CZ20021303A3 - Virové částice s exogenními epitopy uvnitř částice - Google Patents

Description

Virové částice s exogenními epitopy uvnitř částice

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká exprese peptidů na virových částicích a obzvláště exprese peptidů uvnitř virové kapsidy.

Dosavadní stav techniky

Vakcíny jsou jeden z největších úspěchů biologických a lékařských věd a veřejného zdravotnictví vůbec. Na začátku 20. století byla ve Spojených Státech infekční onemocnění široce rozšířena a vybírala si v populaci obrovský počet obětí. Například v roce 1900 bylo hlášeno 21 064 případů neštovic a 894 pacientů zemřelo. V roce 1920 bylo hlášeno 469 924 případů spalniček a 7 575 pacientů, bylo hlášeno 147 991 případů diftérie a zemřelo 13 170 pacienti. V roce 1922 bylo hlášeno 107 473 případů černého kašle a zemřelo 5099 pacientů. Tato onemocnění byla ve Spojených Státech převážně eliminována.

Navzdory tomuto úspěchu zemře každý rok více než 5 milionů dětí na celém světě na onemocnění, kterým by mohlo být zabráněno, kdyby existovaly vakcíny. Avšak mnoho současných vakcín musí být uchováváno v lednici, což činí jejich distribuci v rozvojových zemích obtížnou. Navíc pro onemocnění spojovaná s významnou frekvencí morbidity nebo mortality vakcíny buď neexistují nebo nejsou k dispozici. Například více než 250 milionů lidí je chronicky infikováno virem hepatitidy B, malárie způsobuje 1-2 miliony úmrtí každý rok, průjmové onemocnění (například infekce vyvolané rotoviry, Shigella, Vibrio cholera a toxinem produkovaným E. colí) ročně usmrcují velké množství odhadované na 4-5 milionů lidí.

Centrum pro eliminaci nemocí (Center for Disease Control) určilo několik faktorů pro dosažení plného potenciálu vakcín (www.cdc.gov/epo/mmwr/preview/mmwrhtml/00056803.htm). Tyto návrhy zahrnují sledování nových přístupů pro podávání a příjem vakcín. Jedním z takových nových přístupů je rozvoj vakcín, které stimulují dva typy imunitních reakcí: humorální reakce zprostředkované B lymfocyty a buněčné reakce zprostředkované pomocnými T lymfocyty.

Ale pokusy vytvořit vakcíny, které stimulují jak humorální tak buněčnou imunitní reakci nebo přednostně indukují buněčnou imunitní reakci, narážejí na obtíže. Například syntetické peptidové vakcíny a rekombinantní proteinové vakcíny jsou často špatně imunogenní a mají tendenci indukovat humorální reakce a neindukují buněčné imunitní reakce. DNA vakcíny mohou indukovat jak humorální tak buněčné imunitní reakce. Ale otázkou zůstává, jaké budou následky dlouhodobé exprese antigenu.

V souladu s tím jsou v oboru potřebné zlepšené mechanismy podávání (aplikace) vakcíny. Konkrétně by byl velmi užitečný takový mechanismus aplikace, který indukuje jak buněčné tak humorální imunitní reakce.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká exprese peptidů na virových částicích a obzvláště exprese peptidů uvnitř virové kapsidy. V některých provedeních předkládaný vynález poskytuje sloučeninu obsahující chimérickou virovou částici mající kapsidu, přičemž kapsida má vnitřní stranu a vnější stranu, a kapsida obsahuje alespoň jeden exogenní peptid na vnitřní straně kapsidy. V některých výhodných provedeních je virová částice schopná sestavení („assembling) v hostitelské buňce nebo tkáni. V některých provedeních je virová částice ikosaedrická. V některých výhodných provedeních je virová částice comovizus. V některých obzvláště výhodných provedeních je virová částice virus mozaiky vigny (vigna, lat. Vigna sinensis). V některých provedeních je exogenní peptid vložen do obalového proteinu virové částice. V některých výhodných provedeních má exogenní peptid 5 až 20 aminokyselin. V dalších výhodných provedeních je exogenní peptid vložen v místě 5 až 20 aminokyselin od N-koncové části obalového proteinu. Takové sestavení virové částice není v hostitelské buňce předem vyloučeno. V některých obzvláště výhodných provedeních je exogenní peptid vložen do VP-S viru mozaiky vigny mezi tyrosinový zbytek v poloze 11 a duplikovaný tyrosinový zbytek v poloze 12. V dalších obzvláště výhodných provedeních je exogenní peptid vložen do VP-S viru mozaiky vigny mezi dipeptid obsahující valinový zbytek v poloze 10 a tyrosinový zbytek v poloze 11 a duplikovaný dipeptid obsahující valinový zbytek v poloze 12 a tyrosinový zbytek v poloze 13. V ještě dalších výhodných provedeních je exogenní peptid vložen do VP-S víru mozaiky vigny mezi valinový zbytek v poloze 10 a duplikovaný valinový zbytek v poloze 11. V dalších provedeních virová částice neobsahuje nukleovou kyselinu.

V dalších provedeních exogenní peptid kóduje epitop rozpoznatelný zvířecím imunitním systémem. V některých výhodných provedeních exogenní epitop je epitop cytotoxického T lymfocytu. V obzvláště výhodných provedeních exogenní peptid obsahuje epitop cytotoxického T lymfocytu s hraničními aminokyselinami odvozenými z přirozeně se vyskytujícího zdroje epitopu. V některých provedeních exogenní peptid je epitop pomocného T lymfocytu. V některých výhodných provedeních exogenní peptid obsahuje epitop pomocného s hraničními aminokyselinovými sekvencemi

T lymfocytu odvozenými • · • · pomocného sekvencemi provedeních T lymfocytu z přirozené se vyskytujícího zdroje epitopu. V ještě dalších provedeních exogenní peptid je epitop B lymfocytu. V dalších exogenní peptid obsahuje epitop s hraničními aminokyselinovými odvozenými z přirozeně se vyskytujícího zdroje epitopu.

V některých provedeních chimérická virová částice obsahuje druhý exogenní peptid exprímovaný na vnějším povrchu virové kapsidy. Ve výhodných provedeních je druhý exogenní peptid exprimován na vnějším povrchu virové kapsidy, přičemž peptid je vložen v β<Ζ'-β<3 kličce VP-S viru mozaiky vigny. V dalších výhodných provedeních je druhý exogenní peptid exprimován na vnějším povrchu virové kapsidy, přičemž peptid je vložen v βΒ-βΟ kličce VP-S viru mozaiky vigny. V ještě dalších výhodných provedeních je druhý exogenní peptid exprimován na vnějším povrchu virové kapsidy, přičemž peptid je vložen v βΕ-αΒ kličce VP-L viru mozaiky vigny.

V dalších provedeních předkládaný vynález poskytuje vakcinační přípravek charakterizovaný tím, že obsahuje účinné množství virových částic obsahujících kapsidu, která má vnitřní stranu a vnější stranu, kapsida obsahuje alespoň jeden exogenní peptid, přičemž exogenní peptid je na vnitřní straně kapsidy. V ještě dalších provedeních předkládaný vynález poskytuje přípravek, který obsahuje jako účinnou složku virovou částici obsahující kapsidu mající vnitřní stranu a vnější stranu, kapsida obsahuje alespoň jeden exogenní peptid, přičemž exogenní peptid je na vnitřní straně kapsidy a adjuvans.

V některých provedeních předkládaný vynález poskytuje sloučeninu obsahující virový obalový protein, kde virový obalový protein zahrnuje exogenní peptid, virový obalový protein je utvořen tak, aby se zapojil do virové kapsidy mající vnitřní stranu a vnější stranu, kde exogenní peptid je

• · exprimován na vnitřní straně virové kapsidy.

V dalších provedeních předkládaný vynález poskytuje způsob výroby virové Částice, který zahrnuje poskytnutí hostitelské buňky a nukleové kyseliny kódující virovou částici, přičemž virová částice obsahuje i) virový obalový protein, virový obalový protein obsahuje vnitřní stranu a vnější stranu a ii) exogenní peptid, přičemž exogenní peptid je vložen na vnitřní stranu virového obalového proteinu, transfekci hostitelské buňky nukleovou kyselinou, takže jsou vytvářeny virové částice.

V ještě dalších provedeních se předkládaný vynález týká způsobu indukce imunitní reakce u zvířete, které tuto léčbu potřebuje, přičemž tento způsob zahrnuje podávání zvířeti virové částice obsahující kapsidu mající vnitřní stranu a vnější stranu, kde kapsida obsahuje alespoň jeden exogenní peptid, přičemž exogenní peptid je na vnitřní straně kapsidy.

V ještě dalších provedeních předkládaný vynález poskytuje produkt, který lze získat způsobem zahrnujícím poskytnutí hostitelské buňky a nukleové kyseliny kódující virovou částici, virová částice obsahuje i) virový obalový protein, virový obalový protein obsahuje vnitřní stranu a vnější stranu a ii) exogenní peptid, přičemž exogenní peptid je vložen na vnitřní stranu virového obalového proteinu, transfekci hostitelské buňky nukleovou kyselinou, takže jsou vytvářeny virové částice.

V některých provedeních předkládaný vynález poskytuje komerční balení obsahující virovou částici obsahující kapsidu mající vnitřní stranu a vnější stranu, kde kapsida obsahuje alespoň jeden exogenní peptid, přičemž exogenní peptid je na vnitřní straně kapsidy, jakožto účinnou složku, spolu s pokyny pro její použití.

• · * · • · · ·

V dalších provedeních vynálezu sloučenina obsahuje částice chimérického viru exprimující vnitřní epitop, jak je popsáno v tomto textu v kterémkoliv z příkladů.

V některých provedeních předkládaný vynález poskytuje vektor obsahující nukleovou kyselinu kódující virovou částici, virová částice obsahuje i) virový obalový protein obsahující vnitřní stranu a vnější stranu a ii) exogenní peptid, přičemž exogenní peptid je vložen na vnitřní stranu virového obalového proteinu. Předkládaný vynález není omezen žádným konkrétním typem vektoru. Ve skutečnosti se uvažuje o celé řadě vektorů včetně, ale bez omezení, RNA vektorů (například nukleová kyselina kódující RNA virus obsahující (+) řetězec) nebo DNA vektorů (například plazmidová DNA kódující RNA virus obsahující (+) řetězec). Podobně předkládaný vynález není omezen žádnou konkrétní virovou částicí. Ve skutečnosti se uvažuje o celé řadě virových částic, včetně, ale bez omezení, tyčinkovitých virových částic a íkosaedrických virových částic. Předkládaný vynález není omezen žádným konkrétním rostlinným virem obsahujícím (+) řetězec. Ve skutečnosti celá řada rostlinných RNA virů obsahujících (+) řetězec nalezne použití v předkládaném vynálezu. V některých výhodných provedeních rostlinný RNA virus obsahující (+) řetězec je comovirus. V obzvláště výhodných provedeních rostlinný RNA virus obsahující (+) řetězec je virus mozaiky vigny.

V některých provedeních je obalový protein odvozen z RNA viru obsahujícího (+) řetězec. Předkládaný vynález není omezen na obalové proteiny ze obsahujícího (+) řetězec.

RNA viru uvažuje o žádného konkrétního

Ve skutečnosti se obalových proteinech z celé řady RNA virů obsahujících ( + ) řetězec. V některých výhodných provedeních obalový protein je z rostlinného RNA viru obsahujícího (+) řetězec. Předkládaný vynález není omezen inzercí exogenního peptidu do nějakého konkrétního místa. Ve skutečnosti se uvažuje o inzerci do celé řady míst. V některých provedeních virový obalový protein má N-koncovou část. a exogenní peptid je vložen do polohy 5 až 20 aminokyselin od N-koncové části, takže sestavení virového obalového proteinu není předem vyloučeno. V některých výhodných provedeních virový obalový protein je VP-S viru mozaiky vigny a exogenní peptid je vložen mezi tyrosinový zbytek v poloze 11 VP-S a duplikovaný tyrosinový zbytek geneticky modifikovaný v poloze 12 VP-S. V dalších výhodných provedeních virový obalový protein je VP-S viru mozaiky vigny a exogenní peptid je vložen mezi dipeptid obsahující valinový zbytek v poloze 10 a tyrosinový zbytek v poloze 11 VP-S, a duplikovaný dipeptid obsahující valinový zbytek geneticky modifikovaný v poloze 12 a tyrosinový zbytek geneticky modifikovaný v poloze 13 VP-S.

Předkládaný vynález není omezen na exogenní peptidy nějakého konkrétního typu. Ve skutečnosti může být exprimována celá řada exogenních peptidů ve vektorech podle předkládaného vynálezu. V některých provedeních je exogenní peptid hydrofobní. V dalších provedeních je exogenní peptid epitop cytotoxického T lymfocytu. V dalších provedeních je exogenní peptid epitop pomocného T lymfocytu. V ještě dalších provedeních je exogenní peptid epitop B lymfocytu.

Předkládaný vynález není omezen na vektory kódující pouze jeden exogenní peptid. Ve skutečnosti předkládaný vynález předpokládá, že vektory může být exprimován více než jeden exogenní peptid. V některých provedeních virový obalový protein dále obsahuje druhý exogenní peptid. Ve výhodných provedeních je druhý exogenní peptid vložen na vnější stranu virového obalového proteinu. V některých obzvláště výhodných provedeních virový obalový protein je VP-S mající β(3'-βθ kličku a druhý exogenní peptid je vložen v β<3'-β(3 kličce.

» • 9

V dalších výhodných provedeních virový obalový protein je VP-L mající βΕ-αΒ kličku a druhý exogenní peptid je vložen v βΕ-αΒ kličce.

Vektory podle předkládaného vynálezu také obsahují další složky, jako jsou například regulační prvky. V některých provedeních nukleová kyselina dále kóduje promotor operativně spojený s nukleovou kyselinou kódující virovou částici. Předkládaný vynález není omezen žádným konkrétním promotorem. Ve skutečnosti se uvažuje o celé řadě promotorů, včetně, ale bez omezení, tkáňově specifických rostlinných promotorů a konstitutivních rostlinných promotorů.

V dalších provedeních předkládaný vynález poskytuje způsoby obsahující poskytnutí i) vektoru popsaného výše a ii) hostitelských buněk, a b) transfekci hostitelských buněk vektorem za vzniku transfekovaných hostitelských buněk za takových podmínek, že transfekované hostitelské buňky exprimují virovou částici. Předkládaný vynález není omezen na transfekci žádných konkrétních hostitelských buněk. Ve skutečnosti se uvažuje o transfekci celé řady hostitelských buněk, včetně, ale bez omezení, hostitelských buněk vybraných ze skupiny, kterou tvoří rostlinné buňky, buňky rostlinných tkáňových kultur, rostlinné protoplasty a buňky rostlinných tkání. V ještě dalších provedeních předkládaný vynález obsahuje hostitelské buňky vytvořené těmito způsoby.

V některých provedeních předkládaný vynález poskytuje způsoby obsahující poskytnutí rostlin transfekovaných vektorem popsaným výše a pěstováním rostliny za takových podmínek, že je produkována virová částice. V některých výhodných provedeních způsoby dále obsahují krok purifikace virových částic z rostliny.

V dalších provedeních předkládaný vynález poskytuje • · přípravky obsahující nukleovou kyselinu kódující virový obalový protein obsahující exogenní peptid, virový obalový protein je utvořen tak, aby se sestavil do virové kapsidy mající vnitřní stranu a vnější stranu, kde exogenní peptid je exprimován na vnitřní straně virové kapsidy. Předkládaný vynález není omezen na žádný konkrétní typ nukleové kyseliny. Ve skutečnosti se uvažuje o celé řadě nukleových kyselin, včetně, ale bez omezení, RNA (například nukleová kyselina kódující RNA virus obsahující ( + ) řetězec) nebo DNA (například plazmidová DNA kódující RNA virus obsahující (+) řetězec). Předkládaný vynález také není omezen na žádnou konkrétní virovou částici. Ve skutečnosti se uvažuje o celé řadě virových částic, včetně, ale bez omezení, tyčinkovitých virových částic a ikosaedrických virových částic. Předkládaný vynález není omezen na žádný konkrétní rostlinný virus obsahující (+) řetězec. Ve skutečnosti celá řada rostlinných RNA virů obsahujících (+) řetězec nalezne použití v předkládaném vynálezu. V některých výhodných provedeních rostlinný RNA virus obsahující (+) řetězec je comovirus. V obzvláště výhodných provedeních rostlinný RNA virus obsahující (+) řetězec je virus mozaiky vigny.

V některých provedeních je obalový protein odvozen z RNA viru obsahujícího (+) řetězec. Předkládaný vynález není omezen na obalové proteiny ze žádného konkrétního RNA viru obsahujícího (+) řetězec. Ve skutečnosti se uvažuje o obalových proteinech z celé řady RNA virů obsahujících (+) řetězec. V některých výhodných provedeních obalový protein je z rostlinného RNA viru obsahujícího (+) řetězec. Předkládaný vynález není omezen inzercí exogenního peptidu do nějakého konkrétního místa. Ve skutečnosti se uvažuje o inzerci do celé řady míst. V některých provedeních virový obalový protein má N-koncovou část a exogenní peptid je vložen • · do polohy 5 až 20 aminokyselin od N-koncové části, takže sestavení virového obalového proteinu není předem vyloučeno. V některých výhodných provedeních virový obalový protein je VP-S viru mozaiky vigny a exogenní peptid je vložen mezi tyrosinový zbytek v poloze 11 VP-S a duplikovaný tyrosinový zbytek geneticky modifikovaný v poloze 12 VP-S. V dalších výhodných provedeních virový obalový protein je VP-S viru mozaiky vigny a exogenní peptid je vložen mezi dipeptid obsahující valinový zbytek v poloze 10 a tyrosinový zbytek v poloze 11 VP-S, a duplikovaný dipeptid obsahující valinový zbytek geneticky modifikovaný v poloze 12 a tyrosinový zbytek geneticky modifikovaný v poloze 13 VP-S.

Předkládaný vynález není omezen na exogenní peptidy nějakého konkrétního typu. Ve skutečnosti může být exprimována celá řada exogenních peptidů ve vektorech podle předkládaného vynálezu. V některých provedeních je exogenní peptid hydrofobní. V dalších provedeních je exogenní peptid epitop cytotoxického T lymfocytu. V dalších provedeních je exogenní peptid epitop pomocného T lymfocytu. V ještě dalších provedeních je exogenní peptid epitop B lymfocytu.

Předkládaný vynález není omezen na nukleové kyseliny kódující pouze jeden exogenní peptid. Ve skutečnosti předkládaný vynález předpokládá, že nukleovými kyselinami může být kódován více než jeden exogenní peptid. V některých provedeních virový obalový protein dále obsahuje druhý exogenní peptid. Ve výhodných provedeních je druhý exogenní peptid vložen na vnější stranu virového obalového proteinu. V některých obzvláště výhodných provedeních virový obalový protein je VP-S mající βζν-β(Ζ kličku a druhý exogenní peptid je vložen v β<3'-β<3 kličce. V dalších výhodných provedeních virový obalový protein je VP-L mající βΕ-αΒ kličku a druhý exogenní peptid je vložen v βΕ-αΒ kličce.

Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu také obsahují další složky, jako jsou například regulační prvky. V některých provedeních nukleové kyseliny dále kódují promotor operativně spojený s nukleovou kyselinou kódující virovou částici. Předkládaný vynález není omezen na žádný konkrétní promotor. Ve skutečnosti se uvažuje o celé řadě promotorů, včetně, ale bez omezení, tkáňově specifických rostlinných promotorů a konstitutivních rostlinných promotorů.

V ještě dalších provedeních předkládaný vynález poskytuje virové částice obsahující kapsidu mající vnitřní stranu a vnější stranu, kapsida obsahuje alespoň jeden exogenní peptid, přičemž exogenní peptid je na vnitřní straně kapsidy. Předkládaný vynález není omezen na žádnou konkrétní virovou částici. Ve skutečnosti, jak bylo popsáno výše, předkládaný vynález zahrnuje celou řadu virových částic. V některých provedeních předkládaný vynález poskytuje rostlinu exprimující virové částice. V dalších provedeních předkládaný vynález poskytuje plody, listy, hlízy, stonky nebo purifikované virové částice izolované z rostliny.

V dalších provedeních předkládaný vynález poskytuje způsoby indukce imunitní reakce zahrnující poskytnutí i) virových částic (popsáno výše) obsahujících velké množství obalových proteinů majících vnitřní stranu a vnější stranu, obalové proteiny obsahují exogenní peptid, přičemž exogenní vnitřní straně obalových proteinů, a b) vystavení pacienta virové částici za takových podmínek, že se u pacienta vyvine imunitní reakce na exogenní peptid. V některých výhodných provedeních jsou virové částice poskytnuty z rostlinného zdroje.

peptid je na ii) pacienta, a

V ještě dalších provedeních předkládaný vynález poskytuje vektory obsahující nukleovou kyselinu kódující sekvence virového obalového proteinu, které mají v sobě vloženou sekvenci exogenního peptidů, vírový obalový protein obsahuje místo druhé mutace tak, že virový obalový protein je schopen sestavení na virové kapsidě. Předkládaný vynález není omezen na žádné konkrétní místo druhých mutací. Ve skutečnosti se uvažuje o celé řadě míst druhé mutace, včetně, ale bez omezení, míst druhé mutace v obou VP-S a VPL viru mozaiky vigny. V obzvláště výhodných provedeních místo druhé mutace je vybráno ze skupiny, kterou tvoří F91S ve VP-S, F180L ve VP-S, M177V ve VP-S, I124V ve VP-S, R2102K ve VP-L, I2045M ve VP-L, M177T ve VP-S, A2092T ve VP-L, G80D ve VP-S.

