CN113929786B

CN113929786B - 新型冠状病毒突变株s蛋白及其亚单位疫苗

Info

Publication number: CN113929786B
Application number: CN202111181856.XA
Authority: CN
Inventors: 徐可; 蓝柯
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2021-04-13
Filing date: 2021-10-11
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2041-10-11
Also published as: CN113234170A; WO2022218272A1; CN113929786A

Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒突变株S蛋白及其亚单位疫苗，所述新型冠状病毒突变株S蛋白的S1/S2两个亚基之间的furin裂解位点682‑RRAR‑685替换为柔性的蛋白linker；所述linker为(GGCAGCGCCAGC)或者(GGCGGCGGCAGC)n或(GGCGGCGGCGGCAGC)n或者(GGC)n；或者linker为GSAS或者(GGGS)n或者(GGGGS)n或者(G)n，其中1≤n≤3，且n为整数；所述新型冠状病毒突变株S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示或者如SEQ ID NO：4所示。该S蛋白具有作为应对SARS‑CoV‑2突变株的疫苗抗原的巨大潜力。

Description

新型冠状病毒突变株S蛋白及其亚单位疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年4月13日提交的中国专利申请CN202110395097.0的优先权，这个专利申请的全部内容在此引入作为参考。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型冠状病毒突变株S蛋白及其亚单位疫苗。

背景技术

目前正在全球大流行的SARS-CoV-2是具有包膜结构的单股正链RNA病毒，极易发生突变。近期出现的SARS-CoV-2突变株由于突变位点在刺突蛋白(S蛋白)上，尤其是位于关键受体结合域(RBD)，可能会加强其与受体ACE2的结合能力，增加病毒的传播力或致病性；同时突变可能会改变抗原的关键表位，使得已筛选的中和抗体亲和力下降，发生免疫逃逸，降低疫苗和中和抗体的保护效果。目前，根据GISAID数据库公布的新冠病毒谱系信息，全球共出现700余种突变，其中传播能力较强，分布广泛的突变株共有7种，即：Alpha(英国B.1.1.7突变株)、Beta(南非B.1.351突变株)、Gamma(巴西P.1突变株)、美国B.1.2突变株、意大利B.1突变株、Eta(尼日利亚B.1.525突变株)以及目前流行优势突变株Delta。

Alpha突变株，其S蛋白上的定义突变有9个。研究表明，接种Moderna mRNA疫苗，Novavax重组蛋白疫苗的血清对Alpha突变株假病毒的中和能力与非突变相比无显著差异。Novavax重组蛋白疫苗的三期临床数据显示，对新冠病毒的保护效力为90％，而对Alpha突变株的保护效力为85％。综上，这些疫苗对Alpha突变株的保护效力可能不变。

Beta突变株，其S蛋白上的定义突变有10个。研究表明，其E484K突变能够显著提高活病毒及假病毒抵抗单克隆中和抗体和疫苗血清能力。此外，Moderna的数据显示疫苗血清针对Beta突变株的中和作用下降了7倍以上，辉瑞的数据同样显示其中和作用显著下降。Novavax重组蛋白疫苗三期临床试验结果显示，对Beta突变株的有效性低于50％。综上，Beta突变株以及具有Beta突变株相似特征的突变株的出现及流行对现有的抗疫策略提出了巨大挑战。

Gamma突变株，其S蛋白上的定义突变有11个，具有与Alpha，Beta突变株相似的特征，包括E484K，N501Y突变，因此可以合理推测其可能存在免疫逃逸。

Delta突变株，其S蛋白上的定突变有6个，其RBD上的突变位点L452R以及T478K是新的突变。研究表明BNT162b2疫苗血清对Delta突变株的中和活性降低5.8倍。其余广泛流行的突变株包括美国B.1.2突变株，意大利B.1突变株，Eta突变株等，开发具有广谱应对现有及未来可能出现的SARS-CoV-2突变株策略迫在眉睫。因此，面对已经出现和未来可能出现的突变株，我们需要开发新型，广谱的通用策略来应对。

基于流感病毒研究经验，我们采取共识序列策略，多种计算方法并行，结合突变株对疫苗和中和抗体的抵抗效果，得到一株具有广谱应对新冠病毒突变株的共识序列，并以此序列作为蓝本，开发针对突变株的S蛋白亚单位疫苗，是目前解决突变株逃逸现有SARS-CoV-2疫苗的最佳选择。

与SARS-CoV-2类似，流感病毒因其血凝素蛋白(HA)及神经氨酸酶(NA)的高突变率，使得现有流感疫苗需要每年更新。越来越多的证据表明，一种亚型流感病毒可能诱导针对其他亚型的交叉反应性免疫反应。因此，理想的情况下，一种共识序列通用疫苗可以预防多种甲型流感病毒亚型或某一亚型内的所有病毒株。前期实验数据表明，一种针对H1N1亚型设计的共识序列CH1所产生的DNA疫苗，能够引起机体对异源H1N1病毒的广泛反应性T细胞和B细胞反应。因此，将共识序列策略应用于防控新冠病毒突变株，具有极大可行性和应用。

因此，亟需开发一种新的有效的针对新型冠状病毒突变株的疫苗。

发明内容

为了解决所述技术问题，本发明提供了一种新型冠状病毒突变株S蛋白及其亚单位疫苗，S1/S2切割位点RRAR经突变以失去被弗林样蛋白酶切割的能力，以保留完整的S蛋白抗原性。

在本发明的第一方面，提供了一种新型冠状病毒突变株S蛋白，所述新型冠状病毒突变株S蛋白的S1/S2两个亚基之间的furin裂解位点682-RRAR-685替换为柔性的蛋白linker；所述linker的核苷酸序列为(GGCAGCGCCAGC)或者(GGCGGCGGCAGC)n或者(GGCGGCGGCGGCAGC)n或者(GGC)n，其中1≤n≤3，且n为整数；

所述linker的氨基酸序列为GSAS或者(GGGS)n或者(GGGGS)n或者(G)n，其中1≤n≤3，且n为整数；

所述新型冠状病毒突变株包括含有共识序列S6突变株和含有共识序列S15突变株；

所述含有共识序列S6突变株中，所述新型冠状病毒突变株S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述含有共识序列S15突变株中，所述新型冠状病毒突变株S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步地，所述新型冠状病毒突变株S蛋白还包括分别在如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的基础上进行如下修饰1-修饰3中的至少一种：

修饰1、将原始信号肽替换为tPA信号肽、CD5信号肽和IgG信号肽中的一种；

修饰2、将C端结构域删除SEQ ID NO：5所示跨膜结构域；

修饰3、所述新型冠状病毒突变株S蛋白跨膜区替换为SEQ ID NO：6所示的T4噬菌体fibritin三聚体基序或SEQ ID NO：7所示的GCN4多聚体形成基序。

进一步地，所述含有共识序列S6突变株中，所述新型冠状病毒突变株S蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述含有共识序列S15突变株中，所述新型冠状病毒突变株S蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO：1所示或者SEQ ID NO：3所示。

在本发明的第三方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体能够表达所述的新型冠状病毒突变株S蛋白。

进一步地，所述重组表达载体的表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或者SEQID NO：3所示。

