CN111537721B - SARS-COV-2 Spike蛋白在新冠肺炎检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了SARS‑COV‑2 Spike蛋白在新冠肺炎检测中的应用。本发明获得稳定、高表达SARS‑COV‑2 Spike蛋白S1蛋白亚基重组蛋白的HEK293细胞株，并将SARS‑COV‑2 Spike蛋白S1蛋白亚基重组蛋白应用于免疫层析检测试剂的研制。本发明使用SARS‑COV‑2 Spike蛋白S1蛋白亚基重组抗原作为标记材料，并应用于金标免疫层析系统，该检测体系为直接标记捕获，与以原核表达的SARS‑COV‑2 NP重组蛋白为包被的IgM/IgG检测产品相比较，灵敏度和特异性均较大幅度的提高。

Description

SARS-COV-2 Spike蛋白在新冠肺炎检测中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域领域，更具体地，涉及SARS-COV-2 Spike蛋白在新冠肺炎检测中的应用。
背景技术
2019年12月新型冠状病毒肺炎(COVID-19)席卷全国至今，经证实为2019新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病。截止目前，已致八万多人受到感染，死亡达3000多人，对人类健康、百姓生活和国家经济建设都造成了重大影响。当前，除了有效的隔离防范外，还需要尽快针对该病毒开发有效的诊断抗原和预防疫苗。
冠状病毒粒子呈不规则形状，直径约60-220nm。病毒粒子外包脂肪膜(膜表面有三种糖蛋白)，小包膜糖蛋白(Envelope Protein，较小，与包膜结合的蛋白)和膜糖蛋白(Membrane Protein，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成)。
病毒的膜蛋白主要有表面的棘突蛋白(Spike蛋白，S)和膜(membrane，M)，Spike蛋白是一种糖蛋白，主要作用于细胞粘附和细胞膜融合，在许多哺乳动物体内，S被furin酶或其他酶酶解为S1和S2。其中S1上有受体附着位点，S2主要体现融合活性。冠状病毒可以结合多种细胞受体，其中血管紧张素转换酶2(ACE2)作为一种肽酶是细胞表面冠状病毒的受体之一，SARS-CoV-2(2019-nCoV)的Spike蛋白(结构如图1所示)与人ACE2相互作用来感染人的呼吸道上皮细胞。S1内有一部分区域与ACE2紧密结合，被称之为受体结合域(RBD)，是病毒和受体相互作用的关键因素。Spike蛋白可通过RBD的基因重组或突变可以实现不同宿主间传播，并导致较高致死率。且RBD包含重要的病毒中和表位，对提高免于抗体应答十分关键。对RBD及S1区的研究，有助于设计病毒疫苗和开发新的抗冠状病毒药物。
发明内容
本发明的目的在于提供SARS-COV-2 Spike蛋白在新冠肺炎检测中的应用。本发明建立了重组SARS-COV-2 Spike(S1)蛋白HEK293细胞，制备了重组SARS-COV-2Spike(S1)蛋白，进一步将构建的SARS-COV-2 Spike(S1)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2Spike(S1)转染HEK293细胞，获得稳定、高表达SARS-COV-2 Spike(S1)分子的HEK293细胞株，并将SARS-COV-2 Spike(S1)重组蛋白应用于免疫层析检测试剂的研制。本发明使用SARS-COV-2 Spike(S1)重组抗原作为标记材料，并应用于金标免疫层析系统，该检测体系为直接标记捕获，与以原核表达的SARS-COV-2NP重组蛋白为包被的IgM/IgG检测产品相比较，灵敏度和特异性均较大幅度的提高。
本发明的第一目的在于提供SARS-COV-2的Spike蛋白在制备新冠肺炎检测试剂盒中的应用。
本发明的第二目的在于提供SARS-COV-2的Spike蛋白的S1蛋白亚基在制备新冠肺炎检测试剂盒中的应用。
本发明的第三目的在于提供一种新冠肺炎检测试剂盒。
本发明的第四目的在于提供所述的试剂盒的制备方法。
本发明的第五目的在于提供所述的编码基因、重组载体、和/或重组细胞在制备新冠肺炎检测试剂盒中的应用。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
本发明在哺乳动物HEK293细胞表达重组SARS-CoV-2(2019-nCoV)的Spike蛋白确保蛋白proper folding、充分的糖基化，适用于基础研究、诊断和疫苗的开发。重组SARS-CoV-2(2019-nCoV)的Spike(S1)蛋白antigen，包括2019-nCoV spike蛋白的N-末端(残基3-687)。这个抗原包含一个His Tag标签为了方便表达和纯化，为后续开展的诊断、疫苗以及抗病毒抗体和药物的研究奠定了基础。
本发明要求保护以下内容：
SARS-COV-2的Spike蛋白在制备新冠肺炎检测试剂盒中的应用。
优选地，所述试剂盒为免疫检测试剂盒，SARS-COV-2的Spike蛋白为捕获抗原。
SARS-COV-2的Spike蛋白的S1蛋白亚基(SARS-COV-2 Spike(S1))在制备新冠肺炎检测试剂盒中的应用。
优选地，所述试剂盒为免疫检测试剂盒，SARS-COV-2的的S1蛋白亚基为捕获抗原。
