CN102399292A - 重组干细胞因子与免疫球融合蛋白及其制备 - Google Patents
重组干细胞因子与免疫球融合蛋白及其制备 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102399292A CN102399292A CN2011102678754A CN201110267875A CN102399292A CN 102399292 A CN102399292 A CN 102399292A CN 2011102678754 A CN2011102678754 A CN 2011102678754A CN 201110267875 A CN201110267875 A CN 201110267875A CN 102399292 A CN102399292 A CN 102399292A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- leu
- lys
- ser
- val
- pro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种重组干细胞因子与免疫球融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白，由两部分组成：干细胞因子部分和免疫球蛋白Fc段；免疫球蛋白Fc段组成为免疫球蛋白G，E，D，M和A型的Fc段，及部分Fc段或者Fc段与Fab的融合体。其制备步骤为：1)宿主细胞的选择；2)构建重组表达载体；3)宿主细胞的转染；4)宿主细胞的筛选；5)细胞培养过程；6)目标蛋白质的分离与纯化。该制备步骤分离变的方便快捷高效，产品稳定性更好，蛋白在体内半衰期显著长，效果好。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程制备多肽类产品。
背景技术
干细胞因子(Stem cell factor，SCF)又称肥大细胞生长因子(MGF)，Kit配体(KL)及Steel因子(SLF)。SCF有2种存在形式：可溶性和膜结合型。SCF和其他细胞因子一起诱导干细胞和祖细胞增生、延长其存活期及引起干和祖细胞动员。与不同细胞因子结合将产生不同作用：SCF与其他细胞因子的联合应用可用于提高骨髓移植后的细胞恢复。在小鼠实验中，SCF和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的联合应用使外周血干细胞和祖细胞1天达到高峰，并使骨髓中干和祖细胞2周内升高达10倍；在体外SCF和白介素7协同促进前体B细胞增生。SCF与白介素6的联合应用可以用于促使各类骨髓细胞的增生。使用SCF、促血小板生长因子(TPO)、IL-12、IL-3处理冷冻骨髓细胞，其恢复血小板和中性粒细胞比用未处理的骨髓移植早；在鼠模型中，受者在应用5-FU前和后给予SCF注射，可以使干细胞从静止期进入细胞周期，这样干细胞对5-FU敏感，易于杀死，为供者骨髓移入受者提供了稳定的内环境，有利于骨髓移植的成功。
现有的重组干细胞因子有其单体形式(US Pat.App 11517619)，与其二连体形式(专利号：03112934)；重组干细胞因子在进入人体后，将会被肝脏与肾脏迅速代谢，静脉注射周期为2.1小时，皮下注射为8.4小时。而本专利解决了重组干细胞因子体内半衰期过短的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种重组干细胞因子(Stem cellfactor，SCF)与免疫球蛋白Fc段(Ig Fc)融合蛋白(rSCF-Fc)。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种重组干细胞因子与免疫球融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白，由两部分组成：干细胞因子部分和免疫球蛋白Fc段；
干细胞因子部分为具有干细胞因子活性的片段或整体；
免疫球蛋白Fc段组成为免疫球蛋白G，E，D，M和A型的Fc段，及部分Fc段或者Fc段与Fab的融合体；
重组干细胞因子与免疫球蛋白Fc段融合蛋白核苷酸序列为：
atgaagaagacacaaacttggattatcacttgcatttatcttcaactgctcctatttaatcctcttgt
caaaaccaaggagatctgcgggaatcctgtgactgataatgtaaaagacattacaaaactggtggcaa
atcttccaaatgactatatgataaccctcaactatgtcgccgggatggatgttttgcctagtcattgt
tggctacgagatatggtaatacaattatcactcagcttgactactcttctggacaagttctcaaatat
ttctgaaggcttgagtaattactccatcatagacaaacttgggaaaatagtggatgacctcgtgttat
gcatggaagaaaacgcaccgaagaatataaaagaatctccgaagaggccagaaactagatcctttact
cctgaagaattctttagtattttcaatcaattcaccatggcagagcccaaatcttctgacaaaactca
cacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaac
ccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaa
gaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcg
ggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctga
atggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc
aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaa
gaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggaga
gcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttc
ctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgat
gcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaggatccgccg
ccatcatggactacaaggacgacgacgacaagtag
下划线部分为干细胞因子部分
相应的氨基酸序列为：
Met Lys Lys Thr Gln Thr Trp Ile Ile Thr Cys Ile Tyr Leu Gln Leu Leu Leu Phe Asn
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Pro Leu Val Lys Thr Lys Glu Ile Cys Gly Asn Pro Val Thr Asp Asn Val Lys Asp Ile
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Asn Asp Tyr Met Ile Thr Leu Asn Tyr Val Ala Gly
41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Leu Arg Asp Met Val Ile Gln Leu Ser Leu Ser
61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
Leu Thr Thr Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile
81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
Ile Asp Lys Leu Gly Lys Ile Val Asp Asp Leu Val Leu Cys Met Glu Glu Asn Ala Pro
101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120
Lys Asn Ile Lys Glu Ser Pro Lys Arg Pro Glu Thr Arg Ser Phe Thr Pro Glu Glu Phe
121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140
Phe Ser Ile Phe Asn Gln Phe Thr Met Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380
Gly Lys Gly Ser Ala Ala Ile Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys ***
381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397
具有活性的干细胞因子部分提供自然型干细胞因子所具有的生物功能，包括引起干细胞和祖细胞增生、延长其存活期及引起干细胞和祖细胞动员。免疫球蛋白Fc段使目标蛋白质的分离变的方便快捷高效，还使得目标蛋白质的临床价值大大提高，因为Ig Fc片段融合蛋白使体内半衰期显著延长。Ig Fc片段的另一个作用就是形成同源二聚体使得干细胞因子的局部浓度提高并提高其效果。含有Ig Fc片段融合蛋白在体外使用时，可以利用Ig Fc片段将其铺于培养装置表面，以提高产品效果。
本发明所要解决的第二个技术问题是：提供一种重组干细胞因子(Stemcell factor，SCF)与免疫球蛋白Fc段(Ig Fc)融合蛋白(rSCF-Fc)的制备方法。
为了解决第二个技术问题，本发明的技术方案是：重组干细胞因子与免疫球蛋白Fc段融合蛋白的制备方法，其步骤为：
1)宿主细胞的选择：采用原核类细胞，酵母类细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞作为宿主细胞；
2)构建重组表达载体：构建与步骤1)中所采用宿主细胞相对应的表达载体；
重组表达载体核心元件组成为：核心目标蛋白质基因，大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因，与步骤1)中所采用宿主细胞相对应的启动子和增强子元件，生物标签，免疫球蛋白Fc段，及选择标志；
其中选择标志为抗生素抗性基因，二氢叶酸还原酶，荧光蛋白中的一种或任意两种以上的组合；
其中，生物标签安置在目标蛋白质的N端或者C端；免疫球蛋白Fc段(Ig Fc)安置在目标蛋白质的N端或者C端；
载体中原件顺序可以随意变换，核心目标蛋白质基因数量为1个，2个，3个，4个或5个；
3)宿主细胞的转染：宿主细胞的转染方法为磷酸钙沉淀法，电穿孔法或以病毒为基础的转染方法；
4)宿主细胞的筛选：宿主细胞的筛选方法基于步骤2)中构建载体所含选择标志为基础进行确定；
当选择标志为抗生素抗性基因时，在与步骤1)所采用宿主细胞相对应的培养基中加入抗生素进行筛选；
当选择标志为二氢叶酸还原酶时，在与步骤1)所采用宿主细胞相对应的培养基中，所述培养基中不加入甘氨酸，次黄嘌呤和胸苷成分进行筛选；
当选择标志为荧光蛋白时，利用荧光激活细胞分检(Fluorescence-activatedcell sorting，FACS)进行筛选(获取产荧光细胞株即为蛋白质表达细胞株。而通过筛选GFP荧光亮度可以快速获得高产细胞株)；
选择标志既可以与不表基因在同一质粒中也在与目标基因在不同质粒中进入宿主细胞。当选择标志与重组表达载体在同一载体质粒中，选择标志与目标蛋白质由不同或者共同的启动子转录并表达；
5)细胞培养过程：将生产细胞株在与步骤4)相同的培养基中培养；