V některých provedeních předkládaný vynález poskytuje způsoby indukce míst druhé mutace ve virovém obalovém proteinu zahrnující poskytnutí i) vektoru obsahujícího nukleovou kyselinu kódující virovou částici, virová částice obsahuje virový obalový protein, virový obalový protein obsahuje vnitřní stranu a vnější stranu a ii) cizorodého peptidů, přičemž cizorodý peptid je vložen na vnitřní stranu virového obalového proteinu a ii) první hostitelské rostliny, infekci první hostitelské rostliny vektorem, takže virová částice je exprimována, monitorování první hostitelské rostliny, dokud se neobjeví pozdní léze (např. v přímo infikovaných listech), izolaci virových částic z pozdních lézí za poskytnutí izolovaných virových částic, a inokulaci druhé hostitelské rostliny za zisku sekundární infekce. V některých provedeních způsoby dále zahrnují krok monitorování druhé hostitelské rostliny na výskyt systémových symptomů. V některých výhodných provedeních se systémové symptomy objeví v časovém rámci srovnatelném s rámcem rostlin infikovaných kontrolními virovými částicemi. V dalších provedeních způsoby dále zahrnují kroky způsobu uvedené v nároku 84, dále zahrnují kroky izolace virových částic ze systémových lézí, kde virové částice obsahují genom, a sekvencování genomu virových částic.

• ·

V některých provedeních předkládaný vynález poskytuje virové částice vytvořené tímto způsobem.

V některých provedeních předkládaný vynález poskytuje vakcinační přípravek obsahující virovou částici obsahující kapsidu mající vnitřní stranu a vnější stranu, kapsida obsahuje alespoň jeden exogenní peptid, přičemž exogenní peptid je na vnitřní straně kapsidy. V dalších provedeních předkládaný vynález poskytuje způsoby indukce humorální imunitní reakce, které obsahují podávání vakcinačního přípravku zvířeti.

V ještě dalších provedeních předkládaný vynález poskytuje způsoby zesílení imunitní reakce na epitop B lymfocytu zahrnující poskytnutí i) modifikované virové částice obsahující epitop B lymfocytu a vnitřní CTL epitop v imunogenním komplexu, a ii) zvíře, a podávání modifikované virové částice zvířeti. Předkládaný vynález není omezen na konkrétní CTL epitop. Ve skutečnosti se uvažuje o celé řadě CTL epitopů včetně, ale bez omezení, 2F1C peptidového mimotopu skupiny (třídy) „a determinanty povrchového antigenu viru hepatitidy B.

Předkládaný vynález také poskytuje způsoby zesílení imunitní reakce na epitop B lymfocytu zahrnující poskytnutí i) modifikované virové částice obsahující epitop B lymfocytu a vnitřní CTL epitop v antigenním komplexu, a zvíře, a b) podávání chimérických virových částic (CVP) jako vakcín představuje poutavou strategii pro zlepšení skladování a dodávku vakcín. Použití CVP je popsáno v patentech Spojených Států č. 5 874 087 a 5 958 422 (každý z nich je zahrnut v tomto textu v odkazech). Tyto patenty popisují vývoj vektorů kódujících modifikované genomy viru mozaiky vigny (CPMV) obsahující peptidové inzerty do obalového proteinu. Vektory jsou použitelné pro produkci virových částic, ve kterých je »

peptid prezentován na povrchu virové částice.

Po části popisu, kde jsou uvedeny definice, jsou popsány expresní systémy virových částic, peptidové inzerty a místa inzerce a použití modifikovaných virových částic.

Definice

Pro snadnější porozumění popisu vynálezu je níže definován značný počet termínů používaných v popisu.

Termín „virová částice, jak se v tomto textu používá, se týká plně nebo částečně sestavené kapsidy viru. Virová částice může nebo nemusí obsahovat nukleovou kyselinu.

Termín „virová kapsida, jak se v tomto textu používá, se týká proteinového obalu, který obklopuje virovou nukleovou kyselinu ve viru divokého typu. Virové kapsidy mají vnitřní povrchy a vnější povrchy. Vnitřní povrch virové kapsidy je povrch, který je normálně vystaven virové nukleové kyselině. Vnější povrch virové kapsidy je povrch, který je obecně vystaven okolí.

Termín „virový obalový protein, jak se v tomto textu používá, se týká proteinu, který interaguje s dalšími proteiny při sestavení a tvoří část virové kapsidy. Příklady virových obalových proteinů obsahují, ale bez omezení, VP-S a VP-L obalové proteiny viru mozaiky vigny. Vnitřní strana virového obalového proteinu je část obalového proteinu, která je exponována vnitřnímu povrchu virové kapsidy. Vnější strana virového obalového proteinu je část obalového proteinu, která je exponována vnějšímu povrchu virové kapsidy.

Termín „RNA virus obsahující (+) řetězec, jak se v tomto textu používá, se týká viru majícího RNA genom, přičemž izolovaná RNA je přímo infekční při zavedení do vhodného • · 9 » · hostitele. Je známo, že RNA viry obsahující (+) řetězec infikují celou řadu zvířat, hub a rostlinných hostitelů. Příklady RNA virů obsahujících (+) řetězec zahrnují, ale bez omezení, pikornaviry (například polioviry) a viry z následujících čeledí: Caulimoviridae, Bromovíridae, Comoviridae, Geminiviridae, Reoviridae, Partítiviridae, Sequiviridae, Tobamoviry a Tombusviridae.

Termín „symptomy při používáni v odkazech na infekci rostlinným virem se týká výskytu indikátorů virové infekce v rostlinách. Tyto indikátory systémové symptomy. Lokální nekrotické léze, chlorotické vyskytují v místě infekce nebo se vyskytují na celé rostlině a zakrslost, žloutnutí a nekrózu.

j sou	jak	lokální léze tak
léze,	jako jsou například
léze	a	kroužkovitost, se
blízko	ní.	Systémové symptomy

zahrnují mozaiky, skvrnitost,

Termín „systémová infekce, jak se v tomto textu používá, se týká virových infekcí, které se šíří z místa původní infekce. V rostlinách systémová infekce nastane, když se viry pohybují z infikovaných buněk do cévních svazků (například floemu) rostliny. U mnoha virů je tento pohyb zprostředkováván „pohybovým proteinem, který modifikuje plazmodezmy.

Termín „ikosaedrická při používání v odkazech na virovou kapsidu nebo virovou částici se týká kapsidy projevující obecnou ikosaedrickou symetrii: 5-násobnou rotační symetrii přes každý ze 12 vrcholů, 3-násobnou rotační symetrii kolem osy v centru každé z 20 trojúhelníkových ploch a 3-násobnou rotační symetrii kolem osy v centru každého ze třiceti rohů. Ikosaedry (dvacetistěny) jsou složeny ze 60 identických stavebních jednotek (které mohou obsahovat více než jednu podjednotku) nebo násobků 60 identických stavebních jednotek. Mezijednotkové kontakty nejsou přesně identické všude v kapsidě, ale všechny mezijednotkové vazby vyžadují stejný • ♦ « obecný typ kontaktu, takže mezijednotkové vazby mohou být popsány jako kvasi-rovnocenné. Předpokládá se, že některé ikosaedrické -viry, obzvláště velké ikosaedrické viry (například adenoviry) se mohou odchýlit od strukturních a geometrických kritérií pozorovaných u menších ikosaedrických virů. Příklady ikosaedrických virů zahrnují, ale bez omezení, polioviry, adenoviry a viry z následujících čeledí: Caulimoviridae, Bromoviridae, Comoviridae, Geminívírídae, Reoviridae, Partitiviridae, Sequiviridae a Tombusviridae.

Termín „epitop, jak se v tomto textu používá, se týká antigenní determinanty, což je kterýkoliv úsek makromolekuly se schopností nebo potenciálem vazby ke specifickému receptoru imunoglobulinu nebo T lymfocytu.

Termín „hydrofobní při používání v odkazech na peptid nebo epitop se týká peptidu nebo epitopu, který má přibližně 20 procent nebo více hydrofobních aminokyselinových zbytků (například alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin).

Termín „epitop cytotoxického T lymfocytu, jak se v tomto textu používá, se týká epitopu, který je schopen rozpoznávat cytotoxické T lymfocyty.

Termín „epitop pomocného T lymfocytu, jak se v tomto textu používá, se týká epitopu, který je schopen rozpoznávat pomocné T lymfocyty.

Termín „epitop B lymfocytu, jak se v tomto textu používá, se týká epitopu, který je schopen rozpoznávat B lymfocyt.

Termín „imunitní reakce, jak se v tomto textu používá, se týká reakce zvířete zprostředkované imunitním systémem na antigen nebo imunogen, a může být charakterizována produkcí protilátek a/nebo stimulací buněk zprostředkovávajících imunitu nebo imunitní toleranci.

« ·

Termín „antigenní komplex, jak se v tomto textu používá, se týká komplexu obsahujícího alespoň jeden epitop, který je schopen spojení s imunoglobulinem nebo receptorem buněčného povrchu.

Termín „imunitní komplex, jak se v tomto textu používá, se týká komplexu obsahujícího alespoň jeden epitop, který je schopen vyvolat humorální a/nebo buňkami zprostředkovanou imunitní reakci.

Termín „mimotop, jak se v tomto textu používá, se týká peptidu dostatečně strukturně podobného epitopu, takže indukuje imunitní reakci proti tomuto epitopu, dokonce i když tyto dvě sekvence jsou málo homologní nebo nejsou homologní či podobné na úrovni aminokyselin (v případě peptidového mimotopu) nebo v případě, kdy mimotop představuje strukturní konfiguraci přijatou neproteinovou molekulou, jako je například sacharid, je mimotop schopen reakce s imunitními molekulami namířenými proti tomuto neproteinovému epitopu.

Termín „imunoglobulin, jak se v tomto textu používá, se týká sekretovaného produktu plazmatické buňky (například aktivovaného B lymfocytu) obsahujícího dva polypeptidy těžkého řetězce v komplexu s dvěma polypeptidy lehkého řetězce, které spolu vytvářejí vazebné místo pro proteiny nebo další antigeny.

Termín „proteiny hlavního histokompatibilního systému I, MHC I. třídy, jak se v tomto textu používá, se týká proteinů kódovaných geny hlavního histokompatibilního systému a zapojených do účinné prezentace antigenů CD8+ T lymfocytům.

Termín „proteiny hlavního histokompatibilního systému II, MHC II. třídy, jak se v tomto textu používá, se týká proteinů kódovaných geny hlavního histokompatibilního systému a zapojených do účinné prezentace antigenů CD4 + T lymfocytům.

• · • ···..· · • · · t . <

• · · _ ··

Termín „rostlina, jak se v tomto textu používá, se týká velkého množství rostlinných buněk, které jsou převážně diferencované do struktury, která je přítomná v každém stádiu vývoje rostliny. Tyto struktury zahrnují, ale bez omezení, plod, výhonek, stonek, list, okvětní lístek, apod. Termín „rostlinná tkáň” zahrnuje diferencované a nediferencované tkáně rostlin včetně, ale bez omezení, kořenů, nadzemních částí, listů, pylu, semen, nádorové tkáně a různých typů buněk v kultuře (například jednotlivé buňky, protoplasty, embrya, kalus, apod.). Rostlinná tkáň může být in planta, v orgánové kultuře, tkáňové kultuře nebo buněčné kultuře.

Termín „protoplast, jak se v tomto textu používá, se týká izolovaných rostlinných buněk, ve kterých byly odstraněny buněčné stěny. Obecně jsou protoplasty vytvářeny podle běžných metod (viz například patenty Spojených Států č. 4 743 548, 4 677 066, 5 149 645 a 5 508 184, všechny jsou zahrnuty v tomto textu v odkazech). Rostlinná tkáň může být dispergována ve vhodném médiu majícím vhodný osmotický potenciál (například 3 až 8 hmotnostních procent cukerných polyolů) a obsahujícím jednu nebo více polysacharidových hydroláz (například pektináza, celuláza, apod.) a degradace buněčné stěny probíhala dobu dostatečnou pro získání protoplastů. Po filtraci mohou být protoplasty izolovány centrifugací a pak mohou být resuspendovány pro následné ošetření nebo použití. Regenerace protoplastů udržovaných v kultuře do celé rostliny je prováděna metodami v oboru známými (viz například Evans et al., Handbook of Plant Cell Culture, 1: 124-176, MacMillan Publishing Co., New York (1983], Binding, Plant Protoplasts, p. 21-37, CRC Press, Boča Raton [1985],) a Potrykus and Shillito, Methods in Enzymology, Vol. 118, Plant Molecular Biology, A. A H. Weissbach, Ed., Academie Press, Orlando [1986]).

• ···... · · ;

• ·· · · * * • · · · ·· ♦·

Termín „gen jak se v tomto textu používá, se týká DNA sekvence, která obsahuje kontrolní a kódující sekvence nezbytné pro produkci prekurzoru polypeptidu nebo proteinu. Polypeptid může být kódován kompletní kódující sekvencí nebo kteroukoliv částí kódující sekvence, dokud je zachována požadovaná aktivita proteinu.

„Nukleosid, jak se v tomto textu používá, se týká sloučeniny, kterou tvoří purinová [guanin (G) nebo adenin (A)] nebo pyrimidinová [thymin (T) , uridin (U) nebo cytidin (C) ] báze kovalentně spojená s pentózou, zatímco „nukleotid se týká nukleosidu fosforylovaného v jedné ze svých hydroxylových skupin pentózy.

fosfodiesterovou ve které jsou „Nukleová kyselina, jak se v tomto textu používá, je kovalentně spojená sekvence nukleotidů, ve které 3' poloha pentózy jednoho nukleotidu je připojena vazbou k 5' poloze pentózy dalšího a nukleotidové zbytky (báze) spojeny do specifické sekvence, což je lineární pořadí nukleotidů. „Polynukleotid, jak se v tomto textu používá, je nukleová kyselina obsahující sekvenci, která je delší než přibližně 100 nukleotidů. „Oligonukleotid, jak se v tomto textu používá, je krátký polynukleotid nebo část polynukleotidu. Oligonukleotid typicky obsahuje sekvenci dlouhou přibližně dvě až jedno sto bází. Termín „oligo je někdy použit namísto termínu „oligonukleotid.

Molekuly nukleové kyseliny mají „5'-koncovou část (5' konec) a „3'-koncovou část (3' konec), protože fosfodiesterové vazby nukleové kyseliny probíhají na 5' uhlíku a 3' uhlíku pentózového kruhu mononukleotidových substituentů. Konec nukleové kyseliny, na kterém má být nová vazba k 5' uhlíku, je její 5' koncový nukleotid. Konec nukleové kyseliny, na kterém má být nová vazba k 3' uhlíku, je její 3' koncový nukleotid. Koncový nukleotid, jak se v tomto textu používá, je nukleotid v koncové poloze 3'- nebo 5'-koncové části. DNA molekuly mají „5' konce a „3' konce, protože mononukleotidy- reagují za vzniku oligonukleotidů tak, že 5' fosfát jednoho pentózového kruhu mononukleotidu je připojen ke 3' kyslíku svého souseda v jednom směru prostřednictvím fosfodiesterové vazby. Tudíž konec oligonukleotidu je nazývaný „5' konec, jestliže jeho 5' fosfát není připojen ke 3' kyslíku pentózového kruhu mononukleotidu a „3' konec, jestliže jeho 3' kyslík není připojen k 5' fosfátu následného pentózového kruhu mononukleotidu.

Sekvence nukleové kyseliny, jak se v tomto textu používá, dokonce i když je uvnitř většího oligonukleotidu nebo polynukleotidu, také může mít 5' a 3' konce. V lineární nebo kruhové DNA molekule jsou samostatné prvky uváděny jako tzv. „v protisměru („upstream) nebo 5', či tzv. „po směru („downstream) nebo 3' prvky. Tato terminologie odráží fakt, že transkripce postupuje způsobem od 5' k 3' podél DNA vlákna. Typicky promotor a zesilovač, které řídí transkripci připojeného genu, jsou obecně lokalizovány 5' nebo v protisměru od kódujícího úseku. Ale zesilovače mohou projevit svůj účinek dokonce i když jsou lokalizovány 3' od promotoru a kódujícího úseku. Terminační signál transkripce a polyadenylační signál jsou lokalizovány 3' nebo po směru od kódujícího úseku.

Termín „divoký typ při používání v odkazech na gen se týká genu, který má charakteristické vlastnosti genu izolovaného z přirozeně se vyskytujícího zdroje. Termín „divoký typ při používání v odkazech na genový produkt se týká genového produktu, který má charakteristické vlastnosti genového produktu izolovaného z přirozeně se vyskytujícího zdroje. Gen divokého typu je ten, který je nejčastšji pozorován v populaci a je tedy dohodou nazýván „normální • ·

• · • ^{9 9} • · • · · forma genu nebo forma genu „divokého typu. Na rozdíl od toho se termín „modifikovaný nebo „mutanta při používání v odkazech na -gen nebo genový produkt týká, v daném pořadí, genu nebo genového produktu, který projevuje modifikace v sekvenci a/nebo funkčních vlastnostech (tj. změněné charakteristické vlastnosti) ve srovnání s genem nebo genovým produktem divokého typu. Je nutné poznamenat, že mohou být izolovány přirozeně se vyskytující mutanty, ty jsou identifikovány faktem, že mají změněné charakteristické vlastnosti ve srovnání s genem nebo genovým produktem divokého typu.

Termín „nadměrná exprese („overexpresion), jak se v tomto textu používá, se týká produkce genového produktu v transgenních organizmech, která překročuje stupeň produkce v normálních nebo netransformovaných organizmech. Termín „kosuprese, jak se v tomto textu používá, se týká exprese cizorodého genu, který je podstatně homologní k endogennímu genu, což má za následek supresi exprese jak cizorodého, tak endogenního genu. Termín „změněný stupeň, jak se v tomto textu používá, se týká produkce genového produktu (genových produktů) v transgenních organizmech v množství nebo podílu, který se liší od stupně u normálních nebo netransformovaných organi zmů.

Termín „rekombinantní při používání v odkazech na DNA molekulu se týká DNA molekuly, která je složena ze segmentů DNA spojených dohromady pomocí technik molekulární biologie. Termín „rekombinantní při používání v odkazech na protein nebo polypeptid se týká molekuly proteinu, která je exprimována s použitím rekombinantní DNA molekuly.

Termín „zkoumaná nukleotidová sekvence se týká každé nukleotidové sekvence jejíž manipulace může být odborníkem považována z jakéhokoliv důvodu za žádoucí (například

propůjčení zlepšených vlastností). Takové nukleotidové sekvence zahrnují, ale bez omezení, kódující sekvence strukturních -genů (například reportérové geny, selekční markerové geny, onkogeny, geny lékové rezistence, růstové faktory, apod.) a nekódující regulační sekvence, které nekódují mRNA nebo proteinový produkt, (například promotorové sekvence, polyadenylační sekvence, terminační sekvence, sekvence zesilovače, apod.).

Termín „kódující úsek, jak se v tomto textu používá v odkazech na strukturní gen, se týká nukleotidových sekvencí, které kódují aminokyseliny zjištěné ve vznikajícím polypeptidu jako výsledek translace mRNA molekuly. Typicky je kódující úsek omezen na 5' konci nukleotidovým tripletem „ATG, který kóduje iniciátor methionin a na 3' konci stop kodonem (například TAA, TAG, TGA). Je známo, že v některých případech kódující úsek také začíná nukleotidovým tripletem „TTG „.

Termíny „komplementární nebo „komplementarita, jak se v tomto textu používají v odkazech na polynukleotidy, se týkají polynukleotidů, které jsou příbuzné na základě pravidel pro párování bází. Například sekvence 5'-AGT-3' je komplementární k sekvenci 5'-ACT-3^ř. Komplementarita může být „parciální, kdy pouze některé báze nukleové kyseliny jsou spárovány podle pravidel pro párování bází. Nebo může být „kompletní nebo „totální komplementarita mezi nukleovými kyselinami. Stupeň komplementarity mezi vlákny nukleových kyselin má významné účinky na účinnost a sílu hybridizace mezi vlákny nukleových kyselin. To je důležité zejména v amplifikačních reakcích, a také detekčních metodách, které závisí na vazbě mezi nukleovými kyselinami.

Termín „komplement sekvence nukleové kyseliny, jak se v tomto textu používá, se týká nukleotidové sekvence, jejíž nukleové kyseliny prokazují totální komplementaritu k nukleovým kyselinám sekvence nukleové kyseliny.

