CN116621950A - 新型冠状病毒抗原、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型冠状病毒抗原，包含来自至少一种Omicron毒株的受体结合结构域和N端结构域，还可以包含来自其他新型冠状病毒毒株的RBD和NTD，能够诱导产生针对包括Omicron株在内的不同毒株的中和抗体，实验表明，本发明的新型冠状病毒抗原组合物具有优异的免疫原性，对于包括Omicron株在内的不同毒株均能表现出较好的免疫效果，以此制备的疫苗适合作为一种应对COVID‑19的候选疫苗，并有望在预防Omicron株的快速传播和大规模流行中发挥作用。
Description
技术领域
本申请属于生物医药工程技术领域，特别涉及一种新型冠状病毒抗原、其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染可导致冠状病毒疾病(COVID-19)，常见体征有发热、咳嗽、咽痛等，在较严重病例中，感染可导致呼吸困难、低氧血症、急性呼吸窘迫综合征，甚至死亡。新型冠状病毒可以通过呼吸道和飞沫途径在人与人之间传播，也存在通过空气和消化道传播的可能。
SARS-CoV-2病毒颗粒包含4个结构蛋白，即刺突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)。研究发现，只有针对S蛋白的抗体有中和活性，因此目前研发中的疫苗均包含S蛋白或其组分。其中，S蛋白的受体结合结构域被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。受体结合结构域作为疫苗能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。SARS-CoV-2通过其受体结合结构域与宿主细胞受体hACE2结合而进入细胞。
新型冠状病毒在传播过程中不断进化，目前已检测到多个代表性突变株，例如阿尔法(Alpha)株、贝塔(Beta)株、德尔塔(Delta)株、奥密克戎(Omicron)株等。Omicron株因其传播速度快、潜伏期短的特点，目前已经成为最主要的流行毒株，但现有的原型株疫苗对Omircon株的预防效果有限，无法阻挡其大规模流行。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒抗原，其包含至少一种Omicron变异株S蛋白的免疫原性成分，该新型冠状病毒抗原具有优异的免疫原性，能够激发针对包括Omicron株在内的不同毒株的中和抗体的产生，因而能够显著提高免疫效果。
为实现本发明目的，一方面，本发明提供了一种新型冠状病毒抗原，其包含源自新型冠状病毒奥密克戎(Omicron)株的免疫原性成分，所述免疫原性成分包含S蛋白的受体结合结构域或其功能活性片段，以及N端结构域(NTD)或其功能活性片段。
在一些实施方式中，所述奥密克戎(Omicron)株选自BA.1、BA.2、BA.3、BA.4以及BA.5变异株中的至少一种。
例如，在一些实施方式中，该新型冠状病毒抗原仅含有一种Omicron变异株的免疫原性成分，即可以来自BA.1、BA.2、BA.3、BA.4或BA.5；在另一些实施方式中，该新型冠状病毒抗原含有两种Omicron变异株的免疫原性成分，即可以来自BA.1+BA.2、BA.1+BA.3、BA.1+BA.4、BA.1+BA.5、BA.2+BA.3、BA.2+BA.4、BA.2+BA.5、BA.3+BA.4、BA.3+BA.5或BA.4+BA.5；在另一些实施方式中，该新型冠状病毒抗原含有三种Omicron变异株的免疫原性成分，即可以来自BA.1+BA.2+BA.3、BA.1+BA.2+BA.4、BA.1+BA.2+BA.5、BA.1+BA.3+BA.4、BA.1+BA.3+BA.5、BA.1+BA.4+BA.5、BA.2+BA.3+BA.4、BA.2+BA.3+BA.5、BA.2+BA.4+BA.5或BA.3+BA.4+BA.5；在另一些实施方式中，该新型冠状病毒抗原同时含有四种Omicron变异株的免疫原性成分，即可以来自BA.1+BA.2+BA.3+BA.4、BA.1+BA.2+BA.3+BA.5、BA.1+BA.2+BA.4+BA.5、BA.1+BA.3+BA.4+BA.5或BA.2+BA.3+BA.4+BA.5；在另一些实施方式中，该新型冠状病毒抗原可以同时含有五种Omicron变异株的免疫原性成分，即可以来自BA.1+BA.2+BA.3+BA.4+BA.5。
在本发明中，毒株的各种组合仅用于表示抗原的不同种类，并不表示各免疫原性成分之间存在任何顺序，本领域技术人员可以根据广泛传播的毒株以及抗原抗体的交叉反应确定合适的抗原种类和数量。
在一些实施方式中，所述奥密克戎(Omicron)BA.1株的受体结合结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，BA.2变异株的受体结合结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，BA.3变异株的受体结合结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，BA.4和BA.5变异株的受体结合结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
在一些实施方式中，所述奥密克戎(Omicron)BA.1株的N端结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，BA.2变异株的N端结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，BA.3变异株的N端结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，BA.4和BA.5变异株的N端结构域的氨基酸序列为SEQ IDNO:8。
在一些实施方式中，所述N端结构域或其功能活性片段与受体结合结构域或其功能活性片段直接相连或者通过氨基酸接头连接。
在一些实施方式中，所述新型冠状病毒抗原组合物还包含Foldon结构域、人免疫球蛋白的Fc结构域或其功能活性片段。
在一些实施方式中，所述Foldon结构域或人免疫球蛋白的Fc结构域位于所述抗原的氨基酸序列的C端。