一种新冠肺炎检测试剂盒，所述试剂盒为胶体金检测试纸，由吸水垫3、NC膜2、金标结合垫4、样品垫5和PC衬板1组成；
所述NC膜包被有质控线C线和检测线T1线、T2线，C线为兔抗SARS-COV-2Spike(S1)重组抗原抗体，T1线为抗人IgG单抗，T2线为抗人IgM单抗；
所述NC为Sartorius CN 140；
所述金标结合垫为吸附有胶体金标记的SARS-COV-2的Spike蛋白的S1蛋白亚基；
所述胶体金标记的SARS-COV-2的Spike蛋白的S1蛋白亚基，胶体金颗粒平均直径为40nm。
所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
核苷酸序列SEQ ID NO图3所示编码基因连接入表达载体得到重组载体，重组载体转染细胞德奥重组细胞，重组细胞表达得到SARS-COV-2的Spike蛋白的S1蛋白亚基；
SARS-COV-2的Spike蛋白的S1蛋白亚基与40nm胶体金偶联后吸附于金标结合垫；
NC膜包被C线包被兔抗SARS-COV-2 Spike(S1)重组抗原抗体，T1线包被抗人IgG单抗，T2线包被抗人IgM单抗；
吸水垫3、NC膜2、金标结合垫4和样品垫5依次固定于PC衬板1表面。
优选地，所述表达载体为pcDNA3.1(+)，所述细胞为HEK293，插入片段的核苷酸序列SEQ ID NO:2所示。
前文中所述的编码基因、重组载体、和/或重组细胞在制备新冠肺炎检测试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明构建了SARS-COV-2 Spike(S1)的真核表达载体pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)，蛋白序列与SARS-COV-2S(GenBank:MN908947.3)的SARS-COV-2 Spike(S1)除C端添加四个作为linker的柔性氨基酸和6个组氨酸、N端删除一个苯丙氨酸外，其余的氨基酸完全一致，氨基酸序列SEQ ID NO:1所示；pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)载体脂质体法转染HEK293细胞，经过筛选获得了获得稳定、高表达SARS-COV-2 Spike(S1)蛋白的重组HEK293细胞株。
2、HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞，是载体构建理想的工具细胞；所得重组HEK293-SARS-COV-2 Spike(S1)细胞经过检测SARS-COV-2Spike(S1)得到稳定高表达。
3、选择SARS-COV-2 Spike(S1)重组抗原作为标记材料，并应用于金标免疫层析系统，该检测体系为直接标记捕获，与以原核表达的SARS-COV-2NP重组蛋白为包被的IgM/IgG检测产品相比较，灵敏度和特异性均较大幅度的提高，为临床提供一种既快速又能准确检测新冠肺炎IgM/IgG的新方法，为诊断新冠肺炎感染提供帮助，具有良好的市场前景。
本发明建立了重组SARS-COV-2 Spike(S1)蛋白HEK293细胞，制备了重组SARS-COV-2 Spike(S1)蛋白，进一步将构建的SARS-COV-2 Spike(S1)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)转染HEK293细胞，获得稳定、高表达SARS-COV-2Spike(S1)分子的HEK293细胞株，并将SARS-COV-2 Spike(S1)重组蛋白应用于免疫层析检测试剂的研制。本发明使用SARS-COV-2 Spike(S1)重组抗原作为标记材料，并应用于金标免疫层析系统，该检测体系为直接标记捕获，与以原核表达的SARS-COV-2NP重组蛋白为包被的IgM/IgG检测产品相比较，灵敏度和特异性均较大幅度的提高。
附图说明
图1为SARS-CoV-2 Spike蛋白结构。
图2为表达的SARS-COV-2 Spike(S1)蛋白氨基酸序列。
图3为全合成的密码子优后的SARS-COV-2 Spike(S1)基因序列。
图4为pcDNA3.1(+)载体的质粒图谱。
图5为pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)载体Kpn I和Xba I酶切产物进行琼脂糖电泳检测结果，结果显示2道为重组表达载体pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)经酶切后可以看到两条带，上面一条为5400bp的pcDNA3.1(+)，下面一条是大小为2100bp的SARS-COV-2 Spike(S1)基因，而3道对照的空载体pcDNA3.1(+)经酶切后只看见一条5400bp的条带。
图6为经质粒pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)转化HEK293-SARS-COV-2Spike(S1)细胞的SARS-COV-2 Spike(S1)表达平的WESTERN BLOT印迹检测图，结果显示质粒pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)转化的四个阳性克隆1、2、3、5道在特定位置都有强的显色，4道的对照空白质粒转化的克隆未见显色.
