CN108779152B

CN108779152B - 包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白的抗菌肽制造方法

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Publication number: CN108779152B
Application number: CN201680076161.6A
Authority: CN
Inventors: 朴灿奎
Original assignee: University Industry Cooperation Corporation of Konkuk University
Current assignee: University Industry Cooperation Corporation of Konkuk University
Priority date: 2016-01-27
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2036-02-26
Also published as: WO2017131279A1; US11230575B2; EP3409685B1; EP3409685A4; KR20170089583A; US20210032295A1; EP3409685A1; CN108779152A; KR101830792B1

Abstract

本发明涉及一种抗菌肽的制造方法，尤其涉及一种通过将抗菌肽遗传基因融合到在大肠杆菌中以不溶性形态表达的绿色荧光蛋白遗传基因并引进到大肠杆菌中进行表达之后再去除绿色荧光蛋白并收取抗菌肽的过程而批量地制造抗菌肽的方法。如上所述的本发明能够通过提供一种制造工程简单、经济性良好且生产收率较高的抗菌肽的制造方法，在因为多重耐药性微生物的急剧增加而急需开发出具有能够对上述耐药性菌株进行杀灭的全新作用机制的抗生素的制药以及饲料产业，提供能够替代现有的抗生素的天然抗生素。此外，本发明能够通过利用以酸处理方式切割氨基酸的方式替代现有的使用氰化溴的方式，在从不溶性蛋白纯化出目标蛋白质的过程中节省成本、降低工程的危险性并更快速地完成所需的作业。

Description

包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白的抗菌肽制造方法

技术领域

本发明涉及一种由绿色荧光蛋白(Green Fluorescent protein，GFP)和抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)结合而成的融合蛋白以及利用上述融合蛋白的抗菌肽的批量制造方法，尤其涉及一种通过将抗菌肽融合到在大肠杆菌中以不溶性形态表达的绿色荧光蛋白并引进到大肠杆菌中进行表达之后再去除绿色荧光蛋白并收取抗菌肽的过程而批量地制造抗菌肽的方法。

背景技术

从微生物到高等生物位置的所有生物，均具有用于保护自己免受外部有害环境侵害的自身独有的固有防御系统。周边所存在的微生物甚至于菌丝类都会通过生成具有抗菌活性的自身防御物质即抗菌肽而构建先天性免疫系统，提供在抗原-抗体反应之前保护自身免受外部有害因素侵害的第一轮屏障。

此外，人类在继青霉素之后开发出了很多种类型的抗生素并进行使用，但是近年来与过去不同，对如上所述的抗生素具有耐药性的菌株呈现出了非常快速的增长趋势。尤其是，对两种以上的不同抗生素、抗菌剂呈现出耐药性的多重耐药性微生物急剧增加，所以目前急需开发出一种能够对如上所述的耐药性菌株进行杀灭的具有全新作用机制的抗生素。

因为如上所述的原因，存在于大自然中的抗菌肽作为全新抗生素的候选物质而备受关注，因为是通过与目前所使用的化合物物性的抗生素不同的作用机制呈现出抗菌活性，因此有望解决对抗生素具有耐药性的菌株相关的问题。

因此，很多人在努力尝试直接使用自然界中所存在的抗菌肽或合成使用其类似物，但是因为抗菌肽在提升抗菌活性的同时还会导致细胞毒性的标准即红细胞溶血现象的增加，因此在实际应用方面受到很多限制。

而且，为了实现在抗菌肽的商用化方面最为重要的因素即大规模生产，同样进行了各种各样的研究与尝试，但是直至目前为止并没有达到可适用于产业领域的水准。这是因为当通过化学合成的方法生产抗菌肽时，其经济性较差，而当通过利用微生物的遗传基因工程技法生产抗菌肽时，虽然其经济性良好，但却会因为所表达的抗菌肽阻碍宿主微生物的生长而导致抗菌肽的生产收率极低的问题。

因此，本发明人发明了一种可通过简单且经济性良好的方式实现抗菌肽的批量生产的方法，通过利用可轻易实现遗传基因操作且经济性良好的大肠杆菌表达系统并将在大肠杆菌中以不溶性形态表达的绿色荧光蛋白作为载体对结合到抗菌肽中的融合蛋白的表达进行诱导之后再通过从上述融合蛋白中分离出抗菌肽的过程而制造抗菌肽，从而解决因为蛋白质的加水分解而导致的阻碍抗菌肽生成的问题以及因为抗菌肽阻碍大肠杆菌的生长而导致的抗菌肽生产收率降低的问题。

作为相关的现有技术，包括大韩民国注册专利第10-0958095号(利用翻译偶联系统的抗菌肽的批量表达方法)、大韩民国公开专利第10-2012-0062504号(在细胞表面表达的抗菌肽聚合物)等。

专利内容

本发明的目的在于提供一种能够通过将不溶性的绿色荧光蛋白作为载体进行使用并利用大肠杆菌表达系统制造出抗菌肽的制造工程简单、经济性良好且生产收率较高的抗菌肽制造方法。

为了实现上述目的，本发明提供一种由能够通过酸处理实现切割以及活性化的抗菌肽与绿色荧光蛋白结合而成的不溶性融合蛋白。

上述抗菌肽连续排列且在上述抗菌肽的N-末端、C-末端或上述的连接部上能够连接Asp-Pro氨基酸序列。上述连续排列的抗菌肽能够以3拷贝存在。上述天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列能够通过酸处理实现切割，上述酸处理能够通过投入HCl而执行。

此外，本发明提供一种包括以序列编号24记录的氨基酸序列的不溶性融合蛋白。

此外，本发明提供一种包括用于对上述不溶性融合蛋白进行编码的以序列编号21记录的碱基序列的遗传基因。

此外，本发明提供一种将上述重组表达载体引进到宿主细胞中的转化体。上述宿主细胞能够是大肠杆菌。

此外，本发明提供一种包括：(1)在培养液中对利用以序列编号21记录的碱基序列进行重组的转化体进行培养的步骤；(2)从上述培养液回收转化体的步骤；(3)从转化体获取蛋白质的步骤；以及，(4)通过对上述蛋白质进行酸处理而分离出抗菌肽的步骤；的抗菌肽的制造方法。

上述蛋白能够以包涵体形态表达。

上述抗菌肽连续排列且在上述抗菌肽的N-末端、C-末端或上述的连接部上能够连接天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列。上述连续排列的抗菌肽能够以3拷贝存在。上述天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列能够通过酸处理实现切割，上述酸处理能够通过投入HCl而执行。

