 바이러스 3(Callitrichine herpesvirus 3, CalHV3), 사이미린 헤르페스 바이러스 2(Saimiriine herpesvirus 2, HVS2), 소 헤르페스 바이러스 1(Bovine herpesvirus 1, BoHV-1), 소 헤르페스 바이러스 5(Bovine Herpesvirus 5, BoHV-5), 말 헤르페스 바이러스 1(Equine herpesvirus 1, EHV-1), 말 헤르페스 바이러스 2(Equine herpesvirus 2, EHV-2), 말 헤르페스 바이러스 5(Equine herpesvirus 5, EHV-5), 개 헤르페스 바이러스 1(Canine herpesvirus 1, CHV), 고양이 헤르페스 바이러스 1(Feline herpesvirus 1, FHV-1), 오리 장염 바이러스(Duck enteritis virus, DEV), 과일 박쥐 알파헤르페스 바이러스 1(Fruit bat alphaherpesvirus 1, FBAHV1), 소 헤르페스 바이러스 2(Bovine herpesvirus 2, BoHV-2), 토끼 헤르페스 바이러스 4(Leporid herpesvirus 4, LHV-4), 말 헤르페스 바이러스 3(Equine herpesvirus 3, EHV-3), 말 헤르페스 바이러스 4(Equine herpesvirus 4, EHV-4), 말 헤르페스 바이러스 8(Equine herpesvirus 8, EHV-8), 말 헤르페스 바이러스 9(Equid herpesvirus 9, EHV-9), 세르코피테신 헤르페스 바이러스 9(Cercopithecine herpesvirus 9, CeHV-9), 돼지 헤르페스 바이러스 1(Suid herpesvirus 1, SuHV-1), 마레크병 바이러스(Marek's disease virus, MDV), 마레크병 바이러스 혈청혀 2(Marek's disease virus serotype 2, MDV2), 매 헤르페스 바이러스 타입 1(Falconid herpesvirus type 1, FaHV-1), 칠면조 헤르페스 바이러스 3(Gallid herpesvirus 3, GaHV-3), 칠면조 헤르페스 바이러스 2(Gallid herpesvirus 2, GaHV-2), 폐-눈-기관 질병관련 헤르페스 바이러스(Lung-eye-trachea disease-associated herpesvirus, LETV), 칠면조 헤르페스 바이러스 1(Gallid herpesvirus 1, GaHV-1), 앵무과 헤르페스 바이러스 1(Psittacid herpesvirus 1, PsHV-1), 인간 헤르페스 바이러스 8(Human herpesvirus 8, HHV-8), 인간 헤르페스 바이러스 4(Human herpesvirus 4, HHV-4), 켈로니드 헤르페스 바이러스 5(Chelonid herpesvirus 5, ChHV5), 아텔린 헤르페스 바이러스 3(Ateline herpesvirus 3, AtHV3) 또는 멜레아그리드 헤르페스 바이러스 1(Meleagrid herpesvirus 1, MeHV-1)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 헤르페스 바이러스는 HSV-1 또는 HSV-2이고, 가장 바람직하게는 HSV-1이다.
본원에서 사용된 용어 "이종"은 헤르페스 바이러스 게놈에 의해 암호화되지 않은 폴리펩티드 또는 임의의 다른 헤르페스 바이러스의 폴리펩티드를 말한다. 바람직하게는, 용어 "이종"은 리간드의 표적 분자를 가지며 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스에 의해 감염되는 세포에 결합하는 폴리펩티드를 말한다. 이종 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드, 또는 이의 일부, 또는 자연에서 발견되지 않는 인공 폴리펩티드일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 이루어진 연속적이며 비분지된 펩티드 사슬이다. 폴리펩티드 사슬의 길이는 비제한적(unlimited)이며, 5개의 아미노산과 같은 몇 개의 아미노산에서부터 약 백 개 또는 천 개의 아미노산에 이르는 범위일 수 있다. 본 발명에서, 폴리펩티드는 리간드로서 또는 표적 분자로서 사용될 수 있다. 사슬의 길이는 리간드 또는 표적 분자를 위한 출발 분자(starting molecule)에 의존한다. 2 이상의 폴리펩티드 사슬이 항체와 같은 복합체에 조립될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 또한 폴리펩티드 사슬의 어셈블리(assembly)를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "펩티드"는 주로 약 50개 미만의 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 40개 미만의 아미노산 잔기, 또는 더욱 바람직하게는 약 10개 내지 약 30개 사이의 아미노산 잔기로 이루어지는 짧은 폴리펩티드 사슬이다. 최소 길이는 5개의 아미노산 잔기이다.
용어 "상동 gB의 상응하는 영역"은 Smith-Waterman 알고리즘과 다음의 정렬 파라미터: MATRIX: BLOSUM62, GAP OPEN: 10, GAP EXTEND: 0.5를 사용하는 경우에, 서열번호 1에 따른 gB의 주어진 영역과 정렬되는 gB의 영역을 말한다. 이 알고리즘은 일반적으로 공지되어 있고, 쌍 단위(pairwise) 서열 비교를 수행하는 경우에 당업계에서 사용되며, 당업자들은 이를 적용하는 방법을 알고 있다. 서열번호 1의 주어진 영역의 일부 또는 일부들만이 상기 알고리즘과 파라미터를 이용하여 상동 gB의 서열과 정렬되는 경우, 용어 "상응하는 영역"은 서열번호 1의 주어진 영역의 일부(들)와 정렬되는 영역을 말한다. 이 경우, 리간드가 삽입되는 상동 gB 내의 영역은 서열번호 1의 주어진 영역의 일부(들)과 정렬되는 아미노산만을 포함한다. 용어 "상응하는 영역"은 또한 상응하는 인접(flanking) 서열에 의해 측면에 위치하는(flanked) 영역을 말하며, 여기에서 인접 서열은 상기 알고리즘과 파라미터를 이용하여 서열번호 1의 영역에 인접하는 서열로 정렬된다. 이들 인접 서열은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50개의 아미노산 길이이다. 사용될 수 있는 또 다른 알고리즘은 1970년 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘, 1988년 Pearson 및 Lipman의 유사도 방법, 또는 1993년 Karlin 및 Altschul에 의해 변경된 1990년 kariln 및 Altschul의 알고리즘, 또는 이들 알고리즘의 전산화된 실행일 수 있다.
용어 "상응하는 아미노산"은 상응하는 영역 내에 존재하며, 정렬에서 서열번호 1의 주어진 아미노산의 대응부(counterpart)인 아미노산을 말한다. 상응하는 아미노산은 상응하는 영역 내에 존재하는 한, 정렬에서 서열번호 1에 있는 이의 대응부와 동일하지 않아야 한다.
본원에서 언급된 리간드는 세포의 표면에 접근 가능한 표적 분자에 결합하거나 결합할 수 있다. 바람직하게는, 이는 세포의 표면에 접근 가능한 표적 분자에 특이적으로 결합하거나 특이적으로 결합할 수 있으며, 이에 의해 "특이적으로 결합(specifically bind)"이라는 용어는 리간드가 특정의 관심 표적 분자에는 결합하는 반면, 세포 상에 존재하는 다른 분자 또는 리간드가 유기체에서 접촉할 수 있는 다른 분자에는 상당한 양(10% 미만)으로 결합하지 않는 결합 반응을 말한다. 일반적으로, 표적 분자에 "특이적으로 결합"하는 리간드는 그 표적 분자에 대해 약 105(예를 들어, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 또는 그 이상) 몰(mole)/리터(liter)보다 큰 평형 친화도 상수(equilibrium affinity constant)를 갖는다. 바람직하게는, 리간드는 바이러스가 세포와 융합하는 능력을 매개하므로, 더욱 바람직하게는 바이러스는 그 후 세포에 들어가고, 더욱 바람직하게는 세포를 죽인다. 리간드는 인간에게 유해하지 않은 것으로 이해된다. 또한, 리간드는 헤르페스 바이러스 단백질이 아니거나, 또는 헤르페스 바이러스 단백질로부터 변형에 의해 유래되지 않는다.
리간드는 세포에 접근 가능한 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 천연 또는 인공 폴리펩티드 리간드일 수 있고, 바람직하게는 여기에서 이종 폴리펩티드 리간드는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자 또는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있다. 천연 폴리펩티드 리간드는 표적 분자에 결합할 수 있는 천연 폴리펩티드이다. 따라서, 리간드는 수용체 분자와 같은 천연 표적 분자의 천연 리간드일 수 있고, 이는 세포에 접근 가능하다. 이러한 리간드의 예는 사이토카인, 케모카인, 면역 체크포인트 차단물질(blocker) 또는 성장 인자일 수 있다. 공지의 예는 EGF 및 IL13이다. 대안적으로, 리간드는 표적 분자에 결합하는 항체이다. 여전히 대안적으로, 리간드는 인공 표적 분자에 결합하도록 선택된 천연 폴리펩티드이며, 이에 의해 표적 분자는 리간드에 결합할 수 있도록 설계된다. 천연 폴리펩티드는 임의의 유기체로부터, 바람직하게는 인간에 해롭지 않은 유기체로부터 유래 될 수 있다. 예를 들어, 천연 폴리펩티드는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 사카로마이세스 속으로부터의 폴리펩티드와 같은 진균 또는 세균성 폴리펩티드이다. 천연 폴리펩티드의 예는 GCN4 효모 전사 인자이다. 인공 폴리펩티드 리간드는 특정 표적 분자에 결합하도록 기능하는 비-자연적으로 발생한 아미노산 서열을 갖는다. 인공 폴리펩티드 리간드의 서열은 아미노산의 삽입, 결실, 치환 및/또는 부가를 포함하는, 변형된 천연 폴리펩티드로부터 유래 될 수 있고, 이에 의해 상응하는 천연 폴리펩티드의 결합 능력은 유지된다. 예를 들어, 리간드는 상응하는 전장 폴리펩티드가 결합하는 표적 분자에 결합할 수 있는 한, 상기 언급된 천연 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 대안적으로, 천연 폴리펩티드는 상응하는 천연 폴리펩티드에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 포함하도록 변형되고, 이에 의해 변형된 폴리펩티드는 표적 분자에 결합하는 것과 같은 상응하는 천연 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 여전히 대안적으로, 인공 폴리펩티드 리간드는 천연 폴리펩티드의 일부 또는 (랜덤) 펩티드 라이브러리로부터의 펩티드와 같은, 274개 미만의 아미노산 잔기, 바람직하게는 200개 미만의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 50개 미만의 아미노산 잔기, 여전히 더욱 바람직하게는 40개 미만의 아미노산 잔기, 또는 여전히 더욱 바람직하게는 10개와 30개 사이의 아미노산. 가장 바람직하게는 20개의 아미노산을 가질 수 있다. 여전히 대안적으로, 폴리펩티드는 표적 분자에 결합하는 항체 유도체 또는 항체 모방체이다. 항체, 항체 유도체 또는 항체 모방체는 단일 특이적(mono-specific)(즉, 세포의 표면에 접근 가능한 하나의 표적 분자에 특이적임) 또는 예를 들어, 이중 특이적 또는 삼중 특이적(예를 들어, Castoldi et al., 2013, Castoldi et al., 2012) 등의 다중 특이적(multi-specific)(즉, 동일 또는 상이한 세포의 표면상에 접근 가능한 하나 이상의 표적 분자에 특이적임)일 수 있다. 바이러스의 특이도(specificity)는 동일한 세포 상의 하나 이상의 표적 분자를 동시에 타겟팅하는 것에 의해 증가한다. 상이한 세포 상에 존재하는 하나 이상의 표적 분자가 표적화되면, 종양 이질성은 해소될 수 있다.
본원에서 언급된 용어 "항체 유도체"는 적어도 하나의 항체 가변 도메인을 포함하지만, 항체의 전체 구조를 포함하지 않는 분자를 말한다. 항체 유도체는 여전히 표적 분자에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 항체 유도체는 바이러스가 세포와 융합하는 능력을 매개하므로, 더욱 바람직하게는 바이러스는 그 후 세포에 들어가고, 여전히 더욱 바람직하게는 세포를 죽인다. 상기 유도체는 Fab, Fab2, scFv, Fv와 같은 항체 단편, 또는 이들의 일부, 또는 기타 유도체, 또는 나노바디, 디아바디, 미니바디, 낙타과(camelid) 단일 도메인 항체, 단일 도메인 또는 Fab 단편, 가변 영역의 중쇄 및 경쇄의 도메인(예컨대, Fd, V람다(Vlambda)와 V카파(Vkappa)를 포함하는 VL, VH, VHH)뿐만 아니라 적어도 두 개의 구조적 루프(structural loop)에 의해 연결된 면역글로불린 도메인의 두 개의 베타-나선으로 이루어지는 미니 도메인과 같은 면역글로불린의 조합일 수 있다. 바람직하게는, 항체 유도체는 단일 사슬 항체이고, 더욱 바람직하게는 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질인 scFv는 짧은 링커 펩티드와 연결된다. VH의 N-말단은 VL의 C-말단과 연결되거나, 또는 VL의 N-말단은 VH의 C-말단과 연결된다.
본원에서 언급된 용어 "항체 모방체(antibody mimetic)"는 항체와 마찬가지로 항원과 특이적으로 결합할 수 있지만, 항체와 구조적으로 관련이 없는 유기 화합물을 말한다. 이는 주로 약 3 내지 20 kDa의 몰 질량(molar mass)을 갖는 인공 펩티드 또는 단백질이다. 이는 치료 또는 진단적 효과를 가질 수 있다. 항체 모방체의 비제한적인 예는 애피바디(affibody), 애필린(affilin), 애피머(affimer), 애피틴(affitin), 안티칼린(anticalin), 아비머(avimer), DARPins, 피노머(fynomer), 쿠니츠 도메인 펩티드(Kunitz domain peptide), 모노바디(monobody), 단백질 A의 Z 도메인, 감마 B 결정질(Gamma B crystalline), 유비퀴틴(ubiquitin), 시스타틴(cystatin), 술폴로부스 아시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)로부터의 Sac7D, 리포칼린(ipocalin), 막 수용체의 도메인, 안키린 반복 모티브(ankyrin repeat motive), Fyn의 SH3 도메인, 프로테아제 억제제의 쿠니츠 도메인, 피브로넥틴의 10th 타입 III 도메인, 합성 이형 2가 또는 이형 다가 리간드(synthetic heterobivalent or heteromultivalent ligands)(Josan et al., 2011, Xu et al., 2012, Shallal et al., 2014)이다.
본원에서 언급된 용어 "이종 폴리펩티드 리간드" 또는 "리간드"는 2개, 3개 또는 4개의 리간드와 같은 하나 이상의 리간드(들)를 포함한다. 이는 재조합 헤르페스 바이러스가 하나의 리간드를 포함할 수 있거나, 하나 이상의 리간드를 포함할 수 있음을 의미한다. 하나의 리간드의 존재는 하나의 표적 세포 유형의 타겟팅을 가능하게 한다. 하나 이상의 리간드가 존재하는 경우, 리간드는 즉, 연속하여(successively) 상이한 부위 또는 동일한 부위 상의 gB 분자에 위치하는 하나의 gB에 융합되거나 또는 삽입될 수 있거나, 또는 리간드는 상이한 gB에 융합되거나 또는 삽입될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 리간드가 존재하는 경우, 제2의 또는 추가의 리간드(들)는 gD 및/또는 gH와 같은 gB 이외의 헤르페스 바이러스의 당단백질로 구성될 수 있다. 상이한 리간드는 동일한 표적 세포 또는 상이한 표적 세포, 바람직하게는 상이한 표적 세포 상에 존재하는 상이한 표적 분자를 표적으로 할 수 있다. 상기와 유사하게, 본원에서 언급된 용어 "표적 분자"는 2개, 3개 또는 4개의 표적 분자와 같은 하나 이상의 표적 분자(들)를 포함한다. 결과적으로, 재조합 헤르페스 바이러스는 하나의 표적 세포에 결합할 수 있거나, 또는 2개, 3개 또는 4개의 상이한 세포와 같은 하나 이상의 표적 세포에 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 이종 폴리펩티드 리간드는 인공 폴리펩티드이고, 바람직하게는 질병 세포, 바람직하게는 종양 세포, 더욱 바람직하게는 유방암 세포, 난소암 세포, 위암 세포, 폐암 세포, 두경부암 세포, 골육종 세포, 다형성 신경교모종 세포 또는 침샘 종양 세포와 같은 HER2를 발현하는 종양 세포 상의 천연 수용체에 결합할 수 있는 scFv이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 이종 폴리펩티드 리간드는 HER2에 결합할 수 있는 scFv이다. 가장 바람직한 구현예에서, 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 2로 표시되는 scFv이다.
본 발명의 부가적으로 또는 대안적으로 바람직한 구현예에서, 이종 폴리펩티드 리간드는 인공 폴리펩티드, 바람직하게는 천연 폴리펩티드의 일부이고, 이는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 인공 표적 분자에 결합할 수 있다. 리간드의 길이는 더욱 바람직하게는 약 50개 미만의 아미노산 잔기, 여전히 더욱 바람직하게는 약 40개 미만의 아미노산 잔기, 여전히 더욱 바람직하게는 약 10개와 약 30개 사이의 아미노산, 또는 가장 바람직하게는 20개의 아미노산이다. 리간드와 표적 분자는 서로 결합하도록 특이적으로 제작된다. 더욱 바람직하게는, 이종 폴리펩티드 리간드는 GCN4 효모 전사 인자의 일부이다. 여전히 더욱 바람직하게는, 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 37로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부이고, 가장 바람직하게는 리간드는 서열번호 37의 서열로 표시되는 분자이다. 대안적 구현예에서, 리간드는 서열번호 38의 서열로 표시되는 분자일 수 있다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 언급된 바와 같이 바람직하고 대안적으로 바람직한 구현예가 조합된다. 즉, 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 두 개의 이종 폴리펩티드 리간드를 동시에 포함하며, 하나는 질병 세포에 결합할 수 있고, 다른 하나는 세포 배양물에 존재하는 세포에 결합할 수 있다.
gB에 융합되거나 또는 삽입되는 폴리펩티드 리간드로서 사용되는 GCN4 효모 전사 인자는 최신 기술(state of the art)(예를 들어, Arndt and Fin, 1986; Hope and Struhl, 1987를 참조)이다. 예시적인 GCN4 효모 전사 인자는 AJ585687.1(서열번호 42)에 의해 암호화되는, 서열번호 43으로 표시되는 GCN4 효모 전사 인자(UniProtKB - P03069 (GCN_YEAST))이다. 본원에서 언급된 용어 "GCN4 효모 전사 인자(GCN4 yeast transcription factor)"는 자연에 존재하는 임의의 GCN4 효모 전사 인자를 말한다. 대안적으로, 본원에서 언급된 GCN4 효모 전사 인자는 서열번호 43의 서열에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 동일성을 갖는 임의의 GCN4 효모 전사 인자이다. 대안적으로, 본원에서 언급된 GCN4 효모 전사 인자는 서열번호 43에 대하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 상동성을 갖는 GCN4 효모 전사 인자이다. GCN4 효모 전사 인자가 서열번호 43에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 경우, 서열번호 43에 대하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 상동성을 갖는 경우, 또는 서열번호 43에 따른 GCN4 효모 전사 인자와 같은 동일한 활성을 갖는 경우, "상동"이거나 "상동체"이다. 바람직하게는, "동일한 활성"은 GCN4 효모 전사 인자가 서열번호 34에 따른 GCN4 효모 전사 인자와 같은 동일한 방식으로 전사 인자로서 작용한다는 의미로 이해될 수 있다. "이의 일부"라는 용어는 표적 분자가 생성될 수 있는 GCN4 효모 전사 인자의 "일부"가 결합할 수 있는 임의의 부분을 포함한다. 바람직하게는, "이의 일부"의 길이는 따라서 274개 이하의 아미노산, 바람직하게는 200개 미만의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 50개 미만의 아미노산 잔기, 여전히 더욱 바람직하게는 40개 미만의 아미노산 잔기, 여전히 더욱 바람직하게는 10개와 30개 사이의 아미노산, 또는 여전히 더욱 바람직하게는 20개의 아미노산의 리간드 길이이고, 이에 의해 리간드는 링커 서열과 같은 추가 서열을 포함할 수 있다. 가장 바람직한 "이의 일부"는 두 개의 인접 wt(야생형) GCN4 잔기가 각 측면에 첨가될 수 있는 GCN4 효모 전사 인자의 서열 YHLENEVARLKK (서열번호 38)이다. gB에의 융합 또는 삽입을 위해, GS 링커가 펩티드의 각 측면에 추가적으로 존재할 수 있다. 이 구조물(construt)은 본원에서 GCN4 펩티드(서열번호 37)로 명명된다. 이 20개의 아미노산 펩티드는 헤르페스 바이러스에 "이의 일부"가 결합하는 표적 분자를 포함하는 세포주를 감염시키고 그 내부에서 복제되는 능력을 부여한다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스에서, 리간드는 성숙 gB(서열번호 2)의 아미노산 13 및 14에 상응하는 gB의 아미노산 43과 44 사이에서 gB에 융합되거나 또는 삽입될 수 있다. 이와 관련하여, 본원에서 언급된 용어 "융합된(fused)" 또는 "융합(fusion)"은 펩티드 링커를 통해 직접 또는 간접적으로 펩티드 결합에 의해 gB의 N-말단 아미노산으로의 폴리펩티드 리간드의 첨가를 말한다. "융합된" 또는 "융합"이 gB의 말단에 대한 추가를 의미하는 반면 "삽입(insertion)"은 gB 내로의 통합(incorporation)을 의미하는 한, N-말단 영역에 "융합된" 또는 이에 대한 "융합"은 "삽입"과는 다르다.