6)目标蛋白质的分离与纯化：目标蛋白质的分离方法为亲和析层(affinitychromatography)，尺寸排阻析层(size exclusion chromatography)，离子交换层析(ion exchange chromatography)中的一种或任意两种以上的组合；
其中，亲和析层原理：利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。在目标蛋白质的表达载体中，在目标蛋白质的N端或C端，生物标签会与目标蛋白质联接，并与亲和析层柱中相对应的吸附剂产生结合作用，用于蛋白质的分离。
步骤2)中所述的安置在目标蛋白质的N端或者C端的单种或多种生物标签为旗标签(FLAG tag)，组氨酸标签HIS，维生素H(biotin)，链霉素(streptavidin)，链霉素结合肽(streptavidin-binding peptide)，Strep II，V5肽，S肽，myc肽，血凝素(haemagglutinin，HA)，蛋白质A，G，C(protein A，G，C)，钙调蛋白(calmodulin)，钙调蛋白结合肽(calmodulin binding peptide，CBP)，谷胱甘肽转移酶，(GLUtathione transferase，GST)，麦芽糖结合蛋白(maltose bindingprotein，MBP)中的一种或两种以上任意比组合。
组氨酸标签HIS中，HIS为6到19个。
步骤4)所述抗生素抗性基因为：氨必西林，稻瘟菌素，卡那霉素，新霉素，潮霉素，遗传霉素，博来霉素或甲氨蝶呤抗性基因。
步骤4)所述荧光蛋白为绿色蛋白(GFP，green fluorescent protein)，蓝色蛋白，红色蛋白，黄色荧光蛋白中的一种。
有益效果：
本发明方法纯化更简单：目标蛋白质将会直接由宿主细胞生产并分泌入培养基。免疫球蛋白Fc段和生物标签使目标蛋白质的分离变的方便快捷高效
产品稳定性更好：因为Ig Fc片段融合蛋白使体内半衰期显著延长。Ig Fc片段的另一个作用就是形成同源二聚体使得干细胞因子的局部浓度提高并提高其效果。含有Ig Fc片段融合蛋白在体外使用时，可以利用Ig Fc片段将其铺于培养装置表面，以提高产品效果。
说明书附图
图1，为重组蛋白质载体质粒构建流程框图。
图2，为重组干细胞因子与免疫球融合蛋白基因序列测序结果图。
图3，SDS-PAGE电泳图谱
1.分子量标准蛋白质
2.融合蛋白双聚体
3.融合蛋白单体
具体实施方式
本发明制备流程见附图1，下面通过具体实施对本发明作进一步详细描述。
实施例1：
1)宿主细胞的选择：选择CHO细胞。
2)构建重组表达载体
以互补DNA(cDNA)或者含有目标基因的质粒为模版，用引物(primer)
引物1：aac ctcgag atgaagaagacacaaacttg
引物2：aac caattg cacctcttgaaattctctc
经多聚酶链反应(PCR)法合成5’端带有XhoI，3’端带有MfeI酶切位点(Restriction site)。将PCR产物经过XhoI与MfeI内切酶的酶切反应(Digestion)。
将含有XhoI和EcoRI酶切位的载体质粒pMyc-CMV-IgGlFc-FLAG-IRES-GFP经过XhoI与EcoRI内切酶的酶切反应.将上述两个酶切反应的产物经过结合反应(Ligation)得到pMyc-CMV-SCF-IgGFc-FLAG-IRES-GFP的载体。CMV代表人巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子，IRES代表内部核糖体进入位。
3)宿主细胞的转染
将反转录载体pMyc-CMV-FLAG-SCF-IgG Fc-IRES-GFP通过FuGENETransfection Reagent(Roche Applied Science)或者Lipofectamine Plus(Invitrogen)进入逆转录病毒包装细胞Plat-A(Cell Biolabs)。在含有10％胎牛血清的DMEM培养基，37度，7％浓度二氧化碳中培养。48小时后收获含有反转录病毒细胞上清液。将含有反转录病毒细胞上清液与宿主细胞培养液混合并加入聚凝胺(Polybrene)使其浓度为4微克每毫升，此处使用CHO细胞，并使用ProCHO4，Lonza培养液。
4)宿主细胞的筛选
48小时后将收集宿主细胞并通过FACS ARIA细胞分析仪筛选，选择GFP表达最高的10％部分，即为稳定高效的目标蛋白质生产细胞株。
5)细胞培养过程
将生产细胞株在与步骤4相同培养基中培养。
6)目标蛋白质的分离与纯化
表达72小时后，以300g，5分钟离心(eppendorf 5810R)分离细胞与培养液。将Protein G Sepharose(Invitrogen)用1XPBS冲洗两次，并用1XPBS平衡，然后将混合液通过平衡后的Protein G Sepharose(GE Healthcare)柱，亲和层析分离纯化得到rSCF-IgG Fc-FLAG。
实施例2：
1)宿主细胞的选择：选择HEK细胞。
2)构建重组表达载体
以cDNA或者含有目标基因的质粒为模版，用引物
引物1：aac ctcgag atgaagaagacacaaacttg
引物2：aac caattg cacctcttgaaattctctc
经PCR法合成5’端带有XhoI，3’端带有MfeI酶切位点。克隆于pMyc-CMV-IgG1 Fc-FLAG-IRES-PuroR的XhoI和EcoRI酶切位点之间得到pMyc-CMV-SCF-IgG Fc-FLAG-IRES-PuroR的载体。CMV代表人巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子。
3)宿主细胞的转染
将反转录载体pMyc-CMV-FLAG-SCF-IgG Fc-IRES-PuroR通过电穿孔法进入逆转录病毒包装细胞Plat-A(Cell Biolabs).在含有10％胎牛血清的DMEM培养基，37度，7％浓度二氧化碳中培养。48小时后收获含有反转录病毒细胞上清液。将含有反转录病毒细胞上清液与宿主细胞培养液混合并加入聚凝胺(Polybrene)使其浓度为4微克每毫升，此处使用HEK细胞，并使用Pro293，Lonza培养液。