如上所述的本发明能够通过提供一种制造工程简单、经济性良好且生产收率较高的抗菌肽的批量制造方法，在因为多重耐药性微生物的急剧增加而急需开发出全新抗生素的时代背景下将存在于大自然中的抗菌肽适用于制药以及饲料产业等。

此外，本发明能够通过利用以酸处理方式切割氨基酸的方式替代现有的使用氰化溴的方式，在从不溶性蛋白纯化出目标蛋白质的过程中节省成本、降低工程的危险性并更快速地完成所需的作业。

附图说明

图1A是重组的r5M-172AMP173的氨基酸序列(下划线：r5M-GFP序列，黑色阴影：连接序列以及蛋氨酸部分，灰色阴影：AMP的氨基酸序列位(需要注意的是，以灰色阴影标记的AMP并不是氨基酸序列，而是抗菌肽(Antimicrobal peptide)的缩写))。

图1B是用于不溶性绿色荧光蛋白与抗菌肽的融合的重组载体的模式图。

图1C是从不溶性绿色荧光蛋白纯化出抗菌肽的过程的模式图。

图2是重组的r5M-172(PG1)₃173的氨基酸序列(下划线：r5M-GFP序列，灰色阴影且有下划线：从天冬氨酸置换成丝氨酸的部位，黑色阴影：连接序列以及天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)结合部位，灰色阴影但无下划线：PG1的氨基酸序列)。

图3是在对已插入r5M-172PG1173遗传基因的pET30b表达载体进行引进的大肠杆菌中，通过光学密度对已诱导以及未诱导蛋白质表达时的大肠杆菌的生长曲线进行测定的图表。

图4A是利用电子显微镜对从已插入r5M172PG1173遗传基因的转化体生成的蛋白质(箭头)形成包涵体的过程进行拍摄的照片。

图4B、图4C以及图4D是在进行免疫化学标记之后利用电子显微镜对从已插入r5M172PG1173遗传基因的转化体生成的蛋白质(箭头)形成包涵体的过程进行拍摄的照片。

图5是以所有细胞蛋白为样本并利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，对大肠杆菌中已插入r5M-172PG1173遗传基因的pET30b表达载体在时间流逝(3小时、4小时、5小时)时的r5M-172PG1173蛋白生成情况进行确认的结果。

图6A是利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对各个步骤中所表达的r5M-172PG1173蛋白进行确认的结果。

图6B是利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对各个步骤中的r5M-172PMAP36173蛋白进行确认的结果。

图7A以及图7B是利用三羟甲基氨基甲烷-三(羟甲基)甲基甘胺酸(tris-tricine)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白质纯化的各个步骤中所提取出的蛋白质样本的纯度进行分析的结果。

图7C是利用蛋白印记法(western blot)对所纯化的PG1进行确认的结果。

具体实施方式

接下来，将对本发明进行详细的说明。

本发明提供一种由能够通过酸处理实现切割以及活性化的抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)与绿色荧光蛋白(Green Fluorescent protein，GFP)结合而成的不溶性融合蛋白。为了制造出上述不溶性融合蛋白，能够将绿色荧光蛋白作为抗菌肽的载体进行使用。通过利用由绿色荧光蛋白与抗菌肽结合而成的不溶性融合蛋白结构对表达进行诱导，能够防止抗菌肽受到损伤并将抗菌肽的表达对宿主造成的成长阻碍效果降至最低，从而预防因为宿主的成长受到阻碍而导致的生产收率下降的问题。

在适用本发明的一实施例中，上述抗菌肽连续排列且在上述抗菌肽的N-末端、C-末端或上述的连接部上能够连接Asp-Pro(天冬氨酸(aspartic acid)-脯氨酸(proline)，DP)氨基酸序列。上述连续排列的抗菌肽能够以3拷贝(copies)存在。上述天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列能够通过酸处理而实现切割。上述酸处理能够通过投入HCl而执行。

此外，本发明提供一种包括以序列编号24记录的氨基酸序列的绿色荧光蛋白。

为了制造出上述绿色荧光蛋白(以下简称为“GFP”)，能够在GFP的氨基酸序列中的第218个蛋氨酸(M218)开始到丙氨酸(alanine)为止的位置上诱发突变(mutation)。接下来，能够通过在所有的内部蛋氨酸(Met)位上诱发突变而诱导出蛋氨酸-缺失GFP(以下简称为“r5M-GFP”)。此外，能够使第76个以及第204个天冬氨酸(D76，D204)位置被置换成丝氨酸(Ser，S)。

在向r5M-GFP插入抗菌肽的方法中，能够首先利用Ndel和Xhol限制酶位执行使r5M-GFP进入到pET30b载体内部的克隆处理。这能够通过利用限制酶的分离以及通过T4连接酶(ligase)的连接(ligation)过程而执行，其详细的过程如下所述。

能够将已插入r5M-GFP的pET30b载体作为DNA模板，通过设计出在5'方向上具有Ndel(包括起始密码子(start codon))限制酶位以及组氨酸标记(His-tag)而在3'方向上的第172个氨基酸之后具有连接肽(包括Kpnl限制酶位)以及蛋氨酸的引物并执行聚合酶链反应(PCR)而制造出N-末端侧断片(fragment)。C-末端侧短片也能够通过如上所述的方式，通过设计出在5'方向上具有蛋氨酸、连接肽以及第173个氨基酸而在3'方向上具有组氨酸标记(His-tag)、终止密码子(stop codon)以及Xhol限制酶位的引物而进行扩增。

能够将对PG1或PMAP36进行译码的遗传基因作为DNA模板，设计出在5'方向上具有对Kpnl限制酶位、连接肽(连接肽包括Kpnl限制酶位)以及蛋氨酸进行译码的碱基序列而在3'方向上具有对蛋氨酸、BamHI限制酶位以及连接肽(连接肽包括BamHI限制酶位)进行译码的碱基序列的引物之后执行聚合酶链反应(PCR)。

