CN101784655A - 可溶性重组二十面体病毒样颗粒的改良生成和体内装配 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于在假单胞菌起源的细菌细胞中体内生成可溶性的、装配好的病毒样颗粒(“VLP”)的改良方法。假单胞菌细胞支持自二十面体病毒衣壳蛋白(“CP”)体内装配VLP，并容许包含较大的重组肽作为VLP中的单体或多联体。具体地，本发明提供了一种用于在体内生成可溶性的、装配好的豇豆褪绿斑点病毒(“CCMV”)VLP的改良方法，其通过将导致可溶性CP融合物在荧光假单胞菌细菌系统中高产量生成的修饰引入CCMV CP来实现。随后，可以纯化这些可溶性VLP，并作为疫苗使用。

Description

可溶性重组二十面体病毒样颗粒的改良生成和体内装配
优先权要求
本申请要求2007年4月27日提交的美国临时专利申请流水号60/914,677的申请日权益。
政府利益的声明
本发明是在与国立卫生研究院(National Institutes of Health)、国立过敏与传染病研究院(National Institute of Allergy and Infectious Disease，NIAID)的美国政府合同，合作协议号1-U01-AI054641-01下获得政府支持而产生的。政府具有本发明的某些权利。
发明领域
本发明提供了一种用于在细菌宿主细胞中生成可溶性的、装配好的病毒样颗粒(virus-like particles，“VLP”)的改良方法。
发明背景
目前，不同程度成功地使用细菌、酵母、盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)、昆虫、和哺乳动物细胞表达系统来生产作为人和动物治疗剂使用的重组肽。创建用于生成异源肽的表达系统的一个目的是提供能在商业、治疗、和疫苗应用中利用的广泛的、灵活的、有效的、经济的、和实用的平台和方法。例如，对于某些多肽的生成，会希望提供如下表达系统，其能够以有效且便宜的方式在体内生成大量的可溶性的想要产物以消除或降低下游重装配成本。
目前，细菌是最广泛用于生成重组肽的表达系统，因为其生成丰富数量的重组肽的潜力。然而，细菌常常受限于其生成某些类型的肽的能力，需要使用备选的且更昂贵的表达系统。例如，细菌系统生成单体抗微生物肽的能力受到限制，这是由于此类肽对细菌的毒性，其常常导致细胞在表达所述肽后死亡。由于非细菌表达系统的固有缺陷，已经在设法改善细菌系统生成广泛的在商业上和治疗上有用的肽的能力方面花费了相当多的时间和资源。虽然在此领域中已经取得进步，但是用于在细菌表达系统中生成异源肽的别的方法和平台会是有益的。
病毒
一种用于改善宿主细胞表达系统中肽生成的方法包括使用复制型病毒来生成感兴趣的重组多肽。然而，复制型、全长病毒的应用在重组多肽生成策略中的使用方面具有许多缺点。例如，可能难以控制发酵条件过程中的重组多肽生成，这可能要求紧密调控表达以使运行的发酵的效率最大化。此外，复制型病毒生成重组多肽的使用可能导致强加调控要求，其可能导致下游纯化步骤增加。
为了克服产量难题(特别在发酵过程中)，一项研究领域已经聚焦于在对于特定病毒而言不是天然宿主的细胞(非向性宿主细胞)中表达和装配病毒。非向性细胞(non-tropic cell)是如下细胞，即病毒由于病毒衣壳蛋白与宿主受体分子之间的不相容性，或者病毒生化与细胞生化之间的不相容性而不能成功进入细胞，由此阻止病毒完成其生活周期。例如，Price等的美国专利号5,869,287描述了一种用于在酵母细胞中合成和装配可复制的或感染性的含有RNA的病毒的方法，其中病毒衣壳蛋白或衣壳内含有的RNA来自野田村病毒科(Nodaviridae)或雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)的非酵母病毒物种。然而，这种方法没有克服与复制型病毒中的蛋白质生成有关的潜在调控障碍。
病毒样颗粒(VLP)
用于改善重组肽生成的另一种方法已经是要利用VLP。一般而言，VLP的微粒性质诱导比变性的蛋白质或可溶性蛋白质更有效的免疫应答。VLP作为疫苗具有许多超过常规免疫原的优点。例如，可以在异源表达系统中作为VLP合成来自多种感染剂的抗原。在某些衣壳或包膜蛋白自我装配的能力外，还可以大量生成这些颗粒，并容易进行富集和纯化。用嵌合VLP进行的疫苗接种能甚至在没有佐剂的情况中诱导插入物特异性B和/或T细胞应答两者；此外，VLP不能复制，而且是非感染性的。
一般而言，封装的病毒包括蛋白质外壳或“衣壳”，其装配来含有病毒核酸。许多病毒具有能自个别表达的衣壳蛋白“自我装配”的衣壳——在其中表达衣壳的细胞内(“体内装配”)形成VLP及在分离和纯化后在细胞的外部(“体外装配”)两者。
病毒样颗粒在细菌表达系统中的使用
理想地，将衣壳蛋白(“CP”)修饰成含有靶重组多肽，生成重组病毒CP-肽融合物。然后可以在细胞中表达融合肽，并且理想地，在体内装配以形成可溶形式的重组VLP。由于重组多肽快速的、有效的、便宜的、和丰富的产量的潜力，已经将细菌作为用于生成装配好的、可溶性的重组病毒CP-肽融合VLP的表达系统中的宿主细胞进行检查。
研究人员已经显示了，可以在非向性肠细菌(enterobacteria)中以转基因方式表达没有重组多肽插入物的特定野生型(“wt”)病毒衣壳蛋白。研究人员还显示了，这些衣壳蛋白可以在体内和在体外装配以形成VLP。参见，例如，S.J.Shire等，Biochemistry 29(21)：5119-26(1990年5月29日)(病毒样颗粒自大肠杆菌中表达的螺旋烟草花叶病毒衣壳蛋白的体外装配)；X.Zhao等，Virology 207(2)：486-94(1995年3月10日)(病毒样颗粒自大肠杆菌中表达的二十面体豇豆褪绿斑点病毒衣壳蛋白的体外装配)；Y.Stram等，Virus Res.28(1)：29-35(1993年4月)(丝状马铃薯病毒Y衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达，及病毒样颗粒的体内形成)；J.Joseph和H.S.Savithri，Arch.Virol.144(9)：1679-87(1999)(丝状辣椒脉带病毒衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达，及病毒样颗粒的体内形成)；D.J.Hwang等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 91(19)：9067-71(1994年9月13日)(螺旋烟草花叶病毒衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达，及病毒样颗粒的体内形成)；M.Sastri等，J.Mol.Biol.272(4)：541-52(1997年10月03日)(二十面体酸浆斑点病毒衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达，及病毒样颗粒的体内形成)。
迄今为止，重组病毒CP-肽融合物颗粒在非向性细菌细胞中的成功表达和体内装配已经有所变化。例如，Brumfield等尝试作为体内装配的VLP表达插入二十面体衣壳蛋白中的重组多肽未获成功。参见Brumfield等(2004)“Heterologous expression of the modified capsid protein of Cowpea chloroticmottle bromovirus results in the assembly of protein cages with alteredarchitectures and functions，”J.Gen.Vir.85：1049-1053。尚未完全理解所观察到的二十面体病毒CP-肽融合颗粒不能在大肠杆菌中作为VLP体内装配的原因。
美国专利申请号11/001,626描述了一种用于在细菌宿主细胞荧光假单胞菌(Pseudomas fluorescens)中生成含有肽插入物的体内装配的VLP的方法。描述了豇豆褪绿斑点雀麦花叶病毒衣壳蛋白，其已经被工程化改造成在肽插入位点处含有限制酶消化位点以容许感兴趣肽的插入。
对含有插入的感兴趣肽的VLP的生成的进一步改善能容许体内可溶性的、装配好的VLP的产量增加。较高产量的可溶性VLP的生成能容许加工步骤的减少，这是由于对溶解、变性、复性、正确重折叠和装配先前不溶性VLP的需要降低。如此，体内可溶性的、装配好的VLP的产量增加能使制备过程更有效。
发明概述
本发明提供了核酸构建体及其用于在细菌宿主细胞中生成可溶性的、体内装配好的病毒样颗粒(VLP)的使用方法。使用一套亲水性优化规则来工程化改造核酸构建体以优化病毒衣壳蛋白(CP)或CP-肽融合物的亲水性。经由消除、诱变、或添加通过亲水性优化规则鉴定的聚焦区域中的某些密码子，设计经亲水性优化的核酸构建体以容许体内装配好的、可溶性的VLP的产量增加。
在本发明的一些实施方案中，可以通过消除编码具有低得不想要的亲水性值的氨基酸的密码子来增加低亲水性值区域。在本发明的其它实施方案中，可以通过消除初始CCMV外壳蛋白构建体第63位和第129位插入位点处的氨基酸来修饰插入肽，其通过定点诱变或使用通过基于交叠延伸(“SOE”)的技术进行的剪接来实现。
在本发明的实施方案外，可以通过用具有较高亲水性值的氨基酸替换编码低亲水性氨基酸的密码子来增加具有低亲水性值的鉴定区域的亲水性值。或者，可以通过添加一个或超过一个编码具有想要的亲水性值的氨基酸的密码子来增加聚焦区域的亲水性。
在一些实施方案中，本发明提供了编码经亲水性优化的病毒衣壳蛋白的分离的核酸构建体。在一个实施方案中，所述经亲水性优化的衣壳蛋白衍生自二十面体病毒。在一个实施方案中，所述二十面体病毒是CCMV。在一个实施方案中，所述病毒衣壳蛋白衍生自SEQ ID NO：1。
在其它实施方案中，本发明提供了编码病毒衣壳蛋白的分离的核酸构建体，其中所述核酸构建体含有编码具有至少50％亲水性区域的经工程化改造的限制性位点。经工程化改造的限制性位点为感兴趣肽提供插入位点，容许能自我装配成可溶性VLP的病毒衣壳蛋白-肽融合肽(CP-肽融合物)的生成。在一些实施方案中，限制性位点具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、或至少85％亲水性的区域。在别的实施方案中，经工程化改造的限制性位点具有至少75％亲水性的区域。在其它实施方案中，经工程化改造的限制性位点由编码氨基酸天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、或精氨酸(Asp-Glu-Lys-Arg)的核酸密码子构成。在一些实施方案中，经工程化改造的限制性位点不含编码两个或更多个连续的选自下组的疏水性氨基酸的密码子：丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、或脯氨酸。在其它实施方案中，经工程化改造的限制性位点包含在CCMV衣壳蛋白中。在一些实施方案中，编码具有经工程化改造的限制性位点的病毒衣壳蛋白的经亲水性优化的核酸构建体选自由SEQ ID NO：3、4和5组成的组。
在本发明的备选实施方案中，提供了编码CP-肽融合物的经亲水性优化的核酸构建体。在一些实施方案中，改变肽插入物以增加肽的亲水性。在其它实施方案中，改变亲水性以提供包含小于50％的疏水性氨基酸的重组肽。在一些实施方案中，改变肽以包含至少50％、至少55％、至少56％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％的亲水性。可以通过自肽的N或C端添加或减去编码氨基酸的密码子来改变肽插入物的亲水性。在一些实施方案中，可以增加肽插入物的亲水性，使得肽插入物的亲水性是至少56％。在一些实施方案中，通过向肽的N或C端添加至少一个亲水性氨基酸来增加插入物的亲水性，其中所述氨基酸选自具有大于一(1)的亲水性值的氨基酸，如通过改良Roseman疏水性标量(表1)所测定的。在别的实施方案中，经亲水性优化的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：7、9、11、12、13和14组成的组。
本发明进一步包括细菌细胞，其包含使用一套亲水性优化规则进行工程化改造以优化病毒衣壳蛋白(CP)或CP-肽融合物的亲水性的核酸构建体。在一些实施方案中，所述细胞在体内生成可溶性的、装配好的重组病毒样颗粒。在其它实施方案中，本发明的细胞在自经亲水性优化的核酸构建体表达时提供自.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2g/L或超过2g/L的可溶性的、装配好的VLP。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞是假单胞菌，诸如荧光假单胞菌。
附图简述
图1呈现了对于在假单胞菌宿主细胞中表达重组VLP有用的CCMV129-CP表达质粒的质粒图谱。CCMV CP尚未经亲水性优化。
图2显示了用于在宿主细胞(例如假单胞菌宿主细胞)中生成病毒样颗粒(“VLP”)中的肽单体的方案。在构建重组病毒衣壳基因(“rCP”)时将想要的靶肽插入物编码序列(“I”)以符合读码框的方式插入病毒衣壳编码序列(“CP”)中，将所述重组病毒衣壳基因(“rCP”)(作为载体的一部分)转化入宿主细胞中，并表达以形成重组衣壳(“rCP”)。然后将这些进行装配以形成各含有多至180个rCP的VLP(在CCMV的情况中)。例示了VLP，其中靶肽插入物(“I”)在衣壳的外部环中表达。
图3显示了用于在宿主细胞(例如假单胞菌宿主细胞)中生成VLP中的肽多聚体的方案。肽插入物是想要的靶肽的多聚体(显示了三聚体)，其编码序列(“i”)在构建重组病毒衣壳基因(“rCP”)时被插入病毒衣壳编码序列(“CP”)中。每个靶肽编码序列以切割位点的编码序列(“*”)为边界，并将整个核酸插入物标记为“I”。
图4是SDS-PAGE凝胶(顶部)和Western印迹(底部)的图像，其显示了诱导后24小时被分开成可溶性和不可溶性级分的在荧光假单胞菌中表达的具有第129位BamHI限制性位点的未经亲水性优化的CCMV衣壳蛋白(CP)的表达。以箭头标示CCMV衣壳蛋白。第1道是大小梯(“M”)，第2道是诱导后0小时的CP(“0”)，第3道是诱导后24小时的CP(“24”)。
图5是SDS-PAGE凝胶的图像，其显示了可溶性和不溶性级分中诱导后0、6、12、18、和24小时时经亲水性优化的CCMV衣壳蛋白在荧光假单胞菌细菌系统中的表达。以箭头标示可溶性经亲水性优化的CCMV衣壳蛋白，并产生大于2g/L。第1道是大小梯(“M”)，第2道是用于比较的衣壳蛋白(CP)标准品。
图6是Western印迹的图像，其显示了经亲水性优化的CCMV衣壳蛋白的表达，所述经亲水性优化的CCMV衣壳蛋白已经在蔗糖密度梯度中自荧光假单胞菌细菌系统纯化。诱导后24小时，通过PEG沉淀分离经亲水性优化的CCMV VLP，并在蔗糖密度梯度上分级。来自蔗糖密度梯度上的底部条带的VLP级分是经亲水性优化的CCMV衣壳蛋白阳性的。标示了全细胞溶胞物、分子量梯、PEG沉淀的VLP级分(蔗糖梯度加载)、及顶部和底部蔗糖密度级分。
图7是自荧光假单胞菌细菌系统纯化的可溶性经亲水性优化的CCMVVLP的透射电子显微术(“TEM”)图像。使用PEG沉淀和蔗糖密度分级自荧光假单胞菌分离可溶性经亲水性优化的CCMV VLP。
图8是SDS-PAGE凝胶的图像，其显示了在荧光假单胞菌中表达的被工程化改造成表达炭疽保护性抗原(“PA1”)的具有第129位BamHI限制性位点的未经亲水性优化的CCMV衣壳蛋白的表达。以箭头标示衣壳蛋白-PA1融合物。诱导后0小时和24小时时，通过PEG沉淀来分离CCMV衣壳蛋白，并在蔗糖密度梯度上分级。第1道是大小梯(“M”)。嵌合外壳蛋白主要是不溶性的。
图9是SDS-PAGE凝胶的图像，其显示了在荧光假单胞菌中表达的被工程化改造成表达炭疽保护性抗原(“PA1”)的经亲水性优化的CCMV衣壳蛋白的表达。以箭头标示衣壳蛋白-PA1融合物。诱导后0、6、12、18、和24小时时分离经亲水性优化的CCMV衣壳蛋白。第1道是大小梯(“M”)，第2道是用于比较的衣壳蛋白(CP)标准品。嵌合外壳蛋白主要是可溶性的。
图10例示了使用通过基于交叠延伸(“SOE”)的技术进行的剪接将经亲水性优化的CCMV衣壳融合肽克隆入荧光假单胞菌质粒中。
用于实施发明的方式
已经发现了衣壳重组多肽的总体氨基酸组成是可溶性VLP生成中的一项重要变量。具有高含量疏水性残基的CP-融合肽在水溶液中可能具有有限的溶解度或者可能完全不溶。提高CP-融合肽的亲水性可以在对VLP或插入肽的折叠、装配、或功能没有不利影响的情况中改善VLP溶解度。一种用于提高CP-融合肽亲水性的具体策略包括提高跨越氨基酸聚焦区域的衣壳蛋白、肽插入物、或两者的亲水性。
可以通过计算跨越特定区域所包含的氨基酸的亲水性值来测定由构建体中的核酸序列编码的蛋白质或肽的亲水性，其中所述计算基于改良Roseman疏水性标量(表2)。可以通过在核酸构建体中消除、诱变、或添加核酸密码子来提高VLP的亲水性，其中所述密码子编码氨基酸。例如，基于特定聚焦区域亲水性的计算，可以改变核酸构建体以便提高那个区域的亲水性。若一个区域具有基于改良Roseman疏水性标量的低亲水性值，则可以改变该区域中的密码子以提高该区域的亲水性。
在本发明的一个实施方案中，可以通过消除具有基于改良Roseman疏水性标量(表2)的低得不想要的亲水性值的密码子来增加具有低亲水性的聚焦区域的亲水性值。在本发明的别的实施方案中，可以通过用具有基于改良Roseman疏水性标量(表2)的较高亲水性值的氨基酸替换编码低亲水性的氨基酸的密码子来增加具有低亲水性的聚焦区域的亲水性值。或者，可以通过添加一个或超过一个编码具有想要的依照改良疏水性标量(表1)的亲水性值的氨基酸的密码子来提高聚焦区域的亲水性。
I.亲水性的测定
已经发现了跨越特定区域的CP-融合肽的亲水性氨基酸含量强烈地影响VLP溶解度。例如，具有低亲水性聚焦区域的CP-融合肽可能具有有限的溶解度。一处聚焦区域包括感兴趣肽插入病毒衣壳融合物中的区域，包括限制酶位点。提高聚焦区域上的CP-融合肽的亲水性可以提供体内生成的可溶性VLP的产量增加。
如本文中所使用的，术语“经亲水性优化的”描述包含衣壳蛋白(CP)或CP-融合肽的核酸构建体，其中已经设计、工程化改造、或改变所述核酸构建体以提高CP或CP-融合肽内聚焦区域的基于改良Roseman疏水性标量(表2)的亲水性。
“亲水性”氨基酸(如该术语在本文中所使用的)指具有高于0.0的改良Roseman疏水性标量值的氨基酸。
如本文中所使用的，术语“亲水性％”指具有所鉴定的亲水性氨基酸百分比的特定氨基酸序列，其中亲水性氨基酸具有高于0.0的改良Roseman疏水性标量值。例如，编码氨基酸Arg-Gly-Gly-Arg-Try-Trp的亲水性聚焦区域可以具有66％的亲水性。
术语“改良Roseman疏水性标量”(如该术语在本文中所使用的)指基于对由Roseman(Hydrophilicity of polar amino acid side-chains is markedlyreduced by flanking peptide bonds，J.Mol.Biol.1999，200：513-522)、Kyte和Doolittle(A simple method for displaying the hydropathic character of a protein，J.Mol.Biol.1982，157：105-132)、及Black和Mould(Development ofhydrophobicity parameters to analyze proteins which bear post-or cotranslationalmodifications，Analytical Biochemistry，1991，193：72-82)产生的疏水性数据的改良和由Gunasekaran等(Beta-hairpins in proteins revisited：lessons for de novodesign，Protein Eng.1997，10：1131-1141)进行的研究而指定给氨基酸的亲水性值。表1中提供了Roseman、Kyte和Doolittle、及Black和Mould疏水性标量。
表1：未改良的疏水性标量
首先，列出Roseman数据，并自0定标至10，其中10为最亲水的，而0为最疏水的。因为脯氨酸通常在衣壳蛋白环中发现(Ragone等，Flexibility plot ofproteins，Protein Eng.1989，7，497-504)，所以脯氨酸就被放置在胱氨酸下面，这与由Black和Mould产生的数据一致。另外，由于苏氨酸通常在衣壳蛋白环中发现的实情(Ragone等，Flexibility plot of proteins，Protein Eng.1989，7，497-504)，其提升至丝氨酸和甘氨酸之间，这与Kyte和Doolittle及Black和Mould两者的数据一致。然后，基于通常在柔性环中找到的小氨基酸(诸如丙氨酸和脯氨酸)需要进行分类以使得它们会具有高于疏水性氨基酸的偏爱的实情，选择甲硫氨酸作为亲水性的边界。然后自所有数值减去2.4以使甲硫氨酸的值为0。表2中提供了所得的改良Roseman疏水性标量。改良Roseman疏水性标量是如下排序的，其中病毒衣壳蛋白背景中最亲水的氨基酸具有最高的正值。