在本发明的第四方面，提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞包含所述的重组表达载体。

在本发明的第五方面，提供了一种新型冠状病毒突变株S蛋白的制备方法，所述方法包括：

获得所述的重组表达载体；

将所述重组表达载体转染至细胞中，并通过细胞群的谷氨酰胺抗性筛选以及单克隆筛选，获得稳定表达重组S蛋白的细胞株；

将所述细胞株进行分泌表达和纯化，获得纯化的重组新型冠状病毒突变株S蛋白。

在本发明的第六方面，提供了一种新型冠状病毒突变株亚单位疫苗，所述新型冠状病毒突变株亚单位疫苗包含所述的重组S蛋白以及药学上接受的佐剂。

进一步，所述佐剂包括氢氧化铝、卵磷脂、弗氏佐剂、MPLTM、IL-12、氢氧化铝联合CpG ODN复合佐剂、ISA51VG、ISA720VG、MF59、QS21、AS03佐剂中的至少一种。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供的新型冠状病毒突变株S蛋白及其亚单位疫苗，本发明通过四种策略，我们得到了具有6个典型突变(69-HV-70缺失，Y144位缺失，E484K，N501Y，D614G，P681H)的S蛋白共识序列(S6)以及具有15个特征突变(69-HV-70缺失，Y144缺失，242-LAL-244缺失，并且含有A222V、K417N、L452R、E484K、N501Y、A570D、D614G、Q677H、P681H、T716I、S982A、D1118H)的S蛋白共识序列(S15)。此外，为了使携带上述突变的序列克隆到真核细胞表达载体后高效表达，我们使用了JAVACodonAdapation软件对S表达基因的密码子进行了哺乳动物偏好的密码子优化。同时将原始株中S蛋白Furin切割位点由RRAR突变为GSAS或者GS组合、(GGGS)n或者(GGGGS)n或者(G)n(其中1≤n≤3，且n为整数)，保持S蛋白的完整性。再次，我们将S蛋白共识序列(S6和S15)C端中的跨膜膜结构域突变为T4噬菌体次要纤维蛋白(Fibritin)的三聚体折叠结构域或GCN4多聚体形成基序，增强三聚体的形成。最后获得了SEQ.NO.1和SEQ.NO.3的序列的核酸分子，将其克隆到哺乳动物细胞表达载体后，转染哺乳动物细胞，可以表达氨基酸序列为SEQ.NO.2及SEQ.NO.4的重组S蛋白。该S蛋白具有目前SARS-CoV-2流行突变株的S蛋白重要的突变类型，因此该重组蛋白具有作为应对SARS-CoV-2突变株的疫苗抗原的巨大潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为截至2021-3-7日迅速传播的重要病原株的频率分析；

图2为NCBI数据库(截至2021年2月28日)S蛋白序列系统发育树；

图3为四种策略计算S蛋白特征突变所占比例；

图4为S蛋白序列功能区及策略四示意图；

图5为共识序列在S蛋白系统发育树中的位置；

图6为共识序列S6模式图，含有HV69-70缺失、Y144位缺失、E484K、N501Y、D614G、P681H，共6个突变位点；

图7为共识序列S15模式图，含有69-HV-70缺失、Y144缺失、242-LAL-244缺失、A222V、K417N、L452R、E484K、N501Y、A570D、D614G、Q677H、P681H、T716I、S982A、D1118H，共15个突变位点。

图8为原型株S疫苗、S6以及S15疫苗二次免疫14天后小鼠血清ELISA；

图9为原型株S疫苗、S6疫苗二次免疫小鼠血清对原型株以及7株突变株假病毒中和实验；其中，图9A为S原型株疫苗二次免疫后的小鼠血清对原型株假病毒以及D614G突变株具有较高的中和活性的结果；图9B为S6疫苗二次免疫小鼠血清对新冠原型株以及D614G、Alpha、Beta、Gamma、Eta、Kappa、Delta突变株假病毒均有较高的中和活性的结果；

图10为S15疫苗二次免疫小鼠血清对6株突变株假病毒中和实验。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

本申请人针对这些突变株，我们采取了四种不同的策略，通过软件预测比较突变株的共识序列。我们得到了具有6个典型突变(69-HV-70缺失，Y144位缺失，E484K，N501Y，D614G，P681H)的S蛋白共识序列(S6)以及具有15个特征突变(69-HV-70缺失，Y144缺失，242-LAL-244缺失，并且含有A222V、K417N、L452R、E484K、N501Y、A570D、D614G、Q677H、P681H、T716I、S982A、D1118H)的S蛋白共识序列(S15)。

根据本发明实施例一种典型的实施方式，提供一种新型冠状病毒突变株S蛋白，所述新型冠状病毒突变株S蛋白的S1/S2两个亚基之间的furin裂解位点682-RRAR-685替换为柔性的蛋白linker；所述linker的核苷酸序列为(GGCAGCGCCAGC)或者(GGCGGCGGCAGC)n或者(GGCGGCGGCGGCAGC)n或者(GGC)n，其中1≤n≤3，且n为整数；

所述linker的氨基酸序列为GSAS或者(GGGS)n或者(GGGGS)n或者(G)n，其中1≤n≤3，且n为整数；如果linker为(G)n，n可适当长些，1≤n≤10，且n为整数；

本申请的核心在于(1)获得含有共识序列S6和含有共识序列S15，一种共识序列通用疫苗可以预防多种新冠病毒突变株。(2)将S1/S2切割位点RRAR经突变以失去被弗林样蛋白酶切割的能力，以保留完整的S蛋白抗原性，本发明的免疫原S蛋白多肽具有稳定的融合前构象，将S1/S2两个亚基之间的Furin裂解位点682-RRAR-685替换为柔性的蛋白linker，如以G(Gly)甘氨酸和S(Ser)丝氨酸构成的GSAS、GS组合、(GGGS)_n或者(GGGGS)_n或者(G)_n，其中1≤n≤3，且n为整数通过n来调整linker的长度和效果；或者所述linker为(GGCAGCGCCAGC)或者(GGCGGCGGCAGC)n或者(GGCGGCGGCGGCAGC)n或者(GGC)n，其中1≤n≤3，且n为整数；

在本发明实施例中，所述linker具有较好的保护剪切的效果，能更好地保持不被剪切的S蛋白形式。

其次，我们将S蛋白共识序列(S6和S15)C端中的跨膜膜结构域突变为T4噬菌体次要纤维蛋白(Fibritin)的三聚体折叠结构域或GCN4多聚体形成基序，增强三聚体的形成。

作为一种可选的实施方式，所述新型冠状病毒突变株S蛋白还包括分别在如SEQID NO：2所示氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的基础上进行如下修饰1-修饰3中的至少一种：

修饰1、将原始信号肽替换为tPA信号肽、CD5信号肽和IgG信号肽中的一种；该序列采用分泌性信号肽以保证S蛋白可以在哺乳动物细胞的培养上清中分泌表达，选用tPA信号肽以及S蛋白天然信号肽以及IgG信号肽以及CD5信号肽，最优的选择tPA信号肽。

修饰2、将C端结构域删除SEQ ID NO：5所示跨膜结构域。目的在于促进所述重组S蛋白的分泌表达；

以上修饰1-修饰3中的一种或多种，其中任何一种排列组合的方案，均在本发明的保护范围之内。

再次，为了在真核细胞中高效表达，我们使用了JAVACodonAdapation软件对S表达基因的密码子进行了哺乳动物偏好的密码子优化，在一些实施方案中，本申请选用了JAVACodonAdapation软件对S表达基因的密码子进行了优化，获得了在哺乳动物细胞中表达效率比天然S基因更高的表达效率。所述含有共识序列S6突变株中，所述新型冠状病毒突变株S蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供一种核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或者SEQ ID NO：3所示。含有所述核酸分子的生物材料也在本发明的保护范围之内，所述生物材料包括重组DNA、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和工程菌中的一种。

根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体能够表达所述的新型冠状病毒突变株S蛋白。

根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供一种工程化细胞，所述工程化细胞包含所述的重组表达载体。所述工程化细胞可选用悬浮细胞，包括CHO系列和293、293FT等人用疫苗哺乳动物细胞株都在本发明的保护范围之内，具体地，本发明实施例使用CHO-K1细胞，通过将上述S基因转染该细胞并获得稳定表达细胞株，高效表达重组的S蛋白。

