CN101094688A

CN101094688A - 多聚构建体

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Publication number: CN101094688A
Application number: CNA2005800386237A
Authority: CN
Inventors: A·斯卡里; P·佩汉; S·沃兹沃思
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2004-09-13
Filing date: 2005-09-13
Publication date: 2007-12-26
Anticipated expiration: 2025-09-13
Also published as: EP1804835A2; PT1804835E; ES2407859T3; US8658602B2; ATE470454T1; EP1804835B9; US9815892B2; MX2007002942A; EP1804835A4; DK1804835T3; US20180155417A1; PL2229956T3; HK1144663A1; US7928072B2; EP2229956B1; CN101094688B; IL216095A0; US20140193411A1; US20070224178A1; WO2006031689A2

Abstract

通过包涵体(inclusion)或连接体(linker)部分使Flt－1的Ig样结构域的多聚融合蛋白功能化。编码融合蛋白的载体和表达融合蛋白的宿主细胞可以治疗性地用于在患有与新血管形成有关的病理状况的个体内阻断新血管形成。这类病症包括年龄相关性黄斑变性、癌症、牛皮癣、增生性糖尿病视网膜病变、哮喘、葡萄膜炎、骨关节炎和类风湿性关节炎。用于Flt－1的Ig样结构域的相同多聚手段，即连接体和多聚结构域，可用于其他多肽，包括细胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子和生长因子。

Description

多聚构建体

技术领域

本发明涉及可用于治疗病理性新血管形成，例如哮喘、关节炎、癌症和黄斑变性的重组构建蛋白。

背景技术

病理性新血管形成是湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、增生性糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎、骨关节炎和哮喘之类疾病的关键因素。其还在肿瘤生长和扩散中起到重要作用。通过促血管新生和抗血管新生因子的精妙平衡调节新血管形成。

血管内皮生长因子(VEGF)已知对于新血管形成是必须的。在AMD、关节炎的动物模型中和在各种肿瘤模型中，VEGF活性的抑制已证明抑制了新血管形成。用于抑制VEGF活性的方法包括抗体、受体融合蛋白、肽和小分子。

VEGF-R1(Flt-1)和VEGF-R2(KDR)蛋白质已证明以高亲合力结合VEGF。Flt-1和KDR在其细胞外区域中均具有7个Ig样结构域。结构域2已经证明对于VEGF结合是必不可少的。全长可溶受体(结构域1-7)和结构域1-3各自与IgG Fc的融合有效地结合VEGF。但是，IgG Fc仅与Ig样结构域2融合不能结合VEGF，Ig样结构域1和2的组合也是如此。Davis-Smyth，1996。因此，对于有效的VEGF结合，除结构域2外，似乎还需要Ig样结构域1和3。

发明内容

根据本发明的一个实施方案，提供融合蛋白。融合蛋白具有式X-Y-Z。X包含选自细胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子或生长因子的多肽。Y基本由5-25氨基酸残基多肽构成。Z是IgG重链分子的CH3区。

本发明的另一实施方案是式X-Y-Z的多肽。X包含选自细胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子或生长因子的多肽。Y基本由提供5-25氨基酸残基的空间隔离(spatial separation)的连接体部分构成。Z是IgG重链分子的CH3区。

本发明的再一方面是式X-Y-Z的融合蛋白。X包含选自细胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子或生长因子的多肽。Y基本由5-25氨基酸残基多肽构成。Z是抗体分子的Fc部分。

还提供了式X-Y-Z的融合蛋白。X包含选自细胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子或生长因子的多肽。Y基本由提供5-25氨基酸残基的空间隔离的连接体部分构成。Z是抗体分子的Fc部分。

本发明的再一方面是使多肽X多聚的方法。多肽X通过多肽Y连接到多肽Z上以形成多肽XYZ。X包含选自细胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子或生长因子的多肽。Y基本由5-25氨基酸残基多肽构成。Z是IgG重链分子的CH3区。形成的多肽XYZ多聚(multimerizes)。

本发明的再一实施方案提供了使多肽X多聚的方法。多肽X通过Y部分连接到多肽Z上以形成聚合物XYZ。X包含选自细胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子和生长因子的多肽。Y基本由提供5-25氨基酸残基的空间隔离的连接体部分构成。Z是IgG重链分子的CH3区。如此形成的多肽XYZ多聚。

在本发明的一个实施方案中，提供了核酸分子。该核酸分子编码包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig样结构域2、连接体和多聚结构域的融合蛋白。该融合蛋白包含选自SEQ ID NO：2、8、21、23或25的序列。