表2：改良的Roseman疏水性标量
  Arg   7.6
  Asp   7.4
  Glu   6.0
  Lys   5.7
  Asn   4.4
  Gln   3.4
  Ser   3.3
  Thr   2.3
  Gly   1.3
  His   1.0
  Cys   0.9
  Pro   0.8
  Ala   0.7
  Met   0.0
  Val   -0.8
  Tyr   -1.1
  Ile   -1.6
  Leu   -1.6
  Trp   -2.1
  Phe   -2.4
II.核酸构建体
本发明提供了编码病毒衣壳蛋白和CP-融合肽的经亲水性优化的核酸构建体。所编码的衣壳蛋白或融合肽在细菌宿主系统中的体内表达导致可溶性的、装配好的VLP的生成增强。如下设计本发明的经亲水性优化的核酸构建体，即分析病毒衣壳蛋白或CP-融合肽内的聚焦区域，并调节低亲水性区域，其通过经由添加、减去或诱变特定氨基酸(包括使用基于改良Roseman疏水性标量的亲水性优化规则)来修饰该区域而实现。
在本发明的一些实施方案中，通过消除编码具有低亲水性值(诸如小于0.0的值)的氨基酸的密码子来提高核酸构建体内具有低亲水性值的聚焦区域的亲水性值。在本发明的其它实施方案中，如下提高核酸构建体内具有低亲水性值的聚焦区域的亲水性值，即通过定点诱变或SOE来消除初始CCMV外壳蛋白构建体第63位和第129位插入位点处的氨基酸。
在本发明的别的实施方案中，可以通过用具有较高亲水性值(大于0.0)的氨基酸替换编码低亲水性(小于0.0)的氨基酸的密码子来增加具有低亲水性值的鉴定区域的亲水性值。或者，可以通过添加一个或超过一个编码具有想要的亲水性值(大于0.0)的氨基酸的密码子来提高聚焦区域的亲水性。
在本发明的一些实施方案中，提供了一种核酸构建体，其中优选使用具有高于改良Roseman疏水性标量中1.0的数值的氨基酸来提高聚焦区域的疏水性。在其它实施方案中，将具有高于改良Roseman疏水性标量中1.0的数值的氨基酸添加至聚焦区域以提高该区域的亲水性。在别的实施方案中，利用具有高于改良Roseman疏水性标量中1.0的数值的氨基酸来替换或替代具有小于1.0的数值的氨基酸。
经亲水性优化的衣壳蛋白
在一些实施方案中，本发明提供了编码经亲水性优化的病毒衣壳蛋白的分离的核酸构建体。在一个具体的实施方案中，所述经亲水性优化的衣壳蛋白衍生自二十面体病毒。在一些实施方案中，所述经优化的衣壳蛋白衍生自二十面体病毒，其是CCMV。在其它实施方案中，所述经优化的衣壳蛋白衍生自SEQ ID NO：1。
CCMV是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)的雀麦花叶病毒(bromovirus)组的成员。雀麦花叶病毒是具有四组分、正义、单链RNA基因组的25-28nm直径二十面体病毒。RNA1和RNA2编码复制酶。RNA3编码牵涉植物宿主内病毒运动的蛋白质。RNA4(一种自RNA3衍生的亚基因组RNA)，即sgRNA4，编码20kDa衣壳蛋白(“CP”)。每个CCMV颗粒含有多至约180个拷贝的CCMVCP。参见图2和图3。
在一个实施方案中，本发明提供了编码病毒衣壳蛋白的核酸构建体，其中所述病毒衣壳蛋白含有编码至少50％亲水性区域的经工程化改造的限制性位点。所述经工程化改造的限制性位点为感兴趣肽提供插入位点，容许能自我装配成可溶性VLP的病毒衣壳蛋白-肽融合肽(“CP-肽融合物”)的生成。在一个实施方案中，所述限制性位点具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、或至少85％的亲水性区域。在一个实施方案中，所述经工程化改造的限制性位点具有100％的亲水性区域。
在一个实施方案中，所述经工程化改造的限制性位点由编码氨基酸天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、和精氨酸(Asp-Glu-Lys-Arg)的核酸密码子构成。在一个实施方案中，所述经工程化改造的限制性位点不含编码两个或更多个连续的选自下组的疏水性氨基酸的密码子：丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、或脯氨酸。参见实施例2。在一个实施方案中，经亲水性优化的限制性位点包含在自CCMV衣壳蛋白衍生的衣壳蛋白内。在一个实施方案中，所述经亲水性优化的衣壳蛋白包含SEQ ID NO：2，其中在环接合处插入至少一个氨基酸。
在具体的实施方案中，用于选择用于将克隆位点引入CCMV衣壳蛋白环中的限制性位点的标准一般包括：1)该限制性位点应当是核糖体结合位点-CCMV CP可读框(ORF)盒所没有的；2)该限制性位点应当是荧光假单胞菌表达载体所没有的；和3)该限制性位点插入物不应导致氨基酸异亮氨酸继之有亮氨酸的引入。在一个普遍的实施方案中，限制性位点插入不应翻译成两个或更多个连续的疏水性氨基酸，包括丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、或脯氨酸。选定的限制性位点的非限制性例子是：平端切割者(cutter)，诸如AfeI；3’突出端切割者，诸如BmtI和PvuI；和5’突出端切割者，诸如BglII、BsiWI、BspEI、BssSI、MluI、NheI和XbaI。
含有疏水性聚焦区域(加下划线的)的CCMV CP的氨基酸序列：
mstvgtgklt raqrraaark nkrntrvvqp vivepiasgqgraikawtgy svskwtasca aaeawraaaa kvtsaitisl pnelssernk qlkvgrvllw lgllpsvsgtvkscvtetqt taaasfqval avadngilsk dvvaamypea fkgitleqlt adltiylyss aaltegdvivhlevehvrpt fddsftpvy(SEQ ID NO：1).
初始CCMV CP的氨基酸序列：
mstvgtgklt raqrraaarknkrntrvvqp vivepiasgq gkaikawtgy svskwtasca aaeakvtsai tislpnelss ernkqlkvgrvllwlgllps vsgtvkscvt etqttaaasf qvalavadns kdvvaamype afkgitleql tadltiylyssaaltegdvi vhlevehvrp tfddsftpvy(SEQ ID NO：2).
用于克隆入荧光假单胞菌表达载体中的经亲水性优化的CCMV CP的核酸序列(针对荧光假单胞菌优化的密码子)含有SpeI限制性位点、核糖体结合位点、CP可读框(ORF)、两个终止密码子、和XhoI限制性位点：
GGACTAGTAGGAGGTAACTTATGTCGACC
GTGGGTACTGGGAAATTGACTCGGGCACAACGTCGTGCTGCGGCCCGTA
AGAATAAGCGCAAAACCCGCGTCGTCCAGCCTGTTATCGTCGAGCCAAT
CGCCTCGGGGCAAGGGAAAGCCATCAAGGCATGGACCGGGTACTCGGTG
AGCAAATGGACCGCGTCGTGCGCGGCAGCCGAGGCCAAAGTGACGAGC
GCGATCACCATCAGCTTGCCTAACGAGCTGTCCAGCGAACGCAACAAGC
AGCTCAAGGTCGGTCGTGTGCTGCTGTGGTTGGGCCTGCTCCCGAGCGTC
TCCGGCACCGTGAAGTCGTGCGTGACGGAAACCCAGACGACTGCGGCCG
CATCGTTCCAAGTGGCGCTCGCCGTGGCCGATAACAGCAAGGACGTGGT
GGCCGCTATGTATCCTGAGGCCTTCAAGGGCATCACCCTGGAGCAGCTG
ACGGCCGACCTGACGATCTACCTGTACTCCTCGGCCGCGTTGACCGAGG
GCGATGTGATCGTGCACCTCGAAGTTGAACACGTGCGCCCGACTTTCGA
CGATTCCTTTACCCCGGTTTATTGATAATAGCTCGAGGC(SEQ ID NO：3).
为了在荧光假单胞菌中表达而经密码子优化的、经亲水性优化的CCMVCP的核酸序列：
ATGTCGACCGTGGGTACTGGGAA
ATTGACTCGGGCACAACGTCGTGCTGCGGCCCGTAAGAATAAGCGCAAA
ACCCGCGTCGTCCAGCCTGTTATCGTCGAGCCAATCGCCTCGGGGCAAG
GGAAAGCCATCAAGGCATGGACCGGGTACTCGGTGAGCAAATGGACCG
CGTCGTGCGCGGCAGCCGAGGCCAAAGTGACGAGCGCGATCACCATCAG
CTTGCCTAACGAGCTGTCCAGCGAACGCAACAAGCAGCTCAAGGTCGGT
CGTGTGCTGCTGTGGTTGGGCCTGCTCCCGAGCGTCTCCGGCACCGTGAA
GTCGTGCGTGACGGAAACCCAGACGACTGCGGCCGCATCGTTCCAAGTG
GCGCTCGCCGTGGCCGATAACAGCAAGGACGTGGTGGCCGCTATGTATC
CTGAGGCCTTCAAGGGCATCACCCTGGAGCAGCTGACGGCCGACCTGAC
GATCTACCTGTACTCCTCGGCCGCGTTGACCGAGGGCGATGTGATCGTGC
ACCTCGAAGTTGAACACGTGCGCCCGACTTTCGACGATTCCTTTACCCCG
GTTTATTGATAATAG(SEQ ID NO：4).
CCMV CP的经亲水性和密码子优化的核酸序列的变体：
ATGAGTACTGTTGGCACTGGTAAATTGACTCGGGCCCAGCGT
CGTGCCGCCGCTCGCAAGAATAAGCGGAAGACCCGCGTGGTCCAACCTG
TGATCGTGGAGCCCATCGCCTCCGGCCAGGGTAAAGCGATCAAAGCCTG
GACGGGGTACAGTGTCAGCAAATGGACGGCTTCGTGCGCTGCCGCGGAG
GCCAAGGTCACGTCCGCTATCACCATTTCCCTGCCCAACGAGCTGAGCA
GCGAGCGCAATAAGCAACTGAAGGTCGGCCGGGTCCTGCTGTGGCTGGG
GTTGTTGCCTAGCGTGTCGGGCACCGTGAAGTCGTGCGTCACCGAAACC
CAGACCACGGCAGCCGCTTCGTTCCAAGTGGCGCTGGCCGTCGCCGATA
ATTCCAAGGATGTCGTCGCGGCCATGTACCCGGAGGCTTTTAAGGGCAT
CACCCTGGAACAATTGACCGCCGACCTGACTATCTACCTCTATTCGTCGG
CTGCCTTGACTGAGGGCGACGTGATCGTGCATTTGGAAGTCGAACACGT
CCGTCCTACCTTTGACGACAGCTTTACCCCGGTGTACTGATAATAG(SEQ
ID NO：5).
用于在荧光假单胞菌中表达的豇豆褪绿斑点病毒(CCMV)衣壳蛋白(CP)的经密码子优化的核酸序列(编码区对应于SEQ ID NO：1)：
ATGTCGACCGTGGGTACTGGGAAATT
GACTCGGGCACAACGTCGTGCTGCGGCCCGTAAGAATAAGCGCAAAACC
CGCGTCGTCCAGCCTGTTATCGTCGAGCCAATCGCCTCGGGGCAAGGGA
AAGCCATCAAGGCATGGACCGGGTACTCGGTGAGCAAATGGACCGCGTC
GTGCGCGGCAGCCGAGGCCAAAGTGACGAGCGCGATCACCATCAGCTTG
CCTAACGAGCTGTCCAGCGAACGCAACAAGCAGCTCAAGGTCGGTCGTG
TGCTGCTGTGGTTGGGCCTGCTCCCGAGCGTCTCCGGCACCGTGAAGTCG
TGCGTGACGGAAACCCAGACGACTGCGGCCGCATCGTTCCAAGTGGCGC
TCGCCGTGGCCGATAACAGCAAGGACGTGGTGGCCGCTATGTATCCTGA
GGCCTTCAAGGGCATCACCCTGGAGCAGCTGACGGCCGACCTGACGATC
TACCTGTACTCCTCGGCCGCGTTGACCGAGGGCGATGTGATCGTGCACCT
CGAAGTTGAACACGTGCGCCCGACTTTCGACGATTCCTTTACCCCGGTTT
ATTGATAATAG.
用于在荧光假单胞菌中表达的豇豆褪绿斑点病毒(CCMV)衣壳蛋白(CP)的经密码子优化的核酸序列：
ATGAGTACTGTTGGCACTGGTAAATTGACTCGGGCCCAGCGTCGTGCCG
CCGCTCGCAAGAATAAGCGGAAGACCCGCGTGGTCCAACCTGTGATCGT
GGAGCCCATCGCCTCCGGCCAGGGTAAAGCGATCAAAGCCTGGACGGGG
TACAGTGTCAGCAAATGGACGGCTTCGTGCGCTGCCGCGGAGGCCAAGG
TCACGTCCGCTATCACCATTTCCCTGCCCAACGAGCTGAGCAGCGAGCGC
AATAAGCAACTGAAGGTCGGCCGGGTCCTGCTGTGGCTGGGGTTGTTGC
CTAGCGTGTCGGGCACCGTGAAGTCGTGCGTCACCGAAACCCAGACCAC
GGCAGCCGCTTCGTTCCAAGTGGCGCTGGCCGTCGCCGATAATTCCAAG
GATGTCGTCGCGGCCATGTACCCGGAGGCTTTTAAGGGCATCACCCTGG
AACAATTGACCGCCGACCTGACTATCTACCTCTATTCGTCGGCTGCCTTG
ACTGAGGGCGACGTGATCGTGCATTTGGAAGTCGAACACGTCCGTCCTA
CCTTTGACGACAGCTTTACCCCGGTGTACTGATAATAG.
经亲水性优化的CP-融合肽
在本发明的备选实施方案中，提供了编码CP-肽融合物的经亲水性优化的核酸构建体。CP-融合肽表达数据提示插入病毒衣壳蛋白中的肽应当具有至少约56％的亲水性。在本发明的一个实施方案中，提供了如下核酸构建体，其中改变所编码的肽插入物以将肽的亲水性提高至达到至少56％的亲水性。若所插入的肽具有小于56％的亲水性，则可以如下改善亲水性，即添加额外的氨基酸、减去氨基酸、或改变现有氨基酸的核酸序列以便编码具有更有利的亲水性值的氨基酸。
在本发明的另一个实施方案中，可以如下修饰所插入的肽，即通过定点诱变或SOE来消除初始CCMV外壳蛋白构建体第63位和第129位插入位点处的氨基酸。
在另一个实施方案中，可以如下对所插入的肽进行亲水性优化，即向肽的N或C端添加一个或多个具有大于1.0的改良Roseman疏水性标量值的氨基酸。在一个备选的实施方案中，可以如下优化所插入的肽，即自N或C端消除一个或多个具有小于0.0的改良Roseman疏水性值的氨基酸。或者，可以如下优化所插入的肽，即将一个或多个氨基酸用在改良Roseman疏水性标量上具有比所述一个或多个氨基酸大的值的氨基酸替换。
在一个具体的实施方案中，通过向肽的N或C端添加具有高于1.0的值的氨基酸来优化所插入的肽。或者，通过向肽的N或C端添加具有高于0.0的值的氨基酸来优化所插入的肽。在一个实施方案中，通过自肽的N或C端消除具有小于0.0的值的氨基酸来优化所插入的肽。在一个备选的实施方案中，通过将氨基酸用具有在改良Roseman疏水性标量上具有较高值的氨基酸替换来优化所插入的肽。
在一个实施方案中，可以如下优化肽，即将至少一个选自由天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、或精氨酸组成的组的氨基酸添加至N或C端以便提高肽的亲水性。
或者，可以工程化改造核酸构建体以获得经亲水性优化的CP-肽融合物。例如，可以通过提供容许亲水性聚焦区域增加的克隆策略来优化跨越插入物区域的CP-肽融合物。在一个实施方案中，使用基于限制性消化进行的克隆方法来生成经亲水性优化的CP-感兴趣蛋白质核酸融合物。例如，该融合物可以是编码重组多肽和经亲水性优化的二十面体衣壳蛋白的序列的，其中通过基于限制性消化进行的克隆方法来将重组多肽与经亲水性优化的二十面体衣壳蛋白融合。
在一些实施方案中，使用基于PCR的技术来生成经亲水性优化的CP-感兴趣蛋白质核酸融合物。例如，该融合物可以是编码重组多肽和经亲水性优化的二十面体衣壳蛋白的序列的，其中通过基于PCR的技术来将重组多肽与经亲水性优化的二十面体衣壳蛋白融合。在某些实施方案中，所述基于PCR的技术是通过交叠延伸(“SOE”)进行的剪接，如图10中所例示的。SOE的基本规程记载于Horton等(1989)“Engineering hybrid genes without the use ofrestriction enzymes：Gene splicing by overlap extension，”Gene 77：61-68；及Ho等的美国专利号5,023,171。SOE是一种用于如下连接两种DNA分子的方法，即首先通过使用设计的寡核苷酸引物对每种分子实施的聚合酶链式反应(PCR)来扩增它们以使得所得的PCR产物的末端含有互补的序列。在混合、变性和复性两种PCR产物时，在其3’末端具有互补序列的单链DNA链退火，然后充当彼此的引物。通过DNA聚合酶进行的退火区域的延伸生成双链DNA分子，其中最初的分子被剪接在一起。
另外，在将肽插入衣壳蛋白中后，可以通过添加、消除、或改变限制酶位点中的氨基酸来优化核酸构建体。在一个实施方案中，可以通过消除含有不想要的亲水性的氨基酸的限制酶位点来提高CP-融合肽的亲水性。在某些实施方案中，融合衣壳蛋白和肽插入物后，可以通过诱变来改变或消除限制性位点。在某些实施方案中，通过定点诱变来改变或消除限制酶位点。
具有来自流感病毒的M2e-1插入物的CCMV CP的氨基酸序列。以大写字母显示M2e-1氨基酸序列。加下划线的残基被鉴定为疏水性的聚焦区域。百分比(％)亲水性是65：
mstvgtgklt raqrraaark nkrntrvvqp vivepiasgq graikawtgy svskwtascaaaeawraaaa kvtsaitisl pnelssernk qlkvgrvllw lgllpsvsgt vkscvtetqt taaasfqval avadngilSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDgil sk dvvaamypea fkgitleqlt adltiylyssaaltegdviv hlevehvrpt fddsftpvy(SEQ ID NO：6).
具有来自流感病毒的M2e-1插入物的经亲水性优化的CCMV CP的氨基酸序列。以大写字母显示M2e-1氨基酸序列。百分比(％)亲水性是78％：
mstvgtgklt raqrraaark nkrntrvvqpvivepiasgq graikawtgy svskwtasca aaea kvtsaitisl pnelssernk qlkvgrvllw lgllpsvsgtvkscvtetqt taaasfqval avadn srSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDsr skdvvaamypea fkgitleqlt adltiylyss aaltegdviv hlevehvrpt fddsftpvy(SEQ ID NO：7).
具有来自炭疽的PA1插入物的CCMV CP的氨基酸序列。以大写字母显示PA1氨基酸序列。加下划线的残基被鉴定为疏水性的聚焦区域。百分比(％)亲水性是77：
mstvgtgklt raqrraaark nkrntrvvqp vivepiasgq graikawtgy svskwtasca aaeawraaaakvtsaitisl pnelssernk qlkvgrvllw lgllpsvsgt vkscvtetqt taaasfqval avadngilSNSRKKRSTSAGPTVPDRDNDGIPD gil sk dvvaamypea fkgitleqlt adltiylyssaaltegdviv hlevehvrpt fddsftpvy(SEQ ID NO：8).
具有来自炭疽的PA1插入物的经亲水性优化的CCMV CP的氨基酸序列。以大写字母显示PA1氨基酸序列。百分比(％)亲水性是90：
mstvgtgklt raqrraaark nkrntrvvqp vivepiasgqgraikawtgy svskwtasca aaea kvtsaitisl pnelssernk qlkvgrvllw lgllpsvsgt vkscvtetqttaaasfqval avadn srSNSRKKRSTSAGPTVPDRDNDGIPDsr sk dvvaamypeafkgitleqlt adltiylyss aaltegdviv hlevehvrpt fddsftpvy(SEQ ID NO：9).