Termín „homologie při použití ve vztahu k nukleovým kyselinám se týká stupně komplementarity. Může být parciální homologie nebo kompletní homologie (tj. identita). „Sekvenční identita se týká míry příbuznosti mezi dvěma nebo více nukleovými kyselinami nebo proteiny a je udávána jako procenta s odkazem na celkovou srovnávanou délku. Výpočet identity bere do úvahy ty nukleotidové nebo aminokyselinové zbytky, které jsou identické a ve stejných relativních polohách ve svých příslušných větších sekvencích. Výpočty identity mohou být prováděny algoritmy obsaženými v počítačových programech, jako je například „GAP (Genetics Computer Group, Madison, Wis.) a „ALIGN (DNAStar, Madison, Wis částečně komplementární alespoň částečně inhibuje komplementární sekvenci při kyselině a je nazývána „v podstatě homologní. komplementární sekvence k cí

.) ·

sekvence je	sekvence	, která
(nebo s ní	kompetuje;	) zcela
hybridizaci	k cílové	nukleové
s použitím	funkčního	termínu
Inhibice hybridizace	zcela
ové sekvenci	může být	zkoumána

s použitím hybridizačního testu (Southern nebo Northern blot, hybridizace v roztoku apod.) za podmínek nízké stringence. V podstatě homologní sekvence nebo sonda kompetuje a inhibuje vazbu (tj . hybridizaci) sekvence, která je zcela homologní s cílovou sekvencí v podmínkách nízké stringence. Tím není řečeno, že podmínky nízké stringence jsou takové, že je umožněna nespecifická vazba, podmínky nízké stringence vyžadují, že vazba dvou sekvencí k sobě navzájem je specifická (tj. selektivní) interakce. Absence nespecifické vazby může být testována s použitím druhé cílové sekvence, která postrádá dokonce i parciální stupeň komplementarity (například identita menší než přibližně 30 procent), při absenci nespecifické vazby sonda nebude hybridizovat k druhému nekomplementárnímu cíli .

Termín „v podstatě homologní se při používání v odkazech na sekvence dvouvláknové nukleové kyseliny, jako je například cDNA nebo genomový klon, týká každé sondy, která může hybridizovat k jednomu nebo oběma vláknům sekvencí dvouvláknové nukleové kyseliny v podmínkách nízké stringence jak je popsáno níže.

Podmínky nízké stringence při používání v odkazech na hybridizaci nukleových kyselin zahrnují podmínky odpovídající vazbě nebo hybridizaci ve 42°C v roztoku, který tvoří 5x SSPE (43,8 g/1 NaCl, 6,9 g/1 NaH₂PO₄*H₂O a 1,85 g/1 EDTA, pH upraveno na 7,4 s NaOH), 0,1 procento SDS, 5x Denhardtovo činidlo [50x Denhardtovo činidlo obsahuje na 500 ml: 5 g fikolu (typ 400, Pharmacia) , 5 g BSA (frakce V, Sigma) ] a 100 μς/ml denaturované DNA lososího spermatu, pak následovalo promytí v roztoku obsahujícím 5x SSPE, 0,1 procento SDS ve 42°C, když je použita sonda dlouhá přibližně 500 nukleotidů.

Podmínky vysoké stringence při používání v odkazech na hybridizaci nukleových kyselin zahrnují podmínky odpovídající vazbě nebo hybridizaci ve 42°C v roztoku, který tvoří 5x SSPE (43,8 g/1 NaCl, 6,9 g/1 NaH₂PO₄‘H₂O a 1,85 g/1 EDTA, pH upraveno na 7,4 s NaOH), 0,5 procento SDS, 5x Denhardtova činidlo a 100 μg/ml denaturované DNA lososího spermatu, pak následovalo promytí v roztoku obsahujícím 0,lx SSPE, 1,0 procento SDS ve 42°C, když je použita sonda dlouhá přibližně 500 nukleotidů.

Při používání v odkazech na hybridizaci nukleových kyselin se v oboru dobře ví, že mohou být použity četné odpovídající podmínky, aby zahrnovaly podmínky buď nízké nebo vysoké stringence, přitom jsou brány do úvahy faktory, jako je například délka a povaha (DNA, RNA, složení bází) sondy a povaha cíle (DNA, RNA, složení bází, přítomnost v roztoku nebo imobilizace, apod.) a koncentrace solí a dalších složek (například přítomnost nebo absence formamidu, dextransulfátu, polyethylenglykolu) a hybridizační roztok může být změněn, aby se vytvořily podmínky buď nízké nebo vysoké stringence

hybridizace	odlišné od	výše	uvedených podmínek, ale
odpovídáj ící	j im.
Termín	„stringence	při	používání v odkazech na

hybridizaci nukleových kyselin typicky zahrnuje podmínky v rozmezí od přibližně T_m -5°C (5°C pod T_m sondy) do přibližně 20°C až 25°C pod T_m. Jak odborník rozumí, stringentní hybridizace může být použita k identifikaci nebo detekci identických polynukleotidových sekvencí nebo k identifikaci nebo detekci podobných nebo příbuzných polynukleotidových sekvencí. Ve „stringentních podmínkách zkoumané sekvence nukleové kyseliny hybridizují ke svému přesnému komplementu a těsně příbuzným sekvencím.

Polypeptidové molekuly mají „amino-koncovou část (N-koncová část) a „karboxy-koncovou část (C-koncová část), protože peptidové vazby se vyskytují mezi hlavním řetězcem aminoskupiny prvního aminokyselinového zbytku a hlavním řetězcem karboxylové skupiny druhého aminokyselinového zbytku. Typicky koncová část polypeptidu, ve které by měla být nová vazba ke karboxy-koncové části rostoucího polypeptidového řetězce a polypeptidové sekvence jsou psány odleva doprava počínaje na amino-koncové části.

Termíny „exogenní peptid nebo „cizorodý peptid, jak se v tomto textu používají, se týkají peptidu, který není ve svém přírodním prostředí (tj . byl změněn rukou člověka). Například gen exogenního peptidu obsahuje peptid, který byl vložen do jiného polypeptidu nebo přidán či fúzován k polypeptidu.

Termín „část - (jako například „část aminokyselinové • · ► · · * ·· ·· sekvence), jak se v tomto textu používá při odkazu na aminokyselinovou sekvenci nebo protein, se týká fragmentů tohoto proteinu. Fragmenty mohou být v rozmezí velikostí od čtyř aminokyselinových zbytků do celé aminokyselinové sekvence bez jedné aminokyseliny.

Termín „fúzní protein, jak se v tomto textu používá, se týká chimérického proteinu obsahujícího zkoumaný protein (například virový obalový protein) připojený k fragmentu exogenního proteinu (například hydrofobní epitop).

Termín „izolovaný když je použit ve vztahu k nukleové kyselině, jako například v izolované sekvenci nukleové kyseliny, se týká sekvence nukleové kyseliny, která je identifikována a oddělena od alespoň jedné kontaminující nukleové kyseliny, se kterou je obyčejně sdružena ve svém přírodním zdroji. Izolovaná nukleová kyselina je nukleová kyselina přítomná ve formě nebo uspořádání, které je odlišné od uspořádání, ve kterém se vyskytuje v přírodě. Na rozdíl od toho neizolované nukleové kyseliny jsou nukleové kyseliny, jako je například DNA a RNA, které jsou zjišťovány ve stavu, ve kterém existují v přírodě. Například daná DNA sekvence (například gen) je zjištěna na chromozomu hostitelské buňky v blízkosti sousedních genů, RNA sekvence, jako je například specifická mRNA sekvence kódující specifický protein, jsou zjištěny v buňce jako směs s četnými dalšími mRNA, které kódují velké množství proteinů. Ale izolovaná sekvence nukleové kyseliny obsahující sekv. id. č. X zahrnuje, jako příklad, takové sekvence nukleové kyseliny v buňkách, které obyčejně obsahují sekv. id. č. X, přičemž sekvence nukleové kyseliny je v chromozomové nebo extrachromozomové poloze odlišné od polohy v přírodních buňkách nebo je jinak ohraničena odlišnými sekvencemi nukleové kyseliny než které jsou nalézány v přírodě. Izolované sekvence nukleové kyseliny • · » · » « ·

mohou být přítomny v jednovláknové nebo dvouvláknové formě. Když má být použita izolovaná sekvence nukleové kyseliny pro expresi proteinu, sekvence nukleové kyseliny obsahuje minimálně alespoň část sense vlákna nebo kódujícího vlákna (tj. sekvence nukleové kyseliny může být jednovláknová). Alternativně může obsahovat obě vlákna, sense a anti-sense (tj. sekvence nukleové kyseliny může být dvouvláknová).

Termín „purifikován, jak se v tomto textu používá, se týká molekuly nebo shluků (agregací) molekul (například virových částic), buď nukleových nebo aminokyselinových sekvencí, které jsou odstraněny z jejich přírodního prostředí, izolované nebo oddělené. Termín „izolovaná sekvence nukleové kyseliny je tudíž purifikovaná sekvence nukleové kyseliny. „V podstatě purifikované molekuly jsou alespoň z 60 procent

bez, výhodně	alespoň	ze 75 bez a	výhodněji alespoň z 90
procent bez	dalších	složek, se	kterými jsou přirozeně
sdruženy.
Termíny	„vektor	a „vehikulum	, jak se v tomto textu

používají, jsou použity zaměnitelně v odkazech na molekuly nukleové kyseliny, které přenášejí DNA segment(y) z jedné buňky do jiné. Vektory mohou obsahovat plazmidy, bakteriofágy, viry, kosmidy apod.

Termín „expresní vektor nebo „expresní kazet, jak se v tomto textu používá, se týká rekombinantní DNA molekuly obsahující požadovanou kódující sekvence a vhodné sekvence nukleové kyseliny nezbytné pro expresi operativně spojené kódující sekvence v konkrétním hostitelském organizmu. Sekvence nukleové kyseliny nezbytné pro expresi v prokaryotech obvykle obsahují promotor, operátor (volitelný) a vazebné místo ribozomu, často spolu s dalšími sekvencemi. Je známo, že eukaryotické buňky používají promotory, zesilovače a terminační a polyadenylační signály.

« ·

Termíny „cílící vektor („targeting) nebo „cílící konstrukt” se týkají oligonukleotidových sekvencí obsahujících zkoumaný gen ohraničený na každé straně rozpoznávací sekvencí, které jsou schopny homologní rekombinace DNA sekvence lokalizované mezi hraničními rozpoznávacími sekvencemi.

Termíny „v operativní kombinaci, „v operativním pořadí,, a „operativně spojený apod., jak se v tomto textu používají, se týkají vazby sekvencí nukleové kyseliny tak, že vzniká molekula nukleové kyseliny schopná řídit transkripci daného genu a/nebo syntézu molekuly požadovaného proteinu. Termín se také týká vazby aminokyselinových sekvencí tak, že vzniká funkční protein.

Transkripční kontrolní signály v eukaryotech zahrnují „promotory a „zesilovače. Promotory a zesilovače se skládají z krátkých sestav DNA sekvencí, které interagují specificky s buněčnými proteiny zapojenými do transkripce (Maniatis, et al., Science, 236:1237, 1987). Promotory a zesilovače byly izolovány z celé řady eukaryotických zdrojů včetně genů ve kvasinkách, hmyzích, savčích a rostlinných buňkách. Promotory a zesilovače byly také izolovány z virů a analogické kontrolní prvky, jako jsou například promotory, jsou také nalézány u prokaryot. Selekce konkrétního promotoru a zesilovače závisí na buněčném typu použitém k expresi zkoumaného proteinu. Některé eukaryotické promotory a zesilovače mají širokou řadu hostitelů, zatímco jiné jsou funkční v omezené podskupině buněčných typů (pro přehled viz Voss, et al., Trends Biochem. Sci., 11:287, 1986, a Maniatis, et al., výše, 1987).

Termíny „promotorový prvek, „promotor nebo „promotorové sekvence, jak se v tomto textu používají, se týkají DNA sekvence, která je lokalizována na 5' konci (tj . předchází) proteinu kódujícího úsek DNA polymeru. Lokalizace většiny promotorů známých v přírodě uvádí transkribovaný úsek.

• · · • ·

Promotor funguje jako vypínač, aktivuje expresi genu. Jestliže je gen aktivován, je transkripce. -Transkripce transkribován nebo se účastní vyžaduje syntézu mRNA z genu.

Promotor tudíž slouží jako transkripční regulační prvek a také poskytuje místo pro iniciaci transkripce genu do mRNA.

Promotory mohou být tkáňově specifické nebo buněčně specifické. Termín „tkáňově specifický pří aplikaci na promotor se týká promotoru, který je schopen řídit selektivní expresi zkoumané nukleotidové sekvence do specifického typu tkáně (například semen) při relativní absenci exprese stejné zkoumané nukleotidové sekvence v jiném typu tkáně (například listech). Tkáňová specifičnost promotoru může být hodnocena například operativní vazbou reportérového genu k promotorové sekvenci za vzniku reportérového konstruktu, čímž se zavede reportérový konstrukt do genom rostliny tak, že reportérový konstrukt je integrován do každé tkáně výsledné transgenní rostliny a detekcí exprese reportérového genu detekcí mRNA, proteinu nebo aktivity proteinu reportérovým genem) v různých tkáních transgenní rostliny. Detekce vyššího stupně exprese reportérového genu v jedné nebo více tkáních relativně ke stupni exprese reportérového genu v dalších tkáních ukazuje, že promotor je specifický pro tkáně, ve kterých jsou detekovány vyšší hladiny exprese. Termín „specifický pro buněčný typ při aplikaci na promotor se týká promotoru, který je schopen řídit selektivní expresi zkoumané nukleotidové sekvence ve specifickém typu buněk při relativní absenci exprese stejné zkoumané nukleotidové sekvence v jiném typu buněk ve stejné tkáni. Termín „specifický pro buněčný typ při aplikaci na promotor také znamená promotor schopný podporovat selektivní expresi zkoumané nukleotidové sekvence v oblasti v jedné tkáni. Specifičnost pro buněčný typ promotoru může být stanovena (například kódovaného • »

·· ·· · · · * s použitím metod v oboru známých, například imunohistochemickým značením. Stručně, tkáňové řezy jsou zality do parafinu a parafinové řezy reagují s primární protilátkou, která je specifická pro polypeptidový produkt kódovaný zkoumanou nukleotidovou sekvencí, jejíž exprese je řízena promotorem. Značená (například konjugovaná s peroxidázou) sekundární protilátka, která je specifická pro primární protilátku, se ponechá navázat k řezům tkáně a specifická vazba je detekována (například s avidinem/biotinem) mikroskopicky.

Promotory mohou být konstitutivní nebo regulovatelné. Termín „konstitutivní při používání v odkazech na promotor znamená, že promotor je schopen řídit transkripci operativně spojené sekvence nukleové kyseliny při absence stimulu (například tepelný šok, chemikálie, světlo, apod.). Typicky jsou konstitutivní promotory schopné řídit expresi transgenu a každé tkáni. Příklady promotorů zahrnují, ale bez omezení, promotor SD viru mozaiky květáku (CaMV SD, viz například patent Spojených Států č. 5 352 605, zahrnut v tomto textu v odkazech), promotor v podstatě v každé buňce konstitutivních rostlinných oktopinsyntázu pro mannopinsyntázu, (ocs), superpromotor (viz například WO 95/14098) a ubi3 (viz například Garbarino a Belknap, Plant Mol. Biol. 24:119-127 [1994]). Tyto promotory byly použity úspěšně k řízení exprese heterologních sekvencí nukleové kyseliny v transformované rostlinné tkáni.

Na rozdíl od toho „regulovatelný promotor je ten, který je schopen řídit stupeň transkripce operativně spojené sekvence nukleové kyseliny v přítomnosti stimulu (například tepelný šok, chemikálie, světlo, apod.), který je odlišný od stupně transkripce operativně spojené sekvence nukleové kyseliny v absenci stimulu.

• · • · · ·

Termín „regulační prvek, jak se v tomto textu používá, se týká genetického prvku, který kontroluje některé aspekty exprese sekvence(sekvencí) nukleové kyseliny. Například promotor je regulační transkripce operativně regulační prvky jsou prvek, který usnadňuje iniciaci spojeného kódujícího úseku. Další sestřihové signály, polyadenylační signály, terminační signály, apod.

Zesilovač a/nebo promotor mohou být „endogenní nebo „exogenní nebo „heterologní. „Endogenní zesilovač nebo promotor je ten, který je přirozeně spojen s daným genem v genomu. „Exogenní nebo „heterologní zesilovač nebo promotor je ten, který je umístěn vedle genu prostředky genetické manipulace (tj. molekulárně biologickými technikami) tak, že transkripce genu je řízena připojeným zesilovačem nebo promotorem. Například endogenní promotor v operativní kombinaci s prvním genem může být izolován, odstraněn a umístěn do operativní kombinace s druhým genem, a tím vytvoří „heterologní promotor v operativní kombinaci s druhým genem. Předpokládá se celá řada těchto kombinací (například první a druhé geny mohou být ze stejných živočišných druhů nebo z odlišných živočišných druhů.

Přítomnost „sestřihových signálů v expresním vektoru má často za následek vyšší hladiny exprese rekombinantního transkriptu v eukaryotických hostitelských buňkách. Sestřihové signály zprostředkovávají odstranění intronů z primárního RNA transkriptu a skládají se z donorového a akceptorového místa sestřihu (Sambrook, et al., Molekulární Cloning: A Laboratory Manual, 2. Vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York [1989] s. 16,7-16,8). Obecně používané donorové a akceptorové místo sestřihu je sestřihové spojení („splice junction) z 16S RNA z SV40.

Účinná exprese rekombinantních

DNA sekvencí • · v eukaryotických buňkách vyžaduje expresi signálů řídících účinnou terminaci a polyadenylaci výsledného transkriptu. Transkripční terminační signály jsou obecně zjišťovány po směru- od polyadenylačního signálu a jsou dlouhé několik set nukleotidů. Termín „póly(A) místo nebo „póly(A) sekvence, jak se v tomto textu používá, označuje DNA sekvence, které řídí jak terminaci, tak polyadenylaci vznikajícího RNA transkriptu. Účinná polyadenylace rekombinantního transkriptu je žádoucí, protože transkripty postrádající póly(A) konec jsou nestabilní a jsou rychle degradovány. Póly(A) signál používaný v expresním vektoru může být „heterologní nebo „endogenní. Endogenní póly(A) signál je ten, který je zjištěn přirozeně na 3' konci kódujícího úseku daného genu v genomu. Heterologní póly(A) signál je ten, který byl izolován z jednoho genu a umístěn 3' k dalšímu genu. Obecně používaný heterologní póly (A) signál je SV40 poly(A) signál. SV40 póly(A) signál je obsažen v restrikčním fragmentu BamHI/BclI o velikosti 237 bp a řídí jak terminaci, tak polyadenylaci (Sambrook, výše, v 16,6-16,7).

Termíny „infikování a „infekce baktérií se týkají společné inkubace cílového biologického vzorku, (například buňka, tkáň, apod.) s baktérií za takových podmínek, že sekvence nukleové kyseliny obsažené v baktérii jsou zavedeny do jedné nebo více buněk cílového biologického vzorku.

Termíny „bombardování, „ostřelování nebo „biolistické bombardování se týkají tzv. biobalistického procesu zrychlujícího částice proti cílovému biologickému vzorku (například buňka, tkáň, apod.) za účelem poranění buněčné membrány buňky v cílovém biologickém vzorku a/nebo vstupu částic do cílového biologického vzorku. Metody biolistického bombardování jsou v oboru známé (například patent Spojených Států č. 5 584 807, jehož obsah je zahrnut formou odkazu • · · · v tomto textu) a jsou komerčně dostupné (například heliem hnaný urychlovač mikroprojektilů (PDS-1000/He, BioRad).

Termín „mikroporanění při používání v odkazech na rostlinnou tkáň se týká zavedení mikroskopických ranek do této tkáně. Mikroporanění může být dosaženo například bombardováním částicemi, jak bylo popsáno v tomto textu, nebo abrazí tkáně.

Termín „transfekce, jak se v tomto textu používá, se týká zavedení cizorodé DNA do eukaryotických buněk. Transfekce může být uskutečněna celou řadou prostředků v oboru známých, včetně koprecipitace DNA s fosforečnanenm vápenatým, transfekce zprostředkované DEAE-dextranem, transfekce zprostředkované polybrenem, elektroporace, mikroinjekce, lipozomové fúze, lipofekce, protoplastové fúze, retrovirovou infekcí a biolistickou metodou.

Termín „transgenní při používání v odkazech na buňku se týká buňky, která obsahuje transgen nebo jejíž genom byl změněn zavedením transgenu. Termín „transgenní při používání v odkazech na tkáň nebo na rostlinu se týká tkáně nebo rostliny, v daném pořadí, která obsahuje jednu nebo více buněk, které obsahují transgen nebo jejíž genom byl změněn zavedením transgenu. Transgenní buňky, tkáně a rostliny mohou být vytvářeny několika metodami včetně zavedení „transgenu obsahujícího nukleovou kyselinu (obvykle DNA) do cílové buňky nebo integrace transgenu do chromozomu cílové buňky intervencí člověka, jako například metodami popsanými v tomto textu.

Termín „cizorodý gen se týká každé nukleové kyseliny (například genové sekvence), která je zavedena do genomu buňky experimentální manipulací a může obsahovat genové sekvence nalezené v této buňce dokavad zavedený gen obsahuje některé modifikace (například bodovou mutaci, přítomnost selektivního genového markéru, apod.) relativně k přirozeně se vyskytujícímu genu.

Termín „transformace, jak se v tomto textu používá, se týká zavedení transgenu do buňky. Transformace buňky může být trvalá nebo přechodná. Termín „přechodná transformace nebo „přechodně transformován se týká zavedení jednoho nebo více transgenů do buňky při absenci integrace transgenu do genomu hostitelské buňky. Přechodná transformace může být detekována například enzymatickým imunotestem (ELISA), který detekuje přítomnost polypeptidu kódovaného jedním nebo více transgeny. Alternativně, přechodná transformace může být detekována detekcí aktivity proteinu (například β-glukuronidáza) kódovaného transgenem. Termín „přechodná transformanta se týká buňky, která má přechodně zaveden jeden nebo více transgenů. Na rozdíl od toho termín „trvalá transformace nebo „trvale transformován se týká zavedení a integrace jednoho nebo více transgenů do genomu buňky. Trvalá transformace buňky může být detekována hybridizací „Southern blotem genomové DNA buňky se sekvencemi nukleové kyseliny, které jsou schopné vazby k jednomu nebo více transgenům. Alternativně, trvalá transformace buňky může také být detekována polymerázovou řetězovou reakcí genomové DNA buňky, aby se amplifikovaly sekvence transgenu. Termín „trvalá transformanta se týká buňky, která má trvale integrován jeden nebo více transgenů do genomové DNA. Tedy, trvalá transformanta se liší od přechodné transformanty tím, že zatímco genomová DNA z trvalé transformanty obsahuje jeden nebo více transgenů, genomová DNA z přechodné transformanty neobsahuje transgen.