在通过重叠延伸聚合酶链反应(overlap PCR)对通过聚合酶链反应(PCR)扩增的PG1或PMAP36的各个遗传基因以及上述从r5M-GFP扩增的两个断片进行扩增时，能够获取到包括可对抗菌肽进行译码的序列的遗传基因(r5M-172-PG1-173或r5M-172-PMAP-173)。因为在各个断片以及遗传基因中，通过之前的聚合酶链反应(PCR)步骤添加的蛋氨酸、连接肽部分的碱基序列相辅，因此能够得到上述结果(接下来，将抗菌肽被结合到上述GFP上的如图1A所示的结构标记为“r5M-172AMP173”)。

上述r5M-172-PG1-173或r5M-172-PMAP-173遗传基因能够在聚合酶链反应(PCR)之后通过凝胶抽提(gel extraction)过程从琼脂糖凝胶获得。接下来，能够利用Ndel和Xhol限制酶分别对上述遗传基因进行切割，然后通过在利用相同的两个限制酶进行切割的pET0b载体上利用T4连接酶(ligase)进行连接以及转化而完成克隆处理(图1B)。

在向r5M-GFP插入遗传基因的上述系统中，能够通过如上所述的重叠延伸聚合酶链反应(overlap PCR)执行克隆处理，且可能需要执行多次聚合酶链反应(PCR)过程以及在各个聚合酶链反应(PCR)过程之后执行的凝胶抽提(gel extraction)过程。

通过利用Kpnl和BamHI限制酶对在上述克隆处理之后克隆获得的载体进行切割，能够分离出已插入的遗传基因。通过利用与上述PG1以及PMAP36遗传基因相同的方式设计出需要进行克隆的遗传基因的引物，并在通过聚合酶链反应(PCR)扩增之后利用Kpnl和BamHI限制酶进行切割，再连接到对已插入的遗传基因进行分离的载体中，能够对克隆过程进行简化。较佳地，r5M-172AMP 173遗传基因所包含的限制酶能够按照Ndel、Kpnl、BamHI以及Xhol的顺序进行配置。

此外，本发明提供一种包括用于对上述绿色荧光蛋白进行编码的以序列编号21记录的碱基序列的遗传基因。

此外，本发明提供一种包括上述遗传基因的重组表达载体。

重组的上述遗传基因(r5-M172AMP173)能够被插入到pET30b表达载体的Ndel和Xhol限制酶位，此时，为了在r5M-172AMP173的两侧末端黏附组氨酸标记(his-tag)，能够在设计上述聚合酶链反应(PCR)引物时添加组氨酸标记(his-tag)序列。组氨酸标记(his-tag)是指黏附于重组蛋白末端的多个组氨酸(histidine)，通过利用组氨酸(histidine)对金属粒子的选择性结合能力，能够轻易地对重组蛋白进行分离和纯化。

组氨酸(histidine)是具有咪唑基的氨基酸，主要能够轻易地与如Ni²⁺或Fe²⁺等2价金属粒子实现结合。组氨酸标记(his-tag)需要从重组蛋白表达载体的制造步骤开始考虑其粘附与否，使得在重组蛋白碱基序列的前端部分或后端部分表达多个组氨酸(histidine)，而通常所表达的组氨酸(histidine)的数量能够是6个以上。

此外，本发明提供一种将上述重组表达载体引进到宿主细胞中的转化体。较佳地，作为上述宿主细胞能够选择大肠杆菌。上述大肠杆菌能够是大肠杆菌(E.coli)BL21。

此外，本发明提供一种包括：(1)在培养液中对利用以序列编号21记录的碱基序列进行重组的转化体进行培养的步骤；(2)从上述培养液回收转化体的步骤；(3)从转化体获取蛋白质的步骤；以及，(4)通过对上述蛋白质进行酸处理而分离出抗菌肽的步骤；的抗菌肽的制造方法。上述蛋白质能够是不溶性蛋白。

在上述步骤(1)中，上述转化体能够是大肠杆菌(E.coli)BL21，能够在37℃的1LLB培养基(Luria-Bertani broth)中进行培养，能够通过投入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D thiogalactoside)而诱导蛋白质的表达。

在上述步骤(2)中，上述回收能够利用离心分离机执行。

在适用本发明的一实施例中，上述不溶性蛋白能够以包涵体(inclusion bodies)的形态表达。

为了提取出上述不溶性蛋白，能够利用超声波震碎机(sonicator)震碎细胞并通过对所震碎的裂解物(lysate)进行离心分离而获取可溶性以及不溶性分离物。在利用裂解缓冲液(lisys buffer)对不溶性分离物进行再悬浮之后，能够通过投入溶菌酶(lysozyme)破坏细胞壁，而在通过投入脱氧核糖核酸酶(DNase)对DNA进行切割之后，能够通过离心分离对以包涵体(inclusion bodies)形态表达的不溶性蛋白进行分离。

为了提升上述所分离出的不溶性蛋白的收率，能够执行利用包括溶菌酶(lysozyme)和脱氧核糖核酸酶的磷酸钠缓冲溶液(sodium phosphate buffer)去除细胞壁(cell wall)、细胞碎片(cell debris)以及基因组DNA(gDNA)的洗涤步骤(washing step)。

上述不溶性蛋白是以包涵体形态表达，因此能够将因为抗菌肽的毒性作用而对宿主细胞的生长造成的阻碍降至最低，此外还能够防止如抗菌肽等分子量较小的多肽因为存在于宿主细胞内部的蛋白酶而发生分解，从而提升抗菌肽制造过程中的生产收率。

上述以包涵体形态表达的不溶性蛋白能够通过镍-次氮基三乙酸柱色谱法(Ni-NTA column chromatograph)进行纯化，洗脱分离物能够通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析，再以脱离子水作为透析液进行透析。透析用于去除在纯化过程中所投入的尿素、咪唑、NaCl，在经过上述过程之后，能够通过对不溶性蛋白进行冻结干燥而去除不必要的水。通过如上所述的透析以及冻结干燥过程，能够获取到高浓度的不溶性蛋白。

在适用本发明的一实施例中，上述抗菌肽连续排列且在上述抗菌肽的N-末端、C-末端或上述的连接部上能够连接天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列。上述连续排列的抗菌肽能够以3拷贝存在。上述天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列能够通过酸处理而实现切割。上述酸处理能够通过投入HCl而执行。

上述酸处理是利用酸性条件对氨基酸键进行切割的方法，目前所使用的氰化溴会因为其毒性较强而需要非常小心地进行使用并因此导致工程速度变慢的问题，同时还会因为其价格较高而导致经济性不良的问题，酸处理方法能够对上述问题进行改善，从而以较低的成本实现所需要的目的。