具有来自炭疽的PA4插入物的CCMV CP的氨基酸序列。以大写字母显示PA4氨基酸序列。加下划线的残基被鉴定为疏水性的聚焦区域。百分比(％)亲水性是61：
mstvgtgklt raqrraaark nkrntrvvqp vivepiasgq graikawtgy svskwtasca aaeawraaaakvtsaitisl pnelssernk qlkvgrvllw lgllpsvsgt vkscvtetqt taaasfqval avadngilRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPN gil sk dvvaamypea fkgitleqlt adltiylyssaaltegdviv hlevehvrpt fddsftpvy(SEQ ID NO：10).
具有来自炭疽的PA4插入物的经亲水性优化的CCMV CP的氨基酸序列。以大写字母显示PA4氨基酸序列。百分比(％)亲水性是72：
mstvgtgklt raqrraaark nkrntrvvqp vivepiasgqgraikawtgy svskwtasca aaea kvtsaitisl pnelssernk qlkvgrvllw lgllpsvsgt vkscvtetqttaaasfqval avadn srRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNsr sk dvvaamypeafkgitleqlt adltiylyss aaltegdviv hlevehvrpt fddsftpvy(SEQ ID NO：11).
使用SOE生成的含有M2e-1插入物的经亲水性优化的CCMV CP的氨基酸序列(M2e-1氨基酸序列以大写字母显示)：
mstvgtgklt raqrraaark nkrntrvvqp vivepiasgq graikawtgy svskwtasca aaeakvtsaitisl pnelssernk qlkvgrvllw lgllpsvsgt vkscvtetqt taaasfqval avadnSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDsk dvvaamypea fkgitleqlt adltiylyss aaltegdvivhlevehvrpt fddsftpvy(SEQ ID NO：12).
使用SOE生成的含有PA1插入物的经亲水性优化的CCMV CP的氨基酸序列(PA1氨基酸序列以大写字母显示)：
mstvgtgklt raqrraaark nkrntrvvqp vivepiasgq graikawtgy svskwtasca aaeakvtsaitisl pnelssernk qlkvgrvllw lgllpsvsgt vkscvtetqt taaasfqval avadnSNSRKKRSTSAGPTVPDRDNDGIPD sk dvvaamypea fkgitleqlt adltiylyssaaltegdviv hlevehvrpt fddsftpvy(SEQ ID NO：13).
使用SOE所生成的含有PA4插入物的经亲水性优化的CCMV CP的氨基酸序列(以大写字母显示的PA4氨基酸序列)：
mstvgtgklt raqrraaark nkrntrvvqp vivepiasgq graikawtgy svskwtasca aaea kvtsaitislpnelssernk qlkvgrvllw lgllpsvsgt vkscvtetqt taaasfqval avadnRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPN sk dvvaamypea fkgitleqlt adltiylyssaaltegdviv hlevehvrpt fddsftpvy(SEQ ID NO：14).
启动子
在一个实施方案中，核酸构建体包括启动子序列，其可操作接至编码衣壳蛋白-重组多肽融合肽的核酸序列。可操作附接或连接指任何如下构造，其中转录和任何翻译调控元件共价附接至所描述的序列以使得通过宿主细胞的作用，调控元件能指导感兴趣序列的表达。
在一种发酵方法中，一旦诱导靶重组多肽的表达，理想的是具有高水平的生成以便使表达系统的效率最大化。启动子启动转录，并且一般位于核糖体结合位点上游10-100个核苷酸处。理想地，启动子会强到足以容许重组多肽积累到宿主细胞总体细胞蛋白质的约50％，受到紧密调控，而且容易(且便宜)进行诱导。
依照本发明所使用的启动子可以是组成型启动子或可调型启动子。常用的诱导型启动子及其随后的诱导物的例子包括lac(IPTG)、lacUV5(IPTG)、tac(IPTG)、trc(IPTG)、Psyn(IPTG)、trp(色氨酸饥饿)、araBAD(1-阿拉伯糖)、lppa(IPTG)、lpp-lac(IPTG)、phoA(磷酸盐饥饿)、recA(萘啶(酮)酸)、proU(摩尔渗透压浓度)、cst-l(葡萄糖饥饿)、tetA(四环素)、cadA(pH)、nar(厌氧条件)、PL(热变化至42℃)、cspA(热变化至20℃)、T7(热诱导)、T7-lac操纵基因(IPTG)、T3-lac操纵基因(IPTG)、T5-lac操纵基因(IPTG)、T4基因32(T4感染)、nprM-lac操纵基因(IPTG)、Pm(烃基或卤代-苯甲酸盐/酯)、Pu(烃基或卤代-甲苯)、Psal(水杨酸盐)、和VHb(氧)。参见例如S.C.Makrides(1996)Microbiol.Rev.60：512-538；G.Hannig和S.C.Makrides(1998)TIBTECH 16：54-60；R.C.Stevens(2000)Structures 8，R177-R185；J.Sanchez-Romero和V.De Lorenzo，Genetic Engineering of NonpathogenicPseudomonas strains as Biocatalysts for Industrial and Environmental Methodes，于Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology(A.Demain和J.Davies编)第460-74页(1999)(ASM Press，Washington，D.C.)；H.Schweizer，Vectorsto express foreign genes and techniques to monitor gene expression forPseudomonads，Current Opinion in Biotechnology，12：439-445(2001)；及R.Slater和R.Williams，The Expression of Foreign DNA in Bacteria，于MolecularBiology and Biotechnology(J.Walker和R.Rapley编)第125-54页(2000)(TheRoyal Society of Chemistry，Cambridge，UK)。
还可以使用具有对于选定的细菌宿主细胞而言天然的启动子的核苷酸序列的启动子来控制编码靶多肽的转基因的表达，例如假单胞菌邻氨基苯甲酸盐或苯甲酸盐操纵子启动子(Pant，Pben)。还可以使用串联启动子，其中一个以上的启动子共价附接至另一个启动子，无论序列是相同的还是不同的，例如Pant-Pben串联启动子(启动子间的杂合物)或Plac-Plac串联启动子。
可调型启动子利用启动子调控蛋白以控制启动子是其一部分的基因的转录。若使用可调型启动子，则相应的启动子调控蛋白也会是表达系统的一部分。启动子调控蛋白的例子包括：激活蛋白，例如大肠杆菌分解代谢物激活蛋白，MalT蛋白；AraC家族转录激活物；阻抑蛋白，例如大肠杆菌LacI蛋白；和双功能调控蛋白，例如大肠杆菌NagC蛋白。许多可调型启动子/启动子调控蛋白对在本领域中是已知的。
启动子调控蛋白与效应器化合物相互作用，所述效应器化合物即如下化合物，其可逆地或不可逆地与调控蛋白相结合以使得所述蛋白质能够释放或结合启动子控制下的基因中的至少一个DNA转录调控区，由此容许或阻断转录酶在启动基因转录中的作用。效应器化合物分类为诱导物或协阻抑物，并且这些化合物包括天然效应器化合物和义务诱导物化合物。许多可调型启动子/启动子调控蛋白/效应器化合物三元组合在本领域中是已知的。虽然效应器化合物可贯穿细胞培养或发酵使用，但是在使用可调型启动子的一个具体的实施方案中，在宿主细胞生物量生长到想要的数量或密度后，将合适的效应器化合物添加至培养物以直接地或间接地导致想要靶基因的表达。
举例而言，在利用lac家族启动子的情况中，lacI基因、或其衍生物诸如lacIQ或lacIQ1基因也可存在于系统中。lacI基因(其(通常)是组成型表达的基因)编码Lac阻抑蛋白(LacI蛋白)，其结合这些启动子的lac操纵基因。如此，在利用lac家族启动子的情况中，lacI基因也可包括在表达系统中，并在表达系统中表达。在lac启动子家族成员(例如tac启动子)的情况中，效应器化合物是诱导物，优选义务诱导物，诸如IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，也称作“异丙基硫代半乳糖苷”)。
在一个具体的实施方案中，在本发明中利用lac或tac家族启动子，包括Plac、Ptac、Ptrc、PtacII、PlacUV5、lpp-PlacUV5、lpp-lac、nprM-lac、T7lac、T5lac、T3lac、和Pmac。
其它元件
其它调控元件可包括在表达构建体中，包括lacO序列。此类元件包括但不限于例如转录增强子序列、翻译增强子序列、其它启动子、激活子、翻译起始和终止信号、转录终止子、顺反子调节物、多顺反子调节物、标签序列(诸如核苷酸序列“标签”和“标签”肽编码序列)，其促进所表达的多肽的鉴定、分开、纯化、或分离，包括His标签、Flag标签、T7标签、S标签、HSV标签、B标签、Strep标签、聚精氨酸、聚半胱氨酸、聚苯丙氨酸、聚天冬氨酸、(Ala-Trp-Trp-Pro)n、硫氧还蛋白、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶、CTP：CMP-3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸胞苷酰基转移酶(3-deoxy-manno-octulosonate cytidylyltransferase)、trpE或trpLE、亲合素、链霉亲合素、T7基因10、T4gp55、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G、GST、DHFR、CBP、MBP、半乳糖结合域、钙调蛋白结合域、GFP、KSI、c-myc、ompT、ompA、pelB、NusA、泛素、和溶血素A。
在一个实施方案中，核酸构建体进一步包含与感兴趣重组蛋白或肽的编码序列邻近的标签序列、或与病毒衣壳蛋白的编码序列连接的标签序列。在一个实施方案中，此标签序列容许蛋白质的纯化。标签序列可以是亲和标签，诸如六组氨酸亲和标签。在另一个实施方案中，亲和标签可以是谷胱甘肽-S-转移酶分子。标签还可以是荧光分子，诸如YFP或GFP，或此类荧光蛋白的类似物。标签还可以是对纯化有用的已知结合配偶的已知抗原或配体、或抗体分子的一部分。
在衣壳蛋白-重组多肽编码序列之外，本发明还可以包括与其可操作连接的下列调控元件：启动子、核糖体结合位点(RBS)、转录终止子、翻译起始和终止信号。有用的RBS可自在依照本发明的表达系统中可用作宿主细胞的任何物种获得。许多特异的和多种共有的RBS是已知的，例如那些在D.Frishman等，Starts of bacterial genes：estimating the reliability of computerpredictions，Gene 234(2)：257-65(1999年7月8日)；及B.E.Suzek等，Aprobabilistic method for identifying start codons in bacterial genomes，Bioinformatics 17(12)：1123-30(2001年12月)中记载的和提及的。另外，可使用天然的或合成的RBS，例如那些记载于：EP 0207459(合成的RBS)；O.Ikehata等，Primary structure of nitrile hydratase deduced from the nucleotidesequence of a Rhodococcus species and its expression in Escherichia coli，Eur.J.Biochem.181(3)：563-70(1989)的(天然RBS序列AAGGAAG)。本发明中有用的方法、载体、和翻译和转录元件及其它元件的进一步的例子记载于例如Gilroy的美国专利No.5,055,294和Gilroy等的美国专利No.5,128,130；Rammler等的美国专利No.5,281,532；Barnes等的美国专利No.4,695,455和4,861,595；Gray等的美国专利No.4,755,465；及Wilcox的美国专利No.5,169,760。
载体
本发明的核酸构建体可以包含在能够在细菌宿主细胞中表达的载体中。一般而言，重组表达载体会包括复制起点和容许宿主细胞转化(例如本发明的衣壳蛋白-重组多肽融合肽)的选择标志和自高度表达的基因衍生以指导下游结构序列转录的启动子。异源结构序列以合适的状态与翻译起始和终止序列装配在一起。任选地，异源序列可编码包含赋予想要的特性(例如所表达重组产物的稳定化或简化的纯化)的N端鉴定肽的融合多肽。
可以如下构建对于在表达衣壳蛋白-重组多肽融合肽(例如用荧光假单胞菌)中应用有用的表达载体，即以与功能性启动子可操作的阅读状态插入结构DNA序列以及合适的翻译起始和终止信号，所述结构DNA序列编码与衣壳肽融合的想要的靶多肽。载体可以包含一种或多种表型选择标志和复制起点以确保载体的维持，并在想要时提供宿主内的扩增。依照本公开内容的适用于转化的宿主包括假单胞菌属内的多种物种，并且具体的是，荧光假单胞菌的宿主细胞株。
对于在宿主细胞中表达重组蛋白有用的载体是本领域中已知的，并且可以修饰这些中的任一种，并用于体内表达依照本发明的可溶性融合产物。此类载体包括例如质粒、粘粒、和噬菌体表达载体。可以针对本发明上的用途进行修饰的有用质粒载体的例子包括但不限于表达质粒pBBR1MCS、pDSK519、pKT240、pML122、pPS10、RK2、RK6、pRO1600、和RSF1010。进一步的例子可以包括pALTER-Ex1、pALTER-Ex2、pBAD/His、pBAD/Myc-His、pBAD/gIII、pCal-n、pCal-n-EK、pCal-c、pCal-Kc、pcDNA2.1、pDUAL、pET-3a-c、pET 9a-d、pET-11a-d、pET-12a-c、pET-14b、pET15b、pET-16b、pET-17b、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21a-d(+)、pET-22b(+)、pET-23a-d(+)、pET24a-d(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET28a-c(+)、pET-29a-c(+)、pET-30a-c(+)、pET31b(+)、pET-32a-c(+)、pET-33b(+)、pET-34b(+)、pET35b(+)、pET-36b(+)、pET-37b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a-c(+)、pET-42a-c(+)、pET-43a-c(+)、pETBlue-1、pETBlue-2、pETBlue-3、pGEMEX-1、pGEMEX-2、pGEX1λT、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-3X、pGEX-4T、pGEX-5X、pGEX-6P、pHAT10/11/12、pHAT20、pHAT-GFPuv、pKK223-3、pLEX、pMAL-c2X、pMAL-c2E、pMAL-c2g、pMAL-p2X、pMAL-p2E、pMAL-p2G、pProEX HT、pPROLar.A、pPROTet.E、pQE-9、pQE-16、pQE-30/31/32、pQE-40、pQE-50、pQE-70、pQE-80/81/82L、pQE-100、pRSET、和pSE280、pSE380、pSE420、pThioHis、pTrc99A、pTrcHis、pTrcHis2、pTriEx-1、pTriEx-2、pTrxFus。此类有用的载体的其它例子包括那些记载于例如：N.Hayase，于Appl.Envir.Microbiol.60(9)：3336-42(1994年9月)；A.A.Lushnikov等，于Basic Life Sci.30：657-62(1985)；S.Graupner和W.Wackemagel，于Biomolec.Eng.17(1)：11-16(2000年10月)；H.P.Schweizer，于Curr.Opin.Biotech.12(5)：439-45(2001年10月)；M.Bagdasarian和K.N.Timmis，于Curr.Topics Microbiol.Immunol.96：47-67(1982)；T.Ishii等，于FEMS Microbiol.Lett.116(3)：307-13(1994年3月1日)；I.N.Olekhnovich和Y.K.Fomichev，于Gene 140(1)：63-65(1994年3月11日)；M.Tsuda和T.Nakazawa，于Gene 136(1-2)：257-62(1993年12月22日)；C.Nieto等，于Gene 87(1)：145-49(1990年3月1日)；J.D.Jones和N.Gutterson，于Gene 61(3)：299-306(1987)；M.Bagdasarian等，于Gene16(1-3)：237-47(1981年12月)；H.P.Schweizer等，于Genet.Eng.(NY)23：69-81(2001)；P.Mukhopadhyay等，于J.Bact.172(1)：477-80(1990年1月)；D.O.Wood等，于J.Bact.145(3)：1448-51(1981年3月)；及R.Holtwick等，于Microbiology 147(Pt 2)：337-44(2001年2月)的。
可用于假单胞菌宿主细胞的表达载体的进一步例子包括那些列于下表中的，如自指明的复制子衍生的。
有用的表达载体的非限制性例子
Figure G2008800225385D00231
表达质粒RSF1010记载于例如F.Heffron等，于Proc.Nat’l Acad.Sci.USA72(9)：3623-27(1975年9月)及K.Nagahari和K.Sakaguchi，于J.Bact.133(3)：1527-29(1978年3月)。质粒RSF1010及其衍生物是本发明中特别有用的载体。例示性的、有用的RSF1010衍生物(其在本领域中是已知的)包括例如pKT212、pKT214、pKT231及相关质粒，和pMYC1050及相关质粒(参见例如Thompson等的美国专利No.5,527,883和5,840,554)，诸如例如pMYC1803。质粒pMYC1803衍生自基于RSF1010的质粒pTJS260(参见Wilcox的美国专利No.5,169,760)，其携带来自RSF1010质粒的可调型四环素抗性标志及复制和转移基因座(replication and mobilization loci)。其它例示性的有用的载体包括那些记载于Puhler等的美国专利No.4,680,264的。
在其它实施方案中，表达质粒可以作为表达载体使用。在另一个实施方案中，RSF1010或其衍生物可以作为表达载体使用。在又一个实施方案中，pMYC1050或其衍生物，或pMYC1803或其衍生物可以作为表达载体使用。
ChampionTM pET表达系统提供了高水平的蛋白质生成。自T7lac启动子诱导表达。此系统利用噬菌体T7RNA聚合酶的高活性和特异性来高水平地转录感兴趣基因。位于启动子区中的lac操纵基因提供了比传统的基于T7的载体更紧密的调控，这改善了质粒稳定性和细胞生存力(F.W.Studier和B.A.Moffatt(1986)J.Molecular Biology 189(1)：113-30；Rosenberg等(1987)Gene56(1)：125-35)。T7表达系统使用T7启动子和T7 RNA聚合酶(T7RNAP)来高水平地转录感兴趣基因。可以在T7表达系统中实现高水平表达，因为T7RNAP比天然的大肠杆菌RNAP更有条理(methodive)，而且致力于转录感兴趣基因。可以通过在宿主细胞中提供T7RNAP的来源来诱导所鉴定基因的表达。这可以通过使用含有T7RNAP基因的染色体拷贝的BL21大肠杆菌宿主来实现。T7RNAP基因在可由IPTG诱导的lacUV5启动子的控制下。T7RNAP可以在诱导后进行表达，并转录感兴趣基因。
pBAD表达系统经由特定碳源(诸如葡萄糖、甘油和阿拉伯糖)的存在而容许重组蛋白的紧密控制的、可滴定的表达(Guzman等(1995)J.Bacteriology 177(14)：4121-30)。独特地设计pBAD载体以对表达水平给予精确的控制。在araBAD启动子处启动来自pBAD载体的异源基因表达。启动子受到araC基因产物的正和负两种调控。AraC是与L-阿拉伯糖形成复合物的转录调节物。在没有L-阿拉伯糖的情况中，AraC二聚体阻断转录。为了最大限度的转录激活，需要两项事件：(i.)L-阿拉伯糖结合至AraC，这容许转录开始；(ii)cAMP激活蛋白(CAP)-cAMP复合物结合至DNA，并刺激AraC结合至启动子区的正确位置。
trc表达系统容许大肠杆菌中自trc启动子的高水平、可调型表达。trc表达载体已经得到了优化以在大肠杆菌中表达真核基因。trc启动子是自色氨酸(trp)和乳糖(lac)启动子衍生的强杂合启动子。它受到lacO操纵基因和lacIQ基因产物的调控(J.Brosius，(1984)Gene 27(2)：161-72)。
III.病毒衣壳蛋白
本发明利用自病毒衍生的衣壳蛋白。在本发明的一些实施方案中，衣壳蛋白的氨基酸序列选自分类为具有二十面体形态学的病毒的衣壳蛋白。二十面体形态学包括二十面体的正常的(proper)、等轴的、准等轴的、和成对的或“成对的”。在其它实施方案中，衣壳蛋白氨基酸序列可以选自二十面体正常的实体的衣壳蛋白。在另一个实施方案中，衣壳蛋白氨基酸序列可以选自二十面体病毒的衣壳蛋白。在一个具体的实施方案中，衣壳蛋白氨基酸序列可以选自二十面体植物病毒的衣壳蛋白。然而，在另一个实施方案中，病毒衣壳可以衍生自对于植物而言是非感染性的二十面体病毒。例如，在一个实施方案中，病毒是对于哺乳动物而言是感染性的病毒。