在本发明的另一实施方案中，提供了融合蛋白。该融合蛋白包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig样结构域2、连接体和多聚结构域。该融合蛋白包含选自SEQ ID NO：2、8、21、23或25的序列。

在本发明的另一实施方案中，提供了体外方法。将核酸分子输送到分离的哺乳动物细胞中。该核酸分子编码包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig样结构域2、连接体或多聚结构域的融合蛋白。该融合蛋白包含选自SEQ ID NO：2、8、21、23或25的序列。通过启动子控制融合蛋白的表达。形成表达融合蛋白的细胞。

本发明的再一实施方案是将融合蛋白输送给哺乳动物的方法。将表达融合蛋白的哺乳动物细胞输送给哺乳动物。细胞表达并分泌融合蛋白，由此将融合蛋白供应给哺乳动物。该融合蛋白包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig样结构域2、连接体和多聚结构域。该融合蛋白包含选自SEQ ID NO：2、8、21、23或25的序列。

本发明的另一方面是向哺乳动物供应融合蛋白的方法。将包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig样结构域2、连接体和多聚结构域的融合蛋白输送给哺乳动物。该融合蛋白包含选自SEQ ID NO：2、8、21、23或25的序列。或者，可以将编码所述融合蛋白的核酸构建体输送给哺乳动物，由此使哺乳动物表达该融合蛋白。

下面更详细描述的本发明的这些和其他实施方案为本领域提供治疗与血管增生和炎症有关的疾病的方法和试剂。这些试剂提供了相对于蛋白质天然形式的稳定性和生物利用率。

附图说明

图1.D2-9Gly-Fc构建体中9-Gly连接体的柔韧(flexible)区域。通过Karpus和Schultz(1985)法所预测的相对柔韧性表明，与不含9-Gly连接体的D2-Fc构建体相比，D2-9Gly-Fc蛋白中的多聚甘氨酸9-mer(9-Gly)连接体(aa 94至103)是柔韧性高于平均水平(＞1)的区域。这两种融合蛋白均含有相同的封在框中的氨基酸序列：sp-信号肽(aa-24至-1)、Flt-1结构域2(aa1至93)和IgG1-Fc残基(244aa)。箭头代表使用SignalP V2.0程序(Nielsen等，1997)预测的信号肽酶裂解位点。

图2.D2-9Gly-Fc vs.D2-Fc的生物活性。293细胞在饥饿培养基(starvation media)(M199+5％FCS)中生长并在CMV启动子的控制下用含有D2-9Gly-Fc和D2-Fc表达盒的质粒转染。72小时后收集条件培养基(CM)。将HUVECs种入含有饥饿培养基+VEGF(10纳克/毫升)种96孔板(2E3细胞/孔)，并在24小时后加入50微升CM加VEGF(10纳克/毫升)。来自对照pEGFP(Clontech；pEGFP带有野生型绿色荧光蛋白(GFP)的红移变体，其经过最优化以获得更亮的荧光和在哺乳动物细胞中更高的表达)质粒转染的对照物(+/-VEGF)在CM中培养。阳性对照用50纳克Flt-1-IgG重组蛋白(R&D Systems)处理。使用CellTiter 96^AQ_ueous试剂(Promega)检测HUVECs在处理后3天的增殖。数据是各分三份检测的两个实验的OD₄₉₀平均值的平均数。

图3.D2-9Gly-Fc和D2-Fc的免疫印迹分析。D2-9Gly-Fc和D2-Fc蛋白的尺寸在非还原性凝胶中迁移时均为在还原性凝胶中迁移时的两倍大。蛋白质载自在表达D2-9Gly-Fc和D2-Fc质粒的293细胞转染后的条件培养基，通过SDS-电泳分离并转移到PVDF膜上。用山羊抗人抗-IgG1 Fc和兔抗山羊IgG-HRP抗体探测印迹。

图4.含有9Gly连接体和VEGF Ex3的sFlt-1杂交蛋白质。D2-9Gly-Ex3/CH3与之前构建的蛋白质的结构对比。所有三种蛋白质均含有Flt-1结构域2的相同氨基酸序列，由Flt-1信号肽的24aa和Flt-1结构域2的93aa构成。D2-9Gly-Ex3/CH3含有9Gly连接体的9aa、VEGFEx3的14aa和人IgG1重链Fc的CH3区的120aa。