根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供一种新型冠状病毒突变株S蛋白的制备方法，所述方法包括：

获得所述的重组表达载体；

根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供一种新型冠状病毒突变株亚单位疫苗，所述新型冠状病毒突变株亚单位疫苗包含所述的重组S蛋白以及药学上接受的佐剂。

所述佐剂包括氢氧化铝、卵磷脂、弗氏佐剂、MPLTM、IL-12、氢氧化铝联合CpG ODN复合佐剂、ISA51VG、ISA720VG、MF59、QS21、AS03佐剂中的至少一种。在其他实施方式中，所述佐剂也可选用其他形式的佐剂。

所述新型冠状病毒突变株亚单位疫苗可以制备成滴鼻剂、喷雾剂和肌肉注射剂。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。

实施例一、共识序列的预测

由于SARS-CoV-2的高突变性，尤其是突变位点在S蛋白上关键受体结合域(RBD)，可能会加强其与受体ACE2的结合能力，增加病毒的传播力或致病性；同时突变可能会改变抗原的关键表位，使得已筛选的中和抗体亲和力下降，或降低疫苗和中和抗体的保护效果，目前SARS-CoV-2已经演化出多种类型的突变(图1)。针对这些突变株，我们采取了四种不同的策略，通过软件预测比较突变株的共识序列。

1、策略一：

我们从NCBI数据库(截至2021年2月28日)下载了2674个(已去重)新冠病毒S蛋白序列，并使用MEGA7.0软件通过邻接法构建了这些S蛋白的系统发育树(图2)。可将S蛋白序列分为5个Clade，其中Clade 1包含2539条序列，含有Gamma突变株，美国B.1.2突变株等序列。Clade 2-3共包含56条序列，含有Alpha，Beta，Eta突变株等，Clade4-5包含80条序列，包含具有其余特征的突变株。因此，此数据库较完整且具有可信度。Clade 1中2539条序列亲缘关系较近且占数据库95％权重，我们采用计算1(Clade 1共识序列)+136条序列(Clade2-5)同时序列的方式，得到含69-70缺失，614G特征的共识序列。通过snapgene软件评估其余特征突变占总数据库的比例，记录于图3c1列。

2、策略二：

我们从NCBI数据库下载了1453个(2021年3月1日-3月15日，已去重)新冠病毒S蛋白序列，并使用snapgene软件通过Clustal Omega比对，计算特征突变占总数据库的比例(图3c2列)。此策略优势在于可评估近期新出现的重要突变病原株频率，一定程度上代表未来发展趋势。

3、策略三：

我们从GISAID数据库下载了11万余条(截至2021年3月12日，已去重)新冠病毒S蛋白序列，由于现有商业化，临床使用的中和抗体的抗原表位主要位于S蛋白的N端区域(NTD)以及RBD区域，因此我们使用Mega 7.0比对后删除534-1273号氨基酸后经去重得到3419条S蛋白(NTD+RBD)序列，并使用snapgene软件通过Clustal Omega比对，计算特征突变占总数据库的比例(图3c3列)。此策略优势在于集中发生在NTD及RBD的突变，一定程度上反应突变位点对疫苗及抗体的潜在影响力。

4、策略四：

我们从GISAID数据库下载了11万余条(截至2021年3月12日，已去重)新冠病毒S蛋白序列，将S蛋白根据功能区域分为4个部分，包括NTD,RBD,S1/S2 cleavage domain以及S2区域(图4)。分别使用snapgene软件通过Clustal Omega比对，计算特征突变占总数据库的比例(图3c4列)。经去重后，NTD区域包含4817条序列，RBD区域包含1312条序列，S1/S2cleavage domain区域包含1294条序列，S2区域包含5513条序列。此策略优势在于进一步集中突变的频率，稀释了其余位置存在的连锁突变或协同突变带来的影响，主要反应了该S蛋白位点发生突变的频率。

综上，通过四种策略，我们得到了各突变株特征突变所占比例(图3)，其中多种方法均占较大比例的突变位点，包括HV69-70缺失，Y144位缺失，N501Y，D614G，P681H共5个特征，结合假病毒中和实验结果，E484K具有显著抵抗中和抗体，疫苗血清的能力，因此将其纳入共识序列范围。此外，如A222V，L452R，A570D，Q677H，T716I，S982A，D1118H突变，在两种策略中具有较高比例，同时结合假病毒中和实验结果，242-244缺失，K417N具有抵抗中和抗体的能力，因此将其纳入S15共识序列范围。根据抗原表位预测软件(包括IMED预测，IEDB预测，BepiPred-2.0服务器)结果，位于S2的突变位点并不位于高分抗原表位区，因此将其排除于S6，但保存于S15。综上，我们得到了具有6个特征突变(HV69-70缺失，Y144位缺失，E484K，N501Y，D614G，P681H)的S蛋白共识序列(S6)，以及具有15个特征突变的S15。我们将此序列带入S蛋白系统发育树，发现其位于Clade 3中(图5)，共识序列S6与SARS-CoV-2/human/USA/FL-CDC-STM-000008237/2021序列(GenBank：MW596211.1)具有99.76％的相似度，S15位于Clade 5中(图5)，S15与SARS-CoV-2-Spike protein(PDB：7LWS_A)序列具有99.03％的相似度。共识序列与B.1.1.7谱系更为相似，结合了多株突变株的特征，因此具有广谱应对新冠病毒突变株的能力。

5、共识序列(S6&S15)的序列

通过四种策略，我们得到了具有6个典型突变(69-HV-70缺失，Y144位缺失，E484K，N501Y，D614G，P681H)的S蛋白共识序列(S6)以及具有15个特征突变(69-HV-70缺失，Y144缺失，242-LAL-244缺失，并且含有A222V、K417N、L452R、E484K、N501Y、A570D、D614G、Q677H、P681H、T716I、S982A、D1118H)的S蛋白共识序列(S15)。

实施例二、重组S蛋白载体构建与表达优化

1、哺乳动物细胞上清表达的S蛋白基因的构建

本发明的S蛋白表达基因的构建示意图见图6和图7。

图6：共识序列S6模式图。该序列包含缺失69-70以及144位氨基酸，并且含有E484K、N501Y、D614G、P681H突变。同时为保持重组S蛋白完整性，将Furin剪切位点突变为GSAS、GS组合、或者(GGGS)n或者(GGGGS)n或者(G)n，随n数值变化，S1与S2连接的linker长度也变化。为保证重组S蛋白以天然三聚体形式分泌表达，将C端跨膜结构域替换为T4噬菌体Fibritin三聚体基序或GCN4多聚体形成基序。

图7：共识序列S15模式图。该序列包含缺失69-70，144以及242-244位氨基酸，并且含有A222V、K417N、L452R、E484K、N501Y、A570D、D614G、Q677H、P681H、T716I、S982A、D1118H突变。同时为保持重组S蛋白完整性，将Furin剪切位点突变为GSAS、GS组合、(GGGS)n或者(GGGGS)n或者(G)n，随n数值变化，S1与S2连接的linker长度也变化。为保证重组S蛋白以天然三聚体形式分泌表达，将C端跨膜结构域替换为T4噬菌体Fibritin三聚体基序。

此外，为了使携带上述突变的序列克隆到真核细胞表达载体后高效表达，我们使用了JAVACodonAdapation软件对S表达基因的密码子进行了哺乳动物偏好的密码子优化。同时将原始株中S蛋白Furin切割位点由RRAR突变为GSAS或者GS组合、(GGGS)n或者(GGGGS)n或者(G)n(其中1≤n≤3，且n为整数)，保持S蛋白的完整性。