图7为重组SARS-COV-2 Spike(S1)经纯化收集样品的SDS-PAGE电泳图。
图8为组装好的新冠肺炎IgM/IgG金标层析检测试剂。
图9为新冠肺炎抗体免疫层析试剂检测示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1真核表达载体pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)的构建
a、密码子优化，基因合成及克隆载体构建
采用哺乳动物细胞优势密码子反向翻译SARS-COV-2 Spike(S1)的氨基酸序列图2，获得由哺乳动物细胞优势密码子组成的SARS-COV-2 Spike(S1)基因序列，其核苷酸序列SEQ ID NO:2所示。
根据SARS-COV-2S基因(GenBank:MN908947.3)，采取全基因合成方法，委托通用生物系统(安徽)有限公司合成全基因，并在其5′和3′端分别加上GGTACC和TCTAGA以分别获得内切酶KpnⅠ和Xba I的酶切识别位点，序列长度2112bp，将密码子替换成上面获得的哺乳动物细胞偏爱密码子，其核苷酸序列SEQ ID NO:2所示，连接在pGEM-T Vector(Promega公司产品)载体上，获得了SARS-COV-2 Spike(S1)和His Tag融合蛋白全基因序列，其基因序列如图3所示。
b、重组表达载体构建
以pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司产品，其质粒图谱，如图4所示)为基础载体，选择Kpn I和Xba I酶切位点作为连接外源基因的多克隆位点和表达克隆载体酶切鉴定位点，制备重组表达载体构建。
具体步骤为：
将上述步骤获得的含了SARS-COV-2 Spike(S1)基因质粒载体1μg用限制性内切酶Kpn I/Xba I进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的1μg载体pcDNA3.1(+)，经1％琼脂糖电泳，且胶回收目的片段和载体片段。1％琼脂糖电泳检测回收片段的量，按相对分子数目的片段：载体片段＝4:1混合，加入5μT4连接酶16℃连接过夜。取5μl连接产物转化100μl预制好的DH5α感受态细胞，涂布抗性LB平板，37℃倒置培养过夜。挑选含有阳性质粒的克隆，将得到的含有SARS-COV-2 Spike(S1)的重组表达载体对的克隆命名为pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)。
c、重组表达载体的酶切鉴定
将待鉴定含重组表达载体pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)克隆小量培养，碱法快速抽提质粒，用限制性内切酶Kpn I/Xba I进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳检测，结果如图5所示。其中泳道2为重组表达载体pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果，说明真核表达载体pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2Spike(S1)构建成功。
实施例2 pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)表达载体转染HEK293细胞及培养
a、采用脂质体2000将质粒转入HEK293细胞(脂质体2000购自美国GIBCO，Invitrogen公司，按照脂质体2000试剂盒说明书操作)，DMEM培养基(Dulbecco′s ModifiedEagle Media)加G418浓度600ng/ml筛选14天，挑取G418抗性单克隆传代培养，将调整G418浓度调整为300ng/ml，DMEM培养基筛选培养，得到pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)阳性转染的克隆。
b、重组蛋白的WESTERN印迹鉴定收集阳性克隆细胞用SDS-PAGE loading Buffer重悬后，开水煮10min，10000rpm离心10min，上清经SDS-PAGE电泳分离，用半干转移系统将蛋白转印到PVDF膜上，依次经10g/L BSA封闭，4℃过夜，加入Rabbit anti SARS Spike N-Term(Meridian Life Science公司产品，1:2000)，37℃作用1h，PBS彻底洗涤后，再与HRP标记的羊抗兔IgM/IgG(二抗，1:2000)相互作用，37℃，1h，PBS充分洗涤后经DAB显色。以空载体转染的细胞作为阴性对照，对表达产物进行WESTERN印迹鉴定。结果如图6所示：泳道1、2、3和5为随机挑选的4个pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)转化HEK293的阳性克隆，3道为对照质粒pcDNA3.1(+)转化HEK293细胞的阳性克隆。
取上述实施的、经WESTERN印迹鉴定阳性的细胞克隆，用胰酶消化，加入新鲜的DMEM培养基制成细胞悬液后细胞计数。根据细胞计数结果稀释细胞悬液至浓度为1×104/mL，每25ml小瓶接种1mL细胞悬液，共接种30瓶细胞。5％CO2，37℃培养箱培养48h，3000g，5min离心收获细胞，放于-80℃保存。
实施例3 HEK293-SARS-COV-2 Spike(S1)蛋白的分离纯化
a、由于实施例1构建的重组表达载体pcDNA3.1(+)-SARS-COV-2 Spike(S1)上带有融合标签(His·Tag)的基因序列，所以表达出的目的蛋白上也带有His·Tag标签。因此，利用络合Ni的琼脂糖通过亲和层析法可以进行目的蛋白的纯化，亲和层析柱购于GEHealthcare公司。