图5.D2-9Gly-Ex3/CH3 vs.D2-9Gly-Fc的生物活性。蛋白质D2-9Gly-Ex3/CH3(其中结构域2通过9Gly连接体连接到CH3区和VEGF Ex3上)与对照蛋白D2-9Gly-Fc和D2-Fc相比，也有效抑制了VEGF依赖型HUVECs增殖。使用50纳克重组Flt-1-IgG(R&D Systems)作为对照物。

图6.比较D2-(Gly₄Ser)₃-Fc蛋白质活性与D2-9Gly-Fc和D2-9Gly-Ex3/CH3的HUVECs增殖检测。

图7.免疫印迹。来自用表达(1)：D2-9Gly-Fc；(2)：D2-(G₄S)₃-Fc和(3)-EGFP蛋白质的质粒转染293细胞的条件培养基(15微升CM)的蛋白质(未还原和还原)通过SDS-电泳分离并转移到PVDF膜上。用山羊抗人IgG1 Fc和兔抗山羊IgG-HRP抗体探测印迹。

图8.含/不含9Gly连接体或VEGF Ex3的蛋白质组合。三种含或不含9Gly连接体和/或VEGF Ex3、D2-9Gly-CH3、D2-CH3和D2-Ex3/CH3的新型蛋白质的结构比较。

图9.用带有9Gly、Ex3和CH3组合的Flt-1(D2)构建体进行的HUVECs增殖检测。将来自293细胞的含有蛋白质D2-Ex3/CH3、D2-9Gly-CH3和D2-CH3的条件培养基(5微升)与D2-9Gly-Fc和D2-9Gly-Ex3/CH3进行比较。

图10.免疫印迹。用表达(1)：D2-9Gly-Fc；(2)：D2-9Gly-CH3(52/26 kDa)和(3)D2-CH3(50/25 kDa)的质粒转染293细胞。将来自293细胞条件培养基(15微升CM，未还原和/或还原)的蛋白质通过SDS-电泳分离并转移到PVDF膜上。用抗-人VEGF-R1 HRP结合物(conjugate)(R&D Systems)探测印迹。

图11.VEGF“体外”结合检测。将含有已知浓度的D2-9Gly-Fc和Flt-1 D(1-3)对照可溶受体(浓度为0.29-150pM)的来自293细胞的条件培养基连续稀释并用10pM VEGF混合。然后通过ELISA测量未结合的VEGF的量。D2-9Gly-Fc以比所有其他构建体高的亲合力结合VEGF。“n”代表独立实验(转染和结合检测)的数量。

图12.用BIAcore仪器通过表面等离子体共振测量可溶Flt-1构建体的结合动力。将sFlt-1构建体固定到传感器芯片上，并以0.2至1.5nM的浓度注射VEGF165。使用BIA Evaluation程序评测sensorgrams，测定速率常数Ka和Kd，并由Kd/Ka＝KD的比率计算离解常数(KD)。越低的KD值意味着越好的亲合力。

图13A-13C.图13A显示含有各种连接体的Flt-1构建体的表达水平。图13B显示了含有各种连接体和IgG1的Fc的CH3部分的Flt-1构建体的二聚或多聚。未还原和还原条件之间的差异表明，蛋白质已经多聚。图13C显示了在存在VEGF的HUVEC增殖检测中在条件培养基中存在的所示Flt-1构建体的抑制生物活性。每一构建体均表现出与HUVEC在不存在VEGF情况下的增殖水平接近的抑制活性。

图14.使用视网膜血管新生(NV)的氧诱导视网膜病变(OIR)鼠科模型，对鼠眼施加Flt-1构建体之一，并测定新血管形成。使鼠暴露在含氧量高的条件下。测定处理过的眼中的新生血管事件数，与相同动物的未处理过的眼中的事件数进行比较。如果新生血管事件数降低了50％以上，该动物就被视为“反应者”。

具体实施方式

本发明人发现，Flt-1Ig样结构域2在没有结构域1和3的情况下能够有效结合VEGF并抑制VEGF依赖型内皮细胞增殖。结构域2可以通过连接体共价连接到多聚结构域上。连接体通常是多肽链。链长可以为6、7、9、11、13、15个或更多氨基酸残基，但通常为5至25个残基。根据长度和侧链组成，连接体可以但不需要具有大于平均水平的柔韧性。柔韧性可以使用本领域已知的运算法计算。多聚结构域是多聚蛋白质的促进亚单位结合形成例如二聚体、三聚体、四聚体等等的那些部分。适用于有效结合VEGF和/或抑制VEGF依赖型内皮细胞增殖的重组蛋白选自SEQ ID NO：2、8、21、23或25。