一般而言，二十面体病毒的病毒衣壳由许多以二十面体(立体)对称排列的蛋白质亚基构成。可以装配天然二十面体衣壳，例如，其中3个亚基形成衣壳的每个三角形面，导致60个亚基形成完整的衣壳。此小病毒结构的代表是例如噬菌体
Figure G2008800225385D00251
许多二十面体病毒衣壳含有超过60个亚基。二十面体病毒的许多衣壳蛋白含有反向平行的、八链β-桶折叠基序。该基序具有楔形块，其中4条β链(称作BIDG)在一侧，另4条(称作CHEF)在另一侧。还有两个保守的α-螺旋(称作A和B)，一个在βC与βD之间，另一个在βE与βF之间。
有包膜病毒能离开受感染细胞而不完全破坏它，其通过颗粒穿过膜的挤压(出芽)来实现，在此过程中，颗粒被包在自细胞膜衍生的脂质包膜中(参见例如：A.J.Cann(编)(2001)Principles of Molecular Virology(AcademicPress)；A.Granoff和R.G.Webster(编)(1999)Encyclopedia of Virology(Academic Press)；D.L.D.Caspar(1980)Biophys.J.32：103；D.L.D.Caspar和A.Klug(1962)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.27：1；J.Grimes等(1988)Nature 395：470；J.E.Johnson(1996)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 93：27；及J.Johnson和J.Speir(1997)J.Mol.Biol.269：665)。
病毒
病毒分类学认可包壳颗粒实体的以下分类单元：
组I病毒，即dsDNA病毒；
组II病毒，即ssDNA病毒；
组III病毒，即dsRNA病毒；
组IV病毒，即没有DNA阶段的ssRNA(+)链病毒；
组V病毒，即ssRNA(-)链病毒；
组VI病毒，即RNA类反转录病毒，其是ssRNA逆转录病毒；
组VII病毒，即DNA类反转录病毒，其是dsDNA逆转录病毒；
δ病毒；
类病毒；和
卫星噬菌体和卫星病毒，其排除卫星核酸和阮病毒。
衣壳蛋白的氨基酸序列可以选自这些分类单元之任一项的任何成员的衣壳蛋白。这些分类单元成员的衣壳蛋白的氨基酸序列可以获自如下来源，包括但不限于例如：由NCBI于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi提供的PubMed搜索工具的在线“核苷酸”(Genbank)、“蛋白质”、和“结构”部分。
在一个实施方案中，衣壳蛋白氨基酸序列会选自对至少一种以下宿主特异性的分类单元成员：真菌(包括酵母)、植物、原生动物(包括藻类)、无脊椎动物、脊椎动物、和人。在一个实施方案中，衣壳蛋白氨基酸序列会选自以下分类单元之任一项的成员：组I、组II、组III、组IV、组V、组VII、类病毒、和卫星病毒。在一个实施方案中，衣壳蛋白氨基酸序列会选自这7种分类单元之任一项的成员，其对6种上文所述宿主类型之至少一种是特异性的。在一个更具体的实施方案中，衣壳蛋白氨基酸序列会选自组II、组III、组IV、组VII、和卫星病毒之任一项；或者选自组II、组IV、组VII、和卫星病毒之任一项的成员。在另一个实施方案中，病毒衣壳蛋白选自组IV或组VII。
病毒衣壳蛋白序列可以衍生自对细胞非向性的病毒。在一个实施方案中，细胞不包括除想要的二十面体蛋白质以外的来自特定选定病毒的病毒蛋白。在一个实施方案中，病毒衣壳可以衍生自如下的病毒，其具有对与该细胞不同的生物体科的向性。在另一个实施方案中，病毒衣壳可以衍生自如下的病毒，其具有对与该细胞不同的生物体属的向性。在另一个实施方案中，病毒衣壳可以衍生自如下的病毒，其具有对与该细胞不同的生物体种的向性。在一个具体的实施方案中，病毒衣壳可以选自组IV的病毒。
在一个实施方案中，病毒衣壳选自二十面体病毒。所述二十面体病毒可以选自下组之任一项的成员：乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、全病毒科(Totiviridae)、双顺反子病毒科(Dicistroviridae)、肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、披膜病毒科(Togaviridiae)、多瘤病毒科(Polyomaviridiae)、野田村病毒科(Nodaviridae)、覆盖层病毒科(Tectiviridae)、轻小病毒科(Leviviridae)、微小病毒科(Microviridae)、长尾病毒科(Sipoviridae)、野田村病毒科(Nodaviridae)、小RNA病毒科(Picornoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、杯状病毒科(Calciviridae)、四病毒科(Tetraviridae)、和卫星病毒。
在一个具体的实施方案中，所述序列可以选自对至少一种植物宿主特异性的分类单元之任一项的成员。在一个实施方案中，所述二十面体植物病毒种类会是植物感染性病毒种类，其是下组分类单元之任一项或其成员：布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、黄矮病毒科(Luteoviridae)、矮缩病毒科(Nanoviridae)、双组分RNA病毒科(Partitiviridae)、伴生病毒科(Sequiviridae)、芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)、欧尔密病毒(Ourmiavirus)、烟草坏死病毒卫星(TobaccoNecrosis Virus Satellite)、花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)、双生病毒科(Geminiviridae)、豇豆花叶病毒科(Comoviridae)、南方菜豆花叶病毒组(Sobemovirus)、蕃茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、或雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)分类单元。在一个实施方案中，所述二十面体植物病毒种类是植物感染性病毒种类，其是下组分类单元之任一项或其成员：黄矮病毒科、矮缩病毒科、双组分RNA病毒科、伴生病毒科、芜菁黄花叶病毒科、欧尔密病毒、烟草坏死病毒卫星、花椰菜花叶病毒科、双生病毒科、豇豆花叶病毒科、南方菜豆花叶病毒组、蕃茄丛矮病毒科、或雀麦花叶病毒科分类单元。在具体的实施方案中，所述二十面体植物病毒种类是植物感染性病毒种类，其是下组病毒之任一项或其成员：花椰菜花叶病毒科、双生病毒科、豇豆花叶病毒科、南方菜豆花叶病毒组、蕃茄丛矮病毒科、或雀麦花叶病毒科。在更具体的实施方案中，所述二十面体植物病毒种类会是植物感染性病毒种类，其是下组病毒之任一项或其成员：豇豆花叶病毒科、南方菜豆花叶病毒组、蕃茄丛矮病毒科、或雀麦花叶病毒科。在其它实施方案中，所述二十面体植物病毒种类会是植物感染性病毒种类，其是豇豆花叶病毒科或雀麦花叶病毒科的成员。在一个具体的实施方案中，所述病毒衣壳衍生自豇豆花叶病毒或豇豆褪绿斑点病毒。在另一个实施方案中，所述病毒衣壳衍生自雀麦花叶病毒科分类单元的种类。在一个具体的实施方案中，所述衣壳衍生自等轴不稳定环斑病毒组(Ilarvirus)或苜蓿花叶病毒(Alfamovirus)。在又一个实施方案中，所述衣壳衍生自烟草线条病毒、苜蓿花叶病毒(“AMV”)(包括AMV1或AMV2)。
VLP
本发明的二十面体病毒衣壳蛋白在所描述的宿主细胞中是非感染性的。在一个实施方案中，可以在表达病毒衣壳蛋白过程中或者之后在宿主细胞中形成可溶性病毒样颗粒(“VLP”)或笼形结构。在一个实施方案中，VLP或笼形结构还包含感兴趣的蛋白质或肽，并且在一个具体的实施方案中，在VLP的表面上表达感兴趣的蛋白质或肽。典型地，表达系统不含容许病毒感染性的别的病毒蛋白。在一个典型的实施方案中，表达系统包括宿主细胞和编码一种或多种病毒衣壳蛋白和可操作连接的感兴趣蛋白质或肽的载体。典型地，载体不包含别的病毒装配蛋白。
在一个实施方案中，VLP或笼形结构是衣壳蛋白的多聚体装配物，包括自3个至约200个或更多个衣壳蛋白，如图2和图3中所显示的。在一个实施方案中，VLP或笼形结构包括至少30个、至少50个、至少60个、至少90个或至少120个衣壳蛋白。在另一个实施方案中，每个VLP或笼形结构包括至少150个衣壳蛋白、至少160个、至少170个、或至少180个衣壳蛋白。
在一个实施方案中，VLP作为二十面体结构表达。在另一个实施方案中，以与衍生衣壳序列的天然病毒的几何学相同的几何学表达VLP。然而，在一个分开的实施方案中，VLP没有天然病毒的相同几何学。例如，在某些实施方案中，以由多个衣壳形成的颗粒生成所述结构，但不形成天然型VLP。例如，可以形成少至3个病毒衣壳的笼形结构。在分开的实施方案中，可以形成约6个、9个、12个、15个、18个、21个、24个、27个、30个、33个、36个、39个、42个、45个、48个、51个、54个、57个、或60个衣壳的笼形结构。
在一个实施方案中，至少一种衣壳蛋白包括至少一种感兴趣蛋白质或肽。在一个实施方案中，在VLP的至少一个内部环内或在至少一个外部表面环中表达所述蛋白质或肽。
在某些实施方案中，可以修饰宿主细胞以改善VLP的装配。例如，可以将宿主细胞修饰成包括伴侣蛋白，其促进自所表达的病毒衣壳形成VLP。在另一个实施方案中，可以将宿主细胞修饰成包括阻抑蛋白以更有效地调控衣壳蛋白的表达，以便促进VLP的可调型形成。
另外，还可以修饰编码一种或多种病毒衣壳蛋白的核酸序列以改变VLP的形成(参见例如Brumfield等(2004)J.Gen.Virol 85：1049-1053)。例如，最典型地，为修饰VLP表达和装配产生3种普遍类型的修饰。设计这些修饰以改变装配好的蛋白质笼中邻近亚基之间的界面、内部、或外部。为了实现这个，可以使用诱变引物来：(i)通过用酸性谷氨酸替换N端中的碱性残基(例如K、R)来改变病毒核酸结合区的内部表面电荷(Douglas等，2002b)；(ii)自N端删除内部残基(在CCMV中，通常是残基4-37)；(iii)将编码11个氨基酸的多肽细胞靶向序列的cDNA(Graf等，1987)插入表面暴露环中；和(iv)通过改变金属结合位点(在CCMV中，是残基81/148突变体)来修饰病毒亚基之间的相互作用。
在本发明的VLP可以包含治疗活性剂时，还可以使用它们来治疗人或动物患者中的病症。如此，本发明可以用于治疗人或动物患者中的疾病或病症，包括给所述患者施用有效量的本发明的VLP。
还可以使用VLP免疫原性制备物或“混合物”来施用单一疫苗，其引起针对许多感染剂的保护性的或治疗方面受益的免疫应答。
IV.重组多肽
在一个实施方案中，与病毒衣壳序列可操作连接的肽或蛋白质插入物含有至少两个氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白质或肽的长度是至少3个、至少4个、至少5个、或至少6个氨基酸。在一个分开的实施方案中，所述蛋白质或肽是长至少7个氨基酸。所述蛋白质或肽还可以是长至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、30个、45个、50个、60个、65个、75个、85个、95个、96个、99个或更多个氨基酸。在一个实施方案中，所编码的蛋白质或肽是至少25kD。
在一个实施方案中，所述蛋白质或肽会含有自2个至约300个氨基酸、或约5个至约250个氨基酸、或约5个至约200个氨基酸、或约5个至约150个氨基酸、或约5个至约100个氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白质或肽含有自约10个至约140个氨基酸、或自约10个至约120个氨基酸、或自约10个至约100个氨基酸。
在一个实施方案中，与病毒衣壳序列可操作连接的肽或蛋白质会含有约500个氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽会含有小于500个氨基酸。在又一个实施方案中，所述肽可以含有多至约300个氨基酸、或多至约250个、或多至约200个、或多至约180个、或多至约160个、或多至约150个、或多至约140个、或多至约120个、或多至约110个、或多至约100个、或多至约90个、或多至约80个、或多至约70个、或多至约60个、或多至约50个、或多至约40个或多至约30个氨基酸。
在一个实施方案中，与二十面体衣壳蛋白融合的重组多肽可以是至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少75个、至少85个、至少95个、至少99个、或至少100个氨基酸。
在本发明的一个实施方案中，重组多肽含有想要靶肽的至少1个单体。在一个备选的实施方案中，重组多肽含有想要靶肽的超过1个的单体。在某些实施方案中，所述多肽由至少2个、至少5个、至少10个、至少15个或至少20个分开的单体构成，所述单体可以作为多联体肽与衣壳蛋白可操作连接。在另一个实施方案中，可以通过可切割接头区连接多联体肽中的各单体个体。在又一个实施方案中，可以将重组多肽插入二十面体病毒样颗粒的至少一个表面环中。在一个实施方案中，可以在病毒样颗粒的表面环中插入至少1个单体。
与病毒衣壳蛋白融合的感兴趣蛋白质或肽可以是异源蛋白质，即其不是衍生自病毒，且任选地，其不是衍生自与细胞相同的物种。与病毒衣壳蛋白融合的感兴趣蛋白质或肽可以是：功能肽；结构肽；抗原肽、毒性肽、抗微生物肽、其片段；其前体；任何上述的组合；和/或任何上述的多联体。在本发明的一个实施方案中，重组多肽是对于人和动物治疗有用的治疗肽。
功能肽包括但不限于例如：生物活性肽(即如下的肽，其施加、引发、或在其它方面导致生物学实体(例如生物体、细胞、培养物、组织、器官、或细胞器)的或者生物学实体中的生物学功能或活性的启动、增强、延长、衰减、终止、或阻止)；催化肽；微结构和纳米结构活性肽(即形成经工程化改造的微结构或纳米结构的一部分的肽，它们在所述微结构或纳米结构中或者连同所述微结构或纳米结构运行活性，例如运动、能量转换)；和刺激肽(stimulant peptide)(例如肽调味剂、着色剂、芳香剂、信息素、引诱剂、阻碍素、和驱除剂(repellant))。
生物活性肽包括但不限于例如：免疫活性肽(例如抗原性肽、变应性肽、肽免疫调节剂、肽免疫调控剂)；信号传导和信号转导肽(例如肽激素、细胞因子、和神经递质；受体；激动性和拮抗性肽；多肽靶向和分泌信号肽)；和生物抑制肽(例如毒性的、杀生物的、或抑制生物的肽，诸如肽毒素和抗微生物肽)。
结构肽包括但不限于例如：肽适体；折叠肽(例如，促进或诱导另一个分子中的物理构象形成或保留的肽)；粘附促进肽(例如粘附肽、细胞粘附促进肽)；界面肽(例如，肽表面活性剂和乳化剂)；微结构和纳米结构构筑肽(即形成经工程化改造的微结构或纳米结构的一部分的结构肽)；和活化前肽(例如，前-、原-、和前-原-形式的蛋白质和肽的前导肽；内含肽)。
催化肽包括例如：apo B RNA编辑胞苷脱氨酶肽；谷氨酰胺酰-tRNA合成酶的催化肽；天冬氨酸转氨甲酰酶的催化肽；植物1型核糖体灭活肽；病毒催化肽，诸如例如口蹄疫病毒[FMDV-2A]催化肽；基质金属蛋白酶肽；和催化性金属寡肽。
所述蛋白质或肽还可以是肽、半抗原、或相关肽(例如，抗原性病毒肽；病毒相关肽，例如HIV相关肽、肝炎相关肽；抗体独特型域；细胞表面肽；抗原性人、动物、原生动物、植物、真菌、细菌、和/或古细菌肽；变应性肽和变应原脱敏肽)。
所述蛋白质或肽还可以是：肽免疫调节剂或免疫调控剂(例如，干扰素、白介素、肽免疫抑制剂和免疫强化剂)；抗体肽(例如，单链抗体；单链抗体片段和构建体，例如单链Fv分子；抗体轻链分子、抗体重链分子、删除了结构域的抗体轻链或重链分子；单链抗体域和分子，例如CH1、CH1-3、CH3、CH1-4、CH4、VHCH1、CL、CDR1、或FR1-CDR1-FR2域；互补位肽(paratopicpeptide)；微抗体)；另一种结合肽(例如，肽适体、细胞内和细胞表面受体蛋白、受体片段；抗肿瘤坏死因子肽)。所述蛋白质或肽还可以是酶底物肽或酶抑制剂肽(例如，胱天蛋白酶底物和抑制剂、蛋白激酶底物和抑制剂、荧光共振能量传递肽酶底物)。
所述蛋白质或肽还可以是：细胞表面受体肽配体、激动剂、和拮抗剂(例如，雨蛙肽、强啡肽、食欲肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽、肿瘤坏死因子肽；合成肽配体、激动剂、和拮抗剂)；肽激素(例如，内分泌、旁分泌、和自分泌激素，包括例如：支链淀粉(amylins)、血管紧张肽、缓激肽、降钙素、心脏兴奋神经肽(cardioexcitatory neuropeptide)、酪啡肽、缩胆囊素、促肾上腺皮质激素和促肾上腺皮质激素相关肽、分化因子、内啡肽、内皮缩血管肽、脑啡肽、促红细胞生成素、毒蜥外泌肽(exendin)、促卵泡激素、甘丙肽、促胃液素、胰高血糖素和胰高血糖素样肽、促性腺激素、生长激素和生长因子、胰岛素、胰激肽(kallidin)、激肽、瘦蛋白、向脂激素(lipotropic hormone)、黄体生成素、促黑激素、褪黑激素、利尿钠肽、神经激肽、神经调节肽、伤害感受肽(nociceptin)、骨钙蛋白(osteocalcin)、催产素(即催产素)(oxytocin、ocytocin)、甲状旁腺激素、多营养因子(pleiotrophin)、促乳素、松弛素、分泌素、血清素(serotonin)、睡眠诱导肽、生长调节素、胸腺生成素、促甲状腺激素、促甲状腺素、硬骨鱼紧张肽(urotensin)、血管活性肠肽、血管升压素)；肽细胞因子、趋化因子、病毒因子、和病毒受体激素释放和释放抑制肽(viroceptor hormone releasing and release-inhibiting peptide)(例如，促肾上腺皮质激素释放激素、皮质抑素(cortistatin)、促卵泡激素释放因子、抑胃肽(gastric inhibitory peptide)、胃泌素释放肽、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素、促黄体激素释放激素(luteinizing hormone-releasing hormone)、促黑激素释放激素、促黑激素释放抑制因子；痛稳素(nocistatin)、胰抑制素、促乳素释放肽(prolactinreleasing peptide)、促乳素释放抑制因子；促生长素抑制素；促甲状腺素释放激素)；肽神经递质或通道阻断剂(例如，铃蟾肽、神经肽Y、神经降压肽、P物质)肽毒素、毒素前体肽、或毒素肽部分。在某些实施方案中，肽毒素不包含D-氨基酸。毒素前体肽可以是如下那些，它们不含D-氨基酸和/或尚未通过翻译后修饰而转化成天然毒素结构，诸如例如通过能够在氨基酸中引入D构型的D构型诱导剂(例如，肽异构酶或差向异构酶或消旋酶或转氨酶)的作用，和/或通过能够形成环形肽结构的环化剂(例如，肽硫酯酶、或肽连接酶诸如反式剪接蛋白质或内蛋白)的作用来实现。
毒素肽部分可以是含肽毒素的线性或环化前寡肽和多肽部分。肽毒素的例子包括例如美洲蜘蛛毒素(agatoxin)、鹅膏蕈毒素(amatoxin)、卡律布得蝎毒素(charybdotoxin)、氯毒素(chlorotoxin)、食鱼螺毒素(conotoxin)、树突毒素(dendrotoxin)、昆虫毒素(insectotoxin)、玛格斑蝎毒素(margatoxin)、肥大细胞脱粒肽(mast cell degranulating peptide)、皂草毒蛋白(saporin)、角蝰毒素(sarafotoxin)；和细菌外毒素诸如例如，炭疽毒素、肉毒毒素(botulism toxin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、和破伤风毒素(tetanus toxin)。
所述蛋白质或肽还可以是：代谢和消化相关的肽(例如，缩胆囊素-肠促胰酶素肽、肽yy、胰肽、促胃动素)；细胞粘附调节或介导肽、胞外基质肽(例如，粘附素、选择蛋白、层粘连蛋白)；神经保护剂(neuroprotectant)或髓鞘生成促进肽；聚集抑制肽(例如，细胞或血小板聚集抑制肽、淀粉状蛋白形成或沉积抑制肽)；连接肽(例如，心血管连接神经肽、iga连接肽)；或混杂的肽(例如，刺鼠相关肽(agouti-related peptide)、淀粉状肽、骨相关肽、可透过细胞的肽、芋螺抑制肽、contryphan、contulakin、髓磷脂碱性蛋白、及其它)。
在某些实施方案中，感兴趣蛋白质或肽可以是对于选定病毒衣壳蛋白而言外源的。肽在序列方面可以是天然的或合成的(并且它们的编码序列可以是天然的或合成的核苷酸序列)。如此，例如，涵盖天然的、经修饰的天然的、和完全人工的氨基酸序列。同样地，编码这些氨基酸序列的核酸分子的序列可以是天然的、经修饰的天然的、或完全人工的核酸序列，并且可以是例如用于(即由人力所应用的)获得核酸分子的一种或多种理性或随机突变和/或重组和/或合成和/或选择方法的结果。
若可获得的话，编码序列可以是靶多肽的天然编码序列，但是更典型地，会是已经针对在选定的表达宿主细胞中的使用而进行过选择、改善、或优化的编码序列：例如，通过合成反映宿主物种的密码子使用偏爱的基因来实现。在本发明的一个实施方案中，宿主物种是荧光假单胞菌，并且在设计信号序列和蛋白质或肽序列两者时考虑荧光假单胞菌的密码子偏爱。
抗原肽
在一个实施方案中，经由与病毒衣壳蛋白一起表达来生成抗原肽。抗原肽可以选自如下那些，它们是人或动物致病物(包括感染物、寄生物、癌细胞、和其它致病物)的抗原肽。此类致病物还包括那些物质的毒力因子和发病因子(例如，外毒素、内毒素等)。致病物可以展现出任何水平的毒力，即它们可以是例如毒力的、无毒力的、假毒力的、和半毒力的。在一个实施方案中，抗原肽可以含有来自致病物的表位氨基酸序列。在另一个实施方案中，表位氨基酸序列可以包括至少一种此类物质的表面蛋白质或肽的至少一部分。在一个实施方案中，衣壳蛋白-重组多肽VLP可以作为人或动物应用中的疫苗使用。
可以选择超过一种抗原肽，在该情况中，所得的VLP可以呈现多种不同抗原肽。在多抗原肽形式的一个具体的实施方案中，可以自多种致病物或自同一致病物选择多种抗原肽。在多抗原肽形式的一个具体的实施方案中，可以自多种密切相关的致病物(例如同一属的同一种或不同种的不同株、亚种、生物变型、致病变型、血清变型或基因变型)选择多种抗原肽。
