WO2009103826A1 - Sistema para producir péptidos y proteínas, multiméricos, y sus aplicaciones - Google Patents

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WO2009103826A1
WO2009103826A1 PCT/ES2008/070026 ES2008070026W WO2009103826A1 WO 2009103826 A1 WO2009103826 A1 WO 2009103826A1 ES 2008070026 W ES2008070026 W ES 2008070026W WO 2009103826 A1 WO2009103826 A1 WO 2009103826A1
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nucleic acid
acid sequence
protein
peptide
interest
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PCT/ES2008/070026
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José Ángel MARTÍNEZ ESCRIBANO
Félix GIL DONES
Inmaculada Galindo
Covadonga ALONSO MARTÍ
Bruno HERNÁEZ DE LA PLAZA
Eduardo GÓMEZ CASADO
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Alternative Gene Expression, S.L.
Instituto Nacional De Investigación Y Tecnología Agraria Y Alimentaria
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    • C12N2800/103—Plasmid DNA for invertebrates
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Definitions

  • This invention relates to the production of multimeric recombinant peptides and proteins through the use of an expression system comprising the sequence encoding said peptide or protein of interest and a sequence encoding a tetramerization domain.
  • transgenic plants represent an alternative to expensive traditional protein expression systems, since they are easily transformable, and, in addition, production costs can be reduced by growing large areas and harvesting them with existing infrastructure.
  • transgenic plants have other potential advantages, since they could be administered for therapeutic or preventive purposes without the need for purification using their edible organs.
  • the possibility of using the plants orally as inducers of an immune response has been demonstrated. Therefore, plants are presented as ideal candidates to produce new vaccines: cheaper, safer and easily administrable.
  • the use of plants as bio factories presents some drawbacks.
  • the low levels of xenoprotein expression being in the best cases around 0.1-3% of the total soluble protein, and, on the other hand, the instability in the expression of the transgene during the development of the plant or in successive generations.
  • transgenic animals with the exclusion of man, can be used as bio factories, using the transformation vectors specific to their gender.
  • insect cells preferably forming part of larvae, which once transformed, they are capable of producing proteins of interest.
  • the larval mass rearing systems optimize the large-scale production of these proteins.
  • Plants are a rational alternative because of the potential reduction in production costs, but the development time of transgenic plants is long and production yields are often very low. This means that many proteins are not produced at the minimum levels that ensure system profitability.
  • few systems are as versatile as those based on baculovirus (insect virus). These vectors are easy to manipulate and produce recombinant functional proteins in insect cell cultures.
  • industrial scaling based on fermentation systems of insect cells presents high costs and technical difficulties that frequently prevent its application in commercial production.
  • Insects produce recombinant proteins with the same properties as fermentation cells but at costs that can be 500 times lower and with an investment in equipment up to 40 times lower. Each larva produces milligrams of recombinant protein with the virtually unlimited possibility of industrial scaling, simply increasing the larval rearing surface or optimizing the number or efficiency of their growth per unit area.
  • the inventors have evaluated the importance of the conformation and structure of the foreign protein in its accumulation in transgenic plants and in larvae of insects, with special emphasis on small-sized peptides. For this, they have evaluated the possibility of increasing the expression levels of a linear vaccine peptide by increasing its stability in the plant or in the larva by obtaining a complex (multimeric) structure and comparing the expression levels and / or accumulation of the same peptide without fusing or fused to a high stability protein (GUS).
  • GUS high stability protein
  • the tetramerization domain of the p53 protein fused to the 2L21 peptide of Canine Virus (CPV), a synthetic vaccine peptide has been used.
  • CPV Canine Virus
  • the invention uses the same anterior tetramerization domain of the p53 protein, but in this case fused with the dynein-binding peptide of the p54 protein of the African Swine Plague virus.
  • the invention thus underlies a single inventive concept such as the provision of high performance recombinant peptide or protein production systems, either using a non-human plant or animal as a bio factory, in particular an insect larva, in which said high yield is provided by the fusion of the DNA coding for the peptide or protein of interest with a DNA coding for a multimerization domain, in particular with the tetramerization domain of a transcription factor, more specifically of p53.
  • p53 is a transcription factor, involved in different cellular functions, such as cell cycle control, apoptosis and cell differentiation (SEQ ID NO: 8).
  • the p53 protein is formed by 4 functional domains, in addition to a transactivation domain and a proline-rich domain (residues 1 to 43 and 61 to 94, respectively) in the N-terminal region.
  • the DNA binding domain has a central location in the protein (residues 110-286).
  • the tetramerization domain (DT) is in the C-terminal region of the protein (residues 326 to 355) ( Figure
  • the structure of the DT has been previously determined both by X-ray crystallography and by nuclear magnetic resonance (NMR).
  • a monomer contains a ⁇ -sheet (residues 326 to 333), attached to an ⁇ -helix (residues 335 to 355) by a single residue (glycine 334).
  • a monomer is V-shaped and both elements in the secondary structure are an arm of the V.
  • Three amino acids (Ile-332, Phe-338 and Phe-341) form a small hydrophobic cluster in the junction region.
  • the dimer is formed by the interaction of two monomers via the interaction of their ⁇ -sheets to form a double-stranded antiparallel sheet, and, via the antiparallel association of their helices, create a double helix beam.
  • the formation of ⁇ -antiparallel plate allows the formation of Eight hydrogen bridges.
  • the ⁇ -sheets are outside the tetramer and, therefore, are not directly involved in the association between the two dimers.
  • the interface between the propellers is predominantly hydrophobic and envelops Met-340, Leu-344, Ala-347, Leu-348 and Leu-350.
  • One of the embodiments of the present invention is the use of the tetramerization domain of the p53 protein to make gene constructs comprising, fused to the nucleic acid encoding and expressing said domain, a nucleic acid sequence that encodes and expresses at least one product. of interest selected from a peptide or protein.
  • the peptide chosen for the practical embodiment of the present invention and proof of the claimed inventive general concept, exemplified in plant cells is the 2V21 epitope of CPV, which is formed by two antigenic sub sites distant from the amino terminal region of the VP2 protein of the CPV capsid and which had previously been published as the first synthetic vaccine peptide (López de Turiso, JA, Cortés, E., Mart ⁇ nez, C, Ruiz de Ybánez, R., Simarro, L, Vela, C, Casal, I . (1992) J. Virol. 66: 2748-2753).
  • the knowledge of the three-dimensional structure and the links involved in the formation of the tetramer allows, a priori, to design a fusion strategy that does not affect the conformation of the tetramer. Therefore, the 2L21 peptide was fused in the N-terminal region of the tetramerization domain where it was expected not to prevent the formation of the tetramer. In turn, the same peptide was expressed in unbound plants using the same plasmid and under the control of the same promoter.
  • peptide 2L21 had previously been successfully expressed in the inventors' laboratory fused to GUS (Gil F., Brun A., Wigdorovitz A., Mart ⁇ nez-Torrecuadra JL, Cattala R., Casal L, Salinas J., Borca MV and Escribano JM FEBS Letters 488: 13-17, 2001), a very stable protein, with a low degradation rate and perfectly adapted to plant expression, which provided a good reference standard for comparing these strategies.
  • the invention is illustrated by the development of a high production system of the 2L21 peptide fused to the DT of p53 (2L21-DT) in transgenic plants of A. thaliana, based on the multimerization capacity of the fusion protein with respect to the same peptide without merging or merging to GUS. It was found that the 2L21-DT monomers expressed in A. thaliana transgenic plants are assembled into dimers and tetramers. A high percentage of transgenic plant lines with high levels of recombinant peptide expression was obtained with this strategy. Expression levels obtained with the 2L21-DT construct were even higher than those obtained in transgenic plants transformed with the 2L21-GUS construct.
  • the recombinant peptide (2L21-DT) maintained the antigenic and immunogenic characteristics of the 2L21 peptide, inducing high specific antibody titres in groups of animals immunized both orally and intraperitoneally and this being far superior to that induced by the 2L21- fusion protein. GUS. These results seem to suggest that the tetramers formed could offer not only great stability, but also immunogenic advantages. No transgenic plants were obtained that expressed the unbound fusion peptide, which demonstrates that its stability is dependent on the protein to which it is fused, which confers a greater or lesser resistance to degradation by cellular proteases.
  • the protein chosen for the practical realization of the present invention and proof of the claimed inventive general concept, exemplified in insect larvae is the p54 protein of the African swine fever virus, a virus of enormous livestock importance, against which there is no vaccine effective until now.
  • the p54 protein of the African swine fever virus is key in the entry of the virus into the cell and induces antibodies capable of neutralizing the infection in those animals that survive the infection.
  • Interaction studies of the African swine fever virus with the infected cell have allowed characterizing that the transport of the virus in the early stages of infection, from the surface of the cell to the nucleus, is carried out through the union of p54 protein with the dynein light chain.
  • the domain of the p54 protein that mediates this binding to the dynein has been characterized.
  • synthetic domain peptide p54DUD
  • An alternative to the use of high-cost synthetic peptides is their synthesis by recombinant DNA. Given the size of the peptide, its stable synthesis as a recombinant is impossible, which is why the tetramerization domain derived from p53 has been used.
  • the immunization of animals with this tetramerized domain would result in the induction of antibodies capable of binding the virus and blocking its binding to dynein and thus neutralizing the infection, constituting an effective vaccine.
  • the invention is illustrated by the development of a high production system of the p54 protein fused to the DT of the p53 (p54-TDH) in insect cells and larvae, specifically Trichoplusia ni, based on the multimerization capacity of the protein of fusion with respect to it without merging.
  • Figure 1 is a schematic representation of the domain structure of the p53 protein and the tetramerization domain of said p53 protein, including a detail of the amino acid sequence corresponding to the tetramerization domain (DT) of the p53 protein as well as the structure of the tetramer once formed (Science, vol. 67, March 10, 1995).
  • Figure 2 schematically shows the obtaining of the binary plasmid pBI-
  • Figure 3 shows the structure of the expression region of the binary plasmid pBI-TEV 2L21-DT and the amino acid sequence of the 2L21-DT fusion protein, the CaMV35S promoter (35 S prom), which directs the sequence expression corresponding to the 2L21 antigen fused to the tetramerization domain of the p53 protein and the polyadenylation sequence (Nos-ter); LB and RB, delimit the T-DNA that will be integrated into the nuclear genome of plants.
  • the amino acid sequence of the 2L21-DT fusion protein includes the 2L21 peptide sequence, the tetramerization domain of the p53 protein and 4 amino acid separators (GSPG).
  • GSPG amino acid separators
  • Figure 4 shows the result of a Western blot analysis of the expression of the 2L21-DT fusion protein in transgenic Arabidposis thaliana plants.
  • Figure 4A shows the result of a Western blot analysis on denaturing tricine gel loaded with 40 ⁇ g of total protein per well; an immunoreactive band close to 8 kDa is observed.
  • Figure 4B shows the result of a Western blot analysis on a gel under native conditions loaded with 40 ⁇ g of total soluble protein extracted with a buffer without reducing agents or denaturing agents; be they observe two immunoreactive bands one above 16 kDa (dimers) and a majority band of 32 kDa (tetramer).
  • the structure of the 2L21-DT monomer and predictable dimers and tetramers are included.
  • Figure 5 illustrates the transcriptional analysis of some lines expressing various amounts of the 2L21-DT fusion antigen.
  • the results of a Northern blot analysis of the transcription of the 2L21-DT fusion gene in Arabidopsis transgenic plants, on 5 ⁇ g of total and hybridized RNA are shown using as a probe the complete DNA sequence of the 2L21-DT fusion (200 pb) marked with 32 P.
  • Figure 6 shows the serum antibody titer in the different groups of immunized mice.
  • Figure 6A is a bar chart showing the titles of anti-2L21 antibodies reached in the different groups of animals immunized intraperitoneally (DTl, DT2, DT3, DT4, GUSl, GUS2, DT Pool IP, GUS Pool IP) [ each DT is a group of mice, just like each GUS; Pool IP means "intraperitonal inoculated pool”].
  • Figure 6B is a bar chart showing the mean of the title developed by the different groups of animals fed with plant leaves expressing each of the peptide fusions.
  • Figure 7 illustrates the possibility of obtaining multivalent vaccines containing 2 vaccine peptides or proteins according to the present invention and schematically shows the formation of tetramers containing 2 vaccine proteins or peptides from a single construct that includes the tetramerization domain of the p53 protein and 2 foreign genes.
  • Figure 8 shows the sequence of the generated fusion peptide.
  • the dynein binding domain of the p54 protein (p54DUD) was fused to the tatramerization domain of p53 (p53TD) and a coding sequence for 8 Histidines (His), the sequence was flanked with the restriction targets BamHI and HindIII for facilitate its cloning in the plasmid pFastBacl.
  • Figure 9 a) The expression of the protein -, n Sf21 cells and in larvae was analyzed by Western blotting with an anti-Histidine antibody. A band of the expected size was detected, as well as others corresponding to the multimeric forms; b) The formation of tetramers was confirmed by Western blot, with the same antibody, on an acrylamide gel under native conditions.
  • Figure 10 The fusion peptide was purified by affinity columns and fraction 2 was analyzed by coomassie (1) and western-blot (2) staining with an anti-Histidine antibody.
  • Figure 11 The immunogenicity of the fusion peptide, produced in larvae and purified by affinity column was analyzed by Elisa. The D.O. values at 405 nm, obtained at a serum dilution of 1/100, show the presence of specific antibodies against the protein.
  • the invention relates to a DNA construct, hereinafter referred to as the DNA construct of the invention, comprising, operably linked, at least: a) a nucleic acid sequence (A) containing the nucleotide sequence encoding for a product of interest; and b) a nucleic acid sequence (B) containing the nucleotide sequence encoding a tetramerization domain; wherein the 3 'end of said nucleic acid sequence (A) is attached to the 5' end of said nucleic acid sequence (B).
  • the nucleic acid sequence (A) contains the nucleotide sequence that codes for a product of interest.
  • the product of interest can be practically any peptide or protein, regardless of its origin (eukaryotic, prokaryotic, viral, etc.), which can be expressed recombinantly.
  • said product of interest is a peptide or protein useful in vaccination, therapy or diagnosis, for example, CPV 2L21 peptide, RHDV VP60 protein, antibiotic peptides, etc.
  • said product of interest is a peptide or protein with application in any type of industry, for example, industrial enzymes, such as cellulases, glucanases, proteases, etc.
  • the nucleic acid sequence (B) contains the nucleotide sequence that codes for a tetramerization domain.
  • a tetramerization domain is a peptide sequence that promotes dimerization and / or tetramerization in proteins. They contain it. Virtually any tetramerization domain can be used in the DNA construction of the invention.
  • said tetramerization domain comprises or is constituted by the tetramerization domain (DT) of the p53 protein, which is in the C-terminal region of the p53 protein (residues 326-355) (Chéne P. , (2001), The role of tetramerization in p53 funcion. Oncogene 20: 2611-2617).
  • the DNA construct of the invention comprises a single nucleic acid sequence (A) and a single nucleic acid sequence (B).
  • A a single nucleic acid sequence
  • B a single nucleic acid sequence
  • This type of DNA construction can result in homotetramers of the product of interest (in the form of a fusion protein where the peptide or protein of interest is fused to the DT).
  • the DNA construct of the invention comprises, in addition to said nucleic acid sequences (A) and (B), a nucleic acid sequence (A ') containing the nucleotide sequence encoding a product of of interest, wherein the 5 'end of said nucleic acid sequence (A') is attached to the 3 'end of said nucleic acid sequence (B).
  • the products of interest encoded by the nucleotide sequences contained in the nucleic acid sequences (A) and (A ') may be the same or different.
  • homotetramers of the product of interest formed by 4 equal monomers each containing 2 residues of the same product of interest are obtained (in the form of fusion proteins where the products of interest are fused to both ends of the DT).
  • tetramers of the products of interest formed by 4 equal monomers are obtained each containing 2 different products of interest (in the form of fusion proteins where each of the products of interest is fused to a DT end).
  • nucleic acid sequence (B) that contains the nucleotide sequence that codes for the tetramerization domain does not fuse directly to the nucleic acid sequence (A) that contains the nucleotide sequence that codes for the product or products of interest but it is advantageous to introduce a spacer (flexible) peptide between the end of the nucleic acid sequence (A) and the beginning of the nucleic acid sequence (B).
  • the DNA construct of the invention may also contain, in addition, a nucleic acid sequence (C) that contains the nucleotide sequence encoding a spacer peptide (Cl) located between said nucleic acid sequences (A) and (B), wherein the 5 'end of said nucleic acid sequence (C) is attached to the 3' end of said nucleic acid sequence (A) and the 3 'end of said nucleic acid sequence (C) is attached to the 5' end of said nucleic acid sequence (B).
  • said spacer peptide (Cl) is a peptide with structural flexibility. Virtually any peptide with structural flexibility can be used.
  • said flexible peptide may contain repetitions of amino acid residues, in particular of GIy and Ser residues or any other suitable amino acid residue repeat.
  • said flexible spacer peptide comprises the Gly-Ser-Pro-Gly sequence (GSPG) or the sequence (Gly-Ser) 4 .
  • said DNA construct of the invention contains said nucleic acid sequence (A '), in addition to said nucleic acid sequences (A) and (B), said DNA construct may also contain, if desired, a sequence of nucleic acid (C) containing the nucleotide sequence encoding a spacer peptide (C2) located between said nucleic acid sequences (A ') and (B), wherein the 5' end of said nucleic acid sequence (C ) is attached to the 3 'end of said nucleic acid sequence (B) and the 3' end of said nucleic acid sequence (C) is attached to the 5 'end of said nucleic acid sequence (A').
  • C nucleic acid
  • the spacer peptide (C2) can be virtually any structurally flexible peptide, for example, a flexible spacer peptide comprising the GSPG or (Gly-Ser) 4 sequence.
  • the nucleic acid sequence (C) containing the nucleotide sequence encoding a spacer peptide (C2) may be the same or different from that encoding said spacer peptide (Cl) contained in said nucleic acid sequence (C), whereby said spacer peptides (Cl) and (C2) can be the same or different.
  • the DNA construct of the invention may contain, if desired, a nucleic acid sequence encoding a peptide capable of being used with isolation or purification purposes of the fusion peptide or protein.
  • the DNA construct of the invention includes, if desired, a nucleic acid sequence (D) containing the nucleotide sequence encoding a peptide capable of being used for the purpose of Isolation or purification. Said nucleic acid sequence (D) may be located in any position that does not alter the functionality of the tetramerization domain or of the product or products of interest.
  • said nucleic acid sequence (D) may be located between said nucleic acid sequences (A) and (B), wherein the 5 'end of said nucleic acid sequence (D) is attached to the 3' end of said nucleic acid sequence (A) and the 3 'end of said nucleic acid sequence (D) is attached to the 5' end of said nucleic acid sequence (B), or said nucleic acid sequence (D) is located upstream of the 5 'end of said nucleic acid sequence (A), or said nucleic acid sequence (D) is located downstream of the 3' end of said nucleic acid sequence (B).
  • Virtually any peptide or peptide sequence that allows the isolation or purification of the fusion peptide or protein can be used, for example, polyhistidine sequences, peptide sequences capable of being recognized by monoclonal antibodies that can be used to purify the resulting fusion protein by chromatography of immunoaffinity, such as tag peptides, etc.
  • the DNA construct of the invention may also contain a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that can be specifically cleaved by enzymatic or chemical means in order to release the product of interest once the product is isolated.
  • the DNA construct of the invention may further include a nucleic acid sequence (E) containing the nucleotide sequence encoding an amino acid sequence (El) capable of being specifically cleaved by enzymatic or chemical means. , wherein said nucleic acid sequence (E) is next to the 3 'end of said nucleic acid sequence (A).
  • Virtually any amino acid sequence that can be specifically cleaved by enzymatic or chemical means can be used, for example, protease recognition sites (enterokinase, Arg-C endoprotease, GIu-C endoprotease, Lys-C endoprotease, Coagulation factor Xa, etc.) or sites susceptible to being specifically cleaved by chemical reagents (cyanogen bromide, etc.).
  • said DNA construct of the invention contains said nucleic acid sequence (A '), in addition to said nucleic acid sequences (A) and (B), said DNA construct may also contain, if desired, a sequence of acid nucleic acid (E ') containing the nucleotide sequence encoding an amino acid sequence (E2) that can be specifically cleaved by enzymatic or chemical means, wherein said nucleic acid sequence (E') is located after end 3 'of said nucleic acid sequence (A').
  • E2 can be virtually any amino acid sequence that can be specifically cleaved by enzymatic or chemical means.
  • the nucleic acid sequence (E ') containing the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence (E2) that can be specifically cleaved by enzymatic or chemical means may be the same or different from said amino acid sequence (El) susceptible to being specifically cleaved by enzymatic or chemical means encoded by said nucleic acid sequence (E), whereby said sequences (El) and (E2) may be the same or different.
  • the DNA construct of the invention can be obtained by using techniques well known in the prior art [Sambrook et al, "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989 VoI 1-3].
  • Said DNA construct of the invention may, operably linked, incorporate a sequence regulating the expression of the nucleotide sequence encoding the product or products of interest, thereby constituting an expression cassette.
  • operably linked means that the product or products of interest is (are) expressed in the correct reading frame under the control of the control or regulatory expression sequences.
  • the invention provides an expression cassette comprising the DNA construct of the invention operably linked to an expression control sequence of the nucleotide sequence encoding the product of interest.
  • Control sequences are sequences that control and regulate transcription and, where appropriate, translation of the product of interest, and include promoter sequences, coding sequences for transcriptional regulators, ribosome binding sequences (RBS) and / or terminator sequences of transcription.
  • said expression control sequence is functional in prokaryotic cells and organisms, while in another particular embodiment, said expression control sequence is functional in eukaryotic cells and organisms.
