CN111929438B - 一种检测非洲猪瘟病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条及其应用 - Google Patents

一种检测非洲猪瘟病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测非洲猪瘟病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条及其应用，属于兽医生物诊断制品的生产和技术领域。该试纸条包括底板，所述底板上依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；结合垫上包被有量子点微球标记的重组蛋白P30V和重组多肽串联蛋白R10；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线处包被有羊抗猪IgG多抗，检测线靠近所述结合垫一侧设置；质控线处包被有非洲猪瘟病毒P30单抗，质控线靠近所述吸水垫一侧设置。配合所述试纸条使用的样本稀释液，是含有BSA和Tween20的PBS缓冲液。本发明检测方法，可用于非洲猪瘟病毒抗体的快速、高特异性、高灵敏度的定性或定量检测。

Description

一种检测非洲猪瘟病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条及 其应用
技术领域
本发明属于兽医生物诊断制品的生产和技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染引起的家猪和野猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，是我国一类动物疫病，也是世界动物卫生组织(OIE)法定报告动物疫病。
ASFV是一种复杂的、有囊膜的、双股DNA病毒，直径170～190kb，具有末端交联和反转重复区，其编码151-167种蛋白，成熟的病毒粒子包含有约50多种结构蛋白。
目前针对ASFV防控尚无有效的商品化疫苗，因此疫情防控的监测与诊断变得至关重要。传统的检测非洲猪瘟病毒抗体的方法有间接免疫荧光(IFA)、酶联免疫法(ELISA)和胶体金免疫层析法。其中IFA的敏感性偏低，需要荧光操作人员和荧光显微镜，成本高昂，限制了在现场快速检测中的应用。ELISA以抗原抗体特异性反应为原理检测动物具有非洲猪瘟病毒抗体，具有灵敏度高，特异性强等优点，但操作较为繁琐，耗时较长，加之需要酶标仪、恒温箱等设备，在基层养殖场难以展开实时检测。目前使用最为广泛的是胶体金检测试纸条，和ELISA相同以抗原抗体特异性反应为原理，检测非洲猪瘟病毒抗体，具有耗时短、成本低、操作简便等优点，但美中不足的是灵敏度低、无法定量检测。
发明内容
针对现有问题的不足，本发明的第一个目的是提供一种检测非洲猪瘟病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条，可用于非洲猪瘟病毒抗体的快速、高特异性、高灵敏度的定性或定量检测。
本发明的第二个目的是提供配合该检测非洲猪瘟病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条的样本稀释液。
本发明的第三个目的是以非诊断为目的的检测非洲猪瘟病毒抗体的方法，该方法操作简单，无需经过专业的培训，可以很好地胜任各种现场、基层实验室等环境下的检测；结合较荧光显微镜和酶标仪价格更为低廉的紫外光发射器或荧光检测仪，可以对结果进行定量，通过读取检测线和质控线的荧光强度，定量测定抗体效价。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种检测非洲猪瘟病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条，包括底板，所述底板上依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述的结合垫上包被有量子点微球标记的重组蛋白P30V和量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10；所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线处包被有羊抗猪IgG多抗，所述检测线靠近所述结合垫一侧设置；所述质控线处包被有非洲猪瘟病毒P30单抗，所述质控线靠近所述吸水垫一侧设置。
在本发明中，所述非洲猪瘟病毒P30单抗购自南京文鼎生物医药科技有限公司，货号为Mab0152；所述羊抗猪IgG多抗购自Bethyl公司，货号为A100-105a。
在本发明中，所述样品垫是将玻璃纤维采用含有牛血清白蛋白和Tween20的Tris-HCl缓冲液浸泡处理后所得.