通过对位于上述抗菌肽(PG1，PMAP36)两侧的N-末端与C-末端部位进行切割，能够仅获取到抗菌肽(图1C)。接下来，能够通过反相高压液相色谱法(reverse phase HPLC)对抗菌肽进行纯化。通过向纯化出的抗菌肽添加重折叠缓冲液(refolding buffer)，能够使其以天然(native)状态重折叠，同时还能够通过透析将重折叠缓冲液(refolding buffer)替换成脱离子水。

此外，迄今为止从各种不同的生物体发现的抗菌肽，能够根据其结构分成三种类型。第一种为富含半胱氨酸的β-折叠(sheet)肽，第二种为α-螺旋(helical)两亲性分子，而第三种为富含脯氨酸的肽。如上所述的抗菌肽的各种不同的结构取决于肽氨基酸序列，而上述结构与肽的抗菌活性具有非常密切的关系。

在本发明中，使用了通过两个二硫键实现稳定化的，具有典型的反平行β-转角结构的猪源抗菌肽(Protegrin1，PG1)，这最初是在猪的白细胞中被发现。除此之外，还使用了具有螺旋(helix)结构的猪骨髓源抗菌肽36(Pig myeloid antibacterial peptide36，PMAP36)，但是并不以此为限。

为了对按照适用本发明的实施例进行纯化的抗菌肽PG1以及PMAP36的抗菌活性进行确认，通过利用大肠杆菌(E.coli)ATCC25922、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853以及金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 29213执行Spot-On-Lawn测试确认了其具有抗菌活性，具体结果如下述表1所示。

【表1】

表所生成的重组AMP的抗菌活性试验

接下来，将结合实施例对本发明进行更为详细的说明。下述实施例只是用于对本发明进行示例性说明，具有本领域一般知识的人员应该理解，本发明的范围并不因为下述实施例而受到限定。

实施例1。用于制造由不溶性绿色荧光蛋白与抗菌肽结合而成的融合蛋白的DNA扩增以及表达载体的制造

以对抗菌肽PG1进行译码的遗传基因(下述序列编号1)以及对PMAP36(下述序列编号2)进行译码的遗传基因作为DNA模板，设计出在5'方向上具有对Kpnl限制酶位、连接肽(连接肽包括Kpnl限制酶位)以及蛋氨酸进行译码的碱基序列而在3'方向上具有对蛋氨酸、BamHI限制酶位以及连接肽(连接肽包括BamHI限制酶位)进行译码的碱基序列的引物之后执行聚合酶链反应(PCR)。扩增所需的各个引物序列如下述表2所示。

序列编号1；

5'-AGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGA-3'

序列编号2；

5-'GGACGATTTAGACGGTTGCGTAAGAAGACCCGAAAACGTTTGAAGAAGATCGGGAAGGTTTTGAAGTGGATTCCTCCCATTGTCGGCTCAATACCCTTGGGTTGTGGG-3'

此外，在将上述抗菌肽插入到已诱发突变的r5M-GFP的方法中，对r5M-GFP遗传基因以及抗菌肽分别设计了5'方向以及3'方向上的引物。扩增所需的各个引物序列如下述表2所示。

【表2】

在上述引物序列的序列编号3的碱基序列中，包括用于在后续工程中与表达载体pET30b进行结合的限制酶Ndel的识别序列以及用于Ni-NTA柱色谱法的6x组氨酸标记(Histag)序列(5'-CATCACCATCATCACCAT-3')，而在接下来的序列编号4的碱基序列以及序列编号5的碱基序列中，包括为了利用氰化溴的肽切割而对蛋氨酸进行编码的ATG密码子。此外，在序列编号6的碱基序列中，包括用于在后续工程中与表达载体pET30b进行结合的限制酶Ndel的识别序列，在序列编号7(退火温度：57℃)以及序列编号9(退火温度：50℃)的碱基序列中，包括限制酶Kpnl以及用于利用氰化溴的肽切割的ATG密码子。此外，在序列编号8以及序列编号10的碱基序列中，包括限制酶BamHI的识别序列以及用于利用氰化溴的肽切割的ATG密码子。通过按照如上所述的方式添加用于对蛋氨酸进行编码的ATG密码子，能够在后续的从融合蛋白仅分离出抗菌肽PG1以及PMAP36的步骤中，使得在利用氰化溴(CNBr)进行处理时能够对紧邻蛋氨酸残基之后的肽结合进行切割，从而仅分离出抗菌肽。

此外，为了增强PG1的表达，通过将拷贝数量增加至3个而尝试实现重组。利用以序列编号11记录的正方向5'末端和以序列编号12记录的反方向3'末端引物，对PG1的遗传基因断片进行了扩增。各个PG1单体(monomer)是利用T4 DNA连接酶(Ligase)(NEB)进行连续连接。对于连续包括PG1的3拷贝的聚合物(以下简称为(PG1)₃)，在3％的低熔点琼脂糖(lowmelting agarose)凝胶中进行电泳并观察到150至300bp大小的DNA带之后，利用苯酚-氯仿(phenol-chloroform)纯化出(PG1)₃。

序列编号11(5'->3')；

CCGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGAGAC

序列编号12(5'->3')；

TCCTCGTCCGACACAGACGCAGAACCTACGCCTACAATAGCACAGGCGACCTCCCCTCGGCTG

通过对在上述过程中得到扩增的DNA断片进行连接(ligation)而完成重组，其中抗菌肽PG1、PMAP36以及(PG1)₃遗传基因被插入到GFP的氨基酸序列中的第172号以及第173号之间的环(loop)区。其中，(PG1)₃遗传基因的插入是利用以序列编号13以及14记录的引物执行(表3)。借此，(PG1)₃形成了在3拷贝连续排列的PG1的各个拷贝的N-末端、C-末端或上述之连接部上连接Asp-Pro(天冬氨酸-脯氨酸，DP)氨基酸序列的结构。

【表3】

因为在后续的步骤中，需要通过对从已插入(PG1)₃遗传基因的转化体生成的蛋白质中的天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)部位进行切割而分离出PG1，因此在插入(PG1)₃遗传基因之前，首先执行了分离工程所需的r5M-GFP的定点突变(site directed mutagenesis)。因为重组遗传基因的第76个以及第204个天天冬氨酸(D76、D204)位置对应于天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)结合部位，因此还能够通过将其分别置换成丝氨酸(Ser，S)而防止在分离蛋白质的过程中发生不必要的结合部位被切断的现象(图2)。用于执行上述置换的引物如下述表4所示。利用下述以序列编号15以及序列编号16记录的引物，将第76个天冬氨酸置换成丝氨酸，并利用以序列编号17以及18记录的引物，将第204个天冬氨酸置换成丝氨酸。

