CN110873792A - 非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒 - Google Patents

非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请提供非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，涉及动物传染病检测领域，具体涉及非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒。非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，包括采用重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R包被的酶标板，所述重组多肽串联蛋白R10的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述重组蛋白PS273R的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒能够快速、准确、高特异性地对非洲猪瘟病毒抗体进行检测。

Description

非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒
技术领域
本发明涉及动物传染病检测领域，具体涉及非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。猪科动物和蜱类是ASF的易感动物，其中家猪高度易感，死亡率高达100％，无明显的品种、年龄和性别差异。ASFV基因组包括160～175个开放阅读框，编码150～200种蛋白质。
目前，ASF没有有效的疫苗可用于预防，抗体检测为阳性即表明动物已经或曾经感染了病毒。随着ASFV入侵我国后大规模的蔓延，ASF很可能成为我国的又一常在的主要猪病，因此抗体检测在该病的控制和诊断中具有重要意义。现有技术中，还没有可以高效检测非洲猪瘟抗体的试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，该试剂盒能够快速、准确、高特异性地对非洲猪瘟病毒抗体进行检测。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，包括采用重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R包被的酶标板，所述重组多肽串联蛋白R10的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述重组蛋白PS273R的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在本发明中，所述重组多肽串联蛋白R10的包被浓度为0.6～20μg/ml，所述重组蛋白PS273R的包被浓度为0.6～20μg/ml。
优选的技术方案中，所述重组多肽串联蛋白R10的包被浓度为1～1.5μg/ml，所述重组蛋白PS273R的包被浓度为2～3μg/ml。
在本发明中，所述重组多肽串联蛋白R10采用如下方法制备：将重组多肽串联蛋白R10基因插入载体pET-28a(+)中，然后转化大肠杆菌，诱导表达后纯化，得到重组多肽串联蛋白R10。
在本发明中，所述重组蛋白PS273R采用如下方法制备：将重组蛋白PS273R基因插入载体pET-21a(+)中，然后转化大肠杆菌，诱导表达后纯化，得到重组蛋白PS273R。
在本发明中，所述试剂盒还包括非洲猪瘟阳性对照血清、非洲猪瘟阴性对照血清的制备、样品稀释液、HRP-羊抗猪IgG酶标抗体、TMB底物显色液和终止液。
在本发明中，所述样品稀释液为0.5-1.5％脱脂乳溶液。
本发明通过将重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R组合包被酶标板，建立了MP-ELISA抗体检测试剂盒。其制造成本低廉，检测速度快，敏感性和特异性分别高达96.58％和98.61％，非常适用于ASFV的血清学的准确诊断和流行病学调查。
附图说明
图1是纯化后的重组多肽串联蛋白R10的SDS-PAGE电泳图，其中M：ProteinMarker；1：纯化后的重组多肽串联蛋白R10。
图2是纯化后的重组蛋白PS273R的SDS-PAGE电泳图，M：Protein Marker；1：纯化后的重组蛋白PS273R。
图3是重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R的Western-bloting鉴定，M：Protein Marker；1：pET-21a空载体插入BL21诱导表达后裂解液上清；2：pET-28a空载体插入BL21诱导表达后裂解液上清；3：纯化的重组蛋白PS273R；4：纯化的重组多肽串联蛋白R10。
图4显示了各单抗原包被浓度对P/N值的影响。
图5显示了样品稀释度对P/N值的影响。
图6显示了样品稀释液对P/N值的影响。
图7是阴性对照OD450nm值频数分布图。
图8是阴性对照OD450nm值正态分布图。
图9是阳性对照OD450nm值频数分布图。
图10是阳性对照OD450nm值正态分布图。
图11.对样品检测的ROC分析，其中(A)是检测AFSV阴、阳性血清所得S/P值的散点分布图，阳性血清n＝117，阴性血清n＝342；(B)是检测AFSV阴、阳性血清所得S/P值的ROC曲线分析图。