在本发明中，所述结合垫是将玻璃纤维采用含有牛血清白蛋白、蔗糖、Tween20和PEG1500的Tris-HCl缓冲液浸泡处理后，喷涂含有量子点微球标记的重组蛋白P30V和量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10的微球稀释液后所得。
在本发明中，所述重组蛋白P30V的序列如SEQ ID NO:4所示；所述重组多肽串联蛋白R10的序列如SEQ ID NO:2。
在本发明中，将量子点微球分别与重组蛋白P30V和重组多肽串联蛋白R10偶联，分别得到量子点微球标记的重组蛋白P30V和量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10；然后将量子点微球标记的重组蛋白P30V和量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10按照体积比为1：0.5-1.5混合，得到非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物；将所述非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物与含有BSA、蔗糖和Tween20的PBS缓冲液按照体积比1:5-7混合，得到微球稀释液。
在本发明中，所述量子点微球与重组蛋白P30V的质量比为5-7:1，所述量子点微球与重组多肽串联蛋白R10的质量比为5-7:1。
本发明还提供配合所述试纸条使用的样本稀释液，是含有BSA和Tween20的PBS缓冲液。
本发明还提供以非诊断为目的的采用所述量子点微球免疫层析试纸条和所述样本稀释液检测非洲猪瘟病毒抗体的方法：将血清样品加入样本稀释液中稀释后，滴加至所述试纸条的样品垫上，反应后，采用紫外光发射器或荧光检测仪检测C线和T线。
在本发明中，通过标准曲线和荧光检测仪检测C线和T线处数值，计算非洲猪瘟病毒抗体效价。
本发明的实验原理为间接法，通过量子点微球标记的重组蛋白P30V和量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10捕获血清中的非洲猪瘟病毒抗体，被捕获的抗体和检测线上包被的羊抗猪IgG多抗结合固定，量子点标记的重组蛋白P30V和质控线上的非洲猪瘟病毒P30单抗结合固定，并通过量子点微球发光显色。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1.本发明提供的检测非洲猪瘟病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条，量子点微球具有均一度高，单分散性好，稳定性强等优点，使用量子点微球作为标记物制作的试纸条批次间差异较小。
2.本发明提供的检测非洲猪瘟病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条，其制备方法，操作易上手，所需原料简单，可在较短时间内掌握，有广阔的市场前景和较大的经济收益。
3.采用本发明量子点微球免疫层析试纸条和样本稀释液可以定性或定量检测非洲猪瘟病毒抗体，特异性强，灵敏度高，稳定且具有较好的重复性。
4.本发明的检测方法操作简单，无需经过专业的培训，可以很好地胜任各种现场、基层实验室等环境下的检测；结合荧光检测仪，可以对结果进行定量，通过读取检测线和质控线的荧光强度，定量测定抗体效价。
附图说明
图1是本发明实施例1重组多肽串联蛋白R10的表达鉴定图，其中泳道8是纯化后的重组多肽串联蛋白R10，泳道9是纯化后的重组多肽串联蛋白R10和ASFV抗体阳性参考血清的Western-bloting鉴定，M为蛋白maker。
图2是本发明实施例1所述的重组蛋白P30V的表达鉴定图，其中泳道10是纯化后的重组蛋白P30V，泳道11是纯化后的重组蛋白P30V和ASFV抗体阳性参考血清的Western-bloting鉴定，M为蛋白maker。
图3是本发明检测非洲猪瘟抗体的量子点微球免疫层析试纸条的结构示意图；
图4是本发明检测非洲猪瘟抗体的量子点微球免疫层析试纸条的剖面图；
图5是本发明检测非洲猪瘟抗体的量子点微球免疫层析试纸条的俯视图；
图6是采用本发明试纸条配合本发明样本稀释液检测非洲猪瘟病毒抗体的标准曲线。
其中：1-检测非洲猪瘟病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条；2-底板；3-样品垫；4-结合垫；5-硝酸纤维素膜；6-检测线；7-质控线；8-吸水垫。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的优选实施方式进行详细说明。此外需要理解的是，以下的实施例仅是为了对本发明作进一步说明，帮助理解。而不是用于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围不受任何实施例形式上的限制。下述实施例中所使用的的实验方法如无特殊说明，皆为常规方法。
本发明中：MES、EDC、NHS、Tween-20、PEG1500、蔗糖、弗氏完全佐剂、硫柳汞购自Sigma；Tris-HCl、BSA购自Thermo Fisher；羊抗猪IgG多抗、羊抗猪IgG酶标抗体购自Bethyl；非洲猪瘟病毒P30单抗购自南京文鼎生物医药科技有限公司，货号为Mab0152；小牛血清购自Gibco；玻璃纤维膜购Ahlstrom；硝酸纤维素膜购自Sartorius；超声波仪购自Bandelin；吸水滤纸和底板购自上海金标生物科技有限公司；量子点微球(产品编号为FM610C，水合粒径是120nm)购自北京纳晶生物科技有限公司；荧光检测仪(MD-600型荧光免疫分析仪)购自南京微测生物科技有限公司。
0.02M、pH 7.0的MES缓冲液配制方法：将4.265g MES溶于1L的双蒸水中，再调节pH至7.0。
PBS缓冲液(浓度为0.01M、pH7.4)配制方法：将3g的Na2HPO4.12H2O、0.2g的KH2PO4、8g的NaCl和0.2g的KCl溶于1L的双蒸水中，再调节pH至7.4。
Tris-HCl缓冲液(浓度为50mM、pH8.0)配制方法：将7.88g Tris溶于1L的双蒸水中，再添加盐酸调节pH至8.0。
实施例1制备重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白P30V