取实施例2制备的收获的冻存细胞，用预冷的细胞裂解液裂解用Buffer A(20mMTris，0.5M NaCl pH 8.0)重悬，150W超声裂解10次，每次5s，间歇10s，4℃条件下12000rpm/min离心20min收集上清准备上样。
具体纯化步骤如下：
用Buffer A平衡Ni柱至OD280读数恒定；
收集的样品滤过上清上柱；
用含有40mM咪唑的Buffer A过柱淋洗去掉杂蛋白；
d、用含有300mM咪唑的Buffer A缓慢过柱，将纯化的目的蛋白收集到离心管中；
e、取纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE，观察，目的蛋白的纯化效果。
图7为纯化的SARS-COV-2 Spike(S1)SDS-PAGE蛋白电泳图；其中，泳道1为15.0kda～250.0kDa的蛋白质分子量标准，泳道2为样品纯化后的SARS-COV-2 Spike(S1)SDS-PAGE检测结果。
实施例4新冠肺炎检测试剂制备
使用实施例3制备的SARS-COV-2 Spike(S1)重组蛋白抗原作为标记材料，并应用于金标免疫层析系统，该检测体系为直接标记捕获。
一、胶体金的制备
取1ml 2％氯金酸(HAuCl4)溶液，加入到100ml水中，加热至沸，再加入1.5ml2％柠檬酸三钠，继续煮沸5分钟，直到颜色不再发生变化，此时制得的胶体金颗粒为40nm。
二、金标制备
1、抗原稀释
取一定量的实施例3制备的SARS-COV-2 Spike(S1)重组抗原，用pH值8.0，0.1M浓度的PB缓冲液稀释至1mg/ml，4℃保存备用。
2、抗原偶联
取250ml制备好的40nm胶体金，用0.2M的K2CO3溶液调节pH至8.0，然后加入2.5ml上述稀释至1.0mg/ml的重组抗原，磁力搅拌器上搅拌0.5小时，然后按2％的比例加入10％BSA，继续搅拌0.5小时。
3、金标工作液的制备
将上述已经偶联好抗原的胶体金溶液离心(10000rpm，15分钟)，弃去上清液，保留沉淀。沉淀用含20％蔗糖的金标稀释液(0.02M Tris+1％BSA，pH8.0)复溶至10mL，4℃保存备用。
4、金标条的制备
取上述金标工作液10ml，上样到喷金机，设定参数选取喷量为1.5μl/cm。打开气泵，待气压稳定后，启动喷金机，将金标工作液均匀喷到30cm×8.5cm的金标垫上。将喷好金标工作液的金标垫放入37℃恒温箱内干燥12～24小时后取出，按8mm宽度切好金标条放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋中，常温保存备用。
三、NC膜的选择
选取市场上使用率较高的三家公司的NC膜：PALL Vivid 170、YN 120B、SartoriusCN 140，规格均为2.5×30cm，带背衬，孔径为8um，进行对比，要求膜各点的宽度与厚度均一；跑水性能符合要求：4cm NC膜层析的时间在100s～140s，且无倾斜和空白；性能测试符合要求：将三种NC膜分别包被1.0mg/ml的鼠抗人IgG并配对相应的金标条，测试一份阴性样本、一份临界阴性样本(要求3～5分钟显色)以及一份临界阳性样本(要求5分钟之内显色)。
表1
(注：“-”表示阴性结果；“+”表示阳性结果；“+/-”表示不明显阴性结果)
测试结果图如表1所示，结果显示：Sartorius CN 140符合预期要求，因此选择Sartorius CN 140作为新冠肺炎抗体检测试剂盒的生产用NC膜。
四、NC膜的包被
1、兔抗SARS-COV-2 Spike(S1)重组抗原抗体、鼠抗人IgM单抗与鼠抗人IgG单抗稀释
将一定量的抗SARS-COV-2 Spike(S1)重组抗原抗体(北京义翘神州公司产品)，用0.01M PBS(含3％海藻糖，pH 7.4)，稀释至终浓度1.0mg/ml，4℃保存备用。
将一定量的鼠抗人IgM单抗(IgM-MAb)(杭州隆基生物公司产品)，用0.01M PBS(含3％海藻糖，pH 7.4)，稀释至终浓度1.0mg/ml，4℃保存备用。
将一定量的鼠抗人IgG单抗(IgG-MAb)(杭州隆基生物公司产品)，用0.01M PBS(含3％海藻糖，pH 7.4)，稀释至终浓度1.0mg/ml，4℃保存备用。
2、兔抗SARS-COV-2 Spike(S1)重组抗原抗体、鼠抗人IgM单抗与鼠抗人IgG单抗包被
将上述1.0mg/ml的兔抗SARS-COV-2 Spike(S1)重组抗原抗体、鼠抗人IgM单抗与鼠抗人IgG单抗上样到点膜机的工作液柱中，设定参数，选择喷量为1.0μl/cm。调整划膜头的位置。启动点膜机，将溶液分别包被到NC膜上的C线、T1和T2的位置。将包被好点膜工作液的NC膜放入37℃恒温箱内干燥12～24小时后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋中，常温保存备用。
五、样品垫的制备
将玻璃纤维素膜切割成17×300mm的规格，按3.5ml/条用玻纤处理液(表2)处理，放入37℃恒温箱内干燥12～24小时后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋中，常温保存做样品垫备用。
表2玻纤处理液配方
物料 含量
Tris 10mM
PVP-10 1％
鼠抗RBC单抗 0.1mg/ml
六、试剂条的组装
如图8所示，将制备好的NC膜2、金标条4、样品垫5以及吸水垫3分别粘贴到PVC板1上，然后切割成4.0mm条，该PVC板首尾两端为样品垫5及吸水垫3。如有需要，将图7的试剂条压入对应检测试剂模具即可用于检验。
七、试纸条及其使用和结果判定方法