본원에서 언급된 펩티드 링커는 폴리펩티드 내에서, 다른 공급원으로부터 유래된 폴리펩티드 서열을 연결하는 역할을 한다. 이러한 링커는 당단백질 B 서열과 이종 폴리펩티드 리간드를 연결하여 적절한 폴딩(folding)을 가능하게 하거나, 이종 폴리펩티드 리간드 내의 리간드 부분을 연결하는 역할을 한다. 이는 또한 리간드 서열을 gB 이외의 당단백질 서열과 연결하는 역할을 한다. 링커는 전형적으로 1 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 25개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 8개, 12개 또는 20개의 아미노산과 같은 8 내지 20개의 아미노산 사이의 길이를 가지며, 임의의 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이는 아미노산(들) Gly 및/또는 Ser 및/또는 Thr을 포함하고, 바람직하게는 이는 Gly, Ser 및/또는 Thr로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 아미노산을 포함한다. 가장 바람직하게는, 이는 아미노산 Gly 및/또는 Ser로 이루어진다. Gly 및/또는 Ser에 기초한 링커는 유연성(flexibility), 우수한 용해성 및 단백질 분해(proteolysis)에 대한 저항성을 제공한다. 대안적으로, 링커는 글리신, 세린 및/또는 트레오닌을 가장 많이(predominantly) 포함하지 않을 수 있지만, 글리신, 세린 및/또는 트레오닌이 존재하지 않거나 또는 단지 작은 정도로만 존재할 수는 없다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스에서, 리간드는 gB의 무질서 영역 내의 임의의 아미노산에 대안적으로 삽입될 수 있고, 이에 의해 리간드는 서열번호 1에 따른 gB의 아미노산 77 내지 88에 걸친 영역 또는 상동 gB의 상응하는 영역 내의 임의의 아미노산에 삽입되지 않는다. 그러나 120개의 아미노산을 초과하지 않는 짧은 길이의 리간드는 서열번호 1에 따른 gB의 아미노산 77 내지 88에 걸친 영역 또는 상동 gB의 상응하는 영역 내로 삽입될 수 있다. 본원에서 언급된 바와 같이, 무질서 영역은 고정된 3차 구조(fixed tertiary structure)가 결핍되고, 비구조적(unstructured)이며, 결과적으로 결정 구조에서 분해(resolved)될 수 없는 영역을 포함하는 것을 의미한다. 종종, 무질서 영역은 즉, 랜덤 코일과 같이, 또는 붕괴된(collapsed), 즉 용융된 소구체(molten globule)와 같이 확장된다. gB에서의 무질서 구조는 문헌[Gallagher et al., 2014, Heldwein et al., 2006, 및 Lin et al., 2007]에 언급되어 있으며, HSV gB의 N-말단 영역(아미노산 31 내지 108까지임), 중앙 영역(아미노산 460 내지 491까지임) 및 C-말단 영역(아미노산 796 내지 904까지임)(Heldwein et al., 2006)에 존재할 수 있다. 무질서한 것으로 언급되는 위치는 HSV-1 gB의 아미노산 31 내지 108(N-말단 영역)(Lin et al., 2007), 아미노산 460 내지 491(중앙 영역)(Heldwein et al., 2006) 및 아미노산 796 내지 904(C-말단 영역)(Heldwein et al., 2006, Lin et al. 2007)이다. 바람직하게는, 리간드는 서열번호 1에 따른 gB의 아미노산 31 내지 108 또는 460 내지 491에 걸친 영역 또는 상동 gB의 상응하는 영역 내의 임의의 아미노산에 삽입된다. 리간드는 서열번호 1에 따른 gB의 아미노산 77 내지 88에 걸친 영역 또는 상동 gB의 상응하는 영역 내에 삽입되지 않는다. 그러나 120개의 아미노산을 초과하지 않는 짧은 길이의 리간드는 서열번호 1에 따른 gB의 아미노산 77 내지 88에 걸친 영역 또는 상동 gB의 상응하는 영역 내에 삽입될 수 있다.
리간드는 대안적으로 서열번호 1에 따른 gB의 아미노산 31 내지 77 또는 88 내지 184, 바람직하게는 아미노산 31 내지 77 또는 88 내지 136 또는 더욱 바람직하게는 31 내지 77 또는 88 내지 108에 걸친 영역 내의 임의의 아미노산에, 또는 아미노산 409 내지 545, 바람직하게는 아미노산 459 내지 545, 더욱 바람직하게는 아미노산 459 내지 497 또는 여전히 더욱 바람직하게는 아미노산 460 내지 491에 걸친 영역 내로, 또는 상동 gB의 상응하는 영역 내의 임의의 아미노산에 삽입될 수 있다. 또한, 120개의 아미노산을 초과하지 않는 짧은 길이의 리간드는 서열번호 1에 따른 gB의 아미노산 77 내지 88에 걸친 영역 또는 상동 gB의 상응하는 영역 내에 삽입될 수 있다. 이들 영역은 gB의 무질서 영역 내에 위치하는 아미노산을 포함하지만, 무질서 영역의 근처에 위치하는 아미노산 또한 포함한다. 상기 나타낸 바와 같은 영역은 폴리펩티드 삽입을 허용하는 것으로 밝혀졌으며, 그렇게 함으로써 gB와 수용체를 가지는 세포의 막 융합을 매개하는 융합 유도물질로서 기능하는 gB의 능력을 유지한다(Gallagher et al., 2014; Lin and Spear, 2007; Potel et al., 2002).
리간드가 gB 내로 삽입된다는 의미로 본원에서 언급된 용어 "삽입된" 또는 "삽입"은 gB 내로의 폴리펩티드 리간드의 통합을 말하며, 여기에서 통합된 폴리펩티드는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해, 더욱 상세하게는 삽입물(insert)에 대하여 상류(upstream) 및/또는 하류(downstream)에 위치된 펩티드 링커를 통해, 직접 또는 간접적으로 펩티드 결합에 의해 gB의 두 개의 아미노산 사이에 도입된다. 링커는 폴리펩티드 리간드에 직접적으로 연결된다. gB에 대한 폴리펩티드 리간드의 융합 또한 gB의 아미노산 1 바로 앞에 서열번호 1 또는 상동 gB로 예시되는 gB 전구체 내로의 폴리펩티드 리간드 서열의 삽입으로 볼 수 있으며; 이러한 삽입은 본원에서 융합으로 지칭된다. 융합되거나 또는 삽입된 폴리펩티드를 가지는 gB는 본원에서 키메라 gB로 지칭된다. 키메라 gB는 비리온 외피의 일부이다. "링커"의 정의는 상기 기술된 바와 같다.
삽입 및 융합은 바람직하게는 HSV의 게놈에서, gB 유전자의 유전자 조작에 의해 수행된다. HSV 게놈의 유전자 조작은 당업계에 공지되어 있으며, BAC 테크놀로지로 예시되나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 HER2에 대한 scFv가 아미노산 81과 82 사이에 삽입된 서열번호 3으로 예시된 gB의 아미노산 77 내지 88의 영역 내의 아미노산에의 이종 폴리펩티드 리간드의 삽입이 재조합 헤르페스 바이러스의 리간드의 수용체를 가지는 세포로의 리타겟팅을 유도하지 않음을 발견하였다. 본 발명자들은 이러한 리타겟팅이 결여된 이유가 이 영역 내의 프롤린이 풍부한 영역(PPPPXP) 및 예상(predicted) N-글리코실화 부위(N-glycosylation site, NAT)의 존재 때문이라고 생각한다. 프롤린은 단백질의 2차 구조를 파괴하고/하거나 다른 형태의 2차 구조를 우선시하는(override) 제한된(confined) 파이 각(phi angle)을 가진 이러한 형태의 2차 구조를 도입하며, 폴리프롤린 나선은 로컬 기하학적 구조에서 급격한 회전(turn)을 유도할 수 있기 때문에, 이러한 영역에서 폴리프롤린 신장부(stretch)는 리간드에 의해 채택된 구조를 제한할 수 있다. 또한, 이 영역에서 N-글리코실화 부위는 리간드를 차폐시킬(shielded) 수 있다. 결과적으로, 리간드는 세포 표면상의 그것의 수용체와 상호작용을 하기에 충분하지 않을 수 있다. 또한, 본 발명자들은 또한 gB의 아미노산 77 내지 88에 걸친 영역 내의 임의의 아미노산에의 이종 폴리펩티드 리간드의 삽입이, 이종 폴리펩티드 리간드가 짧은 길이인 경우, 재조합 헤르페스 바이러스의 리간드의 수용체를 가지는 세포로의 리타겟팅을 유도한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 표적 분자에 결합할 수 있으며 헤르페스 바이러스의 외피에 존재하는 당단백질 B(gB)에 삽입될 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드를 포함하는 재조합 헤르페스 바이러스를 제공하며, 여기에서 리간드는 짧은 길이의 리간드이며, 서열번호 1에 따른 gB의 아미노산 77 내지 88에 걸친 영역 내 또는 상동 gB의 상응하는 영역 내의 임의의 아미노산에 삽입된다. "짧은 길이"는 120개의 아미노산을 초과하지 않는 길이, 예컨대 5 내지 120개의 아미노산, 5 내지 110개, 5 내지 100개, 5 내지 90개, 5 내지 80개, 5 내지 70개, 5 내지 60개, 5 내지 50개, 5 내지 40개, 5 내지 30개, 5 내지 25개, 10 내지 30개, 10 내지 20개, 20개 또는 12개의 아미노산을 의미한다. 바람직하게는, 리간드는 10 내지 30개의 아미노산 길이를 가지고, 더욱 바람직하게는 리간드는 12 내지 20개의 아미노산 길이를 가지고, 여전히 더욱 바람직하게는 리간드는 12 내지 20개의 아미노산이다. 삽입은 아미노산 77 내지 88 사이의 임의의 아미노산에서, 예컨대 아미노산 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 또는 87 뒤에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 리간드는 아미노산 81 및 82 사이에 삽입된다. 상기 언급된 임의의 아미노산 뒤에 삽입된 상기 나타낸 바와 같은 길이의 리간드의 임의의 조합은 헤르페스 바이러스의 리간드의 표적 분자로의 리타겟팅을 유도한다. 바람직하게는, 이종 폴리펩티드 리간드는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 천연 폴리펩티드의 일부, 예컨대 서열번호 37로 구성된 GCN4 효모 전자 인자의 일부와 같은 GCN4 효모 전사 인자의 일부일 수 있다. 가장 바람직하게는, 리간드는 서열번호 37의 서열로 표시되는 분자이다. 이러한 리간드는 아미노산 77 내지 88에 걸친 영역 내의 임의의 아미노산에, 바람직하게는 아미노산 81 내지 82 사이에 삽입될 수 있다. 가장 바람직하게는, 리간드는 gB의 아미노산 81과 82 사이에 삽입된, 서열번호 37의 서열로 표시되는 분자이다. 아미노산의 수는 서열번호 1 또는 상동 gB의 상응하는 아미노산을 참조한다.
본원에서 사용된 표적 분자는 세포의 표면에 접근 가능하며, 이종 폴리펩티드 리간드에 의해 결합 될 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 표적 분자는 폴리펩티드 또는 단백질, 당지질 또는 배당체(glycoside)와 같은 천연 분자일 수 있다. 예를 들어, 표적 분자는 단백질 수용체와 같은 수용체일 수 있다. 수용체는 리간드의 결합을 통해 외부로부터 화학 신호를 받아서 어떤 형태의 세포 반응을 일으키는, 세포막에 묻혀있는 분자이다. 대안적으로, 표적 분자는 세포의 표면에 존재하는, 효소, 수송물질 또는 이온 채널과 같은 약물 표적인 분자일 수 있다. 바람직하게는, 표적 분자는 질병 세포 상에 또는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재한다. 바람직한 표적 분자는 예컨대, 하기 언급되는 바와 같은 특이적 또는 비정상적 방식으로 유기체의 질병 세포 상에 천연으로 존재하는 것들이다. "특이적 방식(specific manner)"은 표적 분자가 질병 세포 상에서는 과발현되지만, 그것은 미미한 정도, 즉 정상 세포 상에서 발현되는 각각의 정상 세포 상에 통상적으로 존재하는 정도가 아니라는 의미로 이해될 수 있다. "비정상적 방식(abnormal manner)"은 표적 분자가 각각의 비질병 세포의 각각의 분자와 비교하여, 돌연변이된 형태로 질병 세포 상에 존재한다는 의미로 이해될 수 있다. 따라서, 특이적으로 발현되거나 돌연변이된 표적 분자와 같은 표적 분자로 헤르페스 바이러스를 리타겟팅하는 것은 표적 분자를 가지지 않거나, 낮은 수준으로 표적 분자를 가지거나, 야생형(돌연변이되지 않은) 표적 분자를 가지는 세포와 비교하여, 표적 분자를 가지는 세포의 감염율 및 박멸율(eradication rate)이 높아진다.
대안적으로, 표적 분자는 인공 분자일 수 있다. 본원에서 언급된 용어 "인공 표적 분자"는 자연적으로 발생하지 않은, 즉 비천연 아미노산 서열을 가지는 분자이다. 이러한 인공 분자는 예를 들어, Douglas 등(Douglas et al., 1999); 및 Nakamura 등(Nakamura et al., 2005)에 기술되어 있는 것과 같이, 세포 표면상에 세포에 의해 발현되도록 제작될 수 있거나, 또는 세포 표면에 결합될 수 있다. 인공 표적 분자는 특정 리간드에 결합하는 기능을 하는 비-자연적으로 발생한 아미노산 서열을 갖는다. 인공 표적 분자의 예는 항체 유도체 또는 항체 모방체이다. 인공 표적 분자는 바람직하게는 재조합 헤르페스 바이러스를 생산하기 위해 사용될 수 있는 세포 배양물에 존재하는 세포의 표면상에 존재한다. 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 바람직한 인공 표적 분자는 scFv이다. 인공 표적 분자의 맥락에서, 항체는 자연적으로 생성되지 않는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재할 수 있는 "인공 표적 분자"라는 용어에 포함된다.
바람직한 구현예에서, 표적 분자는 종양-관련 수용체, 바람직하게는 HER2, EGFR, EGFRIII 또는 EGFR3 (ERBB3), EGFRvIII을 포함하는 EGF 수용체 패밀리의 구성원, MET, FAP, PSMA, CXCR4, CEA, CADC, 뮤신, 엽산 결합 단백질, GD2, VEGF 수용체 1 및 2, CD20, CD30, CD33, CD52, CD55, 인테그린 패밀리, IGF1R, 에프린 수용체 패밀리, 단백질-티로신 키나아제(TK) 패밀리, RANKL, TRAILR1, TRAILR2, IL13Ralpha, UPAR, 테나신, PD-1, PD-L1, CTL-A4, 및 면역 체크포인트 패밀리 수용체의 추가적 구성원, 종양 관련 당단백질 72, 강글리오사이드 GM2, A33, 루이스 Y 항체 또는 MUC1, 가장 바람직하게는 HER2이다. 바람직하게는, 표적 분자는 유방암 세포, 난소암 세포, 위암 세포, 폐암 세포, 두경부암 세포, 골육종 세포, 다형성 신경교모종 세포 또는 침샘 종양 세포와 같은 일부 종양 세포에 의해 과발현되지만, 비악성(non-malignant) 조직에서는 매우 낮은 수준으로 발현되는 HER2이다. 종양 관련 수용체는 특이적 또는 비정상적 방식으로 종양 세포에 의해 발현되는 수용체이다. 대안적으로, 표적 분자는 세포를 감염시키는 병원체(예를 들어, 바이러스, 세균 또는 기생충)와 같은 감염원(infectious agent)으로부터 유래되는 분자이다. 표적 분자는 감염된 세포(예컨대, HBV로부터의 HBsAg, HIV로부터의 gpl20, HCV로부터의 E1 또는 E2, EBV로부터의 LMP1 또는 LMP2)의 표면에서 발현된다. 병원체는 만성 감염성 질환과 같은 감염성 질환을 유발할 수 있다. 여전히 대안적으로, 표적 분자는 퇴행성 장애 관련 세포, 또는 CXCR2 또는 IL-1 수용체와 같은 노화세포에 의해 발현된다. 다른 바람직한 구현예에서, 표적 분자는 항체 유도체, 더욱 바람직하게는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전자 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 37로 구성된 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 39로 구성된 scFv, 가장 바람직하게는 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자이다.
본원에서 언급된 용어 "세포"는 표적 분자를 가지며, 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스에 의해 감염될 수 있는 임의의 세포이다. 세포는 질병 세포와 같은, 원치 않으며 제거되어야 하는 자연적으로 발생한 세포일 수 있다. 질병 세포의 예는 아래에 주어진다. 바람직한 질병 세포는 HER2를 포함하는 세포이다. 대안적으로, 세포는 재조합 헤르페스 바이러스를 생산하는 역할을 하는 세포일 수 있다. 이러한 세포는 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스에 의해 감염될 수 있고, 헤르페스 바이러스를 생산할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 또한, 인간에서 종양 세포와 같은 질병 세포의 DNA, RNA 및/또는 단백질과 같은 물질의 도입을 피하기 위하여, 질병 세포에서 헤르페스 바이러스의 증식은 피해야만 한다. 따라서, 헤르페스 바이러스를 생산하는 세포는 인간에 존재하는 경우 해를 끼치지 않는 세포, 예를 들어 비질병 세포이다. 재조합 헤르페스 바이러스를 생산하기 위해, 세포는 세포 배양물에 존재한다. 따라서, 재조합 헤르페스 바이러스를 생산하는 역할을 하는 세포는 본원에서 "세포 배양물에 존재하는 세포"로 명명한다. 따라서, 세포는 헤르페스 바이러스의 성장에 적합한 배양된 세포일 수 있고, 바람직하게는 세포는 헤르페스 바이러스 성장을 위해 승인된 세포주이다. 이러한 세포의 예는 Vero, 293, 293T, HEp-2, HeLa, BHK 또는 RS 세포이고, 바람직하게는 Vero 세포이다. 바람직하게는, 세포 배양물에 존재하는 세포는 상응하는 모(parent) 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않는 표적 분자를 발현하도록 변형되거나, 또는 세포 배양물에 존재하는 세포는 변형되어 그것의 표면상의 표적 분자와 결합한다. 더욱 바람직하게는, 세포는 항체 유도체, 여전히 더욱 바람직하게는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 37로 구성된 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 39로 구성된 scFv, 가장 바람직하게는 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자를 표적 분자로서 포함한다.
"배양된" 세포는 당업계에 공지된 바와 같이, 유지되고 증식되는 시험관 내(in vitro) 세포 배양물에 존재하는 세포이다. 배양된 세포는 일반적으로 자연 환경을 벗어난, 제어된 조건하에서 성장된다. 일반적으로, 배양된 세포는 다세포 진핵생물, 특히 동물 세포에서 유래된다. "헤르페스 바이러스의 성장을 위해 승인된 세포주"는 헤르페스 바이러스에 의해 감염될 수 있는 세포주, 즉 바이러스가 세포에 들어가 바이러스를 증식시키고 생산할 수 있는 것으로 이미 밝혀진 임의의 세포주를 포함하는 것을 의미한다. 세포주는 단일 세포에서 유래된 세포의 집단이며, 동일한 유전적 구성을 포함한다. 재조합 헤르페스 바이러스의 증식 및 생산을 위한 바람직한 세포는 Vero, 293, 293T, HEp-2, HeLa, BHK 또는 RS 세포이다.
본원에서 사용된 용어 "질병 세포"는 유기체에 부정적인 영향을 미치기 때문에 원하지 않는 세포를 말한다. 이러한 세포의 박멸은 그것의 사멸이 생명을 살리거나 유기체의 건강을 증진시키기 때문에 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 질병 세포는 비정상적인 성장을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 세포는 종양 세포이다. 대안적인 바람직한 구현예에서, 세포는 만성 감염 세포, 퇴행성 장애관련 세포 또는 노화 세포와 같은 감염된 세포이다.
종양 세포의 경우, 기저(underlying) 질병은 종양이며, 바람직하게는 부신암(adrenal cancer), 항문암(anal cancer), 담도암(bile duct cancer), 방광암(bladder cancer), 골암(bone cancer), 뇌/CNS 종양(brain/CNS tumor), 유방암, 원발부위 불명암(cancer of unknown primary treatment), 캐슬맨병(Castleman disease), 자궁경부암(cervical cancer), 결장/직장암(colon/rectum cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 식도암(esophagus cancer), 유잉 육종계열 종양(ewing family of tumors), 안암(eye cancer), 담낭암(gallbladder cancer), 위장관 카르시노이드 종양(gastrointestinal carcinoid tumor), 위장관 기질 종양(gastrointestinal stromal tumor, gist), 임신성 융모 질환(gestational trophoblastic disease), 호지킨병(Hodgkin disease), 카포시 육종(Kaposi sarcoma), 신장암(kidney cancer), 후두 및 하인두암(laryngeal and hypopharyngeal cancer), 백혈병(leukemia), 간암(liver cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 피부의 림프종, 악성 중피종(malignant mesothelioma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 비강 및 부비동암(nasal cavity and paranasal sinus cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 신경모세포종(neuroblastoma), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 구강 및 구인두암(oral cavity and oropharyngeal cancer), 골육종, 난소암, 췌장암(pancreatic cancer), 음경암(penile cancer), 뇌하수체 종양(pituitary tumor), 전립선암(prostate cancer), 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 침샘암, 육종 - 성인 연조직암(adult soft tissue cancer), 피부암(skin cancer), 소장암(small intestine cancer), 위암(stomach cancer), 고환암(testicular cancer), 흉선암(thymus cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 자궁육종(uterine sarcoma), 질암(vaginal cancer), 외음부암(vulvar cancer), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldnstrom macroglobulinemia) 및 윌름스 종양(Wilms tumor)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 종양 질병은 HER2-양성 암(유방암, 난소암, 위암, 폐암, 두경부암, 골육종 및 다형성 신경교모종 등), EGFR-음성 암(두경부암, 다형성 신경교모종, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 유방암, 결장직장암 및 췌장암 등), EGFR-vIII-양성 암(다형성 신경교모종 등), PSMA-양성 암(전립선암 등), CD20+ 양성 림프종, 및 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 전형적 호지킨 림프종 및 면역력이 약화된(immunocompromised) 개체에서 발생하는 림프종(이식 후 및 HIV-관련 림프세포증식성 질환)과 같은 B-세포 림프세포증식성 질환(B-cell lymphoproliferative disorders), T-세포 림프세포증식성 질환, 혈관면역모세포 T-세포 림프종(angioimmunoblastic T-cell lymphoma), 결절외 비강형 자연 살해/T-세포 림프종(extranodal nasal type natural killer/T-cell lymphoma)이다.
감염된 세포의 경우, 기저 질병은 만성 감염 질병과 같은 감염 질병이며, 여기에서 감염원은 바이러스, 세균 또는 기생충일 수 있다. 예로는 폐결핵, 말라리아, 만성 바이러스성 간염(HBV, 간염 D 바이러스 및 HCV), 후천성 면역 결핍 증후군(acquired immune deficiency syndrome, AIDS; 인간 면역결핍 바이러스인 HIV에 의해 유발됨), EBV 관련 질환 또는 HCMV 관련 질환이 있다.
퇴행성 장애 관련 세포의 경우, 기저 질병은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 루게릭병(Lou Gehrig's Disease), 골관절염(osteoarthritis), 죽상 동맥경화증(atherosclerosis), 샤리코 마리 투스병(Charcot Marie Tooth disease, CMT), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 만성 외상성 뇌병증(chronic traumatic encephalopathy), 당뇨병(diabete), 엘러스-단로스 증후군(ehlers-danlos syndrome), 수전증(essential tremor), 프리히드리히 실조증(Friedreich's ataxia), 헌팅턴병(huntington's disease), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD), 원추각막(keratoconus), 구상각막(keratoglobus), 황반변성(macular degeneration), 마르팡 증후군(marfan's syndrome), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 근위축증(muscular dystrophy), 니만 픽병(Niemann Pick disease), 골다공증(osteoporosis), 파킨슨병(Parkinson's Disease), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy), 전립선염(prostatitis), 망막색소 변성증(retinitis pigmentosa), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 또는 테이-삭스병(Tay-Sachs disease)일 수 있다. "퇴행성 장애 관련 세포"라는 용어는 장애와 관련이 있는 세포를 말하며, 세포의 변화(alteration)가 질병의 발병에 기여하거나 또는 세포가 질병의 결과로 변경된다는 것을 의미한다. 세포를 파괴하면 질병이 치료된다.