  • said expression cassette further comprises a marker or gene that codes for a motif or for a phenotype that allows the selection of the host cell transformed with said expression cassette.
  • Illustrative examples of said markers that could be present in the expression cassette of the invention include antibiotic resistance genes, toxic compound resistance genes, and in general all those that allow the selection of genetically transformed plants.
  • the invention relates to a vector, such as an expression vector, comprising said DNA construct or said expression cassette.
  • a vector such as an expression vector
  • the choice of the vector will depend on the host cell into which it will be subsequently introduced.
  • the vector where said DNA sequence is introduced can be a plasmid or a vector that, when introduced into a host cell, is integrated or not into the genome of said cell.
  • the obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art [Sambrok et al, 1989, cited supra].
  • said recombinant vector is a viral vector, preferably, viral vectors capable, respectively, of infecting plants, algae or animal cells, preferably insect or larval cells thereof.
  • Said viral vector can be used to infect cells susceptible to being infected by said virus. Therefore, in another aspect, the invention relates to a cell infected with said viral vector.
  • said infected cell is a plant cell or an insect cell, infected with an appropriate viral vector, said infected plant or insect cell being able to express the product of interest.
  • Plant cells infected with recombinant viral vectors can be obtained after infection of a plant or a protoplast with said recombinant viral vector.
  • An interesting application of the infective viral vectors of plants is the expression in plants of proteins or epitopes of animal pathogens in order to produce edible vaccines against said pathogens. This strategy can be applied to insect cells infected with recombinant viral vectors that can Obtained after infection of a larva of an insect with said recombinant viral vector.
  • the recombinant vectors provided by this invention can be used to transform eukaryotic or prokaryotic cells. Therefore, in another aspect, the invention relates to a transformed cell comprising said recombinant vector, or said DNA construct provided by this invention, or said expression cassette provided by the invention. Transformed cells can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art [Sambrok et al, 1989, cited supra]. In a particular embodiment, eukaryotic or prokaryotic cells are co-infected with two or more recombinant vectors provided by this invention. Said recombinant vectors may contain sequences encoding the same products of interest whose expression results in homotetramers in the cells co-transformed with said vectors.
  • said recombinant vectors may contain coding sequences of different products of interest whose expression results in tetramers of 2 different peptides or proteins in cells co-transformed with said vectors, which may be interesting, for example, in multiple immunization developments.
  • one of said vectors contains a DNA construct of the invention comprising a nucleotide sequence encoding one or more products of interest while another of the vectors (vector II) contains a DNA construct of the invention comprising a nucleotide sequence that codes for one or more products of different interest (s) to the product or products of interest encoded (s) by the nucleotide sequence contained in the DNA construct present in the vector I.
  • the invention relates to a transformed cell comprising at least one DNA construct of the invention, or a recombinant vector provided by this invention or an expression cassette provided by this invention.
  • said transformed cell comprises two or more DNA constructs of the invention, or recombinant vectors or cassettes, the same or different, preferably different, provided by this invention.
  • Transformed cells can be obtained by Conventional methods known to those skilled in the art [Sambrok et al., 1989, cited supra].
  • the invention in another aspect, relates to a transgenic cell comprising, inserted in its genome, at least one DNA construct of the invention, or an expression cassette provided by this invention.
  • said transgenic cell is derived from a plant cell and comprises, inserted in its genome or in the genome of a chloroplast, at least one DNA construct of the invention or an expression cassette provided by the invention. From said transgenic plant cells or from transgenic plant material, transgenic plants can be obtained. Therefore, in another aspect, the invention relates to a transgenic plant comprising at least one transgenic plant cell provided by this invention.
  • An interesting application of transgenic plants is the expression in plants of proteins or epitopes of animal pathogens in order to produce edible vaccines against such pathogens.
  • said plants will express different products of interest, for example, different proteins or epitopes of animal pathogens, in order to simultaneously immunize the animals against different pathogens.
  • said transgenic cell is an animal cell belonging to a non-human animal, preferably an insect and more preferably an insect larva. Therefore, the invention also relates to a transgenic non-human animal, particularly an insect or a transgenic insect larva that expresses the peptide or protein of interest, with high yield, attributable to its fusion with a multimerization domain of another peptide or protein, preferably of a transcription factor and more preferably of p53.
  • the DNA construct of the invention can be used to produce products of interest. Therefore, in another aspect, the invention relates to a method of producing a product of interest comprising growing a cell or organism provided by this invention under conditions that allow the production of said product of interest.
  • the method of producing a product of interest provided by this invention further includes isolation and purification of said product of interest.
  • the construction of DNA of the invention should advantageously include said previously defined nucleic acid (E) [and (E ') sequence] comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence (El) [and (E2) where appropriate] that can be cleaved specifically by enzymatic or chemical means in order to release the product of interest once the fusion protein is isolated.
  • the product of interest obtained by the method of the present invention is in the form of a multimeric fusion protein, namely, dimeric or, mostly, tetrameric.
  • said product of interest is in the form of a homotetramer containing, for example, 4 residues of the same peptide or protein of interest (when using a DNA construct of the invention containing only a nucleic acid sequence ( A) which codes for a product of interest) or 8 residues of the same peptide or protein of interest (when two DNA constructs of the invention are used each containing two nucleic acid sequences (A) and (A ') which code for the same product of interest) or in the form of a tetramer containing, for example, 2 residues of a first product of interest and another 2 remains of a second product of interest, wherein said first and second products of interest are products of interest different from each other (when two different DNA constructs of the invention are used each containing a nucleic acid sequence (A) that encodes
  • a feature of the product expression system of interest provided by this invention is its versatility, which allows different products of interest to be expressed simultaneously.
  • the invention also provides, in another aspect, a method for expressing a gene encoding a product of interest in a plant, which comprises transforming said plant with at least one DNA construct provided by this invention, or an expression cassette. or a vector provided by this invention.
  • the transformation of plant tissue cells can be carried out by conventional methods.
  • the invention also provides, in another aspect, a method for expressing a gene encoding a product of interest in a non-human animal, preferably in an insect and more preferably in an insect larva, which comprises transforming said insect or larva with, at least one DNA construct provided by this invention, or an expression cassette or a vector provided by this invention.
  • the transformation of animal tissue cells, more preferably of insects can be carried out by conventional methods.
  • the invention relates to a fusion protein obtainable by expression of the nucleic acid sequence contained in the DNA construct. provided by this invention. More specifically, the invention provides a fusion protein comprising:
  • said tetramerization domain comprises (or is constituted by) the tetramerization domain of the p53 protein.
  • the fusion protein may have the amino acid sequence of a single product of interest or the amino acid sequence of two products of interest.
  • Said fusion protein is a multimeric fusion protein, namely, dimeric or, mostly, tetrameric. Therefore, in a particular embodiment, said fusion protein comprises 4 residues of the same product of interest, or 8 residues of the same product of interest.
  • said fusion protein comprises 2 residues of a first product of interest and another 2 residues of a second product of interest other than said first product of interest, for example, 4 residues of a first product of interest and another 4 remains of a second product of interest other than said first product of interest.
  • said fusion protein comprises 4 different products of interest, or 8 different products of interest.
  • the fusion protein provided by this invention comprises 4 residues of the same product of interest, or 8 residues of the same product of interest, or 4 residues of a first product of interest and another 4 residues of a second product of interest other than said first product of interest.
  • the invention provides a fusion protein comprising: (i) the amino acid sequence corresponding to a tetramerization domain; (ii) an amino acid sequence corresponding to a product of interest
  • Said products of interest (Al) and (A2) may be the same or different.
  • said products of interest (Al) and (A2) are different from each other.
  • the tetramerization domain comprises (or is constituted by) the tetramerization domain of the p53 protein.
  • the fusion protein provided by this invention may also contain, if desired, (a) a spacer peptide between the product of interest and the tetramerization domain; and / or (b) a peptide to facilitate isolation or purification of the fusion peptide or protein; and / or (c) an amino acid sequence capable of being cleaved specifically by enzymatic or chemical means.
  • the invention in another aspect, relates to a recombinant vaccine comprising a fusion protein provided by this invention, wherein said product of interest comprises an immunogenic peptide or protein, and, optionally, a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the recombinant vaccine provided by this invention can be univalent or multivalent, that is, it can immunize against one or more pathogens simultaneously.
  • the multimeric fusion protein present in the recombinant vaccine provided by this invention may contain 4 residues of the same peptide or immunogenic protein, or 8 residues of the same peptide or immunogenic protein.
  • said fusion protein comprises 2 residues of a first immunogenic peptide or protein and another 2 residues of a second different immunogenic peptide or protein, or 4 residues of a first immunogenic peptide or protein and another 4 residues of a second different immunogenic peptide or protein.
  • the invention provides a vaccine comprising:
  • said tetramerization domain comprises (or is constituted by) the tetramerization domain of the p53 protein.
  • Virtually any immunogenic (vaccine) peptide or protein can be used in the preparation of the recombinant vaccine provided by this invention; however, in a particular embodiment, they include, said immunogenic peptide or protein is selected from peptide 2L21 of CPV or VP60 of RHDV.
  • the vaccine provided by this invention comprises:
  • the tetramerization domain comprises (or is constituted by) the tetramerization domain of the p53 protein.
  • Said first immunogenic peptide or protein may be the same or different from said second immunogenic peptide or protein, in order to obtain univalent or multivalent vaccines.
  • said first immunogenic peptide or protein is different from said second immunogenic peptide or protein.
  • FIG. 7 illustrates the possibility of obtaining multivalent vaccines according to the present invention.
  • the figure shows schematically the formation of tetramers containing 2 vaccine proteins or peptides from a single construct provided by this invention comprising the tetramerization domain of the p53 protein.
  • the predicted structure that would be formed from a single expression cassette formed by two genes fused at the ends of the tetramerization domain is included.
  • Another preferred embodiment of the present invention is the use of the p53 tetramerization domain to improve the expression of proteins whose expression presents some added difficulty, such as, for example, industrial enzymes, which must be expressed and isolated with the least loss of activity. possible.
  • the tetramerization domain of p53 is fused with acids nucleic coding for enzymes involved in the degradation or hydrolysis of cellulose.
  • the model plant used has been Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia.
  • the genus Arabidopsis belongs to the family of the Cruciferas (Brassicaceae or Cruciferae).
  • MS medium Murashige T. and F. Skoog. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaceous tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497, 1962
  • the seeds were sterilized for 10 minutes in a solution of 30% sodium hypochlorite and 0.01% Triton X-100, and subsequently washed 5 times in sterile water.
  • the seeds were sown on the petri dishes, which were brought to 4 0 C and dark for 48 hours. Subsequently they took culture chambers under conditions of 22 0 C and 16 hours light followed by 8 hours dark. After two weeks, the seedlings were transplanted to land and grown under the conditions previously mentioned.
  • the cultures of E. coli were carried out in LB medium (Sigma) in the presence of the corresponding selective agent (Sambrook et al. 1989) for 14-16 hours at 37 ° C.
  • the preparation of competent cells was carried out by the chloride chloride method. rubidium, described by Hanahan (Studies on transformation of E. coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: 557-580. 1983).
  • the cultures of the different strains of Agrobacterium were performed in liquid LB or plate, supplemented with 50 .mu.g / ml kanamycin and 50 / ml rifampicin (Sambrook et al. 1989), and were maintained 36-48 hours at 28 0 C .
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DH5- ⁇ and TOP-IO strains were used for plasmid maintenance and new generation. Both competent strains were transformed following the protocol of Birnboim and Dolly (Birnboin HC and Dolly J. A rapid alkline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nuc ⁇ . Acid Res. 7: 1513-1516. 1979). Briefly, plasmid DNA or ligation product was added to an aliquot of 100 ul of thawed competent cells and kept at 4 0 C for 30 minutes. Next, a thermal shock is caused at 42 0 C, which increases the permeability of the pore, 600 ul of LB were added and incubated under stirring at 37 0 C for 1-1.5 hours. Bacterial cells were pelleted by centrifugation for 3 minutes at 3,500 rpm and plated in solid medium to which the necessary selection antibiotics had previously been added. Plates were incubated in an oven at 37 0 C overnight.
  • pGEM-Teasy was used for cloning and sequencing of PCR products.
  • the binary plasmid PBI-121 and derivatives were used in the transformation of Agrobacterium and in the subsequent infiltration of A. thaliana plants.
  • Plasmid pCMV-p53 was used as a template to obtain the sequence corresponding to the tetramerization domain of p53.
  • pBI-121 (Clontech Cat 6018-1): Derived from plasmid pBI-101.
  • 35S CaMV cauliflower mosaic virus
  • NOS-ter nopalin synthetase
  • pGEM-Teasy Promega: This plasmid is specially designed for cloning and sequencing of PCR products. It contains a region with multiple restriction sites (polylinker).
  • Plasmid pCMV-p53 is an expression plasmid that contains the protooncogene sequence encoding the p53 tumor suppressor protein. This plasmid was used as a template to obtain the sequence corresponding to the tetramerization domain of p53. In addition to these commercial plasmids, plasmid p35S- was also used
  • TEV (4,051 bp), generated in the laboratory of Dr. Escribano (INIA) and derived from plasmid pBI121 [laboratory collection of Dr. Escribano (INIA)], which contains the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (35SCaMV ), the transcription enhancer sequence (VTE) of the tobacco mottling virus, after which a region of multiple cloning and the polyadenylation signal of Vsp appears.
  • This plasmid was used in the subcloning of some constructions as a previous step to its cloning in the binary plasmid. Both plasmids generated in the laboratory of Inventors (Dr. Escribano) are freely available to the public and are not subject to claim in the present invention.
  • TEV 2L21-DT which was used in the genetic transformation of plants.
  • the antigen expressed in said plasmid pBI-TEV 2L21-DT is the fusion of the canine parvovirus 2L21 peptide (CPV) to the tetramerization domain of the p53 protein (SEQ ID NO: 9).
  • the size of the transgene is approximately 0.2 kb.
  • the sequences encoding said antigen and their respective fusions were obtained by amplification by PCR.
  • Two types of commercial polymerases were used, ECOTAQ (Ecogen), which was mainly used in colony analyzes, and Pow DNA polymerase (Roche), which exhibits corrective activity and was used to amplify the transgene sequences.
  • the primers used were those identified as: p53 one way (5 '-3'): CCCGGGC AAACCACTGGATGGAG [SEQ ID NO: I]; and p53 lap (5 '-3'): CCCGGGCCCTGGCTCCTT [SEQ ID NO: 2]
  • the enzymatic modifications of the DNA and the digestion with restriction endonucleases were performed according to conventional methods (Sambrook et al. 1989) and following the recommendations of the manufacturers of the corresponding enzymes.
  • the separation of the different DNA fragments was carried out in agarose gels (Pronadisa) of varying concentration between 0.7 and 2% (w / v), depending on the expected size of the fragments to be resolved.
  • the buffer used was TBE (90 mM Tris, 90 mM boric acid, 1 mM EDTA).
  • the purification of the DNA fragments from the agarose gels was carried out with the "GeI Extraction Kit" (Quiagen).
  • the 5 'protuberant ends became blunt, when necessary, by filling the 3' end with the klenow fragment of E. coli DNA polymerase I (Roche).
  • the incorporation of phosphate groups at the 5 'ends of the DNA was carried out with the T4 polynucleotide kinase (Roche diagnostic).
  • T4 DNA ligase (Roche diagnostic), or the ligation kit of pGEM-Teasy (Promega) was used.
  • Obtaining plasmid pBI-2L21-GUS is described in the publication of Gil et al.
  • the sequence of the tetramerization domain of the p53 protein was obtained by PCR amplification with specific primers, using plasmid pCMV-p53 (Clontech) as a template.
  • the primers used were designed to obtain the tetramerization domain sequence of the p53 protein flanked by two restriction targets.
  • Such primers were the oligonucleotides identified as p53 one way [SEQ ID NO: 1] and p53 back [SEQ ID NO: 2].
  • the sequence corresponding to the tetramerization domain was cloned into the cloning plasmid pGEM-Teasy (Promega), obtaining the plasmid pGEM-DT. After sequencing and verification of the sequence, this plasmid was digested with the restriction enzyme Kpnl and the 3 'protruding ends were removed by incubation with the klenow fragment of the DNA polymerase (Roche).
  • Agrobacterium cells previously transformed with the different plant transformation plasmids were grown in 500 ml of LB medium (Sigma), supplemented with kanamycin and rifampin (Sambrook et al. 1989), for 48 hours at 28 0 C. After centrifugation at 3,000 rpm for 20 minutes, the sediment (containing the bacteria) was resuspended in 200 ml of infiltration medium: 2.35 g / 1 DM (Murashige and Skoog, 1962), 5% sucrose, 10 g / 1 6-benzylaminopurine and 0.02% Silweet L-77 (Lehle Seeds, VIS-Ol catalog number).
  • Inflorescences were immersed in the infiltration medium containing Agrobacterium in a vacuum chamber, subjecting them to a pressure of 5 kPa (50 mbar) for 10 minutes (Bechtold N. and Pelletier G. In Agrobacterium-mQdia ⁇ Qd transformation of adult Ar ⁇ bidopsis th ⁇ li ⁇ n ⁇ plants by vacuum infiltration Methods Mol. Biol. 82: 259-266, 1998). Once the time had elapsed, the vacuum was released as quickly as possible, the plants were washed with water and covered with plastic to prevent their drying out and possible contamination between the different infiltrated plants.
  • Tl seeds were kept at 4 0 C temperature and dark for 48 hours and then in vitro culture chamber, under controlled conditions (16 hours light and 8 hours dark, 22 0 C temperature). After 12-15 days, the transgenic seedlings (capable of growing normally in the presence of kanamycin) were transplanted to land and taken to culture chambers for growth and development.
  • GM medium MS 4.7 g / 1, 1% sucrose, morpholin-ketanesulfonic acid (MES) 0.5 g / 1, agar 8 g / 1 and pH 5.7
  • MES morpholin-ketanesulfonic acid
  • the Tl seeds were kept at 4 0 C temperature and dark for 48 hours and then in vitro culture chamber, under controlled conditions (16 hours light and 8 hours dark, 22 0 C temperature). After 12-15 days, the transgenic seedlings (capable of growing normally in the presence of kanamycin) were transplanted to land and taken to culture chambers for growth and development.
  • genomic DNA For its transfer to membranes, genomic DNA, previously digested with the chosen enzymes, following manufacturer's instructions, 0.75% agarose gels (Pronadisa) were used (w / v).
  • the buffer used was TBE (90 mM Tris, 90 mM boric acid, 1 mM EDTA.
  • the DNA was transferred to Hybond N + (Amersham) nylon membranes, with sodium hydroxide 0 , 4 M using conventional methods (Sambrook et al. 1989) for 14-16 hours.
  • RNA quantification was performed by spectrophotometry. For transfer to membranes, RNA was resolved in 1.5% horizontal agarose gels in the presence of formaldehyde / formamide (Sambrook et al. 1989). The RNA samples were loaded with ethidium bromide, in order to visualize them by fluorescence and thus check its integrity. Subsequently, the RNA was transferred to Hybond N + membranes (Amersham) using 0.05 M sodium hydroxide by conventional methods (Sambrook et al. 1989).
  • Oligolabelling kit (Pharmacia Biotech). Unincorporated nucleotides were removed by molecular exclusion chromatography on S-200 columns (Pharmacia Biotech), following the manufacturer's instructions. The different DNA fragments used as probes (complete sequences of fusion genes), as well as the method used to obtain them, are detailed below.
  • Nucleic acid hybridizations were performed in glass tubes, containing 10-15 ml of prehybridization solution. The membranes were prehybridized for at least two hours at the hybridization temperature. After this time, the radioactively denatured labeled probe was added and the membranes were maintained in this solution for 16 to 20 hours.
  • Southern hybridizations at low astringency were carried out in a prehybridization solution with 5X SSPE (0.15 M NaCl, 10 mM NaH 2 PO 4 , 1 mM EDTA Na 2 ), 5X Denhardt Solution (0.02% Ficoll , 0.02% Polyvinylpyrrolidone, 0.02% bovine serum albumin, 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS) and denatured herring sperm DNA 0.5 mg / ml).
  • Hybridization was carried out at 65 ° C. After hybridization, the membranes were subjected to successive washes with 5X SSPE and 0.5% SDS, decreasing the concentration of salts in each wash.
  • Northern hybridizations were performed to type 42 0 C in phosphate buffer 0.25 M pH 7.2, 0.25 M NaCl, 1 mM EDTA, 7% SDS, 10% PEG 6000, 40% formamide and herring sperm DNA denatured 0.2 mg / ml. After hybridization, the membranes were subjected to several washes with 5X SSPE and 0.5% SDS, at 65 0 C. Each wash was approximately 20 minutes long. Sometimes it was necessary to wash with 0.5% SDS.
  • the membranes were exposed with autoradiographic film (Hyperfilm MP, Amersham) and intensifying screens, at -8O 0 C, for the time necessary to visualize the hybridization bands. In order to reuse the membranes, they were inhibited with a boiling 5% SDS solution, and stirring until the solution cooled. To verify that there was no radioactivity in the membrane, the filters were exposed with autoradiographic film for several days.
  • Fresh plant material was homogenized in protein extraction buffer (10 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.1% Triton x-100, 1% ⁇ -mercaptoethanol and 1 mM PMFS as a protease inhibitor), after being cut and introduced into 1.5 ml eppendorf tubes and kept on ice (4 0 C). After homogenization, they were centrifuged 10-15 minutes at 13,000 rpm, collecting the supernatant. In some cases, frozen material was used. To solubilize some of the precipitated proteins and improve extraction yields, a buffer containing urea was used. For the Western blois under native conditions an extraction lamp was used without reducing agents or denaturing agents: 10 mM Tris pH 7.5 and 500 mM NaCl.
  • Protein analysis was carried out in acrylamide bisacrylamide electro foresis gels (30: 1) in the presence of SDS, in gels under native conditions (structure formation analysis) or in tricine gels for low molecular weight antigens .