1、组成
由吸水垫3、NC膜2、金标结合垫4、样品垫5和PC衬板1组成；
所述NC膜包被有质控线C线和检测线T1线、T2线，C线为兔抗SARS-COV-2Spike(S1)重组抗原抗体，T1线为抗人IgG单抗，T2线为抗人IgM单抗；
所述NC为Sartorius CN 140；
所述金标结合垫为吸附有胶体金标记的SARS-COV-2的Spike蛋白的S1蛋白亚基(实施例3制备得到)；
所述胶体金标记的SARS-COV-2的Spike蛋白的S1蛋白亚基，胶体金颗粒平均直径为40nm。
2、使用方法
将组装好的试纸条平放于工作台面，用一次性吸管吸取一滴全血/或血清/或血浆(约10μl)滴加到试剂条的样品孔中(样品垫上)(图9中S孔)，滴加两滴Buffer(0.01MPBS+2％Casein)，计时10～15分钟，进行检测结果判定：
试剂条检测窗口的C线位置出现显色条带，T1线和T2线位置均未出现显色条带表示检测结果为阴性。C线位置出现显色条带，同时T1线位置出现显色条带表示新冠肺炎IgM抗体阳性，T2线位置出现显色条带表示新冠肺炎IgG抗体阳性。如果C线位置不出现条带，T1和/或T2线位置有条带出现/或无显色条带出现皆判定检测结果为无效检测。试剂条使用方法示意及结果判定如图9所示。
实施例5新冠肺炎检测试剂的检测应用及结果
实施例4制备的检测试剂盒(试纸条)适用于新冠肺炎抗体的检测，该试剂盒已进行了55例新冠肺炎确诊患者的临床检测。抗体(IgM和/或IgG)检测阳性率达到98.18％，而对398名健康人检测中无一阳性，显示出了良好的敏感性和特异性，并实现对新冠肺炎患者全周期管理。结果显示，该新冠肺炎IgM/IgG免疫层析试剂与其他病原微生物(肺炎衣原体、肺炎支原体、腺病毒等)引起的呼吸系统感染患者血清及高血压、糖尿病患者血清无交叉反应，与含有人冠状病毒229E、人冠状病毒NL63、人冠状病毒HKU1抗体样本无交叉反应。与含有MERS-CoV抗体以及SARS-CoV抗体样本均可发生交叉反应，可以同时应用于SARS和MERS既往感染的筛查。
对比例：
使用原核表达的SARS-COV-2NP重组蛋白为包被的IgM/IgG检测产品与本实施例4制备的试剂盒检测同一批样本。检测结果如表3所示。
注：自制的N蛋白为包被的新冠肺炎IgG/IgM检测试剂的制备步骤与实施例4相同，仅SARS-COV-2 Spike(S1)重组抗原替换为重组SARS-CoV-2N蛋白(杭州博森生物公司产品)
结果显示本发明制备得到的试剂盒与相比较，灵敏度和特异性均较大幅度的提高。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 杭州泰熙生物技术有限公司
<120> SARS-COV-2 Spike 蛋白在新冠肺炎检测中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 696
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val Asn
1 5 10 15
Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr
20 25 30
Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His
35 40 45
Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe
50 55 60
His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn
65 70 75 80
Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys
85 90 95
Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys
100 105 110
Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys
115 120 125
Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr
130 135 140
His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met
165 170 175
Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val
180 185 190
Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro
195 200 205
Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro
210 215 220
Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu
225 230 235 240
Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly
245 250 255
Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg
260 265 270
Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val
275 280 285
Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser
290 295 300
Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln
305 310 315 320
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
325 330 335
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
340 345 350
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
355 360 365
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
370 375 380
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
385 390 395 400
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
405 410 415
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
420 425 430
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
435 440 445
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
450 455 460
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
465 470 475 480
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
485 490 495
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
500 505 510
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
515 520 525
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly
530 535 540
Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro
545 550 555 560
Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg
565 570 575
Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly
580 585 590
Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala
595 600 605
Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His
610 615 620
Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn
625 630 635 640
Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn
645 650 655
Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser
660 665 670
Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Gly Gly
675 680 685
Ser Gly His His His His His His
690 695
<210> 2
<211> 2112
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtaccatgg tgttcctggt gctgctgccc ctggtgtcct cccagtgcgt gaacctgacc 60
acccgcaccc agctgccccc cgcctacacc aactccttca cccgcggcgt gtactacccc 120
gacaaggtgt tccgctcctc cgtgctgcac tccacccagg acctgttcct gcccttcttc 180
tccaacgtga cctggttcca cgccatccac gtgtccggca ccaacggcac caagcgcttc 240
gacaaccccg tgctgccctt caacgacggc gtgtacttcg cctccaccga gaagtccaac 300
atcatccgcg gctggatctt cggcaccacc ctggactcca agacccagtc cctgctgatc 360
gtgaacaacg ccaccaacgt ggtgatcaag gtgtgcgagt tccagttctg caacgacccc 420
ttcctgggcg tgtactacca caagaacaac aagtcctgga tggagtccga gttccgcgtg 480
tactcctccg ccaacaactg caccttcgag tacgtgtccc agcccttcct gatggacctg 540
gagggcaagc agggcaactt caagaacctg cgcgagttcg tgttcaagaa catcgacggc 600
tacttcaaga tctactccaa gcacaccccc atcaacctgg tgcgcgacct gccccagggc 660