노화 세포의 경우, 기저 질병은 (i) 조기 노화(pre-mature aging)를 특징으로 하는 조로증(progeroid syndromes)이라고 불리는 희귀 유전 질환: 워너 증후군(Werner syndrome, WS), 블룸 증후군(Bloom syndrome, BS), 로트문드-톰슨 증후군(Rothmund-Thomson syndrome, RTS), 코케인 증후군(Cockayne syndrome, CS), 색소성 건피증(xeroderma pigmentosum, XP), 털유황이상증(trichothiodystrophy) 또는 허친슨-길포드 조로증 증후군(Hutchinson-Gilford Progeria syndrome, HGPS), 또는 (ii) 비만(obesity), 2형 당뇨병(type 2 diabetes), 근손실증(sarcopenia), 골관절염, 특발성 폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis), 만성 폐쇄성 폐질환, 백내장(cataract), 신경퇴행성 질병(neurodegenerative diseases), 전신성 자가면역 질병(systemic autoimmune diseases)(전신홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 류마티스 관절염 또는 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome)) 또는 다발성 경화증(multiple sclerosis)과 같은 통상적인 나이 관련 질환과 같은 노화 관련 질환이다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 키메라 gB 외에, WO 2009/144755에 개시된 것과 같은 변형된 gD 당단백질을 포함할 수 있으나, 이런 형태의 변형에 한정되지 않는다. 변형된 gD는 성숙 gD(서열번호 5로 예시됨; 예시적 gD 야생형 전구체 서열은 서열번호 4에 나타나 있음)의 아미노산 위치 6 내지 38의 결실을 가질 수 있다. 대안적으로, 변형된 gD는 천연 수용체인 Nectin-1 및 HVEM으로부터 헤르페스 바이러스의 친화성을 디타겟팅하는 다른 변형을 가질 수 있다. gD는 헤르페스 바이러스의 친화성을 디타겟팅하는 변형 대신에 또는 그 외에, 재조합 R-LM113(서열번호 6)에 기재된 바와 같은 HER2 수용체와 같은 질병 세포 상의 수용체인, 헤르페스 바이러스의 친화성을 선택된 수용체로 다시 지시하는(readdressed) 부가적 서열을 암호화할 수 있다. gD의 변형은 본원에서 정의된 바와 같은 이종 폴리펩티드 리간드를 gD에 융합시키거나 또는 삽입시킴으로써 발생한다. 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 키메라 gB 외에 본원에 정의된 바와 같은 이종 폴리펩티드 리간드를 포함하는, gH를 표적 수용체 분자로 리타겟팅할 수 있는 변형된 gH 당단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 키메라 gB 외에 Gatta 등(Gatta et al., 2015)에 개시된 바와 같은 변형된 gD 및 변형된 gH 당단백질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 두 문헌 모두 본원에 참조로 인용된다. gD 및/또는 gH의 변형(들)은 본원에 정의된 바와 같은 질병 세포에 대한 헤르페스 바이러스의 친화성을 다시 지시하는 역할을 한다.
따라서, 본 발명의 구현예에서, 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 질병 세포, 예를 들어 HER2를 발현하는 세포 또는 세포 배양물에 존재하는 세포와 같은 세포 상에 접근 가능한 표적 분자에 결합하는 리간드를 포함하는 키메라 gB 및 변형된 gD를 포함하며, 여기에서 변형은 아미노산 6 내지 38의 결실일 수 있다. gD는 대안적으로 또는 부가적으로 헤르페스 바이러스를 질병 세포로 리타겟팅할 수 있는, 본원에 정의된 바와 같은 이종 폴리펩티드 리간드의 삽입에 의해 변형될 수 있다.
또한, 본 발명자들은 서열번호 62에 따른 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 영역에 대하여 gD로부터 아미노산 30 내지 38 또는 이들의 서브셋의 결실이 재조합 헤르페스 바이러스의 비변형된 gD의 천연 수용체로부터의 디타겟팅을 유도한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 구현예에서, 재조합 헤르페스 바이러스는 본원에 정의된 바와 같이 gB에 융합되거나 또는 삽입된 이종 폴리펩티드 리간드를 포함하고, 서열번호 62에 따른 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 영역에 대하여 아미노산 30 내지 38 또는 이의 서브셋에서, 바람직하게는 서열번호 62에 다른 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 영역에 대하여 아미노산 30 및/또는 38, 더욱 바람직하게는 아미노산 30 및 38이 결실된 곳에서, 리간드의 표적 분자와 gD로 리타겟팅된다.
결실된 아미노산 30 내지 38 또는 이의 서브셋 대신 본원에 정의된 바와 같은 이종 폴리펩티드 리간드가 삽입될 수 있고, 그 결과 재조합 헤르페스 바이러스가 비변형 gD의 천연 수용체로부터 디타겟팅되고, 리간드의 표적 분자로 리타겟팅된다. 이종 폴리펩티드 리간드에 의한 서브셋의 치환에 추가하여, 아미노산 30 내지 38 내의 추가 아미노산 또는 아미노산의 범위가 결실될 수 있다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 아미노산 30 및 38이 결실되고, 이종 폴리펩티드 리간드는 아미노산 30 또는 38 대신 삽입된다. 더욱 바람직하게는, 아미노산 30 및 38이 결실되고, 이종 폴리펩티드 리간드는 아미노산 38 대신 삽입된다.
"이의 서브셋"이라는 용어는 아미노산 30 내지 38로 이루어지는 영역으로부터 하나의 아미노산 또는 적어도 2개, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 인접한 아미노산을 의미한다. 따라서, "이의 서브셋"은 아미노산 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 또는 38, 30 내지 31, 30 내지 32, 30 내지 33, 30 내지 34, 30 내지 35, 30 내지 36, 30 내지 37, 30 내지 38, 31 내지 32, 31 내지 33, 31 내지 34, 31 내지 35, 31 내지 36, 31 내지 37, 31 내지 38, 32 내지 33, 32 내지 34, 32 내지 35, 32 내지 36, 32 내지 37, 32 내지 38, 33 내지 34, 33 내지 35, 33 내지 36, 33 내지 37, 33 내지 38, 34 내지 35, 34 내지 36, 34 내지 37, 34 내지 38, 35 내지 36, 35 내지 37, 35 내지 38, 36 내지 37, 36 내지 38, 37 내지 38을 의미할 수 있다. "서브셋"이라는 용어는 하나 이상의 서브셋, 예컨대 2개, 3개, 4개 또는 5개의 서브셋을 포함할 수 있다. 예를 들어, "서브셋"은 아미노산 30 및 아미노산 38을 포함할 수 있고, 이들의 결실은 아미노산 30 및 38을 포함하지 않는 gD를 생성한다. 서브셋, 또는 아미노산 30 내지 38의 전체의 결실은 gD의 nectin-1 결합 부위를 불활성화시켜 nectin-1에 대한 gD의 결합 능력을 감소시키고/시키거나 gD의 HVEM 결합 부위를 불활성화시켜 HVEM에 대한 gD의 결합 능력을 감소시킨다. 예를 들어, 아미노산 30이 결실되는 경우, gD의 HVEM 결합 부위는 불활성화되는 반면, 아미노산 38의 결실은 nectin-1 결합 부위의 불활성화를 초래한다. 아미노산 30 및 38 양쪽 모두의 결실은 HVEM 결합 부위 및 nectin-1 결합 부위의 불활성화를 초래한다.
아미노산 30 내지 38 또는 이의 서브셋 대신에 삽입된 이종 폴리펩티드 리간드는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드, 바람직하게는 유방암 세포, 난소암 세포, 위암 세포, 폐암 세포, 두경부암 세포, 골육종 세포, 다형성 신경교모종 세포 또는 침샘 종양 세포와 같은 암세포 상에 존재하는 표적 분자, 예컨대 HER2에 결합할 수 있는 scFv, 더욱 바람직하게는 서열번호 32로 표시되는 scFv일 수 있고, 여기에서 표적 분자는 HER2를 발현하는 종양 세포 상에 존재하는 HER2이다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드는 아미노산 43 내지 44 사이의 gB에 삽입되고, 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드는 아미노산 30이 추가로 결실된 gD의 아미노산 38 대신에 삽입된다. 가장 바람직하게는, 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 37로 표시되는 서열을 포함하고, 표적 분자는 서열번호 41로 표시되는 서열을 갖는 분자이며, 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 32로 표시되는 scFv를 포함하고, 표적 분자는 HER2이며, 세포는 HER2를 발현하는 종양세포, 바람직하게는 유방암 세포, 난소암 세포, 위암 세포, 폐암 세포, 두경부암 세포, 골육종 세포, 다형성 신경교모종 세포 또는 침샘 종양 세포이다.
또한, 서열번호 62에 따른 성숙 gD, 또는 상동 gD의 상응하는 영역 또는 상응하는 아미노산에 대한 아미노산 30 내지 38 또는 이의 서브셋, 바람직하게는 아미노산 30 및/또는 38, 더욱 바람직하게는 아미노산 30 및 38이 결실된 gD를 포함하는 재조합 헤르페스 바이러스가 개시된다. 결실된 아미노산 30 내지 38 또는 이의 서브셋 대신 본원에 정의된 바와 같은 이종 폴리펩티드 리간드가 삽입될 수 있으며, 이로 인하여 재조합 헤르페스 바이러스가 비변형 gD의 천연 수용체로부터 디타겟팅되고, 리간드의 표적 분자로 리타겟팅된다. 이종 폴리펩티드 리간드에 의해 결실된 아미노산 또는 결실된 아미노산의 범위의 치환에 더하여, 아미노산 30 내지 38 내의 추가의 아미노산 또는 아미노산의 범위가 결실될 수 있다. 따라서, 예를 들어 아미노산 30 및 38은 결실되고, 이종 폴리펩티드 리간드가 아미노산 30 또는 38 대신 삽입된다. 예를 들어, 아미노산 30 및 38이 결실되고, 이종 폴리펩티드 리간드가 아미노산 38 대신 삽입된다.
gD에 대한 아미노산의 수는 서열번호 62에 따른 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산을 나타낸다. 따라서, 서열번호 62에 따른 성숙 gD에 대한 아미노산 30은 서열번호 4(전구체 형태)에 따른 아미노산 63에 상응하는 서열번호 62에 따른 성숙 gD에 대하여 아미노산 55 및 아미노산 38에 상응한다. gB에 대한 아미노산의 수는 서열번호 1(전구체 형태)에 따른 gB 또는 상동 gB의 상응하는 아미노산을 나타낸다.
gD 상동체는 헤르페스 바이러스과의 알파 서브패밀리의 일부 구성원에서 발견되었다. 본원에서 언급된 용어 "상동 gD"는 헤르페스 바이러스과의 gD를 암호화하는 구성원에서 발견된 임의의 gD 상동체를 말한다. 대안적으로, 본원에서 언급된 상동 gD는 각각 서열번호 4 또는 62의 서열에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 동일성을 갖는 전구체 또는 성숙형의 임의의 gD를 말한다. 대안적으로, 본원에서 언급된 상동 gD는 각각 서열번호 4 또는 62에 대하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 상동성을 갖는 전구체 또는 성숙형의 임의의 gD를 말한다. 본원에서 언급된 상동 gD는 또한 gD의 단편을 포함한다. 바람직하게는, 헤르페스 바이러스과에서 발견된 임의의 gD, 각각 서열번호 4 또는 62의 서열에 대하여 상기 정의된 바와 같은 아미노산 동일성 또는 상동성을 가지는 전구체 또는 성숙형의 임의의 gD 및 gD의 임의의 단편을 포함하는 본원에서 언급된 상동 gD는 서열번호 4 또는 62에 따른 gD와 동일한 활성을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 세포 내로 바이러스가 들어가는 과정 동안, gD는 이의 수용체 중 하나에 결합함으로써 여전히 더욱 바람직하게는 gH/gL 이종 이량체와 상호작용하며, 이는 여전히 더욱 바람직하게는 gD의 풍부한(profusion) 도메인을 제거(dislodging)하게 된다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 또한 세포, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 자극하는 하나 이상의 분자(들)를 암호화할 수 있다. 숙주 면역 반응을 자극하는 분자는 또한 "면역치료 분자(immunotherapy molecule)"로도 불린다. 따라서, 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 조합된 종양 용해성 및 면역치료 바이러스일 수 있다. 면역치료 바이러스는 세포에 대한 숙주 면역 반응을 증가시키는, 즉 세포에 대하여 유도되도록 숙주 면역 반응을 자극하는 분자를 암호화하는 바이러스이다. 이러한 바이러스의 예는 T-VEC이다(Liu et al., 2003).
키메라 분자 gB 이외에, 면역치료 분자는 재조합 바이러스가 이종 폴리펩티드 리간드를 통한 세포의 특이적 타겟팅 및 사멸 외에, 특이적 또는 비특이적 방식으로 대상체의 면역계를 자극할 수 있게 한다. 대상체에서의 재조합 바이러스에 의한 면역치료 분자의 발현은 면역 반응을 유도할 수 있고, 결국 질병 세포를 죽인다. 면역치료요법은 특이적으로 작용할 수 있으며, 여기에서 면역치료 분자는 세포(들) 상에 존재하는 하나 또는 그 이상(one or some)의 특정 항원(들)에 대하여 대상체의 면역계를 자극한다. 예를 들어, 면역치료 분자는 특정 세포 표면 수용체, 예를 들어, CD20, CD274 및 CD279에 대한 항체일 수 있다. 일단 항원에 결합하면, 항체는 항체-의존성 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)을 유도하거나, 보체 시스템을 활성화시키거나, 수용체가 이의 리간드와 상호작용하는 것을 방지할 수 있다. 이 모든 것이 세포 사멸로 이어질 수 있다. 바람직한 세포는 종양 세포이다. 이러한 기술은 당업계에 공지되고 승인되어 있다. 알렘투주맙(Alemtuzumab), 이필리뮤맙(Ipilimumab), 니보루맙(Nivolumab), 오파투무맙(Ofatumumab) 및 리툭시맙(Rituximab)을 포함하는 암 치료에 승인된 여러 항체가 있다. 대안적으로, 면역치료 분자는 대상체의 면역계를 자극함으로써 비특이적으로 작용할 수 있다. 면역치료 분자의 예는 그 중에서도 특히 사이토카인, 케모카인 또는 면역 체크포인트 조절자이다. 예를 들어, 몇몇 사이토카인은 항종양 활성을 강화시키는 능력을 가지며, 수동적 암 치료제로서 사용될 수 있다. 면역치료 분자로서의 사이토카인의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 사이토카인의 예는 GM-CSF, 인터류킨-2, 인터류킨-12 또는 인터페론-α이다. GM-CSF는 예를 들어, 호르몬 불응성 전립선암(hormone-refractory prostate cancer) 또는 백혈병의 치료에 사용된다. 인터류킨-2는 예를 들어, 악성 흑색종 및 신세포암(renal cell carcinoma)의 치료에 사용된다. IL-12는 교모세포종의 실험적 치료에 사용된다. 인터페론-α는 예를 들어, 모발성세포 백혈병(hairy-cell leukemia), AIDS 관련 카포시육종, 소포성 림프종(follicular lymphoma), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia) 및 악성 흑색종의 치료에 사용된다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 예를 들어, 바이러스 유전자 y134.5, UL39 및/또는 ICP47과 같은 바이러스의 독성을 약화시키는 것으로 알려져 있는 유전자의 결실 또는 변형에 의해 약독화될 수 있다. "약독화된(attenuated)"이라는 용어는 약화되거나(weakened) 또는 독성이 덜한 헤르페스 바이러스를 말한다. 조건부 약독화가 바람직하며, 여기에서 약독화는 비질병 세포에만 영향을 미친다. 더욱 바람직하게는, 종양 세포와 같은 질병 세포만이 헤르페스 바이러스의 완전 독성(full virulence)에 의해 영향을 받는다. 조건부 약독화는 예를 들어, y134.5, UL39 및/또는 ICP47 유전자의 프로모터 영역을 질병 세포에서 독점적으로(exclusively) 발현되는 인간 유전자의 프로모터(예를 들어, 종양 세포에서의 서바이빈(survivin) 프로모터)로 대체함으로써 달성될 수 있다. 조건부 약독화에 대한 추가적 변형은 ICP-4 프로모터 영역과 같은 IE 유전자(초기 발현 유전자(immediate early genes))의 전사를 담당하는 조절 영역을 질병 세포에서 독점적으로 발현되는 유전자의 프로모터 영역(예를 들어, 서바이빈 프로모터)으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 변화는 질병 세포에서는 복제될 수 있지만 정상 세포에서는 복제될 수 없는 복제 조건부 HSV를 생성하게 할 것이다. 바이러스의 추가 변형에는 ICP4와 같은 필수 HSV 유전자의 3' 비번역 영역 내로 종양 세포가 아닌 정상 세포에 풍부하게 존재하는 마이크로 RNA(microRNA, miRs)에 반응하는 서열 요소의 삽입이 포함될 수 있다. 그 결과 정상 세포에서만 복제가 불가능한 바이러스가 다시 생길 것이다.
두 번째 양상에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스, 및 선택적으로 상기 정의된 바와 같은 세포, 바람직하게는 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 자극하는 하나 이상의 분자(들)를 추가로 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 약제로서 사용될 수 있다. 약제의 생산을 위해, 헤르페스 바이러스는 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스 및 원하는 특성을 제공하는 약학적으로 허용 가능한 담체와 같은 성분의 혼합물을 포함하는 약학적 투여 형태여야 한다. 약학적 조성물은 당업계에 공지된 하나 이상의 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 약학적 조성물은 세포에 대해 숙주 면역 반응을 자극하는 하나 이상의 분자(들)를 추가로 포함할 수 있다. 세포에 대해 숙주 면역 반응을 자극하는 하나 이상의 분자(들)의 정의는 본 발명의 첫 번째 양상에서 언급된다.
약학적 조성물은 전신, 비강, 비경구, 질, 국소, 질, 종양내 투여용으로 제조될 수 있다. 비경구 투여는 피하, 피내, 근육내, 정맥내 또는 복강내 투여를 포함한다.
약학적 조성물은 캡슐, 정제, 알약, 파우더 및 과립과 같은 경구 투여를 위한 고체 투약 형태, 약학적으로 허용 가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르제와 같은 경구 투여를 위한 액체 투약 형태, 예를 들어 멸균 주사용 수용액 또는 유성(oleaginous) 현탁액 등의 주사용 제제, 직장 또는 질 투여를 위한 조성물, 바람직하게는 좌약, 및 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 파우더, 용액, 스프레이, 흡입제 또는 패치와 같은 국소 또는 경피 투여를 위한 투약 형태를 포함하는 다양한 투약 형태로 제형화 될 수 있다.
임의의 특정 대상체에 대한 구체적인 치료학적으로 유효한 투여 수준은 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스의 활성, 투여 형태, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 치료 기간을 포함하는 다양한 인자 및 의학 분야에서 잘 알려진 것과 같은 인자에 의존할 것이다.
단일 또는 다중 용량으로 대상체에 투여되는 본 발명의 화합물의 총 투여량은 예를 들어, 103 내지 1010의 양일 수 있다. 단일 용량 조성물은 일일 용량을 구성하는 양 또는 그의 약수(submultiple)를 함유할 수 있다. 재조합 헤르페스 바이러스의 투여량은 플라크 형성 단위(plaque forming unit, pfu) 수로서 정의될 수 있다. 투여량의 예는 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 내지 1010을 포함한다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 질병 세포가 그 표면에 특정 표적 분자를 발현하여, 표적 분자가 정상 세포에 의해 생산되지 않거나 정상 세포에 의해 낮은 정도로 생산되는 세포의 외부로부터 접근 가능한 질환을 치료하는 역할을 한다. 정상 세포는 각각 정상 세포일 수 있다. "각각"은 질병 세포와 정상 세포는 같은 기원이지만, 질병을 유발하는 영향으로 인해 세포는 질병에 걸리게 되는 반면, 동일한 기원의 다른 세포는 건강을 유지한다.
세 번째 양상에서, 본 발명은 종양, 감염, 퇴행성 장애 또는 노화 관련 질병의 치료에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 세포, 바람직하게는 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 자극하는 하나 이상의 분자와 선택적으로 결합되는 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 제공한다. 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스 및 세포에 대해 숙주 면역 반응을 자극하는 분자는 동일한 약학적 조성물 또는 상이한 약학적 조성물 내에 존재할 수 있다. 이들이 상이한 약학적 조성물에 존재하는 경우, 이들은 분자 전에 헤르페스 바이러스 또는 헤르페스 전에 분자 중 어느 쪽이든 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 헤르페스 바이러스 또는 분자는 상이한 빈도 및/또는 시점에서 투여될 수 있다. 그러나 병용 치료는 헤르페스 바이러스 및 분자가 질병의 동시 치료를 가능하게 하는 시간 간격 및/또는 시점에서 투여되는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 약학적 유효량의 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 투여함으로써 종양, 감염, 퇴행성 장애 또는 노화 관련 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 개시한다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 세포, 바람직하게는 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 자극하고/하거나 대상체의 특정 질병을 치료하는 역할을 하는 추가의 치료요법과 조합하여 대상체에 투여될 수 있다. 이러한 추가의 치료는 다른 약물, 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 조합된 바이러스요법 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 종양, 감염, 퇴행성 장애 또는 노화관련 장애의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한, 상기 정의된 바와 같은 세포, 바람직하게는 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 자극하는 하나 이상의 분자(들)와 선택적으로 결합되는 본 발명의 헤르페스 바이러스의 용도를 개시한다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스에 의해 치료되는 대상체는 바람직하게는 인간이다.
네 번째 양상에서, 본 발명은 융합되거나 또는 삽입된 리간드를 갖는 본 발명의 키메라 gB를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자는 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스의 게놈 또는 이의 일부일 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자는 gB 당단백질의 신호 서열을 포함하는 키메라 gB의 전구체 형태를 암호화한다. 키메라 gB가 그것의 N-말단 아미노산에 리간드를 포함하도록 조작된 경우, 상응하는 핵산은 신호 서열의 마지막 아미노산과 성숙 단백질의 첫 번째 아미노산 사이에 삽입된 리간드의 핵산 서열을 갖는다.
다섯 번째 양상에서, 본 발명은 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 적합한 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 플라스미드, 코스미드, 인공 크로모좀(예를 들어, 세균, 효모 또는 인간), 박테리오파지, 바이러스 벡터(레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스), 특히 바큘로바이러스 벡터, 또는 나노 공학적(nano-engineered) 물질(예를 들어, 오모실(ormosil))을 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 특히 하나 이상의 핵산 염기의 결실, 삽입 및/또는 돌연변이에 의해 변형되어, 그 독성이 바람직하게는 바이러스 벡터의 경우 약독화되거나, 질병 세포에서는 조건적으로 복제되지만 질병에 걸리지 않은 세포에서는 복제되지 않는 벡터이다. 예를 들어, γ134.5 유전자, UL39 유전자, ICP47 유전자 중 하나 또는 두 개의 카피의 결실은 바이러스의 약독화를 초래한다. 약독화 또는 약독화된은 약화되거나 독성이 덜한 바이러스를 말한다.
또한, 비질병 세포에서 약독화된 표현형 및 질병 세포에서 비약독화된 표현형을 초래할, 질병 세포, 예를 들어 종양 세포에서 독점적으로 발현되는 인간 유전자의 프로모터(예를 들어, 종양 세포에서의 서바이빈 프로모터)로 γ134.5 유전자의 프로모터 영역을 치환하는 것이 포함된다. 추가의 변형은 ICP-4 프로모터 영역과 같은 IE 유전자의 전사를 담당하는 조절 영역을 질병 세포에서 독점적으로 발현되는 유전자의 프로모터(예를 들어, 서바이빈 프로모터)로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 변화는 질병 세포에서는 복제될 수 있지만 정상 세포에서는 복제될 수 없는 복제 조건부 헤르페스 바이러스를 생산할 것이다. 바이러스 자손의 증식을 위한 세포 배양 세포는 고수율의 바이러스 생산을 가능하게 하는 고수준의 특이적 프로모터 활성화 단백질을 제공할 것이다.