具体实施方式
主要仪器：恒温振荡培养箱，恒温培养箱，PCR扩增仪，高速冷冻离心机，电泳仪，转印仪，酶标仪等。
主要试剂与耗材：BamH I、Xho I、HindⅢ(NEB，美国)，质粒提取试剂盒(Omega，美国)，Ni-NTA agarose(碧云天)，Bradford蛋白定量试剂盒，Tryptose phosphate broth，HRP-羊抗猪IgG酶标抗体(Bethyl，美国)，TMB底物显色液(碧云天)，异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(TaKaRa)，胰蛋白胨和酵母抽提物(OXOID)等。
菌株、质粒：(1)菌株：大肠杆菌BL21(DE3)购自大连TaKaRa公司。(2)质粒：pET-21a(+)质粒购自Novagen公司。
抗原与血清：(1)非洲猪瘟灭活抗原，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所非洲猪瘟专业实验室提供。(2)非洲猪瘟抗体阳性参考血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所非洲猪瘟专业实验室提供。(3)非洲猪瘟抗体阴性参考血清，由江苏省农业科学院兽医研究所提供。(4)非洲猪瘟抗体阴性特异性血清：猪呼吸与繁殖综合征病毒IgG抗体阳性样品(PRRS)，猪伪狂犬IgG抗体阳性样品(PRV)，猪口蹄疫病毒IgG抗体阳性样品(FMDV)，猪圆环病毒2型IgG抗体阳性样品(PCV-2)，猪瘟病毒IgG抗体阳性样品(CSFV)猪流感病毒IgG抗体阳性样品(SIV H1，H3)，猪肺炎支原体IgG抗体阳性样品(MHP)和副猪嗜血杆菌IgG抗体阳性样品(HPS 10型，2型，8型，3型)由江苏省农业科学院兽医研究所保存提供。
本发明中的PBST，均是指含有0.05％(体积百分浓度)吐温-20的PBS溶液，其中的PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L、pH值＝7.2～7.4。
实施例1包被抗原蛋白的制备
1.P54E基因重组载体的构建
参考NCBI数据库公布的我国首例非洲猪瘟P54全基因序列(MH766894，E183L，162222-162776)，设计了重组多肽串联蛋白R10的基因(SEQ ID NO:1)，重组多肽串联蛋白R10的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。重组多肽串联蛋白R10的基因是符合大肠杆菌嗜性的。采用基因合成的方式(由南京金斯瑞生物科技有限公司)将重组多肽串联蛋白R10的基因插入载体pET-28a(+)的多克隆酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ之间，得到重组质粒pET-28a-R10。
通过“热激”法，将重组质粒pET-28a-R10转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌pET-28a-R10(BL21)。
2.PS273R基因重组载体的构建
参考NCBI数据库公布的我国首例非洲猪瘟PS273R基因序列(MH766894，S273R，146675-147496)，对密码子进行了针对大肠杆菌的嗜性优化，得到了重组蛋白PS273R的基因序列，如SEQ ID NO：3所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。采用基因合成的方式(南京金斯瑞生物科技有限公司)将SEQ ID NO：3所示的基因序列插入载体pET-21a(+)的多克隆酶切位点NdeⅠ和XholⅠ之间，得到重组质粒pET-21a-PS273R。
通过“热激”法，将重组质粒pET-21a-PS273R转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌pET-21a-PS273R(BL21)。
3.重组蛋白的表达及纯化
将重组菌pET-28a-R10(BL21)在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养，将pET-21a-PS273R(BL21)在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养条件均如下：培养温度为37℃、摇床转速为180r/min，待OD600＝0.6～0.8时降温至20℃，30min后加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导表达，继续在20℃培养16～18小时，收集菌体。用缓冲液洗涤菌体，菌体重悬后加入PMSF进行超声波裂解，4℃下10000r/min离心30分钟。取上清，按照Ni-NTA亲合层析介质(金斯瑞生物科技有限公司产品，Cat.No：L00250)的说明书纯化重组蛋白。从图1可见，纯化后的重组多肽串联蛋白R10在19KDa左右出现特异性的条带，与预期一致。从图2可见，重组蛋白PS273R在31KDa左右出现特异性的条带，与预期一致。因此重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R成功表达，置于-70℃以下保存备用。
4.重组蛋白的抗原性检测