A. Systémy pro expresi virové částice

Pro produkci modifikovaných částic viru podle tohoto vynálezu je virová nukleová kyselina modifikována zavedením nukleotidové sekvence kódující cizorodý peptid (například antigen zvířecího viru) do té části virového genomu, která • · kóduje část obalového proteinu exponovaného dovnitř virové buněk nebo kyselinou a viru. Tento organizmu sklízením postup je kapsidy, infekcí hostitelských modifikovanou _ virovou nukleovou sestavených částic modifikovaného nejlépe prováděn přímou manipulací DNA viru v případě DNA virů nebo manipulací cDNA odpovídající RNA z RNA viru. V souladu s tím poskytuje v některých provedeních předkládaný vynález vektory kódující virovou částici, která byla modifikována tak, aby exprimovala exogenní nebo cizorodý peptid na vnitřním povrchu virové kapsidy. V obzvláště výhodných provedeních sekvence nukleové kyseliny kódující virový obalový protein je modifikována zavedením sekvence kódující exogenní peptid tak, že když je virový obalový protein sestaven na kapsidě, exogenní peptid je prezentován na vnitřním povrchu kapsidy. V dalších provedeních sekvence kódující exogenní peptid je vložena do části virového obalového proteinu tak, že sestavení virového obalového proteinu na kapsidě není v podstatě rušeno nebo porušeno.

Celá řada virových částic nalezne použití v předkládaném vynálezu. Uvažuje se, že oba DNA a RNA viry jsou vhodné pro modifikace metodami popsanými v tomto textu. V obzvláště výhodných provedeních je modifikovaná virová částice rostlinný virus. V dalších výhodných provedeních jsou rostlinné viry výhodně ikosaedrické viry. Doposud všechny rostlinné viry s ikosaedrickou symetrií, u kterých byly objasněny krystalové struktury, jsou charakterizovány přítomností kanonické osmivláknové konformace β-soudku („β-barrel) . Je tudíž pravděpodobné, že to je konfigurace společná pro všechny rostlinné ikosaedrické viry. Tedy výhodný ikosaedrický rostlinný virus může být vybrán ze skupiny, kterou tvoří viry z následujících čeledí: Caulimoviridae, Bromoviridae,

Comoviridae, Geminiviridae,

Reoviridae

Partitiviridae • · · ·

Sequiviridae a Tombusviridae, a následující druhy viru: Luteovirus, Marafiviris, Sobemovirus, Tymovirus, Enamovirus a Ideavirus.

V obzvláště výhodných provedeních je modifikovaná virová částice z čeledi Comoviridae. Comoviry jsou skupina přinejmenším čtrnácti rostlinných virů, které převážně infikují luštěniny. Jejich genomy se skládají ze dvou molekul jednovláknové, pozitivní sense RNA různé velikosti, které jsou samostatně enkapsidovány v isometrických částicích přibližně 28 nm v průměru. Tyto dva typy nukleoproteinových částic jsou nazvány střední (M) a spodní (B) složka jako důsledek jejich chování v hustotním gradientu chloridu česného, RNA v částicích je známa jako M a B RNA, v daném pořadí. Oba typy částic mají identické složení proteinu, který tvoří 60 kopií velkého (VP37, VP-L) a malého (VP23, VP-S) obalového proteinu. Kromě nukleoproteinových částic preparáty comoviru obsahují variabilní množství prázdných (pouze protein) kapsid, které jsou známy jako horní (T) složka.

V případě typického člena skupiny comovirů, viru mozaiky vigny (CPMV) , je známo, že obě M a B RNA jsou polyadenylovány a mají malý protein (VPg) kovalentně připojený k jejich 5' koncové části. Více limitované studie dalších comovirů svědčí pro to, že tyto charakteristické rysy jsou sdíleny RNA všech členů skupiny. Obě RNA z CPMV byly sekvencovány a bylo prokázáno, že se skládají z 3481 (M) a 5889 (B) nukleotidů, nepočítaje póly (A) koncový úsek (van Wezenbeek et al., EMBO J. 2:941-46 [1983], Lomonossoff a Shanks, EMBO J. 2:2253-2258 (1983]). Obě RNA obsahují jeden, dlouhý otevřený čtecí rámec, exprese virových genových produktů nastává syntézou a následným štěpením velkých polypeptidových prekurzorů. Ačkoliv pro infekci celé rostliny jsou nezbytné obě RNA, větší B RNA je schopna nezávislé replikace v protoplastech, ačkoliv • · • · * · • · · · v tomto případě nejsou vytvořeny žádné částice viru (Goldbach et al., Nátuře 286:297-300 [1980]). Toto pozorování ve spojení s dřívějšími genetickými studiemi ustanovilo, že obalové proteiny jsou kódovány M RNA.

Elektronová hustotní mapa CPMV o rozlišení 3,5 Á ukazuje, že existuje jasný vztah mezi CPMV a T=3 rostlinnými viry, jako jsou například tombusviry, konkrétně TBSV („tomato bushy stunt virus) a sobemovirusy, konkrétně SBMV („Southern beán mozaic virus). Kapsidy těchto virů jsou složeny ze 180 identických podjednotek obalového proteinu, které tvoří jedna „β-barrel doména. Ty mohou zaujmout tři odlišné polohy, A, B a C, ve virionech. Bylo prokázáno, že tyto dva obalové proteiny CPMV se skládají ze tří odlišných „β-barrel domén, dvě pocházejí z VP37 a jedna z VP23. Tak spolu s T=3 viry, každá CPMV částice je vytvořena ze 180 „β-barrel struktur. Jedna doména z VP23 zaujímá polohu analogickou k poloze podjednotek A-typu z TBSV a SBMV, zatímco, N- a C-koncové domény z VP37 zaujímají polohy podjednotek C a B typu, v daném pořadí.

Rentgenová difrakční analýza krystalů CPMV a dalšího člena skupiny, BPMV („beán pod mottle virus) ukazuje, že 3-D struktury BPMV a CPMV jsou velmi podobné a jsou typické pro comovirus skupinu obecně. Ve strukturách CPMV a BPMV se každý „β-barrel skládá hlavně z 8 vláken antiparalelního β-listu spojeného kličkami různé délky. Ploché β-listy jsou nazvány B, C, D, E, F, G, H a I listy a spojující kličky jsou nazývány βΒβθ, βϋ-βΕ, βΕ-βΰ a βΗ-βΙ kličky.

Comoviry jsou také strukturně příbuzné zvířecím pikornavirům. Kapsidy pikornavirů se skládají ze 60 kopií každého ze tří různých obalových proteinů VP1, VP2 a VP3, z nichž každý tvoří jedna „β-barrel doména. Jako v případě comovirů, jsou tyto obalové proteiny uvolňovány štěpením • · • · • · polyproteinového prekurzoru a jsou syntetizovány v pořadí VP2VP3-VP1. Srovnání 3-rozměrné struktury CPMV se strukturou pikornavirů ukázalo, že N- a C-koncové domény VP37 jsou odpovídající VP2 a VP3 v daném pořadí a že VP23 je odpovídající VPl. Ekvivalence mezi strukturální polohou a pořadím genů svědčí pro to, že VP37 odpovídá neštěpené formě dvou kapsidových proteinů pikornavirů, VP2 a VP3.

Jeden z hlavních rozdílů mezi comoviry a pikornaviry je, že proteinové podjednotky comovirů postrádají velké inzerce (vložené úseky) mezi vlákny „β-barrels zjištěné u pikornavirů, ačkoliv základní architektura částic je velmi podobná, čtyři kličky (βΒ-βΟ, βϋ-βΕ, βΕ-βΘ a βΗ-βΙ) mezi β-listy nejsou rozhodující pro udržení strukturální integrity virionů, ale podle tohoto vynálezu jsou použity jako místa exprese cizorodých peptidových sekvencí, jako jsou například antigenní místa ze zvířecích virů.

Výhodou virů Comoviridae je, že kapsida obsahuje 60 kopií každého ze dvou ustavujících obalových proteinů, a tím umožňuje, že 60-180 kopií peptidu je prezentováno per virion, přičemž jednotlivé domény obalového proteinu byly manipulovány tak, že exprimují vložené peptidy. V čeledi Comoviridae jsou výhodné virus mozaiky vigny a virus „beán pod mottle, přičemž virus mozaiky vigny je z nich nejvýhodnější.

CPMV je bipartitní RNA virus a aby se manipuloval genom jakéhokoliv RNA viru pro expresi cizorodých peptidů, je žádoucí použít cDNA klony z RNA. V souladu s tím v některých provedeních předkládaný vynález poskytuje cDNA vektory, které kódují virovou částici modifikovanou pro expresi exogenního peptidu uvnitř virové kapsidy. Kompletní cDNA klony obou CPMV RNA molekul jsou k dispozici, které mohou být manipulovány pro inzerci oligonukleotidových sekvencí kódujících exogenní peptid. V některých obzvláště výhodných provedeních vektor je • · • · • · • · · · · 9

	39	• · · ·	• · ·· ·· ····
pCP26. V dalších provedeních	vektor	obsahuje	B RNA	nebo M RNA
nebo variantu nebo homolog	B RNA	nebo	M	RNA.	V některých
provedeních varianta nebo	homolog	je	schopen	hybridizace

k plus nebo minus vláknu B RNA nebo M RNA za podmínek vysoké až nízké stringence. V obzvláště výhodný provedeních varianta nebo homolog obsahují sekvence kódující exogenní peptid.

V některých provedeních je cDNA použita k vytvoření in vitro transkriptů, které jsou infekční při inokulaci do rostlin. V souladu s tím v některých provedeních předkládaný vynález poskytuje RNA vektory, které kódují virovou částicí modifikovanou pro expresi exogenního peptidu uvnitř virové kapsidy. Ale infekčnost transkriptů je významně nižší než infekčnost RNA přírodního virionu, pravděpodobně jako výsledek přítomnosti nevirových zbytků v koncových částech transkriptů. Obtíže mohou také být způsobeny vystavením transkriptů degradačním činidlům během inokulace. Z tohoto důvodu jsou transkripty obvykle stabilizovány tzv. čepičkou na jejich 5' konci. V ještě dalších výhodných provedeních modifikované virové částice také obsahují exogenní peptid, který je prezentován na vnějším povrchu virové kapsidy. Metody prezentace exogenních peptidů na vnější straně virové kapsidy jsou poskytnuty v patentech Spojených Států č. 5 874 087 a 5 958 422, každý z nich je zahrnut v odkazech v tomto textu.

V dalších provedeních je cDNA použita k přímé inokulaci rostlin. V těchto provedeních sekvence kódující modifikovanou virovou částici jsou operativně připojeny k promotoru, který je exprimován v rostlinné tkáni. Promotory, které nalezly použití v předkládaném vynálezu obsahují, ale bez omezení, promotor viru mozaiky květáku (CaMV SD, viz například patent Spojených Států č. 5 352 605, zahrnut v tomto textu v odkazech), genu pro mannopinsyntázu, octopinsyntázu (ocs), superpromotor (viz například WO 95/14098) a ubi3 (viz • · · například Garbarino a Belknap, Plant Mol. Biol. 24:119-127 [1994]). Tato technika překonává některé problémy, na které se naráží při použití transkriptu vytvořených in vitro a je použitelná na všechny rostlinné RNA viry.

V případě DNA viru je do rostliny zavedena samotná DNA. Tímto způsobem je cizorodý peptid nejprve exprimován jako část kapsidového proteinu a je tudíž vytvořen jako část celé virové částice. Peptid může být tedy vytvořen jako konjugovaná molekula zamýšlená pro použití jako taková. Alternativně může být navržena genetická modifikace viru, aby se umožnilo uvolňování požadovaného peptidu aplikací vhodných činidel, která uskuteční štěpení z virové částice.

Aby se tvořil modifikovaný virus v komerčním měřítku, není nutné připravit infekční očkovací látku (DNA nebo RNA transkript) pro každou várku produkce viru. V některých provedeních může být použita původní očkovací látka k infekci rostlin a výsledný modifikovaný virus může být dále přenášen (pasážován) v rostlinách za vzniku celého viru nebo virové RNA jako očkovací látky pro následné várky.

V některých provedeních virová kapsida neobsahuje nukleovou kyselinu. V oboru jsou známy metody pro selektivní, obohacení a purifikaci „prázdných virionů (viz například van Kammen a de Jaeger, Cowpea Mosaic Virus, v: CMI/AAB Description of Plant Viruses 197, Commonwealth Agricultural Bureax [1978], a WO 98/56933, popis je zahrnut formou odkazu v tomto textu).

B. Exprese exogenních peptidů uvnitř virové kapsidy

Jedním z omezení dříve popsaných technologií virové exprese je fakt, že pozitivně nabité peptidy nebo hydrofobní peptidy vložené do jedné povrchové kličky obalových proteinů * « • 9 β · • ·

»	41	• · · · • · · ·	• · · · • · · ·	* · » • · · · · ·
	odstraňuj i	virovou	infekčnost	díky	porušenému	skládání
	proteinu,	agregaci	částice	nebo	porušenému	virovému
	transportu.	Nedostatečná životaschopnost těchto	částic	je

velká překážka pro expresi některých epitopů. Pozitivně nabité epitopy mohou být kompenzovány expresí některých dalších kyselých aminokyselin (například pIMM8, pIMM9, Bendalm-nane et al., J. Mol. Biol 290(1):9-20 [1999]). Exprese hydrofobních zbytků na povrchu ale až doposud byla velmi obtížná. Použití alternativních míst inzerce na povrchu viru problém neřeší. Inzerce epitopů do C-koncové části VP-S, která je také na povrchu, obecně dává podobné charakteristické vlastnosti. Toto omezení technologie činí obtížné exprimovat většinu epitopů T lymfocytů. Objevování nových míst inzerce je popsáno níže.

1. Místa inzerce

Obecně může být exogenní RNA nebo DNA vložena do genomu rostlinného viru v celé řadě konfigurací. Například může být vložena jako adice k existující nukleové kyselině nebo jako substituce části existující sekvence, výběr je určen převážně strukturou kapsidového proteinu a snadností, se kterou adice nebo náhrady mohou být vytvořeny bez interference s kapacitou geneticky modifikovaného viru sestavit se v rostlinách. Stanovení přípustné a nejvhodnější velikosti adice nebo delece pro účely tohoto vynálezu může být dosaženo v každém konkrétním případě experimentem ve světle předkládaného popisu. Zdá se, že použití adičních inzertů nabízí v některých případech větší flexibilitu než náhrady inzertů.

Předkládaný vynález prokazuje inzerci epitopů do virových obalových proteinů tak, že jsou exprimovány na vnitřním povrchu nebo straně virové kapsidy. Obecně, kterákoliv část virového obalového proteinu, která je exponována na vnitřním povrchu sestavené virové kapsidy, je uvažované místo pro • · inzerci epitopu. V některých provedeních předkládaného vynálezu jsou taková místa vybrána analýzou struktur s vysokým rozlišením (například analýza krystalové struktury) virové kapsidy. V dalších provedeních předkládaného vynálezu je virový obalový protein modifikován v určeném místě inzercí epitopu. Vektory (například cDNA nebo RNA vektory) kódující modifikovaný virus jsou pak použity k infekci vhodného hostitele (například protoplasty, rostlinná tkáň nebo celé rostliny). Jestliže nastane infekce (například jak testováno výskytem lokálních lézí v rostlině), pak je místo použitelné pro expresi epitopu. V některých případech sériová selekce infekčního viru identifikuje mutace vedoucí k větší infekčnosti, včetně virových částic schopných systémové infekce (diskutováno detailněji níže).

Předkládaný vynález je znázorněn inzercí cizorodého peptidu do VP-S z CMPV. V některých provedeních je místo inzerce N-koncová část VP-S. V dalších provedeních je cizorodý peptid vložen do místa mezi 5 a 20 aminokyselinami N-koncové části, výhodně mezi 7 a 15 aminokyselinami N-koncové části a výhodněji mezi 9 a 12 aminokyselinami N-koncové části. Ve výhodných provedeních inzerce cizorodého peptidu neruší funkci (například sestavení) viru in vivo.

N-koncová část je, podle výsledků analýzy struktury s vysokým rozlišením, uvnitř virionu, spíše než na vnějším povrchu. Předkládaný vynález není omezen konkrétním mechanismem účinku. Ve skutečnosti porozumění mechanismu účinku není nezbytné pro praxi vynálezu. Nicméně jako strategie pro expresi epitopů v N-koncové části VP-S z CPMV, se jeví žádoucí vložit epitop mezi duplikaci Yll nebo V10Y11. N-koncová část má úlohu v životním cyklu viru, protože je rozpoznávána virovou proteázou během zpracování polyproteinu. Přesná velikost místa rozpoznávání není známa, ale v analogii k místu rozpoznávání mezi VP37 a MP („pohybový protein) je pravděpodobně 10-11 aminokyselin (Verver et al., Virology 242:22-27 [199-8] ) . Prvních 10 aminokyselin z VP-S vyčnívají z β-barrel z VP-S a neinteragují s žádnými dalšími zbytky. Yll označuje hranici mezi N-koncovou částí VP-S a zbytkem malého obalového proteinu a je v hydrofobní kapse vytvořené Q73, R165 a H71. Inzerce v Yll zjevně neruší zpracování polyproteinu.

Další faktory také činí toto místo žádoucí. Distribuce RNA uvnitř CPMV je neznáma. Ale ve střední složce „beán pod mottle' comoviru struktuře. Hlavní v N-koncové části Kryoelektronmikroskopické pravděpodobně existuje je část interakce

VP37. To

RNA pozorována v krystalové RNA-protein se uskutečňují může také být případ CPMV.

obrázky CPMV ukazují, že malý prázdný prostor v osách pětinásobné symetrie, hned pod proteinovou obálkou. Kromě toho N-koncová část VP-S obsahuje dva negativně nabité zbytky, což činí interakce se sacharid-fosfátovým hlavním řetězcem RNA také velmi nepravděpodobné. Tudíž je nepravděpodobné, že inzerce v N-koncové části VP-S interferuje s RNA interakcemi a existuje prostor pro akomodaci cizorodého peptidu. Navíc N-koncová část VP-S je pravděpodobně dobře strukturovaná a pět konců symetrie příbuzné VP23 molekulám ve virionu tvoří prstenec (Lin et al., Journal of Virology 74(1): 493-504 [1999]). B faktory indikují, že aminokyseliny 1-9 jsou flexibilní. Inzerce v tomto úseku nejpravděpodobněji poruší prstenec, ale pravděpodobně neovlivní skládání úseku „β-barrel. Může být relevantní, že analýzy pomocí „pepscan ukazují, že N-koncová část VP-S v CMPV a v celé řadě dalších ikosaedrických rostlinných virech z nejsilnějších epitopů B lymfocytu.

s představou, že tato doména (normálně skrytá v kapsidě) je dočasně exponována dynamickým chováním (tzv. „dýcháním) představuje jeden To je v souhlasu »· · frfr * · * · • » · r r t · t >

• · · * sestaveného virionu.

V souladu s tím v některých provedeních předkládaný vynález poskytuje modifikovaný CPMV mající cizorodý peptid vložený v Yll. V ještě dalších provedeních je cizorodý peptid vložen mezi duplikaci Yll z VP-S. V dalších provedeních předkládaný vynález poskytuje modifikovaný CPMV mající cizorodý peptid vložený mezi duplikaci V10Y11 z VP-S. Předkládaný vynález není omezen na žádný konkrétní mechanismus účinku. Ve skutečnosti porozumění mechanismu účinku není nezbytné pro praxi vynálezu. Ale předpokládá se, že ohraničení cizorodého peptidu duplikaci Yll nebo V10Y11 zachovává hydrofobní kontext Yll.

Duplikace Yll představuje modifikaci virového vektoru genetickým inženýrstvím, která byla vytvořena pro usnadnění cizorodých peptidů v kapsidě CPMV. Obecně bylo akomodace prokázáno obtížné navrhnout další změny aminokyselinové sekvence CPMV, protože mnoho pozorovaných de novo mutací, které nastávají na částicích vystavujících peptidy na vnější straně částice, bylo omezeno na změny v cizorodém peptidu samotném.

Několik epitopů bylo úspěšně vloženo do polohy Yll, což dalo podklad pro velmi dobrou infekci rostlin vigny. Několik konstruktů mělo duplikaci V10Y11, která se ve dvou případech (pNLAL7/pMAL8 a pMV14/pMV15) ukázala být použitelná pro zabránění mutací v epitopu nebo pro učinění konstruktu infekčním. V jednom konstruktu (pTr4) byl duplikován pouze V10 (protože epitop začíná a končí Val), a také v tomto případě byl konstrukt infekční. Tyto výsledky činí žádoucí duplikovat alespoň V10, a jestliže je to možné, V10Y11 v nových konstruktech.