여섯 번째 양상에서, 본 발명은 리간드가 융합되거나 삽입된 키메라 gB를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일곱 번째 양상에서, 본 발명은 재조합 헤르페스 바이러스, 리간드가 융합되거나 삽입된 본 발명의 키메라 gB를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 분자, 핵산 분자를 포함하는 벡터, 또는 리간드가 융합되거나 삽입된 키메라 gB를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공한다. 바람직하게는, 세포는 세포 배양물의 세포이다. 적합한 세포 배양물 및 배양 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(Peterson and Goyal, 1988).
여덟 번째 양상에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 사용하여 세포를 감염시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 목적은 대상체에서 원치 않는 세포를 감염시키고, 세포를 용해시켜 결국 세포를 죽이는 재조합 헤르페스 바이러스의 공급이다. 감염시키는 방법은 또한 세포 배양물에 존재하는 세포에서 재조합 헤르페스 바이러스의 성장을 돕는다. "감염(infecting)"은 바이러스가 세포막과 바이러스 표면 막의 융합을 통해 세포로 들어가서 바이러스 게놈과 같은 바이러스 성분이 세포 내로 방출되는 것을 의미한다. 바이러스로 세포를 감염시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 감염시킬 세포와 함께 바이러스를 배양하는 것이다(Florence et al., 1992; Peterson and Goyal, 1988). "사멸(killing)"은 세포가 본 발명의 헤르페스 바이러스의 감염, 세포 내 바이러스 입자의 생산 및 최종적으로, 세포 용해에 의한 새로운 바이러스 입자의 방출로 인해 완전히 제거됨을 의미한다. 표면상에 리간드의 표적 분자를 가지고 있는, 예를 들어 세포 배양물에서의 세포는 재조합 헤르페스 바이러스의 용균 효능을 시험하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 대상체, 예를 들어 종양 세포로부터 얻어진 질병 세포일 수 있다. 이 세포는 감염되어 재조합 헤르페스 바이러스에 의해 사멸된다. 성공적인 세포의 사멸은 대상체에서 종양 세포와 같은 세포를 제거하는 치료적 성공을 평가하기 위하여, 재조합 헤르페스 바이러스의 세포 특이성을 나타낸다. 추가 구현예에서, 비질병 세포는 또한 동일한 대상체로부터, 또는 질병을 앓고 있지 않은 대조군 대상체, 즉 표면상에 리간드의 표적 분자를 가지고 있지 않은 또는 표적 분자를 낮은 정도로 가지고 있는 세포로부터 얻어질 수 있다. 이것에 의해, 비질병 세포가 재조합 헤르페스 바이러스에 의한 감염에 취약한지 및/또는 어느 정도로 감염되었는지 여부를 시험할 수 있다. 다른 구현예에서, 비질병 세포 및 질병 세포(예를 들어, 백혈병 세포와 같은 종양 세포)를 포함하는 세포 집단(예를 들어, 혈액과 같은 조직)에 포함되어 있는 질병 세포는 대상체로부터의 세포 집단의 분리(예를 들어, 백혈구성분 채집술(leukapheresis)) 후 사멸된다. 이는 특히 대상체 내로, 바람직하게는 세포 집단이 단리되는 동일한 대상체 내로의 세포 집단의 이식 후 동안, 질병 세포를 포함하지 않는 세포 집단, 예를 들어 백혈병 세포와 같은 질병 세포를 포함하지 않은 혈액을 얻을 수 있게 한다. 예를 들어 혈액과 백혈병의 경우, 이 방법은 종양 세포를 포함하지 않은 혈액의 재주입(re-infusion)을 돕는다. 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 사용하여 세포를 사멸시키는 방법은 시험관 내(in-vitro) 또는 생체 내(in- vivo) 방법일 수 있다.
아홉 번째 양상에서, 본 발명은 청구항 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 헤르페스 바이러스를 사용하여 세포 배양물에 존재하는 세포에서 재조합 헤르페스 바이러스를 생산하는 시험관 내 방법을 제공하며, 바람직하게는 여기에서 세포는 표적 분자로서 인공 분자를 발현하거나 이에 결합하며, 더욱 바람직하게는 표적 분자는 항체, 항체 유도체 또는 항체 모방체, 여전히 더욱 바람직하게는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전자 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 37로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 39로 구성되는 scFv, 가장 바람직하게는 서열버호 41의 서열로 표시되는 분자를 포함한다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 인간에서 질병 세포를 감염시키고 사멸시키는 목적을 제공한다. 이는 헤르페스 바이러스의 제공과 그것의 증식 및 생산을 필요로 한다. 인간에서 종양 세포와 같은 질병 세포의 DNA, RNA 및/또는 단백질과 같은 물질의 도입을 피하기 위해 질병 세포에서 헤르페스 바이러스의 증식은 피해야 하므로, 재조합 헤르페스 바이러스는 비질병 세포 또한 감염시킬 수 있도록 유전자 조작되어야 한다. 이는 재조합 헤르페스 바이러스의 사멸을 위한 질병 세포로의 리타겟팅 및 증식을 위한 비질병 세포로의 리타겟팅을 필요로 한다. 따라서 본 발명의 아홉 번째 양상은 하나 초과, 예컨대 2개, 3개 또는 4개, 바람직하게는 2개의 이종 폴리펩티드 리간드를 갖는 재조합 헤르페스 바이러스의 변형을 포함한다. 리간드는 gB만으로 구성될 수 있으나, gB 및 gD 및 선택적으로 gH 또한 포함될 수 있다.
결과적으로, 아홉 번째 구현예에서, 재조합 헤르페스 바이러스는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 gB에 융합되거나 또는 삽입되는 이종 폴리펩티드 리간드, 및 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 gB, gD 및/또는 gH에 융합되거나 또는 삽입되는 추가의 이종 폴리펩티드 리간드를 포함한다. 바람직하게는, 키메라 gB는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드를 포함하며, 변형된 gD 및/또는 gH는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드를 포함한다.
세포에서 헤르페스 바이러스를 성장시키기 위한 적합한 기술 및 조건은 당업계에 잘 알려져 있으며(Florence et al., 1992; Peterson and Goyal, 1988), 세포와 함께 헤르페스 바이러스를 배양하고, 감염된 세포 배양물의 배지로부터 헤르페스 바이러스를 회수하는 것을 포함한다. 재조합 헤르페스 바이러스가 생산되는 세포는 이종 폴리펩티드 리간드를 통해 재조합 헤르페스 바이러스가 결합하는 표적 분자를 가진다. 바람직하게는, 표적 분자는 인공 표적 분자이다. 인공 표적 분자는 이종 폴리펩티드 리간드에 결합하도록 특이적으로 제작된다. 반대로, 리간드는 인공 표적 분자에 결합하도록 특이적으로 선택되어 제작된다. 따라서, 표적 분자는 표적 세포에 의해 자연적으로 생성되지 않는 항체, 항체 유도체 또는 항체 모방체, 바람직하게는 scFv일 수 있다. 이종 폴리펩티드 리간드는 천연 폴리펩티드, 바람직하게는 진균 또는 세균 폴리펩티드, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애와 같은 사카로마이세스속으로부터의 폴리펩티드 또는 표적 분자에 결합할 수 있는 천연 폴리펩티드의 일부와 같은 인공 폴리펩티드일 수 있다. 세포는 헤르페스 바이러스의 성장에 적합한 임의의 배양된 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 비질병 세포이다. 세포는 세포주로서 존재할 수 있거나, 또는 단리된 세포일 수 있고, 바람직하게는 세포는 세포주로서 존재할 수 있다. 세포주는 헤르페스 바이러스 성장을 위해 승인된 것일 수 있다. 적합한 세포주는 Vero, 293, 293T, HEp-2, HeLa, BHK 또는 RS 세포이고, 가장 바람직하게는 Vero 세포이다.
"배양된" 세포는 당업계에 공지된 바와 같이, 유지되고 증식되는 시험관 내 세포 배양물에 존재하는 세포이다. 배양된 세포는 일반적으로 자연환경을 벗어난 제어된 조건하에서 성장한다. 일반적으로, 배양된 세포는 다세포 진핵 생물, 특히 동물 세포로부터 유래된다. "헤르페스 바이러스의 성장을 위해 승인된 세포주"는 헤르페스 바이러스에 의해 감염될 수 있는 것으로 이미 밝혀진, 즉 바이러스가 세포에 들어가서 바이러스를 증식시키고 생산할 수 있는 임의의 세포주를 포함하는 것을 의미한다. 세포주는 단일 세포로부터 유래된 세포 집단으로, 동일한 유전적 구성을 함유한다. 재조합 헤르페스 바이러스의 증식 및 생산을 위한 바람직한 세포는 Vero, 293, 293T, HEp-2, HeLa, BHK 또는 RS 세포이다.
시험관 내 방법의 바람직한 구현예에서, 리간드는 천연 폴리펩티드의 일부이고, 바람직하게는 274개 이하의 아미노산 잔기의 길이, 바람직하게는 200개 미만의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 50개 미만의 아미노산 잔기, 여전히 더욱 바람직하게는 40개 미만의 아미노산 잔기, 및 여전히 더욱 바람직하게는 20개의 아미노산과 같은 10개와 30개 아미노산 잔기 사이의 길이를 가지며, 이로 인해 그 일부는 표적 분자의 제작 및 헤르페스 바이러스의 각각의 표적 분자를 가지는 세포로의 리타겟팅을 가능하게 한다. 표적 분자는 천연 폴리펩티드의 일부에 결합할 수 있는 항체 유도체이다. 더욱 바람직하게는, 이종 폴리펩티드 리간드는 GCN4 효모 전사 인자의 일부이고, 표적 분자는 리간드에 결합할 수 있는 항체 유도체이고, 세포는 표적 분자를 발현하도록 변형된 세포이다. 가장 바람직하게는, 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 37의 서열로 표시되는 분자이고, 표적 분자는 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자이고, 세포는 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자를 발현하도록 변형된 Vero 세포주이며, 여기에서 Vero GCN4 세포주로 명명된다.
Vero-GCN4 세포주는 GCN4 펩티드에 대한 scFv인 인공 수용체를 발현한다. Vero-GCN4 세포주는 HER2-양성 세포에 대해 리타겟팅되고, 천연 헤르페스 바이러스 수용체로부터 디타겟팅된 헤르페스 바이러스 재조합체(recombinant)의 배양을 가능하게 하는 데 도움이 된다. HER2는 종양 유전자이고 HER2-양성 세포는 암세포이기 때문에, 인간에의 종양-유래 물질(DNA, RNA, 단백질)의 우발적인 도입 가능성을 피하기 위해, 사람에게 투여하는(human use) 종양 용해성 재조합 헤르페스 바이러스의 암세포에서의 성장 및 생산은 피해야 한다. 동시에, 헤르페스 바이러스는 질병 세포를 감염시킬 수 있어야 한다. 따라서 Vero-GCN4 세포주 및 HER2-리타겟팅 헤르페스 바이러스가 제작되었다. Vero-GCN4 세포주는 GCN4 펩티드에 대해 scFv로 만들어진 인공 수용체를 발현하고, Nectin-1의 세포외 도메인 2 및 3, 막관통(TM) 및 C-꼬리에 융합된다. HER2 리타겟팅된 헤르페스 바이러스는 gB에서 GCN4 펩티드를 발현한다. 결과적으로, 재조합 헤르페스 바이러스는 암세포를 감염시키기 위해 HER2에 대해, 그리고 바이러스의 성장 및 생산을 위한 Vero-GCN4 세포주를 감염시키기 위해 GCN4 펩티드에 대해 동시에 리타겟팅 된다.
아홉 번째 양상의 특히 바람직한 구현예에서, gB는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하며, 이에 의해 리간드는 인공 폴리펩티드, 더욱 바람직하게는 천연 폴리펩티드의 일부, 및 여전히 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자의 일부일 수 있고, 변형된 gD 및/또는 변형된 gH는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하며, 이에 의해 표적 분자는 항체, 항체 유도체 또는 항체 모방체, 여전히 더욱 바람직하게는 scFv, 및 여전히 더욱 바람직하게는 HER2에 결합할 수 있는 scFv일 수 있다. 가장 바람직한 구현예에서, 재조합 헤르페스 바이러스는 서열번호 37의 서열로 표시되는 분자를 포함하는 키메라 gB를 포함하고, 변형된 gD 및/또는 gH는 서열번호 32의 서열로 표시되는 scFv를 포함한다. 이러한 헤르페스 바이러스는 종양 세포를 사멸시키기 위해 종양 세포 상에 존재하는 HER2를 통해 종양 세포를 증식시키고 감염시기키 위해 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자를 발현하는 Vero-GCN4 세포주를 감염시킬 수 있다.
또 다른 특히 바람직한 그리고 가장 바람직한 구현예에서, gB는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하고, gD는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함한다. 리간드, 표적 분자 및 세포의 정의는 앞선 챕터에서와 같다.
서열
서열번호 1: HSV-1 gB 야생형 전구체(인간 헤르페스 바이러스 1 균주 F, GenBank 등록 번호: GU734771.1; gB는 위치 52996 내지 55710에 의해 암호화됨)의 아미노산 서열.
서열번호 2: 구조물(construct) R-BP903 및 R-BP909에 의해 암호화되는 바와 같이, 아미노산 43과 44 사이에 트라스투주맙 scFv가 삽입되어 있는 gB의 전구체(서열번호 1)의 아미노산 서열. 링커 SSGGGSGSGGSG (서열번호 30)는 scFv 삽입물(insert)의 C-말단 아미노산 서열과 gB의 아미노산 44의 사이에 도입된다.
서열번호 3: 구조물 R-BP901에 의해 암호화되는 바와 같이, 아미노산 81과 82 사이에 트라스투주맙 scFv가 삽입되어 있는 gB의 전구체(서열번호 1)의 아미노산 서열. 링커 HSSGGGSG (서열번호 29)는 gB의 아미노산 81과 scFv 삽입물의 N-말단 아미노산 서열의 사이에 도입된다. 링커 SSGGGSGSGGSG (서열번호 30)는 scFv 삽입물의 C-말단 아미노산 서열과 gB의 아미노산 82의 사이에 도입된다.
서열번호 4: HSV-1 gD 야생형 전구체(인간 헤르페스 바이러스 1 균주 F, GenBank 등록 ID: GU734771.1; gD는 위치 138281 내지 139465에 의해 암호화됨)의 아미노산 서열.
서열번호 5: R-BP909에 의해 암호화되는 바와 같이, 성숙 gD의 아미노산 6 내지 38의 결실을 갖는 HSV-1 gD 야생형 전구체(서열번호 4)의 아미노산 서열.
서열번호 6: 구조물 R-LM113에 의해 암호화되는 바와 같이, 아미노산 30과 64 사이에 트라스투주맙 scFv가 삽입되어 있는 HSV-1 결실 gD(서열번호 5)의 아미노산 서열. 아미노산 EN은 조작 및 선별의 용이성을 위한 제한 효소를 삽입하기 위해 도입되었다.
서열번호 7: 서열번호 3에서의 삽입물을 암호화하는 R-BP901에서와 같이, pSG-scFvHER2-SG로 명명된 플라스미드에 존재하는 Ser-Gly 링커에 의해 개재된 트라스투주맙 scFv 카세트(cassette).
서열번호 8: 서열번호 7에 의해 암호화되는 아미노산 서열; 아미노산 1 내지 8은 상류 Ser-Gly 링커(서열번호 29)이고, 아미노산 9 내지 116은 VL 영역이고, 아미노산 117 내지 136은 VL과 VH 영역을 연결하는 링커(서열번호 31)이고, 아미노산 137 내지 255는 VH 영역을 암호화하고, 아미노산 256 내지 267은 하류 12 Ser-Gly 링커(서열번호 30)를 암호화한다.
서열번호 9: p-SG-scFvHER2-SG로 명명된 플라스미드에 존재하지만, 서열번호 2에서의 삽입물을 암호화하는 R-BP903 및 R-BP909에서 8개 잔기 길이의 상류 Ser-Gly 링커가 결여된 트라스투주맙 scFv 카세트.
서열번호 10: 서열번호 9에 의해 암호화되는 아미노산 서열; 아미노산 1 내지 108은 VL 영역이고, 아미노산 109 내지 128은 VL과 VH 영역을 연결하는 링커(서열번호 31)이고, 아미노산 129 내지 247은 VH 영역을 암호화하고, 아미노산 248 내지 259는 하류 12 Ser-Gly 링커(서열번호 30)를 암호화한다.
서열번호 11: gB43GalKfor
서열번호 12: gB43GalKrev
서열번호 13: gB43_sc4D5_for
서열번호 14: gB43_sc4D5_rev
서열번호 15: gB81fGALK
서열번호 16: gB81GALKrev
서열번호 17: gB81sc4D5f
서열번호 18: gB81SGr
서열번호 19: scFv4D5_358_r
서열번호 20: scFv4D5_315_f
서열번호 21: gD5_galK_f
서열번호 22: gD39_galK_r
서열번호 23: gD_aa5_39_f
서열번호 24: gD_aa5_39_r
서열번호 25: galK_129_f
서열번호 26: galK_417_r
서열번호 27: gB_ext_for
서열번호 28: gB_431_rev
서열번호 29: 8 Ser-Gly 링커
서열번호 30: 12 Ser-Gly 링커
서열번호 31: VL 및 VH 영역을 연결하는 링커
서열번호 32: 트라스트주맙 scFv
서열번호 33: GCN4gB_43_44_fB
서열번호 34: GCN4gB_43_44_rB
서열번호 35: 구조물 R-313에 의해 암호화되는 바와 같이, 아미노산 43과 44 사이에 GCN4 펩티드가 삽입되어 있는 gB의 전구체(서열번호 1)의 아미노산 서열. GCN4 펩티드는 Ser-Gly 링커의 측면에 위치(flanked by)한다.
서열번호 36: gB 내로의 재조합을 위한 상류 링커 및 하류 링커를 갖는 GCN4 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 37: GCN4 펩티드
서열번호 38: GCN4 에피토프
서열번호 39: GCN4 펩티드에 대한 scFv의 아미노산 서열
서열번호 40: scFv-GCN4-Nectin 1 키메라를 암호화하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 41: 서열번호 40에 의해 암호화되는 아미노산 서열; GCN4 펩티드에 결합할 수 있는 scFv의 아미노산 서열은 N-말단 리더 펩티드, HA 태그 서열, 짧은 GA 링커, 아미노산 33 내지 275까지의 scFv 서열, 짧은 GSGA 링커 및 인간 Nectin-1(PVRL1) 잔기 Met143 내지 Val517
서열번호 42: Genbank 등록 번호 AJ585687.1(GCN4 효모 전사 인자를 암호화하는 유전자)
서열번호 43: GCN4 효모 전사 인자 UniProtKB - P03069 (GCN_YEAST)의 아미노산 서열
서열번호 44: gB_76_galK_for
서열번호 45: gB_76_galK_rev
서열번호 46: gB_76_GCN4_for
서열번호 47: gB_76_GCN4_rev
서열번호 48: 구조물 R-317에 의해 암호화되는 바와 같이, 아미노산 76과 77 사이에 GCN4 펩티드가 삽입되어 있는 gB의 전구체(서열번호 1)의 아미노산 서열. GCN4 펩티드는 Ser-Gly 링커의 측면에 위치한다.
서열번호 49: gB_81_GCN4_for
서열번호 50: gB_81_GCN4_rev
서열번호 51: 구조물 R-315에 의해 암호화되는 바와 같이, 아미노산 81과 82 사이에 GCN4 펩티드가 삽입되어 있는 gB의 전구체(서열번호 1)의 아미노산 서열. GCN4 펩티드는 Ser-Gly 링커의 측면에 위치한다.
서열번호 52: gB_95_galK_for
서열번호 53: gB_95_galK_rev
서열번호 54: gB_95_GCN4_for
서열번호 55: gB_95_GCN4_rev
서열번호 56: 구조물 R-319에 의해 암호화되는 바와 같이, 아미노산 95과 96 사이에 GCN4 펩티드가 삽입되어 있는 gB의 전구체(서열번호 1)의 아미노산 서열. GCN4 펩티드는 Ser-Gly 링커의 측면에 위치한다.
서열번호 57: gD5_galK_f
서열번호 58: scFv_galK_rev
서열번호 59: gDdel30_38for
서열번호 60: gDdel30_38rev
서열번호 61: 구조물 R-321에 의해 암호화되는 바와 같이, 성숙 gD에 대하여 아미노산 30 및 38이 결실되고 아미노산 37 이후에 트라스투주맙 scFv가 삽입된 gD의 전구체(서열번호 4)의 아미노산 서열
서열번호 62: HSV-1 gD 야생형 성숙형의 아미노산 서열(인간 헤르페스 바이러스 1 균주 F, GenBank 등록 ID: GU734771.1).