将纯化的重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R经SDS-PAGE电泳后转印至NC膜，进行Western-bloting检测。用5％脱脂乳封闭过夜后，以1：200稀释的非洲猪瘟抗体阳性参考血清作为一抗，37℃孵育2小时。TBST洗涤5次，5分钟/次。用1:20000倍稀释的HRP-羊抗猪IgG酶标抗体作为二抗，37℃孵育1.0小时。TBST洗涤5次，5分钟/次。ECL避光显色5min，曝光10sec。结果如图3，重组蛋白PS273R在31KDa左右出现了特异性反应条带；重组多肽串联蛋白R10在19KDa左右出现了特异性反应条带。上述结果说明，重组表达的重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R均可与非洲猪瘟抗体阳性参考血清发生特异性反应，具有良好的抗原性。
实施例2试剂盒组成优化及使用方法的优化
1.双抗原包被板
单抗原最佳包被浓度的确定：用梯度稀释的重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R分别包被酶标板，检测1∶100稀释的非洲猪瘟抗体阴、阳性参考血清。具体方法如下：将梯度稀释的重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R分别用包被液(0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，pH值＝9.6)稀释后，包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃孵育1小时后2～8℃作用14～18小时。弃去孔中的包被液，每孔加入250μl的PBST(含有0.05％吐温-20的PBS溶液，其中的PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L、pH值＝7.2～7.4)洗涤酶标板3遍。每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2小时后弃去，每孔加入250μl的PBST洗涤酶标板1遍。加入待检样品，100μl/孔，37℃温育60分钟。弃去液体，每孔加入250μl的PBST洗涤酶标板5遍。加入稀释的HRP-羊抗猪IgG酶标抗体，100μl/孔，置37℃温育60分钟。弃去液体，每孔加入250μl的PBST洗涤酶标板5遍。每孔加入TMB底物显色液100μl，37℃避光显色10分钟，每孔加入50μl、2mol/L的H2SO4溶液，终止反应。用酶标仪读取OD450nm值。
结果(图4)显示，当重组多肽串联蛋白R10的包被浓度为0.6～20μg/ml时，均满足P/N值(阳性OD450nm值/阴性OD450nm值)大于2.1，其中最佳包被浓度为1.25μg/ml，此时P/N值最大；当重组蛋白PS273R的包被浓度为0.6～20μg/ml时，均满足P/N值(阳性OD450nm值/阴性OD450nm值)大于2.1，其中最佳包被浓度为2.5μg/ml时，此时P/N值最大。
2.封闭液的确定
配制含有1.25μg/ml重组多肽串联蛋白R10和2.5μg/ml重组蛋白PS273R的溶液，溶剂为0.05mol/L、pH值＝9.6的碳酸盐缓冲液，每孔加入100μL包被96孔酶标板，分别以5％脱脂乳溶液、5％牛血清白蛋白(BSA)溶液、0.4％明胶溶液、1％酪蛋白(OXOID)溶液和10％小牛血清溶液(溶剂均为0.01mol/L、pH值＝7.2～7.4的PBS缓冲液)作为封闭液进行封闭，其他步骤同本实施例标题1中方法。检测非洲猪瘟抗体阴阳性参考血清，根据P/N值选择最佳封闭液。结果显示，以5％脱脂乳溶液作为封闭液进行封闭时，P/N均值最大，封闭效果最好。
3.最佳样品稀释度的确定
将非洲猪瘟抗体阴阳性参考血清分别用原液和以PBST(含有体积百分浓度为0.05％吐温-20的PBS缓冲液，其中PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L、pH值＝7.2～7.4)按照稀释度为1:50、1:100、1:150、1:200进行倍比稀释，采用本实施例标题2确定的方法对其进行ELISA检测。结果显示，当非洲猪瘟抗体阴阳性参考血清稀释度为1:100时，P/N值(非洲猪瘟抗体阳性参考血清OD450nm值/非洲猪瘟抗体阴性参考血清OD450nm值)最大(图6)。所以，最佳样品稀释度为1:100。
4.最佳样品稀释液的选择
分别用PBST、0.1％脱脂乳溶液、1％脱脂乳溶液、1％小牛血清溶液、10％小牛血清溶液、1％BSA溶液、5％BSA溶液、1％酪蛋白溶液和10％酪蛋白溶液作为样品稀释液，对样品进行1:100(稀释度)稀释，采用本实施例标题3确定的方法对各稀释液稀释后的样品进行ELISA检测。结果显示，当使用1％脱脂乳溶液(溶剂为0.01mol/L、pH值＝7.2～7.4的PBS缓冲液)作为样品稀释液时，P/N值(非洲猪瘟抗体阳性参考血清OD450nm值/非洲猪瘟抗体阴性参考血清OD450nm值)最大(图6)。所以，最佳样品稀释液为1％脱脂乳溶液。
5.样品孵育时间的优化
采用本实施例标题4确定的方法对非洲猪瘟抗体阴阳性参考血清进行ELISA检测，不同之处在于设置样品孵育时间30分钟、60分钟、120分钟三个梯度，根据P/N均值最高为条件，筛选出最佳样品孵育时间是30min。
6.最佳HRP酶标抗体工作浓度的测定