1.P54E基因重组载体的构建
参考NCBI数据库公布的我国首例非洲猪瘟P54全基因序列(MH766894，E183L，162222-162776)，设计了重组多肽串联蛋白R10的基因(SEQ ID NO:1)，重组多肽串联蛋白R10的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。重组多肽串联蛋白R10的基因是符合大肠杆菌嗜性的。采用基因合成的方式(由南京金斯瑞生物科技有限公司)获得重组多肽串联蛋白R10的基因，将重组多肽串联蛋白R10的基因插入载体pET-28a(+)的多克隆酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ之间，得到重组质粒pET-28a-R10。
通过“热激”法，将重组质粒pET-28a-R10转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌pET-28a-R10(BL21)。
2.P30V基因重组载体的构建
参考NCBI数据库公布的我国首例非洲猪瘟CP204L基因序列(MH766894，CP204L，124770～125375)，对密码子进行了针对大肠杆菌的嗜性优化，得到了重组蛋白P30V的基因序列，如SEQ ID NO：3所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。采用基因合成的方式(南京金斯瑞生物科技有限公司)获得重组蛋白P30V的基因，将该基因序列插入载体pET-21a(+)的多克隆酶切位点NdeⅠ和XholⅠ之间，得到重组质粒pET-21a-P30V。
通过“热激”法，将重组质粒pET-21a-P30V转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌pET-21a-P30V(BL21)。
3.重组蛋白的表达及纯化
将重组菌pET-28a-R10(BL21)在含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养，将pET-21a-P30V(BL21)在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，培养条件均如下：培养温度为37℃、摇床转速为180r/min，待OD600＝0.6～0.8时降温至20℃，30min后加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导表达，然后在20℃培养17小时，收集菌体。用缓冲液洗涤菌体，菌体重悬后加入PMSF(苯甲基磺酰氟)进行超声波裂解，4℃下10000r/min离心30分钟。取上清，按照Ni-NTA亲合层析介质(金斯瑞生物科技有限公司产品，Cat.No：L00250)的说明书纯化各重组蛋白。从图1的泳道8可见，纯化后的重组多肽串联蛋白R10在19KDa左右出现特异性的条带，与预期一致。从图2的泳道10可见，重组蛋白P30V在43KDa左右出现特异性的条带，与预期一致。因此重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白P30V成功表达，置于-70℃以下保存备用。
4.重组蛋白的抗原性检测:将纯化的重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白P30V经SDS-PAGE电泳后转印至NC膜，进行Western-bloting检测。用5％脱脂乳封闭过夜后，以1：200稀释的非洲猪瘟抗体阳性参考血清(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)作为一抗，37℃孵育2小时。TBST洗涤5次，5分钟/次。用1:20000倍稀释的HRP-羊抗猪IgG酶标抗体(购自Bethyl，货号为a100-105p)作为二抗，37℃孵育1.0小时。TBST洗涤5次，5分钟/次。ECL避光显色5min，曝光10sec。结果：重组多肽串联蛋白R10在19KDa左右出现了特异性反应条带(如图1泳道9)；重组蛋白P30V在43KDa左右出现了特异性反应条带(如图2泳道11)。上述结果说明，重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白P30V均可与非洲猪瘟抗体阳性参考血清发生特异性反应，具有良好的抗原性。
实施例2本发明微球稀释液的制备
本发明微球稀释液：含有非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物。非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物是量子点微球标记的重组蛋白P30V和量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10的混合物。
本发明微球稀释液的制备方法包括如下步骤：
(1)制备量子点微球标记的重组蛋白P30V
量子点微球的活化：取50μL浓度为1.2μg/μL的量子点微球悬浮液加入至50μL浓度为0.02M、pH 7.0的MES缓冲液中，加入终浓度为10mg/mL的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和10mg/mL的NHS(N-羟基丁二酰亚胺)，在37℃摇床中恒温孵育20分钟。再至离心机中10000g离心20分钟，弃上清，加入50μL浓度为0.02M、pH 7.0的MES缓冲液重悬，得到活化的量子点微球。
量子点微球的偶联：在上述活化的量子点微球中，加入10μg重组蛋白P30V(实施例1制备)，于37℃摇床中恒温孵育2小时，将重组蛋白P30V与量子点微球进行偶联，得到重组蛋白P30V和量子点微球的偶联物。
量子点微球的封闭：在所得重组蛋白P30V和量子点微球的偶联物中，加入2μL质量百分浓度为10％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液，在37℃摇床中恒温孵育15分钟，然后在离心机中10000g离心10分钟，弃上清，加入100μL浓度为0.02M、pH 7.0的MES缓冲液重悬，得到量子点微球标记的重组蛋白P30V溶液，置于4℃冰箱中保存。