  • Protein electrophoresis under denaturing conditions were performed on discontinuous acrylamide-bisacrylamide gels in the presence of SDS, following the conventional method (Sambrook et al. 1989).
  • Acrylamide bisacrylamide separator gels (Biorad or Serva) were prepared, at varying concentrations of 7 to 15% depending on the expected molecular weight of the protein to be analyzed and caking gels with a 3.5% arcrilamide-bisacrylamide concentration (Sambrook and col. 1989).
  • the Electrophoresis developed at a constant voltage of 100 to 140 V in the case of minigeles (7x9 cm).
  • Tricine allows the resolution of small molecular weight proteins (5-35 kDa) in acrylamide gels at higher concentrations than with polyacrylamide-glycine-SDS gels (in which low molecular weight proteins are not resolved), without the use of urea being necessary, according to the method described by Schagger et al. (Schagger H. and von Jagow G. Tricine-sodium SDS-polyacrilamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166: 368-379, 1987). 10% caking gels and 20% separators were prepared. Samples were incubated for 30 minutes at 4O 0 C in protein dissociation buffer (4%
  • the proteins were transferred to the nitrocellulose filters, they were stained to verify their integrity with a 0.2% solution of Ponceau (Sigma) in 30% trichloroacetic acid (w / v) and 30% sulfosalicylic acid (w / v) for 1 minute per dive. They were subsequently washed with distilled water to remove excess dye.
  • nitrocellulose filters Once transferred and immobilized proteins on nitrocellulose filters, said nitrocellulose filters well were blocked for 1 hour at 37 0 C with skimmed milk powder 2% (w / v) PBS, either overnight at 4 0 C under stirring, with the same blocking solution. The filters were then incubated for 1 hour with the specific antibody diluted in 0.05% PBS-Tween 20 (v / v) and at the appropriate concentration for each assay. The filters were washed 3 times for 10 minutes in wash buffer (PBS lX-Tween) each time and incubated in the same dilution solution with the corresponding secondary antibody, for 1 hour at room temperature.
  • wash buffer PBS lX-Tween
  • mice 11 weeks old and Swisse or Balb-c line, were immunized intraperitoneally on days 0, 7 and 14 with plant extracts, expressing the recombinant protein under study (0.5-3 mg of soluble protein total / dose).
  • Freund's complete adjuvant (Sigma) and incomplete Freund's adjuvant (Sigma) were used for the rest.
  • mice were immunized using the same protocol with untransformed plant extracts or transformed with the vector without the transgene. Ten days after the last immunization, the mice were bled and the sera were obtained for study.
  • the sera were obtained by incubation of the blood for 30 minutes at 37 0 C, followed by incubation for 14 hours at 4 0 C. blood clots were separated and the sera were clarified by centrifugation at 1,500 rpm for 10 minutes.
  • the wells of the ELISA plates were upholstered with 0.2 ⁇ g of the 2L21 peptide per well, diluted in paste buffer (carbonate / bicarbonate), for 12 hours at 4 0 C. It was blocked with a solution of PBS-Tween-20 0.05% (v / v) and fetal bovine serum or
  • PBS-Tween 20 0.05%
  • the sera were incubated to be determined at different dilutions in PBS-0.05% Tween 20, for 1 hour at 37 0 C under stirring.
  • PBS-Tween After 5 washes with PBS-Tween, the wells were incubated with 0.05% PBS-Tween-20 solution containing a peroxidase-conjugated anti-mouse (Amersham) at a dilution of 1/500, for 1 hour at 37 0 C with agitation.
  • the plates were washed and revealed using o-phenylenediamine (OPD) substrate (Sigma-Aldrich), prepared in water containing 0.1% hydrogen peroxide.
  • OPD o-phenylenediamine
  • the INGEZIM PARVO CANINO 1.5.CPV.K.1 Kit (Ingenasa) was used, designed for the detection and quantification of specific antibodies against canine parvovirus in dog sera.
  • the antigen specificity of antibodies from immunized animals was determined by immunoblotting.
  • the VP2 capsid protein produced in baculovirus (Ingenasa) was resuspended in protein dissociation buffer, boiled for 5 minutes and loaded on polyacrylamide-glycine gel in the presence of SDS and transferred to a nitrocellulose membrane (Biorad).
  • Mouse sera were tested at a dilution limit from 1/10, and the secondary anti-mouse antibody was conjugated to alkaline phosphatase (Roche).
  • the substrate used for the reaction was nitroblue-tetrazolum-4-chloro-3 indolphosphate (NBT-BCIP, Roche).
  • Said plasmid pBI-TEV 2L21-DT allows the selection of transformants in MS medium with kanamycin and stable integration in the nuclear chromosomal DNA of plants of the expression region comprised between the left (LB) and right (RB) edge of the plasmid.
  • A. thaliana plants were transformed with plasmid pBI-TEV 2L21-DT by infiltration of the flowers mediated by A. tumefaciens (Clough and Bent, 1998). Around 30 plants, belonging to different antibiotic resistant clones and presenting a phenotype similar to that of wild plants, were analyzed in Tl.
  • the results of the ELISAs showed similar results to those obtained by the Western blot technique, demonstrating that the plants transformed with the plasmid pBI-TEV 2L21-DT expressed high levels of the 2L21-DT antigen.
  • ELISAs with plant extracts were compared with others carried out with the synthetic 2L21 peptide.
  • the 3C9 monoclonal antibody showed a great avidity for the pure peptide, greatly decreasing when diluted with plant extracts, presenting some variation and lack of linearity, which prevented a more precise quantification could be performed.
  • the antigen once extracted had a high degree of freeze / thaw tolerance, maintaining its antigenic characteristics in ELISA assays.
  • the stability of the antigen after extraction and storage at 4 0 C was studied in the same extraction buffer. The results show that the 2L21-DT antigen is stable and remains at the same levels, at least, for three weeks at 4 0 C.
  • mice In order to test the immunogenicity of the recombinant peptide 2L21-DT produced in transgenic plants of A. thaliana, different groups of mice (Balb-c) were immunized intraperitoneally. One group of mice was immunized with crude extracts of soluble total protein (500 ⁇ g) of the maximum expression line of the 2L21-DT peptide (line 22) and another group of mice was inoculated in the same way with 500 ⁇ g of soluble total protein of plants expressing the 2L21 antigen fused to the ⁇ -GUS protein (2L21-GUS). Both transgenic plants used contained equimolar amounts of the 2L21 peptide.
  • mice immunized intraperitoneally both with extracts containing the 2L21-DT peptide or the 2L21-GUS peptide, presented specific antibodies against the synthetic 2L21 peptide.
  • Antibody titer in mice immunized with extracts containing the 2L21-DT peptide varied between 1/640 and 1/7120 while in the case of GUS fusion (2L21-GUS) titers were obtained that varied between 1 / 320 and 1/1280.
  • the group of negative control mice, immunized with plant extracts without transform did not present specific antibodies against the synthetic peptide 2L21 [Figure 6A].
  • mice with the same transgenic plants as in the previous case were repeated, but by oral administration, allowing the mice to consume leaves of both types of plants.
  • the result of said immunization can be seen in Figure 6B.
  • Both groups of mice presented serum antibodies after immunization, the titles of these being by ELISA higher in the case of plants expressing 2L21-DT.
  • the antigen fused to the DT of p53 produced in plants maintains its antigenic and immunogenic characteristics, both intraperitoneally and orally and, in both cases, improves response obtained with the peptide fused to a carrier protein, immunologically irrelevant.
  • the Sf21 cell line was used for the propagation of the baculoviruses and expression of recombinant proteins. Derived from ovarian tissue of Spodoptera frugiperda.
  • the cultures of E. coli were carried out in LB medium (Sigma) in the presence of the corresponding selective agent (Sambrook et al. 1989) for 14-16 hours at 37 ° C.
  • the preparation of competent cells was carried out by the chloride chloride method. Rubidium, described by Hanahan (Studies on transformation of E. coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: 557-580. 1983).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DH5- ⁇ and TOP-IO strains were used for plasmid maintenance and new generation. Both competent strains were transformed following the protocol of Birnboim and Dolly (Birnboin HC and Dolly J. A rapid alkline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nuc ⁇ . Acid Res. 7: 1513-1516. 1979). Briefly, plasmid DNA or ligation product was added to an aliquot of 100 ul of thawed competent cells and kept at 4 0 C for 30 minutes.
  • the bacteria were sedimented and plated in solid medium supplemented with IPTG and bluo-gal in addition to With the necessary antibiotics. Plates were incubated for 48 to 72 hours at 37 0 C until able to distinguish between white and blue colonies.
  • Plasmid pCMV-p53 was used as a template to obtain the sequence corresponding to the tetramerization domain of the p53 protein. Plasmid pFAstBacl was used to clone the gene of interest and obtain the recombinant virus staff.
  • pGEM-Teasy Promega: This plasmid is specially designed for cloning and sequencing of PCR products. It contains a region with multiple restriction sites (polylinker).
  • Plasmid pCMV-p53 (CLONTECH Cat. K6004-1): Plasmid pCMV-p53 is an expression plasmid that contains the protooncogene sequence that encodes the p53 tumor suppressor protein. This plasmid was used as a template to obtain the sequence corresponding to the tetramerization domain of p53.
  • pFastBac 1 (Invitrogen): Plasmid pFastBacl is an expression plasmid in insect cells. The gene of interest is cloned under the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) polyhedrin promoter. 2.4.2 Plasmids developed during the implementation of this invention
  • the plasmid identified as pFasBac-p54TDH was generated which was used in the transformation of E. coli strain DHlOBac.
  • the antigen expressed in said plasmid, p54TDH is the fusion of the dynein-binding peptide of the p54 protein of the African Swine Plague virus to the tetramerization domain of the p53 protein and an 8 Histidine sequence that facilitated its subsequent purification ( SEQ ID NO: 10).
  • the size of the generated sequence is approximately 0.24 kb.
  • sequences encoding said antigen and their respective fusions were obtained by amplification by PCR. Pyrobest commercial polymerase (Takara) was used for this. The primers used were identified as:
  • P54dud3 atggatccatgcatccgactgagccttacacgacagtcactactcagaacactgcttc (SEQ ID NO:
  • P54dud2 tactcagaac actgcttcac aaacaatgtc ggctattgaa aattta (SEQ ID NO: 4)
  • P54dudl tgtcggctat tgaaaattta aaaccactgg atggagaata (SEQ ID NO: 5)
  • P53td3rc ataagctttt agtgatgatg atggtggtgg tgatgcccctg gctccttccc agcc (SEQ ID NO: 6)
  • the fusion peptide was obtained by PCR amplification using the plasmid pCMV-p53 and oligos P53td3rc and P54dudl as template.
  • the PCR product was cloned into an intermediate plasmid, pGemT-easy. This new plasmid in turn served as a template for a second PCR, in which oligos P53td3rc and
  • Enzymatic DNA modifications and digestion with restriction endonucleases were performed according to conventional methods (Sambrook et al. 1989) and following the recommendations of the manufacturers of the corresponding enzymes.
  • the separation of the different DNA fragments was carried out in agarose gels (Pronadisa) at a concentration of 1% (w / v).
  • the buffer used was TBE (90 mM Tris, 90 mM boric acid, 1 mM EDTA).
  • the purification of the DNA fragments from the agarose gels was carried out with the "GeI Extraction Kit" (Quiagen).
  • the recombinant baculovirus expressing the fusion protein was obtained according to the Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (Invitrogen) method.
  • Competent E. coli DHlOBac cells were transformed with the plasmid pFastBac-p54TDH using as kanamycin antibiotics at 50 ⁇ g / ml, gentamicin at 7 ⁇ g / ml and tetracycline at 10 ⁇ g / ml in LB medium supplemented with 100 ⁇ g / ml Bluo-Gal and 40 ⁇ g / ml IPTG. Competent E.
  • coli DHlOBac cells are characterized by having a bacmid, a circular genome homologous to that of baculovirus in which the polyhedrin gene has been replaced by the lacZ gene.
  • the characteristics of the bacmid allow the transposition of the cloned fragment into the pFastBac vector just behind the polyhedrin promoter, truncating the lacZ gene and giving rise to colonies of white phenotype in case of positive transposition. In those cells in which the transposition did not take place, the colony phenotype was blue.
  • the recombinant bacmid was transfected into SfZl cells.
  • a complex between the bacmid and the agent Celfectin (Invitrogen) was first prepared in such a way that 1 ⁇ g of the bacmid diluted in 100 ⁇ l of Grace's medium was incubated for 45 minutes with 6 ⁇ l of diluted Celfectin also in 100 ⁇ l of the same medium. After incubation 0.8 ml of medium was added to the complex and this to a well containing 9 x 10 5 cells. After an incubation period of 5 hours at 0 C 27, the DNA complex was removed: lipids and cells fresh medium was added. They were incubated at 27 0 C until the appearance of signs of viral infection, between 72 and 96 hours.
  • the recombinant baculoviruses were recovered from the supernatant of the infected culture and amplified by successive passes in SfZl cells.
  • the viral titer of the viral stock was determined by plating.
  • a well was collected with 5 x 10 6 SfZl cells infected with the recombinant baculovirus in 250 ⁇ l of RIPA buffer (Tris pH 8 5OmM, 150 mM NaCl, 1% NP40, 5mM ⁇ -mercaptoethanol, 0.1% SDM) and 1 mM PMSF ( as a protease inhibitor). After an incubation period of 30 minutes at 4 0 C the sample was centrifuged collecting the supernatant. For Western blots under native conditions an extraction buffer was used without reducing or denaturing agents. Protein analysis was carried out on acrylamide-bisacrylamide electrophoresis gels.
  • Trichoplusia larvae were not infected with 10 4 pfu of the recombinant baculovirus by injection of 10 ⁇ l of inoculum, in their fourth segment. At 72 hours post-inoculation the larvae were frozen at - 8O 0 C and subsequently processed. To this end, they were crushed in a blender with 2 ml per extraction buffer larva (PBS IX, 0.1% Triton X 100, 25 mM DTT) and 1 mM PMSF (as protease inhibitor).
  • the processed larvae were centrifuged at 3,000g for 15 minutes at 4 0 C and the supernatant was clarified by passing through a Miracloth filter (Calbiochem) and centrifuged again at 15.00Og for 15 minutes. The supernatant was collected and stored at - 2O 0 C in aliquots. 2.6.3 Purification of proteins expressed in larvae by metal affinity chromatography
  • the larvae were crushed in 4ml per extraction buffer larva (10 mM Imidazole, 1% Triton XlOO, Phosfhate buffer pH 7.4 (Na 2 HPO 4 .2H 2 O 0.01M, NaH 2 PO 4 -H 2 O 0.01M, NaCl 0.5M) and 1 mM PMSF (as a protease inhibitor) Caution was taken not to use DTT as it is a reducing agent that interacts with the binding of His-Tag and resin ions.
  • the processed larvae were centrifuged at 3.00Og for 15 minutes at 4 0 C, the supernatant was clarified by passing through a Miracloth filter (Calbiochem) and sonic for 10 seconds for 3 times. It was centrifuged again for 15 minutes at 15.00Og. The supernatant was collected and incubated with Polyhistidine-tag Purif ⁇ cation Resin (Clontech) HEAD (1 ml per 10 ml of supernatant) for 1 hour 30 minutes in a rotor at 4 0 C.
  • the resin was washed twice with 10 volumes of wash buffer (20 mM Imidazole, Phosfhate buffer pH 7.4) by a 5 minute centrifugation at 2500 rpm. The last wash was mounted on a column and the resin was allowed to settle. Finally, the resin-bound protein was eluted with 10 ml of elution buffer (50OmM Imidazole, Phosfhate buffer pH 7.4) collecting ImI fractions. The purified protein concentration was quantified according to the Bradford-Lowry method (Biorad protein assay).
  • Protein electrophoresis under denaturing conditions were performed on acrylamide-bisacrylamide gels in the presence of SDS, following the conventional method (Sambrook et al. 1989).
  • Acrylamide-bisacrylamide separator gels (Biorad or Serva) were prepared at a concentration of 12% and concentrating gels with a concentration of 7% acrylamide-bisacrylamide (Sambrook et al. 1989).
  • Electrophoresis developed at a constant voltage of 100 to 140 V in minigeles (7x9 cm). All samples were quantified, according to the Bradford-Lowry method (Biorad protein assay).
  • the proteins were transferred to the nitrocellulose filters, they were stained to verify their integrity with a 0.2% solution of Ponceau (Sigma) in 30% trichloroacetic acid (w / v) and 30% sulfosalicylic acid (w / v) for 1 minute per dive. They were subsequently washed with distilled water to remove excess dye.
  • nitrocellulose filters Once transferred and immobilized proteins on nitrocellulose filters, they said nitrocellulose filters well were blocked for 1 hour at 37 0 C with skimmed milk powder 2% (w / v) in PBS, or overnight at 4 0 C under stirring, with the same blocking solution. The filters were then incubated for 1 hour with the specific antibody diluted in 0.05% PBS-Tween 20 (v / v) and at the appropriate concentration for each assay. The filters were washed 3 times for 10 minutes in wash buffer (PBS lX-Tween) each time and incubated in the same dilution solution with the corresponding secondary antibody, for 1 hour at room temperature. After repeating the washes, development was carried out using the Amersham ECL method. 2.7. IMMUNOGENIC ANALYSIS OF PROTEIN EXPRESSED IN BACULOVIRUS
  • Freund's complete adjuvant (Sigma) and incomplete Freund's adjuvant (Sigma) were used for the rest.
  • the rabbits were bled 15 days after the last immunization and the sera were obtained for study.
  • the sera were obtained by incubation of the blood for 30 minutes at 37 0 C, followed by incubation for 14 hours at 4 0 C. blood clots were separated and the sera were clarified by centrifugation at 1,500 rpm for 10 minutes.
  • the nucleotide sequence of the tetramerization domain of p53 obtained by PCR from the gene coding for this protein, was fused to the dynein binding domain of the structural protein p54 of the Swine Plague virus
  • Africana a sequence of 8 Histidines was also incorporated to facilitate its purification by affinity columns.
  • This fusion peptide was cloned into plasmid pFastBac-1.
  • the resulting plasmid was called pFasBac-p54TDH and allowed to obtain a recombinant baculovirus expressing said peptide.
  • SEQ ID NO: 1 shows the sequence of the p54TDH fusion protein.
  • Plasmid pBI-TEV 2L21-DT has been deposited in the Spanish Collection of
  • CECT Type Crops
  • Plasmid pFasBac-p54TDH has also been deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT), Burjassot, Valencia, on 07.02.08, corresponding to the access number CECT7370.
  • CECT Spanish Type Culture Collection

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Abstract

El sistema se basa en una construcción de ADN que comprende, operativamente unidas, al menos, una secuencia de ácido nucleico (A) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés, y una secuencia de ácido nucleico (B) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de tetramerización, tal como el dominio de tetramerización de la proteína p53; en donde el extremo 3 ' de dicha secuencia de ácido nucleico (A) está unido al extremo 5 'de dicha secuencia de ácido nucleico (B). El sistema permite la producción de productos de interés, por ejemplo, péptidos y proteínas recombinantes multiméricos, útiles en vacunación, terapia, diagnóstico o que seaan enzimas industriales. Como sistemas de producción se emplean plantas o larvas de insectos, transformadas con los vectores adecuados para que expresen el péptido o proteína fusionada. En plantas se ejemplifica la expresión del péptido 2L21 de Parvovirus canino y en larvas el péptido de unión a la dineína de la proteína p54 del virus de la Peste Porcina Africana, en ambos casos, fusionados respectivamente con el dominio de tetramerización de p53.

Description

SISTEMA PARA PRODUCIR PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS, MULTIMÉRICOS, Y
SUS APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se relaciona con la producción de péptidos y proteínas recombinantes multiméricos mediante el empleo de un sistema de expresión que comprende la secuencia que codifica para dicho péptido o proteína de interés y una secuencia que codifica para un dominio de tetramerización.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En las últimas décadas, se ha producido una sustitución de muchos de los productos naturales terapéuticos o preventivos que comercializan las empresas por otros de origen recombinante. Hasta el momento, la mayoría de ellos se producen en bacterias, levaduras o células de mamífero. Sin embargo, los costes de inversión y de producción, así como las dificultades de escalado industrial, han hecho que la comunidad científica haya generado alternativas a dichos sistemas de producción. Estas alternativas se basan en la utilización de plantas, animales o insectos modificados genéticamente para producir las proteínas recombinantes o bien producir estas mediante tecnologías que permiten una expresión transitoria en insectos o plantas, generalmente mediante virus manipulados.
En la actualidad las plantas transgénicas representan una alternativa a los costosos sistemas de expresión de proteínas tradicionales, puesto que son fácilmente transformables, y, además, se pueden reducir los costes de producción al cultivar grandes extensiones y cosecharlas con la infraestructura existente.
Además, las plantas transgénicas presentan otras ventajas potenciales, puesto que podrían ser administradas con fines terapéuticos o preventivos sin necesidad de purificación utilizando los órganos comestibles de ésta. De hecho, se ha demostrado la posibilidad de utilizar las plantas por vía oral, como inductores de una respuesta inmune. Por tanto, las plantas se presentan como candidatos ideales para producir nuevas vacunas: más baratas, más seguras y fácilmente administrables. Sin embargo, en la actualidad, el empleo de plantas como bio factorías presenta algunos inconvenientes. Por una parte, los bajos niveles de expresión de xenoproteínas, estando en los mejores casos en torno a 0,1-3% del total de proteína soluble, y, por otra parte, la inestabilidad en la expresión del transgén durante el desarrollo de la planta o en las sucesivas generaciones. Por tanto, para producir proteínas recombinantes de uso terapéutico, industrial o vacunas en plantas es necesario desarrollar estrategias que permitan aumentar los niveles de expresión del transgén y la acumulación de la proteína foránea en la planta. Aunque se han descrito diversas estrategias para mejorar la expresión y acumulación de proteínas foráneas en plantas, sigue existiendo la necesidad de desarrollar estrategias alternativas a las existentes actualmente con el fin de aumentar el arsenal de medios disponibles para expresar y acumular proteínas foráneas en plantas.