【表4】

通过上述过程完成重组的遗传基因，标记为“r5M-172PG1173”(插入抗菌肽PG1遗传基因)、“r5M-172PMAP36173”(插入抗菌肽PMAP36)以及“r5M-172(PG1)₃173”(插入抗菌肽(PG1)₃

)。上述重组遗传基因r5M-172PG1173的碱基序列的序列编号为19，r5M-172PMAP36173的碱基序列的序列编号为20，r5M-172(PG1)₃173的碱基序列的序列编号为21，具体如下。

序列编号19(5'->3')；

CATATGCATCACCATCATCACCATCAGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTTAGCGTGCGTGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCAACGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACCACCGGTAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGGGTTATGGTGTGCAGTGCTTTGCACGTTATCCGGATCACATCAAACGTCATGATTTCTTTAAAAGCGCGCTGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGTACCATTAGCTTTAAAGATGATGGCACCTATAAAACCCGTGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTGAACCGTATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATGGCAACATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAACTTTAACAGCCATAAAGTGTATATTACCGCGGATAAACAGAAAAACGGCATTAAAGCGAACTTTAAAATTCGTCATAACGTGGAAGGTGGTTCTGGTACCATGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGAATGGGATCCGGTGGCGATGGCAGCGTGCAGCTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGCGATGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGTGCTGCTGAAAGATCCGAACGAAAAACGTGATCACGCGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGCATTACCCACGGCAAAGATGAACTGTATAAACATCACCATCATCACCATTAATAACTCGAGATC

序列编号20(5'->3')；

CATATGCATCACCATCATCACCATCAGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTTAGCGTGCGTGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCAACGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACCACCGGTAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGGGTTATGGTGTGCAGTGCTTTGCACGTTATCCGGATCACATCAAACGTCATGATTTCTTTAAAAGCGCGCTGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGTACCATTAGCTTTAAAGATGATGGCACCTATAAAACCCGTGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTGAACCGTATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATGGCAACATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAACTTTAACAGCCATAAAGTGTATATTACCGCGGATAAACAGAAAAACGGCATTAAAGCGAACTTTAAAATTCGTCATAACGTGGAAGGTGGTTCTGGTACCATGGGACGATTTAGACGGTTGCGTAAGAAGACCCGAAAACGTTTGAAGAAGATCGGGAAGGTTTTGAAGTGGATTCCTCCCATTGTCGGCTCAATACCCTTGGGTTGTGGGATGGGATCCGGTGGCGATGGCAGCGTGCAGCTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGCGATGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGTGCTGCTGAAAGATCCGAACGAAAAACGTGATCACGCGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGCATTACCCACGGCAAAGATGAACTGTATAAACATCACCATCATCACCATTAATAACTCGAG

序列编号21(5'->3')；

ATGCATCACCATCATCACCATCAGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTTAGCGTGCGTGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCAACGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACCACCGGTAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGGGTTATGGTGTGCAGTGCTTTGCACGTTATCCGTCTCACATCAAACGTCATGATTTCTTTAAAAGCGCGCTGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGTACCATTAGCTTTAAAGATGATGGCACCTATAAAACCCGTGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTGAACCGTATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATGGCAACATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAACTTTAACAGCCATAAAGTGTATATTACCGCGGATAAACAGAAAAACGGCATTAAAGCGAACTTTAAAATTCGTCATAACGTGGAAGGTGGTTCTGGTACCGACCCGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGAGACCCGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGAGACCCGAGGGGAGGTCGCCTGTGCTATTGTAGGCGTAGGTTCTGCGTCTGTGTCGGACGAGGAGACCCGGGATCCGGTGGCGATGGCAGCGTGCAGCTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGCGATGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGTGCTGCTGAAATCTCCGAACGAAAAACGTGATCACGCGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGCATTACCCACGGCAAAGATGAACTGTATAAACACCATCACCACCATCACTAATAA

在上述序列编号19至序列编号21的碱基序列中，包括由下述序列编号22以及序列编号23的碱基序列构成的连接肽(linker)。

序列编号22；

5'-GGTGGTTCT-3'

序列编号23；

5'-GGATCCGGTGGC-3'

上述r5M-172PG1173、r5M-172PMAP36173以及r5M-172(PG1)₃173被插入到pET30b表达载体的Ndel和Xhol限制酶位，从而制造出重组表达载体。

r5M-172(PG1)₃173的氨基酸序列的序列编号为24，具体如下。在从此分离出抗菌肽PG1的步骤中，在利用HCl进行酸性条件处理时，能够通过使天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)结合中的天冬氨酸与脯氨酸之间的氨基酸结合被切割而仅分离出抗菌肽。

序列编号24(5'->3')；

MHHHHHHQSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLGYGVQCFARYPSHIKRHDFFKSALPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHKVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEGGSGTDPRGGRLCYCRRRFCVCVGRGDPRGGRLCYCRRRFCVCVGRGDPRGGRLCYCRRRFCVCVGRGDPGSGGDGSVQLADHYQQNTPIGDDNHYLSTQSVLLKSPNEKRDHAVLLEFVTAAGITHGKDELYKHHHHHH

实施例2。大肠杆菌转化体的培养以及融合蛋白的表达诱导

在将通过上述实施例1制造出的重组表达载体引进到大肠杆菌(E.coli)BL21之后，在37摄氏度的1L LB培养基(Luria-Bertani broth)中进行培养，然后通过投入0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D thiogalactoside)而诱导了蛋白质的表达。在培养物的浑浊度达到OD600(光密度(Optical Density)600nm)即在600nm波长下的密度值达到0.6至0.8为止对蛋白质的表达进行了诱导，并在此之后的5小时内继续对表达进行了诱导。