(2)制备量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10
按照本实施例标题(1)中相同方法，制备量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10溶液，不同之处仅在于，将10μg重组蛋白P30V替换为10μg重组多肽串联蛋白R10。
(3)混合
配置含有0.5％(质量百分浓度)BSA、5％(质量百分浓度)蔗糖和0.2％(体积百分浓度)Tween20的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液。将本实施例标题(1)制备的量子点微球标记的重组蛋白P30V溶液和本实施例标题(2)制备的量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10溶液以体积比为1:1混匀，得到非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物。将含有0.5％(质量百分浓度)BSA、5％(质量百分浓度)蔗糖和0.2％(体积百分浓度)Tween20的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液和非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物以体积比为5:1混匀，得到本发明微球稀释液，于4℃避光保存。
实施例3本发明试纸条的制备
如图3-5，检测非洲猪瘟病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条，包括底板2，在底板上依次设置样品垫3、结合垫4、硝酸纤维素膜5和吸水垫8。硝酸纤维素膜5上设有检测线6和质控线7，检测线6靠近结合垫一侧设置，检测线处包被有羊抗猪IgG多抗；质控线7靠近吸水垫8一侧设置，质控线处包被有非洲猪瘟病毒P30单抗。
1.样品垫的制备
用含有3％(质量百分浓度)BSA、1％(体积百分浓度)Tween20的50mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液，将玻璃纤维浸泡处理20min，然后干燥，得到样品垫。
2.结合垫的制备
(1)用含有0.5％(质量百分浓度)BSA、8％(质量百分浓度)蔗糖、0.5％(体积百分浓度)PEG1500、0.5％(体积百分浓度)Tween20的50mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液，将玻璃纤维浸泡处理20min，然后干燥备用。
(2)在经过上述处理后的玻璃纤维上，用喷金仪喷涂实施例2制备的本发明微球稀释液，喷涂量为0.5μg/cm。喷涂量是指宽度为0.9cm的结合垫每厘米长喷涂的蛋白质量。
(3)37℃干燥5h，得到喷涂了量子点微球标记的重组蛋白P30V和量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10混合物的结合垫。
3.硝酸纤维素膜的制备
(1)将羊抗猪IgG多抗(购自Bethyl公司，货号A100-105a)用含有3％(质量百分浓度)蔗糖的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液稀释至0.8mg/mL，得到检测线溶液。含有3％(质量百分浓度)蔗糖的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液，是将蔗糖溶解在浓度为0.01M、pH7.4的PBS缓冲液中所得。
(2)将非洲猪瘟病毒P30单抗(购自南京文鼎生物医药科技有限公司，货号Mab0152)用含有3％(质量百分浓度)蔗糖的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液稀释至0.8mg/mL，得到质控线溶液。
(3)在硝酸纤维素膜上，用划膜仪喷涂检测线溶液形成T线，喷涂量为0.8μg/cm；喷涂质控线溶液形成C线，喷涂量为0.8μg/cm。喷涂量是指每厘米长的T线或C线上喷涂的蛋白质量。T线和C线的宽度均是1mm。
(4)过夜干燥，得到喷涂了检测线(T线)和质控线(C线)的硝酸纤维素膜。
4.样本稀释液
样本稀释液为含有0.6％(质量百分浓度)BSA和0.5％(体积百分浓度)Tween20的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液。将该样本稀释液记为本发明样本稀释液。
5.试纸条的组装
按照图3-5中试纸条的结构，采用如下方法组装试纸条：在正常湿度和温度下的洁净操作台上，将处理好的样品垫3、喷涂了量子点微球标记的重组蛋白P30V和量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10混合物的结合垫4、喷涂了检测线和质控线的硝酸纤维素膜5、吸水垫8(材质为吸水滤纸)依次以2-4mm重叠黏贴在底板2上，然后送入切条机，得到宽为4±0.5mm的试纸条。挑取完好整齐的试纸条，放入卡壳中，压盖完成后连同1粒干燥剂放入铝箔袋中密封保存。其中底板2为PVC板。
本实施例制备的试纸条记为本发明试纸条。
实施例4试纸条定性检测方法及结果判定
1.采用本发明试纸条和本发明样本稀释液检测非洲猪瘟病毒抗体的方法，包括如下步骤：
(1)样品处理：将采集的猪只的全血，在4000g离心15min或4℃过夜自然析出，取血清或者该血清采用标准阴性血清稀释后所得稀释液作为检测样本。
(2)撕开试纸条的铝箔袋，取出试纸条，将其放于洁净操作台上。
(3)用1mL巴氏吸管吸取检测样本，滴加1滴检测样本(约30μL)至2mL样本稀释液中。
(4)用1mL巴氏吸管吸取步骤(3)所得混合液3滴(每滴约30μL)，于样品垫上方，垂直缓慢滴加。
(5)滴加完成后，等待10-15min，判定结果。
2.定性判定结果的方法(目视法)
将反应后的试纸条采用365nm的紫外光发射器，如果试纸条的C线显色，T线也显色时，结果判定为阳性，且T线的颜色越深，则样品中的非洲猪瘟病毒抗体效价越高。当试纸条的C线显色，T线不显色时，结果判定为阴性，样品中无非洲猪瘟病毒抗体。若试纸条的C线不显色，则该试纸条的检测结果无效。