在一些实施方式中，所述Fc结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，所述Foldon结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
在一些实施方式中，源自所述奥密克戎(Omicron)BA.1变异株的免疫原性成分包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，源自BA.2变异株的免疫原性成分包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，源自BA.3变异株的免疫原性成分包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，源自BA.4和BA.5变异株的免疫原性成分包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
本发明另一方面提供了一种制备上述新型冠状病毒抗原的方法，包括以下步骤：
利用编码所有免疫原性成分的核苷酸序列构建重组表达质粒；
将构建的重组表达质粒转化宿主菌，筛选正确的重组表达质粒；
利用筛选的重组表达质粒转染表达系统的细胞，表达后收集上清并纯化得到所述免疫原性成分，即为所述新型冠状病毒抗原。
在一些实施方式中，所述表达系统的细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；可选地，所述哺乳动物细胞包括293T细胞或CHO细胞，所述细菌细胞包括大肠杆菌细胞。
本发明第三方面提供了一种编码上述新型冠状病毒抗原的核苷酸序列。
本发明第四方面提供了一种包括上述核苷酸序列的重组载体。
本发明第五方面提供了一种包括上述重组载体的宿主细胞。
本发明第六方面提供了上述新型冠状病毒抗原、上述核苷酸序列上述重组载体或上述宿主细胞在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。
本发明第七方面提供了一种新型冠状病毒疫苗，包括上述新型冠状病毒抗原和佐剂。
在一些实施方式中，每剂疫苗包含所述新型冠状病毒抗原10～80μg，优选20～50μg。
在一些实施方式中，所述佐剂选自铝佐剂、MF59佐剂、MPL佐剂、QS-21、GLA、CpG、AS01、AS02、AS03、AS04佐剂中的一种或多种。
在一些实施方式中，该疫苗还包括源自除奥密克戎(Omicron)株以外的至少一种新型冠状病毒毒株的附加免疫原性成分，所述附加免疫原性成分包含S蛋白的受体结合结构域或其功能活性片段，以及N端结构域(NTD)或其功能活性片段。
在一些实施方式中，所述新型冠状病毒毒株选自以下毒株：WH01株、阿尔法(Alpha)株、贝塔(Beta)株、伽马(Gamma)株、德尔塔(Delta)株、拉姆达(Lambda)株以及缪(Mu)株，优选为WH01株。
例如，在一些实施方式中，该疫苗包括一种Omicron变异株以及一种其他毒株的免疫原性成分，例如可优选为Omicron BA.1株+WH01株的免疫原性成分，或优选为OmicronBA.2株+WH01株的免疫原性成分，或优选为Omicron BA.3株+Delta株的免疫原性成分，还可优选为Omicron BA.5株+Beta株的免疫原性成分。
在另一些实施方式中，该疫苗包括一种Omicron变异株以及多种其他毒株的免疫原性成分，例如可优选为Omicron BA.1株+WH01株+Beta株的免疫原性成分，或优选为Omicron BA.2株+Beta株+Gamma株的免疫原性成分，或优选为Omicron BA.3株+Alpha株+Delta株的免疫原性成分，或优选为Omicron BA.5株+WH01株+Delta株的免疫原性成分。
在另一些实施方式中，该疫苗包括多种Omicron变异株以及一种或多种其他毒株的免疫原性成分，例如可优选为Omicron BA.1株+Omicron BA.2株+WH01株的免疫原性成分，或优选为Omicron BA.3株+Omicron BA.5株+Delta株的免疫原性成分，或优选为Omicron BA.1株+Omicron BA.2株+Beta株+Gamma株的免疫原性成分。
世界卫生组织和其他命名系统对新型冠状病毒毒株命名的对应关系如表1所示。
表1
新发现的毒株还可参见https://cov-lineages.org/lineage_list.html。
在一些实施方式中，WH01株的受体结合结构域的氨基酸序列为SEQ IDNO:15，贝塔(Beta)株的受体结合结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:16，伽马(Gamma)株的受体结合结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:17，德尔塔(Delta)株的受体结合结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。
在一些实施方式中，WH01株的N端结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:19，贝塔(Beta)株的N端结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:20，伽马(Gamma)株的N端结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:21，德尔塔(Delta)株的N端结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:22。
在一些实施方式中，源自WH01株的附加免疫原性成分包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，源自贝塔(Beta)株的附加免疫原性成分包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，源自伽马(Gamma)株的附加免疫原性成分的氨基酸序列包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，源自德尔塔(Delta)株的附加免疫原性成分的氨基酸序列包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列