Se han publicado distintas estrategias para mejorar la expresión y acumulación de proteínas recombinantes en plantas, tales como utilizar distintos promotores y secuencias potenciadoras de la transcripción, utilizar distintas señales de poliadenilación, optimizar el uso de codones para plantas o dirigir las proteínas foráneas a distintos compartimentos celulares para evitar su degradación y obtener una conformación correcta (retículo endoplásmico, cloroplastos, etc.). Todas estas estrategias han dado unas mejoras discretas en el rendimiento de las plantas como bio factorías. Otras estrategias implican el uso de fusiones a proteínas de bajo índice de degradación, tales como la β-glucuronidasa (GUS) y la proteína verde fluorescente (GFP). También se han publicado buenos rendimientos en la producción de proteínas recombinantes en plantas cuando estas tienen la capacidad de adquirir estructuras complejas tales como pseudopartículas víricas (virus-like particles), por ejemplo, la proteína de la cápside del virus de Norwalk, o multimerizar como son los casos de la toxina colérica y la enterotoxina termolábil de Escherichia coli. Estos resultados, considerados en su conjunto, parecen señalar, de forma indirecta, la importancia de la estructura de la proteína foránea expresada en su estabilidad y acumulación en las células vegetales.
De igual forma, los animales transgénicos, con la exclusión del hombre, pueden utilizarse como bio factorías, utilizando para ello los vectores de transformación específicos de su género. En el estado de la técnica se ha descrito la utilización de células de insectos, preferentemente formando parte de larvas, que una vez transformadas, son capaces de producir proteínas de interés. Los sistemas de cría en masa de larvas, optimizan la producción a gran escala de dichas proteínas.
Las plantas suponen una alternativa racional por la potencial reducción de costes de producción, pero el tiempo de desarrollo de las plantas transgénicas es largo y con frecuencia los rendimientos productivos son muy bajos. Esto hace que muchas proteínas no se produzcan a los niveles mínimos que aseguren una rentabilidad del sistema. Por el contrario, pocos sistemas son tan versátiles como los basados en baculovirus (virus de insectos). Estos vectores son fáciles de manipular y producen proteínas funcionales recombinantes en cultivos de células de insecto. Sin embargo, el escalado industrial basado en sistemas fermentativos de células de insecto presenta elevados costes y dificultades técnicas que impiden con frecuencia su aplicación en la producción comercial. El simple cambio de utilizar los baculovirus recombinantes para infectar insectos, en lugar de células en cultivo, cambia radicalmente el potencial productivo y los costes de producción. Los insectos producen las proteínas recombinantes con iguales propiedades que las células en fermentación pero a costes que pueden llegar a ser 500 veces inferiores y con una inversión en equipos de hasta 40 veces menor. Cada larva produce miligramos de proteína recombinante con la posibilidad prácticamente ilimitada de escalado industrial, sencillamente aumentando la superficie de cría de larvas u optimizando el número o la eficacia del crecimiento de las mismas por unidad de superficie.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Los inventores han evaluado la importancia de la conformación y estructura de la proteína foránea en su acumulación en plantas transgénicas y en larvas de insectos, con especial énfasis en péptidos de pequeño tamaño. Para ello, han evaluado la posibilidad de aumentar los niveles de expresión de un péptido lineal vacunal aumentando la estabilidad de éste en la planta o en la larva mediante la obtención de una estructura compleja (multimérica) y se han comparado los niveles de expresión y/o acumulación del mismo péptido sin fusionar o fusionado a una proteína de alta estabilidad (GUS). De este modo, se han conseguido altos niveles de expresión de un péptido vacunal en plantas o larvas transformadas genéticamente, aumentando la estabilidad de éste en la planta mediante la obtención de una estructura compleja (multimérica). Para ello, cuando se transforman células de plantas, se ha utilizado el dominio de tetramerización de la proteína p53 fusionado al péptido 2L21 de Parvo virus canino (CPV), un péptido sintético vacunal. En el caso de transformar células de larvas, la invención utiliza el mismo dominio de tetramerización anterior de la proteína p53, pero en este caso fusionado con el péptido de unión a dineína de la proteína p54 del virus de la Peste Porcina Africana. La invención subyace pues en un único concepto inventivo como es el de procurar sistemas de producción de péptidos o proteínas recombinantes de alto rendimiento, bien sea utilizando como bio factoría una planta o un animal no humano, en concreto una larva de insecto, en el que dicho alto rendimiento lo proporciona la fusión del ADN codificante para el péptido o proteína de interés con un ADN codificante para un dominio de multimerización, en concreto con el dominio de tetramerización de un factor de transcripción, más específicamente de p53. p53 es un factor de transcripción, involucrada en diferentes funciones celulares, tales como el control del ciclo celular, la apoptosis y la diferenciación celular (SEQ ID NO:8). La proteína p53 está formada por 4 dominios funcionales, además de un dominio de transactivación y un dominio rico en prolina (residuos 1 al 43 y del 61 al 94, respectivamente) en la región N-terminal. El dominio de unión a DNA tiene localización central en la proteína (residuos 110-286). El dominio de tetramerización (DT) se encuentra en la región C-terminal de la proteína (residuos 326 al 355) (Figura
1).
La estructura del DT ha sido determinada previamente tanto por cristalografía por rayos-X como por resonancia magnética nuclear (RMN). Un monómero contiene una β-lámina (residuos del 326 al 333), unida a una α-hélice (residuos 335 al 355) por un único residuo (glicina 334). Un monómero tiene forma de V y ambos elementos en la estructura secundaria son un brazo de la V. Tres aminoácidos (Ile-332, Phe-338 y Phe-341) forman un pequeño cluster hidrofóbico en la región de unión. Estimaciones con respecto a la superficie de interacción entre monómeros y las evidencias experimentales indican que el DT es un dímero de dímeros. El dímero se forma por la interacción de dos monómeros vía la interacción de sus β-láminas para formar una lámina bicatenaria antiparalela, y, vía la asociación antiparalela de sus hélices, crear un haz de doble hélice. La formación de la β-lámina antiparalela permite la formación de ocho puentes de hidrógeno. Las β-láminas quedan fuera del tetrámero y, por tanto, no están directamente envueltas en la asociación entre los dos dímeros. La interfaz entre las hélices es predominantemente hidrofóbica y envuelve a Met-340, Leu-344, Ala-347, Leu-348 y Leu-350. Una de las realizaciones de la presente invención es el uso del dominio de tetramerización de la proteína p53 para fabricar construcciones génicas que comprendan, fusionadas al ácido nucleico que codifica y expresa dicho dominio, una secuencia de ácido nucleico que codifique y exprese al menos un producto de interés seleccionado entre un péptido o una proteína. El péptido elegido para la realización práctica de la presente invención y prueba del concepto general inventivo reivindicado, ejemplificado en células de plantas es el epítopo 2L21 de CPV, que está formado por dos sub lugares antigénicos distantes de la región amino terminal de la proteína VP2 de la cápside del CPV y que había sido publicado anteriormente como el primer péptido sintético vacunal (López de Turiso, J.A., Cortés, E., Martínez, C, Ruiz de Ybánez, R., Simarro, L, Vela, C, Casal, I. (1992) J. Virol. 66:2748-2753). El conocimiento de la estructura tridimensional y los enlaces implicados en la formación del tetrámero permite, a priori, diseñar una estrategia de fusión que no afecte a la conformación del tetrámero. Por tanto, el péptido 2L21 fue fusionado en la región N-terminal del dominio de tetramerización donde se esperaba que no impidiera la formación del tetrámero. A su vez, el mismo péptido fue expresado en plantas sin fusionar utilizando el mismo plásmido y bajo el control del mismo promotor. Además, el péptido 2L21 había sido expresado con éxito anteriormente en el laboratorio de los inventores fusionado a GUS (Gil F., Brun A., Wigdorovitz A., Martínez-Torrecuadra J.L., Cátala R., Casal L, Salinas J., Borca M.V. and Escribano J. M.. FEBS Letters 488:13-17, 2001), una proteína muy estable, de bajo índice de degradación y perfectamente adaptada a la expresión en plantas, lo que proporcionaba un buen patrón de referencia para comparar estas estrategias.
La invención se ilustra mediante el desarrollo de un sistema de alta producción del péptido 2L21 fusionado al DT de la p53 (2L21-DT) en plantas transgénicas de A. thaliana, basado en la capacidad de multimerización de la proteína de fusión respecto al mismo péptido sin fusionar o fusionado a GUS. Se comprobó que los monómeros 2L21- DT expresados en plantas transgénicas de A. thaliana se ensamblan formando dímeros y tetrámeros. Se obtuvo con esta estrategia un alto porcentaje de líneas de plantas transgénicas con altos niveles de expresión del péptido recombinante. Los niveles de expresión obtenidos con la construcción 2L21-DT fueron superiores incluso a los obtenidos en plantas transgénicas transformadas con la construcción 2L21-GUS. El péptido recombinante (2L21-DT) mantuvo las características antigénicas e inmunogénicas del péptido 2L21, induciendo altos títulos de anticuerpos específicos en grupos de animales inmunizados tanto por vía oral como intraperitoneal y siendo ésta muy superior a la inducida por la proteína de fusión 2L21-GUS. Estos resultados parecen sugerir que los tetrámeros formados podrían ofrecer no sólo una gran estabilidad, sino además ventajas desde el punto de vista inmunogénico. No se obtuvieron plantas transgénicas que expresaran el péptido sin fusionar, lo que demuestra que la estabilidad del mismo es dependiente de la proteína a la que se fusiona, la cual confiere una mayor o menor resistencia a la degradación por proteasas celulares.
La proteína elegida para la realización práctica de la presente invención y prueba del concepto general inventivo reivindicado, ejemplificado en larvas de insectos es la proteína p54 del virus de la Peste porcina africana, un virus de enorme importancia ganadera, frente al cual no existe una vacuna eficaz hasta el presente. La proteína p54 del virus de la Peste porcina africana es clave en la entrada del virus en la célula e induce anticuerpos capaces de neutralizar la infección en aquellos animales que sobreviven a la infección. Estudios de interacción del virus de la Peste porcina africana con la célula infectada han permitido caracterizar que el transporte del virus en las primeras fases de la infección, desde la superficie de la célula hasta el núcleo, se lleva a cabo a través de la unión de la proteína p54 con la cadena ligera de la dineína. El dominio de la proteína p54 que media esta unión con la dineína se ha caracterizado. Cuando dicho dominio sintético (péptido p54DUD) se ha utilizado para bloquear la infección se ha podido comprobar que compite con el virus bloqueando la infección productiva. Una alternativa al uso de péptidos sintéticos de elevado coste es su síntesis mediante DNA recombinante. Dado el tamaño del péptido es imposible su síntesis estable como recombinante, razón por la que se ha utilizado el dominio de tetramerización derivado de la p53. Además, es concebible que la inmunización de animales con este dominio tetramerizado diera como consecuencia la inducción de anticuerpos capaces de unirse al virus y bloquear la unión de este a la dineína y por tanto neutralizar la infección, constituyendo una eficaz vacuna.
La invención se ilustra mediante el desarrollo de un sistema de alta producción de la proteína p54 fusionada al DT de la p53 (p54-TDH) en células y larvas de insectos, en concreto de Trichoplusia ni , basado en la capacidad de multimerización de la proteína de fusión respecto a la misma sin fusionar.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es una representación esquemática de la estructura en dominios de la proteína p53 y del dominio de tetramerización de dicha proteína p53, incluyéndose un detalle de la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio de tetramerización (DT) de la proteína p53 así como la estructura del tetrámero una vez conformado (Science, vol. 67, 10 de marzo, 1995). La Figura 2 muestra esquemáticamente la obtención del plásmido binario pBI-
TEV 2L21-DT.
La Figura 3 muestra la estructura de la región de expresión del plásmido binario pBI-TEV 2L21-DT y la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión 2L21-DT, el promotor CaMV35S (35 S prom), que dirige la expresión de la secuencia correspondiente al antígeno 2L21 fusionada al dominio de tetramerización de la proteína p53 y la secuencia de poliadenilación (Nos-ter); LB y RB, delimitan el T-DNA que se integrará en el genoma nuclear de las plantas. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión 2L21-DT incluye la secuencia del péptido 2L21, el dominio de tetramerización de la proteína p53 y 4 aminoácidos separadores (GSPG). Se incluye, además, la estructura esperada del monómero 2L21-DT y el tetrámero predecible.
La Figura 4 muestra el resultado de un análisis por Western blot de la expresión de la proteína de fusión 2L21-DT en plantas transgénicas de Arabidposis thaliana. La Figura 4A muestra el resultado de un análisis por Western blot sobre gel de tricina desnaturalizante cargado con 40 μg de proteína total por pocilio; se observa una banda inmunorreactiva cercana a los 8 kDa. La Figura 4B muestra el resultado de un análisis por Western blot sobre un gel en condiciones nativas cargadas con 40 μg de proteína soluble total extraída con un tampón sin agentes reductores ni desnaturalizantes; se observan dos bandas inmunorreactivas una por encima de 16 kDa (dímeros) y una banda mayoritaria de 32 kDa (tetrámero). Se incluyen, además, la estructura del monómero 2L21-DT y de los dímeros y tetrámeros predecibles.
La Figura 5 ilustra el análisis transcripcional de algunas líneas que expresan diversas cantidades del antígeno de fusión 2L21-DT. Se muestran los resultados de un análisis por Northern blot de la transcripción del gen de fusión 2L21-DT en plantas transgénicas de Arabidopsis, sobre 5 μg de ARN total e hibridados utilizando como sonda la secuencia de ADN completa de la fusión 2L21-DT (200 pb) marcada con 32P.
La Figura 6 recoge el título de anticuerpos en suero en los distintos grupos de ratones inmunizados. La Figura 6A es un diagrama de barras que recoge los títulos de anticuerpos anti-2L21 alcanzados en los diferentes grupos de animales inmunizados por vía intraperitoneal (DTl, DT2, DT3, DT4, GUSl, GUS2, DT Pool IP, GUS Pool IP) [cada DT es un grupo de ratones, al igual que cada GUS; Pool IP significa "mancomunado inoculdo intraperitonal"]. La Figura 6B es un diagrama de barras que muestra la media del título desarrollado por los diferentes grupos de animales alimentados con hojas de plantas que expresaban cada una de las fusiones del péptido.
La Figura 7 ilustra la posibilidad de obtener vacunas multivalentes que contienen 2 péptidos o proteínas vacunales según la presente invención y muestra esquemáticamente la formación de tetrámeros conteniendo 2 proteínas o péptidos vacunales a partir de una única construcción que incluye el dominio de tetramerización de la proteína p53 y 2 genes foráneos.
La Figura 8 muestra la secuencia del péptido de fusión generado. El dominio de unión a la dineína de la proteína p54 (p54DUD) se fusionó al dominio de tatramerización de la p53 (p53TD) y a una secuencia codificante para 8 Histidinas (His), la secuencia se flanqueo con las dianas de restricción BamHI y HindIII para facilitar su clonaje en el plásmido pFastBacl.
Figura 9: a) La expresión de la proteína -,n células Sf21 y en larvas se analizó mediante Western-blot con un anticuerpo anti-Histidinas. Se detectó una banda del tamaño esperado, así como otras que correspondían a las formas multiméricas; b) La formación de tetrámeros se confirmó mediante Western blot, con el mismo anticuerpo, sobre un gel de acrilamida en condiciones nativas. Figura 10: Se purificó el péptido de fusión mediante columnas de afinidad y se analizó la fracción 2 mediante tinción coomassie (1) y western-blot (2) con un anticuerpo anti-Histidinas.
Figura 11: La inmunogenicidad del péptido de fusión, producido en larvas y purificado mediante columna de afinidad se analizó mediante Elisa. Los valores de D. O. a 405 nm, obtenidos a una dilución de los suero de 1/100, muestran la presencia de anticuerpos específicos frente a la proteína.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la invención se relaciona con una construcción de ADN, en adelante construcción de ADN de la invención, que comprende, operativamente unidas, al menos: a) una secuencia de ácido nucleico (A) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés; y b) una secuencia de ácido nucleico (B) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de tetramerización; en donde el extremo 3 ' de dicha secuencia de ácido nucleico (A) está unido al extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (B). La secuencia de ácido nucleico (A) contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés. El producto de interés puede ser prácticamente cualquier péptido o proteína, independientemente de su origen (eucarótico, procariótico, viral, etc.), susceptible de ser expresado de forma recombinante. En una realización particular, dicho producto de interés es un péptido o una proteína útiles en vacunación, terapia o diagnóstico, por ejemplo, el péptido 2L21 del CPV, la proteína VP60 de RHDV, péptidos antibióticos, etc., mientras que en otra realización particular, dicho producto de interés es un péptido o proteína con aplicación en cualquier tipo de industria, por ejemplo, enzimas industriales, tales como celulasas, glucanasas, proteasas, etc. La secuencia de ácido nucleico (B) contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de tetramerización. Un dominio de tetramerización es una secuencia peptídica que promueve la dimerización y/o tetramerización en las proteínas que lo contienen. Prácticamente cualquier dominio de tetramerización puede ser utilizado en la construcción de ADN de la invención. En una realización particular, dicho dominio de tetramerización comprende o está constituido por el dominio de tetramerización (DT) de la proteína p53, el cual se encuentra en la región C-terminal de la proteína p53 (residuos 326-355) (Chéne P., (2001), The role of tetramerization in p53 fúnction. Oncogene 20:2611-2617).
En una realización particular, la construcción de ADN de la invención comprende una única secuencia de ácido nucleico (A) y una única secuencia de ácido nucleico (B). Este tipo de construcción de ADN puede dar lugar a homotetrámeros del producto de interés (en forma de proteína de fusión en donde el péptido o proteína de interés está fusionado al DT).
En otra realización particular, la construcción de ADN de la invención comprende, además de dichas secuencias de ácido nucleico (A) y (B), una secuencia de ácido nucleico (A') que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés, en donde el extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (A') está unido al extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (B). Los productos de interés codificados por las secuencias de nucleótidos contenidas en las secuencias de ácido nucleico (A) y (A') pueden ser iguales o diferentes. Cuando son iguales, se obtienen homotetrámeros del producto de interés formados por 4 monómeros iguales conteniendo cada uno de ellos 2 restos del mismo producto de interés (en forma de proteínas de fusión en donde los productos de interés están fusionados a ambos extremos del DT). Sin embargo, cuando son distintos, se obtienen tetrámeros de los productos de interés formados por 4 monómeros iguales conteniendo cada uno de ellos 2 productos de interés diferentes (en forma de proteínas de fusión en donde cada uno de los productos de interés está fusionado a un extremo del DT).
En general, la secuencia de ácido nucleico (B) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para el dominio de tetramerización no se fusiona directamente a la secuencia de ácido nucleico (A) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para el producto o productos de interés sino que es ventajoso introducir un péptido espaciador (flexible) entre el extremo de la secuencia de ácido nucleico (A) y el comienzo de la secuencia de ácido nucleico (B). Por tanto, si se desea, la construcción de ADN de la invención también puede contener, además, una secuencia de ácido nucleico (C) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido espaciador (Cl) situada entre dichas secuencias de ácido nucleico (A) y (B), en donde el extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (C) está unido al extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (A) y el extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (C) está unido al extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (B). Ventajosamente, dicho péptido espaciador (Cl) es un péptido con flexibilidad estructural. Prácticamente, cualquier péptido con flexibilidad estructural puede ser utilizado. A modo ilustrativo, dicho péptido flexible puede contener repeticiones de restos de aminoácidos, en particular de restos de GIy y Ser o cualquier otra repetición de restos de aminoácidos adecuada. En una realización particular, dicho péptido espaciador flexible comprende la secuencia Gly-Ser- Pro-Gly (GSPG) o la secuencia (Gly-Ser)4.
Cuando la construcción de ADN de la invención contiene dicha secuencia de ácido nucleico (A'), además de dichas secuencias de ácido nucleico (A) y (B), dicha construcción de ADN puede contener, además, si se desea, una secuencia de ácido nucleico (C) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido espaciador (C2) situada entre dichas secuencias de ácido nucleico (A') y (B), en donde el extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (C) está unido al extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (B) y el extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (C) está unido al extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (A'). Al igual que (Cl), el péptido espaciador (C2) puede ser prácticamente, cualquier péptido con flexibilidad estructural, por ejemplo, un péptido espaciador flexible que comprende la secuencia GSPG o (Gly-Ser)4. La secuencia de ácido nucleico (C) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido espaciador (C2) puede ser igual o diferente a la que codifica para dicho péptido espaciador (Cl) contenida en dicha secuencia de ácido nucleico (C), con lo que dichos péptidos espaciadores (Cl) y (C2) pueden ser iguales o diferentes.
Con el fin de facilitar el aislamiento y purificación del péptido o proteína de fusión obtenida mediante la presente invención, la construcción de ADN de la invención puede contener, si se desea, una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificación del péptido o proteína de fusión. Por tanto, en una realización particular, la construcción de ADN de la invención incluye, si se desea, una secuencia de ácido nucleico (D) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificación. Dicha secuencia de ácido nucleico (D) puede estar situada en cualquier posición que no altere la funcionalidad del dominio de tetramerización ni del producto o productos de interés. A modo ilustrativo, dicha secuencia de ácido nucleico (D) puede estar situada entre dichas secuencias de ácido nucleico (A) y (B), en donde el extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (D) está unido al extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (A) y el extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (D) está unido al extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (B), o bien dicha secuencia de ácido nucleico (D) está situada aguas arriba del extremo 5 ' de dicha secuencia de ácido nucleico (A), o bien dicha secuencia de ácido nucleico (D) está situada aguas abajo del extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (B).