再次，我们将S蛋白共识序列(S6和S15)C端中的跨膜膜结构域突变为T4噬菌体次要纤维蛋白(Fibritin)的三聚体折叠结构域或GCN4多聚体形成基序，增强三聚体的形成。

我们通过委托金斯瑞生物科技股份有限公司合成了SEQ.NO.1和SEQ.NO.3的序列，将其克隆到哺乳动物细胞表达载体如pC-GS(由promega公司的pC-neo载体改造，加入GS表达标签)后，转染哺乳动物细胞，可以表达氨基酸序列为SEQ.NO.2及SEQ.NO.4的重组S蛋白。该S蛋白具有目前SARS-CoV-2流行突变株的S蛋白重要的突变类型，因此该重组蛋白具有作为应对SARS-CoV-2突变株的疫苗抗原的巨大潜力。

2、分泌表达重组S蛋白的CHO-K1细胞株构建

将上述(1)中构建的S基因(所述S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或者SEQID NO：3所示)克隆至到哺乳动物细胞表达载体如pC-GS(由promega公司的pC-neo载体改造，加入GS表达标签)后，获得S6基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中linker的氨基酸序列具体采用GSAS，对应的核苷酸序列为GGCAGCGCCAGC)和S15基因(核苷酸序列如SEQID NO：3所示，其中linker的氨基酸序列具体采用GSAS，对应的核苷酸序列为GGCAGCGCCAGC)的表达质粒；具体步骤为：pC-GS载体利用限制性内切酶NheI以及SmaI(Thermo Fisher)酶切，S6基因和S15基因则用NheI以及EcorV(Thermo Fisher)酶切，然后通过琼脂糖凝胶电泳分别回收已经酶切好的载体以及S6基因和S15基因，再利用T4连接酶(New EnglandBiolabs)链接，随后转化进感受态DH5，挑单克隆并鉴定正确的pC-GS-S克隆，即得到S6基因表达质粒和S15基因表达质粒。

将上述S基因表达质粒通过电转仪(Biorad公司)电穿孔方式转染至CHO-K1细胞(武汉大学中国典型培养物保藏中心)中。电穿孔转染操作方案：取1×10⁷个细胞到800μLCHO-CD1无血清培养基(上海培源生物科技股份有限公司)中重悬，加入40μg质粒混匀，转移上述培养液至电转杯(Biorad公司)中，设置电转程序为电压300V，电容960μF，电阻∞，指数脉冲。电击完毕，取出培养液至CHO-CD1培养基，调整细胞浓度为5×10⁵个/mL。电转后每天检测细胞密度以及存活率，当细胞浓度开始稳定增长至1×10⁶个/mL时，证明细胞株完成建系。通过有限稀释法进行筛选，挑选克隆株分别扩大培养，进一步筛选优势细胞株。优势株扩大培养后，接种细胞进行细胞生长周期检测。

将上述S基因表达质粒转染哺乳动物细胞，可以表达氨基酸序列为SEQ.NO.2及SEQ.NO.4的重组S蛋白，即为重组S6蛋白和重组S15蛋白。该S蛋白具有目前SARS-CoV-2流行突变株的S蛋白重要的突变类型，因此该重组蛋白具有作为应对SARS-CoV-2突变株的疫苗抗原的巨大潜力。

实施例三、重组S6/S15蛋白三聚体疫苗免疫与效果鉴定

1、小鼠的免疫流程

本实验所用小鼠为K18-hACE雌鼠，6-8周，19-25g，从江苏集萃药康生物科技有限公司购入，所有动物实验操作在SPF实验室进行。S6疫苗实验组，共12只小鼠；S15疫苗实验组，共5只小鼠；原型株S疫苗实验组，共12只小鼠；对照组接种PBS，共12只小鼠。接种第一针疫苗后14天接种第二针，接种第一针后28天(即接种第二针后14天)，对所有小鼠进行眼眶取血。取小鼠血清用于检验血清中和抗体滴度。

2、本发明疫苗免疫的小鼠血清中含有极高的anti-S IgG

为了验证设计的疫苗能诱导小鼠产生特异性抗体，将制备的重组S6或S15疫苗、S原型株疫苗免疫小鼠，对照组小鼠接种等体积PBS。接种第一针后28天(即接种第二针后14天)，对所有小鼠进行眼眶取血。随后将制备的24份疫苗组小鼠血清和12份对照组小鼠血清按1：500稀释，用于酶联免疫反应(ELISA)检测血清中特异性抗体的含量。

所述ELISA检测流程具体为：

(1)用0.1M碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)稀释S蛋白(义翘神州科技有限公司)，使终浓度为1ng/μL，再向96孔酶标板的各孔加入100μL，使每孔最终含有100ng S蛋白。4℃孵育过夜。

(2)弃包被液，每孔加250μL的0.05％的PBST(莫纳生物科技有限公司)洗涤。洗涤3次，每次5分钟。

(3)再向每孔加入200μL的5％脱脂牛奶(用0.05％PBST配制)，进行封闭，37℃孵育2小时。

(4)用5％脱脂牛奶对疫苗组和对照组小鼠的血清样品进行1：500稀释。弃封闭液，每孔加入100μL已经稀释的小鼠血清，每份小鼠血清做三次重复，37℃孵育2小时。

(5)弃血清，每孔加200μL的0.05％的PBST进行洗涤。洗涤3次，每次5分钟。

(6)用5％脱脂牛奶以1：1000比例稀释羊抗鼠IgG二抗(博尔西科技有限公司)。向每孔加入100μL稀释后的二抗。37℃孵育2h。

(7)弃二抗，每孔加200μL的0.05％的PBST进行洗涤。洗涤3次，每次5分钟。

(8)再向每孔加入100μL的酶作用底物(Hcm TMB One)，室温避光显色10分钟。每孔加入50μL 1M HCl终止反应。放入酶标仪中检测OD450的值。

实验结果如图8所示。结果表明，在1：500稀释倍数下，S6和S15疫苗组小鼠血清与新冠病毒S蛋白反应的OD450值显著高于PBS对照组小鼠血清。这说明本发明制备的疫苗能够诱导小鼠产生极高的针对S蛋白的特异性抗体。

3、本发明疫苗对新冠突变株假病毒具有极高中和活性

为了对比本疫苗产生的抗体以及S原型株疫苗对新冠不同突变株假病毒的中和活性，将本疫苗二次免疫的小鼠血清以及S原型株疫苗小鼠血清进行假病毒中和实验。其中，S原型株疫苗的制备过程为：将构建的S基因(所述S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示)克隆至表达载体pC-GS(由promega公司的pC-neo载体改造，加入GS表达标签)中，得到带有谷氨酰胺合成酶(GS)筛选标签的表达载体。具体步骤为：将pC-GS载体利用限制性内切酶NheI以及SmaI(Thermo Fisher)酶切，S基因则用NheI以及EcorV(Thermo Fisher)酶切，然后通过琼脂糖凝胶电泳分别回收已经酶切好的载体以及S基因，再利用T4连接酶(NewEngland Biolabs)链接，随后转化进感受态DH5，挑单克隆并鉴定正确的pC-GS-S克隆，即得到S基因表达质粒。后将S基因表达质粒通过电转仪(Biorad公司)电穿孔方式转染至CHO-K1细胞，经细胞表达后获得S原型株疫苗。

VSV骨架新冠假病毒包装流程与假病毒中和实验具体步骤为：

(1)假病毒包装：新冠病毒原型株Spike蛋白表达质粒Sdel-18以及在此基础上构建的D614G、Alpha、Beta、Gamma、Eta、Kappa、Delta突变株Spike蛋白表达质粒转染Vero E6细胞(15μg/10cm dish)，转染后48h，用种子病毒VSV-DG-Luc(质粒来源夏宁邵教授实验室)感染细胞(300μL/10cm dish)。感染1h后，吸弃病毒液，换为含有VSV-G抗体(1：1000)的新鲜完全培养基。37℃培养24h，收取细胞上清，分装假病毒，冻存于-80℃备用。