在一些实施方式中，来自任意两种毒株的免疫原性成分的质量比为1:1。
例如，在一些实施方式中，该新型冠状病毒抗原仅含有一种Omicron变异株的免疫原性成分，此时每剂疫苗中该免疫原性成分的含量为10～80μg，优选为20～50；在另一些实施方式中，该新型冠状病毒抗原含有两种毒株(可以是两种Omicron变异株，也可以是一种Omicron变异株和一种其他毒株)的免疫原性成分，此时每剂疫苗中每种免疫原性成分的含量为5～40μg，优选为10～25μg；在另一些实施方式中，该新型冠状病毒抗原含有三种毒株(可以是三种Omicron变异株，也可以是Omicron变异株和其他毒株)的免疫原性成分，此时每剂疫苗中每种免疫原性成分的含量为3.5～27μg，优选为6.5～17μg；在另一些实施方式中，该新型冠状病毒抗原同时含有四种毒株(可以是四种Omicron变异株，也可以是Omicron变异株和其他毒株)的免疫原性成分，此时每剂疫苗中每种免疫原性成分的含量为2.5～20μg，优选为5～12.5μg；在另一些实施方式中，该新型冠状病毒抗原可以同时含有五种毒株(可以是五种Omicron变异株，也可以是Omicron变异株和其他毒株)的免疫原性成分，此时每剂疫苗在中每种免疫原性成分的含量为2～15μg，优选为4～10μg。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
本发明的新型冠状病毒抗原包含来自Omicron毒株的受体结合结构域和N端结构域，能够诱导产生针对包括Omicron株在内的不同毒株的中和抗体，实验表明，本发明的新型冠状病毒抗原组合物具有优异的免疫原性，对于包括Omicron株在内的不同毒株均能表现出较好的免疫效果，以此制备的疫苗适合作为一种应对COVID-19的候选疫苗，并有望在预防Omicron株的快速传播和大规模流行中发挥作用。
附图说明
图1显示的是转染后的细胞系传代稳定性检测结果。
图2显示的是用SDS-PAGE电泳与WB验证NTD-RBD-Foldon(WH01)蛋白的结果图。
图3显示的是NTD-RBD-Foldon(Gamma突变株)蛋白的尺寸排阻层析图谱。
图4显示的是SDS-PAGE电泳与Westernblot验证NTD-RBD-Foldon(Gamma突变株)蛋白结果图。
图5显示的是NTD-RBD-Foldon(Beta突变株)蛋白的尺寸排阻层析图谱。
图6显示的是SDS-PAGE电泳与Westernblot验证NTD-RBD-Foldon(Beta突变株)蛋白结果图。
图7显示的是用BA.1疫苗对小鼠进行加强免疫后产生的针对SARS-CoV-2不同流行株假病毒中和抗体滴度；
图8显示的是用BA.2疫苗免疫小鼠后产生的针对SARS-CoV-2不同流行株假病毒中和抗体滴度。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
术语定义：
在本申请中，术语“S蛋白”，也称为“Spike蛋白”或“刺突蛋白”，通常是指冠状病毒的衣壳表面糖蛋白。SARS-CoV-2通过S蛋白与ACE2受体结合并侵入细胞。S蛋白由1273个氨基酸组成，含有一个跨膜区，包含来自冠状病毒的衣壳表面糖蛋白从N端起或从第14位氨基酸起至少到1273氨基酸片段，或者来自其它SAS病毒的相应区域。S1蛋白是S蛋白的亚单位1，主要指从N端或第14位氨基酸起到第685氨基酸片段。
在本申请中，术语“RBD”是指SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合结构域。例如，在本申请中，WH01的RBD可为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)310-560氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以截短N端或C端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本申请中，WH01的RBD可为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)319-541氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以适宜地截短N端或C端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本申请中，WH01的RBD可为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)331-524氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以适宜地截短N端或C端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本申请中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在某些实施方式中，RBD还可以是贝塔(Beta)突变体、伽马(Gamma)突变体、德尔塔(Delta)突变体或奥密克戎(Omicron)突变体的RBD。
在本申请中，术语“NTD”即SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)N端结构域。例如，在本申请中，WH01的NTD可以为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)13-353氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以适宜地截短N端或C端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。例如，WH01的NTD可以为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)13-303氨基酸之间的肽段或其突变体。在本申请中，WH01的NTD可以为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)14-304氨基酸之间的肽段或其突变体。在本申请中，WH01的NTD可以为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)18-353氨基酸之间的肽段或其突变体。在本申请中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在某些实施方式中，NTD还可以是贝塔(Beta)突变体、伽马(Gamma)突变体或德尔塔(Delta)突变体的NTD。