采用本实施例标题5确定的方法对非洲猪瘟抗体阴阳性参考血清进行ELISA检测，不同之处在于，将HRP-羊抗猪IgG酶标抗体(Bethyl，美国)采用PBST(含有0.05％(体积百分浓度)吐温-20的PBS溶液，其中的PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L、pH值＝7.2～7.4)分别进行1:10000、1:20000、1:30000和1:40000(稀释度)稀释，然后加入体系中，根据检测P/N值的结果，筛选出HRP-羊抗猪IgG酶标抗体的最佳工作浓度为1:30000。
7.HRP酶标抗体最佳作用时间的优化
采用本实施例标题6确定的方法对非洲猪瘟抗体阴阳性参考血清进行ELISA检测，不同之处在于，将HRP-羊抗猪IgG酶标抗体以最佳浓度稀释后分别作用15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，根据P/N值结果筛选出二抗最佳作用时间为30min。
8.底物(TMB)反应时间的优化
采用本实施例标题7确定的方法对非洲猪瘟抗体阴阳性参考血清进行ELISA检测，不同之处在于，将TMB底物显色液的反应时间分别设置为5分钟、10分钟、15分钟、20分钟，P/N值结果显示，10min至20min的数据较高且接近，考虑到实际操作，底物最佳作用时间定为10min。
9.检验结果判定标准的研究
采用本实施例标题8确定的方法检测非洲猪瘟病毒抗体的结果判定标准研究如下：
(1)试验有效性的确定
按照本实施例标题8确定的间接ELISA方法对非洲猪瘟抗体阴、阳性对照血清分别进行48次检验，计算48次阳性对照OD450nm(非洲猪瘟抗体阳性参考血清OD450nm)平均值与阴性对照OD450nm(非洲猪瘟抗体阴性参考血清OD450nm)平均值，绘制OD450nm值频数分布图及正态分布图，以此确定试验有效性标准。
结果显示，48次检测的阴性对照OD450nm平均值(X)为0.066，标准差(S)为0.009，其中47次位于X±3S(0.039～0.094)的范围内，占总数的97.9％(图7)；48次检测的阳性对照OD450nm平均值(X)为0.974，标准差(S)为0.175，其中48次位于X±3S(0.449～1.498)的范围内，占总数的100％(图9)；两者均大于95％的标准，符合正态分布(图8，图10)，稳定性良好。阳性对照OD450nm平均值缩写为PCX，阴性对照OD450nm平均值缩写为NCX。因此，确定试剂盒有效性标准为：0.45≤PCX≤1.50，0.04≤NCX≤0.10。
(2)试剂盒CUT-OFF值的确定
采用本实施例标题8确定的方法，对经Western-Blotting鉴定为非洲猪瘟抗体阳性的117份猪血清样品和342份非洲猪瘟抗体阴性的猪血清样品(采集于2017年1月1日之前的猪血清)进行检测，计算每份样品非洲猪瘟IgG抗体S/P值，公式如下：样品非洲猪瘟IgG抗体S/P值＝(样品OD450nm平均值－阴性对照OD450nm平均值)/(阳性对照OD450nm平均值－阴性对照OD450nm平均值)，对计算结果进行ROC统计学分析(图11)，综合比较敏感性、特异性和综合指标(敏感性与特异性之和)，结果显示(表1)，当S/P值小于0.2645时，综合指标最大为197.4(表1)。从而将阴阳性样品判定的CUT-OFF值确定为0.26。
表1.阴阳性样品判定的CUT-OFF值的确定
S/P值 敏感性％ 特异性％ 综合指标(敏感性+特异性)％
＜0.2070 96.49 100 196.49
＜0.2125 96.78 100 196.78
＜0.2170 97.08 100 197.08
＜0.2260 97.08 99.15 196.23
＜0.2345 97.37 99.15 196.52
＜0.2450 97.66 99.15 196.81
＜0.2545 97.95 99.15 197.1
＜0.2645 98.25 99.15 197.4
＜0.2830 98.25 98.29 196.54
＜0.2995 98.54 98.29 196.83
＜0.3145 98.83 98.29 197.12
＜0.3290 99.12 98.29 197.41
＜0.3405 99.12 97.44 196.56
综上所述，采用本实施例标题8确定的方法检测时，试验成立的条件是：0.45≤阳性对照OD450nm平均值≤1.50，0.04≤阴性对照OD450nm平均值≤0.10。根据待检样品S/P值＝(样品OD450nm平均值－阴性对照OD450nm平均值)/(阳性对照OD450nm平均值－阴性对照OD450nm平均值)计算每份样品S/P值。当待检样品的S/P值＜0.26时，判为阴性；当待检样品的S/P值≥0.26时，判为阳性。
实施例3非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒的制备
1.非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒的组成
根据实施例2标题8确定的ELISA检测方法，确定了非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒(缩写为本发明试剂盒)的组成，具体来说包括：非洲猪瘟抗体阳性对照血清、非洲猪瘟抗体阴性对照血清、双抗原包被板、浓缩洗涤液(10×)、样品稀释液、HRP-羊抗猪IgG酶标抗体(30×)、TMB底物显色液和终止液。具体如下：
(1)双抗原包被板