실시예
실시예 1: gD HSV 유전자에 결실을 갖거나 갖지 않는, HER2(scFv-HER2)(R-BP901, R-BP903, R-BP909)에 대한 단일 사슬 항체(scFv)를 가지고, 리포터 유전자로서 eGFP를 암호화하거나, 또는 GCN4 펩티드(R-313)를 가지는 유전적으로 변형된 gB를 발현하는 HSV 재조합체의 제작
A) R-BP903: HSV gB의 아미노산(amino acid, AA) 43과 44 사이에 scFv-HER2의 삽입
본 발명자들은 성숙 gB의 AA 13과 14에 상응하는 미성숙 gB의 AA 43과 44 사이에 트라스투주맙 scFv를 암호화하는 서열을 삽입한 후, AA 1-30을 포함하는 신호 서열을 절단하여 R-BP903(이 클론은 R-903으로도 불림; 도 1A)을 조작하였다. 시작 게놈은 BAC LM44였고, 이는 HSV-1 게놈의 UL3과 UL4 사이에 삽입된 LOX-P 사이에 개재된 pBeloBAC11과 eGFP 서열을 가진다(Menotti et al., 2008). galK 재조합에 의해 조작을 수행하였다. 간단하게는, 주형으로서 pGalK를 이용하는 프라이머 gB43GalKfor GGTGGCGTCGGCGGCTCCGAGTTCCCCCGGCACGCCTGGGGTCGCGGCCGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(서열번호 11) 및 gB43GalKrev GGCCAGGGGCGGGCGGCGCCGGAGTGGCAGGTCCCCCGTTCGCCGCCTGGGTTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(서열번호 12)에 의해 gB에 대해 상동성 암(arm)을 갖는 galK 카세트를 증폭시켰다. 이 카세트를 LM55 BAC를 가지는 SW102 세균에 전기천공시켰다. 1 mg/L D-비오틴, 0.2 % 갈락토오스, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(15 mM (NH4)2SO4, 100 mM KH2PO4, 1.8 μg FeSO4·H2O, pH7로 조정됨)를 포함하는 플레이트에서 galK 카세트를 보유하는 재조합 클론을 선별하였다. galK 위양성 세균 클론을 제외하기 위하여, 이를 1% 갈락토오스와 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 MacConkey 한천기반 플레이트에 스트리킹(streaked)하고, 프라이머 galK_129_f ACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGG(서열번호 25) 및 galK_417_r CATTGCCGCTGATCACCATGTCCACGC(서열번호 26)를 이용하여 콜로니 PCR로 확인하였다. 다음으로, 프라이머 gB43_sc4D5_for GGTGGCGTCGGCGGCTCCGAGTTCCCCCGGCACGCCTGGGGTCGCGGCCGCGTCCGATATCCAGATGACCCAGTCCCCG(서열번호 13) 및 gB43_sc4D5_rev GGCCAGGGGCGGGCGGCGCCGGAGTGGCAGGTCCCCCGTTCGCCGCCTGGGTACCGGATCCACCGGAACCAGAGCC(서열번호 14)의 어닐링 및 신장을 통해, 아래에 기술되고 gB에 대한 상동성 암에 의해 개재되는 하류 Ser-Gly 링커를 갖는 트라스투주맙 scFv 카세트(서열번호 9; 서열번호 10을 암호화함)를 생성하였다. 재조합 게놈은 HER2에 대한 scFv 및 서열 SSGGGSGSGGSG(서열번호 30)를 갖는 하나의 하류 Ser-Gly 링커와 서열 SDMPMADPNRFRGKNLVFHS(서열번호 31)를 갖는 VL 및 VH 영역 사이의 하나의 링커를 보유하는 키메라 gB를 암호화한다. galK 카세트의 제거 및 선택 서열(sequence of choice)의 삽입물을 가지는 재조합 클론인 scFv-HER2를 1mL D-비오틴, 0.2% 데옥시-2-갈락토오스, 0.2% 글리세롤, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(상기를 참조)를 포함하는 플레이트 상에서 선별하였다. 세균 콜로니 또한 프라이머 gB_ext_for GAGCGCCCCCGACGGCTGTATCG(서열번호 27) 및 gB_431_rev TTGAAGACCACCGCGATGCCCT (서열번호 28)를 이용하여 콜로니 PCR에 의해 선택 서열의 존재에 대해 확인하였다.
B) R-BP909(도 1B): R-BP903의 성숙 gD로부터 AA 6-38의 결실. R-BP909(이 클론은 R-909로도 불림)는 R-BP903과 동일하며, 또한 이는 gD에서 AA 6-38에 상응하는 서열의 결실을 가진다. 시작 물질은 R-BP903 BAC 게놈이었다. gD에서 AA 6-38 결실을 생성하기 위하여, gD에 대해 상동성 암의 측면에 위치하는 galK 카세트를 프라이머 gD5_galK_f
TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(서열번호 21) 및 gD39_galK_r ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(서열번호 22)를 이용하여 증폭시켰다. 다음으로, 본 발명자들은 galK 서열을 gD_aa5_39f TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCACATCCAGGCGGGCCTACCGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCCTCCCGAT(서열번호 23)와 gD_aa5_39r ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGCGCCAAGGCATATTTGCCGCGGACCCCATGGAGGCCCACTATGACGACAA(서열번호 24)로 만들어진 합성 이중-가닥 올리고뉴클레오티드로 대체하였다.
C) R-BP901(이 클론은 R-901이라고도 불림; 도 1C): HSV gB의 AA 81과 82 사이에 scFv-HER2의 삽입
절차는 R-BP903의 gB에서 scFv-HER2를 조작하기 위하여 상기 기술한 것과 동일하지만 다음과 같은 차이가 있었다. 첫째로, galK 카세트를 프라이머 gB81fGALK CGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAAACCCACCGCCGCCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(서열번호 15)와 gB81GALKrev CGCAGGGTGGCGTGGCCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(서열번호 16)으로 증폭시켰다. 그 다음, 아래에 기술되는 Ser-Gly 링커 및 gB에 대한 상동성 암에 의해 개재되는 트라스투주맙 scFv 카세트를 pSG-ScFvHER2-SG로부터 단편# 1 및 단편# 2로 명명된 두 개의 별개의 단편으로서 증폭시켰다. pSG-ScFvHER2-SG는 Ser-Gly 링커(서열번호 7; 서열번호 8을 암호화함)에 의해 개재된다. 단편# 1은 주형으로서 p-SG-ScFv-HER2-SG를 사용하여 프라이머 gB81sc4D5f CGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAAACCCACCGCCGCCGCATAGTAGTGGCGGTGGCTCTGGATCCG(서열번호 17)와 scFv4D5_358_r GGAAACGGTTCGGATCAGCCATCGG(서열번호 19)에 의해 증폭시켰다. 단편# 2는 주형으로서 pSG-ScFvHER2-SG를 사용하여 프라이머 gB81SGr CGCAGGGTGGCGTGGCCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGACCGGATCCACCGGAACCAGAGCC(서열번호 18)와 scFv4D5_ 315_f GGAGATCAAATCGGATATGCCGATGG(서열번호 20)에 의해 증폭시켰다. 단편# 1 및 # 2를 어닐링하고 연장시켜 Ser-Gly 링커와 gB에 대한 상동성 암에 의해 개재된 scFv-HER2 카세트를 생성하였다. 재조합 게놈은 서열 HSSGGGSG(서열번호 29)를 갖는 상류 Ser-Gly 링커와 서열 SSGGGSGSGGSG(서열번호 30)를 갖는 하류 Ser-Gly 링커에 의해 개재되는 scFv-HER2를 가진다. VL과 VH 사이의 링커는 SDMPMADPNRFRGKNLVFHS(서열번호 31)이다.
D) R-313: gD에서 AA 6-38이 결실된 scFv-HER2를 이미 발현하고 있는 HSV 재조합체에서 HSV gB의 AA 43과 44 사이에 GCN4 펩티드의 삽입
본 발명자들은 AA 1-30을 포함하는, 신호 서열의 절단 후 성숙 gB의 AA 13과 14에 상응하는, 미성숙 gB의 AA 43과 44의 사이에 GCN4 펩티드를 암호화하는 서열을 삽입함으로써 R-313(도 1D)을 조작하였다. 시작 게놈은 BAC LM44였고, 이는 gD의 AA 6 내지 38 대신 scFv-HER2를 가지고, HSV-1 게놈의 UL3과 UL4 사이에 삽입된 LOX-P 사이에 개재된 pBeloBAC11과 eGFP 서열을 가진다(Menotti et al., 2008). galK 재조합에 의해 조작을 수행하였다. 간단하게는, gB에 GCN4 펩티드를 삽입하기 위하여, gB에 대해 상동성 암(arm)을 갖는 galK 카세트를 주형으로서 pGalK를 이용하는 프라이머 gB43GalKfor GGTGGCGTCGGCGGCTCCGAGTTCCCCCGGCACGCCTGGGGTCGCGGCCGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(서열번호 11) 및 gB43GalKrev GGCCAGGGGCGGGCGGCGCCGGAGTGGCAGGTCCCCCGTTCGCCGCCTGGGTTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(서열번호 12)로 증폭시켰다. 이 카세트를 BAC LM 113 BG를 가지는 SW102 세균에 전기천공시켰다. 1 mg/L D-비오틴, 0.2 % 갈락토오스, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(15 mM (NH4)2SO4, 100 mM KH2PO4, 1.8 μg FeSO4·H2O, pH7로 조정됨)를 포함하는 플레이트에서 galK 카세트를 보유하는 재조합 클론을 선별하였다. galK 위양성 세균 클론을 제외하기 위하여, 이를 1% 갈락토오스와 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 MacConkey 한천기반 플레이트에 스트리킹하고, 프라이머 galK_129_f ACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGG(서열번호 25) 및 galK_417_r CATTGCCGCTGATCACCATGTCCACGC(서열번호 26)를 이용하여 콜로니 PCR로 확인하였다. 다음으로, 제한 분석(restriction analysis)에 의한 콜로니의 선별에 유용한 BamHI 엔도뉴클레아제에 대한 침묵 제한 부위(slient restriction site)를 도입하는, 프라이머 GCN4gB_43_44_fB GGTGGCGTCGGCGGCTCCGAGTTCCCCCGGCACGCCTGGGGTCGCGGCCGCGGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC(서열번호 33)와 GCN4gB_43_44_rB GGCCAGGGGCGGGCGGCGCCGGAGTGGCAGGTCCCCCGTTCGCCGCCTGGGTGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(서열번호 34)의 어닐링 및 신장을 통해 하류 Ser-Gly 링커와 상류 Ser-Gly 링커를 갖고 gB에 대한 상동성 암에 의해 개재된 GCN4 펩티드 카세트(서열번호 36, 서열번호 37을 암호화함)를 생성하였다. 재조합 게놈은 키메라 gB(서열번호 35)를 암호화하며, 이는 서열 GS와 함께 하나의 하류 Ser-Gly 링크와 하나의 상류 Ser-Gly 링크를 포함하는 GCN4 펩티드를 가진다. galK 카세트의 절제(excision)와 선택 서열의 삽입물을 보유하는 재조합 클론인 GCN4 펩티드를 1mL D-비오틴, 0.2% 데옥시-2-갈락토오스, 0.2% 글리세롤, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(상기를 참조)를 포함하는 플레이트 상에서 선별하였다. 세균 콜로니를 프라이머 gB_ext_for GAGCGCCCCCGACGGCTGTATCG(서열번호 27)과 gB_431_rev TTGAAGACCACCGCGATGCCCT(서열번호 28)를 이용하여 콜로니 PCR에 의해 선택 서열의 존재에 대해 확인하였다.
재조합 바이러스 R-BP909를 재구성시키기 위하여, 500 ng의 재조합 BAC DNA를 리포펙타민 2000(Life Technologies)으로 R6(HSV 후기(late) UL26.5 프로모터의 제저하에 wt-gD를 발현하는 토끼 피부 세포주)(Zhou et al., 2000)로 명명된 gD-보완(complementing) 세포주 내로 형질감염시킨 후, SK-OV-3 세포에서 성장시켰다. 바이러스의 성장을 녹색 형광에 의해 관찰하였다. 전체 gB, 그리고 R-BP909에 대한 gD ORF와 gH ORF, scFv HER2, 및 R-BP903과 R-BP901의 gB에서의 삽입 부위를 시퀀싱함으로써 재조합체의 구조를 확인하였다. SK-OV-3 세포에서 바이러스 스톡(stock)을 생성시켜 적정하였다.
재조합 바이러스 R-BP901, R-BP903, R313을 재구성시키기 위하여, 500 ng의 재조합 BAC DNA를 리포펙타민 2000(Life Technologies)에 의해 SK-OV-3 세포 내로 형질감염시켰다. 바이러스의 성장을 녹색 형광으로 관찰하였다. R-313 바이러스를 SK-OV-3에서 6회 계대시키고, 동결/해동시켜 SK-OV-3 세포를 용해시킨 후, Vero-GCN4 세포에서 성장시켰다. 바이러스 스톡을 Vero-GCN4에서 생성시키고, Vero-GCN4, wt-Vero 및 SK-OV-3 세포에서 적정하였다. GCN4 및 gB에서의 삽입 부위를 시퀀싱함으로써 재조합 R-313의 구조를 확인하였다.
실시예 2: R-BP901 및 R-BP909의 키메라 scFv-HER2-gB의 발현의 확인
SK-OV-3 세포를 3 PFU/세포의 다중 감염도 투입량으로 R-BP901, R-BP909로 그리고 비교를 위해 R-LM5로 감염시키고, 감염 72시간 후 수확하였다. 세포 용해액에 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시하고, PVDF 막으로 옮겨 gB에 대한 단일클론 항체(H1817)로 면역블롯을 실시하였다. 도 2는 R-BP901 및 R-BP909로부터의 키메라 scFv-HER2-gB가 R-LM5로부터의 wt-gB보다 느린 전기영동 이동도(electrophoretic mobility) 및 130 K 달톤의 명백한 Mr로 이동한다는 것을 보여준다. 화살표는 키메라와 wt gB의 이동 위치를 나타낸다. 왼쪽의 숫자는 분자량 마커의 이동 위치를 나타내며, k 달톤으로 표시된다.
실시예 3: 재조합 R-BP903, R-BP909 및 R-BP901을 이용한, 단일 수용체를 발현하는 J 세포의 감염
이전에 gD에서 scFv-HER2의 삽입은 재조합 바이러스 R-LM113에 HER2 수용체를 통해 세포로 들어가는 능력을 부여하는 것으로 나타났다. gB의 위치 43-44 또는 81-82에 scFv-HER2의 삽입이 HER2 수용체를 통해 세포에 들어가는 능력을 부여한다는 증거를 제공하기 위하여, 본 발명자들은 유일한 수용체로서 HER2를 발현하는 세포를 사용하였다. 모 J 세포는 gD에 대한 수용체를 발현하지 않으므로, gD를 활성화시킬 수 없으며, wt-HSV에 의해 감염되지 않는다. J-HER2 세포는 단일 수용체로서 HER2를 형질전환적(transgenically)으로 발현한다. 대조군으로서, 본 발명자들은 N-Nectin 및 J-HVEM 세포를 포함시켰고, 이는 수용체로서 Nectin-1 또는 HVEM을 형질전환적으로 발현하며, wt-HSV에 의해 감염된다. 지시된 세포를 R-BP903, R-BP909 및 R-BP901로 감염시키고, 감염 24시간 후 녹색 형광 현미경으로 관찰하였다.
도 3A에 나타낸 바와 같이, R-BP303은 J-HER2 세포를 감염시켰다. J-Nectin, J-HVEM의 감염은 R-BP903이 wt-gD를 암호화하는 한 놀랍지 않다. 이 바이러스는 HER2로 리타겟팅되고, 천연 친화성을 유지한다.
본 발명자들은 gB의 위치 43-44에 scFv-HER2를 가지며, gD로부터 수용체의 결합 부위의 일부가 결실된 재조합체를 조작하였다. gD의 두 개의 주요 수용체는 Nectin-1과 HVEM이다. gD에서 HVEM의 결합 부위는 AA 1-32로 맵핑된다. 성숙 gD에서 Nectin-1의 결합 부위는 보다 광범위하게 분포되어 있고, Ig-접힘 코어(folded core) 및 AA 35-38, 199-201, 214-217, 219-221 사이에 있는 부분을 포함한다. 본 발명자들은 성숙 gD의 R-BP903으로부터 AA 6-38 영역, 즉 이전에 R-LM113으로부터 결실된 동일한 영역을 결실시켰고, HSV는 성숙 gD의 AA 5 및 39 사이에 scFv-HER2의 삽입에 의해 HER2로 리타겟팅되었다. 결실은 전체 HVEM 결합 부위, 및 Nectin-1과의 상호작용에 관여하는 일부 잔기(AA 35-38 사이에 위치하는 부분을 포함)를 제거한다. Nectin-1과의 상호작용에 관여하는 몇몇의 AA가 결실되더라도, R-LM113은 Nectin-1과 HVEM 모두로부터 디타겟팅된 것으로 나타났다. R-BP909로 명명된 재조합 바이러스는 J-HVEM 세포뿐만 아니라 J-Nectin 세포 또한 감염시키지 못하였고, J-HER2 세포를 효율적으로 감염시키는 능력은 유지하였다(도 3B). 본 발명자들은 HER2 리타겟팅된 gB를 통한 R-BP909 감염은 gD에서 HVEM 및 Nectin-1에 대한 결합 부위를 필요로 하지 않으며, 결과적으로 수용체-매개성 gD 활성화를 필요로 한다고 결론지었다. 요약하면, R-BP909는 완전히 방향을 바꾼 친화성을 나타내며, gB를 통해 HER2 수용체로 리타겟팅되고, gD 수용체로부터 디타겟팅된다.
gB의 AA 81과 82 사이에 scFv HER2를 가지며 wt gD를 갖는 재조합 R-BP901은 J-HER2 세포를 감염시키지 못하며; 이 바이러스는 HER2로 리타겟팅되지 않았다(도 3C).
실시예 4: HER2+ 및 HER2- 암세포의 감염
SK-OV-3, BT-474, MDA-MB-453 HER2+ 암세포, 및 HER2- HeLa 및 MDA-MB-231 암세포, 및 HER2- 비-암(non-cancer) HaCaT 세포를 R-BP909 및 R-BP903을 이용하여 5 PFU/세포(SK-OV-3에서 적정된 바와 같음)의 다중 감염도 투입량으로 37℃에서 90분간 감염시켰다. 감염 24시간 후 형광 현미경에서 사진을 찍었다. R-BP909는 HER2-양성 암세포는 감염시키고, HER2-음성 세포는 감염시키지 못한다. R-BP903은 리타겟팅의 결여와 일치하여 HER2의 발현과는 무관하게 세포를 감염시킨다(도 4).
실시예 5: J-HER2 및 SK-OV-3에서의 R-BP909 진입 경로의 특성
J-HER2 세포로의 R-BP909의 진입이 세포 수용체로서 HER2를 통해 일어나는 것을 증명하고, SK-OV-3 세포 내로의 R-BP909의 진입 경로에서 gD의 역할을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 일련의 차단 검정(blocking assay)을 수행하였다.
또한, R-BP909 및 R-LM113에 존재하는 wt-gD 및 다른 게놈 변형, 즉 BAC 서열의 삽입물과 GFP 마커의 삽입물을 가지는 R-LM5를 대조군으로서 사용하였다. 본 발명자들은 먼저 R-BP909의 감염이 HER2 수용체를 통해 발생하는지를 확인하였다. 12-웰 플레이트에서 J-HER2 세포 또는 SK-OV-3 세포의 복제 단일층(replicate monolayer)을 scFv-HER2가 유래된 HER2에 대한 MAb인 트라스투주맙과 함께 또는 비면역성 마우스 IgG(최종 농도 28 μg/ml)와 함께 전배양하였다. 37℃에서 1시간 동안 항체와의 전배양 후, 세포를 5 PFU/세포(SK-OV-3에서 적정된 바와 같음)의 다중 감염도의 투입량으로 R-BP909와 R-LM113 또는 비교를 위해 LM5를 이용하여 감염시켰다. 두 세포 형태의 R-BP909 감염은 트라스투주맙에 의해 거의 사라졌으며, 이는 R-BP909가 HER2를 진입의 입구로서 사용하고, 진입의 오프-타겟(off-target) 경로를 이용하지 않음을 보여준다. R-BP909가 수용체로서 HER2를 사용할 수 있다는 발견은 HSV의 친화성이 gB에서 이종 리간드를 조작함으로써 변경될 수 있다는 증거를 제공한다. 또한, gD 수용체가 결여된 세포에서 일어날 수 있는 J-HER2 세포 내로의 gB-리타겟팅된 HSV R-BP909의 감염은 그것의 동족(cognate) 수용체에 의해 활성화될 수 없고, gB에 대한 활성화를 전달할 수 없다. 본 발명자들은 R-BP909의 감염이 기능적 수용체-결합 부위를 갖는 gD를 필요로 하지 않는다고 결론지었다. 이는 리타겟팅된 R-BP909가 HER2를 J-HER2 세포에서 진입의 입구로서 사용한다는 결론을 입증한다.
필수 당단백질 gD, gH/gL뿐만 아니라 유전공학에 의해 변형되지 않은 gB의 부분의 기여(contribution)를 설명하기 위하여, 37℃에서 1시간 동안 gD HD1에 대한 MAb(1.5 μg/ml), gB H126에 대한 MAb(1:2000), gH에 대한 MAb 52S(복수(ascites fluid) 1:25)와 함께 지시된 바와 같이 비리온을 전배양한 후, 90분 동안 세포에 흡착시켰다. MAb HD1의 경우, HD1과 트라스투주맙의 조합 또한 테스트하였다. 그 후, 바이러스 접종물(inocula)을 제거하고, 세포를 지시된 항체를 함유하는 배지로 덮었다.
형광표지 세포 분류기(fluorescent activated cell sorter, FACS)로 감염을 정량화하였다(도 5). gB에 대한 MAb H126은 gB의 도메인 I에서 선형 에피토프를 인식하며, Tyr303에 중요한 잔기를 갖는다. gH에 대한 MAb 52S는 gL과는 관계없이 연속적(continuous) 에피토프를 인식하며, Ser536 및 Ala537에 중요한 잔기를 갖는다. SK-OV-3 및 J-HER2 세포 모두의 R-BP909 감염은 MAb H126(1:2000)에 의해 사라졌으며(도 5A 및 5B), 이는 wt-gB의 핵심 기능적 도메인이 키메라에 보존되었으며, gH/gL의 역할을 한다는 것을 보여준다. MAb HD1은 R-BP909 및 R-LM113 감염을 억제하지 못하였으며, 이는 이전의 연구 결과와 일치한다(Gatta et al, 2015); 결과는 R-BP909가 gB에 의해 HER2로 리타겟팅되고, 성숙 gD에서의 AA 6-38 결실의 결과로 Nectin1/HVEM으로부터 디타겟팅된다는 결론을 뒷받침한다.
실시예 6: 재조합체의 복제의 정도(extent)
본 발명자들은 R-BP909의 복제 정도를 gD 및 gH에서 각각 scFv-HER2의 삽입을 통해 HER2로 리타겟팅된 재조합체인 R-LM113 및 R-VG809의 복제 정도와 비교하였다. 수용체로서 HER2 및 Nectin-1/HVEM을 발현하는 SK-OV-3 세포에서 복제를 측정하였다.
세포를 37℃에서 90분 동안 0.1 PFU/세포의 다중 감염도의 투입량으로 감염시키고; 비흡수된 바이러스를 산성 세척(40 mM 시트르산, 10 mM KCl, 135 mM NaCl [pH 3])에 의해 불활성화시켰다. 복제 배양물(replicate culture)을 감염 후 지시된 시간(3, 24 및 48시간)에 동결시키고, 자손을 SK-OV-3에서 적정하였다. 도 6의 결과는 R-BP909가 R-VG809와 유사한 정도로 복제되었으며, R-LM113보다 약 1 로그 적은 것을 보여준다.
실시예 7: HER2-양성 암세포를 사멸시키기 위한 R-BP909 및 비교를 위한 R-VG809의 능력, 및 HER2- 암세포에 대한 사멸 능력의 결여
HER-양성 SK-OV-3 및 MDA-MB-453 및 HER2-음성 MDA-MB-231 세포를 96 웰 플레이트에 8 × 10E3 세포/웰로 시딩하고, 재조합 R-BP909, 비교를 위한 R-VG809 또는 모의-감염된(mock-infected) R-VG809에 37℃에서 90분간 노출시켰다. 다중 감염도 투입량은 SK-OV-3 및 MDA-MB-453에 대해서는 2 PFU/세포였고, MDA-231 세포에 대해서는 0.1 PFU/세포였다. 바이러스 노출 후 지시된 시간에 배양 배지에 Alamar-Blue(10 μl/웰, Life Technologies)를 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 플레이트를 글로맥스 디스커버 시스템(GloMax Discover System, Promega)으로 560 및 600 nm에서 판독하였다. 각 시점에 대하여, 세포 생존율을 감염된 세포 대 비감염 세포에서 AlamarBlue 감소의 백분율로 나타내었고, 각 샘플에 대한 배지 단독의 기여는 제외하였다. HER2-양성 SK-OV-3 및 MDA-MB-453에서 R-BP909 및 R-VG809에 의해 유발된 세포독성은 감염 후 7일째에 70 내지 90%의 범위였다. 두 바이러스 모두 HER2-음성 MDA-MD-231 암세포를 사멸시키지 못했으며, 이는 이들 세포를 감염시킬 수 없다는 것과 일치한다(도 7).