ttctccgccc tggagcccct ggtggacctg cccatcggca tcaacatcac ccgcttccag 720
accctgctgg ccctgcaccg ctcctacctg acccccggcg actcctcctc cggctggacc 780
gccggcgccg ccgcctacta cgtgggctac ctgcagcccc gcaccttcct gctgaagtac 840
aacgagaacg gcaccatcac cgacgccgtg gactgcgccc tggaccccct gtccgagacc 900
aagtgcaccc tgaagtcctt caccgtggag aagggcatct accagacctc caacttccgc 960
gtgcagccca ccgagtccat cgtgcgcttc cccaacatca ccaacctgtg ccccttcggc 1020
gaggtgttca acgccacccg cttcgcctcc gtgtacgcct ggaaccgcaa gcgcatctcc 1080
aactgcgtgg ccgactactc cgtgctgtac aactccgcct ccttctccac cttcaagtgc 1140
tacggcgtgt cccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta cgccgactcc 1200
ttcgtgatcc gcggcgacga ggtgcgccag atcgcccccg gccagaccgg caagatcgcc 1260
gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg gaactccaac 1320
aacctggact ccaaggtggg cggcaactac aactacctgt accgcctgtt ccgcaagtcc 1380
aacctgaagc ccttcgagcg cgacatctcc accgagatct accaggccgg ctccaccccc 1440
tgcaacggcg tggagggctt caactgctac ttccccctgc agtcctacgg cttccagccc 1500
accaacggcg tgggctacca gccctaccgc gtggtggtgc tgtccttcga gctgctgcac 1560
gcccccgcca ccgtgtgcgg ccccaagaag tccaccaacc tggtgaagaa caagtgcgtg 1620
aacttcaact tcaacggcct gaccggcacc ggcgtgctga ccgagtccaa caagaagttc 1680
ctgcccttcc agcagttcgg ccgcgacatc gccgacacca ccgacgccgt gcgcgacccc 1740
cagaccctgg agatcctgga catcaccccc tgctccttcg gcggcgtgtc cgtgatcacc 1800
cccggcacca acacctccaa ccaggtggcc gtgctgtacc aggacgtgaa ctgcaccgag 1860
gtgcccgtgg ccatccacgc cgaccagctg acccccacct ggcgcgtgta ctccaccggc 1920
tccaacgtgt tccagacccg cgccggctgc ctgatcggcg ccgagcacgt gaacaactcc 1980
tacgagtgcg acatccccat cggcgccggc atctgcgcct cctaccagac ccagaccaac 2040
tccccccgcc gcgcccgctc cgtgggcggc tccggccacc accaccacca ccactaatct 2100
agataatcta ga 2112

Claims (3)

1.一种新冠肺炎检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为胶体金检测试纸，由吸水垫3、NC膜2、金标结合垫4、样品垫5和PC衬板1组成；
所述NC膜包被有质控线C线和检测线T1线、T2线，C线为兔抗SARS-COV-2 Spike(S1)重组抗原抗体，T1线为抗人IgG单抗，T2线为抗人IgM单抗；
所述NC膜为Sartorius CN 140；
所述金标结合垫为吸附有胶体金标记的SARS-COV-2的Spike蛋白的S1蛋白亚基；
所述胶体金标记的SARS-COV-2的Spike蛋白的S1蛋白亚基，胶体金颗粒平均直径为40nm。
2.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：核苷酸序列如SEQID NO:1所示编码基因连接入表达载体得到重组载体，重组载体转染细胞德奥重组细胞，重组细胞表达得到SARS-COV-2的Spike蛋白的S1蛋白亚基；
SARS-COV-2的Spike蛋白的S1蛋白亚基与40nm胶体金偶联后吸附于金标结合垫；
NC膜包被C线包被兔抗SARS-COV-2 Spike(S1)重组抗原抗体，T1线包被抗人IgG单抗，T2线包被抗人IgM单抗；
吸水垫3、NC膜2、金标结合垫4和样品垫5依次固定于PC衬板1表面。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pcDNA3.1(+)，所述细胞为HEK293。
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