实施例3。不溶性融合蛋白的分离

在4℃、800rpm条件下对通过上述实施例2诱导表达的培养物进行了10分钟的离心分离，从而对大肠杆菌细胞进行了回收。在利用超声波震碎机(sonicator)震碎所获取到的细胞之后，在4℃、13000rpm条件下对所震碎的细胞震碎物进行了20分钟的离心分离，从而获取到了包括可溶性分离物和不溶性蛋白质的沉淀物(pellet)。按照向每1L不溶性沉淀物添加40ml的裂解缓冲液(包括100mM氯化钠(sodium chloride)且pH值为7.4的20mM磷酸钠缓冲溶液(sodium phosphate buffer)，0.5％triton-X100，0.1mM PMSF，1mM DTT)的比例对其进行了再悬浮(resuspend)处理。接下来，向上述溶解物添加溶菌酶(0.1mg/ml)以及脱氧核糖核酸酶(0.01mg/ml)并在常温下进行了20分钟的孵化(incubation)处理。在此过程中，借助于溶菌酶对细胞壁造成了破坏并借助于脱氧核糖核酸酶对DNA进行了切割。

接下来，在4℃、8000rpm条件下对上述已添加溶菌酶以及脱氧核糖核酸酶的溶解物进行10分钟的离心分离，从而获取到了以包涵体(inclusion bodies)形态表达的不溶性蛋白。为了提升所获取到的不溶性蛋白的收率，执行了2次利用包括溶菌酶(lysozyme)和脱氧核糖核酸酶的磷酸钠缓冲溶液(sodium phosphate buffer)去除细胞壁(cell wall)、细胞碎片(cell debris)以及基因组DNA(gDNA)的洗涤步骤(washing step)。

接下来，利用包括8M尿素(urea)以及30mM咪唑(imidazole)且pH值为7.4的20mM磷酸钠缓冲溶液(sodium phosphate buffer)对上述不溶性蛋白进行了再悬浮，并通过Ni-NTA柱色谱法(GE医疗生命科学，瑞典)进行了纯化。

通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对纯化之后所溶出的分离物进行了分析，并在常温条件下以脱离子水作为透析液进行了透析。

实施例4。抗菌肽PG1、PMAP36的分离以及纯化

在上述实施例3中，对纯化并透析之后的不溶性蛋白进行冻结干燥处理，再利用70％的甲酸(formic acid)进行了溶解。

在向从包括重组遗传基因r5M-172PG1173以及r5M-172PMAP36173的转化体生成的不溶性蛋白溶液添加氰化溴(CNBr)溶液之后，在暗室中进行24小时的孵化(incubation)，从而对位于抗菌肽PG1以及PMAP36两侧的GFP的N-末端以及C-末端部位进行了切割。通过冻结干燥对上述甲酸以及氰化溴进行去除，然后利用反相高压色谱法用的缓冲液进行了溶解。

为了能够从r5M-172(PG1)₃173纯化出抗菌肽PG1，使用了利用酸性条件的氨基酸结合切割方法。这是因为目前所使用的氰化溴会因为其毒性较强而需要非常小心地进行使用并因此导致工程速度变慢的问题，同时还会因为其价格较高而导致经济性不良的问题。

从包括重组遗传基因r5M-172(PG1)3173的转化体生成的不溶性蛋白，通过实施例1形成了PG1的3拷贝连续排列且在上述PG1的各个拷贝的N-末端、C-末端或上述之连接部上连接Asp-Pro(天冬氨酸-脯氨酸，DP)氨基酸序列的结构。通过在75℃的条件下利用80mM的HCl对上述不溶性蛋白进行4小时的处理而对天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸结合进行了切割，从而从不溶性蛋白分离出了PG1。

通过16％的三羟甲基氨基甲烷-三(羟甲基)甲基甘胺酸(tris-tricine)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，在各个步骤对所纯化出的蛋白质的纯度进行了分析。

抗菌肽PG1以及PMAP36是利用反相高压色谱法(沃特世Deltapak C18 column7.8，300mm)进行了纯化，将试料以2.5ml/分钟的流速持续1小时倒入到包括0.1％的三氟乙酸(trifluoroacetic acid)且具有5至90％的线形浓度梯度的管中。在220nm以及280nm下对吸光度进行了观察，并通过16％的三羟甲基氨基甲烷-三(羟甲基)甲基甘胺酸(tris-tricine)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对不一致的峰值进行了分析。

为了形成所纯化出的分离物的重折叠条件(refolding condition)，在执行通过冻结干燥而去除不必要的缓冲液的步骤之后，通过添加由包括8M尿素、5mM还原的谷胱甘肽(glutathione)以及0.5mM氧化的谷胱甘肽(glutathione)的20mM磷酸钠缓冲溶液(sodiumphosphate buffer)(pH值为7.4)构成的重折叠缓冲液(refolding buffer)而使其以天然状态重折叠(refolding)，同时通过透析将重折叠缓冲液(refolding buffer)替换成了脱离子水。接下来，对经过纯化以及透析的肽进行了冻结干燥。

试验例1。已插入r5M-172PG1173遗传基因的pET30b表达载体的蛋白质表达被诱导或未被诱导时的大肠杆菌(E.coli)BL21的生长曲线的测定以及比较

在对已插入r5M172-PG1-173遗传基因的pET30b表达载体进行引进的大肠杆菌(E.coli)BL21中，通过光学密度(optical density)测定的方式，对蛋白质表达被诱导或未被诱导时的大肠杆菌(E.coli)BL21的生长进行了测定以及比较。

其结果如图3所示，可以发现r5M-172PG1173蛋白质的表达并没有对大肠杆菌的生长率造成过大的影响。即，作为载体被插入到不溶性GFP中的抗菌肽并不会对大肠杆菌的生长造成过大的影响。如图4所示，r5M-172PG1173蛋白以包涵体形态被表达。

虽然为了实现抗菌肽的稳定生产而做出了与融合标签进行结合的多种尝试，但是因为生产收率较低，因此必须采取如投入高营养的培养基、在融合标签之间插入遗传基因的多个拷贝等需要耗费额外的生产成本的完善措施。但是，通过向以不溶性状态高度表达的GFP插入抗菌肽而制造出的适用本发明的融合蛋白，能够将对宿主细胞的生长阻碍降至最低并借此以较高的收率生产出抗菌肽。

试验例2。已插入r5M-172PG1173遗传基因的pET30b表达载体在时间流逝时的蛋白质生成性测定

以所有细胞蛋白为样本并利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，对大肠杆菌中已插入r5M-172PG1173遗传基因的pET30b表达载体在时间流逝(3小时、4小时、5小时)时的r5M-172PG1173蛋白生成情况进行了确认。