4)宿主细胞的筛选
24小时后在细胞培养基中加入1-3微克每毫升嘌罗霉素，培养3-7天后所得稳定细胞即为细胞株。
5)细胞培养过程
将生产细胞株在与步骤4相同培养基中培养。
6)目标蛋白质的分离与纯化
表达72小时后，以300g，5分钟离心(eppendorf 5810R)分离细胞与培养液。将Protein G Sepharose(Invitrogen)用1XPBS冲洗两次，并用1XPBS平衡，然后将混合液通过平衡后的Protein G Sepharose(GE Healthcare)柱，亲和层析分离纯化得到rSCF-IgG Fc-FLAG
实施例3：
1)宿主细胞的选择：选择SP20细胞。
2)构建重组表达载体
以cDNA或者含有目标基因的质粒为模版，用引物
引物1：aac ctcgag atgaagaagacacaaacttg
引物2：aac caattg cacctcttgaaattctctc
经PCR法合成5’端带有XhoI，3’端带有MfeI酶切位点。克隆于pMyc-CMV-IgG1Fc-FLAG的XhoI和EcoRI酶切位点之间得到pMyc-CMV-SCF-IgG Fc-FLAG的载体。CMV代表人巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子。
3)宿主细胞的转染
将反转录载体pMyc-CMV-FLAG-SCF-IgG Fc-FLAG与质粒pMyc-CMV-GFP按3∶1比例通过FuGENE Transfection Reagent(Roche AppliedScience)或者Lipofectamine Plus(Invitrogen)进入逆转录病毒包装细胞Plat-A(Cell Biolabs).在含有10％胎牛血清的DMEM培养基，37度，7％浓度二氧化碳中培养。48小时后收获含有反转录病毒细胞上清液。将含有反转录病毒细胞上清液与宿主细胞培养液混合并加入聚凝胺(Polybrene)使其浓度为4微克每毫升，此处使用SP20细胞，并使用含有2％胎牛血清的IMDM培养液。
4)宿主细胞的筛选
48小时后将收集宿主细胞并通过FACS ARIA细胞分析仪筛选，选择GFP表达最高的10％部分，即为稳定高效的目标蛋白质生产细胞株。
5)细胞培养过程
将生产细胞株在300g，5分钟相同培养基中培养。
6)目标蛋白质的分离与纯化
表达72小时后，以低速离心(eppendorf 5810R)分离细胞与培养液。将ProteinG Sepharose(Invitrogen)用1XPBS冲洗两次，并用1XPBS平衡，然后将混合液通过平衡后的Protein G Sepharose(GE Healthcare)柱，亲和层析分离纯化得到rSCF-IgG Fc-FLAG。
采用ABI 3730测序仪，对重组干细胞因子与免疫球融合蛋白基因进行测序，测序结果(见附图2)与设计完全一致。
在含有10％聚丙烯的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)中以80V电泳15分钟，之后以100V电压电泳60分钟，之后将凝胶使用考马斯蓝染色法染色，得到SDS-PAGE电泳图谱(见附图3)：
1.分子量标准蛋白质，指示不同条带的分子量；
2.融合蛋白双聚体，在不含有beta mercaptoethanol(β-巯基乙醇)情况下，融合蛋白正常结合，形成同源双聚体；
3.融合蛋白单体，在含有beta mercaptoethanol(β-巯基乙醇)情况下，融合蛋白中的双硫共价键被破坏，无法形成同源双聚体，观测到单体。
序列表
Claims (6)
1.一种重组干细胞因子与免疫球融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白，由两部分组成：干细胞因子部分和免疫球蛋白Fc段；
免疫球蛋白Fc段组成为免疫球蛋白G，E，D，M和A型的Fc段，及部分Fc段或者Fc段与Fab的融合体；
重组干细胞因子与免疫球蛋白Fc段融合蛋白核苷酸序列为：
Atgaagaagacacaaacttggattatcacttgcatttatcttcaactgctcctatttaatcctcttgt
caaaaccaaggagatctgcgggaatcctgtgactgataatgtaaaagacattacaaaactggtggcaa
atcttccaaatgactatatgataaccctcaactatgtcgccgggatggatgttttgcctagtcattgt
tggctacgagatatggtaatacaattatcactcagcttgactactcttctggacaagttctcaaatat
ttctgaaggcttgagtaattactccatcatagacaaacttgggaaaatagtggatgacctcgtgttat
gcatggaagaaaacgcaccgaagaatataaaagaatctccgaagaggccagaaactagatcctttact
cctgaagaattctttagtattttcaatcaattcaccatggcagagcccaaatcttctgacaaaactca
cacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaac
ccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaa
gaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcg
ggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctga
atggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc
aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaa
gaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggaga
gcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttc
ctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgat
gcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaggatccgccg
ccatcatggactacaaggacgacgacgacaagtag
下划线部分为干细胞因子部分
相应的氨基酸序列为：
Met Lys Lys Thr Gln Thr Trp Ile Ile Thr Cys Ile Tyr Leu Gln Leu Leu Leu Phe Asn
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Pro Leu Val Lys Thr Lys Glu Ile Cys Gly Asn Pro Val Thr Asp Asn Val Lys Asp Ile
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Asn Asp Tyr Met Ile Thr Leu Asn Tyr Val Ala Gly
41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Leu Arg Asp Met Val Ile Gln Leu Ser Leu Ser
61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
Leu Thr Thr Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile
81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
Ile Asp Lys Leu Gly Lys Ile Val Asp Asp Leu Val Leu Cys Met Glu Glu Asn Ala Pro
101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120
Lys Asn Ile Lys Glu Ser Pro Lys Arg Pro Glu Thr Arg Ser Phe Thr Pro Glu Glu Phe
121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140
Phe Ser Ile Phe Asn Gln Phe Thr Met Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380
Gly Lys Gly Ser Ala Ala Ile Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys ***
381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397。
2.根据权利要求1所述的重组干细胞因子与免疫球融合蛋白的制备方法，其步骤为：
1)宿主细胞的选择：选用原核类细胞，酵母类细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞作为宿主细胞；
2)构建重组表达载体：构建与步骤1)中所选用宿主细胞相对应的表达载体；
重组表达载体核心元件组成为：核心目标蛋白质基因，大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因，与步骤1)中所采用宿主细胞相对应的启动子和增强子元件，生物标签，免疫球蛋白Fc段，及选择标志；
其中，选择标志为抗生素抗性基因，二氢叶酸还原酶，荧光蛋白中的一种或任意两种以上的组合；
其中，生物标签安置在目标蛋白质的N端或者C端；免疫球蛋白Fc段安置在目标蛋白质的N端或者C端；
载体中元件顺序可随意组合，核心目标蛋白质基因数量为1个，2个，3个，4个或5个；
3)宿主细胞的转染：宿主细胞的转染方法为磷酸钙沉淀法，电穿孔法或以病毒为基础的转染方法；
4)宿主细胞的筛选：宿主细胞的筛选方法基于步骤2)中构建载体所含选择标志为基础进行确定；
当选择标志为抗生素抗性基因时，在与步骤1)所选用宿主细胞相对应的培养基中加入抗生素进行筛选；
当选择标志为二氢叶酸还原酶时，在与步骤1)所选用宿主细胞相对应的培养基中，所述培养基中不加入甘氨酸，次黄嘌呤，和胸苷成分进行筛选；
当选择标志为荧光蛋白时，利用荧光激活细胞分检进行筛选；
5)细胞培养过程：将生产细胞株在与步骤4)相同的培养基中培养；
6)目标蛋白质的分离与纯化：目标蛋白质的分离方法为亲和析层，尺寸排阻析层，离子交换层析中的一种或任意两种以上的组合。
3.根据权利要求2所述的重组干细胞因子与免疫球融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述的安置在目标蛋白质的N端或者C端的单种或多种生物标签为旗标签，组氨酸标签HIS，维生素H，链霉素，链霉素结合肽， Strep II，V5肽，S肽，myc肽，血凝素，蛋白质A，蛋白质G，蛋白质C，钙调蛋白，钙调蛋白结合肽，谷胱甘肽转移酶，麦芽糖结合蛋白中的一种或任意两种以上的组合。
4.根据权利要求3所述的重组干细胞因子与免疫球融合蛋白的制备方法，其特征在于：组氨酸标签HIS中，HIS为6到19个。
5.根据权利要求2所述的重组干细胞因子与免疫球融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤4)所述抗生素抗性基因为：氨必西林，稻瘟菌素，卡那霉素，新霉素，潮霉素，遗传霉素，博来霉素，甲氨蝶呤抗性基因中的一种或任意两种以上的组合。