Prácticamente cualquier péptido o secuencia peptídica que permita el aislamiento o purificación del péptido o proteína de fusión puede ser utilizada, por ejemplo, secuencias de polihistidina, secuencias peptídicas susceptibles de ser reconocidas por anticuerpos monoclonales que pueden servir para purificar la proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad, tales como péptidos etiqueta, etc.
Si se desea, la construcción de ADN de la invención puede contener, además, una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos con el fin de liberar el producto de interés una vez aislada la proteína de fusión. En este caso, la construcción de ADN de la invención puede incluir, además, una secuencia de ácido nucleico (E) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos (El) susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos, en donde dicha secuencia de ácido nucleico (E) se encuentra a continuación del extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (A). Prácticamente cualquier secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos puede ser utilizada, por ejemplo, sitios de reconocimiento de proteasas (enteroquinasa, Arg-C endoproteasa, GIu-C endoproteasa, Lys-C endoproteasa, Factor de coagulación Xa, etc.) o sitios susceptibles de ser específicamente escindidos por reactivos químicos (bromuro de cianógeno, etc.). Cuando la construcción de ADN de la invención contiene dicha secuencia de ácido nucleico (A'), además de dichas secuencias de ácido nucleico (A) y (B), dicha construcción de ADN puede contener, además, si se desea, una secuencia de ácido nucleico (E') que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos (E2) susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos, en donde dicha secuencia de ácido nucleico (E') se encuentra a continuación del extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (A'). Al igual que (El), (E2) puede ser prácticamente cualquier secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos. La secuencia de ácido nucleico (E') que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos (E2) susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos puede ser igual o diferente a dicha secuencia de aminoácidos (El) susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos codificada por dicha secuencia de ácido nucleico (E), por lo que dichas secuencias (El) y (E2) pueden ser iguales o diferentes.
La construcción de ADN de la invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica [Sambrook et al, "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 VoI 1-3]. Dicha construcción de ADN de la invención puede incorporar, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica para el producto o productos de interés, constituyendo de este modo un cassette de expresión. Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "operativamente unida" significa que el producto o productos de interés es (son) expresado(s) en el marco de lectura correcto bajo el control de las secuencias de control o reguladoras de expresión.
Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un cassette de expresión que comprende la construcción de ADN de la invención operativamente unida a una secuencia de control de expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica para el producto de interés. Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción del producto de interés, e incluyen secuencias promotoras, secuencias codificantes para reguladores transcripcionales, secuencias de unión a ribosomas (RBS) y/o secuencias terminadoras de transcripción. En una realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en células y organismos procariotas, mientras que en otra realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en células y organismos eucariotas. Ventajosamente, dicho cassette de expresión comprende, además, un marcador o gen que codifica para un motivo o para un fenotipo que permita la selección de la célula hospedadora transformada con dicho cassette de expresión. Ejemplos ilustrativos de dichos marcadores que podrían estar presentes en el cassette de expresión de la invención incluyen genes de resistencia a antibióticos, genes de resistencia a compuestos tóxicos, y en general todos aquellos que permitan seleccionar a las plantas transformadas genéticamente.
La construcción de ADN de la invención, o el cassette de expresión proporcionado por esta invención, pueden ser insertados en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, tal como un vector de expresión, que comprende dicha construcción de ADN o dicho cassette de expresión. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al, 1989, citado supra]. En una realización particular, dicho vector recombinante es un vector viral, preferentemente, vectores virales capaces, respectivamente, de infectar plantas, algas o células animales , preferentemente células de insectos o de larvas de los mismos.
Dicho vector viral puede ser utilizado para infectar células susceptibles de ser infectadas por dicho virus. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula infectada con dicho vector viral. En una realización particular, dicha célula infectada es una célula vegetal o una célula de insecto, infectada con un vector viral apropiado, siendo dicha célula vegetal o de insecto infectada capaz de expresar el producto de interés. Células vegetales infectadas con vectores virales recombinantes pueden obtenerse tras infección de una planta o de un protoplasto con dicho vector viral recombinante. Una aplicación interesante de los vectores virales infectivos de plantas es la expresión en plantas de proteínas o epítopos de patógenos animales con el fin de producir vacunas comestibles frente a dichos patógenos. Esta estrategia puede aplicarse a células de insectos infectadas con vectores virales recombinantes que pueden obtenerse tras la infección de una larva de un insecto con dicho vector viral recombinante.
Los vectores recombinantes proporcionados por esta invención pueden ser utilizados para transformar células eucariotas o procariotas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula transformada que comprende dicho vector recombinante, o dicha construcción de ADN proporcionada por esta invención, o bien dicho cassette de expresión proporcionado por la invención. Células transformadas pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al, 1989, citado supra]. En una realización particular, células eucariotas o procariotas se co-infectan con dos o más vectores recombinantes proporcionados por esta invención. Dichos vectores recombinantes pueden contener secuencias codificantes de los mismos productos de interés cuya expresión da lugar a homotetrámeros en las células co-transformadas con dichos vectores. Alternativamente, dichos vectores recombinantes pueden contener secuencias codificantes de distintos productos de interés cuya expresión da lugar a tetrámeros de 2 péptidos o proteínas diferentes en las células co-transformadas con dichos vectores, lo cual puede ser interesante, por ejemplo, en desarrollos de inmunizaciones múltiples. Por tanto, en una realización particular, uno de dichos vectores (vector I) contiene una construcción de ADN de la invención que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para uno o más productos de interés mientras que otro de los vectores (vector II) contiene una construcción de ADN de la invención que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para uno o más productos de interés diferente(s) al producto o productos de interés codificado(s) por la secuencia de nucleótidos contenida en la construcción de ADN presente en el vector I. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula transformada que comprende, al menos, una construcción de ADN de la invención, o un vector recombinante proporcionado por esta invención o un cassette de expresión proporcionado por esta invención. En una realización particular, dicha célula transformada comprende dos o más construcciones de ADN de la invención, o vectores recombinantes o casetes, iguales o diferentes, preferentemente diferentes, proporcionados por esta invención. Células transformadas pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra].
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula transgénica que comprende, insertada en su genoma, al menos, una construcción de ADN de la invención, o un cassette de expresión proporcionado por esta invención. En una realización particular, dicha célula transgénica procede de una célula vegetal y comprende, insertada en su genoma o en el genoma de un cloroplasto, al menos una construcción de ADN de la invención o un cassette de expresión proporcionado por la invención. A partir de dichas células vegetales transgénicas o bien a partir de material vegetal transgénico, pueden obtenerse plantas transgénicas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una planta transgénica que comprende, al menos, una célula vegetal transgénica proporcionada por esta invención. Una aplicación interesante de las plantas transgénicas es la expresión en plantas de proteínas o epítopos de patógenos animales con el fin de producir vacunas comestibles frente a dichos patógenos. Ventajosamente, dichas plantas expresarán diferentes productos de interés, por ejemplo, diferentes proteínas o epítopos de patógenos animales, con el fin de inmunizar simultáneamente a los animales frente a diferentes patógenos.
En otra realización particular de la invención dicha célula transgénica es una célula animal perteneciente a un animal no humano, preferentemente a un insecto y más preferentemente a una larva de insecto. Por lo tanto, la invención también se relaciona con un animal no humano transgénico, particularmente un insecto o una larva de insecto transgénica que exprese el péptido o proteína de interés, con alto rendimiento, atribuible a su fusión con un dominio de multimerización de otro péptido o proteína, preferentemente de un factor de transcripción y más preferentemente de p53. La construcción de ADN de la invención puede ser utilizada para producir productos de interés. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir un producto de interés que comprende crecer una célula u organismo proporcionado por esta invención bajo condiciones que permiten la producción de dicho producto de interés. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula u organismo dependerán de la célula u organismo utilizado. Si se desea, el método para producir un producto de interés proporcionado por esta invención incluye, además, el aislamiento y purificación de dicho producto de interés. En este caso, la construcción de ADN de la invención debería incluir, ventajosamente, dicha secuencia de ácido nucleico (E) [y (E') en su caso] previamente definida que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos (El) [y (E2) en su caso] susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos con el fin de liberar el producto de interés una vez aislada la proteína de fusión.
En general, el producto de interés obtenido mediante el método de la presente invención se encuentra en forma de una proteína de fusión multimérica, en concreto, dimérica o, mayoritariamente, tetramérica. En una realización particular, dicho producto de interés se encuentra en forma de un homotetrámero conteniendo, por ejemplo, 4 restos del mismo péptido o proteína de interés (cuando se utiliza una construcción de ADN de la invención que contiene únicamente una secuencia de ácido nucleico (A) que codifica para un producto de interés) o bien 8 restos del mismo péptido o proteína de interés (cuando se utilizan dos construcciones de ADN de la invención conteniendo cada una de ellas dos secuencias de ácidos nucleico (A) y (A') que codifican para el mismo producto de interés) o bien en forma de un tetrámero conteniendo, por ejemplo, 2 restos de un primer producto de interés y otros 2 restos de un segundo producto de interés, en donde dicho primer y segundo productos de interés son productos de interés diferentes entre sí (cuando se utilizan dos construcciones de ADN de la invención diferentes conteniendo cada una de ellas una secuencia de ácido nucleico (A) que codifica para un producto de interés diferente) o bien 4 restos de un primer producto de interés y otros 4 restos de un segundo producto de interés diferente, en donde dicho primer y segundo productos de interés son productos de interés diferentes entre sí (cuando se utilizan dos construcciones de ADN de la invención diferentes conteniendo cada una de ellas una secuencia de ácido nucleico (A) que codifica para un producto de interés diferente) o bien 4 productos de interés diferentes (cuando se utilizan dos construcciones de ADN de la invención diferentes conteniendo cada una de ellas dos secuencias de ácidos nucleico (A) y (A') que codifican para distintos productos de interés), etc., lo que puede permitir desarrollar, por ejemplo, vacunas multivalentes. Por tanto, una característica del sistema de expresión de productos de interés proporcionado por esta invención es su versatilidad, que permite expresar simultáneamente diferentes productos de interés. La invención también proporciona, en otro aspecto, un método para expresar un gen que codifica para un producto de interés en una planta, que comprende transformar dicha planta con, al menos, una construcción de ADN proporcionada por esta invención, o un cassette de expresión o un vector proporcionados por esta invención. La transformación de células de tejidos vegetales puede realizarse por métodos convencionales. Para una revisión de la transferencia génica a plantas, incluyendo vectores, métodos de transferencia de ADN, etc., véase, por ejemplo, el libro titulado "Ingeniería genética y transferencia génica", de Marta Izquierdo, Ed. Pirámide (1999), en particular, el capítulo 9, titulado "Transferencia génica a plantas", páginas 283-316.
La invención también proporciona, en otro aspecto, un método para expresar un gen que codifica para un producto de interés en un animal no humano, preferentemente en un insecto y más preferentemente en una larva de insecto, que comprende transformar dicho insecto o larva con, al menos, una construcción de ADN proporcionada por esta invención, o un cassette de expresión o un vector proporcionados por esta invención. La transformación de células de tejidos animales, más preferentemente de insectos, puede realizarse por métodos convencionales. Para una revisión de la transferencia génica a insectos, incluyendo vectores, métodos de transferencia de ADN, etc., véase, por ejemplo, TRANSGENIC SILKWORMS PRODUCE RECOMBINANT HUMAN TYPE III PROCOLLAGEN IN COCOONS. M. Tomita Et Al. Nature Biotechnology 21. 53-56. 2003; DEVELOPMENT OF A LOW-COST, INSECT-DERIVED RECOMBINANT SUBUNIT VACCINE AGAINST RHDV. M. Perez-Filgueira Et Al. Virology 364. 422-443. 2007
Cuando en la presente memoria se menciona un animal no humano, se está haciendo referencia a seres humanos transgénicos como tales. No estarían excluidos pues del a'mbito de la presente invención células humanas transgénicas derivadas de líneas celulares humanas, en las que se haya incluido el dominio de tetramerización de p53 fusionado a una secuencia de ácido nucleico codificante para una proteína o producto de interés. En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión obtenible por expresión de la secuencia de ácido nucleico contenida en la construcción de ADN proporcionada por esta invención. De modo más concreto, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende:
(i) la secuencia de aminoácidos correspondiente a un dominio de tetramerización; y (ii) la secuencia de aminoácidos de, al menos, un producto de interés.
En una realización particular, dicho dominio de tetramerización comprende (o está constituido por) el dominio de tetramerización de la proteína p53. La proteína de fusión puede tener la secuencia de aminoácidos de un único producto de interés o bien la secuencia de aminoácidos de dos productos de interés. Dicha proteína de fusión es una proteína de fusión multimérica, en concreto, dimérica o, mayoritariamente, tetramérica. Por tanto, en una realización particular, dicha proteína de fusión comprende 4 restos de un mismo producto de interés, o bien 8 restos de un mismo producto de interés. En otra realización particular, dicha proteína de fusión comprende 2 restos de un primer producto de interés y otros 2 restos de un segundo producto de interés distinto a dicho primer producto de interés, por ejemplo, 4 restos de un primer producto de interés y otros 4 restos de un segundo producto de interés distinto a dicho primer producto de interés. En otra realización particular, dicha proteína de fusión comprende 4 productos de interés diferentes, o bien 8 productos de interés diferentes. Preferentemente, la proteína de fusión proporcionada por esta invención comprende 4 restos de un mismo producto de interés, o bien 8 restos de un mismo producto de interés, o bien 4 restos de un primer producto de interés y otros 4 restos de un segundo producto de interés distinto a dicho primer producto de interés.
Por tanto, a modo ilustrativo, en una realización particular, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende: (i) la secuencia de aminoácidos correspondiente a un dominio de tetramerización; (ii) una secuencia de aminoácidos correspondiente a un producto de interés
(Al); y
(iii) una secuencia de aminoácidos correspondiente a un producto de interés (A2).
Dichos productos de interés (Al) y (A2) pueden ser iguales o diferentes. En una realización particular, dichos productos de interés (Al) y (A2) son distintos entre sí. En una realización concreta, el dominio de tetramerización comprende (o está constituido por) el dominio de tetramerización de la proteína p53.
La proteína de fusión proporcionada por esta invención puede contener, además, si se desea, (a) un péptido espaciador entre el producto de interés y el dominio de tetramerización; y/o (b) un péptido para facilitar el aislamiento o purificación del péptido o proteína de fusión; y/o (c) una secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una vacuna recombinante que comprende una proteína de fusión proporcionada por esta invención, en la que dicho producto de interés comprende un péptido o proteína inmunogénico, y, opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable. La vacuna recombinante proporcionada por esta invención puede ser univalente o multivalente, es decir, puede inmunizar frente a uno o más patógenos simultáneamente. A modo ilustrativo, la proteína de fusión multimérica presente en la vacuna recombinante proporcionada por esta invención puede contener 4 restos de un mismo péptido o proteína inmunogénico, o bien 8 restos de un mismo péptido o proteína inmunogénico. En otra realización particular, dicha proteína de fusión comprende 2 restos de un primer péptido o proteína inmunogénico y otros 2 restos de un segundo péptido o proteína inmunogénico diferente, o bien 4 restos de un primer péptido o proteína inmunogénico y otros 4 restos de un segundo péptido o proteína inmunogénico diferente.
Por tanto, en una realización particular, la invención proporciona una vacuna que comprende:
(i) la secuencia de aminoácidos correspondiente a un dominio de tetramerización; y (ii) la secuencia de aminoácidos de, al menos, un péptido o proteína inmunogénico.
En una realización particular, dicho dominio de tetramerización comprende (o está constituido por) el dominio de tetramerización de la proteína p53. Prácticamente cualquier péptido o proteína inmunogénico (vacunal) puede ser utilizado en la elaboración de la vacuna recombinante proporcionada por esta invención; no obstante, en una realización particular, incluyen, dicho péptido o proteína inmunogénico se selecciona entre el péptido 2L21 de CPV o la VP60 de RHDV. En otra realización particular, la vacuna proporcionada por esta invención comprende:
(i) la secuencia de aminoácidos correspondiente a un dominio de tetramerización; (ii) la secuencia de aminoácidos de un primer péptido o proteína inmunogénico; y (iii) la secuencia de aminoácidos de un segundo péptido o proteína inmunogénico.
En una realización concreta, el dominio de tetramerización comprende (o está constituido por) el dominio de tetramerización de la proteína p53. Dicho primer péptido o proteína inmunogénico puede ser igual o diferente a dicho segundo péptido o proteína inmunogénico, con el fin de obtener vacunas univalentes o multivalentes. En una realización particular, dicho primer péptido o proteína inmunogénico es diferente a dicho segundo péptido o proteína inmunogénico. Como es conocido, es frecuente la necesidad de formular más de una vacuna en un mismo preparado vacunal, tanto en sanidad humana como animal. El empleo de un dominio de tetramerización, tal como el dominio de tetramerización de la proteína p53, ofrece posibilidades muy interesantes en este sentido ya que se puede postular la inclusión de más de un antígeno vacunal en la construcción sin que ello interfiera a priori en la formación de estructuras estables. La Figura 7 ilustra la posibilidad de obtener vacunas multivalentes según la presente invención. En dicha figura se muestra esquemáticamente la formación de tetrámeros que contienen 2 proteínas o péptidos vacunales a partir de una única construcción proporcionada por esta invención que comprende el dominio de tetramerización de la proteína p53. Se incluye la estructura predicha que se formaría a partir de un único cassette de expresión formado por dos genes fusionados en los extremos del dominio de tetramerización.
Otra realización preferida de la presente invención es el uso del dominio de tetramerización de p53 para mejorar la expresión de proteínas cuya expresión presenta alguna dificultad añadida, tal como, por ejemplo, enzimas industriales, que deben ser expresadas y aisladas con la menor pérdida de actividad posible. En esta realización preferida, preferentemente el dominio de tetramerización de p53 se fusiona con ácidos nucleicos codificantes para enzimas implicadas en la degradación o hidr'lisis de la celulosa.
El siguiente Ejemplo sirve para ilustrar la invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma.
EJEMPLO 1 Multimerización del antígeno 2L21 y su empleo en la inmunización de animales
1.1. CRECIMIENTO DE Arabidopsis thaliana
La planta modelo utilizada ha sido Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia. El género Arabidopsis pertenece a la familia de las Cruciferas (Brassicaceae o Cruciferae).
1.1.1 En tierra Para el crecimiento de plantas de Arabidopsis en tierra, las semillas se sembraron en superficie, en macetas o alvéolos de plástico, que contenían una mezcla de sustrato universal y vermiculita (3:1). La mezcla fue previamente empapada en agua destilada y esterilizada en autoclave a 101 kPa (1 atm) de presión durante 20 minutos a 12O0C. Las macetas o alvéolos se colocaron en bandejas que, a continuación, se cubrieron con plástico para mantener una humedad adecuada y evitar contaminaciones durante la germinación. Las bandejas se mantuvieron durante 48 horas a 40C y en oscuridad, para favorecer una germinación homogénea de las semillas. Tras esto, las bandejas se llevaron a cámaras de cultivo a 220C con un fotoperíodo de 16 horas de luz fluorescente y 8 horas en oscuridad. Transcurrida una semana desde la siembra, se retira el plástico, manteniéndose siempre la bandeja con agua. Las plantas se regaron una vez por semana con medio universal mínimo (Haughn y Somerville, (1986), Sulfonylurea resistant mutants of Arabidopsis thaliana. Molec. General Genetics 204:430-434). Se mantuvieron las plantas en estas condiciones hasta que se inicia la floración (6-7 semanas), momento idóneo para la infiltración. En ocasiones, para intentar mejorar los rendimientos de las infiltraciones, se cortan algunas flores y se espera a que se desarrollen las inflorescencias secundarias, más numerosas. 1.1.2 En placas petri
Para la germinación de las semillas en placa, se utilizó medio MS (Murashige T. and F. Skoog. A revised médium for rapid growth and bioassays with tobáceo tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-497, 1962), suplementado con sacarosa al 1% y solidificado con agar al 0,8%, y el antibiótico correspondiente. Las semillas fueron esterilizadas durante 10 minutos en una solución de hipoclorito sódico al 30% y Tritón X-100 al 0,01%, y lavadas posteriormente 5 veces en agua estéril. Las semillas se sembraron sobre las placas petri, que fueron llevadas a 40C y oscuridad durante 48 horas. Posteriormente se llevaron a cámaras de cultivo en condiciones de 220C y 16 horas de luz seguidas de 8 horas de oscuridad. Tras dos semanas, las plántulas fueron transplantadas a tierra y crecidas en las condiciones anteriormente comentadas.
1.2. CEPAS BACTERIANAS UTILIZADAS, CULTIVO Y OBTENCIÓN DE COMPETENTES
Para la transformación y crecimiento de los plásmidos se usaron las cepas de Escherichia coli, DH5-α y TOP-10 (Clontech). Las cepas de Agrobacterium tumefaciens C58C1 y AGLO 5-α (Hellens R. and Mullineaux P. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science 5:446-451, 2000), fueron utilizadas para la infiltración de las flores de A. thaliana.
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Los cultivos de E. coli se realizaron en medio LB (Sigma) en presencia del correspondiente agente selectivo (Sambrook y col. 1989) durante 14-16 horas a 370C. La preparación de células competentes se realizó por el método del cloruro de rubidio, descrito por Hanahan (Studies on transformation of E. coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166:557-580. 1983).
Los cultivos de las distintas cepas de Agrobacterium se realizaron en LB líquido o en placa, suplementado con 50 μg/ml de kanamicina y 50 μg/ml rifampicina (Sambrook y col. 1989), y fueron mantenidos 36-48 horas a 280C.