2. Peptidy

Cizorodé peptidy, které mohou být zavedeny do rostlinných virů podle tohoto vynálezu, mohou být vysoce diverzní typy a podléhají pouze omezení z povahy a velikosti cizorodého peptidu a místo, ve kterém jsou umístěny do nebo na virovou částici, neinterferuje s kapacitou modifikovaného viru se sestavit, když jsou pěstovány in vitro nebo in vivo. V širším pojetí mohou být modifikované viry vytvořeny z každého biologicky použitelného peptidu (obvykle polypeptidy), jehož funkce vyžaduje konkrétní konformaci pro jeho aktivitu. Toho může být dosaženo asociací peptidu s větší molekulou (například pro zlepšení jeho stability) nebo způsobem prezentace v konkrétním biologickém systému. Příklady takových peptidů jsou peptidové hormony, enzymy, růstové faktory, antigeny protozoálního, virového, bakteriálního nebo houbového původu, protilátky včetně anti-idiotypových protilátek, imunoregulátory a cytokiny (například interferony a interleukiny) , receptory, adheziny, a části nebo prekurzory každého z předcházejících typů peptidů. Peptid výhodně obsahuje více než 5 aminokyselin.

Předkládaný vynález umožňuje expresi celé řady cizorodých peptidů na vnitřním povrchu virové kapsidy. V některých provedeních je peptid z 5-20 aminokyselin, výhodně ze 7-15 aminokyselin a nejvýhodněji z 8-12 aminokyselin. Ale předpokládá se, že limit velikosti cizorodého proteinu je omezen pouze kapacitou chimérického viru akomodovat cizorodý peptid a ještě být schopen sestavení na infekční virus in planta. Ve výhodných provedeních má cizorodý peptid imunologické vlastnosti. V souladu s tím v některých provedeních je cizorodý peptid antigen nebo imunogen. Příklady epitopů, které byly úspěšně vloženy, jsou poskytnuty v tabulce 1 níže. V některých provedeních epitop je epitop B lymfocytu.

• ·

V dalších provedeních epitop je epitop T lymfocytů.

V některých výhodných provedeních je cizorodý peptid epitop cytotoxického T lymfocytů, který je reaktivní na cytotoxické T lymfocyty. Obecně jsou epitopy T lymfocytů hydrofobní.

V některých provedeních mají epitopy pí větší než 7,0 (například pHBV16, pLCMV2, PVSVI) a jsou hydrofobní nebo obsahují dlouhé hydrofobní úseky (například pLCMV2 a pHBV16). Některé z těchto epitopů byly dříve vloženy do βΒβΟ-kličky z VP-S, za vzniku dobrých (krátký HBV epitop), středních (LCMV epitop) nebo žádných (2F10 peptid) symptomů. V některých výhodných provedeních peptid odpovídá sekv. id. č. 4-17.

V dalších provedeních je peptid kódován sekvencí nukleové kyseliny odpovídající sekv. id. č. 18-31.

Tabulka 1 Shrnutí N-koncových inzertů
Konstrukt	N-koncová část VP-S	Vložená aminokyselinová sekvence	Vložená sekvence nukleové kyseliny	βΑ
CPMV	sekv. id. č. 1 GPVCAEASDV			sekv. id. č. 31 YSPCMIAST
PHBV 15	sekv. id. č. 2 GPVCAEASDVY	sekv. id. č. 4 GYHGSSL	sekv. id. č. 18 Ggttatcatggttcta gtttg	sekv. id. č. 31 YSPCMIAST
PHBV 16	sekv. id. č. 2 GPVCAEASDVY	sekv. id. č. 5 AVYYCTRGYHGSSL	sekv. id. č. 19 gctgtttattattgta ctagaggttatcatgg ttctagtttg	sekv. id. č. 31 YSPCMIAST
PLCMV 2	sekv. id. č. 2 GPVCAEASDVY	sekv. id. č. 6 RPQASGVYMGNLTA Q	sekv. id. č. 20 agacctcaagcttdgg tgttatatgggtaatt tgactgctcaa	sekv. id. č. 31 YSPCMIAST
PMAL 7	sekv. id. č. 2 GPVCAEASDVY	sekv. id. č. 7 SYIPSAEKI Sekv. Id. č. 8 SYIPSAGKI*	sekv. id. č. 21 tcttatattccttctg ctgaaaagatt	sekv. id. č. 31 YSPCMIAST

Tabulka	1	pokračování
Shrnutí	N-	-koncových	inzertů
Konstrukt	N-koncová	část	Vložená		Vložená sekvence	βΑ
			VP-S			aminokyselino-	nukleové
						vá sekvence		kyseliny
PMAL	8		sekv. id.	č.	2	sekv. id.	Č.	sekv. id. č. 21	sekv. id.
			GPVCAEASDVY		SYIPSAEKI		Tcttatattccttctg	č. 32
								ctgaaaagatt	VYSPCMIAST
PMAL	10		sekv. id.	č.	2	sekv. id. č.	7	sekv. id. č. 21	sekv. id.
			GPVCAEASDVY		SYIPSAEKI		Tcttatattccttctg	č. 32
								ctgaaaagatt	VYSPCMIAST
PMAL	11		sekv. id.	č.	2	sekv. id. č.	9	sekv. id. č. 22	sekv. id.
			GPVCAEASDVY		AAASYIPSAEKIA	gcagcggcctcttata	č. 32
						AAA		ttcctctgctgaaaag attgcggccgctgct	VYSPCMIAST
pSEN	1		sekv. id.	č.	2	sekv. id.	č.	sekv. id. č. 23	sekv. id.
			GPVCAEASDVY		10 APGNYPAL		gctcctggtaattatc	č. 31
								ctgctttg	YSPCMIAST
pSEN	2		sekv. id.	č.	2	sekv. id.	č.	sekv. id. č. 24	sekv. id.
			GPVCAEASDVY		11		catggtgaatttgctc	č. 31
						HGEFAPGNYPALWS	ctggtaattatcctgc	YSPCMIAST
						YA		tttgtggtcttatgct
pSEN	3		sekv. id.	č.	2	sekv. id.	č.	sekv. id. č. 24	sekv. id.
			GPVCAEASDVY		11		catggtgaatttgctc	č. 31
						HGEFAPGNYPALWS	ctggtaattatcctgc	YSPCMIAST
						YA		tttgtggtcttatgct
PVSV1		sekv. id.	č.	2	sekv. id.	č.	sekv. id. č. 25	sekv. id.
			GPVCAEASDVY		12		agaggttatgtttatc	č. 31
						RGYVYQGL		aaggttg	YSPCMIAST
pMV	14		sekv. id.	č.	2	sekv. id.	č.	sekv. id. č. 26	sekv. id.
			GPVCAEASDVY		13		ttggatagattggtta	č. 31
						LDRLVRLIG		gattgattggt	YSPCMIAST
pMV	15		sekv. id.	č.	2	sekv. id.	č.	sekv. id. č. 26	sekv. id.
			GPVCAEASDVY		13		ttggatagattggtta	č. 32
						LDRLVRLIG		gattgattggt	VYSPCMIAST
pMV	16		sekv. id.	č.	2	sekv. id.	č.	sekv. id. č. 27	sekv. id.
			GPVCAEASDVY		14		gcagcggccttggata	č. 32
						AAALDRLVRLIGAA A	gattggttagattgat tggggccgctgct	VYSPCMIAST

• · · · ·· · K • ·· · · ·· · * ··· · ···

Tabulka 1 pokračování Shrnutí N-koncových inzertů
Konstrukt	N-koncová část VP-S	Vložená aminokyselinová sekvence	Vložená sekvence nukleové kyseliny	βΑ
HBV 18	sekv. id. č. 2 GPVCAEASDVY	sekv. id. č. 16 MQWNSTTFHQTLQ	sekv. id. č. 29 atgcaatggaactcta ctacttttcatcaaac tttgcaa	sekv. id. č. 32 VYSPCMIAST
pCP 35	sekv. id. č. 2 GPVCAEASDVY	sekv. id. č. 17 AAAAA	sekv. id. č. 30 gcagcggccgctgct	sekv. id. č. 32 VYSPCMIAST
mutace byla pozorována v epitopu pMAL 7.

Použití místa inzerce v N-koncové části VP-S má jasné výhody proti místům inzerce použitých předtím v tom, že je nyní možné exprimovat hydrofobní nebo bazické epitopy. To otevírá celou novou řadu možností pro expresi cizorodých epitopů na CPMV. Protože nové místo inzerce je uvnitř virové částice, není pravděpodobná silná protilátková reakce na vložený epitop. Ale ukázalo se, že skryté N-koncové části mnoha rostlinných virů patří k nejvíce imunogenním částem viru. Nejpravděpodobnější vysvětlení tohoto jevu je dynamické chování (dýchání) částic. Z tohoto důvodů byla testována reakce B lymfocytu na 2F10 peptid v HBV16. Absence jakékoliv a-2F10 protilátky jasně ukazuje, že epitop v tomto konstruktu je skrytý.

3. Místo druhých mutací

Překvapivě bylo zjištěno, že chimérické virové částice obsahující cizorodý peptid v N-koncové části VP-S (tj . vnitřní vystavení částic) jsou obzvláště náchylné k selekci pro mutace ovlivňující sekvenci obalových proteinů in planta v místech • · • ft jiných než v samotné inzerci. Tyto de novo mutace jsou charakterizovány následujícími vlastnostmi: nové mutace se objevují spontánně a jsou selektovány v hostitelské rostlině, a velmi velký podíl mutací nastává v polohách distálně a proximálně k místu inzerce cizorodého peptidu. Je zajímavé, že mnoho mutací vyvolává změny v aminokyselinových sekvencích obalových proteinů lokalizovaných v doménách, o kterých se předpokládá, že jsou zapojeny do interakcí protein-protein mezi podjednotkami kapsidy.

Infekcí hostitelské rostliny novými konstrukty chimérické virové částice obsahujícími internalizovaný epitop, je možné provádět selekci a izolaci nových virových částic, ve kterých jsou změněny aminokyseliny jiné než ty vyskytující se v inzertu. Kromě toho je jasné, že de novo mutace v dané poloze v daném obalovém proteinu mohou vznikat nezávisle kdykoliv a opět vedou k odděleně indukovaným a selektovaným mutacím v přesně stejné poloze v proteinech skládajících kapsidu. Kromě toho fakt, že daný aminokyselinový zbytek může být změněn na různé aminokyseliny (tj. nekonzervativní změny) svědčí pro to, že je důležitější odstranit ze struktury omezení vykonávaná původní aminokyselinou, než stanovit substituci konkrétní aminokyseliny. Navíc substituce aminokyselin jsou přirozeně omezené na ty, které vyplývají z (jednotlivých) bodových mutací v jednoznačných (nedegenrovaných, „non-wobble) polohách v kodonech. Proto je poskytnut způsob identifikace poloh v CPMV kapsidě umožňující selekci kompenzačních mutací („hotspots). Způsob je nezávislý na exprimovaném internalizovaném peptidu a jeho přesném místě inzerce v této kapsidě.

Ještě pozoruhodněji může být vybráno druhé místo, třetí místo a další mutace v obalových proteinech CPMV infekcí hostitelské rostliny chimérou exprimující vnitřně cizorodý « · • · « · peptid. Tam, kde se vyskytne třetí místo a další mutace, je zesílena infekčnost a produktivita nové chimérické virové částice oproti-jejímu protějšku s pouze jednou de novo (pouze druhé místo) mutací. Navíc jestliže je genom změněného viru použit k prezentaci odlišného peptidu, jak infekčnost tak produktivita této virové částice jsou větší ty pozorované u virového vektoru divokého typu exprimujícího stejný peptid. Tedy vynález poskytuje způsob výroby zlepšených virových vektorů schopných vyšší produktivity in planta než analogické CPMV vektory divokého typu.

V souladu s tím v některých provedeních předkládaný vynález také poskytuje vektory obsahující druhé a třetí místo mutací, které zesilují infekčnost virových částic obsahujících inzerce epitopu a způsoby selekce těchto mutací. V některých provedeních jsou mutace ve VP-S, zatímco v dalších provedeních jsou mutace ve VP-L. Sedm druhých míst mutací a dvě třetí místa mutací jsou popsána v tabulce 2 níže. V souladu s tím předkládaný vynález také poskytuje vektorovou banku obsahující celou řadu mutovaných virových vektorů, které mohou býr selektovány na expresi epitopu. Detailní protokol pro selekci a identifikaci těchto mutací je poskytnut v příkladu 12.

Tabulka 2 Shrnutí mutací
Mutace v CMPV RNA2	Mutace v obalovém proteinu	Mutace konstruktu identifikované v:	Mutace konstruktů aplikované na:
T2931C	F91S ve VP-S	pMAL8	pMAL8(=pMALlO )
T3199G	F180L ve VP-S	PSEN1	pSEN2(=pSEN3)
A3188G	M177V ve VP-S	pTT4	pTT4(=pTT7)
A3029G	I124V ve VP-S	pTT4, pPAE14	pTT4(=pTT6)
G2388A	R2102K ve VP-L	pTT4	pTT4(=pTT5)

A2245G	I2045M ve VP-L	pTT4	-
T3189C	M177T ve VP-S	pPAE14	-
G2357A	A2092T ve VP-L	pMUC53	-
G2898A	G80D ve VP-S	pMUC53

Phe91

F91S je na mutace

Předkládaný vynález není omezen konkrétním mechanismem účinku. Ve skutečnosti porozumění mechanismu účinku není nezbytné pro použití předkládaného vynálezu. Nicméně většina mutovaných aminokyselin je pravděpodobně zapojena do intermolekulárních interakcí protein-protein.

styčné ploše dvou sousedních VP23 molekul, rozhodně tuto interakci oslabuje. Phel80 je na styčné ploše VP23 a VP37 molekul a interaguje s Phe2045 a Ala2047. F180L mutace inhibuje tyto interakce. Metl77 má hydrofobní interakci s postranním řetězcem Arg97 z C-domény VP37. Obě mutace M177V a M177T činí tuto interakci nemožnou. Arg2102 je pravděpodobně prostorově blízko k N-koncové části sousední VP37. Existuje intramolekulární interakce s E2121, která je nemožná, když nastane R2102K mutace. Ale některé mutované zbytky jsou skryté v jednom obalovém proteinu a je nemožné předpovídat strukturální důsledky. Možné vysvětlení pro alespoň některé mutace je to, že existuje potřeba snížené stability částice pro zajištění účinné dekapsidace (odstranění kapsidy) viru. Protože N-koncové části VP-S tvoří kruh, vložené epitopy mohou interagovat jeden s druhým a stabilizovat částici virionu.. Vypadá to, že některé epitopy mají mnohem silnější tendenci takto činit, než jiné další. Tedy existuje jasná aplikace pro místa druhé mutace. V některých provedeních předkládaného vynálezu mohou být použity mutace v konstruktech, které samy o sobě nejsou infekční (například pSEN2, viz tabulka 2 výše). Fředpokládá se, že toto zvyšuje rozsah možností pro použití nového místa inzerce. V souladu s tím je použitelným přístupem vytvoření banky vektorů se všemi druhými a třetími místy i

• ··· · ··· mutací, které byly pozorovány, ve kterých mohou být klonovány nové epitopy. V některých provedeních se pak provádí selekce nejživotaschopnějšího vektoru v rostlině.

4. Exprese v kombinaci s externími epitopy

Předkládaný vynález také obsahuje virové částice a vektory kódující virové částice, které exprimují epitopy jak uvnitř tak na vnější straně virové kapsidy. Tyto částice jsou nazývány „amfidisplejové („amphidisplay) chimérické virové částice (ADCVP). Předkládaný vynález není omezen konkrétním mechanismem účinku. Ve skutečnosti porozumění mechanismu účinku není nezbytné pro praxi vynálezu. Nicméně se uvažuje, že koexprese epitopu T lymfocytu a B lymfocytu na virové vést k zesílené imunitní reakci na epitop V souladu s tím v některých provedeních předkládaný vynález obsahuje virovou částici (nebo vektor kódující virovou částici), která exprimuje epitop B lymfocytu na vnější straně virové kapsidy a epitop T lymfocytu uvnitř virové kapsidy. V některých výhodných provedeních virová částice je CMPV a epitop T lymfocytu je vložen v N-koncové části VP-S. V ještě dalších provedeních epitop T lymfocytu je vložen mezi duplikaci Yll nebo V10Y11 a epitop B lymfocytu je vložen buď v βΒβΟ kličce, βΟ'βΟ kličce nebo karboxylové koncové části VP-S nebo βΕαΒ kličce VP-L. Příklady ADVCPs jsou poskytnuty v příkladu 7.

částici může B lymfocytu.

C. Použití modifikovaných virových částic

Vektory a virové částice podle předkládaného vynálezu mají mnoho použití. V některých provedeních jsou virové částice použity k indukci buď imunogenní nebo antigenní reakce u zvířete. Tudíž virové částice jsou použitelné pro ochranu

I

J zvířat, včetně člověka, proti onemocněním vyvolávaným patogeny. V dalších provedeních částice naleznou použití jako vakcíny proti - karcinomům. V dalších provedeních jsou virové částice použity pro výrobu vakcinačního přípravku. Ve výhodných provedeních vakcinační přípravek obsahuje modifikovanou virovou částici a adjuvans (například QS-21). Vakcína je pak podávána zvířeti tak, jak je v oboru známo.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady slouží pro ilustraci určitých výhodných provedení a aspektů předkládaného vynálezu a nejsou zamýšleny omezovat jeho rozsah. V popise, který následuje, jsou použity následující zkratky: M (molární), mM (milimolární), μΜ (mikromolární) , nM (nanomolární), mol (moly), mmol (milimoly), pmol (mikromoly), nmol (nanomoly), g (gramy), mg (miligramy), μς (mikrogramy), pg (pikogramy), 1 (litry), ml (mililitry), μΐ (mikrolitry) , cm (centimetry), mm (milimetry), μπι (mikrometry), nm (nanometry), °C (stupně Celsia), cDNA (kopie nebo komplementární DNA), DNA (deoxyribonukleová kyselina) , ssDNA (jednovláknová DNA) , dsDN7\ (dvojvláknová DNA), dNTP (deoxyribonukleotidtrifosfát), CPMV (virus mozaiky vigny), ADVCP (Amfidisplejová chimérická virová částice), CTL (cytotoxický T lymfocyt), CVP (chimérická virová částice), ELISA (enzymatický imunotest), MP (pohybový protein), VLP (viru podobná částice, „virus-like particle), VP-L (virový protein velký [37 kD obalový protein]), VP-S (virový protein malý [23 kD obalový protein]).

Vektor použitý ve všech experimentech popsaných níže je pCP26. Je odvozen z popsaného pCP7 (Dalsgaard et al., Nat. Biotech. 15, 248-252 [1997]) a skládá se z komerčně dostupného vektoru Bluescript p BS 11 BS SK+ (Stratagene, CA) , který má klonovanou kazetu obsahující konstitutivní rostlinný promotor z viru mozaiky květáku (CAMV 35S) ligovaný k cDNA molekule odpovídající RNA2 infekčního viru mozaiky vigny, ve které byly odstraněny nukleotidy kódující N-koncových 24 aminokyselin a byla geneticky modifikována mutace nt3295 (T-»A) zavádějící místo pro restrikční endonukleázu Pstl. V hlavní sekvenci vektoru byly geneticky modifikovány následující bodové mutace pro vytvoření nových míst pro restrikční endonukleázy: Eco47III (T->C v nt960) a Sáli, (T-»C v ntl005) . Sekvence polylinkeru byla odstraněna mezi Sáli a KpnI. Protože většina polylinkeru byla v tomto konstruktu odstraněna, existuje unikátní EcoO 1091 restrikční místo blízko Nhel místa, které je normálně používáno pro inzerce v βΒβϋ kličce VP-S. To je ukázáno na obrázku 1, který ukazuje klonovací strategii pro inzerci epitopů mezi duplikaci TyRll VP-S CPMV. Tato dvě restrikční místa jsou použita k inzerci oligonukleotidů kódujících různé epitopy.

Pokud není uvedeno jinak, inokulace hostitelských rostlin s cDNA kódující chimérické virové částice popsané v následujících příkladech byla prováděna v podstatě tak, jak bylo ukázáno v práci autorů Daísgaard et al., výše a Dessens & Lomonossoff (J. Gen. Virol. 74, 889-892 [1993)). Aby se dosáhlo současné exprese kombinace N-koncového plus povrchového epitopu na VP-S z CPMV, byly štěpeny dva plazmidy kódující epitopy v odlišném místu inzerce s Nhel a BamHI, což mělo za následek fragmenty o velikosti 1,3 kb a 5 kb. Menší fragment obsahuje sekvence kódující N-koncovou část VP-S a větší fragment obsahuje sekvence kódující βΒβϋ kličku, βΒ'β<3 kličku a C-koncovou část VP-S. Konstrukty obsahující četné epitopy jsou vytvořeny purifikaci fragmentů obsahujících vložené epitopy a jejich ligací s použitím standardních molekulárních biologických technik (Sambrook, J., Fritsch, • ·

E.F. & Maniatis, T. Molecular Cloning -A Laboratory Manual. 2. Vydání. Cold Spring Harbor Laboratory Press [1989]).