其中，所述新冠病毒原型株Spike蛋白表达质粒Sdel-18(尾端删除18个氨基酸)来源夏宁邵教授实验室，具体见文献《Xiong HL,WuYT,Cao JL,Yang R,LiuYX,Ma J,Qiao XY,Yao XY,Zhang BH,Zhang YL,Hou WH,Shi Y,Xu JJ,Zhang L,Wang SJ,Fu BR,Yang T,GeSX,Zhang J,Yuan Q,Huang BY,Li ZY,Zhang TY,XiaNS.Robust neutralization assaybased on SARS-CoV-2S-protein-bearing vesicular stomatitis virus(VSV)pseudovirus and ACE2-overexpressing BHK21 cells.Emerg MicrobesInfect.2020Dec；9(1):2105-2113.doi:10.1080/22221751.2020.1815589.PMID:32893735；PMCID:PMC7534347.》；所述D614G、Alpha、Beta、Gamma、Eta、Kappa、Delta突变株Spike蛋白表达质粒的构建过程为：在新冠病毒原型株Spike蛋白表达质粒Sdel-18上采用常规的方法分别对相应的位点进行突变即得；

(2)取疫苗二次免疫组以及灭活疫苗小鼠血清，进行1：100、1：900、1：2700、1：8100、1：24300、1：72900、1：218700、1：656100倍和1：1968300稀释。将稀释完毕的血清与VSV骨架新冠假病毒进行中和实验，测定小鼠血清中S蛋白特异性抗体的中和活性。

假病毒中和实验具体步骤为：

①接种BHK-21ACE2细胞(来自武汉大学中国典型培养物保藏中心)于96孔板中，待细胞聚合度达到90％，进行实验。

②小鼠血清56℃，30min去除补体。

③用感染培养基(DMEM+2％FBS+1％PS)梯度稀释小鼠血清。

④用感染培养基(DMEM+2％FBS+1％PS)稀释假病毒，假病毒(v)：总体积(v)＝1：10。

⑤血清稀释液与假病毒稀释液等比混合(50L+50L每孔)，37℃孵育1h。

⑥用PBS清洗BHK-21ACE2细胞两次。

⑦血清与假病毒混合液加入细胞，37℃培养24h，裂解细胞，加入萤火虫荧光素酶底物(Promega)，用Varioskan LUX多功能微孔板读数仪(Thermo fisher)测定萤火虫荧光素酶活性。

实验结果如图9和图10所示：

图9A结果显示，S原型株疫苗二次免疫后的小鼠血清对原型株假病毒以及D614G突变株具有较高的中和活性，但是血清对Alpha、Beta、Gamma、Eta、Kappa、Delta突变株假病毒的中和活性下降明显，尤其是对目前流行的Delta株中和活性下降约12.88倍。说明S原型株疫苗应对现在流行的Delta突变株保护效果下降非常明显。

图9B结果显示，S6疫苗二次免疫小鼠血清对新冠原型株以及D614G、Alpha、Beta、Gamma、Eta、Kappa、Delta突变株假病毒均有较高的中和活性。这表明，接种S6亚单位疫苗的小鼠可以产生对新冠突变株病毒广谱的、高水平的中和抗体。

图10结果显示，S15疫苗二次免疫小鼠血清对D614G、Alpha、Beta、Gamma、Eta、Delta突变株假病毒均有较高的中和活性，对上述不同突变株假病毒的中和活性远高于S原型株疫苗小鼠血清。表明S15疫苗接种后同样可以诱导产生针对新冠突变株广谱、高水平的中和抗体。

综上，本发明设计到的两种疫苗均可以诱导产生对新冠原型株以及目前流行的Delta突变株中和效果更好，广谱且滴度更高的特异性抗体。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 新型冠状病毒突变株S蛋白及其亚单位疫苗

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3688

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (2035)..(2035)

<223> r=(ggcagcgccagc)或者(ggcggcggcagc)n或者(ggcggcggcggcagc)n或者(ggc)n，其中1≤n≤3，且n为整数