Los cultivos bacterianos se conservaron a largo plazo en dimetilsufóxido (DMSO) a una concentración final del 6% a -8O0C (Sambrook y col, 1989).
1.3. MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN BACTERIANA 1.3.1 Transformación de E. coli
Las cepas DH5-α y TOP-IO, fueron utilizadas para el mantenimiento de plásmidos y generación de nuevos. Ambas cepas competentes fueron transformadas siguiendo el protocolo de Birnboim y Dolly (Birnboin H.C. and Dolly J. A rapid alcaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucí. Acid Res. 7:1513-1516. 1979). Brevemente, el ADN plasmídico o producto de ligación se añadió a una alícuota de 100 μl de células competentes descongeladas y se mantuvo a 40C durante 30 minutos. A continuación, se provocó un choque térmico a 420C, lo que aumenta la permeabilidad de los poros, se añadieron 600 μl de LB y se incubaron en agitación a 370C durante 1-1,5 horas. Las células bacterianas sedimentaron por centrifugación durante 3 minutos a 3.500 r.p.m. y se plaquearon en medio sólido al que previamente se la habían añadido los antibióticos de selección necesarios. Las placas se incubaron en estufa a 370C durante toda la noche.
1.3.2 Transformación de A. tumefaciens Las cepas C58C1 y AGLO, fueron transformadas con los plásmidos binarios.
Brevemente, se añadió 1 μg de ADN (plásmidos binarios) a una alícuota de 200 μl de dichas células competentes, sin descongelar y se incubaron durante 5 minutos a 370C, e inmediatamente después se incubaron a 40C durante 30 minutos. A continuación, se añadió 1 mi de LB y se cultivó a 280C durante 3-4 horas. Tras centrifugar, se plaquearon en medio LB con kanamicina-rifampicina. Las placas se incubaron a 280C y las colonias tardaron aproximadamente 48 horas en aparecer. Posteriormente fueron cultivadas y usadas para la infiltración de plantas de A. thaliana. 1.4. PLÁSMIDOS UTILIZADOS 1.4.1 Plásmidos comerciales
Para obtener las distintas construcciones expresando los diferentes antígenos se utilizaron diversos plásmidos comerciales. Para el clonaje y secuenciación de productos de PCR se utilizó el pGEM-Teasy. El plásmido binario PBI- 121 y derivados fueron utilizados en la transformación de Agrobacterium y en la posterior infiltración de plantas A. thaliana. El plásmido pCMV-p53 fue utilizado como molde para obtener la secuencia correspondiente al dominio de tetramerización de la p53. pBI-121 (Clontech Cat 6018-1): Deriva del plásmido pBI-101. Contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S CaMV) dirigiendo la expresión del gen GUS y un fragmento de 260 pb (pares de bases) que contiene la secuencia de poliadenilación del gen nopalin sintetasa (NOS-ter) del plásmido Ti de Agrobacterium. También contiene un origen de replicación RK2 (de bajo número de copias) y un gen de resistencia a kanamicina. pGEM-Teasy (Promega): Este plásmido está especialmente diseñado para el clonaje y secuenciación de los productos de PCR. Contiene una región con múltiples lugares de restricción (polylinker). El polylinker ha sido previamente digerido con EcoRV y posteriormente se le han añadido timidinas 3' en ambos extremos para facilitar el clonaje de los productos de PCR. Además, permite seleccionar los recombinantes por medio del gen LacZ. pCMV-p53 (CLONTECH Cat K6004-1): El plásmido pCMV-p53 es un plásmido de expresión que contiene la secuencia del protooncogén que codifica para la proteína supresora de tumores p53. Este plásmido fue utilizado como molde para obtener la secuencia correspondiente al dominio de tetramerización de la p53. Además de estos plásmidos comerciales, también se utilizó el plásmido p35S-
TEV (4.051 pb), generado en el laboratorio del Dr. Escribano (INIA) y derivado del plásmido pBI121 [colección del laboratorio del Dr. Escribano (INIA)], el cual contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (35SCaMV), la secuencia potenciadora de la transcripción (TEV) del virus del moteado del tabaco, tras la cual aparece una región de clonaje múltiple y la señal de poliadenilación del Vsp. Este plásmido fue utilizado en el subclonaje de algunas construcciones como paso previo a su clonaje en el plásmido binario. Ambos plásmidos generados en el laboratorio de los inventores (Dr. Escribano) se encuentran a libre disposición del público y no son objeto de reivindicación en la presente invención.
1.4.2 Plásmidos de transformación de plantas desarrollados durante la puesta en práctica de esta invención
Para la realización de este ejemplo se generó el plásmido identificado como pBI-
TEV 2L21-DT, el cual se utilizó en la transformación genética de plantas. El antígeno expresado en dicho plásmido pBI-TEV 2L21-DT es la fusión del péptido 2L21 del parvovirus canino (CPV) al dominio de tetramerización de la proteína p53 (SEQ ID NO: 9). El tamaño del transgén es de aproximadamente 0,2 kb.
Las secuencias que codifican dicho antígeno y sus respectivas fusiones fueron obtenidas por amplificación mediante PCR. Se utilizaron 2 tipos de polimerasas comerciales, la ECOTAQ (Ecogen), que fue utilizada principalmente en los análisis de colonias, y la Pow DNA-polimerasa (Roche), que presenta actividad correctora y se utilizó para amplificar las secuencias de los transgenes. Los cebadores utilizados fueron los identificados como: p53 ida (5 '-3'): CCCGGGC AAACCACTGGATGGAG [SEQ ID NO: I]; y p53 vuelta (5 '-3'): CCCGGGCCCTGGCTCCTT [SEQ ID NO: 2]
[Lo subrayado corresponde a las dianas de restricción]
1.4.3 Obtención de los plásmidos de transformación de plantas (clon ajes)
Para obtener el vector de transformación binario, las modificaciones enzimáticas del ADN y las digestiones con endonucleasas de restricción se realizaron según los métodos convencionales (Sambrook y col. 1989) y siguiendo las recomendaciones de los fabricantes de las enzimas correspondientes. La separación de los distintos fragmentos de ADN se llevó a cabo en geles de agarosa (Pronadisa) de concentración variable entre 0,7 y 2% (p/v), en función del tamaño esperado de los fragmentos a resolver. El tampón empleado fue TBE (Tris 90 mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 1 mM). La purificación de los fragmentos de ADN desde los geles de agarosa se llevo a cabo con el "GeI Extraction Kit" (Quiagen).
Los extremos 5' protuberantes se hicieron romos, cuando fue necesario, rellenando el extremo 3' con el fragmento klenow de la DNA polimerasa I de E. coli (Roche). La incorporación de grupos fosfato a los extremos 5' del ADN se llevó a cabo con la T4 polinucleótido quinasa (Roche diagnostic). En las reacciones de ligación se utilizó la T4 DNA ligasa (Roche diagnostic), o el kit de ligación del pGEM-Teasy (Promega). La obtención del plásmido pBI-2L21-GUS se describe en la publicación de Gil y col. (Gil F., Brun A., Wigdorovitz A., Martínez-Torrecuadra J.L., Cátala R., Casal L, Salinas J., Borca M.V. and Escribano J. M. Development of a high-yielding system for expression of peptide vaccines in transgenic plants. FEBS Letters, 488:13-17, 2001).
1.4.3.1 Obtención del vector de transformación pBI-TEV 2L21-DT
La secuencia del dominio de tetramerización de la proteína p53 (SEQ ID NO: 8) fue obtenida por amplificación por PCR con cebadores específicos, utilizando como molde el plásmido pCMV-p53 (Clontech). Los cebadores utilizados fueron diseñados para obtener la secuencia del dominio de tetramerización de la proteína p53 flanqueada por dos dianas de restricción. Dichos cebadores fueron los oligonucleótidos identificados como p53 ida [SEQ ID NO: 1] y p53 vuelta [SEQ ID NO: 2]. Tras la amplificación por PCR, la secuencia correspondiente al dominio de tetramerización fue clonada en el plásmido de clonaje pGEM-Teasy (Promega), obteniéndose el plásmido pGEM-DT. Tras secuenciación y verificación de la secuencia, se digirió este plásmido con la enzima de restricción Kpnl y se eliminaron los extremos 3' protuberantes por incubación con el fragmento klenow de la DNA-polimerasa (Roche).
A continuación, se limpió el vector y se cortó con la enzima de restricción Smal, liberando el fragmento correspondiente a la secuencia del dominio de tetramerización. Este inserto fue ligado y clonado en el plásmido de transformación de plantas pBI-TEV- 2L21-GUS previamente digerido con Smal, constituyendo el plásmido pBI-TEV 2L21- DT [Figura 2]. La estructura de la región de expresión de dicho plásmido binario pBI- TEV 2L21-DT se muestra en la Figura 3. Dicho plásmido se introdujo por transformación en A. tumefaciens para la posterior infiltración de plantas. 1.5. TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS MEDIADA POR A. tumefaciens
Las células de Agrobacterium transformadas previamente con los distintos plásmidos de transformación de plantas fueron crecidas en 500 mi de medio LB (Sigma), suplementado con kanamicina y rifampicina (Sambrook y col. 1989), durante 48 horas a 280C. Tras centrifugación a 3.000 r.p.m. durante 20 minutos, se resuspendió el sedimento (que contenía las bacterias) en 200 mi de medio de infiltración: 2,35 g/1 de MS (Murashige y Skoog, 1962), 5% de sacarosa, 10 g/1 de 6-benzilaminopurina y 0,02% de Silweet L-77 (Lehle Seeds, número de catálogo VIS-Ol).
1.5.1 Infiltración de las flores
Para realizar la infiltración se utilizaron plantas de 6-7 semanas de edad, con el mayor número de inflorescencias posibles. Se sumergieron las inflorescencias en el medio de infiltración conteniendo Agrobacterium en una cámara de vacío, sometiéndolas a una presión de 5 kPa (50 mbar) durante 10 minutos (Bechtold N. and Pelletier G. In planta Agrobacterium-mQdiaϊQd transformation of adult Arαbidopsis thαliαnα plants by vacuum infiltration. Methods Mol. Biol. 82:259-266, 1998). Una vez transcurrido el tiempo se liberó el vacío lo más rápidamente posible, se lavaron las plantas con agua y se les cubrió con plástico para evitar su desecación y posible contaminación entre las diferentes plantas infiltradas. En algunas ocasiones se infiltraron plantas en ausencia de vacío (Clough SJ. and Bent A.F. Floral dip: a simplified method for Agrobαcterium-mQdiaϊQd transformation of Arαbidopsis thαliαnα. Plant. J. 16:735-743, 1998). Se mantuvieron en cámaras de cultivo, en condiciones controladas de luz, humedad y temperatura hasta el desarrollo y maduración de las silicuas.
1.5.2 Medios de crecimiento y selección de las plantas transgénicas
Las semillas procedentes de plantas de A. thαliαnα previamente infiltradas, se esterilizaron en una solución que contenía lejía al 30% y Tritón X-100 al 10%, y se sembraron en placa petri en medio GM (MS 4,7 g/1, 1% de sacarosa, ácido morfolin- cetanesulfónico (MES) 0,5 g/1, agar 8 g/1 y pH 5,7) suplementado con ampicilina y kanamicina (Sambrook y col. 1989). Las semillas Tl se mantuvieron a 40C de temperatura y oscuridad durante 48 horas y posteriormente en cámara de cultivo in vitro, en condiciones controladas (16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, 220C de temperatura). Tras 12-15 días, las plántulas transgénicas (capaces de crecer normalmente en presencia de kanamicina) fueron transplantadas a tierra y llevadas a cámaras de cultivo para su crecimiento y desarrollo.
1.6. ANÁLISIS DE LAS PLANTAS TRANSGÉNICAS
1.6.1 Aislamiento de ADN genómico, cuantificación, modificaciones enzimáticas, electroforesis y transferencia a membranas El ADN genómico de Arabidopsis se aisló según el método descrito por
Dellaporta y col. (Dellaporta S. L., Wood J.A., and Hicks J.B. A plant DNA minipreparation: versión II. Plant Mol. Biol. Report. 1:19-21, 1983). La concentración de ADN se estimó mediante espectro fotometría (Sambrook y col. 1989) o en geles de agarosa con bromuro de etidio, por comparación de fluorescencia de la muestra problema con un marcador de peso molecular conocido (Gibco).
Para su transferencia a membranas, el ADN genómico, previamente digerido con las enzimas elegidas, siguiendo instrucciones del fabricante, se utilizaron geles de agarosa (Pronadisa) al 0,75% (p/v). El tampón empleado fue TBE (Tris 90 mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 1 mM. Para la detección de fragmentos específicos de DNA mediante hibridaciones tipo Southern, el ADN se transfirió a membranas de nylon Hybond N+ (Amersham), con hidróxido sódico 0,4 M utilizando métodos convencionales (Sambrook y col. 1989) durante 14-16 horas.
1.6.2 Aislamiento de ARN total, cuantificación, electroforesis, transferencia a membranas, mareaje radiactivo de sondas e hibridación de ácidos nucleicos
El ARN total se purificó siguiendo el método de hidroclorato de guanidina descrito por Logeman y col. (Logemann J., Schell J., and Willmitzer L. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal. Biochem. 163:16-20, 1987). La cuantificación del ARN se realizó por espectrofotometría. Para su transferencia a membranas, el ARN se resolvió en geles horizontales de agarosa al 1,5% en presencia de formaldehído/formamida (Sambrook y col. 1989). Las muestras de ARN se cargaron con bromuro de etidio, con el fin de visualizarlas por fluorescencia y así comprobar su integridad. Posteriormente, el ARN se transfirió a membranas Hybond N+ (Amersham) utilizando hidróxido sódico 0,05 M por métodos convencionales (Sambrook y col. 1989).
Todas las sondas de ADN se marcaron con 50 μCi de α32P-dCTP (Amersham o ICN) mediante el método de extensión a partir de cebadores aleatorios, utilizando el
Oligolabelling kit (Pharmacia Biotech). Los nucleótidos no incorporados se eliminaron por cromatografía de exclusión molecular en columnas S-200 (Pharmacia Biotech), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los distintos fragmentos de ADN utilizados como sondas (secuencias completas de los genes de fusión), así como el método utilizado para obtenerlos, se detallan a continuación.
Sonda Tamaño Método de obtención Utilizadas*
2L21-GUS l,8 kb Aprox. PCR y digestión N/S
2L21-DT 0,2 kb Aprox. PCR y digestión N/S * N, Northern Blot S, Southern Blot
Las hibridaciones de ácidos nucleicos se realizaron en tubos de vidrio, conteniendo 10-15 mi de solución de prehibridación. Las membranas se prehibridaron durante, al menos, dos horas a la temperatura de hibridación. Transcurrido este tiempo, se añadió la sonda marcada radiactivamente desnaturalizada y las membranas se mantuvieron en esta solución de 16 a 20 horas.
Las hibridaciones tipo Southern a baja astringencia se llevaron a cabo en una solución de prehibridación con 5X SSPE (NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM, EDTA Na2 1 mM), 5X Solución de Denhardt (0,02% Ficoll, 0,02% Polivinilpirrolidona, 0,02% albúmina sérica bovina, 0,5% dodecil sulfato sódico (SDS) y ADN de esperma de arenque desnaturalizado 0,5 mg/ml). La hibridación se llevó a cabo a 650C. Tras la hibridación, las membranas fueron sometidas a sucesivos lavados con 5X SSPE y 0,5% SDS, disminuyendo la concentración de sales en cada lavado.
Las hibridaciones tipo Northern se realizaron a 420C en tampón fosfato 0,25 M pH 7,2, NaCl 0,25 M, EDTA 1 mM, 7% SDS, 10% PEG 6000, 40% formamida y ADN de esperma de arenque desnaturalizado 0,2 mg/ml. Tras la hibridación, las membranas fueron sometidas a varios lavados con 5X SSPE y 0,5% SDS, a 650C. Cada lavado fue de aproximadamente 20 minutos de duración. En ocasiones, fue necesario lavar con SDS al 0,5%.
Las membranas se expusieron con película autorradiográfica (Hyperfilm MP, Amersham) y pantallas intensificadoras, a -8O0C, durante el tiempo necesario para visualizar las bandas de hibridación. Con el fin de reutilizar las membranas, estas se deshibridaron con una solución de SDS al 5% hirviendo, y agitando hasta el enfriamiento de la solución. Para comprobar que no quedaba radiactividad en la membrana, los filtros se expusieron con película autorradiográfica durante varios días.
1.6.3 Análisis de proteínas recombinantes producidas en plantas transgénicas
1.6.3.1 Obtención de la proteína total soluble
Material vegetal fresco, generalmente procedente de las hojas de la roseta basal de las plantas, fue homogeneizado en tampón de extracción de proteínas (Tris 10 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, 0,1% Tritón x-100, 1% β-mercaptoetanol y PMFS 1 mM como inhibidor de proteasas), tras ser cortado e introducido en tubos eppendorf de 1,5 mi y mantenido en hielo (40C). Tras su homogenización se centrifugaron 10-15 minutos a 13.000 r.p.m. recogiéndose el sobrenadante. En algunos casos se usó material congelado. Para solubilizar algunas de las proteínas precipitadas y mejorar los rendimientos de extracción se utilizó un tampón conteniendo urea. Para los Western bloís en condiciones nativas se utilizó un lampón de extracción sin agentes reductores ni desnaturalizantes: Tris 10 mM pH 7.5 y NaCl 500 mM.
El análisis de proteínas se llevó a cabo en geles de electro foresis de acrilamida- bisacrilamida (30:1) en presencia de SDS, en geles en condiciones nativas (análisis de formación de estructuras) o en geles de tricina para antígenos de bajo peso molecular.
1.6.3.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida-glicina en presencia de SDS
Las electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes se realizaron en geles discontinuos de acrilamida-bisacrilamida en presencia de SDS, siguiendo el método convencional (Sambrook y col. 1989). Se prepararon geles separadores de acrilamida- bisacrilamida (Biorad o Serva), a concentraciones variables del 7 al 15% dependiendo del peso molecular esperado de la proteína a analizar y geles apelmazadores con una concentración de arcrilamida-bisacrilamida al 3,5% (Sambrook y col. 1989). Las electroforesis se desarrollaron a voltaje constante de 100 a 140 V en el caso de minigeles (7x9 cm).
Todas las muestras fueron cuantificadas, según el método de Bradford-Lowry (Biorad protein assay). Se solubilizaron en tampón de disociación de proteínas (Tris 0,5 M pH 8,0, SDS 10%, glicerol, β-mercaptoetanol, azul de bromo fenol 0,02%), se calentaron 5 minutos a 1000C y posteriormente se aplicaron al gel.
1.6.3.3 Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativas
Se utilizaron estos geles para verificar la posible multimerización y ensamblaje de distintos antígenos de fusión. Para los geles nativos se utilizó un método basado en un SDS-PAGE al 15% pero con diez veces menos de SDS en el buffer de corrida y evitando el SDS y β-mercaptoetanol en el buffer de carga. Bajo estas condiciones, en principio, no se disocian las proteínas en subunidades y se pueden determinar los pesos moleculares de las oligoproteínas. En ambos casos los geles fueron corridos a 150 V de voltaje constante.
1.6.3.4 Electroforesis en geles de Tricina
La tricina permite la resolución de proteínas de pequeño peso molecular (5-35 kDa) en geles de acrilamida a concentraciones más altas que con los geles de poliacrilamida-glicina-SDS (en los que las proteínas de bajo peso molecular no se resuelven), sin que sea necesario el uso de urea, según el método descrito por Schagger y col. (Schagger H. and von Jagow G. Tricine-sodium SDS-polyacrilamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166: 368-379, 1987). Se prepararon geles apelmazadores al 10% y separadores al 20%. Las muestras se incubaron durante 30 minutos a 4O0C en tampón de disociación de proteínas (4%
SDS, 12% glicerol (p/v), Tris 50 mM, 2% β-mercaptoetanol (v/v), 0,01% de azul de bromo fenol, pH final 6,8). Las electroforesis se realizaron a voltaje constante de 100 V.
Se prepararon dos tampones diferentes para poder desarrollar las electroforesis: tampón del ánodo (Tris 0,2% pH 8,9), y tampón del cátodo (Tris 0,1%, Tricina 0,1%, SDS 0,1% con un pH 8,25). 1.6.3.5 Transferencia de proteínas a filtros de nitrocelulosa
La transferencia de proteínas a filtros de nitrocelulosa (Bio-Rad 2) se realizó en cubeta húmeda a un voltaje constante de 100 V durante 1 hora, o mediante transferencia semiseca (Bio-Rad) durante 25 minutos a 20 voltios. En ambos casos se utilizó el mismo tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 151,8 mM y metanol al 20%
1.6.3.6 Tinción Rojo Ponceau de proteínas transferidas a nitrocelulosa
Una vez transferidas las proteínas a los filtros de nitrocelulosa, estos se tiñeron para comprobar su integridad con una solución de Ponceau (Sigma) al 0,2% en ácido tricloroacético 30% (p/v) y ácido sulfosalicílico al 30% (p/v) durante 1 minuto por inmersión. Posteriormente se lavaron con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
1.6.3.7 Análisis de proteínas por Inmunoblotting o Western Blotting
Una vez transferidas e inmovilizadas las proteínas en filtros de nitrocelulosa, se bloquearon dichos filtros de nitrocelulosa bien durante 1 hora a 370C con leche desnatada en polvo al 2% (p/v) en PBS, o bien durante toda la noche a 40C en agitación, con la misma solución de bloqueo. A continuación, los filtros se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo específico diluido en PBS-Tween 20 al 0,05% (v/v) y a la concentración adecuada para cada ensayo. Los filtros se lavaron 3 veces durante 10 minutos en tampón de lavado (PBS lX-Tween) cada vez y se incubaron en la misma solución de dilución con el anticuerpo secundario correspondiente, durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras repetir los lavados se procedió al revelado utilizando el sustrato adecuado acorde con la conjugación del anticuerpo secundario (NBT-BCIP (Roche), ECL...). 1.7. ANÁLISIS INMUNOGÉNICO DE LAS PROTEÍNAS EXPRESADAS EN PLANTAS
1.7.1 Inmunización intraperitoneal de ratones con extractos de plantas
Se inmunizaron intraperitonealmente hembras de ratón, de 11 semanas de edad y estirpe Swisse o Balb-c, en días 0, 7 y 14 con extractos de planta, que expresaba la proteína recombinante objeto de estudio (0,5-3 mg de proteína soluble total/dosis).