在本申请中，术语“Foldon结构域”通常是指在噬菌体T4纤维蛋白的C末端的残基。在本申请中，Foldon结构域可以是噬菌体T4纤维蛋白的C末端的27个残基或突变体。在本申请中，Foldon结构域可以是噬菌体T4纤维蛋白的C末端的27个残基截短或增加N端或C端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的截短体或增长体。在本申请中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。
在本申请中，术语“功能活性片段”通常是指与RBD、NTD、Foldon结构域、Fc结构域具有相似生物学活性的片段。
在本申请中，术语“佐剂”是指能够增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质。本申请中的佐剂可以选自铝佐剂、MF59、MPL、QS-21、GLA、CpG、AS01、AS02、AS03、AS04佐剂中的一种或多种。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“左右”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“宿主细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的融合蛋白即可。所述宿主细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO细胞。
实施例1构建WH01株重组表达质粒
该实施例中，源自WH01株的抗原(NTD-RBD-Foldon)的氨基酸序列为SEQ ID NO：23，在其N端添加信号肽SEQ ID NO：27，并在C端添加8个HIS标签。选择pcDNA3.1(+)作为载体。按照宿主CHO细胞进行密码子优化。NTD-RBD-Foldon-8*HIS的引物通过PCR的方法扩增得到片段PCR产物，通过多段重组的方法重组到目的载体pcDNA3.1(+)(BamHI-XhoI酶切载体)中，得到重组表达质粒。反应体系如表2所示。
表2处理好的目的片段与载体连接反应体系
| 名称 | 体积 |
| 酶切后载体 | 5μl |
| 纯化的PCR产物 | 5μl |
| 无缝组装MIX | 10μl |
| 总体积 | 20μl |
转化的方法：
将浓度在100ng/μl左右的重组表达质粒吸取1-3μl加入到100μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。42℃水浴90s不要摇动；冰浴中放置3分钟左右；每管中加入500-800μl 37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。
NTD-RBD-Foldon-8*HIS重组表达质粒的验证：
(1)制备含相应抗性的琼脂平板。
(2)取100μl菌液，然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15分钟。
(3)倒置平板于37℃培养12-16小时可出现菌落。
(4)平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液送测序。
克隆质粒的鉴定方法：PCR扩增NTD-RBD-Foldon-8*HIS片段，鉴定引物序列由公司内部引物部合成预期扩增的片段长度为1761bp，PCR反应采用20μL体系：引物0.5μL，模板菌液2μL，聚合酶缓冲液0.5μL，buffer 3μl，ddH2O 14μL。
循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min。以菌液PCR方法筛选阳性克隆，获得的阳性菌液37℃摇菌提质粒，测序。测序比对正确的质粒，用BamHI-XhoI进行双酶切，获得1761bp、5372bp两个片段。
NTD-RBD-Foldon-8*HIS重组表达质粒抽提。接1％含NTD-RBD-Foldon-8*HIS重组表达质粒的大肠杆菌细胞(stbl3)于2mlLB培养基，37℃振荡培养过夜。处理细胞后，使用质粒提取试剂盒提取100μg质粒。测序比对正确的质粒，用BamHI-XhoI进行双酶切，获得1761bp、5372bp两个片段。
实施例2细胞转染
在所有细胞操作过程中，温和地旋转混合宿主细胞；避免剧烈的混合/移液。继代培养和扩增CHO细胞直到细胞密度达到4×106–6×106个/mL。第-1天：细胞扩增，扩增培养细胞到3×106–4×106个/mL，并允许细胞过夜生长。第0天：转染细胞，测定活细胞密度和存活率，细胞的密度应该达7×106–10×106个/mL,存活率到95–99％进行转染，新鲜的细胞表达培养基，预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为6×106个/mL，50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。
使用OPti-PRO SFM培养基制备转染试剂和NTD-RBD-Foldon-8*HIS重组表达质粒复合物(4℃)，例：1ml细胞准备40μl OPti-PRO SFM添加0.8μg NTD-RBD-Foldon-8*HIS重组表达质粒混匀放置5min；准备40μl OPti-PRO SFM添加3μl Expi Fectamine CHO试剂混匀放置5min，室温下1–5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。转染后18-22小时，添加Enhancer和ExpiCHO Feed，执行标准实验方案，例：1ml细胞添加6μl Enhancer和0.24ml ExpiCHOFeed，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。转染后8天收集，进行后续检测和蛋白纯化。