6.根据权利要求2所述的重组干细胞因子与免疫球融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤4)所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白，红色荧光蛋白，黄色荧光蛋白中的一种或任意两种以上的组合。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102678754A CN102399292A (zh) | 2011-09-14 | 2011-09-14 | 重组干细胞因子与免疫球融合蛋白及其制备 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102678754A CN102399292A (zh) | 2011-09-14 | 2011-09-14 | 重组干细胞因子与免疫球融合蛋白及其制备 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102399292A true CN102399292A (zh) | 2012-04-04 |
Family
ID=45881992
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011102678754A Pending CN102399292A (zh) | 2011-09-14 | 2011-09-14 | 重组干细胞因子与免疫球融合蛋白及其制备 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102399292A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108495865A (zh) * | 2015-12-23 | 2018-09-04 | 美天旎生物技术有限公司 | 具有细胞因子受体激活或阻断结构域的嵌合抗原受体 |
| CN108779152A (zh) * | 2016-01-27 | 2018-11-09 | 建国大学校产学协力团 | 包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白的抗菌肽制造方法 |
| CN110818788A (zh) * | 2018-08-09 | 2020-02-21 | 苏州迈斯特细胞生物技术有限公司 | 一种高效提取干细胞因子的方法 |
| CN111549071A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-08-18 | 乾元康安(苏州)生物科技有限公司 | 生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070071714A1 (en) * | 1989-10-16 | 2007-03-29 | Amgen Inc. | Stem cell factor |
| WO2007098548A1 (en) * | 2006-03-01 | 2007-09-07 | Apollo Life Sciences Limited | A molecule and chimeric molecules thereof |
| CN101094688A (zh) * | 2004-09-13 | 2007-12-26 | 建新公司 | 多聚构建体 |
| WO2009015345A1 (en) * | 2007-07-25 | 2009-01-29 | Amgen Inc. | Pharmaceutical compositions comprising fc fusion proteins |
-
2011
- 2011-09-14 CN CN2011102678754A patent/CN102399292A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070071714A1 (en) * | 1989-10-16 | 2007-03-29 | Amgen Inc. | Stem cell factor |
| CN101094688A (zh) * | 2004-09-13 | 2007-12-26 | 建新公司 | 多聚构建体 |
| WO2007098548A1 (en) * | 2006-03-01 | 2007-09-07 | Apollo Life Sciences Limited | A molecule and chimeric molecules thereof |
| WO2009015345A1 (en) * | 2007-07-25 | 2009-01-29 | Amgen Inc. | Pharmaceutical compositions comprising fc fusion proteins |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 《CA号149:38545》 20071231 Leschinger, Christofer Generation of artificial matrix systems for hematopoietic stem cell purging: Inhibition of the in-vitro proliferation of leukemia cells using a stem cell factor-immunoglobulin-G1 fusion protein in combination with fibronectin and retronectin 全文 , * |
| LESCHINGER, CHRISTOFER: "Generation of artificial matrix systems for hematopoietic stem cell purging: Inhibition of the in-vitro proliferation of leukemia cells using a stem cell factor-immunoglobulin-G1 fusion protein in combination with fibronectin and retronectin", 《CA号149:38545》 * |