<400> 1

atgttcgtgt tcctggtgct gctgcccctg gtgagcagcc agtgcgtgaa cctgaccacc 60

cgcacccagc tgccccccgc ctacaccaac agcttcaccc gcggcgtgta ctaccccgac 120

aaggtgttcc gcagcagcgt gctgcacagc acccaggacc tgttcctgcc cttcttcagc 180

aacgtgacct ggttccacgc catcagcggc accaacggca ccaagcgctt cgacaacccc 240

gtgctgccct tcaacgacgg cgtgtacttc gccagcaccg agaagagcaa catcatccgc 300

ggctggatct tcggcaccac cctggacagc aagacccaga gcctgctgat cgtgaacaac 360

gccaccaacg tggtgatcaa ggtgtgcgag ttccagttct gcaacgaccc cttcctgggc 420

gtgtaccaca agaacaacaa gagctggatg gagagcgagt tccgcgtgta cagcagcgcc 480

aacaactgca ccttcgagta cgtgagccag cccttcctga tggacctgga gggcaagcag 540

ggcaacttca agaacctgcg cgagttcgtg ttcaagaaca tcgacggcta cttcaagatc 600

tacagcaagc acacccccat caacctggtg cgcgacctgc cccagggctt cagcgccctg 660

gagcccctgg tggacctgcc catcggcatc aacatcaccc gcttccagac cctgctggcc 720

ctgcaccgca gctacctgac ccccggcgac agcagcagcg gctggaccgc cggcgccgcc 780

gcctactacg tgggctacct gcagccccgc accttcctgc tgaagtacaa cgagaacggc 840

accatcaccg acgccgtgga ctgcgccctg gaccccctga gcgagaccaa gtgcaccctg 900

aagagcttca ccgtggagaa gggcatctac cagaccagca acttccgcgt gcagcccacc 960

gagagcatcg tgcgcttccc caacatcacc aacctgtgcc ccttcggcga ggtgttcaac 1020

gccacccgct tcgccagcgt gtacgcctgg aaccgcaagc gcatcagcaa ctgcgtggcc 1080

gactacagcg tgctgtacaa cagcgccagc ttcagcacct tcaagtgcta cggcgtgagc 1140

cccaccaagc tgaacgacct gtgcttcacc aacgtgtacg ccgacagctt cgtgatccgc 1200

ggcgacgagg tgcgccagat cgcccccggc cagaccggca agatcgccga ctacaactac 1260

aagctgcccg acgacttcac cggctgcgtg atcgcctgga acagcaacaa cctggacagc 1320

aaggtgggcg gcaactacaa ctacctgtac cgcctgttcc gcaagagcaa cctgaagccc 1380

ttcgagcgcg acatcagcac cgagatctac caggccggca gcaccccctg caacggcgtg 1440

aagggcttca actgctactt ccccctgcag agctacggct tccagcccac ctacggcgtg 1500

ggctaccagc cctaccgcgt ggtggtgctg agcttcgagc tgctgcacgc ccccgccacc 1560

gtgtgcggcc ccaagaagag caccaacctg gtgaagaaca agtgcgtgaa cttcaacttc 1620

aacggcctga ccggcaccgg cgtgctgacc gagagcaaca agaagttcct gcccttccag 1680

cagttcggcc gcgacatcgc cgacaccacc gacgccgtgc gcgaccccca gaccctggag 1740

atcctggaca tcaccccctg cagcttcggc ggcgtgagcg tgatcacccc cggcaccaac 1800

accagcaacc aggtggccgt gctgtaccag ggcgtgaact gcaccgaggt gcccgtggcc 1860

atccacgccg accagctgac ccccacctgg cgcgtgtaca gcaccggcag caacgtgttc 1920

cagacccgcg ccggctgcct gatcggcgcc gagcacgtga acaacagcta cgagtgcgac 1980

atccccatcg gcgccggcat ctgcgccagc taccagaccc agaccaacag ccacragcgt 2040

ggccagccag agcatcatcg cctacaccat gagcctgggc gccgagaaca gcgtggccta 2100

cagcaacaac agcatcgcca tccccaccaa cttcaccatc agcgtgacca ccgagatcct 2160

gcccgtgagc atgaccaaga ccagcgtgga ctgcaccatg tacatctgcg gcgacagcac 2220

cgagtgcagc aacctgctgc tgcagtacgg cagcttctgc acccagctga accgcgccct 2280

gaccggcatc gccgtggagc aggacaagaa cacccaggag gtgttcgccc aggtgaagca 2340

gatctacaag acccccccca tcaaggactt cggcggcttc aacttcagcc agatcctgcc 2400

cgaccccagc aagcccagca agcgcagctt catcgaggac ctgctgttca acaaggtgac 2460

cctggccgac gccggcttca tcaagcagta cggcgactgc ctgggcgaca tcgccgcccg 2520

cgacctgatc tgcgcccaga agttcaacgg cctgaccgtg ctgccccccc tgctgaccga 2580

cgagatgatc gcccagtaca ccagcgccct gctggccggc accatcacca gcggctggac 2640

cttcggcgcc ggcgccgccc tgcagatccc cttcgccatg cagatggcct accgcttcaa 2700

cggcatcggc gtgacccaga acgtgctgta cgagaaccag aagctgatcg ccaaccagtt 2760

caacagcgcc atcggcaaga tccaggacag cctgagcagc accgccagcg ccctgggcaa 2820

gctgcaggac gtggtgaacc agaacgccca ggccctgaac accctggtga agcagctgag 2880

cagcaacttc ggcgccatca gcagcgtgct gaacgacatc ctgagccgcc tggacaaggt 2940

ggaggccgag gtgcagatcg accgcctgat caccggccgc ctgcagagcc tgcagaccta 3000

cgtgacccag cagctgatcc gcgccgccga gatccgcgcc agcgccaacc tggccgccac 3060

caagatgagc gagtgcgtgc tgggccagag caagcgcgtg gacttctgcg gcaagggcta 3120

ccacctgatg agcttccccc agagcgcccc ccacggcgtg gtgttcctgc acgtgaccta 3180

cgtgcccgcc caggagaaga acttcaccac cgcccccgcc atctgccacg acggcaaggc 3240

ccacttcccc cgcgagggcg tgttcgtgag caacggcacc cactggttcg tgacccagcg 3300

caacttctac gagccccaga tcatcaccac cgacaacacc ttcgtgagcg gcaactgcga 3360

cgtggtgatc ggcatcgtga acaacaccgt gtacgacccc ctgcagcccg agctggacag 3420

cttcaaggag gagctggaca agtacttcaa gaaccacacc agccccgacg tggacctggg 3480

cgacatcagc ggcatcaacg ccagcgtggt gaacatccag aaggagatcg accgcctgaa 3540

cgaggtggcc aagaacctga acgagagcct gatcgacctg caggagctgg gcaagtacga 3600

gcagggctac atccccgagg ccccccgcga cggccaggcc tacgtgcgca aggacggcga 3660

gtgggtgctg ctgagcacct tcctgtga 3688

<210> 2

<211> 1229

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<222> (679)..(679)

<223> Xaa=GSAS或者(GGGS)n或者(GGGGS)n或者(G)n，其中1≤n≤3，且n为整数

<220>

<221> UNSURE

<222> (679)..(679)

<223> The 'Xaa' at location 679 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 2

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro

65 70 75 80

Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser

85 90 95

Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val

115 120 125

Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr His Lys

130 135 140

Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala

145 150 155 160

Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu

165 170 175

Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys

180 185 190

Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn

195 200 205

Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val

210 215 220

Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala

225 230 235 240

Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr

245 250 255

Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe

260 265 270

Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys

275 280 285

Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr

290 295 300

Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr

305 310 315 320

Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly

325 330 335

Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg

340 345 350

Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser

355 360 365

Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu

370 375 380

Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg

385 390 395 400

Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala

405 410 415

Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala

420 425 430

Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr

435 440 445

Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp

450 455 460

Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val

465 470 475 480

Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro

485 490 495

Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe

500 505 510

Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr

515 520 525

Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr

530 535 540

Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln

545 550 555 560

Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro

565 570 575

Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val

580 585 590

Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu

595 600 605

Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp

610 615 620

Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe

625 630 635 640

Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser

645 650 655

Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln

660 665 670

Thr Gln Thr Asn Ser His Xaa Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala

675 680 685

Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn

690 695 700

Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile

705 710 715 720

Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile

725 730 735

Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser

740 745 750

Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln

755 760 765

Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys

770 775 780

Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu

785 790 795 800

Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu

805 810 815

Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly

820 825 830

Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys

835 840 845

Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile

850 855 860

Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp

865 870 875 880

Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met

885 890 895

Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu

900 905 910

Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile

915 920 925

Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp

930 935 940

Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu

945 950 955 960

Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser

965 970 975

Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr

980 985 990

Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg

995 1000 1005

Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser

1010 1015 1020

Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly

1025 1030 1035 1040

Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe

1045 1050 1055

Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala

1060 1065 1070

Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val

1075 1080 1085

Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr

1090 1095 1100

Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys

1105 1110 1115 1120

Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln

1125 1130 1135

Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1140 1145 1150

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala

1155 1160 1165

Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala

1170 1175 1180

Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr

1185 1190 1195 1200

Glu Gln Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val

1205 1210 1215

Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

1220 1225

<210> 3

<211> 3679

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (2026)..(2026)