在一个实施方案中，致病物可以属于下组中的至少一项：细菌和支原体物质，包括但不限于致病性的：芽胞杆菌(Bacillus spp.)，例如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)；巴尔通氏体(Bartonella spp.)，例如五日热巴尔通氏体(B.quintana)；布鲁氏菌(Brucella spp.)；伯克霍尔德氏菌(Burkholderia spp.)，例如类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei)；弯曲杆菌(Campylobacter spp.)；梭菌(Clostridium spp.)，例如破伤风梭菌(C.tetani)、肉毒梭菌(C.botulinum)；考克斯氏体(Coxiella spp.)，例如伯氏考克斯氏体(C.burnetii)；爱德华氏菌(Edwardsiella spp.)，例如迟钝爱德华氏(E.tarda)；肠杆菌(Enterobacter spp.)，例如阴沟肠杆菌(E.cloacae)；肠球菌(Enterococcus spp.)，例如粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)；埃希氏菌(Escherichia spp.)，例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)；弗朗西丝氏菌(Francisella spp.)，例如土拉热弗朗西丝氏菌(F.tularensis)；嗜血菌(Haemophilus spp.)，例如流感嗜血菌(H.influenzae)；克雷伯氏菌(Klebsiella spp.)，例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；军团菌(Legionella spp.)；利斯特氏菌(Listeria spp.)，例如单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)；脑膜炎球菌(Meningococci)和淋球菌(Gonococci)，例如奈瑟氏球菌(Neisseria spp.)；莫拉氏菌(Moraxella spp.)；分支杆菌(Mycobacterium spp.)，例如麻风分支杆菌(M.leprae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)；肺炎球菌(Pneumococci)，例如肺炎双球菌(Diplococcuspneumoniae)；假单胞菌(Pseudomonas spp.)，例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；立克次氏体(Rickettsia spp.)，例如普氏立克次氏体(R.prowazekii)、立氏立克次氏体(R.rickettsii)、斑疹伤寒立克次氏体(R.typhi)；沙门氏菌(Salmonella spp.)，例如伤寒沙门氏菌(S.typhi)；葡萄球菌(Staphylococcus spp.)，例如金黄色葡萄球菌(S.aureus)；链球菌(Streptococcusspp.)，包括A组链球菌和溶血性链球菌，例如肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)；链霉菌(Streptomyces spp.)；志贺氏菌(Shigella spp.)；弧菌(Vibrio spp.)，例如霍乱弧菌(V.cholerae)；和耶尔森氏菌(Yersinia spp.)，例如鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enteroeolitica)。真菌和酵母物质包括但不限于致病性的：链格孢(Alternaria spp.)；曲霉(Aspergillus spp.)；芽生菌(Blastomyces spp.)，例如皮炎芽生菌(B.dermatiditis)；假丝酵母(Candida spp.)，例如白色假丝酵母(C.albicans)；枝孢(Cladosporiumspp.)；球孢子菌(Coccidiodes spp.)，例如粗球孢子菌(C.immitis)；隐球菌(Cryptococcus spp.)，例如新型隐球菌(C.neoformans)；组织胞浆菌(Histoplasma spp.)，例如夹膜组织胞浆菌(H.capsulatum)；和孢子丝菌(Sporothrix spp.)，例如申克孢子丝菌(S.schenckii)。
在一个实施方案中，致病物可以来自原生生物物质，其包括但不限于治病性的：阿米巴(Amoebae)，包括棘阿米巴(Acanthamoeba spp.)、阿米巴(Amoeba spp.)、纳氏虫(Naegleria spp.)、内阿米巴(Entamoeba spp.)，例如溶组织内阿米巴(E.histolytica)；隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)，例如小球隐孢子虫(C.parvum)；环孢子虫(Cyclospora spp.)；脑胞内原虫(Encephalitozoonspp.)，例如肠道脑胞内原虫(E.intestinalis)；肠胞虫(Enterocytozoon spp.)；贾第鞭毛虫(Giardia spp.)，例如蓝氏贾第鞭毛虫(G.lamblia)；等孢子球虫(Isospora spp.)；微孢子虫(Microsporidium spp.)；疟原虫(Plasmodium spp.)，例如恶性疟原虫(P.falciparum)、三日疟原虫(P.malariae)、卵形疟原虫(P.ovale)、间日疟原虫(P.vivax)；弓形体(Toxoplasma spp.)，例如刚地弓形虫(T.gondii)；和锥虫(Trypanosoma spp.)，例如布氏锥虫(T.brucei)。
在一个实施方案中，致病物可以来自寄生物(例如蠕虫寄生物)包括但不限于致病性的：蛔虫(Ascaris spp.)，例如人蛔虫(A.lumbricoides)；龙线虫(Dracunculus spp.)，例如麦地那龙线虫(D.medinensis)；盘尾丝虫(Onchocercaspp.)，例如旋盘尾丝虫(O.volvulus)；血吸虫(Schistosoma spp.)；毛线虫(Trichinella spp.)，例如旋毛线虫(T.spiralis)；和鞭虫(Trichuris spp.)，例如人鞭虫(T.trichiura)。
在另一个实施方案中，致病物可以来自病毒物，包括但不限于致病性的：腺病毒(Adenovirus)；沙粒病毒(Arenavirus)，例如，拉沙热病毒(Lassa Fevervirus)；星状病毒(Astrovirus)；布尼亚病毒(Bunyavirus)，例如汉坦病毒(Hantavirus)、裂谷热病毒(Rift Valley Fever virus)；冠状病毒(Coronavirus)、δ病毒(Deltavirus)；巨细胞病毒(Cytomegalovirus)、埃巴病毒(Epstein-Barrvirus)、疱疹病毒(Herpes virus)、水痘病毒(Varicella virus)；线状病毒(Filovirus)，例如埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)；黄病毒(Flavirus)，例如登革热病毒(Dengue virus)、西尼罗热病毒(West Nile Fevervirus)、黄热病毒(Yellow Fever virus)；肝炎病毒(Hepatitis virus)；流感病毒(Influenzavirus)；慢病毒(Lentivirus)、T细胞亲淋巴病毒、其它白血病病毒；诺瓦克病毒(Norwalk virus)；乳头瘤病毒(Papillomavirus)，其它肿瘤病毒；副粘病毒(Paramyxovirus)，例如麻疹病毒(Measles virus)、腮腺炎病毒(Mumpsvirus)、副流感病毒(Parainfluenzavirus)、肺病毒(Pneumovirus)、仙台病毒(Sendai virus)；细小病毒组(Parvovirus)；小RNA病毒(Picornavirus)，例如心病毒(Cardiovirus)、柯萨奇病毒(Coxsackie virus)、艾柯病毒(Echovirus)、脊髓灰质炎病毒(Poliomyelitis virus)、鼻病毒(Rhinovirus)，其它肠道病毒(Enterovirus)；痘病毒(Poxvirus)，例如天花病毒(Variola virus)、牛痘病毒(Vaccinia virus)、副痘病毒(Parapoxvirus)；呼肠孤病毒(Reovirus)，例如Coltiviruses、环状病毒(Orbivirus)、轮状病毒(Rotavirus)；弹状病毒(Rhabdovirus)，例如狂犬病毒(Lyssavirus)、水泡性口膜炎病毒(VesicularStomatitis virus)；和披膜病毒(Togavirus)，例如风疹病毒(Rubella virus)、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、西方脑炎病毒(Western Encephalitis virus)。
在一个具体的实施方案中，抗原肽可以选自下组：犬细小病毒肽、炭疽保护性抗原肽、和东方马脑炎病毒抗原肽。在一个具体的实施方案中，抗原肽是具有SEQ ID NO：16、17、18或19的氨基酸序列之任一项的炭疽保护性抗原肽。在又一个具体的实施方案中，抗原肽是具有SEQ ID NO：20或21之一的氨基酸序列的东方马脑炎病毒抗原肽。
编码各种肽插入物的核酸序列
  序列   名称   SEQ ID
  SNSRKKRSTSAGPTVPDRDNDGIPD   炭疽芽孢杆菌保护性抗原1(“PA1”)肽的氨基酸序列   16
  SPEARHPLVAAYPIVHVDMENIILS   炭疽芽孢杆菌保护性抗原2(“PA2”)肽的氨基酸序列   17
  RIIFNGKDLNLVERRIAAVNPSDPL   炭疽芽孢杆菌保护性抗原3(“PA3”)肽的氨基酸序列   18
  序列   名称   SEQ ID
  RQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPN   炭疽芽孢杆菌保护性抗原4(“PA4”)肽的氨基酸序列   19
  DLDTHFTQYKLARPYIADCPNCGHS   东方马脑炎病毒抗原1(“EEE1”)肽的氨基酸序列   20
  GRLPRGEGDTFKGKLHVPFVPVKAK   东方马脑炎病毒保护性抗原2(“EEE2”)肽的氨基酸序列   21
   宿主细胞毒性肽
在另一个具体的实施方案中，所述重组多肽是如下肽，其在处于游离单体形式时对宿主细胞是有毒性的。在一个更具体的实施方案中，所述毒性肽是抗微生物肽。
在某些实施方案中，与病毒衣壳蛋白一起表达的感兴趣蛋白质或肽可以是宿主细胞毒性肽。在某些实施方案中，此蛋白质会是抗微生物蛋白质或肽。宿主细胞毒性肽指明如下生物抑制性肽，其对表达它的宿主细胞、或对宿主细胞为其成员的细胞培养物或生物体中的其它细胞、或对提供宿主细胞的生物体或物种的细胞是抑制生物的、杀生物的、或有毒性的。在一个实施方案中，宿主细胞毒性肽可以是生物抑制肽，其对表达它的宿主细胞是抑制生物的、杀生物的、或有毒性的。宿主细胞毒性肽的一些例子包括但不限于：肽毒素；抗微生物肽；和其它抗生肽。抗微生物肽包括例如：抗细菌肽，诸如例如爪蟾抗菌肽(magainin)、β-防卫素、一些α-防卫素；金环蛇抗菌肽(cathelicidin)；富组蛋白(histatin)；抗真菌肽；抗原生动物肽；合成的AMP；肽抗生素或其线性或环化前寡肽或多肽部分；其它抗生肽(例如驱肠虫肽、溶血性肽、杀肿瘤肽)；和抗病毒肽(例如一些α-防卫素；杀病毒肽；抑制病毒感染的肽)。在一个具体的实施方案中，抗微生物肽(“AMP”)是具有氨基酸序列SEQ ID NO：22的D2A21肽。
名称：D2A21三聚体抗微生物保护性抗原(“PA”)肽的氨基酸序列：FAKKFAKKFKKFAKKFAKFAFAFGDPFAKKFAKKFKKFAKKFAKFAFAFGDPFAKKFAKKFKKFAKKFAKFAFAFG(SEQ ID NO：22)。
在一个实施方案中，重组多肽是经亲水性优化的，并且例如包含低于50％的疏水性氨基酸含量和(在某些情况中)每5个氨基酸的至少1个带电荷的(即极性)氨基酸残基。在另一个实施方案中，重组多肽包含低于40％的疏水性氨基酸含量和每4个氨基酸的至少1个带电荷的氨基酸残基。
本发明还提供了具有编码经亲水性优化的CP-重组多肽的融合肽的核酸构建体的假单胞菌生物体。在本发明的一个具体的实施方案中，所述假单胞菌细胞是荧光假单胞菌。在一个实施方案中，所述细胞在体内生成可溶性的、装配好的VLP。在一个实施方案中，感兴趣蛋白质或肽可以是对人和动物治疗有用的治疗肽。
本发明还提供了一种用于生成重组多肽细胞的方法，其如下实现，即提供编码重组多肽和经亲水性优化的二十面体衣壳蛋白的融合肽的核酸；表达所述核酸，其中所述细胞中的表达提供可溶性的、装配好的VLP的体内生成，并分离所述VLP。在一个实施方案中，所述细胞是假单胞菌，且在某些实施方案中，是荧光假单胞菌。
V.重组假单胞菌细胞
本发明进一步提供了如下细菌宿主细胞，其包含编码病毒衣壳蛋白或CP-肽融合物的经亲水性优化的核酸构建体。在一个实施方案中，所述细菌宿主细胞选自由假单胞菌细胞组成的组。在一个实施方案中，所述细胞是荧光假单胞菌。在另一个实施方案中，所述细胞是大肠杆菌。可以在用于生成重组多肽的方法中利用所述细胞。
供在表达VLP中使用的细胞
典型的细菌细胞记载于例如“Biological Diversity：Bacteria andArchaeans”，即由M.J.Farabee博士(Estrella Mountain Community College，Arizona，USA)在URL：http://www.emc.maricotpa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookDiversity_2.html提供的在线生物学书籍的一章。在一个实施方案中，宿主细胞可以是真细菌的任何种的成员。宿主可以是任一项下列分类单元的成员：酸杆菌门(Acidobacteria)、放线杆菌门(Actinobacteira)、产液菌门(Aquificae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿菌门(Chlorobi)、衣原体门(Chlamydiae)、绿屈挠菌门(Choroflexi)、金矿菌门(Chrysiogenetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、异常球菌(Deinococcus)、网团菌门(Dictyoglomi)、丝状杆菌门(Fibrobacteres)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、浮霉状菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)、热微菌门(Thermomicrobia)、栖热袍菌门(Thermotogae)、栖热菌属(Thermus)(栖热菌目(Thermales))、或疣微菌门(Verrucomicrobia)。在真细菌宿主细胞的一个实施方案中，细胞可以是真细菌(除蓝细菌门之外)的任何种的成员。
细菌宿主还可以是变形菌门的任何种的成员。变形菌门宿主细胞可以是分类单元α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲、δ-变形菌纲或ε-变形菌纲中任一项的成员。另外，宿主可以是分类单元α-变形菌纲、β-变形菌纲或γ-变形菌纲中任一项的成员，和γ-变形菌纲的任何种的成员。
在γ-变形菌纲宿主的一个实施方案中，宿主可以是分类单元气单胞菌目(Aeromonadales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、或黄单胞菌目(Xanthomonadales)中任一项的成员；或肠杆菌目或假单胞菌目的任何种的成员。在一个实施方案中，宿主细胞可以是肠杆菌目的，宿主细胞会是肠杆菌科的成员，或欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、或沙雷氏菌属(Serratia)中任一项的成员；或埃希氏菌属的成员。在假单胞菌目的宿主细胞的一个实施方案中，宿主细胞会是假单胞菌科的成员，甚至是假单胞菌属的成员。γ-变形菌纲宿主包括种大肠杆菌的成员和种荧光假单胞菌的成员。
也可以使用其它假单胞菌生物体。假单胞菌和密切相关的物种包括革兰氏阴性变形菌门亚组1，其包括属于由R.E.Buchanan和N.E.Gibbons(编)，Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology，页217-289(第8版，1974)(TheWilliams and Wilkins Co.，Baltimore，MD，USA)(下文中的“Bergey(1974)”)以“革兰氏阴性好氧杆菌和球菌”描述的科和/或属的变形菌门组。
“革兰氏阴性变形菌门亚组1”还包括依照分类中所使用的标准会分类在此标题中的变形菌门。该标题还包括先前分类在此部分中但不再在此部分中的组，诸如食酸菌属(Acidovorax)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、氢噬胞菌属(Hydrogenophaga)、海洋单胞菌属(Oceanimonas)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(及自其衍生的属芽单胞菌属(Blastomonas))(其通过对属于黄单胞菌属(且先前称为黄单胞菌属的种)的生物体重新分组而创建)、酸单胞菌属(Acidomonas)(其通过对属于Bergey(1974)中定义的酸杆菌属(Acetobacter)的生物体重新分组而创建)。另外，宿主可包括来自下组的细胞：假单胞菌属、海洋假单胞菌(Pseudomonasenalia)(ATCC 14393)、生黑假单胞菌(Pseudomonas nigrifaciensi)(ATCC19375)、和腐败假单胞菌(Pseudomonas putrefaciens)(ATCC 8071)，它们已经分别被重新分类为河豚毒素交替单胞菌(Alteromonas haloplanktis)、产黑交替单胞菌(Alteromonas nigrifaciens)、和腐败交替单胞菌(Alteromonasputrefaciens)。类似地，例如后来食酸假单胞菌(Pseudomonas acidovorans)(ATCC 15668)和睾丸酮假单胞菌(Pseudomonas testosterone)(ATCC 11996)已经被分别重新分类为食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)和睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosterone)；而生黑假单胞菌(ATCC 19375)和杀鱼假单胞菌(Pseudomonas piscicida)(ATCC 15057)已经被分别重新分类为生黑假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)和杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)。
“革兰氏阴性变形菌门亚组1”还包括变形菌门中分类为属于任何如下科的：假单胞菌科、固氮菌科(现在通常以同义词即假单胞菌科的“固氮菌组”称呼)、根瘤菌科、和甲基单胞菌科(现在通常以同义词即“甲基球菌科”称呼)。因此，在那些于本文中所述的属之外，变形菌门中落入“革兰氏阴性变形菌门亚组1”内的其它属包括：1)嗜氮根瘤菌属(Azorhizophilus)的固氮菌组细菌；2)纤维弧菌属(Cellvibrio)、寡源杆菌属(Oligella)、和Teredinibacter的假单胞菌科细菌；3)螯合杆菌属(Chelatobacter)、剑菌属(Ensifer)、Liberibacter(也称为“Candidatus Liberibacter”)、和中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的根瘤菌科细菌；及4)甲基细菌属(Methylobacter)、甲基暖菌属(Methylocaldum)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基八叠球菌属(Methylosarcina)、和甲基球形菌属(Methylosphaera)的甲基球菌科细菌。
在另一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌门亚组2”。“革兰氏阴性变形菌门亚组2”定义为下列属(在圆括号中指明产品目录列出的、公众可获得的、已保藏的其菌株的总数，均保藏于ATCC，除非另有指明)的变形菌门组：酸单胞菌属(Acidomonas)(2)；酸杆菌属(Acetobacter)(93)；葡糖杆菌属(Gluconobacter)(37)；短波单胞菌属(Brevundimonas)(23)；拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)(13)；德克斯氏菌属(Derxia)(2)；布鲁氏菌属(Brucella)(4)；土壤杆菌属(Agrobacterium)(79)；螯合杆菌属(Chelatobacter)(2)；剑菌属(Ensifer)(3)；根瘤菌属(Rhizobium)(144)；中华根瘤菌属(Sinorhizobium)(24)；芽单胞菌属(Blastomonas)(1)；鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(27)；产碱菌属(Alcaligenes)(88)；博德特氏菌属(Bordetella)(43)；伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(73)；罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)(33)；食酸菌属(Acidovorax)(20)；氢噬胞菌属(Hydrogenophaga)(9)；动胶菌属(Zoogloea)(9)；甲基细菌属(Methylobacter)(2)；甲基暖菌属(Methylocaldum)(1，在NCIMB)；甲基球菌属(Methylococcus)(2)；甲基微菌属(Methylomicrobium)(2)；甲基单胞菌属(Methylomonas)(9)；甲基八叠球菌属(Methylosarcina)(1)；甲基球形菌属(Methylosphaera)；氮单胞菌属(Azomonas)(9)；嗜氮根瘤菌属(Azorhizophilus)(5)；固氮菌属(Azotobacter)(64)；纤维弧菌属(Cellvibrio)(3)；寡源杆菌属(Oligella)(5)；假单胞菌属(Pseudomonas)(1139)；弗朗西丝氏菌属(Francisella)(4)；黄单胞菌属(Xanthomonas)(229)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(50)；和海洋单胞菌属(Oceanimonas)(4)。