Příklad 1

Tento příklad ukazuje expresi peptidu uvnitř virové kapsidy. Konkrétně peptidy odvozené z mimotopu třídy „a determinant povrchových antigenů hepatitidy B jsou vloženy do VP-S z CPMV. Bylo publikováno, že sekvence odvozená z antiidiotypové monoklonální protilátky proti povrchovému antigenů viru hepatitidy B (HBsAg), AVYYCTRGYHGSSLY (sekv. id. č. 33) a vysoce hydrofobní oktamer odvozený z této stejné sekvence (GYHGSSLY, sekv. id. č. 34) jsou účinné pro vyvolání imunitní reakce obdobné reakci, kterou vyvolává samotná „a determinanta povrchového antigenů HBV (viz například patenty Spojených Států č. 5 531 990, 5 668 253, 5 744 135, a 5 856 087, zahrnuty formou odkazu v tomto textu). Stejný peptid vyvolává specifickou reakci pomocných T lymfocytů na HBV. Tedy peptid, nazvaný 2FI0 a jeho deriváty jsou mimotopv „a determinanty. Kvindekamer a oktamer odvozené z 2FI0 mohou být exprimovány na vnějším povrchu CPMV částic. Oktamer je exprimován v βΒβΟ kličce VP-S a v βΕαΒ kličce VP-L (Brennan et al., Microbiology 145: 211-220 [1991]) za vzniku chimérických částic nazvaných v daném pořadí, HBV7 a HBV14. Oba CVP jsou schopny vyvolat infekci u rostlin vigna po inokulaci. quindecamer může být exprimován různě v βΒβΟ kličce VP-S za vytvoření konstruktu známého jako HBV2, v C-koncové části VP-S za vzniku HBV8 a v βΕαΒ kličce VP-L (HBV3) . U těchto tří konstruktů jsou symptomy omezeny na inokulované listy, dokonce i po pasáži purifikovaného viru na další rostliny. Jinými slovy neexistuje selekce in planta chimérických virů • · * ♦ v populaci schopných vyvolat cyklus životaschopné infekce.

Pro překonání tohoto technického omezení jsou oba peptidy exprimovány jako rozdílné inzerty v N-koncové části VP-S. Oktamer (HBV 15) a kvindekamer (HBV 16) jsou vloženy mezi TyRll a SeR12. Tato poloha je vybrána, protože N-koncová část se účastní vazby virové polyproteinové proteázy, o které se předpokládá, že vyžaduje alespoň deset N-koncových aminokyselin. Tudíž požadovaným výsledkem vložení cizorodého peptidu do N-koncové části VP-S je zabránit odstranění vazby proteázy, aby vykonala svou funkci. Za předpokladu, že nativní N-koncová doména obsahuje tyrosinový zbytek v poloze 11, se zdá důležité udržovat přítomnost tohoto zbytku v sousedícím aminokyselinovém motivu. Protože peptidy samotné jsou ukončeny tyrosinovým zbytkem, duplikace TyRll není nezbytná, aby se v tomto případě exprimovaly vnitřně (viz také příklad 2 níže). Ve všech rostlinách inokulovaných cDNA vyvolává HBV15 symptomy u hostitelské rostliny nerozpoznatelné od symptomů vzniklých u CPMV infekce divokého typu. Částice purifikované z 62 gramů listů podle standardního postupu purifikace CPMV (Daisgaard et al., výše) poskytly 64,5 mg. HBV16 vyvolává symptomy u 3 z 5 rostlin inokulovaných cDNA. Ale v rostlinách, které pak byly inokulovány virem purifikovaným z původního infekčního cyklu, byly pozorovány symptomy odpovídající infekci divokého typu. Výtěžek purifikovaného viru z těchto rostlin byl 13 mg z 23 gramů (0,57 mg/gram rostlinného materiálu) podle standardního postupu pro CPMV purifikaci (jak uveden výše) . Oba viry byly analyzovány na denaturačním 15 procentním polyakrylamidovém gelu. Malý obalový protein nevykázal štěpení těchto vnitřních peptidů, jak může být někdy pozorováno u peptidů vystavených v povrchových kličkách CPMV.

• ·

Příklad 2

Tento příklad ukazuje expresi a vnitřní expozici hydrofobního peptidu odpovídajícího epitopu CTL (MAL 7) odvozeného z proteinu obalujícího sporozoa Plasmodium berghei. P. Berghei je jednobuněčné protozoární agens způsobující malárii u člověka. Peptid odpovídající epitopu z proteinu obalujícího sporozoa s aminokyselinovou sekvencí SYIPSAEKI může být exprimován v PBpc-kličce VP-S (za vzniku chimérické virové částice nazvané Mal 4) a ve dvou odlišných polohách v C-koncové části VP-S (za vzniku Mal 5 a Mal 6, v daném pořadí). Stejný peptid může být exprimován v N-koncové části VP-S mezi duplikací tyrosinového zbytku v poloze 11 v proteinu (TyRll viz příklad 1). Tento konstrukt je nazván MAL 7. Zpočátku po inokulaci cDNA kódující modifikovaný CPMV MAL 7 na listy hostitelských rostlin vigna, konstrukt nevyvolával systémové symptomy. Ale po 21 dnech byly viditelné velmi jasné lokální léze na primárních listech dvou z pěti rostlin, což indikuje upevnění infekce zprostředkované inokulovaným CVP. Virus purifikovaný z těchto lokálních lézí byl přenesen přímo do dvou skupin po třech mladých rostlinách vigna. Lokální léze se staly viditelné během 5 dnů a následná systémová infekce následovala během týdne. Tato silně zlepšená životaschopnost se vší pravděpodobností indikuje selekci viru z populace nesoucí de novo mutaci ve svém genomu. RNA z viru purifikovaného 8 dnů po inokulaci na druhé dvě skupiny rostlin vigna byla podrobena RT-PCR a bylo prováděno sekvencováni výsledné cDNA. Analýza odhalila bodovou mutaci, u které bylo pozorováno, že vznikala nezávisle v obou skupinách rostlin a která byla ověřena v každém případě sekvencováním obou plus a minus vláken cDNA vzniklé při reakci RT-PCR. Ale tato reverze se nevyskytuje u 100 procent izolovaných virů, protože v této • ·

• · · · · • · · · · · poloze byla pozorována směs dvou nukleotidů v automaticky prováděné sekvencovací chromatografiiz každé izolace. Ale je pozoruhodné, že v každém případě byl adenosin změněn na guanosin v nukleotidové sekvenci, což způsobilo mutaci Glu na Gly ve vloženém peptidů na úrovni aminokyselin. Když byly horní listy rostlin analyzovány 3 týdny po inokulaci, byla ještě pozorována směs virových genomů, ale mutovaný genom byl přítomný ve zjevně větším množství než originální sekvence, jak bylo usuzováno zkoumáním chromatogramů. To ukazuje, že mutovaný VP-L má kompetitivní výhodu oproti nemutované chimérické částici ve své kapacitě vyvolat a vyvinout systémové šíření viru ve svém hostiteli. Díky mutované sekvenci peptidů tento konstrukt nemůže být použit pro imunologickou analýzu zkoumaného epitopu. Ale znázorňuje dva prvky internalizace peptidů systému. Zaprvé použitelnost duplikace tyrosinového zbytku v nativní sekvenci CPMV genomu ve které byla prokázána inzerce cizorodých peptidů. To je v některých případech nezbytné pro udržování předpokládaného vazebného místa pro proteázu virového polyproteinu. Zadruhé byla prokázána schopnost selekce in vivo změněných chimérických virových částic, jejichž charakteristické vlastnosti jim propůjčují přístupnost k infekci a systémovému šíření v rostlinách vigna. V tomto konkrétním případě změna rekombinantního virového genomu přímo ovlivňuje samotný vložený cizorodý peptid. Mutace ovlivňující peptidy vystavené externě na CPMV mohou být pozorovány v případech, kdy vzniká selekční tlak in planta, protože peptid má náboj, který poruší celkovou rovnováhu pí obalových proteinů kapsidy (viz Definice). Zde popsaný výsledek nebyl předpokládán, protože důvody pro internalizací peptidů jsou, že povrchový náboj vlastní zkoumanému peptidů by neměl představovat zábranu, jakmile je peptid rozmístěn uvnitř virionu. Následující příklad ukazuje zcela nečekaný důsledek internalizace peptidů

v CPMV chimérických částicích.

Příklad 3

Tento příklad ukazuje in vivo vytvoření a následnou izolaci de novo mutací v genomech chimérického viru, které propůjčují selektivní výhodu oproti obdobnému genomu chimérického viru divokého typu v progresi infekce a systémového šíření CVP vnitřně exprimující peptidy MAL 7. Výsledný mutantní chiméra popsaná v příkladu 2 (výše) je překvapivě životaschopná co se týče kapacity rekombinantního viru vyvolat a postoupit „přírodní cyklus infekce, včetně systémového šíření v hostitelské rostlině.

Ale při pokusu eliminovat jakoukoliv strukturální zábranu, která by mohla mít díky selekčnímu tlaku za následek mutaci uvedenou v MAL7 výše, bylo modifikováno místo inzerce. Vyšetření teplotního faktoru krystalové struktury ukazuje, že VallO je v relativně rigidní konformaci, zatímco zbytek Asp9 je velmi flexibilní. To svědčí pro to, že by mělo být možné duplikovat VallOTyRll tak, aby se současně zachovalo vazebné místo proteázy a posunout potenciálně destabilizující nabité zbytky v MAL7 peptidu do polohy blíže k C-koncové části ve VP-S N-koncové části vzhledem k originálnímu VallOTyRll. Výsledná chiméra byla nazvána MAL8.

MAL8 konstrukt byl použit k infekci hostitelských rostlin vigna v oddělené studii. Profil počáteční infekce byl stejný, jako byl pozorován pro MAL 7 v příkladu 2. Detailněji, jedna rostlina z pěti inokulovaných cDNA kódující MAL 8 vyvolala jednu lokální lézi po 21 dnech, což indikovalo limitovanou infekci bez zjevného systémového šíření viru. Virus purifikovaný z lokální léze byl použit k inokulaci čerstvých • · ·* ·· 4 » ·*·· ···♦ • ··· · * 4 · • ·· ··· » « φ « *··· ·»·· *· ·· · · ·· rostlin vigna. Symptomy systémového šíření chimérické virové částice v rostlině byly detekovatelné po 5 dnech. To byl ukazatel zlepšené infekčnosti nejpravděpodobněji v důsledku mutace ve virovém genomu. Genomy viru izolovaného z druhého kola infekce s MAL 8 byly předány na cDNA s použitím RT-PCR a gen kódující VP-S byl sekvencován podél obou vláken. De novo mutace byla potvrzena v nukleotidové poloze 2931, měnící zbytek thymidin na cytosin, a tím tvořící změnu aminokyseliny fenylalaninu v poloze 191 na serin. Tato nekonzervativní změna nastává v bodu v malém obalovém proteinu, VP-S, který je situován na styčné ploše mezi sousedními VP-S proteiny ve virionu. Tato mutace je zjevné přístupná pro životaschopné in vivo sestavení a systémové šíření chimérické CPMV částice, ve které je peptid vnitřně exprimován. Tato data ukazují, že odlišné de novo mutace přístupné sestavení in planta CVP schopných exprimovat vnitřně cizorodý peptid a schopných vyvolat infekci a systémové šíření v hostitelské rostlině vigna mohou být vybrány s použitím CVP exprimujících vnitřně stejný peptid. To dále prokazuje, že lokalizace mutace ve virové částici, která je pravděpodobně řízena strukturálními zábranami vytvořenými vloženým peptidem, závisí do určité míry na přesném použitém místu inzerce a nikoliv pouze na peptidů samotném.

Příklad 4

Tento příklad ukazuje in vivo postup selekce a izolace de novo mutací v genomech chimérického viru, které propůjčují selektivní výhodu oproti obdobnému genomu chimérického víru divokého typu v progresi infekce a systémového šíření CVP vnitřně exprimující peptidy. Aby se vyloučila možnost, že jev popsaný v příkladech 2 a 3 je omezen na CVP vnitřně exprimující peptidy malárie, byl sledován postup selekce chimérických virových částic vnitřně exprimujících peptidy, ve kterých se vyskytuje předpokládané místo druhé mutace. Mutace přístupné pro zlepšenou životaschopnost (je míněno sestavení do rekombinantních virionu in planta) , infekčnost, systémové šíření nebo produktivitu mohou být vybrány tak, jak je popsáno níže. Pro účely demonstrace postupu je popsána obohacovací a selekční metoda s odkazem na peptid, APGNYPAL, definující GTL epitop odvozený z nukleoproteinu Sendai viru. Stručně, cDNA byla geneticky modifikována tak, aby kódovala chimérickou virovou částici, do které byl vložen peptid (APGNYPAL, sekv. id. č. 10) mezi tyrosinové zbytky, v daném pořadí, polohu 11 amino-koncové části a polohu 20 karboxy-koncové části k peptidu jednou vloženému do VP-S z CPMV. Tyrosin v poloze 20 představuje duplikaci tyrosinu v poloze 11 v nativním VP-S a je použit pro udržování předpokládaného vazebného místa polyproteinové proteázy (jak diskutováno výše). Výsledný konstrukt byl nazván pSENl.

Po inokulaci hostitelských rostlin vigna SENl se pomalu objevovaly symptomy virové infekce. Po 18 dnech byla viditelná systémová infekce na pouze jedné z pěti inokulovaných rostlin. Symptomy na dalších čtyřech rostlinách byly omezeny na lokální léze na inokulovaných listech. Virové částice byly izolovány ze všech čtyř rostlin, ve kterých byla infekce omezena na lokální léze v listech, přičemž viry byly izolovány z jedné léze. Virová genomová RNA, jak byla izolována ex planta, byla reverzně transkribována pomocí RT-PCR. Následné sekvencování obou vláken cDNA takto vytvořených ukazuje, že genomy virů izolovaných ze všech čtyř rostlin obsahují nezměněné sekvence. Po dalších 7 dnech (v den 25 po infekci) bylo pozorováno systémové šíření u 3 z 5 inokulovaných rostlin. Virus byl purifikován ze systémově infikovaných listů a genomová RNA

I • · « * » » · 4 » · · · » · · · ► · · 4 • · · · reverzne odhalila thymidin divokého typu za guanosin. zaveden leucinový zbytek v poloze transkribována. Sekvenční analýza výsledné cDNA de novo mutaci v nukleotidu 3199 měnící zbytek V důsledku toho byl 180 malého obalového proteinu (VP-S) na místo fenylalaninu. Tato mutovaná genomová sekvence koreluje s úspěšnou infekcí rostlin vigna chimérickou CVP exprimující vnitřně peptid odvozený z viru Sendai. To znázorňuje širokou použitelnost interakce rostlinného viru a hostitele jako dynamický prostředek obohacení a selekce nových CPMV genomů kódujících chimérické virové částice schopné akomodace cizorodých peptidů exprimovaných uvnitř kapsidy. Vzato dohromady s příklady 2 a 3, tento příklad ukazuje, že in vivo selekční proces může fungovat a být aplikován na CVP exprimující vnitřně mnoho odlišných peptidů a že mutace přístupné pro lepší infekčnost a systémové šíření CVP mohou nastat v mnoha různých místech v malém obalovém proteinu CPMV.

Příklad 5

Tento příklad ukazuje vnitřní expresi CTL epitopu odvozeného z viru lymfocytární choriomeningitidy (LCMV). Příklady uvedené výše demonstrují, že peptidv s fyzikálně chemickými vlastnostmi, které nepřispívají k expresi externě na CVP, mohou být exprimovány vnitřně. Ale je pravděpodobné, že existuje omezení velikosti peptidů, které mohou být vloženy, aby byly exprimovány vnitřně ve virionu CPMV. Tedy není pravděpodobné, aby cizorodé peptidy přístupné k vnitřní exprese byly delší než 20 zbytků (ačkoliv není nemožné, že empirické experimenty mohou identifikovat peptidy větší délky, které jsou schopné vnitřního rozmístění) . Jedna třída peptidů, které spadají do tohoto rozmezí velikosti, jsou takzvané epitopy cytotoxických T lymfocytů (CTL). Je důležité, že CTL ·» »► <· ·< ·» •·· · ♦ · · ·♦·, *·· · * ♦ · 9 H 4 • · · · · » ♦ . · « « · ,· · · * ·· · · · » '· ·· ·· ♦· ·. ....

epitopy, kromě toho že jsou typicky dlouhé 6-9 zbytků, jsou nezávislé na konformaci. Ve skutečnosti existuje silný důkaz, že CTL epitopy fungují jako lineární epitopy. Tudíž takové epitopy by měly být vysoce přístupné k inzerci vnitřně v CVP. Jeden takový epitop (RPQASGVYMGNLTAQ, sekv. id. č. 6) byl zjištěn na viru lymfocytární choriomeningitidy. Když je vystavena externě na CVP, má tato sekvence problémy způsobené svým vysokým pozitivním nábojem. Tudíž byly přidány tři dodatečné aminokyseliny (glutamová kyselina, glycin a alanin) k její N-koncové části za účelem vytvoření peptidu s neutrálním povrchovým nábojem, když je exprimována externě na CVP. Symptomy vzniklé po infekci na hostitelské rostlině vigna tímto konkrétním konstruktem byly variabilní a nepředvídatelné, protože vytvořený chimérický virus byl podstatně nestabilní. Kromě toho existuje nepříznivé štěpení externě prezentovaného epitopu a u myší nemůže být měřena reakce T lymfocytů specifická pro chimérické virové částice. Aby se potvrdilo, že CTL epitopy vytvářejí důležitou skupinu cizorodých peptidů schopných exprese vnitřně v CVP, byla DNA kódující tento známý CTL epitop viru lymfocytární choriomeningitidy (RPQASGVYMGNLTAQ, sekv. id. č. 6) vložena do N-koncové části VP-S.

Stejný epitop (bez dalších aminokyselin Glu, Gly a Ala), byl vložen do N-koncové části VP-S, do polohy mezi Tyrll a duplikovaný tyrosinový zbytek hned po směru od cizorodého peptidu v konstruktu známém jako LCMV2. DNA inokulace má za následek virové symptomy u 3 z 5 inokulovaných rostlin. Analýza RT-PCR následovaná sekvencováním produktu cDNA ověřila, že sekvence chimérického konstrukt byla nezměněna a koresponduje se sekvencí inokulovanou do rostliny. Výtěžek viru byl 25 mg z 29 gramů listů. Analýza elektroforézou na denaturačním 15 procentním polyakrylamidovém gelu potvrdila, že neexistuje štěpení LCMV peptidu, jak bylo předpokládáno u peptidu, který byl internalizován. Proto bylo prokázáno, že peptid zastupující velkou a imunologicky důležitou skupinu epitopů, epitopy cytotoxického T lymfocytu (CTL), může být exprimován vnitřně v chimérické virové částici. Navíc stejný konkrétní peptid dále potvrdil, že internalizace pozitivně nabitých peptidů v CVP představuje technické řešení nepředvídatelného chování a potenciální nestability CVP exprimujících externě peptidy s těmito charakteristickými vlastnostmi. Navíc to prokazuje, že peptid dlouhý 15 aminokyselinových zbytků může být úspěšně akomodován uvnitř CVP bez požadavku místa druhé mutace.

Příklad 6

Tento příklad ukazuje imunologickou účinnost CTL epitopů exprimovaných vnitřně v chimérických virových částicích. CVP konstrukt popsaný výše, LCMV2, který exprimuje CTL epitop viru lymfocytární choriomeningitidy uvnitř částice, byl použit k imunizaci myší. V den 0 a v den 14 bylo injikováno subkutánně 100 pg QS-21, s adjuvans nebo bez něj. Jako kontrola byl testovacím zvířatům také inokulován CPMV divokého typu s QS-21 a bez něj. V den 42 byly odstraněny sleziny a CTL testy byly prováděny 8 dnů později (viz Current Protocols in Immunology, díl 1, oddíl 3.11.4 a ff). Cytotoxické T lymfocyty purifikovány z myší infikovaných s LCMV2 v QS-21 podporovaly lýzi až 46 procent cílových buněk (obrázek 2). Nebyla pozorována žádná CTL reakce na LCMV2 při absenci adjuvans. U myší inokulovaných CPMV divokého typu nebyla pozorována specifická CTL reakce, s adjuvans nebo bez něj. Kromě CTL reakce byla pozorována velmi silná reakce pomocných * · t # • * ·· • ♦ » β • · · »

T lymfocytů specifická pro epitop v buňkách purifikovaných ze slezin myší injikovaných LCMV2. Z imunologického výkonu LCMV2 konstruktu je. jasné, že CVP s epitopy rozmístěnými uvnitř částice mohou indukovat jak CTL reakci na specifický peptid tak silnou reakci pomocných T lymfocytů specifickou na peptid. Ale u myší imunizovaných s MAL8, VSV1 nebo SEN1 nebyly pozorovány CTL reakce,. To může být způsobeno obtížemi při zpracování epitopu v buňkách prezentujících antigen.

Příklad 7

Tento příklad ukazuje syntézu „amfidisplejových chimérických virových částic (ADCVP, což jsou jednoduché chimérické virové částice exprimující současně epitopy vnitřně a externě na jednom virionu). Schopnost exprimovat peptidy uvnitř stabilní CVP dohromady se schopností (samostatně) exprimovat velkou řadu peptidů externě na stabilní CVP podporuje možnost, že v jedné částici mohou být prezentovány současně alespoň dva peptidy, jeden vnitřně, druhý externě. Konkrétně přítomnost vnitřního epitopu pomocného T lymfocytu může zesílit imunitní reakci na další epitopy společně exprimované externě na stejných částicích. Aby se otestovala tato představa, byl vytvořen epitop (GVSTAPDTRPAPGSTA, sekv. id. č. 35) spojený s variantou polymorfního epitelového mucinového proteinu zjištěného převážně na buňkách solidních nádorů. Imunologický profil tohoto epitopu v CVP byl dobře charakterizován. Kombinace peptidů, o kterých je známo, že reagují ve zvířecích modelech byly vloženy na vybraná místa molekulární genetickou manipulací CPMV genomu. Doposud byla určena tři vnější místa jako životaschopné body inzerce do VP-S pro vnější vystavení peptidů na CVP: 3Bpc klička, βΟ'βϋ • · « 9 • · · klička a karboxyl-koncová část, zatímco čtvrté vnější místo inzerce na CVP je představováno βΕαΒ kličkou VP-L. Aby se testovala účinnost kombinací vnitřních epitopů s vnějšími epitopy na jedné CVP, byly vytvořeny kombinace, jak je ukázáno v tabulce 3 níže.