实施例3细胞系稳定性检测
(1)细胞系遗传稳定性检测
分别包含编码目标蛋白NTD-RBD-Foldon(WH01)(SEQ ID NO：23)的DNA的细胞从主细胞库(MCB)及MCB传代45PDL(Population Doubling Level)后冻存(简称MCB-P45)的细胞中抽提基因组DNA，通过目标蛋白相对于内参基因B2M在qPCR中不同扩增结果的比较，以判断MCB和MCB-P45中目的基因拷贝数的相对变化情况。抗原的目标蛋白在MCB和MCB-P45的相对基因拷贝数分别为1.00，1.06。
分别从MCB及MCB-P45中抽提基因组DNA后，以基因组DNA为模板，利用合成的引物对目标基因分别进行扩增，最后对PCR产物进行测序，检测各细胞库细胞和MCB-45在基因水平上是否发生突变。运用VectorNTI软件，将获得的MCB和MCB-P45细胞中目标基因的测序结果与理论序列进行比较，各组比对的结果显示，所有测序序列与理论序列100％吻合，未发现突变、倒置或缺失。
(2)细胞系传代稳定性检测
将包含编码目标蛋白NTD-RBD-Foldon(WH01)(SEQ ID NO：23)的DNA的细胞株从MCB(将MCB为PDL 31.3)开始进行连续传代培养，每2-3天传代一次，在PDL31.3+15时撤去筛选压力，继续传代至PDL31.3+45时结束传代。在PDL31.3+15、PDL31.3+30、PDL31.3+45时分别冻存细胞保种。整个传代过程中，细胞活率始终保持在96％以上，细胞倍增时间无显著波动，说明细胞生长状态未发生变化，生长比较稳定(图1)。
传代结束后，同时复苏MCB和PDL31.3+45的细胞，传代1～2周后将各代次细胞分别接种至培养基进行培养，结果显示，MCB和PDL31.3+45的细胞继续传代后，生长和产品质量上表现一致，蛋白表达量增长6.1％。
实施例4蛋白纯化
培养基离心，上清添加Ni柱，振荡孵育2h，经过重力空柱管柱进行亲和层析纯化。平衡缓冲液：PBS，pH7.4，清洗10CV；清洗缓冲液：PBS，pH7.4 with20mM imidazole，清洗10CV；洗脱缓冲液：PBS，pH7.4 with 500mM imidazole，洗脱1CV，重复5次，得到NTD-RBD-Foldon-8*HIS纯化蛋白，结果如表3所示。
表3 NTD-RBD-Foldon-8*HIS纯化蛋白的浓度和体积
| 融合蛋白 | 浓度(mg/ml) | 体积(ml) |
| NTD-RBD-Foldon-8*HIS | 0.05 | 0.5 |
SDS-PAGE电泳与Western blot(WB)验证：
A.1.0mm PAGE胶，上样量8μl，跑胶顺序：M.Molecular weightmarker.Me.Culture medium.FT.Flow through.W.Wash.E.Eluted fractions。
B.电泳:将纯化蛋白与上样缓冲液混合(纯化蛋白:5x上样缓冲液＝4:1)，煮沸5min，进行点样。首先100V恒压电泳，可以看到Marker逐渐变成一条细线。待Marker进入分离胶后，将电压调到300V继续电泳，直到蓝色的溴酚蓝条带到达胶的底部(约25min)。
C.转膜，撬开玻璃板，小心取出凝胶。PVDF膜用甲醇活化30s后和滤纸剪成和胶块相同大小，在转膜液中浸透。从下往上依次为：滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸。注意各层之间尤其是胶和膜之间不能有气泡。将平皿中的转膜液全部倒进转膜盒中。20V恒压转移，50KDa蛋白需20min。分子量越大需时间越长。
D.抗体孵育转膜后取出PVDF膜，可以看到Marker转移到膜上。用5％脱脂奶(1g脱脂奶粉加100ml PBST)封闭1小时，用PBST漂洗2x5min。一抗(anti-His Mab)用5％脱脂奶粉(1g脱脂奶粉，100ml TBS)稀释，放在小盒中孵育，4'C脱色摇床中反应2h。取出PVDF膜,PBST漂洗4×10min。二抗(羊抗鼠)也用5％脱脂奶粉稀释，孵育1小时。PBST漂洗4x 10min.均使用摇床震动。
E.显色，ECL显色:每一块PBST膜，用A液1mL和B液10μL混合后滴在膜上，5min后在化学发光成像系统中拍照记录，如图2所示。
实施例5构建Beta突变株和Gamma突变株重组表达质粒
该实施例中，源自Beta突变株的抗原(NTD-RBD-Foldon)的氨基酸序列为SEQ IDNO：24，源自Gamma突变株的抗原(NTD-RBD-Foldon)的氨基酸序列为SEQ ID NO：25，在其N端添加信号肽SEQ ID NO：28，并在C端添加6个HIS标签。全长氨基酸序列由无锡药明生物技术股份有限公司进行密码子优化，并通过PCR进行全基因合成得到DNA片段。经凝胶纯化后，将纯化后的DNA片段重组到目的载体pcDNA3.1(+)中，得到重组表达质粒。并通过Sanger测序验证，序列100％正确。
转化宿主菌：
(1)将浓度在100ng/μL的重组表达质粒吸取1～3μL加入到100μL的大肠杆菌E.coli Top10感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。
(2)42℃水浴90s不要摇动。
(3)冰浴中放置3分钟左右。
(4)每管中加入500～800μL 37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。
重组表达质粒抽提并测序：
(1)制备含100μg/mL氨苄青霉素的琼脂平板。
(2)取100μL菌液培养后用无菌玻璃涂布器轻轻划LB琼脂平板(含100μg/mL氨苄青霉素)，将平板置于37℃培养15分钟。
(3)倒置平板于37℃培养12～16小时可出现菌落。
(4)从平板上挑取一个单克隆接种至300mL LB培养基中扩大培养，采用NucleoBondXtra Maxi EF试剂盒按照说明书进行质粒大量制备。并测序验证目的基因，测序结果与设计的基因组序列一致。
实施例6细胞转染