| ULRIKE ERBEN ET AL: "Differential Effects of a Stem Cell Factor-Immunoglobulin Fusion Protein on Malignant and Normal Hematopoietic Cells", 《CANCER RESEARCH》 * |
| 严飞 等: "一种新的双元表达质粒pCMV-Myc-IRES-EGFP 的构建及其表达", 《生物工程学报》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108495865A (zh) * | 2015-12-23 | 2018-09-04 | 美天旎生物技术有限公司 | 具有细胞因子受体激活或阻断结构域的嵌合抗原受体 |
| CN108495865B (zh) * | 2015-12-23 | 2022-08-02 | 美天施生物科技有限两合公司 | 具有细胞因子受体激活或阻断结构域的嵌合抗原受体 |
| US11512139B2 (en) | 2015-12-23 | 2022-11-29 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Chimeric antigen receptor with cytokine receptor activating or blocking domain |
| CN108779152A (zh) * | 2016-01-27 | 2018-11-09 | 建国大学校产学协力团 | 包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白的抗菌肽制造方法 |
| CN110818788A (zh) * | 2018-08-09 | 2020-02-21 | 苏州迈斯特细胞生物技术有限公司 | 一种高效提取干细胞因子的方法 |
| CN111549071A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-08-18 | 乾元康安(苏州)生物科技有限公司 | 生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wells | Hormone mimicry | |
| WO2018091003A1 (es) | Método para incrementar los niveles de secreción de la interleucina 2 y sus proteínas derivadas | |
| CN102399292A (zh) | 重组干细胞因子与免疫球融合蛋白及其制备 | |
| LV10973B (en) | A consensus leukocyte interferon and a gene encoding it | |
| CN107523588B (zh) | 一种四环素慢病毒诱导表达载体及其建立方法和应用 | |
| CN109136248A (zh) | 多靶点编辑载体及其构建方法和应用 | |
| CN103184202B (zh) | 一对短肽、蛋白质和多核苷酸、其宿主细胞及其应用 | |
| CN107760650A (zh) | 一种改造的cho细胞及其用途 | |
| CN101341252B (zh) | 啮齿动物细胞中的蛋白质表达 | |
| ES2711161T3 (es) | Selección de células que expresan polipéptidos heterómeros | |
| CN104844691B (zh) | Sox2蛋白肽适配子及其鉴定 | |
| Magistrelli et al. | Rapid, simple and high yield production of recombinant proteins in mammalian cells using a versatile episomal system | |
| CN104088019B (zh) | 一种基于双分子荧光互补技术的肽适配子文库构建方法 | |
| CN115850507B (zh) | 一种正交、双组份蛋白质自组装偶联体系及其构建方法 | |
| CN103103209B (zh) | 一种家蚕气味结合蛋白BmOBP2的表达纯化方法 | |
| CN108192905A (zh) | 一种表达盒、表达载体、宿主菌及制备无标签重组人il37成熟肽的方法 | |
| CN102993289B (zh) | 少棘蜈蚣多肽毒素kappa-SLPTX-Ssm4a及其基因和应用 | |
| CN113406320A (zh) | 基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法及应用 | |
| CN112679615B (zh) | 一种融合蛋白 | |
| CN102533721A (zh) | 一种通过渗透压突变提高重组蛋白瞬时表达的方法 | |
| CN102533722A (zh) | 一种通过温度突变提高哺乳动物细胞重组蛋白瞬时表达的方法 | |
| WO2021003413A2 (en) | Self-assembling circular tandem repeat proteins with increased stability | |
| CN111575314A (zh) | 尿激酶受体稳定突变体suPARcc在真核胞外蛋白表达中的应用 | |
| EP4282873A1 (en) | Method for screening dimerized cyclic peptides | |
| CN114457049B (zh) | 吡咯赖氨酰-tRNA合成酶突变体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120404 |