<400> 3

atgttcgtgt tcctggtgct gctgcccctg gtgagcagcc agtgcgtgaa cctgaccacc 60

cgcacccagc tgccccccgc ctacaccaac agcttcaccc gcggcgtgta ctaccccgac 120

aaggtgttcc gcagcagcgt gctgcacagc acccaggacc tgttcctgcc cttcttcagc 180

aacgtgacct ggttccacgc catcagcggc accaacggca ccaagcgctt cgacaacccc 240

gtgctgccct tcaacgacgg cgtgtacttc gccagcaccg agaagagcaa catcatccgc 300

ggctggatct tcggcaccac cctggacagc aagacccaga gcctgctgat cgtgaacaac 360

gccaccaacg tggtgatcaa ggtgtgcgag ttccagttct gcaacgaccc cttcctgggc 420

gtgtaccaca agaacaacaa gagctggatg gagagcgagt tccgcgtgta cagcagcgcc 480

aacaactgca ccttcgagta cgtgagccag cccttcctga tggacctgga gggcaagcag 540

ggcaacttca agaacctgcg cgagttcgtg ttcaagaaca tcgacggcta cttcaagatc 600

tacagcaagc acacccccat caacctggtg cgcgacctgc cccagggctt cagcgtgctg 660

gagcccctgg tggacctgcc catcggcatc aacatcaccc gcttccagac cctgcaccgc 720

agctacctga cccccggcga cagcagcagc ggctggaccg ccggcgccgc cgcctactac 780

gtgggctacc tgcagccccg caccttcctg ctgaagtaca acgagaacgg caccatcacc 840

gacgccgtgg actgcgccct ggaccccctg agcgagacca agtgcaccct gaagagcttc 900

accgtggaga agggcatcta ccagaccagc aacttccgcg tgcagcccac cgagagcatc 960

gtgcgcttcc ccaacatcac caacctgtgc cccttcggcg aggtgttcaa cgccacccgc 1020

ttcgccagcg tgtacgcctg gaaccgcaag cgcatcagca actgcgtggc cgactacagc 1080

gtgctgtaca acagcgccag cttcagcacc ttcaagtgct acggcgtgag ccccaccaag 1140

ctgaacgacc tgtgcttcac caacgtgtac gccgacagct tcgtgatccg cggcgacgag 1200

gtgcgccaga tcgcccccgg ccagaccggc aacatcgccg actacaacta caagctgccc 1260

gacgacttca ccggctgcgt gatcgcctgg aacagcaaca acctggacag caaggtgggc 1320

ggcaactaca actaccgcta ccgcctgttc cgcaagagca acctgaagcc cttcgagcgc 1380

gacatcagca ccgagatcta ccaggccggc agcaccccct gcaacggcgt gaagggcttc 1440

aactgctact tccccctgca gagctacggc ttccagccca cctacggcgt gggctaccag 1500

ccctaccgcg tggtggtgct gagcttcgag ctgctgcacg cccccgccac cgtgtgcggc 1560

cccaagaaga gcaccaacct ggtgaagaac aagtgcgtga acttcaactt caacggcctg 1620

accggcaccg gcgtgctgac cgagagcaac aagaagttcc tgcccttcca gcagttcggc 1680

cgcgacatcg acgacaccac cgacgccgtg cgcgaccccc agaccctgga gatcctggac 1740

atcaccccct gcagcttcgg cggcgtgagc gtgatcaccc ccggcaccaa caccagcaac 1800

caggtggccg tgctgtacca gggcgtgaac tgcaccgagg tgcccgtggc catccacgcc 1860

gaccagctga cccccacctg gcgcgtgtac agcaccggca gcaacgtgtt ccagacccgc 1920

gccggctgcc tgatcggcgc cgagcacgtg aacaacagct acgagtgcga catccccatc 1980

ggcgccggca tctgcgccag ctaccagacc cacaccaaca gccacragcg tggccagcca 2040

gagcatcatc gcctacacca tgagcctggg cgccgagaac agcgtggcct acagcaacaa 2100

cagcatcgcc atccccatca acttcaccat cagcgtgacc accgagatcc tgcccgtgag 2160

catgaccaag accagcgtgg actgcaccat gtacatctgc ggcgacagca ccgagtgcag 2220

caacctgctg ctgcagtacg gcagcttctg cacccagctg aaccgcgccc tgaccggcat 2280

cgccgtggag caggacaaga acacccagga ggtgttcgcc caggtgaagc agatctacaa 2340

gacccccccc atcaaggact tcggcggctt caacttcagc cagatcctgc ccgaccccag 2400

caagcccagc aagcgcagct tcatcgagga cctgctgttc aacaaggtga ccctggccga 2460

cgccggcttc atcaagcagt acggcgactg cctgggcgac atcgccgccc gcgacctgat 2520

ctgcgcccag aagttcaacg gcctgaccgt gctgcccccc ctgctgaccg acgagatgat 2580

cgcccagtac accagcgccc tgctggccgg caccatcacc agcggctgga ccttcggcgc 2640

cggcgccgcc ctgcagatcc ccttcgccat gcagatggcc taccgcttca acggcatcgg 2700

cgtgacccag aacgtgctgt acgagaacca gaagctgatc gccaaccagt tcaacagcgc 2760

catcggcaag atccaggaca gcctgagcag caccgccagc gccctgggca agctgcagga 2820

cgtggtgaac cagaacgccc aggccctgaa caccctggtg aagcagctga gcagcaactt 2880

cggcgccatc agcagcgtgc tgaacgacat cctggcccgc ctggacaagg tggaggccga 2940

ggtgcagatc gaccgcctga tcaccggccg cctgcagagc ctgcagacct acgtgaccca 3000

gcagctgatc cgcgccgccg agatccgcgc cagcgccaac ctggccgcca ccaagatgag 3060

cgagtgcgtg ctgggccaga gcaagcgcgt ggacttctgc ggcaagggct accacctgat 3120

gagcttcccc cagagcgccc cccacggcgt ggtgttcctg cacgtgacct acgtgcccgc 3180

ccaggagaag aacttcacca ccgcccccgc catctgccac gacggcaagg cccacttccc 3240

ccgcgagggc gtgttcgtga gcaacggcac ccactggttc gtgacccagc gcaacttcta 3300

cgagccccag atcatcacca cccacaacac cttcgtgagc ggcaactgcg acgtggtgat 3360

cggcatcgtg aacaacaccg tgtacgaccc cctgcagccc gagctggaca gcttcaagga 3420

ggagctggac aagtacttca agaaccacac cagccccgac gtggacctgg gcgacatcag 3480

cggcatcaac gccagcgtgg tgaacatcca gaaggagatc gaccgcctga acgaggtggc 3540

caagaacctg aacgagagcc tgatcgacct gcaggagctg ggcaagtacg agcagggcta 3600

catccccgag gccccccgcg acggccaggc ctacgtgcgc aaggacggcg agtgggtgct 3660

gctgagcacc ttcctgtga 3679

<210> 4

<211> 1226

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<222> (676)..(676)

<220>

<221> UNSURE

<222> (676)..(676)

<223> The 'Xaa' at location 676 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 4

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro

65 70 75 80

Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser

85 90 95

Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val

115 120 125

Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr His Lys

130 135 140

Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala

145 150 155 160

Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu

165 170 175

Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys

180 185 190

Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn

195 200 205

Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Val Leu Glu Pro Leu Val

210 215 220

Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu His Arg

225 230 235 240

Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala

245 250 255

Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys

260 265 270

Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp

275 280 285

Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys

290 295 300

Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile

305 310 315 320

Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe

325 330 335

Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile

340 345 350

Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe

355 360 365

Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu

370 375 380

Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu

385 390 395 400

Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn

405 410 415

Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser

420 425 430

Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg

435 440 445

Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr

450 455 460

Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe

465 470 475 480

Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly

485 490 495

Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu

500 505 510

His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val

515 520 525

Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly

530 535 540

Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly

545 550 555 560

Arg Asp Ile Asp Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu

565 570 575

Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile

580 585 590

Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly

595 600 605

Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr

610 615 620

Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg

625 630 635 640

Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys

645 650 655

Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr His Thr

660 665 670

Asn Ser His Xaa Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met

675 680 685

Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala

690 695 700

Ile Pro Ile Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val

705 710 715 720

Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp

725 730 735

Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr

740 745 750

Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn

755 760 765

Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro

770 775 780

Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro

785 790 795 800

Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys

805 810 815

Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu

820 825 830

Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly

835 840 845

Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr

850 855 860

Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly

865 870 875 880

Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg

885 890 895

Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys

900 905 910

Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser

915 920 925

Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn

930 935 940

Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn

945 950 955 960

Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ala Arg Leu Asp

965 970 975

Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu

980 985 990

Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu

995 1000 1005

Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val

1010 1015 1020

Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu

1025 1030 1035 1040

Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val

1045 1050 1055

Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile

1060 1065 1070

Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser

1075 1080 1085

Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln

1090 1095 1100

Ile Ile Thr Thr His Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val

1105 1110 1115 1120

Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu

1125 1130 1135

Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser

1140 1145 1150

Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val

1155 1160 1165

Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu

1170 1175 1180

Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Gly

1185 1190 1195 1200

Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp

1205 1210 1215

Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

1220 1225

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val

1 5 10 15

Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met

20 25

<210> 6

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys

1 5 10 15

Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

20 25

<210> 7

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr

1 5 10 15

His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu

20 25 30

<210> 8

<211> 3708

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgttcgtgt tcctggtgct gctgcccctg gtgagcagcc agtgcgtgaa cctgaccacc 60

cgcacccagc tgccccccgc ctacaccaac agcttcaccc gcggcgtgta ctaccccgac 120

aaggtgttcc gcagcagcgt gctgcacagc acccaggacc tgttcctgcc cttcttcagc 180

aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg agcggcacca acggcaccaa gcgcttcgac 240