在所有细胞操作过程中，温和地旋转混合宿主细胞，避免剧烈的混合/移液。继代培养和扩增CHO细胞(来自Thermo公司的ExpiCHO)直到细胞密度达到4×106～6×106个/mL。转染的第-1天：调整细胞密度到3×106～4×106个/mL，并允许细胞过夜生长。第0天：转染细胞，测定活细胞密度和存活率，细胞的密度应该达7×106～10×106个/mL，存活率达95～99％进行转染。新鲜的细胞表达培养基，预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为6×106个/mL，在50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。使用OptiPROTM SFM培养基制备转染试剂和NTD-RBD-Foldon-6×His(Gamma突变株/Beta突变株)重组表达质粒复合物(4℃)，例：1mL CHO细胞准备40μL OptiPROTM SFM添加0.8μg重组表达质粒，混匀放置5分钟；准备40μLOptiPROTM SFM添加3μL ExpiFectamineTM CHO试剂混匀放置5分钟，室温下1～5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。转染后18-22小时，添加Enhancer和ExpiCHO Feed，执行标准实验方案。例：1mL细胞添加6μL Enhancer和0.24mL ExpiCHO Feed，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。转染后6天收集，进行后续蛋白纯化。
实施例7蛋白纯化
采用固定化金属离子亲和层析(IMAC)和尺寸排阻层析(SEC)相结合的方法进行纯化。采用装载NiSO4的Hi Trap 5ml Chelating HP层析柱(美国GE公司)。鳌合层析介质预处理后装柱，分别用50mmol/L EDTA、0.2mol/LNaOH、超纯水洗柱。5倍以上的裂解缓冲液平衡后，细胞裂解上清直接上柱，以溶液A(20mmol/L PB，pH7.4，0.15mol/L NaCl)与溶液B(20mmol/L PB，pH7.4，0.15mol/LNaCl，0.5mol/L咪唑)为流动相进行梯度洗脱(溶液B的浓度从4％(体积)增大至100％(体积))。收集目标组分，继续进行SEC分离。采用HiLoad 26/60Superdex-200pre-grade凝胶柱(美国GE公司)。以溶液C(20mmol/LPB，pH7.4，0.15mol/LNaCl)为流动相洗脱1个柱体积，洗脱速率为2.5mL/min。SEC纯化后的层析图谱见图3和图5。
得到NTD-RBD-Foldon-6×His(Gamma突变株/Beta突变株)纯化蛋白，蛋白纯化结果如表4所示，经纯化后的目的蛋白纯度分别可达93.6％(Gamma突变株)和95％(Beta突变株)。
表4蛋白纯化结果
SDS-PAGE电泳和Western blot验证：
A.1.0mm PAGE胶，上样量8μL，跑胶顺序：M.Molecular weightmarker.Me.Culture medium.FT.Flow through.W.Wash.E.Eluted fractions。
B.电泳：将纯化蛋白与上样缓冲液混合(纯化蛋白:5×上样缓冲液＝4:1)，煮沸5分钟，进行点样。首先100V恒压电泳，可以看到Marker逐渐变成一条细线。待Marker进入分离胶后，将电压调到300V继续电泳，直到蓝色的溴酚蓝条带到达胶的底部(约25分钟)。
C.转膜，撬开玻璃板，小心取出凝胶。PVDF膜用甲醇活化30s后和滤纸剪成和胶块相同大小，在转膜液中浸透。从下往上依次为：滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸。注意各层之间尤其是胶和膜之间不能有气泡。将平皿中的转膜液全部倒进转膜盒中。20V恒压转移，50KDa蛋白需20分钟。分子量越大需时间越长。
D.抗体孵育，转膜后取出PVDF膜，可以看到Marker转移到膜上。用5％脱脂奶(1g脱脂奶粉加100mL PBST)封闭1小时，用PBST漂洗2×5min。一抗(anti-His Mab)用5％脱脂奶粉(1g脱脂奶粉，100mLTBS)稀释，放在小盒中孵育，4℃脱色摇床中反应2h。取出PVDF膜，PBST漂洗4×10min。二抗(羊抗鼠)也用5％脱脂奶粉稀释，孵育1小时。PBST漂洗4×10min。均使用摇床震动。
E.显色，ECL显色：每一块PBST膜，用A液1mL和B液10μL混合后滴在膜上，5分钟后在化学发光成像系统中拍照记录，如图4和图6所示。
从SDS-PAGE电泳图和Western blot的结果图可知，经SEC分离后NTD-RBD-Foldon(Beta突变株)溶液的电泳泳道上最大的条带是NTD-RBD-Foldon(Beta突变株)，NTD-RBD-Foldon(Gamma突变株)溶液的电泳泳道上最大的条带是NTD-RBD-Foldon(Gamma突变株)，且其主要以三聚体的形式存在，Westernblot结果可见对应的目的条带。
实施例8Omicron BA.1重组蛋白的制备
根据实施例1～4提供的方法，构建Omicron BA.1突变株重组表达质粒，转染入CHO细胞中，扩大培养后进行提取和纯化，得到Omicron BA.1突变株NTD-RBD-Foldon-8*HIS纯化蛋白。
实施例9免疫原性组合物的制备
20μg的WH01 NTD-RBD-Foldon纯化蛋白，20μg的Omicron BA.1突变株NTD-RBD-Foldon纯化蛋白，1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和pH7.5的10mM的PB缓冲液(Na2HPO4，NaH2PO4)，分装到2mL管制瓶，每管0.5mL，置冻干机进行冷冻干燥。
实施例10疫苗的制备
在实施例9制备的免疫原性组合物中进一步添加AS03佐剂，佐剂瓶为0.5mL，AS03佐剂成分包括10.69mg的角鲨烯、11.86mg的α-生育酚、4.86mg的聚山梨酯80、1.768mg的氯化钠、0.044mg的氯化钾、0.253mg的磷酸氢二钠、0.044mg的磷酸二氢钾和注射用水。
实施例11疫苗的制备
在实施例9制备的免疫原性组合物中进一步添加氢氧化铝佐剂，浓度为1mg/mL。