采用0.05mol/L、pH值＝9.6的碳酸盐缓冲液配制同时含有1.25μg/ml重组多肽串联蛋白R10和2.5μg/ml重组蛋白PS273R的溶液，包被96孔酶标板，每孔100μL，在37℃孵育1小时后置于2～8℃作用14～18小时。弃去孔中的包被液，每孔加入250μl洗涤液(PBST，是含有0.05％吐温-20的PBS溶液，其中的PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L、pH值＝7.2～7.4。)洗涤酶标板3遍。每孔加入200μl封闭液(以pH值为7.2～7.4、浓度为0.01mM的PBS为溶剂配制的5％脱脂乳溶液)，37℃封闭2小时后弃去，每孔加入250μl的洗涤液洗涤酶标板1遍。经0.1mba真空干燥10小时后放入塑封袋中，抽真空高温密封。
(2)非洲猪瘟抗体阳性对照血清
用含有1mg/ml的重组多肽串联蛋白R10和1mg/ml重组蛋白PS273R的溶液与等体积的弗氏完全佐剂(Sigma公司产品)混合乳化后，肌肉注射免疫3头3月龄巴马猪(由江苏省农业科学院兽医研究所提供，经购自哈尔滨元亨生物药业有限公司的非洲猪瘟病毒抗原荧光定量PCR检测试剂盒检测为阴性。每头2ml，分两点注射。第一次免疫后2周，用含有1mg/ml的重组多肽串联蛋白R10和1mg/ml重组蛋白PS273R的溶液与弗氏不完全佐剂(Sigma公司产品)等体积混合乳化后，进行第二次免疫，免疫剂量和方法同首次免疫。2周后再用同样的剂量和方法免疫一次。三免后第7天，无菌采血分离猪血清。按照ELISA方法检测血清效价：配制含有1.25μg/ml重组多肽串联蛋白R10和2.5μg/ml重组蛋白PS273R的溶液，溶剂为0.05mol/L、pH值＝9.6的碳酸盐缓冲液，每孔加入100μL包被96孔酶标板，37℃孵育1小时后2～8℃作用14～18小时。弃去孔中的包被液，每孔加入250μl的PBST洗涤酶标板3遍。每孔加入200μl封闭液(同本发明试剂盒中双抗原包被板制备中的封闭液)，37℃作用封闭2小时后弃去，每孔加入250μl的PBST洗涤酶标板1遍。加入10倍比稀释的待检猪血清，100μl/孔，37℃温育30分钟。弃去液体，每孔加入250μl的PBST洗涤酶标板5遍。加入1∶30000稀释的HRP-羊抗猪IgG酶标抗体，100μl/孔，置37℃温育30分钟。弃去液体，每孔加入250μl的PBST洗涤酶标板5遍。每孔加入TMB底物显色液(同本发明试剂盒中的)100μl，37℃避光显色10分钟，每孔加入50μl、2mol/L的H2SO4溶液，终止反应。用酶标仪读取OD450nm值。收集效价大于1∶1000的猪血清，加入终浓度为0.01％(质量百分浓度)的硫柳汞，0.2ml/支分装，-20℃保存，作为非洲猪瘟阳性对照血清。
(3)非洲猪瘟抗体阴性对照血清
采集3头3月龄健康巴马猪(经非洲猪瘟病毒抗原荧光定量PCR检测试剂盒检测为阴性。)血液分离血清，加入终浓度为0.01％(质量百分浓度)的硫柳汞，-20℃保存，作为非洲猪瘟阴性对照血清。
(4)浓缩洗涤液(10×)的制备
称取40g的NaCl、1.0g的KCl、18.25g的Na2HPO4·12H2O、1.2g的KH2PO4和2.5ml吐温-20，溶于去离子水，然后定容至500ml，加终浓度为0.01％硫柳汞，用0.22μm滤膜过滤除菌，即得浓缩洗涤液。
(5)样品稀释液的制备
配制1％脱脂乳溶液，加终浓度为0.01％硫柳汞，用0.45μm滤膜过滤除菌，即得样品稀释液。其中1％脱脂乳溶液的溶剂为浓度为0.01mol/L、pH值＝7.2～7.4的PBS缓冲液。
(6)HRP-羊抗猪IgG酶标抗体(30×)的制备
HRP-羊抗猪IgG酶标抗体(购自Bethyl，美国)，采用PBST(含有0.05％(体积百分浓度)吐温-20的PBS溶液，其中的PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L、pH值＝7.2～7.4)按照稀释度为1:1000进行稀释，加终浓度为0.01％硫柳汞，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到HRP-羊抗猪IgG酶标抗体(30×)。
(7)TMB底物显色液
TMB底物显色液购自碧云天。
(8)终止液
终止液是2mol/L H2SO4水溶液。
2.试剂盒的使用方法
(1)试验前的准备
将试剂盒中所有试剂在检验前室温下放置30分钟，使所有试剂恢复至室温。
1×洗涤液配制：浓缩洗涤液(10×)应恢复至室温(25℃左右)，如有沉淀可在37℃温浴5～10分钟，用灭菌纯水作10倍稀释，即为1×洗涤液，2～8℃保存7日。
1×HRP-羊抗猪IgG酶标抗体的配制：HRP-羊抗猪IgG酶标抗体(30×)在使用前使其回至室温，用1×洗涤液作30倍稀释，备用。
(2)ELISA方法
①取双抗原包被板，记录样品位置；根据样品多少，包被板可拆分使用。如果只用部分板条，将剩余板条取下装于自封袋中，保存于2～8℃
②非洲猪瘟抗体阴性对照血清用样品稀释液作100倍稀释，100μl/孔，每次检测加2孔。
③非洲猪瘟抗体阳性对照血清用样品稀释液作100倍稀释，100μl/孔，每次检测加2孔。
④在剩余的样品孔中依次加入经样品稀释液100倍稀释后的样品，100μl/孔，置37℃温育30分钟。
⑤弃去板孔中的液体，加入1×洗涤液，250μl/孔，洗涤5次，每次静置5分钟后甩掉孔内液体。加入酶标抗体前，避免孔壁变干。在最后一次甩干后，在吸水材料上用力拍干，去掉剩余的液体。
⑥每孔加入1×HRP-羊抗猪IgG酶标抗体100μl，置37℃温育30分钟。