实施例5试纸条定性检测的特性
1.试纸条定性检测时的灵敏度
考察采用本发明试纸条和本发明样本稀释液定性检测非洲猪瘟病毒抗体时的灵敏度。
(1)标准阴性血清的制备：选择4-5周龄，体温、食欲、排泄正常的仔猪，且经非洲猪瘟病毒抗原荧光定量PCR检测试剂盒检测为阴性，采集血液并分离血清，加入终浓度为0.01％(质量百分浓度)的硫柳汞，-20℃保存，作为标准阴性血清。
(2)标准阳性血清的制备
采用PBS缓冲液(浓度0.01M、pH7.4)将实施例1制备得到的重组多肽串联蛋白R10调整为1mg/mL，得到R10抗原。免疫的具体方法如下：将1mg/mL的抗原与等体积的弗氏完全佐剂混合并乳化，然后肌肉注射2月龄健康仔猪1头，免疫剂量为2ml(含有1mg蛋白)/头；第一次免疫10天后，将1mg/mL的抗原与弗氏不完全佐剂按照体积比为1:1混合、乳化，按照首免时相同的剂量加强免疫1次；10天后再用二免时相同的免疫方法和免疫剂量加强免疫1次；在第三次免疫后第7天，无菌采集猪血分离血清，得到重组多肽串联蛋白R10免疫后猪只血清。采用上述相同方法，制备重组蛋白P30V免疫后猪只血清，不同之处在于将其中的重组多肽串联蛋白R10替换为重组蛋白P30V。
按照如下间接ELISA方法检测重组蛋白P30V免疫后猪只血清的抗体效价：用碳酸盐缓冲液(浓度0.01M、pH9.6)配置含有2.5μg/mL重组蛋白P30V的溶液，以每孔100μL包被酶标板，4℃包被过夜；弃去孔内液体，每孔再用250μL的PBST洗涤3次，每次5min，拍干。每孔加入200μL含10％小牛血清的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液，于37℃封闭2h，弃去孔内液体，每孔用250μL PBST洗涤3次，每次5min，拍干。加入10倍梯度稀释的待检猪血清，每孔100μL，于37℃孵育1h。弃去孔中液体，每孔用250μL PBST洗涤3次，每次5min，拍干。用酶标二抗稀释液对HRP-羊抗猪IgG酶标抗体(品牌是Bethyl，货号是A100-105p)以稀释度为1:2000进行稀释，用0.22μm的滤膜过滤，得到稀释后的HRP-羊抗猪IgG酶标抗体。每孔加入100μL稀释好的HRP-羊抗猪IgG酶标抗体，37℃反应1h。每孔加入100μL底物显色液TMB，37℃避光作用15min；再加入50μL浓度为2mol/L的硫酸水溶液终止反应。在酶标仪上测定OD450读值。收集效价大于1:1000的血清，加入终浓度为0.01％(质量百分浓度)的硫柳汞，-20℃保存。其中，PBST缓冲液是含有0.05％(体积百分浓度)Tween20的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液。酶标二抗稀释液是96mL的PBS缓冲液(浓度0.01M、pH为7.4)与4mL小牛血清的混合物。采用上述相同方法检测重组多肽串联蛋白R10免疫后猪只血清的抗体效价，不同之处在于用碳酸盐缓冲液(浓度0.01M、pH9.6)配置含有2μg/mL重组多肽串联蛋白R10的溶液，以每孔100μL包被酶标板，收集效价大于1:1000的血清，加入终浓度为0.01％(质量百分浓度)的硫柳汞，-20℃保存。
将收集的重组多肽串联蛋白R10免疫后猪只血清和重组蛋白P30V免疫后猪只血清以体积比1:1混合，得到标准阳性血清。
(3)灵敏度的检测
将标准阳性血清用标准阴性血清按照稀释度为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000、1:1024000进行稀释。用本发明样本稀释液配合本发明试纸条，分别对标准阳性血清的不同稀释度的稀释液和标准阴性血清进行检测。
检测结果：本发明样本稀释液配合本发明试纸条对标准阳性血清的稀释度为1:1024000的稀释液检测的结果为阳性，表明本发明试纸条对标准阳性血清中非洲猪瘟病毒抗体的检出限最低可达1:1024000的稀释度。采用本实施例标题1中ELISA法检测上述标准阳性血清的稀释液时，发现最低检出限为稀释度1:1600。
2.样本稀释液中缓冲液对定性检测灵敏度的影响
(1)对照样本稀释液1和对照样本稀释液2的配制
为了考察样本稀释液中组分对检测结果的影响，分别配制PBS缓冲液(浓度0.01M、pH7.4)和PBST缓冲液，作为对照样本稀释液1和对照样本稀释液2。其中，PBST缓冲液是含有0.5％(体积百分浓度)Tween20的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液。
(2)检测方法
分别采用本发明样本稀释液、对照样本稀释液1或对照样本稀释液2，配合本发明试纸条，以实施例4中方法检测本实施例标题1中标准阳性血清的各稀释度的稀释液。
(3)检测结果
在使用PBS缓冲液或PBST缓冲液时，均在检测标准阳性血清的稀释度为1：64000的稀释液时出现了假阴性，因此，检出限最低达到稀释度1：32000。采用本发明样本稀释液，假阴性未出现，检出限最低可达1:1024000的稀释度。
3.微球稀释液中非洲猪瘟病毒重组蛋白标记物对定性检测灵敏度的影响
(1)按照本发明微球稀释液的制备方法，制备对照微球稀释液1和对照微球稀释液2，不同点仅在于：步骤(3)中将含有0.5％(质量百分浓度)BSA、5％(质量百分浓度)蔗糖和0.2％(体积百分浓度)Tween20的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液与实施例2制备的量子点微球标记的重组蛋白P30V溶液以体积比为5:1混匀，得到对照微球稀释液1；步骤(3)中将含有0.5％(质量百分浓度)BSA、5％(质量百分浓度)蔗糖和0.2％(体积百分浓度)Tween20的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液与实施例2制备的量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10溶液以体积比为5:1混匀，得到对照微球稀释液2。采用实施例3中相同方法制备对照试纸条1，不同之处仅在于将其中的本发明微球稀释液替换为对照微球稀释液1。采用实施例3中相同方法制备对照试纸条2，不同之处仅在于将其中的本发明微球稀释液替换为对照微球稀释液2。