Tabulka 3 Amphidisplay konstrukty, ve kterých jsou peptidy rozmístěny současně uvnitř a vně na CVP
Jméno konstruktu CVP	Peptid na N-koncové části CVP	Peptid v βΒ-pc kličce VP-S
MUC39	2F10 8-mer	MUC14 peptid
MUC4 0	2F10 15-mer	MUC14 peptid
HCG16	2F10 8-mer	HCG3 peptid
HCG17	2F10 15-mer	HCG3 peptid
Jméno konstruktu CVP	Peptid na N-koncové části CVP	Peptid v βΒ'β0' kličce VP-S
MUC4 7	2F10 8-mer	MUC peptid
MUC 4 8	2F10 15-mer	MUC peptid
Jméno konstruktu CVP	Peptid na N-koncové části CVP	Peptid v C-koncové části VP-S
MUC 41	2F10 8-mer	MUC8 peptid
MUC42	2F10 15-mer	MUC8 peptid

Následující konstrukty vyvolávají dobré symptomy (viz výše): MUC39, HCG16, MUC41, MUC42 a MUC47. Tyto výsledky ukazují, že inzerce v βΒβΟ kličce nebo PC^C kličce VP-S mohou být kombinovány nejúčinněji s malými (8 aminokyselin) inzercemi v N-koncové části VP-S v rozmezí velikosti inzercí ukázaných výše pro toto vnitřní CVP místo. Ale inzerce • · v C-koncové části VP-S nejsou zjevně tak citlivé na velikost inzercí v N-koncové části ve stanoveném rozmezí velikosti inzercí.

Příklad 8

Tento příklad ukazuje imunologickou účinnost amfidisplejových chimérických virových částic (ADCVP) ve vyvolání specifických reakcí pomocného T lymfocytu. Stimulační účinek epitopu pomocného T lymfocytu v N-koncové části na imunitní reakci na epitop B lymfocytu vložený někde jinde byl zkoumán imunologickým srovnáním CVP exprimující externě epitop pomocného T lymfocytu se dvěma odlišnými amfidisplejovými částicemi exprimujícími vnitřně stejný epitop pomocného T lymfocytu ve spojení s odlišnými epitopy B lymfocytu. HBV15 je CVP exprimující oktamer odvozený z 2F10 peptidu ve vnitřním místě (viz příklad 1 výše), MUC39 exprimuje stejný oktamer vnitřně spolu s peptidem odvozeným z lidské varianty mucinu spojené se solidními nádory MUClp (MUC14) exprimovaným externě v βΒβΟ kličce, a MUC42 exprimuje současně stejný 2F10 mimotop vnitřně a peptid odvozený z MUClp (MULL) externě v C-koncové části VP-S (viz předcházející příklad 7).

Tři skupiny po 5 myších byly imunizovány s HBV15, MUC39 nebo MUC42 v přítomnosti QS-21 ve dnech 0 a 21. Séra byla sbírána ve dnech 21, 28 a 42 a vyšetřena na obě 2F10 a MUCIspecifické protilátky testem ELISA. Průměrné titry protilátek specifických pro mucinové peptidy jsou shrnuty v tabulce 4.

• ·

Tabulka 4 Titry specifické pro MUClp peptid na různé CVP konstrukty
Jméno CVP konstruktu	Titr v den 21	Titr v den 28	Titr v den 42
MUC14	51 200	14 703	104 840
MUC39	86 107	52 730	204 800
MUC42	Nedetekovatelný	696	235

V každém časovém bodě vytvořily myši imunizované MUC39 vyšší anti-MUC protilátkové titry (vyšší přibližně o jedno ředění) než myši imunizované MUC14, což svědčí pro to, že zde může být stimulační účinek epitopu pomocného T lymfocytů na anti-MUC reakci B lymfocytů. U myší imunizovaných CPMV-MUC42 tvoří jedna z pěti protilátku specifickou pro MUClp: zatímco když 2F10 není společně exprimován s epitopem pomocného T lymfocytů, netvoří žádná myš protilátku specifickou pro MUC1. Tato reakce byla na mírném stupni v den 28 a titr klesal ode dne 42. Tedy přítomnost 2F10 epitopu pomocného T lymfocynu může zesílit reakci na epitop B lymfocytů znázorněnou Muclp peptidem.

Když byly zkoumány reakce T lymfocytů specifické pro 2F10 (tabulka 5), buňky sleziny z myší imunizovaných MUC39 proliferovaly v reakci na 2F10 peptid. Souhlasně s relativně nízkými hladinami protilátek specifických pro Muclp peptid vyvolanými MUC42 konstruktem (tabulka 5), neexistovala zjevná stimulace proliferace specifických buněk 2F10 peptidem v tomto testu.

• · • · • *

Tabulka 5 Ukazatelé stimulace proliferace T lymfocytů
Jméno CVP konstruktu	Žádná stimulace	Stimulace CPMV divokého typu	Stimulace 2F10 peptidem
MUC39	1	13	14
MUC42	1	28	1
MUC14	1	3	1

Tato data ukazují, že společná stimulace imunitní reakce CTL epitopem může být použita ke spouštění zesílené reakce na společně prezentovaný, ale nepříbuzný peptid.

Příklad 9

Tento příklad ukazuje expresi a internalizaci silného univerzálního epitopů pomocného T lymfocytů selekci dalších de novo mutací v místech jiných než ve vloženém peptidu. Je známo, že epitop pomocného T lymfocytů odvozený z tetanického toxoidu (VDDALINSTKIYSYFPSV, SEKV. ID. Č. 15) má silný imunostimulační účinek v celé řadě organizmů a odpovídající široké rozmezí haplotypů. Aby se dále zesílily imunogenní vlastnosti CPMV jako systému prezentujícího epitop, tetanický toxoid může být zaveden do chimérických virových částic. Aby se toho dosáhlo, byl valin v poloze 10 (VallO) z VP-S nahrazen samotným epitopem. Protože epitop tetanického toxoidu začíná a končí valinovým zbytkem, existuje standardně deset „nativních aminokyselin v N-koncové části mutovaného viru, což je pravděpodobně postačující pro udržení předpokládaného vazebného místa polyproteinové proteázy. Tento výsledný konstrukt byl nazván TT4. Po inokulaci cDNA přímo na rostliny • · vigna (Daisgaard a kol., výše) TT4 konstrukt vykazoval symptomy infekce ode dne 14 dále ve formě lokálních lézí na inokulovaných listech. Systémová infekce hostitelských rostlin neprobíhala. Viry purifikované z těchto lokálních lézí byly přeneseny přímo na mladé rostliny vigna v druhém kole infekce. Lokální léze se staly viditelné během 5 dnů infekce a systémová infekce byla patrná během dalších 7 dnů. Tato zlepšená životaschopnost se vší pravděpodobností ukazuje selekci v populaci virů, ve které se vyskytla de novo mutace ve virovém genomu. RNA z viru purifikovaného 10 dnů po inokulaci druhé skupiny rostlin vigna byla podrobena RT-PCR a bylo prováděno sekvencování výsledné cDNA. Auialýza odhalila několik jednotlivých bodových mutací, které byly ověřeny sekvencováním cDNA opačného vlákna. Dohromady šest de novo mutací bylo pozorováno v různých klonech:

G2388A, která má za následek Arg2102Lys mutaci v VP-L proteinu, (bylo zjištěno, že tato mutace vznikala nezávisle ve třech samostatných klonech),

- A3188G vedla k Metl77Val mutaci ve VP-S proteinu,

- A3029G vedla k Ilel24Val mutaci ve VP-S proteinu, a

- G2388A vedoucí k Ile2045Met mutaci ve VP-S proteinu.

Tiby se otestovalo, zda tyto mutace byly postačující pro to, aby propůjčily TT4 konstruktu infekčnost v primární infekci, byly vytvořeny 3 nové konstrukty používající jako hlavní řetězec vektoru genomy nových chimérických virových částic obsahující, v daném pořadí, ve VP-L), A3188G (Metl77Val ve VP-S) mutace. Rostliny inokulované těmito novými klony vykázaly lokální symptomy infekce 6 dnů po inokulaci a systémové symptomy během dalších 4 dnů. To byla jasná známka toho, že

G2388A (Arg2102Lys a A3029G (Iiel24Val) jednotlivá místa druhé mutace jsou postačující pro to, aby propůjčily upravenému TT4 konstruktu infekčnost.

Tento konstrukt demonstruje několik vlastností inzerce epitopů na vnitřní povrch CPMV. V prvním případě prokazuje, že epitopy pomocných T lymfocytu, jakož i CTL epitopy, mohou být prezentovány jako vnitřně rozmístěné peptidy v CVP.

Kromě toho je jasné, že TyRll nemusí být duplikován, aby vytvořil CVP v rostlinách.

schopné

Přítomnost aminokyselin v N-koncové vyvolat životaschopnou infekci 10 přirozeně se vyskytující části CPMV je postačující pro životaschopnost a infekčnost. Je také jasné, že existuje několik odlišných míst druhé mutace, které mohou významně zvýšit životaschopnost konstruktu s epitopem vloženým v N-koncové části VP-S z CPMV a že tyto mutace mohou nastat buď ve VP-S samotném nebo ve VP-L (velký obalový protein) . Fakt, že konkrétní mutace byly zjištěny nezávisle v samostatných klonech zdůrazňuje, že určitá místa druhé mutace jsou snadněji selektována než jiná. To představuje pro identifikaci ve virovém vektoru vehikul nových chimérických virových částic schopných vytvářet nové CVP pro vystavení celé řady cizorodých peptidů.

prostředek („hotspots) klonovacích mutačně aktivních míst použitelný při tvoření

Příklad 10

Tento příklad ukazuje expresi a internalizaci silného univerzálního epitopu pomocného T lymfocytu odvozeného z tetanického toxoidu v kombinaci s epitopem B lymfocytu vloženého do kličky VP-L na vnější straně CPMV. Protože tetanický toxoid je univerzální epitop pomocného T lymfocytu, • · • · · · stojí za to prozkoumat možnost kombinace vystavení epitopu uvnitř CPMV, jak bylo popsáno v příkladu 9, tak, že je společně exprimován v jedné částici s epitopy prezentovanými na vnějším povrchu CVP. Dosud byl vytvořen konstrukt, ve kterém byly vloženy dva peptidy odvozené z Pseudomonas aeruqinosa v tandemu v βΕαΒ kličce B domény VP-L (peptidy 9 a 10 proteinu vnější membrány, TDAYNQKLSERRAGADNATAEGRAINRRVEA.E, SEKV. ID. Č. 36, Brennan a kol., výše), zatímco epitop tetanického toxoidu byl vložen v N-koncové části VP-S. Tento konstrukt byl nazván pPAE14. Po inokulaci cDNA přímo na rostliny vigna vykázal PAE14 konstrukt symptomy infekce (lokální léze na inokulovaných listech) ode dne 14 dále. Ale nenásledovala systémová infekce hostitelských rostlin. Virus purifikovaný z těchto lokálních lézí byl přenesen přímo na mladé rostliny vigna, aby inicioval sekundární infekci. Lokální léze se staly viditelné během 5 dnů a následná systémová infekce následovala během týdne. To ukazuje selekci nového viru, jehož genom získal de novo mutaci. RNA z virů purifikovaných 10 dnů po inokulaci druhé skupiny rostlin vicna byla podrobena RT-PCR a bylo prováděno sekvencováni výsledné cDNA. Analýza odhalila několik jednotlivých bodových mutací v populaci, které byly ověřeny sekvencováním cDNA opačného vlákna. Pozorované mutace v různých klonech jsou:

- A3029G, která vede k mutaci Ilel24Val ve VP-S. (srovnej příklad 9, kde nastává ve stejné poloze odlišná mutace.), a

T3189C, vedoucí k mutaci Metl77Thr. (jak uvedeno výše, odlišná mutace ve stejné poloze byla uvedena v příkladu 9).

Tento příklad ukazuje, že je možné exprimovat současně epitop uvnitř chimérického rostlinného viru, jako je například CPMV, v kombinaci s epitopem ve VP-L tak, že je prezentován externě. Místa druhé mutace, která byla zjištěna, ukazují, že u odlišných konstruktů mohou být zjištěny podobné mutace ι

A ·····»♦·» • ·· ··· ·· ··· ···· ···· · ·· · · ·· « · (například A3029G v příkladu 9 a v tomto) a že odlišné mutace takto selektované mohou nastat v jedné aminokyselinové poloze, což vede k CVP se značně zvýšenou infekčností.

Příklad 11

Tento příklad ukazuje expresi a internalizaci silného univerzálního epitopu pomocného T lymfocytu odvozeného z tetanického toxoidu v kombinaci s epitopem B lymfocytu prezentovaného na vnější straně CPMV, vloženého do kličky VP-S. Protože je možné kombinovat expresi univerzálního epitopu pomocného T lymfocytu na vnitřním povrchu CPMV s epitopem na vnějším povrchu viru použitím βΕαΒ kličky B domény VP-L (příklad 10), stojí za pokus kombinovat expresi epitopu tetanického toxoidu s expresí epitopů v βΒβΟ kličce VP-S. Podobný postup s 2F10 mimotopem viru hepatitidy B byl popsán v příkladu 7.

Byl tedy vytvořen konstrukt, do kterého byl vložen epitop tetanického toxoidu v N-koncové části VP-S, jak bylo popsáno v příkladu 9, zatímco mucinový peptid (GVTSAPDTRPAPGSTA, SEKV. ID. Č. 37) byl vložen do 3B3C-kličky VP-S, mezi Ala22Prc23 v podstatě tak, jak bylo popsáno v Daisgaard a kol., výše. Tento konstrukt byl nazván pMUC51. Po inokulaci cDNA na rostliny vigna MUC51 nevykázal žádné symptomy infekce, ani po 21 dnech. Z tohoto důvodu byl vytvořen cDNA konstrukt identický s pMUC51 kromě toho, že jedno místo druhé mutace, jak uvedeno v příkladu 9 (A3188G: Metl77Val), bylo kódováno ve vektoru chimérického viru. Tento nový konstrukt byl nazván pMUC53. Po inokulaci cDNA na rostliny vigna MUC53 konstrukt nevykázal symptomy infekce až do dne 14. Systémová infekce hostitelských rostlin nenastala. Viry purifikované z těchto • * · » · · t « · • · · · · * ♦ · « • · · ·*· ·· »·· fr··· ···· · • fr * · ·» «· lokálních lézí byly přeneseny přímo na mladé rostliny vigna, aby podnítily druhý cyklus infekce. Lokální léze se staly viditelné během 5 dnů a následná systémová infekce následovala rychle během 7 dnů. To pravděpodobně ukazuje selekci další mutace v genomu viru. Viry byly purifikovány z rostlin 10 dnů po inokulaci a genomová RNA byla přeměněna na cDNA pomocí RTPCR. Sekvenční analýza obou komplementárních vláken potvrdila výskyt dalších de novo mutací:

- G2357A, která vede k Ala492Thr ve VP-L, a

- G2898A, vedoucí k Gly80Asp ve VP-S.

Tyto experimenty prokázaly několik použitelných vlastností internalizace epitopů. Je jasné, že je možné kombinovat inzerci epitopů v PBpc-kličce VP-S s epitopy v N-koncové části VP-S, dokonce i když druhý epitop je dlouhý 18 aminokyselinových zbytků. Kromě toho to ukazuje, že v některých případech místa druhé mutace samotná nejsou postačující pro vytvoření infekčního konstruktu, ale že je potřebné vybrat třetí místo mutace pro poskytnutí chimérických virových částic schopných vyvolat infekci. Způsob selekce mutací tohoto vyššího řádu, a také místa druhé mutace jsou popsána v příkladu 12 níže.

Příklad 12

Následující příklad uvádí protokol pro selekci nových genomů chimérických virových částic schopných internalizace a/nebo amfidispleje peptidů. Důvody z předcházejících příkladů poskytují rozumný podklad pro selekci in vivo nových rostlinných virových částic schopných akomodace vnitřních peptidů refrakterních na internalizaci nebo amfičisplej s použitím CVP divokého typu jako vektorů. Následující • v « ♦ · · · * » « C * # * » ·. » » · t · fe « V » • · · « * · · · • · »· ·· »* protokol a jeho varianty mohou být tedy použity pro selekci nových CVP vektorů.

1. Sekvence kódující peptid byla klonována do infekční cDNA molekuly kódující CPMV-RNA (například pCP7 nebo pCP26) ligací dvou nebo více hybridizovaných oligonukleotidů nebo DNA fragmentu z externího zdroje. Mohou být použita restrikční místa, která sousedí se sekvencí kódující N-koncovou část VP-S (například unikátní místa Nhel a Eco01091). Přesná lokalizace, do které byl vložen peptid, je výhodně mezi VallO a Tyrll, mezi duplikací VallOTyrll nebo mezi duplikací Tyrll. Je také možné použít cDNA klon, do kterého již byl vložen peptid (například βΒβΟ klička VP-S), takže několik epitopů může být kódováno a prezentováno současně na jedné částici.

2. V případě viru mozaiky vigny byly rostliny vigny staré přibližně 10-14 dnů (nebo kdykoliv jindy během růstu rostliny a před počátkem kvetení*) inokulovány klonem, jak byl konstruován v kroku 1, v kombinaci s cDNA klonem kódujícím CPMV-RNA1. (každý další hostitel vnímavý na CPMV může být infikován ve vhodnou dobu před počátkem kvetení*). [*Viry jsou schopné vyvolat systémovou infekci ve vhodné hostitelské rostlině, dokud se nezastavila růstová fáze a v případě kvetoucích rostlin, ještě nenastalo kvetení.]

3. Rostliny byly důkladně monitorovány na výskyt symptomů infekce. U dobře se replikující částice mohou být očekávány lokální léze na inokulovaných listech po 4-6 dnech, ačkoliv nejsou vždy zřetelné. Systémové symptomy mohou být očekávány po 10-14 dnech po infekci. Jestliže se vyskytly jasné znaky systémové infekce, rostliny byly sklizeny 3-4 týdny po infekci a virus byl purifikován (krok 5) . Jestliže trvalo 14 dnů nebo déle před výskytem první lokální léze a nebyly žádné systémový symptomy nebo velmi málo systémových symptomů až do 3 týdnů po infekci, je pravděpodobně, že nastaly spontánní mutace • ·

in planta. V tomto případě virus potřeboval být přenesen na čerstvé rostliny, jako v kroku 4. Jestliže nebyly vůbec žádné detekovatelné symptomy, mohou být nezbytné další mutace (viz kroky 7 a 8) .

4. Jestliže jediné symptomy byly lokální léze a ne systémové léze, které se staly zjevné 2 týdny nebo déle po infekci (a před počátkem kvetení nebo ukončení růstové fáze rostliny), byly vyříznuty z listů a jednotlivě přeneseny do testovací zkumavky. Do každé testovací zkumavky bylo přidáno trochu vody nebo kteréhokoliv pufru vhodného pro uskladnění virových částic a listové fragmenty byly rozdrceny. Výsledná suspenze byla použita k inokulaci čerstvých mladých rostlin vigna (nebo jiných vhodných hostitelských rostlin), jak bylo popsáno v kroku 2. To vede k lokálním lézím přibližně 5 dnů po infekci a systémovým symptomům 3-6 dnů později.

Listy byly sklizeny. Virus může být purifikován z listů například extrakcí v chloroformu a butanolu následovanou PEGprecipitací (van Kammen & de Jaeger Cowpea mosaic virus, v: CMI/AAB Description of Plant Viruses 197, Commonwealth Agricultural Bureaux [1978] ) . Vzorky byly purifikovány z každé jednotlivé rostliny pro sekvenční analýzu (Brennan a kol., výše) .

6. Virové částice byly použity v standardní RT reakci s primerem, který byl schopen specifické hybridizace a funkce očka (primeru) pro zahájení reverzní transkripce buď VP-S genu nebo VP-L genu. RT produkt byl amplifikován pomocí PCR s použitím primerů, které amplifikovaly buď VP-S gen nebo VP-L gen nebo oba geny. PCR produkty byly sekvencovány tak, že sekvence VP-S, VP-L nebo obě mohou být určeny na obou vláknech. Jestliže nebyly žádné mutace ve vložených epitopech, konstrukt může být použit pro, inter alia, imunologickou analýzu.

Ί. Jestliže místa druhé mutace byla identifikována, mohou být zavedena do nových derivátů cDNA klonů popsaných v kroku 1, buď místně cílenou mutagenezí nebo štěpením a ligací fragmentů cDNA z kroku 6 do infekčního klonu.

8. Jestliže v kroku 4 nebyly vůbec žádné symptomy, známé místo druhé mutace identifikované v odlišném konstruktu nebo každá další mutace, která může vytvořit infekční klon, může být zavedena do cDNA klonu vytvořeného v kroku 1 a modifikovaného jako v kroku 7. S novým konstruktem se opakoval celý infekční proces postup podle kroků 2-5. Jestliže byly v kroku 4 dobré symptomy, zavedené mutace mohou být postačující pro infekci a replikaci CVP in planta. Jestliže byly pouze lokální léze, je pravděpodobné, že existovalo třetí místo mutací. To může být zkoumáno nebo potvrzeno následujícími kroky 5 a 6.