⑦重复步骤⑤。
⑧每孔加入100μl TMB底物显色液，37℃温育避光显色10分钟。
⑨每孔加入50μl终止液，终止反应。
⑩用酶标仪测量和记录样品和对照的吸光值OD450nm值。
结果判定：试验成立的条件是：0.45≤阳性对照OD450nm平均值≤1.50，0.04≤阴性对照OD450nm平均值≤0.10，其中阳性对照OD450nm平均值是非洲猪瘟抗体阳性对照血清OD450nm平均值，阴性对照OD450nm平均值是非洲猪瘟抗体阴性对照血清OD450nm平均值。根据待检样品S/P值＝(待检样品OD450nm平均值－阴性对照OD450nm平均值)/(阳性对照OD450nm平均值－阴性对照OD450nm平均值)计算每份待检样品S/P值。当待检样品的S/P值＜0.26时，判为阴性；当待检样品的S/P值≥0.26时，判为阳性。
实施例4试剂盒的性能
1.试剂盒的重复性研究
(1)批内重复性试验
组装1个批次本发明试剂盒，在相同试验条件下，按照建立的检测方法，对15份非洲猪瘟抗体阴性血清样品(编号为1～15)和15份非洲猪瘟抗体阳性血清样品(编号为16～20为弱阳性，编号为21～30为强阳性)进行平行试验。每批试剂盒取5个进行批内检测。结果显示试剂盒的批内变异系数均小于7.89％(表2)。
表2.批内重复性试验结果
Figure BDA0002294754200000101
Figure BDA0002294754200000111
(2)批间重复性试验
组装3个批次本发明试剂盒，在相同试验条件下，按照建立的检测方法，对15份非洲猪瘟抗体阴性血清样品(编号1～15)和15份非洲猪瘟抗体阳性血清样品(编号16～20为弱阳性，编号21～30为强阳性)进行平行试验。每批试剂盒取1个进行批间检测。结果显示3个批次试剂盒的批间变异系数均小于8.69％(表3)。
表3.批间重复性试验结果
Figure BDA0002294754200000112
Figure BDA0002294754200000121
2.试剂盒的敏感性与特异性比较试验
选取经Western-Blotting验证的非洲猪瘟抗体阳性血清117份和非洲猪瘟抗体阴性血清144份【包括2017年之前采集的猪血清100份，猪呼吸与繁殖综合征病毒IgG抗体阳性样品(PRRS)5份，猪伪狂犬IgG抗体阳性样品(PRV)5份，猪口蹄疫病毒IgG抗体阳性样品(FMDV)5份，猪圆环病毒2型IgG抗体阳性样品(PCV-2)5份，猪瘟病毒IgG抗体阳性样品(CSFV)5份，猪流感病毒IgG抗体阳性样品(SIV H1型，H3型)各2份，猪肺炎支原体IgG抗体阳性样品(MHP)2份和副猪嗜血杆菌IgG抗体阳性样品(HPS 10型，2型，8型，3型)各2份】分别用本发明试剂盒，OIE(世界动物卫生组织)推荐ELISA(抗原由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所非洲猪瘟参考实验室提供)和西班牙商品化试剂盒(Ingenasa公司)进行检测，结果显示：本发明试剂盒的检测敏感性和特异性为99.15％和98.61％，敏感性显著高于其他两种方法。
表4.不同检测方法结果比较
Figure BDA0002294754200000122
Figure BDA0002294754200000131
表4中，敏感性是指Western-Blotting检测出的阳性样品中被OIE ELISA、Ingensas ELISA和本发明试剂盒分别检测出百分比；特异性是指Western-Blotting检测出的阴性样品中被OIE ELISA、Ingensas ELISA和本发明试剂盒分别检测出百分比。
3.本发明试剂盒检测血清样品的灵敏度
将非洲猪瘟抗体阳性参考血清样品(样品Px1～4)在60℃水浴中40min灭活，倍比稀释后，用本发明试剂盒试剂盒检测S/P值，考察检测灵敏度。由表5可见，样品稀释度为1:1600时，均能检测出，说明本发明试剂盒的灵敏度很高。
表5.本发明试剂盒检测血清样品的灵敏度
Figure BDA0002294754200000132
注：当待检样品的S/P值＜0.26时为阴性；当待检样品的S/P值≥0.26时为阳性。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒
<130> 201128
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 399
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 重组多肽串联蛋白R10
<400> 1
caagatcagc aatgggtgga agttaccccg ggcccgggca ccaccgcgag cgtgggcaag 60
ggcccgggcg ttaccgatcg tctggtgatg ggcccgggcc cggcggcggc gccggcggcg 120
gcgagcgcgc cggcgcaccc ggcggagccg tacaccaccg gcccgggcat gagcgcgatt 180
gaaaacctgc gtcaaggccc gggccaagat cagcaatggg tggaagttac cccgggcccg 240
ggcaccaccg cgagcgtggg caagggcccg ggcgttaccg atcgtctggt gatgggcccg 300