Para la primera inoculación se utilizó adyuvante completo de Freund (Sigma) y adyuvante incompleto de Freund (Sigma) para el resto.
Los ratones controles fueron inmunizados utilizando el mismo protocolo con extractos de planta sin transformar o transformada con el vector sin el transgén. Diez días después de la última inmunización los ratones fueron sangrados y se procedió a la obtención de los sueros para su estudio.
1.7.2 Inmunizaciones orales con hojas frescas de A. thaliana Hojas de la roseta basal de Arabidopsis expresando los distintos antígenos recombinantes fueron utilizadas para alimentar ratones. Se administraron 5 dosis de 1-3 g de hojas frescas de Arabidopsis transgénicas por ratón más 10 μg de la subunidad B de la toxina colérica (Sigma) pulverizada por encima de las hojas, a lo largo de 3 semanas. Quince días después, los ratones fueron sangrados.
1.7.3 Obtención de los sueros
Los sueros fueron obtenidos mediante incubación de la sangre durante 30 minutos a 370C, seguida de una incubación de 14 horas a 40C. Se separaron los coágulos sanguíneos y los sueros fueron clarificados por centrifugación a 1.500 r.p.m durante 10 minutos.
1.7.4 Detección de anticuerpos por ELISA
Se tapizaron los pocilios de las placas de ELISA con 0,2 μg del péptido 2L21 por pocilio, diluido en tampón de pegada (carbonato/bicarbonato), durante 12 horas a 40C. Se bloqueó con una solución de PBS-Tween-20 0,05% (v/v) y suero bovino fetal o
BSA al 5% durante 1 hora a 370C en agitación. Tras lavar 3 veces con una solución de
PBS-Tween 20 0,05%, se incubaron los sueros a determinar a diferentes diluciones en PBS-Tween 20 0,05%, durante 1 hora a 370C en agitación. Tras 5 lavados con PBS- Tween, se incubaron los pocilios con solución de PBS-Tween-20 0,05% que contenía un anti-ratón conjugado con peroxidasa (Amersham) a una dilución de 1/500, durante 1 hora a 370C con agitación. Las placas se lavaron y revelaron usando como sustrato o- fenilendiamina (OPD) (Sigma-Aldrich), preparado en agua conteniendo agua oxigenada al 0,1%. Las reacciones se pararon con ácido sulfúrico 3 N leyéndose a continuación la absorbancia de cada pocilio de la placa en un lector de ELISA a una longitud de onda de 492 nm.
Para la detección de anticuerpos contra la cápside del parvovirus canino se utilizó el Kit INGEZIM PARVO CANINO 1.5.CPV.K.1 (Ingenasa), diseñado para la detección y cuantificación de anticuerpos específicos frente al parvovirus canino en sueros de perro.
Para determinar el título de anticuerpos de los sueros analizados por ELISA, se realizaron diluciones seriadas de los sueros a titular, expresando el título de cada suero, como el inverso de la dilución máxima de dicho suero en la que la absorbancia a 492 nm era significativamente mayor que la de los controles negativos (2 veces mayor).
1.7.5 Caracterización de anticuerpos por Immunoblotting
La especificidad de antígeno de los anticuerpos provenientes de los animales inmunizados se determinó mediante immunoblotting. La proteína de la cápside VP2 producida en baculovirus (Ingenasa), fue resuspendida en tampón de disociación de proteínas, hervido durante 5 minutos y cargado en gel de poliacrilamida-glicina en presencia de SDS y transferido a membrana de nitrocelulosa (Biorad). Los sueros de ratón se testaron a dilución límite desde 1/10, y el anticuerpo secundario anti-ratón estaba conjugado con fosfatasa alcalina (Roche). El sustrato empleado para la reacción fue nitroblue-tetrazolum-4-cloro-3 indolfosfato (NBT-BCIP, Roche).
1.8. Obtención de plantas transgénicas de A. thaliana productoras de la proteína de fusión 2L21-DT La secuencia de nucleótidos del dominio de tetramerización de la p53 (DT), obtenida mediante PCR a partir del gen codificante para esta proteína, fue fusionada a la región 3 ' del péptido 2L21 de CPV, previamente adaptada al uso de codones de plantas y clonada en el vector binario pBI 121. En el extremo 5' del gen de fusión se incorporó una secuencia TEV 5' UTR para favorecer el inicio de la traducción del ARN mensajero. El plásmido resultante se denominó pBI-TEV 2L21-DT. Dicho plásmido pBI-TEV 2L21-DT permite la selección de transformantes en medio MS con kanamicina y la integración estable en el ADN cromosómico nuclear de plantas de la región de expresión comprendida entre el borde izquierdo (LB) y derecho (RB) del plásmido.
A continuación, plantas de A. thaliana fueron transformadas con el plásmido pBI-TEV 2L21-DT por infiltración de las flores mediada por A. tumefaciens (Clough y Bent, 1998). Alrededor de 30 plantas, pertenecientes a distintos clones resistentes al antibiótico y que presentaban un fenotipo similar al de las plantas silvestres, fueron analizadas en Tl.
1.9. Expresión del antígeno de fusión 2L21-DT en plantas transgénicas Las plantas transgénicas fueron analizadas mediante Western blot con el anticuerpo monoclonal 3C9 (Ingenasa), específico del péptido 2L21. Dicho estudio reveló la acumulación en la fracción de proteínas solubles de hoja de una proteína inmunoreactiva algo superior a 8 kDa, que no aparecía en los controles de plantas sin transformar o transformadas con el plásmido pBI121. La movilidad electro forética de dicha proteína correspondía a la esperable del monómero de la proteína de fusión 2L21- DT. Al igual que se encontró con la fusión a GUS (Gil y col. 2001), se observó una gran variación en los niveles de expresión entre las distintas líneas transgénicas. Aproximadamente el 20% de estas líneas presentaban altos niveles de expresión y acumulación del antígeno de fusión y fueron seleccionadas para los análisis posteriores (Figura 4A).
Con el fin de intentar comprobar la integridad y funcionalidad de la proteína quimérica expresada y si el dominio de tetramerización mantenía la capacidad de multimerización en dímeros y tetrámeros en el interior de la célula vegetal, se realizaron unos geles de acrilamida/bisacrilamida en condiciones nativas. Los Western blot sobre estos geles nativos (Figura 4B) determinaron la presencia de dos bandas inmunorreactivas de gran intensidad, las cuales correspondían a los dímeros y tetrámeros formados por el péptido de fusión (2L21-DT). Estos resultados sugieren que las plantas transgénicas expresaban el antígeno de fusión en forma monomérica y éste oligomerizaba espontáneamente en el interior del citoplasma de las células de las plantas, en dímeros y, mayoritariamente, en tetrámeros, los cuales migraban como proteínas de alrededor de 8 kDa para la forma monomérica; 16,5 kDa para la forma dimérica; y aproximadamente 32 kDa para la forma tetramérica [Figura 4].
Un análisis de las plantas de alta expresión mediante Northern blot para verificar todos los pasos fundamentales en la expresión génica, reveló una buena correlación entre los niveles de ARNm y la proteína acumulada [Figura 5], sugiriendo que las plantas que expresan el antígeno 2L21-DT no presentan problemas a nivel traduccional.
1.10. Estudio de la estabilidad a la extracción y almacenaje del péptido 2L21-DT
Los resultados de los ELISAs mostraron resultados similares a los obtenidos mediante la técnica Western blot, demostrando que las plantas transformadas con el plásmido pBI-TEV 2L21-DT expresaban elevados niveles del antígeno 2L21-DT. Los ELISAs con extractos de planta se compararon con otros llevados a cabo con el péptido 2L21 sintético. Tal como se esperaba, el anticuerpo monoclonal 3C9 presentó una gran avidez por el péptido puro, disminuyendo en gran medida cuando se diluyó con extractos de plantas, presentando cierta variación y falta de linearidad, lo que impidió que se pudiera realizar una cuantificación más precisa. Sin embargo, se puede afirmar que en aproximadamente 300 ng de proteína soluble total de las líneas de mayor expresión del antígeno 2L21-DT, se encuentra una absorbancia similar a la obtenida con aproximadamente 1,5 ng de péptido puro, y que presentaron aproximadamente la misma absorbancia que 7,5-8 ng del péptido diluido en un extracto de proteínas de plantas sin transformar. Un aspecto importante para la posible aplicación de las vacunas producidas en plantas, es la estabilidad que presentan las proteínas recombinantes durante la extracción y almacenaje. Para comprobar la estabilidad y acumulación del antígeno 2L21-DT se realizaron diferentes ensayos tipo ELISA, utilizando extractos de proteína soluble total de estas plantas a lo largo del tiempo una vez extraídas y almacenadas a 40C. Por tanto, se realizaron estudios destinados a conocer la estabilidad que presentaba el antígeno recombinante 2L21-DT una vez extraído, bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Por un lado, el antígeno una vez extraído presentaba un alto grado de tolerancia a la congelación/descongelación, manteniendo sus características antigénicas en ensayos de ELISA. Además, se estudió la estabilidad del antígeno una vez extraído y almacenado a 40C, en el mismo tampón de extracción. Los resultados muestran que el antígeno 2L21-DT es estable y se mantiene a los mismos niveles, al menos, durante tres semanas a 40C.
Por último, hojas de estas plantas que expresan el antígeno tetramérico 2L21- DT, fueron almacenadas a -2O0C durante 1 año y posteriormente fueron analizadas tanto en ELISA como en Western blot sin que se obtuvieran diferencias significativas respecto a extractos de proteína recién extraídos. Estos resultados sugieren la estabilidad de la estructura tetramérica tanto en el citoplasma celular como una vez extraída.
En conclusión, estos resultados ponen de manifiesto que el péptido 2L21 fusionado al DT (2L21-DT) es muy resistente a la extracción y almacenamiento. Estos datos remarcan la posibilidad no sólo de aumentar los niveles de expresión de epítopos vacunales en plantas por multimerización, sino su alta estabilidad.
1.11. Respuesta de anticuerpos obtenida con el péptido 2L21-DT producido en plantas de A. thaliana
Con el fin de probar la inmunogenicidad del péptido recombinante 2L21-DT producido en plantas transgénicas de A. thaliana, distintos grupos de ratones (Balb-c) fueron inmunizados intraperitonealmente. Un grupo de ratones fue inmunizado con extractos crudos de proteína total soluble (500 μg) de la línea de máxima expresión del péptido 2L21-DT (línea 22) y otro grupo de ratones fue inoculado de la misma forma con 500 μg de proteína total soluble de plantas que expresaban el antígeno 2L21 fusionado a la proteína β-GUS (2L21-GUS). Ambas plantas transgénicas utilizadas contenían cantidades equimolares del péptido 2L21. Los resultados del análisis mediante ELISA (Ingenasa) de los sueros obtenidos muestran que todos los ratones inmunizados intraperitonealmente, tanto con los extractos que contenían el péptido 2L21-DT o el péptido 2L21-GUS, presentaron anticuerpos específicos contra el péptido sintético 2L21. El título de anticuerpos en los ratones inmunizados con los extractos que contenían el péptido 2L21-DT varió entre 1/640 y 1/7120 mientras que en el caso de la fusión a GUS (2L21-GUS) se obtuvieron títulos que variaron entre 1/320 y 1/1280. El grupo de ratones control negativo, inmunizados con extractos de plantas sin transformar, no presentaron anticuerpos específicos contra el péptido sintético 2L21 [Figura 6A].
A continuación, se repitió la inmunización de ratones con las mismas plantas transgénicas que en el caso anterior, pero mediante administración oral, dejando que los ratones consumieran hojas de ambos tipos de plantas. El resultado de dicha inmunización puede observarse en la Figura 6B. Ambos grupos de ratones presentaron anticuerpos séricos después de la inmunización, siendo los títulos de estos por ELISA superiores en el caso de las plantas que expresaban 2L21-DT.
Los datos obtenidos parecen sugerir que la estructura tetramérica del antígeno permite una mejora en el contexto inmuno lógico al favorecer, posiblemente, la presentación del antígeno al sistema inmune. Otra posibilidad podría estar relacionada con la vida media del antígeno tetramérico en el torrente circulatorio una vez inyectado. Tal posibilidad podría favorecer la captación del inmunógeno por las células presentadoras de antígeno. Con esta estrategia se ha probado la posibilidad de obtener altos niveles de expresión del péptido vacunal 2L21 de CPV fusionado al dominio de tetramerización de la p53 (2L21-DT), basándose en la capacidad de multimerización de la proteína de fusión. El monómero 2L21-DT, tiende a oligomerizar en dímeros y tetrámeros, que se acumulan en el citoplasma celular. De hecho, como se observa en los geles nativos, la mayoría de la proteína detectada se encuentra en forma tetramérica, indicando tanto la funcionalidad del dominio de tetramerización expresado en plantas, como la estabilidad de esta estructura compleja en células de planta de A. thaliana. Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teoría, se cree que los tetrámeros formados podrían ofrecer una mayor resistencia a la degradación por proteasas celulares. Además, estos resultados indican que el dominio de tetramerización multimeriza de forma espontánea en el citoplasma de células de plantas, sin necesidad de dirigirse al retículo endoplásmico para facilitar su plegamiento y conformación y sin ninguna modificación de su secuencia para adaptarlo al uso de codones de plantas.
Desde el punto de vista de la respuesta inmune obtenida, el antígeno fusionado al DT de la p53 producido en plantas mantiene sus características antigénicas e inmunogénicas, tanto por vía intraperitoneal como oral y, en ambos casos, mejora la respuesta obtenida con el péptido fusionado a una proteína portadora, inmunológicamente irrelevante.
Estos resultados abren la posibilidad de utilizar este dominio en futuras estrategias de sobreexpresión de epítopos vacunales e incluso se podría utilizar en el desarrollo de vacunas multicomponentes en plantas, al posibilitar la fusión al dominio TD de más de una proteína/péptido que se ensamblaría en la misma molécula (Figura 7).
EJEMPLO 2
Multimerización del péptido p54-DUD expresado en células y larvas de insecto mediante baculovirus y su empleo en la inmunización de animales. Obtención de la proteína p54-TDH
2.1. LINEAS CELULARES UTILIZADAS
Se utilizo la línea celular Sf21 para la propagación de los baculovirus y expresión de proteínas recombinantes. Derivada de tejido ovarico de Spodoptera frugiperda.
2.2. CEPAS BACTERIANAS UTILIZADAS, CULTIVO Y OBTENCIÓN DE COMPETENTES
Para la transformación y crecimiento de los plásmidos se usaron las cepas de Escherichia coli, DH5-α , TOP-IO (Clontech) y DHlOBac (Invitrogen).
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Los cultivos de E. coli se realizaron en medio LB (Sigma) en presencia del correspondiente agente selectivo (Sambrook y col. 1989) durante 14-16 horas a 370C. La preparación de células competentes se realizó por el método del cloruro de rubidio, descrito por Hanahan (Studies on transformation of E. coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166:557-580. 1983).
Los cultivos bacterianos se conservaron a largo plazo en dimetilsufóxido (DMSO) a una concentración final del 6% a -8O0C (Sambrook y col, 1989).
2.3. MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN BACTERIANA 2.3.1 Transformación de E. coli
Las cepas DH5-α y TOP-IO, fueron utilizadas para el mantenimiento de plásmidos y generación de nuevos. Ambas cepas competentes fueron transformadas siguiendo el protocolo de Birnboim y Dolly (Birnboin H.C. and Dolly J. A rapid alcaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucí. Acid Res. 7:1513-1516. 1979). Brevemente, el ADN plasmídico o producto de ligación se añadió a una alícuota de 100 μl de células competentes descongeladas y se mantuvo a 40C durante 30 minutos. A continuación, se provocó un choque térmico a 420C, lo que aumenta la permeabilidad de los poros, después de 2 minutos en hielo se añadieron 600 μl de LB y se incubaron en agitación a 370C durante 1-1,5 horas. Las células bacterianas sedimentaron por centrifugación durante 3 minutos a 3.500 r.p.m. y se plaquearon en medio sólido al que previamente se la habían añadido los antibióticos de selección necesarios. Las placas se incubaron en estufa a 370C durante toda la noche.
Para transformar la Cepa DHlOBac se utilizo el mismo procedimiento con la diferencia de que después del choque térmico las bacterias se incubaron durante 4 horas a 370C. Las bacterias se sedimentaron y se plaquearon en medio sólido suplementado con IPTG y bluo-gal además de con los antibióticos necesarios. Las placas se incubaron entre 48 y 72 horas a 370C hasta que se pudo distinguir entre colonias blancas y azules.
2.4. PLÁSMIDOS UTILIZADOS 2.4.1 Plásmidos comerciales
Para obtener las distintas construcciones se utilizaron diversos plásmidos comerciales. Para el clonaje y secuenciación de productos de PCR se utilizó el pGEM- Teasy. El plásmido pCMV-p53 fue utilizado como molde para obtener la secuencia correspondiente al dominio de tetramerización de la proteína p53. El plásmido pFAstBacl se utilizó para clonar el gen de interés y obtener el báculo virus recombinante. pGEM-Teasy (Promega): Este plásmido está especialmente diseñado para el clonaje y secuenciación de los productos de PCR. Contiene una región con múltiples lugares de restricción (polylinker). El polylinker ha sido previamente digerido con EcoRV y posteriormente se le han añadido timidinas 3' en ambos extremos para facilitar el clonaje de los productos de PCR. Además, permite seleccionar los recombinantes por medio del gen LacZ. pCMV-p53 (CLONTECH Cat. K6004-1): El plásmido pCMV-p53 es un plásmido de expresión que contiene la secuencia del protooncogén que codifica para la proteína supresora de tumores p53. Este plásmido fue utilizado como molde para obtener la secuencia correspondiente al dominio de tetramerización de la p53. pFastBac 1 (Invitrogen): El plásmido pFastBacl es un plásmido de expresión en células de insecto. El gen de interés se clona bajo el promotor de la poliedrina del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV). 2.4.2 Plásmidos desarrollados durante la puesta en práctica de esta invención
Para la realización de este ejemplo se generó el plásmido identificado como pFasBac-p54TDH el cual se utilizó en la transformación de la cepa de E. coli DHlOBac. El antígeno expresado en dicho plásmido, p54TDH, es la fusión del péptido de unión a la dineina de la proteína p54 del virus de la Peste Porcina Africana al dominio de tetramerización de la proteína p53 y a una secuencia de 8 Histidinas que facilitó su posterior purificación (SEQ ID NO: 10). El tamaño la secuencia generada es de aproximadamente 0,24 kb.
Las secuencias que codifican dicho antígeno y sus respectivas fusiones fueron obtenidas por amplificación mediante PCR. Para ello se utilizó la polimerasa comercial Pyrobest (Takara). Los cebadores utilizados fueron identificados como:
P54dud3: atggatccatgcatccgactgagccttacacgacagtcactactcagaacactgcttc (SEQ ID NO:
3) P54dud2: tactcagaac actgcttcac aaacaatgtc ggctattgaa aattta (SEQ ID NO: 4)
P54dudl : tgtcggctat tgaaaattta aaaccactgg atggagaata (SEQ ID NO: 5)
P53td3rc: ataagctttt agtgatgatg atggtggtgg tgatgccctg gctccttccc agcc (SEQ ID NO: 6)
El péptido de fusión se obtuvo por amplificación por PCR utilizando como molde el plásmido pCMV-p53 y los oligos P53td3rc y P54dudl . El producto de la PCR se clonó en un plásmido intermedio, el pGemT-easy. Este nuevo plásmido sirvió a su vez como molde para una segunda PCR, en la que se utilizaron los oligos P53td3rc y
P54dud2. El producto se volvió a clonar a su vez en el pGemT-easy. El plásmido resultante sirvió como molde para la tercera y última PCR que esta flanqueada por dos dianas de restricción, los oligos utilizados fueron P53td3rc y P54dud3. Esta última PCR se cortó con las enzimas de restricción Bam HI y HindIII y se clonó en el plásmido pFastbac-1 previamente digerido con las mismas enzimas. La secuencia del inserto se verificó mediante secuenciación (SEQ ID NO: 7).
Las modificaciones enzimáticas del ADN y las digestiones con endonucleasas de restricción se realizaron según los métodos convencionales (Sambrook y col. 1989) y siguiendo las recomendaciones de los fabricantes de las enzimas correspondientes. La separación de los distintos fragmentos de ADN se llevó a cabo en geles de agarosa (Pronadisa) a una concentración del 1% (p/v). El tampón empleado fue TBE (Tris 90 mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 1 mM). La purificación de los fragmentos de ADN desde los geles de agarosa se llevo a cabo con el "GeI Extraction Kit" (Quiagen).
En las reacciones de ligación se utilizó la T4 DNA ligasa (Roche diagnostic), o bien el kit de ligación del pGEM-Teasy (Promega).
2.5. PRODUCCIÓN DE BÁCULOVIRUS RECOMBINANTES
El baculovirus recombinante expresando la proteína de fusión se obtuvo según el método Bac-to-Bac Baculovirus Expresión System (Invitrogen).