실시예 8: Vero-GCN4와 암세포주 SK-OV-3에서의 복제를 위한 R-313의 능력
이전에 gD의 AA 6-38 대신 scFv-HER2의 삽입은 재조합 바이러스 R-LM113이 HER2 수용체로 리타겟팅되고, Nectin-1 및 HVEM 모두로부터 디타겟팅되게 하는 것으로 나타났다. 본 발명에서, 발명자들은 gB의 AA 43-44 사이에 scFv-HER2를 가지는 R-BP909가 완전히 방향을 바꾼 친화성을 나타내며, gB를 통해 HER2 수용체로 리타겟팅된다는 증거를 제공한다.
본 발명자들은 본원에서 GCN4 펩티드로 명명된, 두 개의 측면 wt GCN4 잔기와 두 개의 GS 링커를 갖는 GCN4 효모 전사 인자의 에피토프 YHLENEVARLKK(서열번호 38)에 의해 본원에 예시된 짧은 펩티드로 HSV를 리타겟팅하기 위하여, gB가 적합한 당단백질인지의 여부를 추가로 조사하였다. 20개의 아미노산 펩티드는 Vero-GCN4 세포주에서 감염 및 복제하기 위한 능력을 R-313에 부여해야 하며, 이는 세포외 도메인 2, 3, TM 및 Nectin-1의 C-꼬리에 융합된 GCN4(Zahnd et al., 2004)에 scFv로 만든 인공 수용체를 발현해야 한다.
R-313에 대한 친화성을 테스트하기 위하여, 본 발명자들은 원숭이(simian)의 wt-Vero, Vero-GCN4, SK-OV-3 및 gD에 대한 수용체를 발현하거나 발현하지 않는 이전에 기술된 J 세포를 이용하였다. 지시된 세포를 R-313으로 감염시키고, 지시된 대로, 세포를 트라스투주맙(허셉틴으로도 불림)(28 μg/ml의 최종 농도)으로 전처리하였다. 감염 24시간 후 녹색 형광 현미경에 의해 감염을 관찰하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, R-313은 비처리된 Vero-GCN4 및 Vero-wt 모두를 감염시켰으나, 트라스투주맙의 존재하에서는 Vero-GCN4에서만 감염이 관찰되었다. 이 결과는 R-313이 Vero-GCN4를 감염시킬 수 있음을 나타낸다. R-313의 wt-Vero 세포의 감염과는 대조적으로, 이 감염은 허셉틴에 의해 저해되지 않았으며, 이는 실제로 gB에 삽입된 GCN4 펩티드에 의해 매개된다는 것을 나타낸다. R-313의 wt-Vero 세포의 감염은 Vero 세포에 존재하는 HER2의 원숭이 오르소로그(ortholog)를 통해 일어나는데, 이는 실제로 허셉틴에 대한 세포의 노출에 의해 억제되기 때문이다.
gD에 융합된 scFv-HER2는 허셉틴에 의한 억제에 의해 입증된 바와 같이, HER2를 통한 SK-OV-3 세포의 감염을 여전히 가능하게 하였다. J, J-Nectin 및 J-HVEM의 감염의 결여는 gD의 AA 6-38의 결실로 인해 R-LM113에 의해 이미 나타난 디타겟팅 프로파일을 확인시켜 주었다. 누적적으로, 이러한 일련의 결과는 R-313이 gB에서 융합된 GCN4 펩티드를 통해 Vero-GCN4 세포를 감염시키고, gD에서 HER2를 통해 SK-OV-3 세포를 감염시키는 능력을 가짐을 나타낸다.
실시예 9: Vero-GCN4 및 SK-OV-3 세포에서 R-313의 복제의 정도
본 발명자들은 R-313의 복제의 정도를 Vero-GCN4 및 SK-OV-3 세포에서 재조합 R-LM113 및 R-LM5의 복제 정도와 비교하였다. 세포를 0.1 PFU/세포의 다중 감염도의 투입량(상응하는 세포주에서 적정된 바와 같음)으로 37℃에서 90분 동안 감염시키고; 비흡수된 바이러스를 산성 세척(40 mM 시트르산, 10 mM KCl, 135 mM NaCl [pH 3])에 의해 불활성화시켰다. 복제 배양물을 감염 후 지시된 시간(3, 24 및 48시간)에 동결시키고, 자손을 SK-OV-3에서 적정하였다. 도 9의 결과는 R-313이 R-LM113보다 높은 정도로 Vero-GCN4에서 복제되고, R-LM5와 유사한 정도로 복제되고, R-LM5보다 거의 1 로그 낮은 정도로 복제되었음을 보여준다.
누적적으로, 결과는 R-313이 GCN4와 HER2를 통해 동시에 리타겟팅됨을 보여준다.
실시예 10: 상이한 세포주에서 R-313의 평판 배양 효율
평판 배양 효율 실험을 위해, 지시된 세포 단일층을 R-313의 연속 희석물(10-5 내지 10- 10)의 복제 분취량으로 감염시켰다. 감염 및 접종물의 제거 후, 한천을 함유하는 배지를 플레이트에 첨가하고, 단일층을 37℃에서 3일간 배양하여 플라크를 형성시켰다. 3일째에 형광 현미경 하에서 플라크의 수를 세었다. 도면은 SK-OV-3에서 R-313의 평판 배양 효율이 Vero-GCN4에서의 평판 배양 효율과 매우 유사하고; 둘 다 wt-Vero 세포에서 관찰되는 평판 배양 효율보다 약간 높음을 보여주며, 이는 R-313이 대안적으로 gB에서 조작된 GCN4 펩티드와 gD에 삽입된 scFv-HER2를 각각 Vero-GCN4 세포와 SK-OV-3 세포로 들어가는데 사용할 수 있음을 확인시켜 준다. J-HER2 세포에서 R-313의 평판 배양 효율은 동일한 세포에서 R-LM113의 평판 배양 효율과 구별될 수 없으며, 이는 GCN4 펩티드의 삽입이 해롭지 않음을 나타낸다(도 10).
실시예 11: 상이한 세포주에서 R-313의 상대적 플라크 크기
플라크 크기 검정을 수행하기 위하여, R-313, R-LM113 및 R-LM5의 10배 희석물을 Vero-GCN4, wt-Vero 및 SK-OV-3 단일층에 도말하였다. 감염된 단일층을 한천을 함유하는 배지로 덮었다. 3일 후 형광 현미경에서 사진을 찍었다. 대표적 사진은 테스트한 모든 세포주에서 R-313이 R-LM113보다 큰 플라크를 형성한다는 것을 보여준다. 결과적으로, R-LM5에 의해 형성된 플라크는 R-313에 의해 형성된 플라크보다 여전히 더 컸다(도 11).
실시예 12:
A) R-315: gD에서 AA 6-38이 결실된 scFv-HER2를 이미 발현하고 있는 HSV 재조합체에서 HSV gB의 AA 81과 82 사이에 GCN4 펩티드의 삽입
절차는 R-313의 gB에서 GCN4 펩티드를 조작하는데 상기 설명한 바와 동일하였으나, 다음과 같은 차이점이 있다. 먼저, 주형으로 pGalK를 사용하여 프라이머 gB81fGALK CGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAAACCCACCGCCGCCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(서열번호 15)와 gB81GALKrev CGCAGGGTGGCGTGGCCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(서열번호 16)에 의해 galK 카세트를 증폭시켰다. 다음으로, 제한 분석에 의한 콜로니의 선별에 유용한 BamHI 엔도뉴클레아제에 대한 침묵 제한 부위를 도입하는, 프라이머 gB_81_GCN4_for CGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAAACCCACCGCCGCCGGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC(서열번호 49)와 gB_81_GCN4_rev CGCAGGGTGGCGTGGCCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC (서열번호 50)의 어닐링 및 신장을 통해, 하류 Ser-Gly 링커와 상류 Ser-Gly 링커를 갖고 gB에 대한 상동성 암에 의해 개재된 GCN4 펩티드 카세트(서열번호 36; 서열번호 37을 암호화함)를 생성하였다. 재조합 게놈은 키메라 gB(서열번호 51)를 암호화하며, 이는 서열 GS와 함께 하나의 하류 Ser-Gly 링커와 상류 Ser-Gly 링커를 포함하는 GCN4 펩티드를 가진다.
B) R-317: gD에서 AA 6-38이 결실된 scFv-HER2를 이미 발현하고 있는 HSV 재조합체에서 HSV gB의 AA 76과 77 사이에 GCN4 펩티드의 삽입
절차는 R-315의 gB에서 GCN4 펩티드를 조작하기 위하여 상기 기술한 것과 동일하지만, 다음과 같은 차이가 있다. 먼저, 주형으로 pGalK를 사용하여 프라이머 gB_76_galK_for GGCCCCGCCCCAACGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAACCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(서열번호 44)와 gB_76_galK_rev CCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGCGGCGGCGGTGGGTTTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(서열번호 45)에 의해 galK 카세트를 증폭시켰다. 다음으로, 제한 분석에 의한 콜로니의 선별에 유용한 BamHI 엔도뉴클레아제에 대한 침묵 제한 부위를 도입하는, 프라이머 gB_76_GCN4_for GGCCCCGCCCCAACGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC(서열번호 46)와 gB_76_GCN4_rev CCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGCGGCGGCGGTGGGTTGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(서열번호 47)의 어닐링 및 신장을 통해, 하류 Ser-Gly 링커와 상류 Ser-Gly 링커를 갖고 gB에 대한 상동성 암에 의해 개재된 GCN4 펩티드 카세트(서열번호 36; 서열번호 37을 암호화함)를 생성하였다. 재조합 게놈은 키메라 gB(서열번호 48)를 암호화하며, 이는 서열 GS와 함께 하나의 하류 Ser-Gly 링커와 상류 Ser-Gly 링커를 포함하는 GCN4 펩티드를 가진다.
C) R-319: gD에서 AA 6-38이 결실된 scFv-HER2를 이미 발현하고 있는 HSV 재조합체에서 HSV gB의 AA 95와 96 사이에 GCN4 펩티드의 삽입
절차는 R-317의 gB에서 GCN4 펩티드를 조작하기 위하여 상기 기술한 것과 동일하지만 다음과 같은 차이가 있다. 먼저, 주형으로 pGalK를 사용하여 프라이머 gB_95_galK_for CGCCGCCGCGCCCCGCCGGCGACAACGCGACCGTCGCCGCGGGCCACGCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(서열번호 52)와 gB_95_galK_rev GTTTGCATCGGTGTTCTCCGCCTTGATGTCCCGCAGGTGCTCGCGCAGGGTTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(서열번호 53)에 의해 galK 카세트를 증폭시켰다. 다음으로, 제한 분석에 의한 콜로니의 선별에 유용한 BamHI 엔도뉴클레아제에 대한 침묵 제한 부위를 도입하는, 프라이머 gB_95_GCN4_for CGCCGCCGCGCCCCGCCGGCGACAACGCGACCGTCGCCGCGGGCCACGCCGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC(서열번호 54)와 gB_95_GCN4_rev GTTTGCATCGGTGTTCTCCGCCTTGATGTCCCGCAGGTGCTCGCGCAGGGTGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(서열번호 55)의 어닐링 및 신장을 통해, 하류 Ser-Gly 링커와 상류 Ser-Gly 링커를 갖고 gB에 대한 상동성 암에 의해 개재된 GCN4 펩티드 카세트(서열번호 36; 서열번호 37을 암호화함)를 생성하였다. 재조합 게놈은 키메라 gB(서열번호 56)를 암호화하며, 이는 서열 GS와 함께 하나의 하류 Ser-Gly 링커와 상류 Ser-Gly 링커를 포함하는 GCN4 펩티드를 가진다.
재조합 바이러스 R-BP909를 재구성시키기 위하여, 500 ng의 재조합 BAC DNA를 리포펙타민 2000(Life Technologies)에 의해 R6(HSV 후기(late) UL26.5 프로모터의 제어하에 wt-gD를 발현하는 토끼 피부 세포주)(Zhou et al., 2000)로 명명된 gD-보완(complementing) 세포주 내로 형질감염시킨 후, SK-OV-3 세포에서 성장시켰다. 바이러스의 성장을 녹색 형광에 의해 관찰하였다. 전체 gB, 그리고 R-BP909에 대한 gD ORF와 gH ORF, scFv HER2, 및 R-BP903과 R-BP901의 gB에서의 삽입 부위를 시퀀싱함으로써 재조합체의 구조를 확인하였다. SK-OV-3 세포에서 바이러스 스톡(stock)을 생성시켜 적정하였다.
재조합 바이러스 R-BP901, R-BP903, R313, R-315, R-317 및 R-319를 재구성시키기 위하여, 500 ng의 재조합 BAC DNA를 리포펙타민 2000(Life Technologies)에 의해 SK-OV-3 세포 내로 형질감염시켰다. 바이러스의 성장을 녹색 형광으로 관찰하였다. R-313 바이러스를 SK-OV-3에서 6회 계대시키고, 동결/해동시켜 SK-OV-3 세포를 용해시킨 후, Vero-GCN4R 세포에서 성장시켰다. 바이러스 스톡을 Vero-GCN4R에서 생성시키고, Vero-GCN4, wt-Vero 및 SK-OV-3 세포에서 적정하였다. 재조합 R-313, R-315, R-317 및 R-319의 게놈을 전체 gB를 서열 분석하여 부분적으로 확인하였다.
실시예 13: Vero-GCN4R과 암세포주 SK-OV-3에서 R-313, R-315, R-317 및 R-319의 복제 능력
이전에 gD의 AA 6-38 대신 scFv-HER2의 삽입은 재조합 바이러스 R-LM113이 HER2 수용체로 리타겟팅되고, Nectin-1 및 HVEM 모두로부터 디타겟팅되게 하는 것으로 나타났다. 본 발명에서, 발명자들은 gB의 AA 43-44 사이에 scFv-HER2를 가지는 R-BP909가 완전히 방향을 바꾼 친화성을 나타내며, gB를 통해 HER2 수용체로 리타겟팅된다는 증거를 제공한다.
본 발명자들은 본원에서 GCN4 펩티드로 명명된, 두 개의 측면 wt GCN4 잔기와 두 개의 GS 링커를 갖는 GCN4 효모 전사 인자의 에피토프 YHLENEVARLKK(서열번호 38)에 의해 본원에 예시된 짧은 펩티드로 HSV를 리타겟팅하기 위하여, gB가 적합한 당단백질인지의 여부를 추가로 조사하였다. 20개의 아미노산 펩티드는 Vero-GCN4 세포주에서 감염 및 복제하기 위한 능력을 R-313, R-315, R-317 및 R-319에 부여해야 하며, 이는 세포외 도메인 2, 3, TM 및 Nectin-1의 C-꼬리에 융합된 GCN4(Zahnd et al., 2004)에 대해 scFv로 만든 인공 수용체를 발현해야 한다.
R-313, R-315, R-317 및 R-319에 대한 친화성을 테스트하기 위하여, 본 발명자들은 원숭이의 wt-Vero, Vero-GCN4R, SK-OV-3, 및 gD에 대한 수용체를 발현하거나 발현하지 않는 이전에 기술된 J 세포를 이용하였다. 지시된 세포를 지시된 재조합체로 감염시키고, 지시된 대로, 세포를 트라스투주맙(허셉틴으로도 불림)(28 μg/ml의 최종 농도)으로 전처리하였다. 감염 24시간 후 녹색 형광 현미경에 의해 감염을 관찰하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, R-313(패널 A), R-315(패널 B), R-317(패널 C) 및 R-319(패널 D)는 비처리된 Vero-CGN4R 및 Vero-wt 모두를 감염시켰으나, 트라스투주맙(허셉틴으로도 불림)의 존재하에서는 Vero-GCN4R에서만 감염이 관찰되었다. 이 결과는 gB의 다른 위치에 GCN4 펩티드의 삽입물을 가지는 모든 재조합 바이러스가 Vero-GCN4R을 감염시킬 수 있음을 나타낸다. wt-Vero 세포의 감염과는 대조적으로, 이 감염은 허셉틴에 의해 저해되지 않았으며, 이는 실제로 gB에 삽입된 GCN4 펩티드에 의해 매개된다는 것을 나타낸다. R-313, R-315, R-317 및 R-319의 wt-Vero 세포의 감염은 Vero 세포에 존재하는 HER2의 원숭이 오르소로그를 통해 일어나는데, 이는 실제로 허셉틴에 대한 세포의 노출에 의해 억제되기 때문이다.
gD에 삽입된 scFv-HER2는 허셉틴에 의한 억제에 의해 입증된 바와 같이, HER2를 통한 SK-OV-3 세포의 감염을 여전히 가능하게 하였다. J, J-Nectin 및 J-HVEM의 감염의 결여는 gD의 AA 6-38의 결실로 인해 R-LM113에 의해 이미 나타난 디리타겟팅 프로파일을 확인시켜 주었다. 누적적으로, 이러한 일련의 결과는 R-313, R-315, R-317 및 R-319가 gB에 삽입된 GCN4 펩티드를 통해 Vero-GCN4R 세포를 감염시키고, gD에서 HER2를 통해 SK-OV-3 세포를 감염시키는 능력을 가짐을 나타낸다.
실시예 14: Vero-GCN4R 및 SK-OV-3 세포에서의 R-313, R-315, R-317 및 R-319의 복제 정도
본 발명자들은 SK-OV-3 세포(도 9A) 및 Vero-GCN4R(도 9B)에서 R-313, R-315, R-317 및 R-319의 복제 정도를 재조합 R-LM113 및 R-VG809의 복제 정도와 비교하였다. 세포를 37℃에서 90분 동안 0.1 PFU/세포의 다중 감염도의 투입량(일치하는(correspondent) 세포주에서 적정된 바와 같음)으로 감염시키고; 비흡수된 바이러스를 산성 세척(40 mM 시트르산, 10 mM KCl, 135 mM NaCl [pH 3])에 의해 불활성화시켰다. 복제 배양물을 감염 후 지시된 시간(24 및 48시간)에 동결시키고, 자손을 SK-OV-3에서 적정하였다. 도 9A로부터, R-315와 R317이 SK-OV-3 세포에서 R-LM5와 R-LM113과 유사한 역가로 성장하였음을 알 수 있다. 반면, R-313과 R-319는 R-315와 R-317보다 약 1-2 로그 적게 성장하였다. 도 9B에서의 결과는 R-313, R-315 및 R-317이 Vero-GCN4R에서 R-LM113과 유사한 정도로 복제되었으며, R-LM5보다 약 1 로그 적은 것을 보여준다. 결과적으로, R-319는 R-315, R-317 및 R-319보다 약 1-2 로그 적게 성장하였다.
누적적으로, 결과는 R-313, R-315, R-317 및 R-319가 GCN4와 HER2를 통해 동시에 리타겟팅됨을 보여준다.
실시예 15: 상이한 세포주에서 R-313, R-315, R-317 및 R-319의 평판 배양 효율
본 발명자들은 수(number)와 관련하여, 상이한 세포주에서 플라크를 형성하는 R-313, R-315, R-317 및 R-319의 능력을 비교하였다. SK-OV-3 세포에서 적정된 바와 같이 동일한 양의 바이러스(50 PFU)를 함유하는 R-LM5, R-LM113, R-313, R-315, R-317 및 R-319의 복제 분취액을 wt-Vero, Vero-GCN4R 및 SK-OV-3에 도말하였다. 감염된 단일층을 한천을 함유하는 배지로 덮고, 3일 후 플라크의 수를 세었다.
실험 결과는 gB에 GCN4 펩티드 삽입물을 보유하는 모든 재조합 바이러스의 평판 배양 효율이 wt-Vero와 비교하여 Vero-GCN4R 세포에서 더 높았으나, 대조군 바이러스에서는 그렇지 않았음을 나타낸다.
실시예 16: 상이한 세포주에서 R-313, R-315, R-317 및 R-319의 상대적 플라크 크기
플라크 크기 검정을 수행하기 위하여, R-313, R-315, R-317 및 R-319의 10배 희석물을 Vero-GCN4R, wt-Vero 및 SK-OV-3 단일층에 도말하였다. 감염된 단일층을 한천을 함유하는 배지로 덮었다. 3일 후 형광 현미경에서 사진을 찍었다. 대표적 사진은 모든 세포주에서 테스트한 R-313, R-315, R-317 및 R-319가 R-LM113보다 큰 플라크를 형성한다는 것을 보여준다. R-LM5에 의해 형성된 플라크는 여전히 더 컸다(도 11). 플라크 크기의 결정(도 11B)을 위해, 각 바이러스에 대하 5개의 플라크 사진을 찍었다. Nis 엘레멘트-이미징 소프트웨어(Nikon)으로 플라크 면적(pxE2)을 측정하였다. 각 결과는 평균 면적 ± SD를 나타낸다.
실시예 17: R-321: gD의 AA 6-38 및 gB의 AA 43과 44 사이에 GCN4 펩티드가 결실된 scFv-HER2를 이미 발현하고 있는 HSV 재조합체에서 gD의 AA 6-29 및 31-37의 재도입
먼저, 주형으로 pGalK를 사용하여 프라이머 gD5_galK_f TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(서열번호 57)와 scFv_galK_rev GAGGCGGACAGGGAGCTCGGGGACTGGGTCATCTGGATATCGGAATTCTCTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(서열번호 58)에 의해 galK 카세트를 증폭시켰다. galK 카세트를 galK 재조합에 의해 R-313 골격(backbone) 내로 삽입하였다. 다음으로, 프라이머 gDdel30_38for TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGGATGCCTCTCTCAAGATGGCCGACCCCAATCGCTTTCGCGGCAAAGACCTTCCGGTCC(서열번호 59)와 gDdel30_38rev GAGGCGGACAGGGAGCTCGGGGACTGGGTCATCTGGATATCGGAATTCTCCACGCGCCGGACCCCCGGAGGGGTCAGCTGGTCCAGGACCGGAAGGTCTTTGCCGCGA(서열번호 60)의 어닐링 및 신장을 통해, gD의 AA 6-29 및 31-37을 포함하는 올리고(oligo)를 생성하였다. 재조합 게놈은 gD의 AA 30과 38의 결실 및 gD의 AA 37 이후의 scFv-HER2의 삽입물을 가지는, 키메라 gB(서열번호 61)를 암호화한다. 서열번호 35는 아미노산 43과 44 사이에 GCN4 펩티드가 삽입된 키메라 gB를 나타낸다. 재조합 BAC의 구조는 gD의 6-37 영역의 상류 및 하류를 시퀀싱하여 확인하였다.
재조합 바이러스 R-321을 재구성시키기 위하여, 500 ng의 재조합 BAC DNA를 리포펙타민 2000(Life Technologies)에 의해 SK-OV-3 세포 내로 형질감염시켰다. 바이러스의 성장을 녹색 형광으로 관찰하였다. R-321 바이러스를 SK-OV-3에서 6회 계대시키고, 동결/해동시켜 SK-OV-3 세포를 용해시킨 후, Vero-GCN4R 세포에서 성장시켰다.