ggcccggcgg cggcgccggc ggcggcgagc gcgccggcgc acccggcgga gccgtacacc 360
accggcccgg gcatgagcgc gattgaaaac ctgcgtcaa 399
<210> 2
<211> 133
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 重组多肽串联蛋白R10
<400> 2
Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gly Pro Gly Thr Thr Ala
1 5 10 15
Ser Val Gly Lys Gly Pro Gly Val Thr Asp Arg Leu Val Met Gly Pro
20 25 30
Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala His Pro Ala
35 40 45
Glu Pro Tyr Thr Thr Gly Pro Gly Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Pro Gly Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gly Pro
65 70 75 80
Gly Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Gly Pro Gly Val Thr Asp Arg Leu
85 90 95
Val Met Gly Pro Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro
100 105 110
Ala His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Gly Pro Gly Met Ser Ala Ile
115 120 125
Glu Asn Leu Arg Gln
130
<210> 3
<211> 819
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 重组蛋白PS273R
<400> 3
atgtctatcc tggaaaaaat cacctcttct ccgtctgaat gcgctgaaca cctgaccaac 60
aaagactctt gcctgtctaa aaaaatccag aaagaactga cctctttcct ggaaaaaaaa 120
gaaaccctgg gttgcgactc tgaatcttgc gttatcaccc acccggctgt taaagcttac 180
gctcagcaga aaggtctgga cctgtctaaa gaactggaga caaggttcaa agctccgggc 240
ccgcgtaaca acaccggtct gctgaccaac ttcaacatcg acgaaaccct gcagcgttgg 300
gctatcaaat acaccaaatt cttcaactgc ccgttctcta tgatggactt cgaacgtgtt 360
cactacaaat tcaaccaggt tgacatggtt aaagtttaca aaggtgaaga actgcagtac 420
gttgaaggta aagttgttaa acgtccgtgc aacaccttcg gttgcgttct gaacaccgac 480
ttctctaccg gtaccggtaa acactgggtt gctatcttcg ttgacatgcg tggtgactgc 540
tggtctatcg aatacttcaa ctctgctggt aactctccgc cgggtccggt tatccgttgg 600
atggaacgtg ttaaacagca gctgctgaaa atccaccaca ccgttaaaac cctggctgtt 660
accaacatcc gtcaccagcg ttctcagacc gaatgcggtc cgtactctct gttctacatc 720
cgtgctcgtc tggacaacgt ttcttacgct cacttcatct ctgctcgtat caccgacgaa 780
gacatgtaca aattccgtac ccacctgttc cgtatcgct 819
<210> 4
<211> 273
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 重组蛋白PS273R
<400> 4
Met Ser Ile Leu Glu Lys Ile Thr Ser Ser Pro Ser Glu Cys Ala Glu
1 5 10 15
His Leu Thr Asn Lys Asp Ser Cys Leu Ser Lys Lys Ile Gln Lys Glu
20 25 30
Leu Thr Ser Phe Leu Glu Lys Lys Glu Thr Leu Gly Cys Asp Ser Glu
35 40 45
Ser Cys Val Ile Thr His Pro Ala Val Lys Ala Tyr Ala Gln Gln Lys
50 55 60
Gly Leu Asp Leu Ser Lys Glu Leu Glu Thr Arg Phe Lys Ala Pro Gly