其结果如图5所示，与r5M-172PG1173蛋白表达未被诱导的泳道(lane)(UI)不同，在蛋白表达被诱导的泳道(lane)(3小时、4小时、5小时)中，3小时至5小时期间内大肠杆菌(E.coli)BL21中的r5M-172PG1173蛋白质均被明显表达。

试验例3。引进到大肠杆菌(E.coli)BL21中的pET30b表达载体内的r5M-172PG1173 以及r5M-172PMAP36173蛋白质生成性测定

对于被分别插入到r5M-GPF遗传基因中的PG1以及PMAP36遗传基因，在被克隆到pET30b表达载体中之后在大肠杆菌(E.coli)BL21上进行了5小时的表达诱导。

预计上述重组蛋白在细胞内的所有蛋白质中占比约45至50％。从每1L细胞培养物获取到1.4g的r5M-172PG1173不溶性蛋白(31kDa)以及从每1L细胞培养物获取到1.3g的r5M-172PMAP36173不溶性蛋白(33kDa)，如电泳的最终不溶性分离物部分所示，最终占到了目标蛋白的几乎90％(图6A以及图6B)。

利用Ni-NTA柱色谱法对上述不溶性蛋白进行纯化并对所纯化出的目标蛋白进行了池(pool)化，然后以脱离子水作为透析液进行了透析。

试验例4。抗菌肽PG1以及PMAP36的收率测定

在通过上述试验例3进行透析的蛋白质样本中，从r5M-GPF分别对PG1以及PMAP36进行了切割，接下来在利用HPLC对PG1(2.4kDa)以及PMAP36(4.2kDa)进行纯化之后对其收率进行了测定。

其结构如表5所示，从包括PG1的3拷贝的重组体(r5M-172(PG1)₃173)生成的蛋白质呈现出了约2.3倍的收率

【表5】

试验例5。抗菌肽PG1以及PMAP36的纯度分析

为了获得高纯度的PG1以及PMAP36，通过三羟甲基氨基甲烷-三(羟甲基)甲基甘胺酸(tris-tricine)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对在蛋白质纯化的各个步骤中所提取出的蛋白质样本进行了加样(loading)，并通过电泳对其纯度进行了分析，最终获取到了纯度达到95％以上的抗菌肽PG1以及PMAP36(图7A以及图6B)。

此外，利用抗-PG1抗体以及蛋白印记法(western blot)对所纯化的PG1进行了确认。如图7所示，在2.4kDa的位置上明确观察到了PG1。

在上述内容中，对本发明的特定部分进行了详细的说明，但是具有相关行业一般知识的人员应该理解，上述具体实施例知识较佳的实施形态，本发明的范围并不因此而受到限制。因此，本发明的实际范围应通过所附的权利要求书及其等价物做出定义。

序列表

<110> 建国大学校产学协力团

<120> 包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白的抗菌肽制造方法

<130> PP160201

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 野猪(Sus scrofa)

<400> 1

aggggaggtc gcctgtgcta ttgtaggcgt aggttctgcg tctgtgtcgg acgagga 57

<210> 2

<211> 108

<212> DNA

<213> 野猪(Sus scrofa)

<400> 2

ggacgattta gacggttgcg taagaagacc cgaaaacgtt tgaagaagat cgggaaggtt 60

ttgaagtgga ttcctcccat tgtcggctca atacccttgg gttgtggg 108

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 3

catatgcatc accatcatca ccatcagagc 30

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 4

catggtacca gaaccacctt ccacgttatg ac 32

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 5

atgggatccg gtggcgatgg cagcgt 26

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 6

gtggtggtgc tcgagttatt aatggtg 27

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 7

gcggttctgg tggtaccatg aggggaggtc gcctgtg 37

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 8

gccaccggat cccattcctc gtccgacaca gacg 34

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 9

gcggttctgg tggtaccatg ggacgattta gacggttg 38

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 10

caccggatcc catcccacaa cccaagggta 30

<210> 11

<211> 63

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 11

ccgaggggag gtcgcctgtg ctattgtagg cgtaggttct gcgtctgtgt cggacgagga 60

gac 63

<210> 12

<211> 63

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 12

tcctcgtccg acacagacgc agaacctacg cctacaatag cacaggcgac ctcccctcgg 60

ctg 63

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 13

gtacccagga cctgccggga tccggtggcg atggcagcgt 40

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 14

cagcatctgg gtaccagaac caccttccac g 31

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 15

gcacgttatc cgtctcacat caaacg 26

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 16

cgtttgatgt gagacggata acgtgc 26

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 17

ctgctgaaat ctccgaacga aaaacgtg 28

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> PCR 引物(人工序列)

<400> 18

cacgtttttc gttcggagat ttcagcag 28

<210> 19

<211> 843

<212> DNA

<213> r5M-172PG1173的碱基序列(人工序列)

<400> 19

catatgcatc accatcatca ccatcagagc aaaggcgaag aactgtttac cggcgtggtg 60

ccgattctgg tggaactgga tggcgatgtg aacggccata aatttagcgt gcgtggcgaa 120

ggcgaaggcg atgcgaccaa cggcaaactg accctgaaat ttatttgcac caccggtaaa 180

ctgccggtgc cgtggccgac cctggtgacc accctgggtt atggtgtgca gtgctttgca 240

cgttatccgg atcacatcaa acgtcatgat ttctttaaaa gcgcgctgcc ggaaggctat 300

gtgcaggaac gtaccattag ctttaaagat gatggcacct ataaaacccg tgcggaagtg 360

aaatttgaag gcgataccct ggtgaaccgt attgaactga aaggcattga ttttaaagaa 420

gatggcaaca ttctgggcca taaactggaa tataacttta acagccataa agtgtatatt 480

accgcggata aacagaaaaa cggcattaaa gcgaacttta aaattcgtca taacgtggaa 540

ggtggttctg gtaccatgag gggaggtcgc ctgtgctatt gtaggcgtag gttctgcgtc 600

tgtgtcggac gaggaatggg atccggtggc gatggcagcg tgcagctggc ggatcattat 660

cagcagaaca ccccgattgg cgatgataac cattatctga gcacccagag cgtgctgctg 720

aaagatccga acgaaaaacg tgatcacgcg gtgctgctgg aatttgtgac cgcggcgggc 780

attacccacg gcaaagatga actgtataaa catcaccatc atcaccatta ataactcgag 840

atc 843

<210> 20

<211> 891

<212> DNA

<213> r5M-172PMAP36173的碱基序列(人工序列)