(2)将本发明样本稀释液分别配合本发明试纸条、对照试纸条1、对照试纸条2，按实施例4中方法对本实施例标题1中标准阳性血清的稀释度为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000、1:1024000的稀释液和标准阴性血清进行检测，进行灵敏度对比试验。具体结果见表1。
表1各种方法对样品检测的结果
由检测结果可以得出：采用本发明样本稀释液配合本发明试纸条进行检测时，对标准阳性血清的稀释度为1:1024000的稀释液检测结果仍然为阳性；采用本发明样本稀释液配合对照试纸条1或对照试纸条2进行检测时，均对稀释度为1:16000的稀释液检测结果为阳性，对稀释度为1:32000的稀释液检测结果为阴性。可见微球稀释液中使用量子点微球标记的重组蛋白P30V或量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10时，其灵敏度远低于使用非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物。
4.特异性检测
(1)检测方法：将本发明样本稀释液配合本发明试纸条，采用实施例4中方法，检测猪圆环病毒抗体标准阳性血清、口蹄疫病毒抗体标准阳性血清、猪繁殖呼吸综合症病毒抗体标准阳性血清、猪瘟病毒抗体标准阳性血清、猪伪狂犬病毒抗体标准阳性血清。
(2)检测结果：判定结果均为阴性，说明本发明试纸条与猪的其他病毒无交叉反应，特异性良好。
5.稳定性检测
(1)检测方法：将本发明试纸条在放入含有1粒干燥剂的铝箔袋中密封保存后，置于20℃和37℃下分别保存7日、14日、21日和28日，分别按照本实施例标题1中方法进行灵敏度的检验，按照本实施例标题4进行特异性的检验。
(2)检测结果：在20℃和37℃下保存7日、14日、21日和28日的试纸条，对标准阳性血清的稀释度为1:1024000的稀释液检测结果仍然为阳性，特异性良好，无交叉反应。
实施例6定量检测方法
1.定量检测方法
采用本发明试纸条和本发明样本稀释液定量检测样品中非洲猪瘟病毒抗体，包括如下步骤：
(1)标准曲线制作：用本发明样本稀释液配合本发明试纸条，采用实施例4中方法对实施例5标题1中标准阳性血清稀释度为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000、1:1024000的稀释液和标准阴性血清进行检测，10min后，用激发波段调至365nm的荧光检测仪，读取C线荧光强度数值(C值)和T线的荧光强度数值(T值)。标准阴性血清检测时，采用荧光检测仪读取C值和T值，分别记为C0和T0，计算T0/C0。对标准阳性血清的不同稀释度的稀释液检测时，分别采用荧光检测仪读取C值和T值，计算对应的T/C。以标准阳性血清的稀释度为横坐标，(T/C)/(T0/C0)为纵坐标，绘制为标准曲线。发现标准曲线的线性范围为稀释度1:1000至1:64000,标准曲线如图6所示，R2＝0.9701。
(2)将待检样品用本发明样本稀释液配合本发明试纸条检测，采用实施例4中方法进行检测，当样品滴加在试纸条上反应10min后，用激发波段调至365nm的荧光检测仪，读取C线荧光强度数值(C值)和T线的荧光强度数值(T值)，根据标准曲线计算效价。
2.定量检测标准阳性血清
将实施例5标题1中标准阳性血清用标准阴性血清按照稀释度为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000分别进行稀释，得到各稀释度的稀释液。将本发明样本稀释液配合本发明试纸条，采用本实施例标题1中方法对标准阳性血清各稀释度的稀释液进行定量检测，用激发波段调至365nm的荧光检测仪读取C线和T线的荧光强度，根据标准曲线计算样品中的非洲猪瘟抗体效价，并与实际效价对比，对比结果如表2所示。
表2
标准效价 标准值(荧光强度值，au) 测定值(荧光强度值，au) 测定效价/标准效价
1:1000 28.47106 27.88265 0.9718
1:2000 25.49187 24.93687 0.9690
1:4000 22.51568 22.27697 0.9840
1:8000 19.53349 19.98643 1.0380
1:16000 16.55430 16.19564 0.9599
1:32000 13.57511 14.13659 1.0942
1:64000 10.59592 10.93778 1.1147
从表2可看出，将本发明样本稀释液配合本发明试纸条，采用本实施例标题1中方法检测，用激发波段调至365nm的荧光检测仪读取C线和T线的荧光强度，根据标准曲线计算样品中的非洲猪瘟抗体效价，发现计算得到的样品中非洲猪瘟病毒抗体效价与实际效价并无明显差异，平均回收率为101.88％，表明本发明样本稀释液配合本发明试纸条可用于样品中的非洲猪瘟病毒抗体效价的定量测定。
实施例7定量检测均一性
将本发明样本稀释液配合本发明试纸条，采用实施例6中方法对实施例5标题1中标准阳性血清的稀释度为1:64000的稀释液进行检测，用激发波段调至365nm的荧光检测仪读取C值和T值，重复检测10次，检测结果均为阳性，荧光显色均一，荧光强度数值接近，方差为0.261456；取实施例5标题1中标准阴性血清重复检测10次，检测结果均为阴性，荧光显色均一，荧光强度数值接近，方差为0.311389。
实施例8本发明试纸条与胶体金检测试纸的灵敏度对比
1.制备胶体金颗粒：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原，制成20-40nm胶体金颗粒，具体方法如下：取质量百分浓度为1％的氯金酸水溶液800mL用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入质量百分浓度为16％的柠檬酸三钠水溶液1mL，继续搅拌加热5-10min，溶液呈透亮的红色。室温冷却，用去离子水补足体积至800mL，得到20-40nm胶体金颗粒，4℃保存。