aaccccgtgc tgcccttcaa cgacggcgtg tacttcgcca gcaccgagaa gagcaacatc 300

atccgcggct ggatcttcgg caccaccctg gacagcaaga cccagagcct gctgatcgtg 360

aacaacgcca ccaacgtggt gatcaaggtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccccttc 420

ctgggcgtgt actaccacaa gaacaacaag agctggatgg agagcgagtt ccgcgtgtac 480

agcagcgcca acaactgcac cttcgagtac gtgagccagc ccttcctgat ggacctggag 540

ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgcgc gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac 600

ttcaagatct acagcaagca cacccccatc aacctggtgc gcgacctgcc ccagggcttc 660

agcgccctgg agcccctggt ggacctgccc atcggcatca acatcacccg cttccagacc 720

ctgctggccc tgcaccgcag ctacctgacc cccggcgaca gcagcagcgg ctggaccgcc 780

ggcgccgccg cctactacgt gggctacctg cagccccgca ccttcctgct gaagtacaac 840

gagaacggca ccatcaccga cgccgtggac tgcgccctgg accccctgag cgagaccaag 900

tgcaccctga agagcttcac cgtggagaag ggcatctacc agaccagcaa cttccgcgtg 960

cagcccaccg agagcatcgt gcgcttcccc aacatcacca acctgtgccc cttcggcgag 1020

gtgttcaacg ccacccgctt cgccagcgtg tacgcctgga accgcaagcg catcagcaac 1080

tgcgtggccg actacagcgt gctgtacaac agcgccagct tcagcacctt caagtgctac 1140

ggcgtgagcc ccaccaagct gaacgacctg tgcttcacca acgtgtacgc cgacagcttc 1200

gtgatccgcg gcgacgaggt gcgccagatc gcccccggcc agaccggcaa gatcgccgac 1260

tacaactaca agctgcccga cgacttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa cagcaacaac 1320

ctggacagca aggtgggcgg caactacaac tacctgtacc gcctgttccg caagagcaac 1380

ctgaagccct tcgagcgcga catcagcacc gagatctacc aggccggcag caccccctgc 1440

aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc cccctgcaga gctacggctt ccagcccacc 1500

aacggcgtgg gctaccagcc ctaccgcgtg gtggtgctga gcttcgagct gctgcacgcc 1560

cccgccaccg tgtgcggccc caagaagagc accaacctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620

ttcaacttca acggcctgac cggcaccggc gtgctgaccg agagcaacaa gaagttcctg 1680

cccttccagc agttcggccg cgacatcgcc gacaccaccg acgccgtgcg cgacccccag 1740

accctggaga tcctggacat caccccctgc agcttcggcg gcgtgagcgt gatcaccccc 1800

ggcaccaaca ccagcaacca ggtggccgtg ctgtaccagg acgtgaactg caccgaggtg 1860

cccgtggcca tccacgccga ccagctgacc cccacctggc gcgtgtacag caccggcagc 1920

aacgtgttcc agacccgcgc cggctgcctg atcggcgccg agcacgtgaa caacagctac 1980

gagtgcgaca tccccatcgg cgccggcatc tgcgccagct accagaccca gaccaacagc 2040

cccggcagcg ccagcagcgt ggccagccag agcatcatcg cctacaccat gagcctgggc 2100

gccgagaaca gcgtggccta cagcaacaac agcatcgcca tccccaccaa cttcaccatc 2160

agcgtgacca ccgagatcct gcccgtgagc atgaccaaga ccagcgtgga ctgcaccatg 2220

tacatctgcg gcgacagcac cgagtgcagc aacctgctgc tgcagtacgg cagcttctgc 2280

acccagctga accgcgccct gaccggcatc gccgtggagc aggacaagaa cacccaggag 2340

gtgttcgccc aggtgaagca gatctacaag acccccccca tcaaggactt cggcggcttc 2400

aacttcagcc agatcctgcc cgaccccagc aagcccagca agcgcagctt catcgaggac 2460

ctgctgttca acaaggtgac cctggccgac gccggcttca tcaagcagta cggcgactgc 2520

ctgggcgaca tcgccgcccg cgacctgatc tgcgcccaga agttcaacgg cctgaccgtg 2580

ctgccccccc tgctgaccga cgagatgatc gcccagtaca ccagcgccct gctggccggc 2640

accatcacca gcggctggac cttcggcgcc ggcgccgccc tgcagatccc cttcgccatg 2700

cagatggcct accgcttcaa cggcatcggc gtgacccaga acgtgctgta cgagaaccag 2760

aagctgatcg ccaaccagtt caacagcgcc atcggcaaga tccaggacag cctgagcagc 2820

accgccagcg ccctgggcaa gctgcaggac gtggtgaacc agaacgccca ggccctgaac 2880

accctggtga agcagctgag cagcaacttc ggcgccatca gcagcgtgct gaacgacatc 2940

ctgagccgcc tggacgtgaa ggaggccgag gtgcagatcg accgcctgat caccggccgc 3000

ctgcagagcc tgcagaccta cgtgacccag cagctgatcc gcgccgccga gatccgcgcc 3060

agcgccaacc tggccgccac caagatgagc gagtgcgtgc tgggccagag caagcgcgtg 3120

gacttctgcg gcaagggcta ccacctgatg agcttccccc agagcgcccc ccacggcgtg 3180

gtgttcctgc acgtgaccta cgtgcccgcc caggagaaga acttcaccac cgcccccgcc 3240

atctgccacg acggcaaggc ccacttcccc cgcgagggcg tgttcgtgag caacggcacc 3300

cactggttcg tgacccagcg caacttctac gagccccaga tcatcaccac cgacaacacc 3360

ttcgtgagcg gcaactgcga cgtggtgatc ggcatcgtga acaacaccgt gtacgacccc 3420

ctgcagcccg agctggacag cttcaaggag gagctggaca agtacttcaa gaaccacacc 3480

agccccgacg tggacctggg cgacatcagc ggcatcaacg ccagcgtggt gaacatccag 3540

aaggagatcg accgcctgaa cgaggtggcc aagaacctga acgagagcct gatcgacctg 3600

caggagctgg gcaagtacga gcagggctac atccccgagg ccccccgcga cggccaggcc 3660

tacgtgcgca aggacggcga gtgggtgctg ctgagcacct tcctgtga 3708

Claims

1.一种新型冠状病毒突变株S蛋白，其特征在于，所述新型冠状病毒突变株S蛋白的S1/S2两个亚基之间的furin裂解位点682-RRAR-685替换为柔性的蛋白linker；所述linker的核苷酸序列为GGCAGCGCCAGC；所述linker的氨基酸序列为GSAS；

所述含有共识序列S6突变株中，所述新型冠状病毒突变株S蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：2所示；

所述含有共识序列S15突变株中，所述新型冠状病毒突变株S蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：4所示。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或者SEQ ID NO：3所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体能够表达权利要求1所述的新型冠状病毒突变株S蛋白。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或者SEQ ID NO：3所示。

5.一种工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞包含权利要求3或4所述的重组表达载体。

6.一种新型冠状病毒突变株S蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

获得权利要求3或4所述的重组表达载体；

7.一种新型冠状病毒突变株亚单位疫苗，其特征在于，所述新型冠状病毒突变株亚单位疫苗包含权利要求1所述的重组S蛋白以及药学上接受的佐剂。

8.根据权利要求7所述的一种新型冠状病毒突变株亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂包括氢氧化铝、卵磷脂、弗氏佐剂、MPLTM、IL-12、氢氧化铝联合CpG ODN复合佐剂、ISA51VG、ISA720VG、MF59、QS21、AS03佐剂中的至少一种。