실시예 18: R-321은 HSV-1 천연 수용체로부터 리타겟팅된다
이전에 gD의 AA 6-38 대신 scFv-HER2의 삽입은 재조합 바이러스 R-LM113이 HER2 수용체로 리타겟팅되고, Nectin-1 및 HVEM 모두로부터 디타겟팅되게 하는 것으로 나타났다. 본 발명에서, 발명자들은 gD의 AA 30 및 38만의 결실 및 gD의 AA 37 이후의 scFv-HER2의 삽입물을 가지는 R-321이 HSV-1 천연 수용체를 통해 감염시키는 능력을 상실하기 때문에, 완전히 디타겟팅된 프로파일을 나타낸다는 증거를 제공한다. 더욱이, R-321은 R-313과 같이 gB의 AA 43과 44 사이에 GCN4 펩티드를 가지고 있다.
R-321의 친화성을 테스트하기 위하여, 본 발명자들은 원숭이 wt-Vero, Vero-GCN4R, SK-OV-3, 및 gD에 대한 수용체를 발현하거나 발현하지 않는 이전에 기술된 J 세포를 이용하였다. 지시된 세포를 R-321으로 감염시키고, 지시된 대로, 세포를 트라스투주맙(허셉틴으로도 불림)(28 μg/ml의 최종 농도)으로 전처리하였다. 감염 24시간 후 녹색 형광 현미경에 의해 감염을 관찰하였다.
J, J-Nectin 및 J-HVEM의 감염의 결여(도 15)는 gD의 AA 30 및 38의 결실로 인해 R-321이 HSV-1 천연 수용체로부터 디타겟팅된다는 것을 나타낸다. gD에 융합된 scFv-HER2는 허셉틴에 의한 억제에 의해 입증된 바와 같이, HER2를 통한 SK-OV-3 세포의 감염을 가능하게 하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, R-321은 비처리된 Vero-GCN4R 및 Vero-wt 모두를 감염시켰으나, 트라스투주맙의 존재하에서는 Vero-GCN4R에서만 감염이 관찰되었다. 이 결과는 R-321이 R-313과 같이 Vero-GCN4R을 감염시킬 수 있음을 나타낸다. wt-Vero 세포의 감염과는 대조적으로, Vero-GCN4R의 감염은 허셉틴에 의해 저해되지 않았으며, 이는 실제로 gB에 삽입된 GCN4 펩티드에 의해 매개된다는 것을 나타낸다. R-321로의 감염은 Vero 세포에 존재하는 HER2의 원숭이 오르소로그를 통해 일어나는데, 이는 실제로 허셉틴에 대한 세포의 노출에 의해 억제되기 때문이다.
누적적으로, 결과는 R-321이 GCN4와 HER2를 통해 동시에 리타겟팅되고, gD에서 AA 30 및 38의 결실의 결과로 HSV 천연 수용체로부터 디타겟팅됨을 보여준다.
실시예 19: Vero-GCN4R 및 SK-OV-3 세포에서 R-321의 복제 정도
본 발명자들은 SK-OV-3 세포(도 16A) 및 Vero-GCN4R(도 16B)에서 R-321의 복제 정도를 재조합 R-LM113 및 R-LM5의 복제 정도와 비교하였다. 세포를 37℃에서 90분 동안 0.1 PFU/세포의 다중 감염도의 투입량(일치하는 세포주에서 적정된 바와 같음)으로 감염시키고; 비흡수된 바이러스를 산성 세척(40 mM 시트르산, 10 mM KCl, 135 mM NaCl [pH 3])에 의해 불활성화시켰다. 복제 배양물을 감염 후 지시된 시간(24 및 48시간)에 동결시키고, 자손을 SK-OV-3에서 적정하였다. 도 16A로부터, R-321이 SK-OV-3 세포에서 R-LM5와 R-LM113과 유사한 역가로 성장하였음을 알 수 있다. 도 16B에서의 결과는 R321이 Vero-GCN4R에서 R-LM113보다 1 로그 높게 복제되었으며, R-LM5와 유사한 정도로 복제되었음을 보여준다.
실시예 20: Vero-GCN4 세포주
Vero GCN4 세포주는 Nectin-1에 융합된, 서열번호 39에 보고된 바와 같이 인간 코돈 사용을 위해 최적화된 서열을 갖는, GCN4 펩티드(Zahnd et al., 2004)에 대해 scFv로 만들어진 인공 키메라 수용체를 발현한다. GCN4 펩티드는 사카로마이세스 세레비지애 전사 인자 GCN4의 일부이며, 그 부분적 mRNA 서열은 서열번호 42에 보고되어 있다. 더욱 상세하게는, N-말단 리더 펩티드 및 HA 태그 서열이 pDISPLAY(Invitrogen)에서와 같이 존재한다. 이는 리더 펩티드의 효율적이고 적절한 프로세싱을 보장해야 한다. HA 태그 후, 짧은 GA 링커는 scFv의 상류에 존재한다. GCN4에 대한 scFv의 아미노산 서열은 서열번호 39에 보고되어 있다. scFv에 대한 C-말단에 짧은 GSGA 링커가 존재한다. 나머지 분자는 Nectin-1 세포외 도메인 2 및 3, TM 분절 및 세포 내 세포질 꼬리를 포함하는 인간 Nectin-1(RVRL1) 잔기 Met143 내지 Val517에 해당한다(도 12). 키메라를 유전자 기술(Gene Art)에 의해 시험관 내에서 합성하고, pcDNA3.1 - Hygro_(+)에 클로닝하여, 플라스미드 scFv_GCN4_Nectin1 키메라를 얻었으며, 그 삽입물은 scFv-GCN4 nectin1 키메라 서열번호 41의 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 40로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가진다.
플라스미드 scFv_GCN4_Nectin1 키메라로부터의 DNA를 리포펙타민 2000에 의해 Vero 세포(ATCC　CCL-81TM) 내로 형질감염시켰다. GCN4 펩티드에 대해 인공 수용체를 발현하는 Vero 세포를 하이그로마이신(200 μg/ml)으로 선별하고, 이어서 HA 태그에 대한 MAb와 조합하여 자성 비드(Miltenyi)로 분류하였다. 분류된 세포에 대해 96 웰에서 단일 세포 클로닝(single cell cloning)을 하였다(0.5 세포/웰).
HA 태그에 대한 MAb에 의해 GCN4 펩티드에 대한 scFv의 발현을 검출하기 위해 단일 클론을 FACS로 분석하였다. 선별된 클론은 11.2였다. 본 발명자들은 Vero-GCN4 세포주의 일련의 계대 동안 인공 수용체의 발현이 40번의 연속적인 계대 후에도 안정하게 유지됨을 확인하였다(도 13).
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Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr 355 360 365 Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg Glu Asp Asp 370 375 380 Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr 385 390 <210> 5 <211> 361 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of HSV-1 gD wild type, precursor (SEQ ID NO: 4), with deletion of amino acids 31-63, corresponding to amino acids 6 to 38 in mature gD <400> 5 Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val 1 5 10 15 Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala His Ile 20 25 30 Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr 35 40 45 Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu Asn 50 55 60 Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp Val 65 70 75 80 Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly 85 90 95 Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr 100 105 110 Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro 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Arg Thr Gln 325 330 335 Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg Glu Asp Asp Gln 340 345 350 Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr 355 360 <210> 6 <211> 621 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of HSV-1 gD wild type, precursor (SEQ ID NO: 4), having inserted the trastuzumab scFv between amino acids 30-64, corresponding to amino acids 5-39 of mature gD <400> 6 Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val 1 5 10 15 Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Glu Asn 20 25 30 Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 35 40 45 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr 50 55 60 Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 65 70 75 80 Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 85 90 95 Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 100 105 110 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro 115 120 125 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro 130 135 140 Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser 145 150 155 160 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 165 170 175 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 180 185 190 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 195 200 205 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 210 215 220 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 225 230 235 240 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 245 250 255 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 260 265 270 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly 275 280 285 Gly Ser His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser 290 295 300 Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser 305 310 315 320 Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala 325 330 335 Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe 340 345 350 Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr 355 360 365 Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gln 370 375 380 Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn 385 390 395 400 Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr 405 410 415 Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile 420 425 430 Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg 435 440 445 Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val 450 455 460 Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln 465 470 475 480 Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro 485 490 495 Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr 500 505 510 Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser 515 520 525 Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro Pro 530 535 540 Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His Pro 545 550 555 560 Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly 565 570 575 Ser Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met Arg 580 585 590 Arg Arg Thr Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg 595 600 605 Glu Asp Asp Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr 610 615 620 <210> 7 <211> 801 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> pSG-ScFvHER2-SG trastuzumab scFv cassette bracketed by Ser-Gly linkers as in R-BP901 <400> 7 catagtagtg gcggtggctc tggatccgat atccagatga cccagtcccc gagctccctg 60 tccgcctctg tgggcgatag ggtcaccatc acctgccgtg ccagtcagga tgtgaatact 120 gctgtagcct ggtatcaaca gaaaccagga aaagctccga agcttctgat ttactcggca 180 tccttcctct actctggagt cccttctcgc ttctctggta gccgttccgg gacggatttc 240 actctgacca tcagcagtct gcagccggaa gacttcgcaa cttattactg tcagcaacat 300 tatactactc ctcccacgtt cggacagggt accaaggtgg agatcaaatc ggatatgccg 360 atggctgatc cgaaccgttt ccgcggtaag aacctggttt ttcattctga ggttcagctg 420 gtggagtctg gcggtggcct ggtgcagcca gggggctcac tccgtttgtc ctgtgcagct 480 tctggcttca acattaaaga cacctatata cactgggtgc gtcaggcccc gggtaagggc 540 ctggaatggg ttgcaaggat ttatcctacg aatggttata ctagatatgc cgatagcgtc 600 aagggccgtt tcactataag cgcagacaca tccaaaaaca cagcctacct acaaatgaac 660 agcttaagag ctgaggacac tgccgtctat tattgtagcc gctggggagg ggacggcttc 720 tatgctatgg actactgggg tcaaggaaca ctagtcaccg tctcctcgag tggcggtggc 780 tctggttccg gtggatccgg t 801 <210> 8 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> pSG-ScFvHER2-SG trastuzumab scFV bracketed by Ser-Gly linkers as in R-BP901 <400> 8 His Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 10 15 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 25 30 Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 35 40 45 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr 50 55 60 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 100 105 110 Val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg 115 120 125 Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 145 150 155 160 Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala 165 170 175 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly 180 185 190 Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala 195 200 205 Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 210 215 220 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe 225 230 235 240 Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 255 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly 260 265 <210> 9 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab scFv cassette present in R-BP901, but lacking the 8 residues long Ser-Gly upstream linker <400> 9 tccgatatcc agatgaccca gtccccgagc tccctgtccg cctctgtggg cgatagggtc 60 accatcacct gccgtgccag tcaggatgtg aatactgctg tagcctggta tcaacagaaa 120 ccaggaaaag ctccgaagct tctgatttac tcggcatcct tcctctactc tggagtccct 180 tctcgcttct ctggtagccg ttccgggacg gatttcactc tgaccatcag cagtctgcag 240 ccggaagact tcgcaactta ttactgtcag caacattata ctactcctcc cacgttcgga 300 cagggtacca aggtggagat caaatcggat atgccgatgg ctgatccgaa ccgtttccgc 360 ggtaagaacc tggtttttca ttctgaggtt cagctggtgg agtctggcgg tggcctggtg 420 cagccagggg gctcactccg tttgtcctgt gcagcttctg gcttcaacat taaagacacc 480 tatatacact gggtgcgtca ggccccgggt aagggcctgg aatgggttgc aaggatttat 540 cctacgaatg gttatactag atatgccgat agcgtcaagg gccgtttcac tataagcgca 600 gacacatcca aaaacacagc ctacctacaa atgaacagct taagagctga ggacactgcc 660 gtctattatt gtagccgctg gggaggggac ggcttctatg ctatggacta ctggggtcaa 720 ggaacactag tcaccgtctc ctcgagtggc ggtggctctg gttccggtgg atccggt 777 <210> 10 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> pSG-ScFvHER2-SG trastuzumab scFV with downstream Ser-Gly linker as in R-BP903 and R-BP909 <400> 10 Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro 100 105 110 Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser 115 120 125 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 130 135 140 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 145 150 155 160 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 165 170 175 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 180 185 190 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 195 200 205 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 225 230 235 240 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Gly Ser Gly <210> 11 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gB43GalKfor <400> 11 ggtggcgtcg gcggctccga gttcccccgg cacgcctggg gtcgcggccg cgcctgttga 60 caattaatca tcggca 76 <210> 12 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gB43GalKrev <400> 12 ggccaggggc gggcggcgcc ggagtggcag gtcccccgtt cgccgcctgg gttcagcact 60 gtcctgctcc tt 72 <210> 13 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gB43_sc4D5_for <400> 13 ggtggcgtcg gcggctccga gttcccccgg cacgcctggg gtcgcggccg cgtccgatat 60 ccagatgacc cagtccccg 79 <210> 14 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gB43_sc4D5_rev <400> 14 ggccaggggc gggcggcgcc ggagtggcag gtcccccgtt cgccgcctgg gtaccggatc 60 caccggaacc agagcc 76 <210> 15 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gB81fGALK <400> 15 cgggggacac gaaaccgaag aagaacaaaa aaccgaaaaa cccaccgccg ccgcctgttg 60 acaattaatc atcggca 77 <210> 16 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gB81GALKrev <400> 16 cgcagggtgg cgtggcccgc ggcgacggtc gcgttgtcgc cggcggggcg tcagcactgt 60 cctgctcctt 70 <210> 17 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gB81sc4D5f <400> 17 cgggggacac gaaaccgaag aagaacaaaa aaccgaaaaa cccaccgccg ccgcatagta 60 gtggcggtgg ctctggatcc g 81 <210> 18 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gB81SGr <400> 18 cgcagggtgg cgtggcccgc ggcgacggtc gcgttgtcgc cggcggggcg accggatcca 60 ccggaaccag agcc 74 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> scFv4D5_358_r <400> 19 ggaaacggtt cggatcagcc atcgg 25 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> scFv4D5_315_f <400> 20 ggagatcaaa tcggatatgc cgatgg 26 <210> 21 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gD5_galK_f <400> 21 ttgtcgtcat agtgggcctc catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg cctgttgaca 60 attaatcatc ggca 74 <210> 22 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gD39_galK_r <400> 22 atcgggaggc tggggggctg gaacgggtcc ggtaggcccg cctggatgtg tcagcactgt 60 cctgctcctt 70 <210> 23 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gD_aa5_39_f <400> 23 ttgtcgtcat agtgggcctc catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg cacatccagg 60 cgggcctacc ggacccgttc cagcccccca gcctcccgat 100 <210> 24 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gD_aa5_39_r <400> 24 atcgggaggc tggggggctg gaacgggtcc ggtaggcccg cctggatgtg cgccaaggca 60 tatttgccgc ggaccccatg gaggcccact atgacgacaa 100 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> galK_129_f <400> 25 acaatctctg tttgccaacg catttgg 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> galK_417_r <400> 26 cattgccgct gatcaccatg tccacgc 27 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gB_ext_f <400> 27 gagcgccccc gacggctgta tcg 23 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gB_431_r <400> 28 ttgaagacca ccgcgatgcc ct 22 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 29 His Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 30 Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 31 Ser Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu 1 5 10 15 Val Phe His Ser 20 <210> 32 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Trastuzumab scFv to HER2 <400> 32 Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro 100 105 110 Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser 115 120 125 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 130 135 140 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 145 150 155 160 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 165 170 175 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 180 185 190 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 195 200 205 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 225 230 235 240 Gly Thr Leu Val Thr Val 245 <210> 33 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GCN4gB_43_44_fB <400> 33 ggtggcgtcg gcggctccga gttcccccgg cacgcctggg gtcgcggccg cgggatccaa 60 gaactaccac ctggagaacg aggtggccag actgaagaag ctggtgggca gc 112 <210> 34 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GCN4gB_43_44_rB <400> 34 ggccaggggc gggcggcgcc ggagtggcag gtcccccgtt cgccgcctgg gtgctgccca 60 ccagcttctt cagtctggcc acctcgttct ccaggtggta gttcttggat cc 112 <210> 35 <211> 924 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the precursor of gB (SEQ ID NO: 1) having inserted the GCN4 peptide between amino acids 43 and 44, as encoded by construct R-313 <400> 35 Met Arg Gln Gly Ala Pro Ala Arg Gly Cys Arg Trp Phe Val Val Trp 1 5 10 15 Ala Leu Leu Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Val Ala Ser Ala Ala Pro 20 25 30 Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Gly Ser Lys Asn Tyr 35 40 45 His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Ser Thr 50 55 60 Gln Ala Ala Asn Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Pro Gly 65 70 75 80 Pro Ala Pro Thr Gly Asp Thr Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys 85 90 95 Asn Pro Pro Pro Pro Arg Pro Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala 100 105 110 Gly His Ala Thr Leu Arg Glu His Leu Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn 115 120 125 Thr Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val 130 135 140 Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln 145 150 155 160 Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro 165 170 175 Tyr Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln 180 185 190 Val Trp Phe Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp 195 200 205 Arg Ala Pro Val Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys 210 215 220 Gly Val Cys Arg Ser Thr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr 225 230 235 240 Thr Ala Phe His Arg Asp Asp His Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro 245 250 255 Ala Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp His Thr Thr Asp Leu 260 265 270 Lys Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr Gly Thr Thr 275 280 285 Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr 290 295 300 Asp Glu Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala 325 330 335 Asp Arg Phe Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr 340 345 350 Lys Ala Arg Ala Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro 355 360 365 Lys Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys 370 375 380 Thr Met Thr Lys Trp Gln Glu Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr 385 390 395 400 Gly Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile Ser Thr Thr Phe Thr 405 410 415 Thr Asn Leu Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu Gly Asp Cys 420 425 430 Ile Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg Arg 435 440 445 Tyr Asn Ala Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala 450 455 460 Asn Gly Gly Phe Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu 465 470 475 480 Ala Glu Leu Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Arg Lys Pro 485 490 495 Pro Asn Pro Thr Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val 500 505 510 Glu Arg Ile Lys Thr Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe 515 520 525 Thr Tyr Asn His Ile Gln Arg His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val 530 535 540 Ala Ile Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn His Glu Leu Thr Leu Trp Asn 545 550 555 560 Glu Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ser Ala Thr Val Gly 565 570 575 Arg Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser Thr 580 585 590 Cys Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg 595 600 605 Ile Ser Ser Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe 610 615 620 Arg Tyr Glu Asp Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn 625 630 635 640 Asn Glu Leu Arg Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly 645 650 655 His Arg Arg Tyr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu 660 665 670 Tyr Ala Tyr Ser His Gln Leu Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser 675 680 685 Thr Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu Asp His Glu Phe Val 690 695 700 Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg His Glu 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<223> Nucleic acid sequence of scFv_GCN4_Nectin1 chimera <400> 40 atggaaaccg acacccttct tttgtgggtg cttcttcttt gggtgcccgg gagcaccggg 60 gactacccct acgacgtgcc cgactacgcc ggggctgatg ccgtggtgac ccaggagagc 120 gccttgacca caagccccgg ggagaccgtg accttgacct gtagaagcag cacaggggcc 180 gttacaacct ctaactacgc cagctgggtt caggagaagc ccgaccacct tttcaccgga 240 cttatcggag ggaccaacaa cagagccccc ggggtgcctg ctagattcag cgggagcctt 300 attggggaca aggccgccct taccattacc ggggctcaga ccgaagacga ggctatctac 360 ttctgtgctc tttggtacag caaccattgg gtgttcggag gcgggacaaa gcttacagtg 420 cttggaggcg gtggaggcag cggcggaggt gggtctggtg gagggggctc tgggggaggc 480 ggtagcgacg tgcagcttca gcagagcggg cccgggcttg tggccccctc tcagtctctt 540 agcataacgt gcaccgtgag cgggttcagc cttaccgact atggggttaa ctgggtgaga 600 cagtctcctg ggaaggggct tgagtggttg ggagttatct ggggagacgg aatcaccgac 660 tacaacagcg ccttgaagag cagactttct gtgacaaagg acaactctaa gagccaggtg 720 ttccttaaga tgaacagcct tcagagcggg gactctgcca gatactactg cgtgacaggg 780 cttttcgact actggggaca agggaccacc ttgaccgtga gcagcggaag cggagccatg 840 gccaagccca ccaactggat cgaggggaca caggccgtgc ttagagccaa gaaggggcag 900 gacgacaagg ttcttgttgc tacttgcacc agcgccaacg gaaagccccc cagcgtggtg 960 agctgggaga caagattgaa aggggaggcc gagtatcagg agatcagaaa ccctaacggg 1020 accgtgaccg tgatcagcag atacagactt gtgcctagca gagaggccca ccagcagagc 1080 cttgcctgca tcgttaacta ccacatggac agattcaagg agagccttac acttaacgtg 1140 cagtacgaac ccgaggtgac catcgagggg ttcgacggga actggtacct tcagagaatg 1200 gacgtgaagc ttacctgcaa ggccgacgcc aaccctcccg ccaccgagta ccactggacc 1260 acccttaacg ggagccttcc caaaggggtg gaggcccaga acagaaccct tttcttcaag 1320 gggcccatca attacagcct tgccgggacc tacatctgcg aggccaccaa ccccatcggg 1380 accagaagcg gtcaagtgga ggtgaacatc accgagttcc cctacacccc cagcccaccc 1440 gagcacggga gaagagctgg gcccgttccc accgccatca tcggaggggt ggccgggagc 1500 atcttgcttg tgcttatcgt ggtgggtggg attgtggtgg cccttagaag aagaagacat 1560 accttcaaag gggactacag caccaagaag cacgtgtacg ggaacgggta cagcaaggcc 1620 ggaatccctc agcaccatcc acctatggcc cagaaccttc agtaccccga cgacagcgac 1680 gatgagaaga aggctgggcc ccttggtggg agcagctacg aagaggagga agaagaggaa 1740 gagggtggcg gcggtggaga gagaaaagtg ggagggcctc atcccaaata cgacgaggac 1800 gccaagagac cctacttcac cgtggacgag gccgaggcca gacaggacgg gtacggggac 1860 agaacccttg ggtaccagta cgaccccgag cagttggact tggccgagaa catggtgagc 1920 cagaacgacg gaagcttcat ctctaagaag gagtggtacg tgtg 1964 <210> 41 <211> 654 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of scFv_GCN4_Nectin1 chimera <400> 41 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala 20 25 30 Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 35 40 45 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 50 55 60 Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 65 70 75 80 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 85 90 95 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu 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tgccaattcc ggagctagat gccgctgtag tggaatcttt cttttcgtca 300 agcactgatt caactccaat gtttgagtat gaaaacctag aagacaactc taaagaatgg 360 acatccttgt ttgacaatga cattccagtt accactgacg atgtttcatt ggctgataag 420 gcaattgaat ccactgaaga agtttctctg gtaccatcca atctggaagt ctcgacaact 480 tcattcttac ccactcctgt tctagaagat gctaaactga ctcaaacaag aaaggttaag 540 aaaccaaatt cagtcgttaa gaagtcacat catgttggaa aggatgacga atcgagactg 600 gatcatctag gtgttgttgc ttacaaccgc aaacagcgtt cgattccact ttctccaatt 660 gtgcccgaat ccagtgatcc tgctgctcta aaacgtgcta gaaacactga agccgccagg 720 cgttctcgtg cgagaaagtt gcaaagaatg aaacaacttg aagacaaggt tgaagaattg 780 ctttcgaaaa attatcactt ggaaaatgag gttgccagat taaagaaatt agttggcgaa 840 cgctga 846 <210> 43 <211> 281 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 43 Met Ser Glu Tyr Gln Pro Ser Leu Phe Ala Leu Asn Pro Met Gly Phe 1 5 10 15 Ser Pro Leu Asp Gly Ser Lys Ser Thr Asn Glu Asn Val Ser Ala Ser 20 25 30 Thr Ser Thr Ala Lys Pro Met Val Gly Gln Leu Ile Phe Asp Lys Phe 35 40 45 Ile Lys Thr 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gB (SEQ ID NO: 1) having inserted the GCN4 peptide between amino acids 76 and 77, as encoded by construct R-317 <400> 48 Met Arg Gln Gly Ala Pro Ala Arg Gly Cys Arg Trp Phe Val Val Trp 1 5 10 15 Ala Leu Leu Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Val Ala Ser Ala Ala Pro 20 25 30 Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala Asn 35 40 45 Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Thr 50 55 60 Gly Asp Thr Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Gly Ser Lys Asn 65 70 75 80 Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Ser 85 90 95 Asn Pro Pro Pro Pro Arg Pro Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala 100 105 110 Gly His Ala