2.非洲猪瘟病毒双蛋白-胶体金标记物的制备：取步骤1制备的胶体金颗粒1mL，在其中加入3.5μL浓度为0.1mol/L的K2CO3溶液以调节pH值，然后加入1.3mg的重组蛋白P30V，混匀后静置5min，加入10μL质量百分浓度为10％的聚乙二醇2000溶液，12000rpm离心7min，弃上清，加入100μL复溶液(含有0.05M三羟甲基氨基甲烷和5％蔗糖的水溶液)，混合均匀，得到胶体金标记的重组蛋白P30V。采用相同方法，制备胶体金标记的重组多肽串联蛋白R10，不同之处在于将其中的重组蛋白P30V替换为重组多肽串联蛋白R10。将胶体金标记的重组蛋白P30V和胶体金标记的重组多肽串联蛋白R10以体积比为1:1混合，得到非洲猪瘟病毒双蛋白-胶体金标记物。
3.胶体金垫的制备：将非洲猪瘟病毒双蛋白-胶体金标记物与含有0.3％(质量百分浓度)BSA、0.5％(体积百分浓度)Tween20和4％(质量百分浓度)蔗糖的50mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液按照体积比为1:100混合均匀，然后用于浸泡玻璃纤维30分钟，37℃干燥30分钟，得到胶体金垫。胶体金垫制备中，使用的含有0.3％BSA、0.5％Tween-20和4％蔗糖的50mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液及其与非洲猪瘟病毒双蛋白-胶体金标记物的体积比均是经过优化的条件。
4.试纸条组装：按照本发明试纸条的组装方法组装胶体金试纸条，不同之处在于将结合垫替换为上述胶体金垫(本实施例标题3中制备)，得到胶体金试纸条。胶体金试纸条的检测方法：采用1mL巴氏吸管吸取3滴样品(每滴约30微升)滴加在样品垫上，直接肉眼观察，当T线、C线均有显色时为阳性；当C线显色，T线不显色为阴性；当C线不显色时，结果无效。
5.本发明试纸条与胶体金试纸条灵敏度对比试验
对实施例5标题1中标准阳性血清的稀释度为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000的稀释液和标准阴性血清分别用本发明试纸条(配合本发明样本稀释液，检测方法同实施例4)与胶体金试纸条进行检测，检测结果表3所示。
表3本发明试纸条与胶体金试纸条灵敏度的对比
由检测结果可以看出：本发明试纸条与胶体金试纸分别对标准阳性血清的不同稀释度的稀释液进行检测，本发明试纸条检测标准阳性血清的稀释度为1:1024000的稀释液时为阳性。胶体金试纸条检测标准阳性血清的稀释度为1:8000的稀释液时为阳性，检测标准阳性血清的稀释度为1:16000的稀释液时为阴性，灵敏度显著低于本发明试纸条。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京农业大学
江苏省农业科学院
<120> 一种检测非洲猪瘟病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条及其应用
<130> 20200803
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 399
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 重组多肽串联蛋白R10
<400> 1
caagatcagc aatgggtgga agttaccccg ggcccgggca ccaccgcgag cgtgggcaag 60
ggcccgggcg ttaccgatcg tctggtgatg ggcccgggcc cggcggcggc gccggcggcg 120
gcgagcgcgc cggcgcaccc ggcggagccg tacaccaccg gcccgggcat gagcgcgatt 180
gaaaacctgc gtcaaggccc gggccaagat cagcaatggg tggaagttac cccgggcccg 240
ggcaccaccg cgagcgtggg caagggcccg ggcgttaccg atcgtctggt gatgggcccg 300
ggcccggcgg cggcgccggc ggcggcgagc gcgccggcgc acccggcgga gccgtacacc 360
accggcccgg gcatgagcgc gattgaaaac ctgcgtcaa 399
<210> 2
<211> 133
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 重组多肽串联蛋白R10
<400> 2
Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gly Pro Gly Thr Thr Ala
1 5 10 15
Ser Val Gly Lys Gly Pro Gly Val Thr Asp Arg Leu Val Met Gly Pro
20 25 30
Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala His Pro Ala
35 40 45
Glu Pro Tyr Thr Thr Gly Pro Gly Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Pro Gly Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gly Pro
65 70 75 80
Gly Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Gly Pro Gly Val Thr Asp Arg Leu
85 90 95
Val Met Gly Pro Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro
100 105 110
Ala His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Gly Pro Gly Met Ser Ala Ile
115 120 125
Glu Asn Leu Arg Gln
130
<210> 3
<211> 582
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 重组蛋白P30V
<400> 3
atggacttca tcctgaacat tagcatgaaa atggaagtga tctttaagac cgacctgcgt 60