<400> 20

catatgcatc accatcatca ccatcagagc aaaggcgaag aactgtttac cggcgtggtg 60

ccgattctgg tggaactgga tggcgatgtg aacggccata aatttagcgt gcgtggcgaa 120

ggcgaaggcg atgcgaccaa cggcaaactg accctgaaat ttatttgcac caccggtaaa 180

ctgccggtgc cgtggccgac cctggtgacc accctgggtt atggtgtgca gtgctttgca 240

cgttatccgg atcacatcaa acgtcatgat ttctttaaaa gcgcgctgcc ggaaggctat 300

gtgcaggaac gtaccattag ctttaaagat gatggcacct ataaaacccg tgcggaagtg 360

aaatttgaag gcgataccct ggtgaaccgt attgaactga aaggcattga ttttaaagaa 420

gatggcaaca ttctgggcca taaactggaa tataacttta acagccataa agtgtatatt 480

accgcggata aacagaaaaa cggcattaaa gcgaacttta aaattcgtca taacgtggaa 540

ggtggttctg gtaccatggg acgatttaga cggttgcgta agaagacccg aaaacgtttg 600

aagaagatcg ggaaggtttt gaagtggatt cctcccattg tcggctcaat acccttgggt 660

tgtgggatgg gatccggtgg cgatggcagc gtgcagctgg cggatcatta tcagcagaac 720

accccgattg gcgatgataa ccattatctg agcacccaga gcgtgctgct gaaagatccg 780

aacgaaaaac gtgatcacgc ggtgctgctg gaatttgtga ccgcggcggg cattacccac 840

ggcaaagatg aactgtataa acatcaccat catcaccatt aataactcga g 891

<210> 21

<211> 963

<212> DNA

<213> r5M-172(PG13173的碱基序列人工序列)

<400> 21

atgcatcacc atcatcacca tcagagcaaa ggcgaagaac tgtttaccgg cgtggtgccg 60

attctggtgg aactggatgg cgatgtgaac ggccataaat ttagcgtgcg tggcgaaggc 120

gaaggcgatg cgaccaacgg caaactgacc ctgaaattta tttgcaccac cggtaaactg 180

ccggtgccgt ggccgaccct ggtgaccacc ctgggttatg gtgtgcagtg ctttgcacgt 240

tatccgtctc acatcaaacg tcatgatttc tttaaaagcg cgctgccgga aggctatgtg 300

caggaacgta ccattagctt taaagatgat ggcacctata aaacccgtgc ggaagtgaaa 360

tttgaaggcg ataccctggt gaaccgtatt gaactgaaag gcattgattt taaagaagat 420

ggcaacattc tgggccataa actggaatat aactttaaca gccataaagt gtatattacc 480

gcggataaac agaaaaacgg cattaaagcg aactttaaaa ttcgtcataa cgtggaaggt 540

ggttctggta ccgacccgag gggaggtcgc ctgtgctatt gtaggcgtag gttctgcgtc 600

tgtgtcggac gaggagaccc gaggggaggt cgcctgtgct attgtaggcg taggttctgc 660

gtctgtgtcg gacgaggaga cccgagggga ggtcgcctgt gctattgtag gcgtaggttc 720

tgcgtctgtg tcggacgagg agacccggga tccggtggcg atggcagcgt gcagctggcg 780

gatcattatc agcagaacac cccgattggc gatgataacc attatctgag cacccagagc 840

gtgctgctga aatctccgaa cgaaaaacgt gatcacgcgg tgctgctgga atttgtgacc 900

gcggcgggca ttacccacgg caaagatgaa ctgtataaac accatcacca ccatcactaa 960

taa 963

<210> 22

<211> 9

<212> DNA

<213> 连接肽碱基序列(人工序列)

<400> 22

ggtggttct 9

<210> 23

<211> 12

<212> DNA

<213> 连接肽碱基序列(人工序列)

<400> 23

ggatccggtg gc 12

<210> 24

<211> 319

<212> PRT

<213> r5M-172(PG13173的氨基酸序列人工序列)

<400> 24

Met His His His His His His Gln Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr

1 5 10 15

Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His

20 25 30

Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys

35 40 45

Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp

50 55 60

Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg

65 70 75 80

Tyr Pro Ser His Ile Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Leu Pro

85 90 95

Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr

100 105 110

Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn

115 120 125

Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu

130 135 140

Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn Ser His Lys Val Tyr Ile Thr

145 150 155 160

Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His

165 170 175

Asn Val Glu Gly Gly Ser Gly Thr Asp Pro Arg Gly Gly Arg Leu Cys

180 185 190

Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Val Cys Val Gly Arg Gly Asp Pro Arg

195 200 205

Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Val Cys Val Gly

210 215 220

Arg Gly Asp Pro Arg Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe

225 230 235 240

Cys Val Cys Val Gly Arg Gly Asp Pro Gly Ser Gly Gly Asp Gly Ser

245 250 255

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Asp

260 265 270

Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Leu Lys Ser Pro Asn Glu

275 280 285

Lys Arg Asp His Ala Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile

290 295 300

Thr His Gly Lys Asp Glu Leu Tyr Lys His His His His His His

305 310 315

Claims

1.一种不溶性融合蛋白，其特征在于，所述不溶性融合蛋白的氨基酸序列为序列编号24记录的氨基酸序列。

2.一种遗传基因，其特征在于，所述遗传基因的碱基序为用于对权利要求1所述的不溶性融合蛋白进行编码的以序列编号21记录的碱基序列。

3.一种重组表达载体，其特征在于，包括：

权利要求2所述的遗传基因。

4.一种转化体，其特征在于：

将权利要求3所述的重组表达载体引进到宿主细胞中。

5.根据权利要求4所述的转化体，其特征在于：

上述宿主细胞是大肠杆菌。

6.一种抗菌肽的制造方法，其特征在于，包括：

(1)在培养液中对利用以序列编号21记录的碱基序列进行重组的转化体进行培养的步骤；

(2)从上述培养液回收转化体的步骤；

(3)从转化体获取蛋白质的步骤；以及，

(4)通过对上述蛋白质进行酸处理而分离出抗菌肽的步骤；

所述转化体中的宿主细胞为大肠杆菌BL21；

所述酸处理为采用HCl处理天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列。

7.根据权利要求6所述的制造方法，其特征在于：上述蛋白以包涵体(inclusionbodies)的形态表达。