2.5.1 Generación del bácmido recombinante
Aquellos clones para los que se confirmó la correcta inserción del fragmento se utilizaron para la obtención del baculovirus recombinante. Con este fin se transformaron células competentes E. coli DHlOBac con el plásmido pFastBac-p54TDH utilizando como antibióticos de selección kanamicina a 50 μg/ml, gentamicina a 7 μg/ml y tetraciclina a 10 μg/ml en medio LB suplementado con 100 μg/ml Bluo-Gal y 40 μg/ml IPTG. Las células competentes E. coli DHlOBac se caracterizan por poseer un bácmido, un genoma circular homólogo al de baculovirus en el que se ha sustituido el gen de la poliedrina por el gen lacZ. Las características del bácmido permiten la transposición del fragmento clonado en el vector pFastBac justo detrás del promotor de la poliedrina, truncando el gen lacZ y dando lugar a colonias de fenotipo color blanco en caso de transposición positiva. En aquellas células en las que no tuvo lugar la transposición, el fenotipo de la colonia fue color azul.
Para purificar el bácmido recombinante se siguió el protocolo de Invitrogen y para confirmar si la transposición se había dado en el lugar y orientación correcta se realizó una PCR con una combinación de cebadores.
2.5.2 Generación del baculovirus recombinante
Finalmente, para generar el baculovirus, el bácmido recombinante fue transfectado en células SfZl. Para ello, primero se preparó un complejo entre el bácmido y el agente Celfectina (Invitrogen) de tal manera que lμg del bácmido diluido en 100 μl de medio Grace's se incubó durante 45 minutos con 6 μl de Celfectina diluido también en 100 μl del mismo medio. Después de la incubación se añadió 0.8 mi de medio al complejo y éste a un pocilio que contenía 9 x 105 células. Después de un periodo de incubación de 5 horas a 270C, se retiró el complejo DNA:lípidos y se añadió medio fresco a las células. Se incubaron a 270C hasta que aparecieron signos de infección viral, entre 72 y 96 horas.
Tras la transfección, los baculovirus recombinantes fueron recuperados a partir del sobrenadante del cultivo infectado y amplificado mediante sucesivos pases en células SfZl. Se determino el título vírico del stock viral mediante plaqueo.
2.6. ANÁLISIS DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE PRODUCIDA
2.6.1 Obtención de la proteína total soluble
Se recogió un pocilio con 5 x 106 células SfZl infectadas con el baculovirus recombinante en 250 μl de buffer RIPA (Tris pH 8 5OmM, NaCl 150 mM, NP40 1%, β-mercaptoetanol 5mM, SDS 0.1 %) y PMSF 1 mM (como inhibidor de proteasas). Después de un periodo de incubación de 30 minutos a 40C la muestra se centrifugó recogiéndose el sobrenadante. Para los Western blots en condiciones nativas se utilizó un tampón de extracción sin agentes reductores ni desnaturalizantes. El análisis de proteínas se llevó a cabo en geles de electroforesis de acrilamida-bisacrilamida .
2.6.2 Obtención de proteína total soluble a partir de larvas de Trichoplusia ni
Las larvas de Trichoplusia ni fueron infectadas con 104 ufp del baculovirus recombinante mediante inyección de 10 μl de inoculo, en su cuarto segmento. A las 72 horas postinoculación las larvas fueron congeladas a - 8O0C y posteriormente procesadas. Para ello se trituraron en una batidora con 2 mi por larva de buffer de extracción (PBS IX, Tritón X 100 0.1%, DTT 25 mM) y PMSF 1 mM (como inhibidor de proteasas).
Las larvas procesadas se centrifugaron a 3.000g durante 15 minutos a 40C y el sobrenadante se clarifico pasándolo por un filtro Miracloth (Calbiochem) y se volvió a centrifugar a 15.00Og durante 15 minutos. El sobrenadante se recogió y se conservo a - 2O0C en alícuotas. 2.6.3 Purificación de proteínas expresadas en larvas mediante cromatografía por afinidad de metales
Las larvas se trituraron en 4ml por larva de buffer de extracción (Imidazol 10 mM, Tritón XlOO 1%, Phosfhate buffer pH 7.4 ( Na2HPO4.2H2O 0.01M, NaH2PO4-H2O 0.01M, NaCl 0.5M )y PMSF 1 mM (como inhibidor de proteasas). Se tuvo la precaución de no usar DTT ya que es un agente reductor que interacciona con la unión de las His-Tag y los iones de la resina.
Las larvas procesadas se centrifugaron a 3.00Og durante 15 minutos a 40C, el sobrenadante se clarificó pasándolo por un filtro Miracloth (Calbiochem) y se sónico durante 10 segundos por 3 veces. Se volvió a centrifugar durante 15 minutos a 15.00Og. El sobrenadante se recogió y se incub con TALÓN Polyhistidine-tag Purifϊcation Resin (Clontech) (1 mi por cada 10 mi de sobrenadante) durante 1 hora 30 minutos en un rotor a 40C.
Transcurrido el tiempo de incubación, se lavoó la resina dos veces con 10 volúmenes de buffer de lavado (Imidazol 20 mM, Phosfhate buffer pH 7.4) mediante una centrifugación de 5 minutos a 2500 rpm. El último lavado se montó en una columna y se dejo que la resina sedimentara. Por último, la proteína unida a la resina se eluyó con 10 mi de buffer de elución (Imidazol 50OmM, Phosfhate buffer pH 7.4) recogiéndose fracciones de ImI. La concentración de proteína purificada fue cuantificada según el método de Bradford-Lowry (Biorad protein assay).
2.6.4 Electroforesis en geles de poliacrilamida-glicina en presencia de SDS
Las electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes se realizaron en geles de acrilamida-bisacrilamida en presencia de SDS, siguiendo el método convencional (Sambrook y col. 1989). Se prepararon geles separadores de acrilamida-bisacrilamida (Biorad o Serva), a una concentración del 12% y geles concentradores con una concentración de acrilamida-bisacrilamida al 7% (Sambrook y col. 1989). Las electroforesis se desarrollaron a voltaje constante de 100 a 140 V en minigeles (7x9 cm). Todas las muestras fueron cuantifϊcadas, según el método de Bradford-Lowry (Biorad protein assay). Se solubilizaron en tampón de disociación de proteínas (Tris 0,5 M pH 8,0, SDS 10%, glicerol, β-mercaptoetanol, azul de bromo fenol 0,02%), se calentaron 5 minutos a 1000C y posteriormente se aplicaron al gel. 2.6.5 Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativas
Se utilizaron estos geles para verificar la posible multimerización y ensamblaje de la proteína de fusión. Para los geles nativos se utilizó un método basado en un SDS- PAGE al 12% en el cual se elimina el SDS en el buffer de corrida y evitando el SDS y β-mercaptoetanol en el buffer de carga. Bajo estas condiciones, en principio, no se disocian las proteínas en subunidades y se pueden determinar los pesos moleculares de las oligoproteínas. Los geles fueron corridos a 100 V de voltaje constante.
2.6.6. Transferencia de proteínas a filtros de nitrocelulosa
La transferencia de proteínas a filtros de nitrocelulosa (Bio-Rad 2) se realizó en cubeta húmeda a un voltaje constante de 100 V durante 1 hora 30 minutos. Se utilizó como tampón de transferencia Tris 25 mM, glicina 151,8 mM y metanol al 20% (v/v).
2.6.7. Tinción Rojo Ponceau de proteínas transferidas a nitrocelulosa
Una vez transferidas las proteínas a los filtros de nitrocelulosa, estos se tiñeron para comprobar su integridad con una solución de Ponceau (Sigma) al 0,2% en ácido tricloroacético 30% (p/v) y ácido sulfosalicílico al 30% (p/v) durante 1 minuto por inmersión. Posteriormente se lavaron con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
2.6.8. Análisis de proteínas por Inmunoblotting o Western Blotting
Una vez transferidas e inmovilizadas las proteínas en filtros de nitrocelulosa, se bloquearon dichos filtros de nitrocelulosa bien durante 1 hora a 370C con leche desnatada en polvo al 2% (p/v) en PBS, o bien durante toda la noche a 40C en agitación, con la misma solución de bloqueo. A continuación, los filtros se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo específico diluido en PBS-Tween 20 al 0,05% (v/v) y a la concentración adecuada para cada ensayo. Los filtros se lavaron 3 veces durante 10 minutos en tampón de lavado (PBS lX-Tween) cada vez y se incubaron en la misma solución de dilución con el anticuerpo secundario correspondiente, durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras repetir los lavados se procedió al revelado utilizando el método ECL de Amersham. 2.7. ANÁLISIS INMUNOGÉNICO DE LA PROTEÍNA EXPRESADA EN BACULOVIRUS
2.7.1 Inmunización de conejos con la proteína purificada Se inmunizaron 3 conejos, en días 0, 7 y 14 con la proteína recombinante objeto de estudio (100 μg de proteína total/dosis) purificada mediante columna de TALON- resin.
Para la primera inoculación se utilizó adyuvante completo de Freund (Sigma) y adyuvante incompleto de Freund (Sigma) para el resto. Los conejos fueron sangrados 15 días después de la última inmunización y se procedió a la obtención de los sueros para su estudio.
2.7.2 Obtención de los sueros
Los sueros fueron obtenidos mediante incubación de la sangre durante 30 minutos a 370C, seguida de una incubación de 14 horas a 40C. Se separaron los coágulos sanguíneos y los sueros fueron clarificados por centrifugación a 1.500 r.p.m durante 10 minutos.
2.7.3 Detección de anticuerpos por ELISA Se tapizaron los pocilios de las placas de ELISA con 0,2 μg de proteína por pocilio, diluida en tampón de pegada (carbonato/bicarbonato), durante 12 horas a 40C. Se bloqueó con una solución de PBS-Tween-20 0,05% (v/v) y BSA al 2% durante 1 hora a 370C. Tras lavar 3 veces con una solución de PBS-Tween 20 0,05%, se incubaron los sueros a determinar a una dilución de 1:100 en PBS-Tween 20 0,05%, durante 1 hora a 370C en agitación. Tras 5 lavados con PBS-Tween, se incubaron los pocilios con solución de PBS-Tween-20 0,05% que contenía Proteína A conjugada con peroxidasa (Amersham) a una dilución de 1/15.000, durante 1 hora a 370C. Las placas se lavaron y revelaron usando como sustrato ABTS peroxidase sustrate. A continuación se leyó la absorbancia de cada pocilio de la placa en un lector de ELISA a una longitud de onda de 405 nm. 2.8. Obtención de un baculovirus recombinante que expresa la proteína de fusión p54TDH
La secuencia de nucleótidos del dominio de tetramerización de la p53, obtenida mediante PCR a partir del gen codificante para esta proteína, fue fusionada al dominio de unión a la dineína de la proteína estructural p54 del virus de la Peste Porcina
Africana (VPPA), además se incorporó una secuencia de 8 Histidinas para facilitar su purificación mediante columnas de afinidad. Este péptido de fusión se clonó en el plásmido pFastBac-1. El plásmido resultante se denominó pFasBac-p54TDH y permitió obtener un baculovirus recombinante que expresaba dicho péptido. En la SEQ ID NO: 1 se muestra la secuencia de la proteína de fusión p54TDH.
2.9. Expresión del antígeno de fusión en extractos de células infectadas con el baculovirus recombinante
Las células infectadas con el baculovirus fueron analizadas mediante Western blot con el anticuerpo monoclonal anti-Histidinas (Clontech). Dicho estudio reveló la acumulación de una proteína inmunorreactiva, de un tamaño superior a 8 kDa, que no aparecía en los controles de células sin infectar (figura 9a). La movilidad electro forética de dicha proteína correspondía a la esperable del mono mero de la proteína de fusión p54TDH, aunque también se detectaron bandas con tamaños esperables para las formas multiméricas. El mismo experimento se realizó con los extractos de larvas infectadas con el baculovirus recombinante. (Figura 9a).
Con el fin de intentar comprobar si el dominio de tetramerización mantenía la capacidad de multimerización en tetrámeros, se realizaron unos geles de acrilamida/bisacrilamida en condiciones nativas. Los Western blot sobre estos geles nativos determinaron la presencia de una banda inmunorreactiva de gran intensidad, la cual correspondía al tetrámero formado por el péptido de fusión y que no aparecía en los extractos de larvas sin infectar (Figura 9b). Estos resultados sugieren que las larvas expresaban el antígeno de fusión y que éste era capaz de oligomerizar en forma de tetrámeros. 2.10. Purificación del péptido producido en larvas mediante columnas de afinidad
La fusión de una cola de 8 Histidinas permitió la purificación del péptido de fusión en columnas de cromatografía de metales. Para ello, se partió de 12 larvas infectadas con el baculovirus recombinante y recogidas a las 72 hpi (horas post infección). Después de procesadas, se pasaron por una columna de TALÓN resin. Tras los correspondientes lavados, se recogieron 10 fracciones de 1 mi cada una, encontrándose la proteína purificada en las fracciones 2, 3 y 4, con una concentración de
9.96, 16.67 y 1.7 mg/ml respectivamente. Las fracciones recogidas se analizaron mediante geles de electro foresis de acrilamida-bisacrilamida. En la figura 10 se muestra el resultado obtenido para la fracción 2.
2.11. Respuesta de anticuerpos obtenida con el péptido p54TDH producido en larvas
Con el fin de probar la inmunogenicidad del péptido recombinante p54TDH producido en larvas, se inmunizaron conejos con 100 μg de proteína purificada. Los sueros obtenidos se analizaron mediante Elisa. Se tapizaron los pocilios con 0.2 μg del péptido p54TDH o con extracto total de larvas sin infectar. Los resultados del análisis del suero obtenido mediante ELISA muestran que el péptido tetramérico fue inmunogénico, induciendo anticuerpos específicos a un título superior a 1/400. En la figura 11 se muestra el valor Elisa obtenido a una dilución del suero de 1/100.
DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO
El plásmido pBI-TEV 2L21-DT ha sido depositado en la Colección Española de
Cultivos Tipo (CECT), Burjassot, Valencia, el 11.11.03, correspondiéndole el número de acceso CECT 5853.
El plásmido pFasBac-p54TDH ha sido depositado también en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Burjassot, Valencia, el 07.02.08, correspondiéndole el número de acceso CECT7370.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una construcción de ADN que comprende,operativamente unidas, al menos:
a) una secuencia de ácido nucleico (A) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés, dicho producto de interés se selecciona entre un péptido o una proteína
b) una secuencia de ácido nucleico (B) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para el dominio de tetramerización de la proteína p53
2. Construcción según la reivindicación 1, que comprende, además de dichas secuencias de ácido nucleico (A) y (B), una secuencia de ácido nucleico (A') que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés, donde dicho producto de interés se selecciona entre el péptido 2L21 del Parvorius Canino (CPV) o el péptido de unión a la dineína de la proteína p54 del virus de la Peste Porcina Africana.
3. Construcción de ADN según la reivindicación 1, que comprende, además, una secuencia de ácido nucleico (C) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido espaciador (Cl) situada entre dichas secuencias de ácido nucleico (A) y (B), en donde el extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (C) está unido al extremo 3 ' de dicha secuencia de ácido nucleico (A) y el extremo 3 ' de dicha secuencia de ácido nucleico (C) está unido al extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (B).
4. Construcción de ADN según la reivindicación 2, que comprende, además, una secuencia de ácido nucleico (C) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido espaciador (C2) situada entre dichas secuencias de ácido nucleico (A') y (B'), en donde el extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (C) está unido al extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (B) y el extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (C) está unido al extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (A').
5. Construcción de ADN según la reivindicación 1, que comprende, además, una secuencia de ácido nucleico (D) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificación, en donde dicha secuencia de ácido nucleico (D) está situada en una posición que no altere la funcionalidad, ni del dominio de tetramerización de la proteína p53, ni del péptido 2L21 de CPV, ni del péptido de unión a dineína de la proteína p54 del virus de la Peste Porcina Africana.
6. Construcción de ADN según la reivindicación 5, en la que dicha secuencia de ácido nucleico (D) está situada entre dichas secuencias de ácido nucleico (A) y (B), en donde el extremo 5 ' de dicha secuencia de ácido nucleico (D) está unido al extremo 3 ' de dicha secuencia de ácido nucleico (A) y el extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (D) está unido al extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (B) o bien dicha secuencia de ácido nucleico (D) está situada aguas arriba del extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (A), o bien dicha secuencia de ácido nucleico (D) está situada aguas abajo del extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (B).
7. Construcción de ADN según la reivindicación 1, que comprende, además, una secuencia de ácido nucleico (E) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos (El) susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos, en donde dicha secuencia de ácido nucleico (E) se encuentra a continuación del extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (A).
8. Construcción de ADN según la reivindicación 2, que comprende, además, una secuencia de ácido nucleico (E') que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos (E2) susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos, en donde dicha secuencia de ácido nucleico (E') se encuentra a continuación del extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (A').
9. Un cassette de expresión que comprende una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 operativamente unida a una secuencia de control de expresión que comprende una secuencia promotora, una secuencia codificante para reguladores transcripcionales, una secuencia de unión a ribosomas (RBS) y/o una secuencia terminadora de transcripción.
10. Cassette de expresión según la reivindicación 9, que comprende, además, un marcador.
11. Cassette de expresión según la reivindicación 9, en el que dicha secuencia de control de expresión se selecciona entre una secuencia de control de expresión funcional en células y organismos procariotas y una secuencia de control de expresión funcional en células y organismos eucariotas.
12. Un vector recombinante que comprende una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
13. Vector según la reivindicación 12, en el que dicho vector recombinante es un vector viral.
14. Vector según la reivindicación 13, en el que dicho vector viral es un vector viral capaz de infectar plantas, algas o células de animales no humanos, preferntemente células de insectos o de larvas de los mismos.
15. Una célula infectada con un vector viral según las reivindicaciones 13 ó 14.
16. Una célula transformada que comprende un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, o una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
17. Célula transformada según la reivindicación 16, que comprende dos o más vectores recombinantes que contienen secuencias codificantes del mismo producto de interés donde dicho producto de interés se selecciona entre el péptido 2L21 del Parvorius Canino o el péptido de unión a la dineína de la proteína p54 del virus de la Peste Porcina Africana.
18. Una célula transgénica que comprende una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
19. Célula transgénica según la reivindicación 18, en la que dicha célula es una célula vegetal y comprende, insertada en su genoma o en el genoma de un cloroplasto, dicha construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o dicho cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
20. Una planta transgénica que comprende, al menos, una célula transgénica según la reivindicación 18 ó 19.
21. Célula transgénica según la reivindicación 18, en la que dicha célula es una célula animal , preferentemente una célula de insecto de de una larva del mismo.
22. Un célula animal transgénica, preferentemente una célula transgénica de insecto o de larva de insecto.
23. Un método para producir un producto de interés que comprende crecer una célula según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22 bajo condiciones que permiten la producción de dicho producto de interés, donde dicho producto de interés se selecciona entre el péptido 2L21 del Parvorius Canino o el péptido de unión a la dineína de la proteína p54 del virus de la Peste Porcina Africana
24. Método según la reivindicación 23, que comprende, además, el aislamiento y purificación de dicho producto de interés.
25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 24, en el que dicho producto de interés se encuentra en forma de una proteína de fusión dimérica o tetramérica.
26. Un método para expresar un gen que codifica para el péptido 2L21 de CPV en una planta, que comprende transformar dicha planta con una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o con un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, o con un vector según cualquiera de las reivindicciones 12 a 14.
27. Un método para expresar un gen que codifica para el péptido de unión a dineína de la proteína p54 del virus de la Peste Porcina Africana en una célula de insecto o de larva de insectos, que comprende transformar dicha célula con una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o con un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, o con un vector según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.
28. Un péptido o una proteína de fusión obtenibles por expresión de la secuencia de ácido nucleico contenida en una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
29. Proteína o péptido de fusión según la reivindicación 28, que comprende: i. la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio de tetramerización de la proteína p53; y ii. la secuencia de aminoácidos de, al menos, un producto de interés, donde dicho producto de interés se selecciona entre el péptido 2L21 del Parvorius Canino o el péptido de unión a la dineína de la proteína p54 del virus de la Peste Porcina Africana.
30. Proteína o péptido de fusión según la reivindicación 29, que comprende la secuencia de aminoácidos de más de un producto de interés.
31. Proteína de fusión según cualquiera de la s reivindicaciones 28 a 30, que comprende, además, (a) un péptido espaciador entre el producto de interés y el dominio de tetramerización; y/o (b) un péptido para facilitar el aislamiento o purificación del péptido o proteína de fusión; y/o (c) una secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos.
32. Una vacuna recombinante que comprende una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, en la que dicho producto de interés comprende un péptido o proteína inmunogénico, donde dicho péptido se selecciona entre el péptido 2L21 del Parvorius Canino o el péptido de unión a la dineína de la proteína p54 del virus de la Peste Porcina Africana y, opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
33. Vacuna según la reivindicación 32, caracterizada por ser una vacuna univalente .
34. Vacuna según la reivindicación 32 caracterizada por ser una vacuna multivalente.
35. Vacuna según la reivindicación 32, que comprende: i. la secuencia de aminoácidos correspondiente a un dominio de tetramerización de la proteína p53; y ii. la secuencia de aminoácidos de, al menos, un péptido o proteína inmunogénico donde dicho péptido se selecciona entre el péptido 2L21 del
Parvorius Canino o el péptido de unión a la dineína de la proteína p54 del virus de la Peste Porcina Africana.
36. Uso del dominio de teramerización de la proteína p53 para fabricar construcciones génicas que comprendan fusionada al ácido nucleico que codifica y expresa dicho dominio, al menos una secuencia de ácido nucleico que codifique y exprese al menos un producto de interés seleccionado entre un péptido o una proteína.
37. Uso según la reivindicación 36 caracterizado porque la proteína de interés expresada es un enzima.
38.- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 36 o 37 caracterizado porque el enzima expresado es un enzima capaz de degradar o hidrolizar celulosa.
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