实施例12疫苗的制备
在实施例9制备的免疫原性组合物中进一步添加MF59佐剂，佐剂瓶为0.5mL，成分包括4.5％的角鲨烯，0.5％Tween 80，0.5％Span85和注射用水。
实施例13 BA.1疫苗的加强免疫实验
取20只BALB/c小鼠(雌性，6-8周龄，购自中国医学科学院实验动物研究所)，按照表7所示的方式进行分组和免疫，用1/10人用剂量的相应疫苗进行肌肉途径免疫，按照间隔21天(0和21天)的免疫程序注射灭活疫苗(购自北京生物制品研究所有限责任公司)，二次免疫后第30天分别采用不同的单价疫苗和二价疫苗(均采用本申请实施例提供的抗原制备而成)进行加强免疫，14天后采集血清，通过基于VSV系统的新冠假病毒中和检测方法，分别利用D614G、Delta、Omicron-BA.1以及Omicron-BA.2假病毒进行假病毒体外中和试验，并测定中和抗体滴度。
表5免疫方案分组表
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结果如图7所示，各组经过不同的加强免疫后，均能诱导机体产生较高滴度的D614G抗体，其中1和3组的GMT显著高于2和4组；Delta中和抗体的情况与D614G相似，1和3组同样显著高于另外两组，表明单价疫苗(WH01)和二价疫苗(WH01/Omicron-BA.1)均能针对D614G毒株和Delta毒株发挥出色的加强免疫效果。Omicron方面，Omicron-BA.1中和抗体滴度较前两种毒株显著降低，其中以第3组最高、第1组次之；Omicron-BA.2突变株的情况类似，也是以第3组最高、第1组次之，均显著高于第4组(灭活疫苗)，表明相对于单价疫苗，二价疫苗(WH01/Omicron-BA.1)针对Omicron及其突变株具有更好的加强免疫效果。
从整体上来看，1、3组的中和抗体水平显著高于2、4组，且2、4组之间未产生显著性差异，说明Omicron BA.1抗原虽然在单独用于加强免疫时效果并不理想、但在与野生型以二价疫苗的形式联用时则能取得不俗的效果，特别是对于其他疫苗都难以攻克的Omicron及其突变体，该二价疫苗更是展现出了出乎意料的应用潜力。
实施例14 Omicron BA.2重组蛋白的制备
根据实施例1～4提供的方法，构建Omicron BA.2突变株重组表达质粒，转染入CHO细胞中，扩大培养后进行提取和纯化，得到Omicron BA.2突变株NTD-RBD-Foldon-8*HIS纯化蛋白。
实施例15免疫原性组合物的制备
20μg的WH01 NTD-RBD-Foldon纯化蛋白，20μg的Omicron BA.2突变株NTD-RBD-Foldon纯化蛋白，1％(w/v)蔗糖；2％(w/v)甘氨酸；0.02％(w/v)吐温80；和pH7.5的10mM的PB缓冲液(Na2HPO4，NaH2PO4)，分装到2mL管制瓶，每管0.5mL，置冻干机进行冷冻干燥。
实施例16疫苗的制备
在实施例15制备的免疫原性组合物中进一步添加AS03佐剂，佐剂瓶为0.5mL，AS03佐剂成分包括10.69mg的角鲨烯、11.86mg的α-生育酚、4.86mg的聚山梨酯80、1.768mg的氯化钠、0.044mg的氯化钾、0.253mg的磷酸氢二钠、0.044mg的磷酸二氢钾和注射用水。
实施例17 Omicron BA.2疫苗免疫实验
取15只BALB/c小鼠(雌性，6-8周龄，购自中国医学科学院实验动物研究所)，按照表6所示的方式进行分组和免疫，用1/10人用剂量的相应疫苗进行肌肉途径免疫，采用两针间隔21天(0和21天)的免疫程序，二次免疫后14天采集血清，通过基于VSV系统的新冠假病毒中和检测方法，分别利用WH01、Omicron-BA.1、Omicron-BA.2以及Omicron-BA.4假病毒进行假病毒体外中和试验，并测定中和抗体滴度。
表6免疫方案分组表
结果如图8所示，各组经过不同的加强免疫后，均能诱导机体产生较高滴度的WH01抗体，其中1组和3组的GMT均显著高于2组，表明单价疫苗(WH01)和二价疫苗(WH01/Omicron-BA.2)均能针对野生型毒株发挥出色的免疫效果。Omicron方面，Omicron-BA.2中和抗体滴度显著高于BA.1和BA.4，其中以第2组最高、第3组次之；Omicron-BA.1中和抗体滴度以第3组最高、第2组次之，BA.4中和抗体滴度低于其余各毒株、但在第2组和第3组中也达到了较高水平，表明二价疫苗(WH01/Omicron-BA.2)针对野生型和Omicron及其突变株均能发挥较好的免疫活性，同时Omicron-BA.2单价疫苗对Omicron的各变种也都能取得较为理想的免疫效果，这对于目前传播迅速、不易防御的Omicron新型突变体而言，提供了一种具有应用潜力的应对方案。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (23)
1.一种新型冠状病毒抗原，其特征在于，包含源自新型冠状病毒奥密克戎(Omicron)株的免疫原性成分，所述免疫原性成分包含S蛋白的受体结合结构域或其功能活性片段，以及N端结构域(NTD)或其功能活性片段。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于，所述奥密克戎(Omicron)株选自BA.1、BA.2、BA.3、BA.4以及BA.5变异株中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于，所述奥密克戎(Omicron)BA.1株的受体结合结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，BA.2变异株的受体结合结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，BA.3变异株的受体结合结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，BA.4和BA.5变异株的受体结合结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