“革兰氏阴性变形菌门亚组2”的例示性宿主细胞物种包括但不限于下列细菌(在圆括号中显示其例示性菌株的ATCC或其它保藏号)：甲醇酸单胞菌(Acidomonas methanolica)(ATCC 43581)；醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)(ATCC 15973)；氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)(ATCC 19357)；缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)(ATCC 11568)；印度拜叶林克氏菌(Beijerinckia indica)(ATCC 9039和ATCC 19361)；胶德克斯氏菌(Derxiagummosa)(ATCC 15994)；马耳他布鲁氏菌(Brucella melitensis)(ATCC23456)；流产布鲁氏菌(Brucella abortus)(ATCC 23448)；根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(ATCC 23308)、放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)(ATCC 19358)、发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)(ATCC11325)；何氏螯合杆菌(Chelatobacter heintzii)(ATCC 29600)；粘着剑菌(Ensifer adhaerens)(ATCC 33212)；豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)(ATCC 10004)；费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)(ATCC 35423)；Blastomonas natatoria(ATCC 35951)；少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)(ATCC 29837)；粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)(ATCC 8750)；百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)(ATCC 9797)；洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)(ATCC 25416)；皮氏罗尔斯通氏菌(Ralstonia pickettii)(ATCC 27511)；敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)(ATCC 11228)；黄色氢噬胞菌(Hydrogenophaga flava)(ATCC 33667)；生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)(ATCC 19544)；藤黄甲基细菌(Methylobacter luteus)(ATCC 49878)；Methylocaldum gracile(NCIMB 11912)；荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)(ATCC 19069)；活泼甲基微菌(Methylomicrobium agile)(ATCC35068)；甲烷甲基单胞菌(Methylomonas methanica)(ATCC 35067)；Methylosarcina fibrata(ATCC 700909)；Methylosphaera hansonii(ACAM 549)；敏捷氮单胞菌(Azomonas agilis)(ATCC 7494)；雀稗嗜氮根瘤菌(Azorhizophiluspaspali)(ATCC 23833)；褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)(ATCC 9043)；混合纤维弧菌(Cellvibrio mixtus)(UQM 2601)；尿道寡源杆菌(Oligellaurethralis)(ATCC 17960)；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC10145)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(ATCC 35858)；土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)(ATCC 6223)；嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637)；野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)(ATCC 33913)；和Oceanimonas doudoroffii(ATCC 27123)。
在另一个实施方案中，宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组3”。“革兰氏阴性变形菌门亚组3”定义为下列属的变形菌门组：短波单胞菌属；土壤杆菌属；根瘤菌；中华根瘤菌属；芽单胞菌；鞘氨醇单胞菌属；产碱菌属；伯克霍尔德氏菌属；罗尔斯通氏菌属；食酸菌属；氢噬胞菌属；甲基细菌属；甲基暖菌属；甲基球菌属；甲基微菌属；甲基单胞菌属；甲基八叠球菌属；甲基球形菌属；氮单胞菌属；嗜氮根瘤菌属；固氮菌属；纤维弧菌属；寡源杆菌属；假单胞菌属；Teredinibacter；弗朗西丝氏菌属；寡养单胞菌属；黄单胞菌属；和海洋单胞菌属。
在另一个实施方案中，宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组4”。“革兰氏阴性变形菌门亚组4”定义为下列属的变形菌门组：短波单胞菌属；芽单胞菌；鞘氨醇单胞菌属；伯克霍尔德氏菌属；罗尔斯通氏菌属；食酸菌属；氢噬胞菌属；甲基细菌属；甲基暖菌属；甲基球菌属；甲基微菌属；甲基单胞菌属；甲基八叠球菌属；甲基球形菌属；氮单胞菌属；嗜氮根瘤菌属；固氮菌属；纤维弧菌属；寡源杆菌属；假单胞菌属；Teredinibacter；弗朗西丝氏菌属；寡养单胞菌属；黄单胞菌属；和海洋单胞菌属。
在一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌门亚组5”。“革兰氏阴性变形菌门亚组5”定义为下列属的变形菌门组：甲基细菌属；甲基暖菌属；甲基球菌属；甲基微菌属；甲基单胞菌属；甲基八叠球菌属；甲基球形菌属；氮单胞菌属；嗜氮根瘤菌属；固氮菌属；纤维弧菌属；寡源杆菌属；假单胞菌属；Teredinibacter；弗朗西丝氏菌属；寡养单胞菌属；黄单胞菌属；和海洋单胞菌属。
宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组6”。“革兰氏阴性变形菌门亚组6”定义为下列属的变形菌门组：短波单胞菌属；芽单胞菌；鞘氨醇单胞菌属；伯克霍尔德氏菌属；罗尔斯通氏菌属；食酸菌属；氢噬胞菌属；氮单胞菌属；嗜氮根瘤菌属；固氮菌属；纤维弧菌属；寡源杆菌属；假单胞菌属；Teredinibacter；寡养单胞菌属；黄单胞菌属；和海洋单胞菌属。
宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组7”。“革兰氏阴性变形菌门亚组7”定义为下列属的变形菌门组：氮单胞菌属；嗜氮根瘤菌属；固氮菌属；纤维弧菌属；寡源杆菌属；假单胞菌属；Teredinibacter；寡养单胞菌属；黄单胞菌属；和海洋单胞菌属。
宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组8”。“革兰氏阴性变形菌门亚组8”定义为下列属的变形菌门组：短波单胞菌属；芽单胞菌；鞘氨醇单胞菌属；伯克霍尔德氏菌属；罗尔斯通氏菌属；食酸菌属；氢噬胞菌属；假单胞菌属；寡养单胞菌属；黄单胞菌属；和海洋单胞菌属。
宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组9”。“革兰氏阴性变形菌门亚组9”定义为下列属的变形菌门组：短波单胞菌属；伯克霍尔德氏菌属；罗尔斯通氏菌属；食酸菌属；氢噬胞菌属；假单胞菌属；寡养单胞菌属；和海洋单胞菌属。
宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组10”。“革兰氏阴性变形菌门亚组10”定义为下列属的变形菌门组：伯克霍尔德氏菌属；罗尔斯通氏菌属；假单胞菌属；寡养单胞菌属；和黄单胞菌属。
宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组11”。“革兰氏阴性变形菌门亚组11”定义为下列属的变形菌门组：假单胞菌属；寡养单胞菌属；和黄单胞菌属。
宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组12”。“革兰氏阴性变形菌门亚组12”定义为下列属的变形菌门组：伯克霍尔德氏菌属；罗尔斯通氏菌属；假单胞菌属。宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组13”。“革兰氏阴性变形菌门亚组13”定义为下列属的变形菌门组：伯克霍尔德氏菌属；罗尔斯通氏菌属；假单胞菌属；和黄单胞菌属。宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组14”。“革兰氏阴性变形菌门亚组14”定义为下列属的变形菌门组：假单胞菌属和黄单胞菌属。宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组15”。“革兰氏阴性变形菌门亚组15”定义为假单胞菌属的变形菌门组。
宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组16”。“革兰氏阴性变形菌门亚组16”定义为下列假单胞菌物种的变形菌门组(在圆括号中显示了例示性菌株的ATCC或其它保藏号)：Pseudomonas abietaniphila(ATCC 700689)；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 10145)；产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)(ATCC 14909)；病鳝假单胞菌(Pseudomonasanguilliseptica)(ATCC 33660)；香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)(ATCC 13674)；变黄假单胞菌(Pseudomonas flavescens)(ATCC 51555)；门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)(ATCC 25411)；硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)(ATCC 33634)；食油假单胞菌(Pseudomonasoleovorans)(ATCC 8062)；类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(ATCC 17440)；食树脂假单胞菌(Pseudomonas resinovorans)(ATCC 14235)；稻草假单胞菌(Pseudomonas straminea)(ATCC 33636)；伞菌假单胞菌(Pseudomonas agarici)(ATCC 25941)；Pseudomonas alcaliphila；Pseudomonasalginovora；Pseudomonas andersonii；铁角蕨假单胞菌(Pseudomonas asplenii)(ATCC 23835)；壬二酸假单胞菌(Pseudomonas azelaica)(ATCC 27162)；拜氏假单胞菌(Pseudomonas beyerinckii)(ATCC 19372)；Pseudomonas borealis；北城假单胞菌(Pseudomonas boreopolis)(ATCC 33662)；Pseudomonasbrassicacearum；食丁酸假单胞菌(Pseudomonas butanovora)(ATCC 43655)；Pseudomonas cellulosa(ATCC 55703)；桔黄假单胞菌(Pseudomonas aurantiaca)(ATCC 33663)；绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)(ATCC 9446，ATCC13985，ATCC 17418，ATCC 17461)；莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)(ATCC4973)；隆德假单胞菌(Pseudomonas lundensis)(ATCC 49968)；腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)(ATCC 4683)；青紫葛假单胞菌(Pseudomonascissicola)(ATCC 33616)；晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens)；Pseudomonas diterpeniphila；伸长假单胞菌(Pseudomonas elongata)(ATCC10144)；弯曲假单胞菌(Pseudomonas flectens)(ATCC 12775)；产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)；Pseudomonas brenneri；Pseudomonas cedrella；皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugate)(ATCC 29736)；Pseudomonasextremorientalis；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(ATCC 35858)；Pseudomonas gessardii；Pseudomonas libanensis；Pseudomonas mandelii(ATCC700871)；边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)(ATCC 10844)；Pseudomonas migulae；霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)(ATCC 4685)；东方假单胞菌(Pseudomonas orientalis)；Pseudomonas rhodesiae；类黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)(ATCC 9890)；托拉氏假单胞菌(Pseudomonastolaasii)(ATCC 33618)；Pseudomonas veronii(ATCC 700474)；Pseudomonasfrederiksbergensis；弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)(ATCC 19374)；Pseudomonas gingeri；Pseudomonas graminis；格氏假单胞菌(Pseudomonasgrimontii)；盐脱氮假单胞菌(Pseudomonas halodenitrificans)；嗜盐假单胞菌(Pseudomonas halophila)；栖木槿假单胞菌(Pseudomonas hibiscicola)(ATCC19867)；哈特假单胞菌(Pseudomonas huttiensis)(ATCC 14670)；噬氢假单胞菌(Pseudomonas hydrogenovora)；Pseudomonas jessenii(ATCC 700870)；Pseudomonas kilonensis；Pseudomonas lanceolata(ATCC 14669)；Pseudomonaslini；划界假单胞菌(Pseudomonas marginata)(ATCC 25417)；臭味假单胞菌(Pseudomonas mephitica)(ATCC 33665)；脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)(ATCC 19244)；百日咳假单胞菌(Pseudomonas pertucinogena)(ATCC 190)；皮克特假单胞菌(Pseudomonas pictorum)(ATCC 23328)；Pseudomonas psychrophila；黄褐假单胞菌(Pseudomonas filva)(ATCC 31418)；蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)(ATCC 700476)；Pseudomonasmosselii；栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)(ATCC 43272)；变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)(ATCC 700383)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(ATCC 12633)；Pseudomonas reactans；多刺假单胞菌(Pseudomonas spinosa)(ATCC 14606)；Pseudomonas balearica；浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)(ATCC 43273)；施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)(ATCC 17588)；扁桃假单胞菌(Pseudomonas amygdali)(ATCC 33614)；Pseudomonas avellanae(ATCC 700331)；番木瓜假单胞菌(Pseudomonascaricapapayae)(ATCC 33615)；菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)(ATCC10857)；天仙果假单胞菌(Pseudomonas ficuserectae)(ATCC 35104)；褐鞘假单胞菌(Pseudomonas fuscovaginae)；苦楝假单胞菌(Pseudomonas meliae)(ATCC 33050)；丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)(ATCC 19310)；绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava)(ATCC 13223)；热食碳酸假单胞菌(Pseudomonas thermocarboxydovorans)(ATCC 35961)；耐热假单胞菌(Pseudomonas thermotolerans)；Pseudomonas thivervalensis；温哥华假单胞菌(Pseudomonas vancouverensis)(ATCC 700688)；威斯康辛假单胞菌(Pseudomonas wisconsinensis)；和厦门假单胞菌(Pseudomonas xiamenensis)。
宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组17”。“革兰氏阴性变形菌门亚组17”定义为本领域中称为“发荧光的假单胞菌”的变形菌门组，发荧光的假单胞菌包括那些属于例如下列假单胞菌物种的：产氮假单胞菌；Pseudomonas brenneri；Pseudomonas cedrella；Pseudomonas corrugata；Pseudomonas extremorientalis；荧光假单胞菌；Pseudomonas gessardii；Pseudomonas libanensis；Pseudomonas mandelii；边缘假单胞菌；Pseudomonasmigulae；霉味假单胞菌；东方假单胞菌；Pseudomonas rhodesiae；类黄假单胞菌；托拉氏假单胞菌；和Pseudomonas veronii。
在此实施方案中，宿主细胞可选自选自“革兰氏阴性变形菌门亚组18”。“革兰氏阴性变形菌门亚组18”定义为物种荧光假单胞菌的所有亚种、变种、菌株和其它亚物种单位的组，包括那些属于例如下列各项的(圆括号中显示了例示性菌株的ATCC或其它保藏号)：荧光假单胞菌生物型A，也称为生物变型1或生物变型I(ATCC 13525)；荧光假单胞菌生物型B，也称为生物变型2或生物变型II(ATCC 17816)；荧光假单胞菌生物型C，也称为生物变型3或生物变型III(ATCC 17400)；荧光假单胞菌生物型F，也称为生物变型4或生物变型IV(ATCC 12983)；荧光假单胞菌生物型G，也称为生物变型5或生物变型V(ATCC 17518)；荧光假单胞菌生物变型VI；荧光假单胞菌Pf0-1；荧光假单胞菌Pf-5(ATCC BAA-477)；荧光假单胞菌SBW25；及荧光假单胞菌纤维素亚种(Pseudomonas fluorescens subsp.cellulosa)(NCIMB 10462)。
宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌门亚组19”。“革兰氏阴性变形菌门亚组19”定义为荧光假单胞菌生物型A的所有菌株的组。此生物型的具体的菌株是荧光假单胞菌菌株MB101(参见Wilcox的美国专利No.5,169,760)及其衍生物。其衍生物的例子是荧光假单胞菌菌株MB214，它是通过将天然大肠杆菌PlacI-lacI-lacZYA构建体(即其中删除了PlacZ)插入MB101染色体asd(天冬氨酸脱氢酶基因)基因座中而构建的。