此外，本发明人已经发现，多聚结构域和连接体可以与各种其他蛋白质或蛋白质部分一起使用以引发多聚。这类蛋白质可以是仅在多聚时结合到配体或受体上的蛋白质，或可以是在多聚时提高其结合亲合力的蛋白质。适合多聚的蛋白质包括细胞外受体(包括其部分)、抗体可变区、细胞因子、趋化因子和生长因子。适合的蛋白质包括酪氨酸激酶受体和丝氨酸苏氨酸激酶受体。细胞外受体的具体例子包括EGF-受体、G蛋白偶联受体、FGF受体、Fc受体、T细胞受体等。抗体可变区的例子包括Fab、F(ab’)₂和ScFv。细胞因子的例子包括GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、IL-23、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNFα和TNF-β。趋化因子的例子包括BCA-1/BLC、BRAK、趋化因子CC-2、CTACK、CXCL-16、ELC、ENA、ENA-70、ENA-74、ENA-78、Eotaxin、Exodus-2、Fractalkine、GCP-2、GRO、GROα(MGSA)、GRO-β、GRO-γ、HCC-1、HCC-4、I-309、IP-10、I-TAC、LAG-1、LD78-β、LEC/NCC-4、LL-37、淋巴细胞趋化因子(Lymphotactin)、MCP、MCAF(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC、MDC、MDC-2、MDC-4、MEC/CCL28、MIG、MIP、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1δ、MIP-3/MPIF-1、MIP-3α、MIP-3 bet、MIP-4(PARC)、MIP-5、NAP-2、PARC、PF-4、RANTES、RANTES-2、SDF-1α、SDF-1β、TARC和TECK。生长因子的例子包括人双调蛋白、人血管生成蛋白、人ACE、人血管生成素(Angiogenin)、人促血管生成素(Angiopoietin)、人血管抑制素(angiostatin)、人β细胞素(betacellulin)、人BMP、人BMP-13/CDMP-2、人BMP-14/CDMP-1、人BMP-2、人BMP-3、人BMP-4、人BMP-5、人BMP-6、人BMP-7、人BMP-8、人BMP-9、人集落刺激因子、人flt-3-配体、人G-CSF、人GM-CSF、人M-CSF、人结缔组织生长因子、人cripto-1、人cryptic、人ECGF、人EGF、人EG-VEGF、人促红细胞生成素、人胎球蛋白、人FGF、人FGF-1、人FGF-10、人FGF-16、人FGF-17、人FGF-18、人FGF-19、人FGF-2、人FGF-20、人FGF-3、人FGF-4、人FGF-5、人FGF-6、人FGF-7/KGF、人FGF-8、人FGF-9、人酸性FGF(acidic)、人碱性FGF(basic)、人GDF-11、人GDF-15、人生长激素释放因子、人HB-EGF、人Heregulin、人HGF、人IGF、人IGF-I、人IGF-II、人抑制素、人KGF、人LCGF、人LIF、人混合生长因子(Miscellaneous Growth Factors)、人MSP、人肌肉生长抑制素(Myostatin)、人肌肉生长抑制素前肽、人神经生长因子、人制瘤素M、人PD-ECGF、人PDGF、人PDGF(AA同型二聚体)、人PDGF(AB异型二聚体)、人PDGF(BB同型二聚体)、人PDGF(CC同型二聚体)、人PIGF、人PIGF、人PIGF-1、人PIGF-2、人SCF、人SMDF、人干细胞生长因子、人SCGF-α、人SCGF-β、人血小板生成素、人转化生长因子、人TGF-α、人TGF-β和人VEGF。

Flt-1受体蛋白具有包含7个Ig样结构域的细胞外部分。这些位于Genbank接受号(accession no.)P17948的残基号32...123、151...214、230...327、335...421、428...553、556...654和661...747，也参见SEQ IDNO：15。残基号1-26包含信号序列。用Genbank接受号NM_002019(SEQ ID NO：14)所示的DNA序列编码Flt-1蛋白。

可以如本领域已知的那样使用多聚结构域。可以使用IgG1或IgG2λ重链的Fc部分的序列，例如单独使用CH3(aa 371-477)或一起使用CH2和CH3域(aa247-477)。Ig分子的Fc部分是通过用木瓜蛋白酶裂解整个抗体分子而得的。可以使用其他方式获得这些部分。对于IgG1λ重链蛋白质序列，参见Genbank accession no Y14737和SEQ ID NO：10。可以使用例如来自其他IgG类型和来自IgA、IgM、IgD或IgE抗体的其他Fc区域。也可以使用VEGF的多聚区域。编码VEGF的DNA序列显示在Genbank接受号NM_003376和SEQ ID NO：11中。VEGF的氨基酸序列显示在Genbank接受号CAC19513和SEQ ID NO：12中。VEGF外显子3(VEGF Ex3)编码的VEGF的多聚区域(SEQ ID NO：13)大致位于VEGF蛋白质的氨基酸残基75-88处(SEQ ID NO：12)。多聚结构域会导致至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％或95％的单体融合蛋白在非变性聚丙烯酰胺凝胶上以适合多聚体的速率迁移。糖基化可以影响蛋白质在凝胶中的迁移。尽管在此列出了特定序列，但也可以使用等位变体之类的变体。通常，这些变体与所公开的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。