65 70 75 80
Pro Arg Asn Asn Thr Gly Leu Leu Thr Asn Phe Asn Ile Asp Glu Thr
85 90 95
Leu Gln Arg Trp Ala Ile Lys Tyr Thr Lys Phe Phe Asn Cys Pro Phe
100 105 110
Ser Met Met Asp Phe Glu Arg Val His Tyr Lys Phe Asn Gln Val Asp
115 120 125
Met Val Lys Val Tyr Lys Gly Glu Glu Leu Gln Tyr Val Glu Gly Lys
130 135 140
Val Val Lys Arg Pro Cys Asn Thr Phe Gly Cys Val Leu Asn Thr Asp
145 150 155 160
Phe Ser Thr Gly Thr Gly Lys His Trp Val Ala Ile Phe Val Asp Met
165 170 175
Arg Gly Asp Cys Trp Ser Ile Glu Tyr Phe Asn Ser Ala Gly Asn Ser
180 185 190
Pro Pro Gly Pro Val Ile Arg Trp Met Glu Arg Val Lys Gln Gln Leu
195 200 205
Leu Lys Ile His His Thr Val Lys Thr Leu Ala Val Thr Asn Ile Arg
210 215 220
His Gln Arg Ser Gln Thr Glu Cys Gly Pro Tyr Ser Leu Phe Tyr Ile
225 230 235 240
Arg Ala Arg Leu Asp Asn Val Ser Tyr Ala His Phe Ile Ser Ala Arg
245 250 255
Ile Thr Asp Glu Asp Met Tyr Lys Phe Arg Thr His Leu Phe Arg Ile
260 265 270
Ala

Claims (9)

1.非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于包括采用重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R包被的酶标板，所述重组多肽串联蛋白R10的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述重组蛋白PS273R的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.根据权利要求1所述非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于所述重组多肽串联蛋白R10的包被浓度为0.6～20μg/ml，所述重组蛋白PS273R的包被浓度为0.6～20μg/ml。
3.根据权利要求2所述非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于所述重组多肽串联蛋白R10的包被浓度为1～1.5μg/ml，所述重组蛋白PS273R的包被浓度为2～3μg/ml。
4.根据权利要求1或2或3所述非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于所述重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R分别采用如下方法制备：将重组多肽串联蛋白R10基因或重组蛋白PS273R基因插入载体中，然后转化大肠杆菌，诱导表达后纯化，得到重组多肽串联蛋白R10或重组蛋白PS273R。
5.根据权利要求4所述非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于所述重组多肽串联蛋白R10基因插入pET-28a（+）中。
6.根据权利要求4所述非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于所述重组蛋白PS273R基因插入载体pET-21a（+）中。
7.根据权利要求1所述非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括非洲猪瘟抗体阳性对照血清、非洲猪瘟抗体阴性对照血清的制备、浓缩洗涤液、样品稀释液、HRP-羊抗猪IgG酶标抗体、TMB底物显色液和终止液。
8.根据权利要求7所述非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于所述样品稀释液为0.5-1.5%脱脂乳溶液。
9.一种用于治疗非洲猪瘟病毒所引起猪的传染病的组合物，其特征在于包括重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R，所述重组多肽串联蛋白R10的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述重组蛋白PS273R的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
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