9. Může být vytvořena banka virových vektorů s různými druhými místy nebo třetími místy (nebo dalšími místy) mutací, do kterých může být ligován epitop, jak bylo popsáno v kroku 1 výše. V tomto případě je důležité pokračovat s transferem lokální léze v kroku 4 pro ujištění, že systémově infikované rostliny obsahují jeden jediný klon viru.

Příklad 13

Tento příklad ukazuje aplikaci de novo místa druhé mutace pro zvýšení infekčnosti a replikace virového vektoru exprimujícího cizorodý peptid jiný než peptid jehož vnitřní exprese vytváří tlak na selekci mutace in vivo. Peptid odvozený z nukleokapsidového proteinu viru Sendai (s aminokyselinovou sekvencí, HGEFAPGNYPALWYSA, SEKV. ID. Č. 11) byl vložen v N-koncovou část VP-S z CPMV, na místo mezi duplikované tyrosinové zbytky (tj. Tyrll je na amino-konci vzhledem k vloženému peptidu a druhý tyrosinový zbytek těsně na karboxy-konci k vložené sekvenci). Tento konstrukt byl nazván pSEN2. Po inokulaci cDNA na rostliny vigna SEN2 nevykázal žádné symptomy po dobu 21 dnů. Z tohoto důvodu byl vytvořen konstrukt, který byl podobný pSEN2, ale lišil se v tom, že chimérický virový vektor obsahoval místo druhé mutace, Phe91Ser, vybrané v konstruktu exprimujícím epitop malárie (MAL8, viz příklad 3). Tento konstrukt byl nazván pSEN3. Po inokulaci cDNA na rostliny vigna SEN3 konstrukt vykázal symptomy infekce na inokulovaných listech už časně v den 6 a systémové symptomy se objevily 4 dny později u 4 z 5 inokulovaných rostlin. Rostliny byly sklizeny 21 dnů po infekci. Virus byl purifikován z inokulovaných listů a byl pozorován výtěžek 50 mg viru ze 47 g listů. RNA z viru purifikovaného 21 dnů po inokulaci byla podrobena RT-PCR a bylo prováděno sekvencovéní výsledné cDNA na obou vláknech. Analýza odhalila, že sekvence byla nezměněna oproti sekvenci pSEN3 konstruktu použitého k inokulaci rostlin.

To jasně prokazuje, že je možné aplikovat konkrétní místo druhé mutace, vybrané v konstruktu exprimujícím jeden peptid vnitřně, pro usnadnění vnitřní exprese dalšího nepříbuzného peptidu vloženého v podstatě ve stejné poloze. To ukazuje, že místa druhé mutace mají široké použití při expresi vnitřních peptidů a v principu při konstrukci dalších amfidisplejových částic podle příkladů 7 a 8. Je tedy možné podle způsobů navržených v příkladech 12 a 13 v tomto textu konstruovat banku vektorů, které mohou být testovány na expresi peptidů uvnitř viru bez nadměrných experimentů.

Příklad 14

Tento příklad ukazuje expresi epitopu T lymfocytu uvnitř rostlinné virové částice, aby se zabránilo expozici tohoto epitopu prvkům humorální imunitní reakce (například cirkulujícím protilátkám) a imunomodulaci prezentací imunogenu nebo antigenů. Cílem mnoha vakcín založených na peptidech je indukce spíše buněčné než humorální (protilátkové) reakce na prezentovaný epitop. Konkrétně terapeutická intervence u karcinomu je zvýšeně rozpoznávána jako účinnější, jestliže může být stimulována buněčná imunitní reakce. Ale protože zkoumaný prezentovaný epitop může být také rozpoznáván protilátkami cirkulujícími v séru, existuje vždycky šance, že imunogen zavedený ke stimulaci požadované imunitní reakce může indukovat spíše humorální než buněčnou reakci na prezentovaný peptid. Navíc náhodná přítomnost cirkulujících protilátek schopných vazby zavedeného imunogenního nebo antigenního přípravku může zabránit vhodné a účinné stimulaci požadované imunitní reakce odstraněním komplexu z oběhu. Ve skutečnosti to je potenciální problém u každého systému prezentujícího peptid, ve kterém jsou peptidy vystaveny na vnější straně nosiče, jako je například hemokyanin Na druhé straně exprese peptidu, jako například epitopu, uvnitř částice, například v rostlinném chimérickém viru, chrání tento peptid před vazbou protilátek. Toto nebrání pouze nežádoucí humorální reakci na epitop, ale také pomáhá umožnit peptidu přežít clearance a proteolýzu, zpracován buňkami prezentující sysnému. Z těchto důvodů je internalizace epitopů v CPMV nebo jiných rostlinných virech použitelná pro expresi epitopů, kreré mohou zkříženě reagovat s cirkulujícími protilátkami, a proto mohou být použity makromolekulárního přílipky (KLH).

dokud nebyl prezentován a antigen (APCS) imunitního k řízení typu imunitní reakce od humorální k buněčné reakci. Toto platí také pro expresi peptidových mimotopů.

Pro imunoterapeutické aplikace peptidů je nezbytná indukce zejména cytotoxických T lymfocytů. Aby se tak stalo, musí být dodány epitopy schopné vyvolat reakci cytotoxických T lymfocytů a prezentovány buňkami tak, že peptidový epitop je zpracován a prezentován na MHC molekulách. Prezentace tímto způsobem se vyhne přímé protilátkové reakce a místo toho vyvolává stimulaci specifických populací cytotoxických T lymfocytů. Tyto lymfocyty pak cílí buňky vystavující zkoumaný peptid přímo, což vede k lýzi buněk nebo clearanci cílových buněk nebo antigenů po opsonizaci.

Je známo, že peptid odvozený z proteinu mucinu, zjišťovaný ve velkém množství na povrchu buněk lidského karcinomu prsu (a dalších karcinomů) je schopen indukovat CTL reakce u myší, když je připojen k nosiči. Mucinový polypeptid zjištěný na karcinomových buňkách se liší od všudypřítomné formy proteinu nalézaného na povrchu mnoha nekarcinomových buněk tím, že je odlišně modifikován po translaci. Při pokusech imunizovat pokusná zvířata vakcínou obsahující mucinový peptid byly u myší zjištěny protilátky zkříženě reagující s Muclp, které převedly vyvolanou imunitní reakci z buněčné na humorální. Když byl použit stejný imunogen pro vakcinaci člověka, následovala spíše protilátková reakce než buněčná reakce, peptid reagoval zkříženě s protilátkami protože antigenní proti epitopu Gal alfa(1,3)Gal, determinantách některých krevních nezjištěného u myší.

normálně skupin u přítomnému na člověka, ale

Jedno technické řešení je exprimovat stejný peptid jako inzerci v N-koncové části VP-S z CPMV, mezi duplikaci Tyrll. Když tyto částice byly použity k imunizaci člověka, protilátky nemohou vázat vložený epitop přímo. Buněčná reakce na epitop probíhá výhodně vychytáváním a prezentací Muclp peptidu na buňkách prezentujících antigen (ADC). Stimulace CTL subpopulací specifických pro epitop Muclp peptidu má za následek lýzi nebo clearance cílových buněk nesoucích v podstatě stejný epitop na svých buněčných membránách.

Příklad 15

Tento příklad ukazuje produkci CVP obsahující CTL epitop z viru spalniček. CTL epitop z viru spalniček (LDRLVRLIG, SEKV. ID. Č. 13), který je pozitivně nabitý, byl vložen v N-koncovou část VP-S, mezi duplikaci Yll. Tento konstrukt je pMV14. Rostliny inokulované tímto konstruktem nevykázaly žádné symptomy. Stejný epitop byl vložen mezi duplikaci V10Y11 (=pMV15) a nové symptomy byly pozorovány na dvou z pěti inokulovaných rostlin. Když byl purifikovaný virus přenesen na mladé rostliny vigna, byly pozorován velmi dobré symptomy. Oba geny obalového proteinu byly kompletně sekvencovány a bylo zjištěno, že jsou správné.

Příklad 16

Tento příklad ukazuje produkci CVP obsahující CTL epitop z viru vezikulární stomatítidy. CTL epitop viru vezikulární stomatitidy (RGYWQGL, SEKV. ID. Č. 12) byl úspěšně exprimován na TY částicích a tyto částice indukovaly velmi dobré CTL reakce u myší (Layton a kol·., Immunology 87: 171-178 [1996]). Stejný epitop byl vložen mezi duplikovaný Yll ve VP-S z CPMV. Tento konstrukt byl pVSVI. Dobré symptomy byly pozorovány na 4 • « • · • · z 5 rostlinách inokulovaných tímto konstruktem. Virus poskytl dobré výtěžky (0,79 mg/g listů).

Příklad 17

Tento příklad ukazuje konstrukci vektorů obsahujících epitop CTL ohraničený oligo-alaninem. Je známo, že pro správné zpracování CTL epitopů buňkami prezentující antigen jsou rozhodující zbytky ohraničující epitop. Ale velmi málo je známo o tom, které zbytky jsou optimální ve spojení s určitými epitopy. Bylo pozorováno, že zavedení krátkých úseků alaninů na místo každého epitopu může napomáhat zlepšení reakce na CTL epitop vložený do proteinového nosiče (Del Vat a kol., Cell 66:1145-1153 [1991) .

Byl vytvořen vektor s pěti alaniny mezi duplikaci V10Y11, zatímco existuje unikátní Notl místo v tomto insertu (pCP35) . Vektor samotný byl infekční v rostlinách vigna, navzdory tomu, že virové symptomy byly opožděny oproti viru divokého typu. Zavedení epitopů do tohoto oligo-A úseku může být použitelné pro studium optimalizace zpracování CTL epitopů, v případě, že epitopy vyvolávají pouze slabé imunitní reakce. Epitop malárie byl vložen do Notl místa za vzniku pMALll. Tento konstrukt vyvolával dobré symptomy na rostlinách.

Protože nebyla pozorována CTL reakce na epitop viru spalniček z pMV15 u myší (viz výše), byl vytvořen další konstrukt, ve kterém byl epitop ohraničen několika alaniny na každé straně. Tento konstrukt, pMV 16, byl neinfekční pro rostliny vigna. V analogii s pSEN3 (viz výše), bylo použito místo druhé mutace z nepříbuzného konstruktu v pMV16 (M177V, odvozen z pTT4). Tento konstrukt, který byl nazván pMV17, nevyvolával žádné symptomy na rostlinách.

• · • ·

·· ·· ·· • · · · · • · · · · • · · · · • · · · • · ·· · · · · 83

Následující použitelné rostlinné virové vektory byly deponovány v American Type Culture Collection (ATCC) , Rockville, Mel., USA, podle Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Mikroorganizm fer the Purposes of Patent Proceduře and Regulations za těchto podmínek: pTB2 (ATCC č. 75280) a pTBUS (ATCC 75281). Konstrukční detaily pro tyto plazmidy byly uvedeny v patentu Spojených Států č. 5 589 367 tímto zahrnuty formou odkazu.

Všechny publikace a patenty zmíněné ve výše uvedeném popisu jsou do tohoto textu zahrnuty formou odkazu. Různé modifikace a variace popsaných přípravků a způsobů podle vynálezu jsou odborníkovi zjevné bez odchýlení se od rozsahu vynálezu a vynálezecké myšlenky. Ačkoliv byl vynález popsán ve spojení s konkrétními výhodnými provedeními, rozumí se, že nárokovaný vynález by neměl být nadmíru omezován těmito specifickými provedeními. Ve skutečnosti různé modifikace popsaných způsobů podle vynálezu, které jsou odborníkovi zjevné, spadají do rozsahu připojených patentových nároků.

SEZNAM SEKVENCÍ <170> Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 1

Gly Pro Val Cys Ala Glu Ala Ser Asp Val 15 10

<210>	2
<211>	11
<212>	PRT
<213>	umělá/neznámá
<220>
<221>	další vlastnosti
<222>	()..()
<223>	syntetická
<4 00>	2

Gly Pro Val Cys Ala Glu Ala Ser Asp Val Tyr 15 io

<210>	3
<211>	9
<212>	PRT
<213>	umělá/neznámá
<220>
<221>	další vlastnosti
<222>	()..()
<223>	syntetická
<400>	3

Gly Pro Val Cys Ala Glu Ala Ser Asp 1 5 <210> 4 <211> 7 • · <212> PRT <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 4

Gly Tyr His Gly Ser Ser Leu 1 5 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 5

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr His Gly Ser Ser Leu 15 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 6

Arg Pro Gin Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn Leu Thr Ala Gin 15 10 15 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 7 • ·

Ser Tyr Ile Pro Ser Ala Glu Lys Ile 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 8

Ser Tyr ile Pro Ser Ala Gly Lys Ile 1 5 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 9

Ala Ala Ala Ser Tyr Ile Pro Ser Ala Glu Lys Ile Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 10

Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu 1 5 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> umělá/neznámá • 4 <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 11

His Gly Glu Phe Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu Trp Ser Tyr Ala 15 10 15

<210>	12
<211>	8
<212>	PRT
<213>	umělá/neznámá
<220>
<221>	další vlastnosti
<222>	()..()
<223>	syntetická
<400>	12
Arg Gly Tyr Val Tyr Gin Gly Leu
1	5

<210>	13
<211>	9
<212>	PRT
<213>	umělá/neznámá
<220>
<221>	další vlastnosti
<222>	()·.()
<223>	syntetická
<400>	13

Leu Asp Arg Leu Val Arg Leu Ile Gly
1	5
<210>	14
<211>	15
<212>	PRT
<213> <220>	umělá/neznámá
<221>	další vlastnosti
<222>	().:()
<223>	syntetická
<400>	14
Ala	Ala Ala Leu Asp Arg	Leu Val Arg Leu	Ile Gly Ala Ala Ala
1	5	10	15

• · » · ··

<210>	15
<211>	18
<212>	PRT
<213>	umělá/neznámá
<220>
<221>	další vlastnosti
<222>	()..()
<223>	syntetická
<400>	15

Val· Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile Tyr Ser Tyr Phe Pro 15 10 ¹⁵

Ser Val <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 16

Met Gin Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gin Thr Leu Gin 1 5 .10

<210>	17
<211>	5
<212>	PRT
<213>	umělá/neznámá
<220>
<221>	další vlastnosti
<222>	()..()
<223>	syntetická
<400>	17
Ala	Ala Ala Ala Ala
1	S

<210>	18
<211>	21
<212>	DNA
<213>	umělá/neznámá
<220>

• φ » * t · <221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 18 ggttatcatg gttctagttt g <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 19 gctgtttatt attgtactag aggttatcat ggttctagtt tg 42 <210> 20 <211> 45 <212> DNA <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 20 agacctcaag cttctggtgt ttatatgggt aatttgactg ctcaa 45 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 21 tcttatattc cttctgctga aaagatt 27 <210> 22 <211> 48

I • · · * <212> DNA <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 22 gcagcggcct cttatattcc ttctgctgaa aagattgcgg ccgctgct 48 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 23 gctcctggta attatcctgc tttg 24 <210> 24 <211> 48 <212> DNA <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 24 catggtgaat ttgctcctgg taafctatcct gctttgtggt cttatgct 48

<210>	25
<211>	23
<212>	DNA
<213>	umělá/neznámá
<220>
<221>	další vlastnosti
<222>	()..()
<223>	syntetická
<400>	25

agaggttatg tttatcaagg ttg

I

<210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> umělé/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 26 ttggatagat tggttagatt gattggt 27 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 27 gcagcggcct tggatagatt ggttagattg attggggccg ctgct 45 <210> 28 <211> 54 <212> DNA <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetické <400> 28 gtggatgatg ctttgattaa ttctactaag atttatagtt attttccttc tgtt 54

<210>	29
<211>	39
<212>	DNA
<213>	umělá/neznámá
<220>
<221>	další vlastnosti
<222>	().·()
<223>	syntetická
<400>	29

I • · atgcaatgga actctactac ttttcatcaa actttgcaa 39 <210> 30 <211> 15 <212> DNA <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 30 gcagcggccg ctgct 15

<210>	31
<211>	9
<212>	PRT
<213>	umělá/neznámá
<220>
<221>	další vlastnosti
<222>	()..()
<223>	syntetická
<400>	31
Tyr	Ser Pro Cys Met Ile Ala Ser Thr
1	5

<210>	32
<211>	10
<212>	PRT
<213>	umělá/neznámá
<220>
<221>	další vlastnosti
<222>	().·()
<223>	syntetická
<400>	32
Val	Tyr Ser Pro Cys Met Ile Ala Ser
1	5

<210>	33
<211>	15
<212>	PRT
<213>	umělá/neznámá
<220>

• · · · <221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 33

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr His Gly Ser Ser Leu Tyr 15 10 15 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 34

Gly Tyr His Gly Ser Ser Leu Tyr 1 5 <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 35

Gly Val Ser Thr Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 15 10 15

<210>	36
<211>	32
<212>	PRT
<213>	umělá/neznámá
<220>
<221>	další vlastnosti
<222>	()..()
<223>	syntetická
<400>	36

Thr Asp Ala Tyr Asn Gin Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Gly Ala Asp 15 10 15

Asn Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu Ala Glu 20 ' 25 30 <210> 37 <211> 16 <212> PRT <213> umělá/neznámá <220>

<221> další vlastnosti <222> ()..() <223> syntetická <400> 37

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

Claims (25)

1. Sloučenina obsahující chimérickou virovou částici mající kapsidu, přičemž kapsida má vnitřní stranu a vnější stranu, a kapsida obsahuje alespoň jeden exogenní peptid na vnitřní straně kapsidy.

2. Chimérická virová částice podle nároku 1, která je schopná sestavení v hostitelské buňce nebo tkáni.

3. Chimérická virová částice podle nároku 1 nebo 2, ve které je virus ikosaedrický.

4. Chimérická virová částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, ve které je virus comovirus.

5. Chimérická virová částice podle nároku 4, ve které virus je virus mozaiky vigny.

6. Chimérická virová částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až

5, ve které je exogenní peptid vložen do obalového proteinu.

7. Chimérická virová částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až

6, ve které exogenní peptid má 5 až 20 aminokyselin.

8. Chimérická virová částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až

7, ve které je exogenní peptid vložen v místě od 5 do 20 • · « · · · • · · · aminokyselin od N-konce obalového proteinu, a toto sestavení virové částice není v hostitelské buňce předem vyloučeno.

9. Chimérická virová částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, ve které je exogenní peptid vložen ve VP-S viru mozaiky vigny mezi tyrosinový zbytek v poloze 11 a duplikovaný tyrosinový zbytek v poloze 12.

10. Chimérická virová částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, ve které je exogenní peptid vložen ve VP-S viru mozaiky vigny mezi dipeptid obsahující valinový zbytek v poloze 10 a tyrosinový zbytek v poloze 11 a duplikovaný dipeptid obsahující valinový zbytek v poloze 12 a tyrosinový zbytek v poloze 13.

11. Chimérická virová částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, ve které je exogenní peptid vložen ve VP-S viru mozaiky vigny mezi valinový zbytek v poloze 10 a duplikovaný valinový zbytek v poloze 11.

12. Chimérická virová částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až

11, ve které virová částice neobsahuje nukleovou kyselinu.

13. Chimérická virová částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až

12, ve které exogenní peptid kóduje epitop rozpoznatelný zvířecím imunitním systémem.

• · • · • · · · ·

14. Chimérická virová částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, ve které exogenní epitop je epitop cytotoxického T lymfocytu.

15. Chimérická virová částice podle nároků 1 až 14, ve které exogenní peptid obsahuje epitop cytotoxického T lymfocytu obklopený aminokyselinami pocházejícími z přirozeně se vyskytujícího zdroje epitopu.

16. Chimérická virová částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, ve které exogenní peptid je epitop pomocného T lymfocytu.

17. Chimérická virová částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 a nároku 16, ve které exogenní peptid obsahuje epitop pomocného T lymfocytu obklopený aminokyselinovými sekvencemi pocházejícími z přirozeně se vyskytujícího zdroje epitopu.

18. Chimérická virová částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, ve které exogenní peptid je epitop B lymfocytu.

19. Chimérická virová částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 a nároku 18, ve které exogenní peptid obsahuje epitop pomocného T lymfocytu obklopený aminokyselinovými sekvencemi pocházejícími z přirozeně se vyskytujícího zdroje epitopu.

20. Chimérická virová částice podle nároků 1 až 19, obsahující druhý exogenní peptid exprimován na vnějším povrchu virové kapsidy.

• · ···· ···· ··· ·· ·« · · ·· · · · · · ·

21. Chimérická virová částice podle nároků 1 až 20, obsahující druhý exogenní peptid exprimovány na vnějším povrchu virové kapsidy, přičemž peptid je vložen v PC'-PC kličce VP-S viru mozaiky vigny.

22. Chimérická virová částice podle nároků 1 až 20, obsahující druhý exogenní peptid exprímovaný na vnějším povrchu virové kapsidy, přičemž peptid je vložen v PB-pc kličce VP-S viru mozaiky vigny.

23. Chimérická virová částice podle nároků 1 až 20, obsahující druhý exogenní peptid exprímovaný na vnějším povrchu virové kapsidy, přičemž peptid je vložen v βΕ-αΒ kličce VP-L viru mozaiky vigny.

24. Chimérická virová částice podle nároků 1 až 20, obsahující druhý exogenní peptid exprímovaný na vnějším povrchu virové kapsidy, přičemž peptid je vložen v C-koncové části VP-S viru mozaiky vigny.

25. Chimérická virová částice podle nároků 1 až 14, ve které epitop exogenního peptidu je obklopený aminokyselinami obsahujícími dva nebo více alaninových zbytků.