agcagcagcc aagtggtttt ccacgcgggt agcctgtaca actggtttag cgtggaaatc 120
attaacagcg gccgtatcgt taccaccgcg attaaaaccc tgctgagcac cgtgaaatat 180
gacatcgtta agagcgcgcg tatttacgcg ggtcagggct ataccgagca ccaggcgcaa 240
gaggaatgga acatgatcct gcacgttctg ttcgaggaag agaccgaaag cagcgcgagc 300
agcgagaaca ttcacgagaa gaacgataac gagaccaacg aatgcaccag cagcttcgag 360
accctgtttg agcaagaacc gagcagcgaa gtgccgaaag acagcaagct gtacatgctg 420
gcgcagaaga ccgttcaaca catcgagcag tatggtaaag cgccggattt caacaaagtg 480
attcgtgcgc acaactttat ccagaccatt tacggcaccc cgctgaaaga agaggaaaag 540
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<210> 4
<211> 194
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 重组蛋白P30V
<400> 4
Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys
1 5 10 15
Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu
20 25 30
Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr
35 40 45
Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys
50 55 60
Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln
65 70 75 80
Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu
85 90 95
Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr
100 105 110
Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr
130 135 140
Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val
145 150 155 160
Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys
165 170 175
Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys
180 185 190
Lys Lys

Claims (4)

1.一种检测非洲猪瘟病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板，所述底板上依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述的结合垫上包被有量子点微球标记的重组蛋白P30V和量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10；所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线处包被有羊抗猪IgG多抗，所述检测线靠近所述结合垫一侧设置；所述重组蛋白P30V的序列如SEQIDNO:4所示；所述重组多肽串联蛋白R10的序列如SEQIDNO:2所示；质控线处包被有非洲猪瘟病毒P30单抗，所述质控线靠近所述吸水垫一侧设置；所述量子点微球与重组蛋白P30V的质量比为5-7:1，所述量子点微球与重组多肽串联蛋白R10的质量比为5-7:1；所述样品垫是将玻璃纤维采用含有牛血清白蛋白和Tween20的Tris-HCl缓冲液浸泡处理后所得；所述结合垫是将玻璃纤维采用含有牛血清白蛋白、蔗糖、Tween20和PEG1500的Tris-HCl缓冲液浸泡处理后，喷涂含有量子点微球标记的重组蛋白P30V和量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10的微球稀释液后所得。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于将量子点微球分别与重组蛋白P30V和重组多肽串联蛋白R10偶联，分别得到量子点微球标记的重组蛋白P30V和量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10；然后将量子点微球标记的重组蛋白P30V和量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10按照体积比为1：1混合，得到非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物；将所述非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物与含有BSA、蔗糖和Tween20的PBS缓冲液按照体积比1:5-7混合，得到微球稀释液。
3.一种以非诊断为目的的采用权利要求1所述量子点微球免疫层析试纸条检测非洲猪瘟病毒抗体的方法：将血清样品加入样本稀释液中稀释后，滴加至所述试纸条的样品垫上，反应后，采用紫外光发射器或荧光检测仪检测C线和T线。
4.根据权利要求3所述检测非洲猪瘟病毒抗体的方法，其特征在于通过标准曲线和荧光检测仪检测C线和T线处数值，计算非洲猪瘟病毒抗体效价。
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