可在本发明中使用的别的荧光假单胞菌菌株包括荧光假单胞菌Migula和荧光假单胞菌Loitokitok，其具有下列ATCC名称：[NCIB 8286]；NRRLB-1244；NCIB 8865菌株CO1；NCIB 8866菌株CO2；1291[ATCC 17458；IFO15837；NCIB 8917；LA；NRRL B-1864；吡咯烷；PW2[ICMP 3966；NCPPB967；NRRL B-899]；13475；NCTC 10038；NRRL B-1603[6；IFO 15840]；52-1C；CCEB 488-A[BU 140]；CCEB 553[EM 15/47]；IAM 1008[AHH-27]；IAM 1055[AHH-23]；1[IFO 15842]；12[ATCC 25323；NIH 11；den Doorende Jong 216]；18[IFO 15833；WRRL P-7]；93[TR-10]；108[52-22；IFO 15832]；143[IFO 15836；PL]；149[2-40-40；IFO 15838]；182[IFO 3081；PJ 73]；184[IFO 15830]；185[W2L-1]；186[IFO 15829；PJ 79]；187[NCPPB 263]；188[NCPPB 316]；189[PJ227；1208]；191[IFO 15834；PJ 236；22/1]；194[Klinge R-60；PJ 253]；196[PJ 288]；197[PJ 290]；198[PJ 302]；201[PJ 368]；202[PJ 372]；203[PJ 376]；204[IFO 15835；PJ 682]；205[PJ 686]；206[PJ692]；207[PJ 693]；208[PJ 722]；212[PJ 832]；215[PJ 849]；216[PJ 885]；267[B-9]；271[B-1612]；401[C71A；IFO 15831；PJ 187]；NRRL B-3178[4；IFO 15841]；KY 8521；3081；30-21；[IFO 3081]；N；PYR；PW；D946-B83[BU 2183；FERM-P 3328]；P-2563[FERM-P 2894；IFO 13658]；IAM-1126[43F]；M-1；A506[A5-06]；A505[A5-05-1]；A526[A5-26]；B69；72；NRRLB-4290；PMW6[NCIB 11615]；SC 12936；A1[IFO 15839]；F 1847[CDC-EB]；F 1848[CDC 93]；NCIB 10586；P17；F-12；AmMS 257；PRA25；6133D02；6519E01；N1；SC15208；BNL-WVC；NCTC 2583[NCIB 8194]；H13；1013[ATCC 11251；CCEB 295]；IFO 3903；1062；或Pf-5。
VI.可溶性的、装配好的病毒样颗粒在假单胞菌中的体内表达
一方面，本发明提供了一种用于在宿主细胞中体内生成可溶性的、装配好的重组病毒样颗粒的方法，包括：
(a)提供宿主细胞；
(b)提供编码经亲水性优化的CP-肽融合物的分离的核酸；
(c)在所述宿主细胞中表达所述分离的核酸，其中所述细胞中的表达提供所述经亲水性优化的CP-融合肽体内装配成可溶性病毒样颗粒；并
(d)分离所述病毒样颗粒。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括：e)切割所述融合肽产物以将所述重组多肽与所述衣壳蛋白分开。在本发明的一个实施方案中，宿主细胞是假单胞菌细胞，且在一个具体的实施方案中，是荧光假单胞菌。在一个实施方案中，可以在疫苗策略中给人或动物施用分离的病毒样颗粒。病毒衣壳蛋白和重组多肽之间可以包括可切割的连接序列。可以切割此类序列的药剂的例子包括但不限于化学试剂诸如酸(HCl、甲酸)、CNBr、羟胺(用于天冬酰胺-甘氨酸)、2-硝基-5-硫氰基苯甲酸盐、邻亚碘酰苯甲酸盐、和酶剂，诸如内肽酶、内切蛋白酶、胰蛋白酶、梭菌蛋白酶、和葡萄球菌蛋白酶。
在另一个实施方案中，第二核酸(其被设计成表达不同蛋白质或肽，诸如伴侣蛋白)可以与编码可溶性融合肽的核酸伴随表达。
上文讨论了对于本发明有用的细菌宿主细胞、衣壳蛋白、和重组多肽。
在一些实施方案中，所述方法生成至少0.1g/L可溶性VLP形式的蛋白质。在另一个实施方案中，所述方法生成0.1至10g/L可溶性VLP形式的蛋白质。在亚实施方案中，所述方法生成至少约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、或多于2.0诸如2.1、2.2、2.3、2.4、2.5或更多g/L可溶性VLP形式的蛋白质。在一个实施方案中，所生成的总重组蛋白是至少1.0或至少2.0g/L。在一些实施方案中，所生成的VLP蛋白质的量是所生成的总重组蛋白的至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
在亚实施方案中，所生成的总可溶性VLP可以是至少约2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、15.0、20.0或50.0g/L。在一些实施方案中，作为可溶性的、装配好的VLP生成的VLP的量是所生成的总重组蛋白的至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、或更多。
在其它实施方案中，所述方法生成占总细胞蛋白质(tcp)的5、10、15、20、25、30、40或50、55、60、65、70、或75％的重组蛋白。“百分比总细胞蛋白质”是宿主细胞中蛋白质或肽的量占聚集细胞蛋白质的百分比。百分比总细胞蛋白质的测定在本领域中是公知的。
在一个具体的实施方案中，在矿物盐培养基中培养(即于约4℃至约55℃的温度范围内，包括端点)时，宿主细胞可以具有至少1％tcp的重组肽、多肽、蛋白质或其片段表达水平和至少40g/L的细胞密度。在一个具体的实施方案中，在矿物盐培养基中以至少10L发酵规模培养(即于约4℃至约55℃的温度范围内，包括端点)时，表达系统会具有至少5％tcp的重组蛋白或肽表达水平和至少40g/L的细胞密度。
表达水平
最佳地，本发明的方法导致可溶性VLP在宿主细胞中的生成升高。或者，生成升高可以是每克所生成蛋白质中或每克宿主蛋白中活性蛋白质或肽的水平升高。生成升高还可以是每克重组蛋白或每克宿主细胞蛋白所生成的可回收蛋白质或肽的水平升高。生成升高还可以是蛋白质的总水平升高和活性或可溶性水平升高的任何组合。
重组蛋白的表达改善可以是经由包囊于VLP中的蛋白质的表达。在某些实施方案中，可以在每个VLP中表达至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、或至少180个拷贝的感兴趣蛋白质或肽。可以生成VLP，并自宿主细胞的胞质、周质或胞外培养液回收。
蛋白质或肽或病毒衣壳序列还可以包括一种或多种靶向序列以帮助纯化。这些可以是亲和标签，并且还可以是指导衣壳蛋白装配成VLP的靶向序列。
细胞生长
可使用本领域中已知的任何转化方法来实施载体对细菌宿主细胞(包括假单胞菌宿主细胞)的转化，而且可以以完整细胞或以原生质体(即包括细胞质)来转化细菌宿主细胞。例示性的转化方法包括穿孔法例如电穿孔、原生质体融合、细菌接合、和二价阳离子处理例如氯化钙处理或CaCl/Mg2+处理、或本领域中其它公知方法。
如本文中所使用的，术语“发酵”包括采用字面上的发酵的实施方案和采用其它非发酵培养模式的实施方案两者。发酵可以以任何规模实施。在一个实施方案中，发酵培养基可以自丰富培养基、基本培养基、和矿物盐培养基中选择。在另一个实施方案中，选择基本培养基或矿物盐培养基。
矿物盐培养基由矿物盐和碳源(诸如例如葡萄糖、蔗糖、或甘油)组成。矿物盐培养基的例子包括例如M9培养基、假单胞菌培养基(ATCC 179)、Davis和Mingioli培养基(参见BD Davis和ES Mingioli(1950)J.Bact.60：17-28)。用于构成矿物盐培养基的矿物盐类包括那些自例如磷酸钾、硫酸铵或氯化铵、硫酸镁或氯化镁、和痕量矿物(诸如氯化钙、硼酸盐、及锌、锰、铜和铁的硫酸盐)之中选择的。矿物盐培养基中不包括有机氮源，诸如蛋白胨、胰蛋白胨、氨基酸或酵母提取物。使用无机氮源代替，并且这可以自例如铵盐、氨水、和氨气中选择。一种矿物盐培养基会含有作为碳源的葡萄糖。与矿物盐培养基相比，基本培养基也可以含有矿物盐和碳源，但是可以补充有例如低水平的氨基酸、维生素、蛋白胨、或其它成分，虽然这些以极低水平添加。
高细胞密度培养可以以分批方法开始，接着是两阶段补料-分批培养。在分批部分中不受限制的生长后，可以在3个倍增时间的期间里将生长控制在降低的比生长速率，其中生物质浓度可增加数倍。此类培养规程的进一步详情记载于D.Riesenberg，V.Schulz，W.A.Knorre，H.D.Pohl，D.Korz，E.A.Sanders，A.Ross，和W.D.Deckwer(1991)“High cell density cultivation ofEscherichia coli at controlled specific growth rate”J.Biotechnol：20(1)17-27。
依照本发明的表达系统可以以任何发酵形式培养。例如，本文中可采用分批、补料-分批、半连续、和连续发酵模式。
依照本发明的表达系统对于任何发酵规模(即体积)的转基因表达是有用的。如此，例如可以使用微升规模、厘升规模、和分升规模发酵体积；并且可以使用1升规模和更大的发酵体积。在一个实施方案中，发酵体积可处于或超过1升。在另一个实施方案中，发酵体积可处于或超过5升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、200升、500升、1,000升、2,000升、5,000升、10,000升、或50,000升。
在本发明中，在容许宿主细胞生存的温度范围内，诸如于约4℃至约55℃的范围内(包括端点)的温度实施经转化宿主细胞的生长、培养和/或发酵。如此，例如如本文中关于本发明宿主细胞所使用的，术语“生长”、“培养”和“发酵”内在地指约4℃至约55℃的温度范围内(包括端点)的“生长”、“培养”和“发酵”。另外，“生长”用于指明活跃的细胞分裂和/或扩大的生物学状态以及非分裂和/或非扩大的细胞在新陈代谢方面得到维持的生物学状态两者，术语“生长”的后一种应用与术语“维持”同义。
感兴趣蛋白质或肽的分离
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于改善感兴趣蛋白质或肽的回收的方法，其通过经由与可溶性病毒衣壳蛋白的连接和共表达来在表达期间保护蛋白质或肽而实现。在某些实施方案中，可溶性病毒衣壳融合物在体内形成可溶性VLP，其可以容易地与细胞溶胞物分开。
为了自周质释放重组蛋白，可以采用本领域中已知的任何合适的方法。此类方法的例子包括渗压震扰、鸡蛋清(HEW)-溶菌酶/乙二胺四乙酸(EDTA)处理、和HEW溶菌酶/渗压震扰组合处理。合适的规程可以包括渗压稳定化培养基中的起始破坏，接着是非稳定化培养基中的选择性释放。这些培养基的组成(pH、保护剂)和所使用的破坏方法(氯仿、HEW溶菌酶、EDTA、超声处理)在所报告的具体规程中有所不同。
用于自胞质以可溶性蛋白质或折射颗粒回收重组蛋白的方法可以包括通过机械破坏来碎裂细菌细胞。机械破坏通常牵涉在液体悬浮液中产生局部空化、用刚性珠子进行的快速搅动、超声处理、或细胞悬液的研磨。
HEW溶菌酶以生化方式起水解细胞壁肽聚糖骨架的作用。已经对广泛的表达系统使用了这些方法的许多不同改良，并且是本领域中已知的。
可以通过本领域中公知的标准技术分离本发明的蛋白质并纯化至基本上纯净，包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、镍层析、羟磷灰石层析、反相层析、凝集素层析、制备电泳、去污剂增溶、用诸如柱层析的物质进行的选择性沉淀、免疫纯化法等。例如，可以将具有已确立的分子粘附特性的蛋白质与配体可逆地融合。凭借合适的配体，可以将蛋白质选择性吸附至纯化柱，然后以相对纯净的形式从柱中释放。然后通过酶活性切出所融合的蛋白质。另外，可以使用免疫亲和柱或Ni-NTA柱来纯化蛋白质。
通过本领域中已知的方法来实现所表达蛋白质的检测，包括例如放射性免疫测定法、Western印迹技术或免疫沉淀。
可以利用重组蛋白的分子量来将其与较大和较小尺寸的蛋白质分离，其使用穿过不同孔径的膜(例如Amicon或Millipore膜)的超滤来实现。作为第1步，蛋白质混合物可以穿过孔径的分子量截留比感兴趣蛋白质的分子量低的膜而进行超滤。然后超滤的保留物可以针对分子截留比感兴趣蛋白质的分子量大的膜进行超滤。重组蛋白会穿过膜而进入滤液中。然后可以对滤液进行层析。
重组蛋白也可以根据其大小、表面净电荷、疏水性、和对配体的亲和力而与其它蛋白质分开。另外，可以将针对蛋白质生成的抗体偶联至柱基质，并对蛋白质免疫纯化。所有的这些方法在本领域中是公知的。对于技术人员会显而易见的是，可以以任何规模和使用来自许多不同制造商(例如Pharmacia Biotech)的仪器实施层析技术。
活性蛋白质或肽分析
活性蛋白质可以具有衍生该序列的天然蛋白质或肽的比活的至少20％、30％、或40％、至少50％、60％、或70％、或至少80％、90％、或95％的比活。此外，任选地，底物特异性(kcat/Km)基本上类似于天然蛋白质或肽。通常，kcat/Km会是天然蛋白质或肽的kcat/Km的至少30％、40％、或50％；或至少60％、70％、80％、或90％。测定和量化蛋白质和肽活性和底物特异性(kcat/Km)的度量的方法对于本领域技术人员是公知的。
可以通过本领域中已知的任何蛋白质特异性的常规或标准体外或体内测定法来测量依照本发明生成的重组蛋白或肽的活性。可以将假单胞菌生成的重组蛋白或肽的活性与相应的天然蛋白质的活性进行比较以确定重组蛋白在相同的或类似的生理学条件下是否展现出与天然蛋白质或肽中一般观察到的活性基本上相似的或等同的活性。
可以将重组蛋白的活性与先前确立的天然蛋白质或多肽标准活性进行比较。或者，重组蛋白或肽的活性可以在同时的、或基本上同时的比较测定法中与天然蛋白质或肽一起测定。例如，可以使用体外测定法来测定重组蛋白或肽与靶物之间(例如所表达的酶与底物之间，所表达的激素与激素受体之间，和所表达的抗体与抗原之间)的任何可检测的相互作用。此类检测可以包括比色变化、增殖变化、细胞死亡、细胞排斥、放射性变化、溶解度变化、通过凝胶电泳和/或凝胶排阻方法测量的分子量变化、磷酸化能力、抗体特异性测定法(诸如ELISA测定法)等的测量。另外，体内测定法包括但不限于用于检测假单胞菌生成的蛋白质或肽的生理学效应的测定法，与天然蛋白质或肽的生理学效应相比，例如重量增加、电解质平衡的变化、血液凝固时间的变化、凝块溶解的变化和抗原应答的诱导。
一般而言，可以使用任何体外或体内测定法来测定假单胞菌生成的重组蛋白的活性性质，其容许与天然蛋白质或肽进行比较分析，只要此类活性是可测定的。或者，可以对本发明中生成的蛋白质或肽测定刺激或抑制蛋白质或肽与通常与所述蛋白质或肽相互作用的分子(例如信号途径中通常与天然蛋白质相互作用的成分或底物)之间的相互作用的能力。此类测定法通常可以包括如下步骤，即在容许蛋白质或多肽与靶分子相互作用的条件下组合蛋白质与底物分子，并检测蛋白质与靶分子相互作用的生化后果。
实施例
实施例1：用于在荧光假单胞菌中表达经密码子和亲水性优化的CCMV衣壳蛋白的表达质粒的克隆
克隆：
设计经密码子和疏水性优化的CCMV CP核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。用SpeI和XhoI将含有SpeI限制性位点、核糖体结合位点、CP ORF、和XhoI限制性位点的CCMV-CP插入物(SEQ ID NO：3)切出穿梭质粒(DNA 2.0，MenloPark，CA)。将插入物在1％琼脂糖凝胶上进行凝胶纯化，并连接入经SpeI、XhoI消化并经碱性磷酸酶(New England Biolabs)处理的载体pDow1169(一种中等拷贝质粒，具有RSF1010起点、pyyF、tac启动子、和来自pKK223-3(PL-Pharmacia)的rrnBT1T2终止子)中，以创建用于在荧光假单胞菌中表达CCMV CP的表达质粒(SEQ ID NO：23)。用Micro Bio-spin 6层析柱进行纯化后，通过电穿孔将连接产物转化入荧光假单胞菌菌株DC454(ΔpyrFRXF01414(lsc)::lacIq1)中。在LB培养基中于30℃摇动2小时后，将转化体在M9葡萄糖平板上铺板。通过对自单菌落分离的质粒DNA的限制性消化和测序来证实插入物的存在。
用于在荧光假单胞菌中表达的具有在SpeI、XhoI位点处插入的CCMV CP的载体pDow1169的核酸序列(SEQ ID NO：23)：
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CTCACCTTTACCGCCTGGCAACTGGCGGCCGGAGGACTTCTGCTCGTTCC
AGTAGCTTTAGTGTTTGATCCGCCAATCCCGATGCCTACAGGAACCAATG
TTCTCGGCCTGGCGTGGCTCGGCCTGATCGGAGCGGGTTTAACCTACTTC
CTTTGGTTCCGGGGGATCTCGCGACTCGAACCTACAGTTGTTTCCTTACT
GGGCTTTCTCAGCCCGGGGACCGCCGTGTTGCTAGGATGGTTGTTCTTGG
ATCAGACGCTGAGTGCGCTTCAAATCATCGGCGTCCTGCTCGTGATCGGG
AGTGTCTGGCTGGGCCAACGTTCCAACCGCACTCCTAGGGCGCGTATAG
CTTGCCGGAAGTCGCCTTGACCCGCATGGCATAGGCCTATCGTTTCCACG
ATCAGCGAT.
蛋白质表达：
将单转化体接种入50ml M9葡萄糖培养基中，并培养过夜。使用3.0-5.0OD600的荧光假单胞菌培养物来接种200ml摇瓶培养基。将摇瓶培养物于30℃在300rpm摇动的情况中温育过夜。用300μM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导15.0-20.0OD600的过夜培养物。
实施例2：将限制性位点引入经密码子和亲水性优化的CCMV衣壳蛋白的环中
使用Quikchange II-XL(Stratagene，TX)依照制造商的方案来实施定点诱变反应。包含经密码子优化的CCMV-CP的荧光假单胞菌表达质粒(SEQ IDNO：23)充当模板。用Micro Bio-spin 6进行纯化后，通过电穿孔将具有所引入的限制性位点的所得质粒转化入荧光假单胞菌菌株DC454(ΔpyrF RXF01414(lsc)::lacIq1)中。如在实施例1中所描述的那样实施蛋白质表达。
用于将平端切割限制性位点AfeII引入63环上的引物：
CCMV-AfeI-63-F(SEQ ID NO：24)：5’-TGCGCGGCTGCCGAGAGCGCTGCCAAGGTCACCAGT-3’
CCMV-AfeI-63-R(SEQ ID NO：25)：5’-ACTGGTGACCTTGGCAGCGCTCTCGGCAGCCGCGCA-3’
用于将3’突出端切割限制性位点PvuI引入102环中的引物：
CCMV-PvuI-102-F(SEQ ID NO：26)：5’-CTGCCGAGTGTGTCCCGATCGGGCACCGTCAAGTCC-3’
CCMV-PvuI-102-R(SEQ ID NO：27)：5’-GGACTTGACGGTGCCCGATCGGGACACACTCGGCAG-3’
用于将5’突出端切割限制性位点BglII引入114环中的引物：
CCMV-Bgl II-114-F(SEQ ID NO：28)：5’-ACGGAAACCCAGACTAGATCTACCGCGGCAGCTTCC-3’
CCMV-Bgl II-114-R(SEQ ID NO：29)：5’-GGAAGCTGCCGCGGTAGATCTAGTCTGGGTTTCCGT-3’
用于将5’突出端切割限制性位点XbaI引入129环中的引物：
CCMV-XbaI-129-F(SEQ ID NO：30)：5’-GCAGTGGCTGATAACTCAAGATCCAAAGACGTCGTT-3’
CCMV-XbaI-129-R(SEQ ID NO：31)：5’-AACGACGTCTTTGGATCTTGAGTTATCAGCCACTGC-3’
用于将5’突出端切割限制性位点NheI引入160环中的引物：
CCMV-NheI-160-F(SEQ ID NO：32)：5’-CCATTTATCTCTACAGCGCTAGCAGTGCCGCGCTGACG-3’
CCMV-NheI-160-R(SEQ ID NO：33)：5’-CGTCAGCGCGGCACTGCTAGCGCTGTAGAGATAAATGG-3’
实施例3：与经密码子和亲水性优化的CCMV衣壳蛋白的129表面环融合的流感疫苗M2e肽的基于限制性消化进行的克隆和表达
肽合成：
通过下文所描述的交叠DNA寡核苷酸及下文所详述的热循环程序来合成插入物：
Figure G2008800225385D00601
Figure G2008800225385D00611
*(来自Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)
用
Figure G2008800225385D00612
PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，用XbaI(NEB)消化，并用
Figure G2008800225385D00613
试剂盒再次纯化，之后用T4DNA连接酶(NEB)连接入经XbaI限制性处理的CCMV CP荧光假单胞菌表达载体(来自实施例2)中，所述载体在129环中含有XbaI限制性位点。用Micro Bio-spin 6层析柱(Biorad)纯化后，通过电穿孔将连接产物转化入荧光假单胞菌菌株DC454(ΔpyrFRXF01414(lsc)::lacIq1)中。在LB培养基中于30℃摇动2小时后，将转化体在M9葡萄糖平板(Teknova)上铺板。将平板于30℃温育48小时。通过限制性消化和测序来证实插入物的存在。如实施例1中所描述的那样实施蛋白质表达。
流感疫苗M2e-1肽的氨基酸序列：
SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO：34)
M2e-1的经密码子优化的核酸序列：
AGCTTGTTGACTGAAGTTGAAACGCCAATCCGTAATGAATGGGGCTGCCGGTGCAACGATAGTTCCGAC(SEQ ID NO：35)
用于克隆入129表面环中限制性位点XbaI中的引物：
M2e-CCMV 129-F(SEQIDNO：36)：CGTCTAGAAGCTTGTTGACTGAAGTTGAAACGCCAATCCGTAATGAATGGGG
M2e-CCMV 129-R(SEQIDNO：37)：CGTCTAGAGTCGGAACTATCGTTGCACCGGCAGCCCCATTCATTACGGATTG
实施例4：与经密码子和亲水性优化的CCMV衣壳蛋白的129表面环融合的流感疫苗M2e肽的基于SOE(通过交叠延伸进行的剪接)进行的克隆和表达
步骤1：使用包含经密码子优化的CCMV-CP的荧光假单胞菌表达质粒(SEQ ID NO：23)作为PCR模板。反应1(参见图10)使用引物Coop-CCMV-F和PCP-CCMV129-SOE-R引物。反应2使用引物Coop-CCMV-R和PCP-CCMV129-SOE-F。依照上文所描述的热循环方案实施PCR。