Thr Leu Arg Glu His Leu Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn 115 120 125 Thr Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val 130 135 140 Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln 145 150 155 160 Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro 165 170 175 Tyr Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr 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<212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the precursor of gB (SEQ ID NO: 1) having inserted the GCN4 peptide between amino acids 81 and 82, as encoded by construct R-315 <400> 51 Met Arg Gln Gly Ala Pro Ala Arg Gly Cys Arg Trp Phe Val Val Trp 1 5 10 15 Ala Leu Leu Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Val Ala Ser Ala Ala Pro 20 25 30 Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala Asn 35 40 45 Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Thr 50 55 60 Gly Asp Thr Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Pro Pro 65 70 75 80 Pro Gly Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys 85 90 95 Lys Leu Val Gly Ser Arg Pro Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala 100 105 110 Gly His Ala Thr Leu Arg Glu His Leu Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn 115 120 125 Thr Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val 130 135 140 Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln 145 150 155 160 Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro 165 170 175 Tyr Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln 180 185 190 Val Trp Phe Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp 195 200 205 Arg Ala Pro Val Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys 210 215 220 Gly Val Cys Arg Ser Thr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr 225 230 235 240 Thr Ala Phe His Arg Asp Asp His Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro 245 250 255 Ala Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp His Thr Thr Asp Leu 260 265 270 Lys Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr Gly Thr Thr 275 280 285 Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr 290 295 300 Asp Glu Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala 325 330 335 Asp Arg Phe Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr 340 345 350 Lys Ala Arg Ala Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro 355 360 365 Lys Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys 370 375 380 Thr Met Thr Lys Trp Gln Glu Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr 385 390 395 400 Gly Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile Ser Thr Thr Phe Thr 405 410 415 Thr Asn Leu Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu Gly Asp Cys 420 425 430 Ile Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg Arg 435 440 445 Tyr Asn Ala Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala 450 455 460 Asn Gly Gly Phe Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu 465 470 475 480 Ala Glu Leu Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Arg Lys Pro 485 490 495 Pro Asn Pro Thr Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val 500 505 510 Glu Arg Ile Lys Thr Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe 515 520 525 Thr Tyr Asn His Ile Gln Arg His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val 530 535 540 Ala Ile Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn His Glu Leu Thr Leu Trp Asn 545 550 555 560 Glu Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ser Ala Thr Val Gly 565 570 575 Arg Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser Thr 580 585 590 Cys Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg 595 600 605 Ile Ser Ser Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe 610 615 620 Arg Tyr Glu Asp Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn 625 630 635 640 Asn Glu Leu Arg Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly 645 650 655 His Arg Arg Tyr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu 660 665 670 Tyr Ala Tyr Ser His Gln Leu Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser 675 680 685 Thr Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu Asp His Glu Phe Val 690 695 700 Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys Asp Ser Gly Leu Leu 705 710 715 720 Asp Tyr Thr Glu Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp Leu Arg Phe 725 730 735 Ala Asp Ile Asp Thr Val Ile His Ala Asp Ala Asn Ala Ala Met Phe 740 745 750 Ala Gly Leu Gly Ala Phe Phe Glu Gly Met Gly Asp Leu Gly Arg Ala 755 760 765 Val Gly Lys Val Val Met Gly Ile Val Gly Gly Val Val Ser Ala Val 770 775 780 Ser Gly Val Ser Ser Phe Met Ser Asn Pro Phe Gly Ala Leu Ala Val 785 790 795 800 Gly Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Phe Phe Ala Phe Arg 805 810 815 Tyr Val Met Arg Leu Gln Ser Asn Pro Met Lys Ala Leu Tyr Pro Leu 820 825 830 Thr Thr Lys Glu Leu Lys Asn Pro Thr Asn Pro Asp Ala Ser Gly Glu 835 840 845 Gly Glu Glu Gly Gly Asp Phe Asp Glu Ala Lys Leu Ala Glu Ala Arg 850 855 860 Glu Met Ile Arg Tyr Met Ala Leu Val Ser Ala Met Glu Arg Thr Glu 865 870 875 880 His Lys Ala Lys Lys Lys Gly Thr Ser Ala Leu Leu Ser Ala Lys Val 885 890 895 Thr Asp Met Val Met Arg Lys Arg Arg Asn Thr Asn Tyr Thr Gln Val 900 905 910 Pro Asn Lys Asp Gly Asp Ala Asp Glu Asp Asp Leu 915 920 <210> 52 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gB_95_galK_for <400> 52 cgccgccgcg ccccgccggc gacaacgcga ccgtcgccgc gggccacgcc cctgttgaca 60 attaatcatc ggca 74 <210> 53 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gB_95_galK_rev <400> 53 gtttgcatcg gtgttctccg ccttgatgtc ccgcaggtgc tcgcgcaggg ttcagcactg 60 tcctgctcct t 71 <210> 54 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gB_95_GCN4_for <400> 54 cgccgccgcg ccccgccggc gacaacgcga ccgtcgccgc gggccacgcc ggatccaaga 60 actaccacct ggagaacgag gtggccagac tgaagaagct ggtgggcagc 110 <210> 55 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gB_95_GCN4_rev <400> 55 gtttgcatcg gtgttctccg ccttgatgtc ccgcaggtgc tcgcgcaggg tgctgcccac 60 cagcttcttc agtctggcca cctcgttctc caggtggtag ttcttggatc c 111 <210> 56 <211> 924 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the precursor of gB (SEQ ID NO: 1) having inserted the GCN4 peptide between amino acids 95 and 96, as encoded by construct R-319 <400> 56 Met Arg Gln Gly Ala Pro Ala Arg Gly Cys Arg Trp Phe Val Val Trp 1 5 10 15 Ala Leu Leu Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Val Ala Ser Ala Ala Pro 20 25 30 Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala Asn 35 40 45 Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Thr 50 55 60 Gly Asp Thr Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Pro Pro 65 70 75 80 Pro Arg Pro Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala Gly His Ala Gly 85 90 95 Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu 100 105 110 Val Gly Ser Thr Leu Arg Glu His Leu Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn 115 120 125 Thr Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val 130 135 140 Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln 145 150 155 160 Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro 165 170 175 Tyr Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln 180 185 190 Val Trp Phe Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp 195 200 205 Arg Ala Pro Val Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys 210 215 220 Gly Val Cys Arg Ser Thr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr 225 230 235 240 Thr Ala Phe His Arg Asp Asp His Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro 245 250 255 Ala Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp His Thr Thr Asp Leu 260 265 270 Lys Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr Gly Thr Thr 275 280 285 Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr 290 295 300 Asp Glu Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala 325 330 335 Asp Arg Phe Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr 340 345 350 Lys Ala Arg Ala Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro 355 360 365 Lys Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys 370 375 380 Thr Met Thr Lys Trp Gln Glu Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr 385 390 395 400 Gly Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile Ser Thr Thr Phe Thr 405 410 415 Thr Asn Leu Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu Gly Asp Cys 420 425 430 Ile Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg Arg 435 440 445 Tyr Asn Ala Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala 450 455 460 Asn Gly Gly Phe Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu 465 470 475 480 Ala Glu Leu Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Arg Lys Pro 485 490 495 Pro Asn Pro Thr Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val 500 505 510 Glu Arg Ile Lys Thr Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe 515 520 525 Thr Tyr Asn His Ile Gln Arg His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val 530 535 540 Ala Ile Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn His Glu Leu Thr Leu Trp Asn 545 550 555 560 Glu Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ser Ala Thr Val Gly 565 570 575 Arg Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser Thr 580 585 590 Cys Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg 595 600 605 Ile Ser Ser Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe 610 615 620 Arg Tyr Glu Asp Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn 625 630 635 640 Asn Glu Leu Arg Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly 645 650 655 His Arg Arg Tyr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu 660 665 670 Tyr Ala Tyr Ser His Gln Leu Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser 675 680 685 Thr Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu Asp His Glu Phe Val 690 695 700 Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys Asp Ser Gly Leu Leu 705 710 715 720 Asp Tyr Thr Glu Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp Leu Arg Phe 725 730 735 Ala Asp Ile Asp Thr Val Ile His Ala Asp Ala Asn Ala Ala Met Phe 740 745 750 Ala Gly Leu Gly Ala Phe Phe Glu Gly Met Gly Asp Leu Gly Arg Ala 755 760 765 Val Gly Lys Val Val Met Gly Ile Val Gly Gly Val Val Ser Ala Val 770 775 780 Ser Gly Val Ser Ser Phe Met Ser Asn Pro Phe Gly Ala Leu Ala Val 785 790 795 800 Gly Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Phe Phe Ala Phe Arg 805 810 815 Tyr Val Met Arg Leu Gln Ser Asn Pro Met Lys Ala Leu Tyr Pro Leu 820 825 830 Thr Thr Lys Glu Leu Lys Asn Pro Thr Asn Pro Asp Ala Ser Gly Glu 835 840 845 Gly Glu Glu Gly Gly Asp Phe Asp Glu Ala Lys Leu Ala Glu Ala Arg 850 855 860 Glu Met Ile Arg Tyr Met Ala Leu Val Ser Ala Met Glu Arg Thr Glu 865 870 875 880 His Lys Ala Lys Lys Lys Gly Thr Ser Ala Leu Leu Ser Ala Lys Val 885 890 895 Thr Asp Met Val Met Arg Lys Arg Arg Asn Thr Asn Tyr Thr Gln Val 900 905 910 Pro Asn Lys Asp Gly Asp Ala Asp Glu Asp Asp Leu 915 920 <210> 57 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gD5_galK_f <400> 57 ttgtcgtcat agtgggcctc catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg cctgttgaca 60 attaatcatc ggca 74 <210> 58 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> scFv_galK_rev <400> 58 gaggcggaca gggagctcgg ggactgggtc atctggatat cggaattctc tcagcactgt 60 cctgctcctt 70 <210> 59 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gDdel30_38for <400> 59 ttgtcgtcat agtgggcctc catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctc 60 tcaagatggc cgaccccaat cgctttcgcg gcaaagacct tccggtcc 108 <210> 60 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> gDdel30_38rev <400> 60 gaggcggaca gggagctcgg ggactgggtc atctggatat cggaattctc cacgcgccgg 60 acccccggag gggtcagctg gtccaggacc ggaaggtctt tgccgcga 108 <210> 61 <211> 652 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the precursor of gD (SEQ ID NO: 4) having deleted amino acids 30 and 38 and inserted the trastuzumab scFv after amino acid 37 with regard to mature gD, as encoded by construct R-321 <400> 61 Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val 1 5 10 15 Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala 20 25 30 Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro 35 40 45 Val Leu Asp Gln Leu Thr Pro Pro Gly Val Arg Arg Val Glu Asn Ser 50 55 60 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 65 70 75 80 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 85 90 95 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 100 105 110 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 115 120 125 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 130 135 140 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 145 150 155 160 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro Met 165 170 175 Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser Glu 180 185 190 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 195 200 205 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr 210 215 220 Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 225 230 235 240 Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 245 250 255 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 260 265 270 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 275 280 285 Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 290 295 300 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly 305 310 315 320 Ser His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Leu 325 330 335 Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val 340 345 350 Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala Ser 355 360 365 Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg 370 375 380 Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu 385 390 395 400 Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro 405 410 415 Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu 420 425 430 Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu 435 440 445 Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu 450 455 460 Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile 465 470 475 480 Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr 485 490 495 Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg 500 505 510 Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys 515 520 525 Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro 530 535 540 Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala 545 550 555 560 Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro Pro Asn 565 570 575 Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His Pro Pro 580 585 590 Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly Ser 595 600 605 Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met Arg Arg 610 615 620 Arg Thr Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg Glu 625 630 635 640 Asp Asp Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr 645 650 <210> 62 <211> 369 <212> PRT <213> Herpes simplex virus 1 <400> 62 Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg 1 5 10 15 Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro Val Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro 20 25 30 Gly Val Arg Arg Val Tyr His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe 35 40 45 Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg 50 55 60 Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile 65 70 75 80 Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr 85 90 95 Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val 100 105 110 Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro 115 120 125 Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val 130 135 140 Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr 145 150 155 160 Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile 165 170 175 Thr Gln Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala 180 185 190 Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr 195 200 205 Gln Gln Gly Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile 210 215 220 Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly 225 230 235 240 Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu 245 250 255 Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro 275 280 285 Gln Ile Pro Pro Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr 290 295 300 Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly 305 310 315 320 Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val 325 330 335 Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu 340 345 350 Pro His Ile Arg Glu Asp Asp Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe 355 360 365 Tyr

Claims (21)

  1. 표적 분자에 결합할 수 있으며 헤르페스 바이러스의 외피에 존재하는 당단백질 B(gB)에 융합되거나 또는 삽입될 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드를 포함하는 재조합 헤르페스 바이러스로서,
    여기에서 리간드는 gB에 융합되거나, 또는
    여기에서 리간드는 gB의 무질서(disordered) 영역 내의 임의의 아미노산에 삽입되지만, 서열번호 1에 따른 gB의 아미노산 77 내지 88에 걸친 영역 내 또는 상동(homologous) gB의 상응하는 영역 내의 임의의 아미노산에는 삽입되지 않고, 또는
    여기에서 리간드는 서열번호 1에 따른 gB의 아미노산 31 내지 77 또는 88 내지 184, 바람직하게는 아미노산 31 내지 77 또는 88 내지 136, 또는 더욱 바람직하게는 31 내지 77 또는 88 내지 108에 걸친 영역 내, 및/또는 아미노산 409 내지 545, 바람직하게는 아미노산 459 내지 545, 또는 더욱 바람직하게는 아미노산 459 내지 497, 또는 여전히 더욱 바람직하게는 아미노산 460 내지 491에 걸친 영역 내의 임의의 아미노산 또는 상동 gB의 상응하는 영역 내의 임의의 아미노산에 삽입되는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  2. 표적 분자에 결합할 수 있으며 헤르페스 바이러스의 외피에 존재하는 당단백질 B(gB)에 삽입될 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드를 포함하는 재조합 헤르페스 바이러스로서,
    여기에서 리간드는 5 내지 120개의 아미노산 길이를 가지며, 서열번호 1에 따른 gB의 아미노산 77 내지 88에 걸친 영역 내 또는 상동 gB의 상응하는 영역 내의 임의의 아미노산에 삽입되는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    헤르페스 바이러스는 표적 분자를 발현하거나 또는 이에 결합하는 세포에 결합하는 능력, 바람직하게는 세포막과 융합하는 능력, 더욱 바람직하게는 세포로 들어가는 능력, 가장 바람직하게는 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 분자는 질병(diseased) 세포 상에 존재하며, 바람직하게는 여기에서 질병 세포는 종양 세포, 감염된 세포, 퇴행성 장애 관련 세포 또는 노화 세포이거나, 또는
    여기에서 표적 세포는 세포 배양물(cell culture)에 존재하는 세포 상에 존재하며, 바람직하게는 여기에서 세포는 헤르페스 바이러스의 성장에 적합한 배양된 세포, 더욱 바람직하게는 헤르페스 성장을 위해 승인된 세포주(cell line), 여전히 더욱 바람직하게는 Vero, 293, 293T, HEp-2, HeLa, BHK 또는 RS 세포, 가장 바람직하게는 Vero 세포인 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    질병 세포 상에 존재하는 표적 분자는 종양 관련 수용체, 바람직하게는 HER2, EGFR, EGFRIII 또는 EGFR3 (ERBB3), EGFRvIII를 포함하는 EGF 수용체 패밀리의 구성원(member), 또는 MET, FAP, PSMA, CXCR4, CEA, CADC, 뮤신, 엽산 결합 단백질(Folate-binding protein), GD2, VEGF 수용체 1 및 2, CD20, CD30, CD33, CD52, CD55, 인테그린 패밀리, IGF1R, 에프린(Ephrin) 수용체 패밀리, 단백질-티로신 키나아제(protein-tyrosine kinase, TK) 패밀리, RANKL, TRAILR1, TRAILR2, IL13Ralpha, UPAR, 테나신(Tenascin), PD-1, PD-L1, CTL-A4, TIM-3, LAG3 또는 IDO를 포함하는 면역 체크포인트 패밀리 수용체의 구성원, 종양 관련 당단백질 72, 강글리오사이드(gangioside) GM2, A33, 루이스 Y 항체 또는 MUC1, 가장 바람직하게는 HER2이고, 또는
    여기에서 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자는 인공(artificial) 분자, 바람직하게는 항체, 항체 유도체 또는 항체 모방체(mimetic), 더욱 바람직하게는 단일-사슬 항체(scFv), 여전히 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 37로 구성되는 GCN4 효모 전자 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 39로 구성되는 scFv, 가장 바람직하게는 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자인 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    리간드는 천연 폴리펩티드 또는 인공 폴리펩티드이고,
    바람직하게는 여기에서 리간드는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 또는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있고,
    더욱 바람직하게는 여기에서 리간드는 세포에 접근 가능한 표적 분자의 천연 리간드, 표적 분자에 결합할 수 있는 천연 리간드의 일부, 천연 폴리펩티드, 항체, 항체 유도체, 항체 모방체의 일부이고,
    더욱 바람직하게는 여기에서 리간드는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 천연 폴리펩티드의 일부 또는 scFv이고,
    여전히 더욱 바람직하게는 여기에서 리간드는 서열번호 37로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부와 같은 GCN4 효모 전자 인자의 일부 또는 종양 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 scFv, 바람직하게는 HER2이고,
    가장 바람직하게는 여기에서 리간드는 서열번호 37의 서열로 표시되는 분자 또는 서열번호 32로 표시되는 scFv인 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 분자는 HER2이고, 리간드는 서열번호 32로 표시되는 scFv이고, 질병 세포는 HER2를 발현하는 종양 세포, 바람직하게는 유방암 세포, 난소암 세포, 위암 세포, 폐암 세포, 두경부암 세포, 골육종 세포, 다형성 신경교모종 세포 또는 침샘 종양 세포이고/이거나, 여기에서 표적 분자는 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자이고, 리간드는 서열번호 37의 서열로 표시되는 분자이고, 세포는 세포 배양물에 존재하며 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자를 발현하는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 리간드는 gB에 융합되거나 또는 삽입되고,
    바람직하게는 여기에서 gB는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드 및 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    헤르페스 바이러스는 변형된 gD 및/또는 변형된 gH를 포함하고,
    바람직하게는 여기에서 gB는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하고, 변형된 gD 및/또는 변형된 gH는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하고,
    가장 바람직하게는 여기에서 gB는 서열번호 37로 표시되는 서열을 포함하고, 표적 분자는 서열번호 41로 표시되는 서열을 갖는 분자이고, 세포는 세포 배양물에 존재하며 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자를 발현하고, 변형된 gD 및/또는 변형된 gH는 서열번호 32로 표시되는 scFv를 포함하고, 표적 분자는 HER2이고, 세포는 HER2를 발현하는 종양 세포, 바람직하게는 유방암 세포, 난소암 세포, 위암 세포, 폐암 세포, 두경부암 세포, 골육종 세포, 다형성 신경교모종 세포 또는 침샘 종양 세포인 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  10. 제9항에 있어서,
    gD는 서열번호 62에 따른 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 영역에 대하여, gD의 아미노산 30 내지 38의 결실 또는 이의 서브셋을 가지도록 변형되고, 바람직하게는 gD는 아미노산 30 및/또는 아미노산 38의 결실을 가지도록 변형되고, 더욱 바람직하게는 gD는 서열번호 62에 따른 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 영역에 대하여 아미노산 30 및 아미노산 38의 결실을 가지도록 변형되는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  11. 제10항에 있어서,
    이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 62에 따른 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 영역에 대하여, 아미노산 30 내지 38 또는 이의 서브셋 대신 gD 내로 삽입되고, 바람직하게는 이종 폴리펩티드 리간드는 아미노산 30 또는 아미노산 38 대신 삽입되고, 더욱 바람직하게는 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 62에 따른 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 영역에 대하여 아미노산 38 대신 삽입되고, 아미노산 30은 결실되는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    헤르페스 바이러스는 세포, 바람직하게는 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 자극하는 하나 이상의 분자를 암호화하는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 헤르페스 바이러스, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하며, 선택적으로 세포, 바람직하게는 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 자극하는 하나 이상의 분자(들)를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양, 감염, 퇴행성 장애 또는 노화 관련 질병의 치료에 사용하기 위하여, 세포, 바람직하게는 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 자극하는 하나 이상의 분자(들)와 조합하여 선택적으로 투여되는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  15. 리간드가 융합되거나 삽입된, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 gB를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 분자.
  16. 제15항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  17. 리간드가 융합되거나 삽입된, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 gB를 포함하는 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 헤르페스 바이러스, 제15항에 따른 핵산 분자, 제16항에 따른 벡터 또는 제17항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 세포.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 헤르페스 바이러스를 이용하여 세포를 감염시키는 방법.
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 헤르페스를 이용하여 세포 배양물에 존재하는 세포에서 재조합 헤르페스 바이러스를 생산하기 위한 시험관 내(in vitro) 방법으로서,
    바람직하게는 여기에서 세포는 표적 분자로서 인공 분자를 발현하거나 이에 결합하며, 더욱 바람직하게는 표적 분자는 항체, 항체 유도체 또는 항체 모방체, 여전히 더욱 바람직하게는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전자 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 37로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 39로 구성되는 scFv, 가장 바람직하게는 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자를 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    재조합 헤르페스 바이러스는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드 및 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 추가의 리간드를 포함하며,
    바람직하게는 여기에서 gB는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하고, 변형된 gD 및/또는 gH는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드를 포함하고,
    가장 바람직하게는 여기에서 gB는 서열번호 37로 표시되는 서열을 포함하고, 표적 분자는 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자이고, 세포는 세포 배양물에 존재하며 서열번호 41의 서열로 표시되는 분자를 발현하고, 변형된 gD 및/또는 gH는 서열번호 32로 표시되는 scFv를 포함하고, 표적 분자는 HER2이고, 세포는 HER2를 발현하는 종양 세포, 바람직하게는 유방암 세포, 난소암 세포, 위암 세포, 폐암 세포, 두경부암 세포, 골육종 세포, 다형성 신경모세포종 세포 또는 침샘 종양 세포인 것인, 시험관 내 방법.
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