4.根据权利要求2所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于，所述奥密克戎(Omicron)BA.1株的N端结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，BA.2变异株的N端结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，BA.3变异株的N端结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，BA.4和BA.5变异株的N端结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于，所述N端结构域或其功能活性片段位于所述免疫原性成分的氨基酸序列的N端。
6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒抗原，其中，所述N端结构域或其功能活性片段与受体结合结构域或其功能活性片段直接相连或者通过氨基酸接头连接。
7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于，所述新型冠状病毒抗原还包含Foldon结构域、人免疫球蛋白的Fc结构域或其功能活性片段。
8.根据权利要求7所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于，所述Foldon结构域或人免疫球蛋白的Fc结构域位于所述免疫原性成分的氨基酸序列的C端。
9.根据权利要求7所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于，所述Fc结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，所述Foldon结构域的氨基酸序列为SEQ IDNO:10。
10.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于，源自所述奥密克戎(Omicron)BA.1变异株的免疫原性成分包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，源自BA.2变异株的免疫原性成分包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，源自BA.3变异株的免疫原性成分包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，源自BA.4和BA.5变异株的免疫原性成分包含SEQID NO:14所示的氨基酸序列。
11.一种制备权利要求1-10所述新型冠状病毒抗原的方法，包括以下步骤：
利用编码所有免疫原性成分的核苷酸序列构建重组表达质粒；
将构建的重组表达质粒转化宿主菌，筛选正确的重组表达质粒；
利用筛选的重组表达质粒转染表达系统的细胞，表达后收集上清并纯化得到所述免疫原性成分，即为所述新型冠状病毒抗原。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述表达系统的细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞，可选地；所述哺乳动物细胞包括293T细胞或CHO细胞，所述细菌细胞包括大肠杆菌细胞。
13.一种编码权利要求1-10中任一项所述新型冠状病毒抗原的核苷酸序列。
14.一种包括权利要求13所述核苷酸序列的重组载体。
15.一种包括权利要求14所述重组载体的宿主细胞。
16.权利要求1-10中任一项所述新型冠状病毒抗原、权利要求13所述核苷酸序列、权利要求14所述重组载体或权利要求15所述宿主细胞在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。
17.一种新型冠状病毒疫苗，包括权利要求1-10中任一项所述新型冠状病毒抗原和佐剂。
18.根据权利要求17所述的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，每剂疫苗包含所述新型冠状病毒抗原10-80μg，优选20-50μg。
19.根据权利要求17所述的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述佐剂选自铝佐剂、MF59佐剂、MPL佐剂、QS-21、GLA、CpG、AS01、AS02、AS03、AS04佐剂中的一种或多种。
20.根据权利要求17所述的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，还包括源自除奥密克戎(Omicron)株以外的至少一种新型冠状病毒毒株的附加免疫成分，所述附加免疫成分包含S蛋白的受体结合结构域或其功能活性片段，以及N端结构域(NTD)或其功能活性片段。
21.根据权利要求20所述的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述新型冠状病毒毒株选自以下毒株：WH01株、阿尔法(Alpha)株、贝塔(Beta)株、伽马(Gamma)株、德尔塔(Delta)株、拉姆达(Lambda)株以及缪(Mu)株，优选为WH01株。
22.根据权利要求21所述的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，源自WH01株的附加免疫成分包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，源自贝塔(Beta)株的附加免疫成分包含SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列，源自伽马(Gamma)株的附加免疫成分的氨基酸序列包含SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列，源自德尔塔(Delta)株的附加免疫成分的氨基酸序列包含SEQ IDNO:26所示的氨基酸序列。
23.根据权利要求22所述的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，来自任意两种毒株的免疫成分的质量比为1:1。
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