步骤2：使用来自反应1和反应2的产物作为PCR模板。使用Coop-CCMV-F和Coop-CCMV-R引物来扩增最终的PCR产物。
然后，通过SpeI和XhoI来消化最终的PCR产物，并在SpeI和XhoI处亚克隆入荧光假单胞菌表达载体pDow1169中。用Micro Bio-spin 6层析柱(Biorad)纯化后，通过电穿孔将连接产物转化入荧光假单胞菌菌株DC454中。在LB培养基中于30℃摇动2小时后，将转化体在M9葡萄糖平板(Teknova)上铺板。将平板于30℃温育48小时。通过限制性消化和测序来证实插入物的存在。如实施例1中所描述的那样实施蛋白质表达。
用于基于SOE的M2e-CCMV融合物的引物：
Coop-CCMV-F(SEQ ID NO：38)：5’-GGACTAGTAGGAGGTAACTTATGTCCACTGTCGGCACTGG-3’
Coop-CCMV-R(SEQ ID NO：39)：5’-CCGCTCGAGTCATTACTATTATCAATACACCGGAG-3’
M2e-CCMV129-SOE-F(SEQ ID NO：40)：5’-CAATCCGTAATGAATGGGGCTGCCGGTGC AACG AT AGTTCCG ACtccaaagacgtcgttgcgg-3’
M2e-CCMV129-SOE-R(SEQ ID NO：41)：5’-CCCCATTCATTACGGATTGGCGTTTCAACTTCAGTCAACAAGCTTCTAGACGGTTATCAGCCACTGCCAGG-3’
实施例5：经密码子和亲水性优化的CCMV衣壳蛋白上的双表面环63和129中的流感疫苗M2e-1肽的基于限制性消化进行的克隆和表达克隆：
将平端切割限制性位点AfeI引入包含经密码子优化的CCMV衣壳蛋白基因的荧光假单胞菌表达质粒的表面环63中，其中单体M2e-1在129表面环处融合，如实施例2和实施例3中所描述的。使用引物CCMV-AfeI-63-F(SEQ IDNO：24)和CCMV-AfeI-63-R(SEQ ID NO：25)来引入AfeI限制性位点。通过PCR合成M2e-1。用于合成平端M2e-1DNA片段的引物是M2e-1-blunt-For(tcactcttgacagaggtagaaacaccgata cgtaatgaatggggc SEQ ID NO：42)和M2e-1-blunt-Rev(atctgaagaatcattacaacgacagcccca ttcattacgtatcgg SEQ IDNO：43)。
如所描述的那样实施PCR合成，但是用Pfu Turbo聚合酶代替Taq聚合酶以创建平端。然后，用DNA聚合酶I的Klenow片段处理M2e-1PCR片段以产生平端M2e-1DNA插入物。然后，将插入物连接入用AfeI限制性处理后的CCMV CP表达质粒中，所述质粒在表面环63中具有AfeI限制性位点。用MicroBio-spin 6纯化后，通过电穿孔将所得连接产物转化入荧光假单胞菌菌株DC454(ΔpyrF RXF01414(lsc)::lacIq1)中。通过限制性消化和测序来证实双插入物的存在和完整性。如实施例1中所描述的那样实施蛋白质表达。
实施例6：与经密码子和亲水性优化的CCMV衣壳蛋白融合的炭疽疫苗肽PA1的基于SOE进行的克隆和表达
PA1-129-SOE-F(SEQ ID NO：44)：5’-CCAGCGCCGGTCCAACCGTGCCCGACCGCGACAACGATGGCATCCCCG ACtccaaagacgtcgttgcgg-3’
PA1-129-SOE-R(SEQ ID NO：45)：5’-TCGGGCACGGTTGGACCGGCGCTGGTGGAGCGTTTCTTGCGACTATTACTGTTATCAGCCACTGCCAGG-3’
步骤1：使用包含经密码子优化的CCMV-CP的荧光假单胞菌表达质粒(SEQ ID NO：23)作为PCR模板。在反应1中使用Coop-CCMV-F和PA1-129-SOE-R引物。在反应2中使用Coop CCMV-R和PA1-129-SOE-F引物。依照上文所描述的热循环方案来实施PCR。
步骤2：使用来自反应1和反应2的PCR产物作为此反应的PCR模板。使用Coop-CCMV-F和Coop-CCMV-R引物来扩增出最终的PCR产物。
然后通过SpeI和XhoI来消化最终的PCR产物，并在SpeI和XhoI处亚克隆入荧光假单胞菌表达载体pDow1169中。用Micro Bio-spin 6层析柱(Biorad)纯化后，通过电穿孔将连接产物转化入荧光假单胞菌菌株DC454中。在LB培养基中于30℃摇动2小时后，将转化体在M9葡萄糖平板(Teknova)上铺板。将平板于30℃温育48小时。通过限制性消化和测序来证实插入物的存在。如上文所描述的那样实施蛋白质表达。图9中显示了与CCMV衣壳蛋白融合的可溶性炭疽疫苗肽PA1在荧光假单胞菌中的表达。
实施例7：与经密码子和亲水性优化的CCMV衣壳蛋白融合的炭疽疫苗肽PA1的基于限制性消化进行的克隆和表达
炭疽疫苗肽PA1的肽序列：
SNSRKKRSTSAGPTVPDRDNDGIPD(SEQID NO：46)
PA1的经密码子优化的核酸序列：
AGTAATAGTCGCAAGAAACGCTCCACCAGCGCCGGTCCAACCGTGCCCGACCGCGACAACGATGGCATCCCCGAC(SEQ ID NO：47)
使用上文所描述的克隆技术使用引物PA1-129-XbaI-F和PA1-129-XbaI-R通过PCR来合成PA1DNA插入物。用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)来纯化PCR产物，用XbaI(NEB)消化，并用Qiaquick试剂盒再次纯化，之后用T4DNA连接酶(NEB)连接入经XbaI限制性处理的CCMV CP荧光假单胞菌表达载体(来自实施例2)中，所述载体在129环中含有XbaI限制性位点。用MicroBio-spin 6层析柱(Biorad)纯化后，通过电穿孔将连接产物转化入荧光假单胞菌菌株DC454(ΔpyrF RXF01414(lsc)::lacIq1)中。在LB培养基中于30℃摇动2小时后，将转化体在M9葡萄糖平板(Teknova)上铺板。将平板于30℃温育48小时。通过限制性消化和测序来证实插入物的存在。如实施例1中所描述的那样实施蛋白质表达。
PA1-129-XbaI-F(SEQ ID NO：48)：5’-CTTCTAGAAGTAATAGTCGCAAGAAACGCTCCACCAGCGCCGGTCCAACCGTGCCCGA-3’
PA1-129-XbaI-R(SEQ ID NO：49)：5’-CTTCTAGAGTCGGGGATGCCATCGTTGTCGCGGTCGGGCACGGTTGGACCGGCGCTGG-3’
实施例8：与经密码子和亲水性优化的CCMV衣壳蛋白融合的炭疽疫苗肽PA4的基于限制性消化进行的克隆和表达
炭疽疫苗肽PA4的肽序列：
RQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPN(SEQ ID NO：50)
PA4的经密码子优化的核酸序列：
CGCCAGGATGGTAAGACGTTCATCGACTTTAAGAAATACAACGACAAGCTGCCCCTGTATATTTCCAACCCTAAT(SEQ ID NO：51)
使用上文所描述的克隆技术使用引物PA4-129-XbaI-F和PA4-129-XbaI-R通过PCR来合成PA4DNA插入物。如上文所描述的那样实施蛋白质表达。
PA4-129-XbaI-F(SEQ ID NO：52)：CTTCTAGACGCCAGGATGGTAAGACGTTCATCGACTTTAAGAAATACAACGACAAGCT
PA4-129-XbaI-R(SEQ ID NO：53)：CTTCTAGAATTAGGGTTGGAAATATACAGGGGCAGCTTGTCGTTGTATTTCTTAAAGT
实施例9：与经密码子和亲水性优化的CCMV衣壳蛋白融合的炭疽疫苗肽PA4的基于SOE进行的克隆和表达
PA4-129-SOE-F(SEQ ID NO：54)：5’-ACTTTAAGAAATACAACGACAAGCTGCCCCTGTATATTTCCAACCCTAATTCCAAAGACGTCGTTGCGG-3’
PA4-129-SOE-R(SEQ ID NO：55)：5’-AGCTTGTCGTTGTATTTCTTAAAGTCGATGAACGTCTTACCATCCTGGCGGTTATCAGCCACTGCCAGG-3’
步骤1：使用含有经密码子优化的CCMV-CP的荧光假单胞菌表达质粒(SEQ ID NO：23)作为PCR模板。在反应1中使用Coop-CCMV-F和PA4-129-SOE-R引物。在反应2中使用Coop CCMV-R和PA4-129-SOE-F引物。依照上文所描述的热循环方案来实施PCR。
步骤2：使用来自反应1和反应2的PCR产物作为此反应的PCR模板。使用Coop-CCMV-F和Coop-CCMV-R引物来扩增出最终的PCR产物。
然后通过SpeI和XhoI来消化最终的PCR产物，并在SpeI和XhoI处亚克隆入荧光假单胞菌表达载体pDow1169中。用Micro Bio-spin 6层析柱(Biorad)纯化后，通过电穿孔将连接产物转化入荧光假单胞菌菌株DC454中。在LB培养基中于30℃摇动2小时后，将转化体在M9葡萄糖平板(Teknova)上铺板。将平板于30℃温育48小时。通过限制性消化和测序来证实插入物的存在。如实施例1中所描述的那样实施蛋白质表达。
实施例10：未经密码子优化的、经亲水性优化的CCMV外壳蛋白在荧光假单胞菌中的表达
通过PCR自CCMV RNA3质粒(pCC3)扩增CCMV外壳蛋白，其使用引物CCMV-SpeI-For(CTACTAGTAGGAGGTAACTTATGTCTACAGTCGGA，SEQ ID NO：56)和CCMV-XhoI-Rev(CCGCTCGAGTCATTAATACACCGGAGTGA，SEQ ID NO：57)来实现。使用以下方案来实施PCR：
Figure G2008800225385D00651
Figure G2008800225385D00661
*(来自Invitrogen Corp，Carlsbad，CA，USA，下文“Invitrogen”)
用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，用SpeI和XhoI(NEB)消化，并再次纯化，之后用T4DNA连接酶(NEB)连接入经XbaI限制性处理的CCMV CP表达载体中。用Micro Bio-spin 6层析柱(Biorad)纯化后，通过电穿孔将连接产物转化入荧光假单胞菌菌株DC454中。在LB培养基中于30℃摇动2小时后，将转化体在M9葡萄糖平板(Teknova)上铺板。将平板于30℃温育48小时。通过限制性消化和测序来证实插入物的存在。如实施例1中所描述的那样实施蛋白质表达。
经亲水性优化的CCMV外壳蛋白主要是可溶性的(图5)，这与未经亲水性优化的CCMV外壳蛋白的表达(图4)形成直接对比。图1中显示了未经亲水性优化的CCMV CP表达质粒。通过PEG沉淀和蔗糖密度梯度来纯化可溶性的、经亲水性优化的CCMV外壳蛋白(参见图6)，并通过电子显微术来成像(参见图7)。
实施例11：可溶性的、未经密码子优化的CCMV-PA1在荧光假单胞菌中的表达
CCMV129-PA1在PA1插入物侧翼有BamHI限制性位点(突出显示的)：
ATGTCTACAGTCGGAACAGGGAAGTTAACTCGTGCACAACGAAG
GGCTGCGGCCCGTAAGAACAAGCGGAACACTCGTGTGGTCCAACCTGTT
ATTGTAGAACCCATCGCTTCAGGCCAAGGCAAGGCTATTAAAGCATGGA
CCGGTTACAGCGTATCGAAGTGGACCGCCTCTTGTGCGGCTGCCGAAGC
TAAAGTAACCTCGGCTATAACTATCTCTCTCCCTAATGAGCTATCGTCCG
AAAGGAACAAGCAGCTCAAGGTAGGTAGAGTTTTATTATGGCTTGGGTT
GCTTCCCAGTGTTAGTGGCACAGTGAAATCCTGTGTTACAGAGACGCAG
ACTACTGCTGCTGCCTCCTTTCAGGTGGCATTAGCTGTGGCCGACAACGG
GATCCTTAGTAATTCTCGTAAGAAACGTTCTACCTCTGCTGGCCCTACCG
TGCCTGATCGTGATAATGATGGCATTCCTGATGGGATCCTGTCGAAAGA
TGTTGTCGCTGCTATGTACCCCGAGGCGTTTAAGGGTATAACCCTTGAAC
AACTCACCGCGGATTTAACGATCTACTTGTACAGCAGTGCGGCTCTCACT
GAGGGCGACGTCATCGTGCATTTGGAGGTTGAGCATGTCAGACCTACGT
TTGACGACTCTTTCACTCCGGTGTAT(SEQ ID NO：58).
此构建体主要产生不溶性CCMV-PA1蛋白(图8)。使用引物CCMV-PA1-nobam5-F(GCATTAGCTGTGGCCGACAACAGTAATTCTCGTAAGAAACG，SEQ ID NO：59)和CCMV-PA1-nobam5-R(CGTTTCTTACGAGAATTACTGTTGTCGGCCACAGCTAATGC，SEQ ID NO：60)通过定点诱变来消除BamHI位点。使用Quikchange II-XL(Stratagene，TX)依照制造商的方案来实施定点诱变反应。包含未经密码子优化的CCMV-PA1的荧光假单胞菌表达质粒充当模板。用Micro Bio-spin 6纯化后，通过电穿孔将所得质粒转化入荧光假单胞菌菌株DC454(ΔpyrF RXF01414(lsc)::lacIq1)中。通过测序来证实删除。然后，质粒充当用于删除3’BamHI的模板，其使用引物CCMV-PA1-nobam3-F(CGTGATAATGAT GGCATTCCTGATTCGAAAGATGTTGTCGCTGC，SEQ ID NO：61)和CCMV-PA1-nobam3-R(GCAGCGACAACATCTTTCGAATCAGGAATGCCATCATTATCACG，SEQ ID NO：62)来实现。
将所得质粒转化入荧光假单胞菌DC454中，如上文所描述的。通过测序来证实删除。
蛋白质表达：
将单转化体接种入50ml M9葡萄糖培养基中，并培养过夜。使用3.0-5.0OD600的荧光假单胞菌培养物来接种200ml Dow专有的摇瓶培养基。将摇瓶培养物于30℃在300rpm摇动的情况中温育过夜。用300μM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导15.0-20.0OD600的过夜培养物。诱导后24小时时收获培养物。图9中显示了可溶性CCMV-PA1外壳蛋白表达。
实施例12：可溶性此、未经密码子优化的CCMV-PA4在荧光假单胞菌中的表达
CCMV129-PA4在PA4插入物侧翼有BamHI限制性位点(突出显示的)：
ATGTCTACAGTCGGAACAGGGAAGTTAACTCGTGCACAACGAAG
GGCTGCGGCCCGTAAGAACAAGCGGAACACTCGTGTGGTCCAACCTGTT
ATTGTAGAACCCATCGCTTCAGGCCAAGGCAAGGCTATTAAAGCATGGA
CCGGTTACAGCGTATCGAAGTGGACCGCCTCTTGTGCGGCTGCCGAAGC
TAAAGTAACCTCGGCTATAACTATCTCTCTCCCTAATGAGCTATCGTCCG
AAAGGAACAAGCAGCTCAAGGTAGGTAGAGTTTTATTATGGCTTGGGTT
GCTTCCCAGTGTTAGTGGCACAGTGAAATCCTGTGTTACAGAGACGCAG
ACTACTGCTGCTGCCTCCTTTCAGGTGGCATTAGCTGTGGCCGACAACGG
GATCCGTCAAGATGGCAAAACCTTCATTGATTTCAAAAAGTATAATGAT
AAACTCCCTCTCTATATTTCTAATCCTAATGGGATCCTGTCGAAAGATGT
TGTCGCTGCTATGTACCCCGAGGCGTTTAAGGGTATAACCCTTGAACAAC
TCACCGCGGATTTAACGATCTACTTGTACAGCAGTGCGGCTCTCACTGAG
GGCGACGTCATCGTGCATTTGGAGGTTGAGCATGTCAGACCTACGTTTGA
CGACTCTTTCACTCCGGTGTAT
此构建体主要产生不溶性CCMV-PA4蛋白。使用引物CCMV-PA4-nobam5-F(GCATTAGCTGTGGCCGACAACCGTC AAGATGGCAAAACCTTC，SEQ ID NO：63)和CCMV-PA4-nobam5-R(GAAGGTTTTGCCATCTTGACGGTTGTCGGCCACAGCTAATGC，SEQ ID NO：64)通过定点诱变来消除BamHI位点以提高亲水性。使用Quikchange II-XL(Stratagene，TX)依照制造商的方案来实施定点诱变反应，其使用包含未经密码子优化的PA4的CCMV作为模板来实现。纯化后，通过电穿孔将删除了5’BamHI限制性位点的所得质粒转化入荧光假单胞菌菌株DC454中，然后充当用于删除3’BamHI的模板，其使用引物CCMV-PA4-nobam3-F(CTCTATATTTCTAATCCTAATTCGAAAGATGTTGTCGCTGC，SEQ ID NO：65)和CCMV-PA4-nobam3-R(GCAGCGACAACATCTTTCGAATTAGGATTAGAAATATAGAG，SEQ ID NO：66)来实现。
将所得质粒转化入荧光假单胞菌DC454中，如上文所描述的。通过测序来证实删除。如实施例1中所描述的那样实施蛋白质表达。经亲水性优化的CCMV-PA4外壳蛋白主要是可溶性的。

Claims (31)

1.一种用于在宿主细胞中体内生成可溶性的、装配好的重组病毒样颗粒的方法，包括：
提供宿主细胞；
提供编码经亲水性优化的外壳蛋白-肽融合物的分离的核酸；
在所述宿主细胞中表达所述分离的核酸，其中所述细胞中的表达提供所述经亲水性优化的CP-融合肽体内装配成可溶性的病毒样颗粒；并分离所述病毒样颗粒。
2.权利要求1的方法，其中提供编码经亲水性优化的外壳蛋白-肽融合物的分离的核酸包括在体外混合：
至少一种第一病毒衣壳融合肽，其包含至少一种抗原肽插入物；和
至少一种第二病毒衣壳融合肽，其包含至少一种抗原肽插入物，其中所述至少一种第二病毒衣壳融合肽包含至少一种不存在于所述第一病毒衣壳融合肽中的抗原肽插入物。
3.权利要求2的方法，其中所述第一和/或第二病毒衣壳融合肽的病毒衣壳衍生自二十面体病毒的氨基酸序列。
4.权利要求2的方法，其中所述二十面体病毒是豇豆褪绿斑点病毒。
5.权利要求1的方法，其中所述经亲水性优化的外壳蛋白-肽衍生自二十面体病毒的氨基酸序列。
6.权利要求5的方法，其中所述二十面体病毒是豇豆褪绿斑点病毒。
7.权利要求1的方法，其中所述经亲水性优化的外壳蛋白-肽衍生自SEQ IDNO：1。
8.权利要求1的方法，其中提供编码经亲水性优化的外壳蛋白-肽融合物的分离的核酸包括提供编码如下外壳蛋白肽的分离的核酸，所述外壳蛋白肽在所述外壳蛋白构建体的第63位和第129位插入位点中具有修饰的氨基酸。
9.权利要求8的方法，其中所述编码具有所述外壳蛋白构建体第63位和第129位插入位点中的氨基酸的外壳蛋白肽的分离的核酸是经由所述氨基酸的消除来修饰的。
10.权利要求9的方法，其中所述在第63位和第129位插入位点中消除的氨基酸包括精氨酸、色氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、和亮氨酸。
11.权利要求8的方法，其中所述外壳蛋白包括豇豆褪绿斑点病毒外壳蛋白。
12.权利要求8的方法，其中所述编码具有外壳蛋白构建体第63位和第129位插入位点中的氨基酸的外壳蛋白肽的分离的核酸是通过定点诱变来修饰的。
13.权利要求8的方法，其中所述编码具有外壳蛋白构建体第63位和第129位插入位点中的氨基酸的外壳蛋白肽的分离的核酸是使用通过基于交叠延伸的技术进行的剪接来修饰的。
14.权利要求8的方法，其中所述编码具有外壳蛋白构建体第63位和第129位插入位点中的氨基酸的外壳蛋白肽的分离的核酸是通过用具有较高亲水性值的氨基酸替换编码低亲水性的氨基酸的密码子来修饰的。
15.权利要求1的方法，其进一步包括切割所述融合肽产物以将所述重组多肽与所述衣壳蛋白分开。
16.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞是细菌宿主细胞。
17.权利要求16的方法，其中所述宿主细胞是γ变形菌宿主。
18.权利要求17的方法，其中所述宿主细胞是假单胞菌细胞。
19.权利要求18的方法，其中所述宿主细胞是荧光假单胞菌。
20.一种用于在宿主细胞中体内生成可溶性的、装配好的重组病毒样颗粒的方法，包括：
提供假单胞菌宿主细胞；
提供编码具有豇豆褪绿斑点病毒(CCMV)外壳蛋白构建体第63位和第129位插入位点中的修饰的氨基酸的外壳蛋白肽的分离的核酸以形成经亲水性优化的CP-融合肽；
在所述假单胞菌宿主细胞中表达所述分离的核酸，其中所述细胞中的表达提供所述经亲水性优化的CP-融合肽体内装配成可溶性的病毒样颗粒；并
分离所述病毒样颗粒。
21.权利要求20的方法，其中所述宿主细胞是荧光假单胞菌。
22.权利要求20的方法，其中所述编码具有外壳蛋白构建体第63位和第129位插入位点中的氨基酸的外壳蛋白肽的分离的核酸是通过定点诱变来修饰的。
23.权利要求20的方法，其中所述编码具有外壳蛋白构建体第63位和第129位插入位点中的氨基酸的外壳蛋白肽的分离的核酸是使用通过基于交叠延伸的技术进行的剪接来修饰的。
24.权利要求20的方法，其中所述编码具有外壳蛋白构建体第63位和第129位插入位点中的氨基酸的外壳蛋白肽的分离的核酸是经由所述氨基酸的消除来修饰的。
25.一种假单胞菌细胞，其包含依照权利要求1的方法制备的可溶性的、装配好的重组病毒样颗粒(VLP)。
26.一种可溶性的、装配好的重组病毒样颗粒，其是依照权利要求1的方法制备的。
27.一种病毒样颗粒，其包含编码具有外壳蛋白构建体第63位和第129位插入位点中的修饰的氨基酸的外壳蛋白肽的分离的核酸。
28.权利要求27的病毒样颗粒，其中所述氨基酸序列衍生自二十面体病毒的氨基酸序列。
29.权利要求28的病毒样颗粒，其中所述二十面体病毒是豇豆褪绿斑点病毒。
30.权利要求27的病毒样颗粒，其中所述分离的核酸包含消除了外壳蛋白构建体第63位和第129位插入位点中的氨基酸的外壳蛋白肽。
31.权利要求30的病毒样颗粒，其中所述在第63位和第129位插入位点中消除的氨基酸包括精氨酸、色氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、和亮氨酸。
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