如本文所示，可以例如使用还原和非还原性凝胶检验多聚。还可以通过检测蛋白质对其配体/受体提高的结合亲合力来检验多聚。在这方面可以使用BiaCore^TM表面等离子体共振检验。这些检验法通过测量接近传感器芯片表面的水层中折射率的变化来检测质量变化。可以使用本领域已知的任何方法来检测多聚。

本发明的连接体部分可以包含例如5-100氨基酸残基、5-75氨基酸残基、5-50氨基酸残基、5-25氨基酸残基、5-20氨基酸残基、5-15氨基酸残基、5-10氨基酸残基、5-9氨基酸残基。可用连接体的例子包括：gly₉(SEQ ID NO：27)、glu₉(SEQ ID NO：28)、ser₉(SEQ ID NO：29)、gly₅cyspro₂cys(SEQ ID NO：30)、(gly₄ser)₃(SEQ ID NO：31)、SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：32)、Pro SerCys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn(SEQ ID NO：13)、GlyAsp Leu Ile Tyr Arg Asn Gln Lys(SEQ ID NO：26)和Gly₉ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：34)。可用的其他多肽连接体包括不同长度，包括5、7或30个残基的多聚甘氨酸。此外，可以使用Flt-1的其他部分作为连接体，例如Flt-1的结构域3。参见SEQ ID NO：15。连接体部分还可以由其他聚合物，例如聚乙二醇制成。这类连接体可以具有10至1000、10-500、10-250、10-100或10-50个乙二醇单体单元。合适的聚合物应该具有与被适当范围的氨基酸残基占据的尺寸类似的尺寸。典型大小的聚合物提供大约10-25埃的间隔。

本发明的融合蛋白可以通过本领域已知的任何方法制造。尽管这些蛋白质可以合成，或通过连接制成的部分制造，也可以使用重组制造。融合基因序列可以使用重组DNA的标准工具制造。融合基因序列可以被插入载体，例如病毒或质粒载体，以复制融合基因序列。可以在融合基因序列的上游引入在最终受体细胞中有作用的启动子序列。所用启动子可以是组成型的(constitutive)、可诱导的或可抑制的。每一类型的例子是本领域中公知的。载体可以通过本领域已知的任何方式引入宿主细胞或哺乳动物。可用的合适的载体包括腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒、慢病毒或质粒。如果载体在病毒载体中且载体已经包装(packaged)，则可以使用病毒粒子传染细胞。如果使用裸DNA，则可以使用适合特定宿主细胞的转染或转化程序。采用聚合物、脂质体或纳米球(nanospheres)的裸DNA制剂可用于融合基因输送。可以用本发明的重组构建体转化或转染的细胞可以是对技术人员而言方便的任何细胞。可用的示例性细胞类型包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。在哺乳动物细胞中，可以视方便选择许多组织类型的细胞。可用的示例性细胞是成纤维细胞、肝细胞、内皮细胞、干细胞、造血细胞、上皮细胞、肌细胞、神经元细胞和角质形成细胞。这些细胞可用于在体外制造蛋白质，或可以输送给包括人类在内的哺乳动物以在体内制造编码蛋白。这种输送手段是向哺乳动物输送核酸、向哺乳动物输送病毒载体和向哺乳动物输送融合蛋白的替代形式。

蛋白质或核酸的组合物可以在载体中，例如缓冲剂、水性或亲脂载体、消毒或未消毒、热源(pyrogenic)或未热源载体。未热源载体可用于可注射配方。配方可以是液体或固体，例如冻干的。配方还可以以气溶胶形式施用。组合物可以包含一种或多种融合蛋白或一种或多种核酸，或即包含融合蛋白又包含核酸。组合物中的融合蛋白和/或核酸可以是同源的，在这种情况下会形成同源多聚体(homomultimer)蛋白质，或它们在组合物中是异源的，在这种情况下会形成异源多聚体(heteromultimer)蛋白质。在异源多聚体的情况下，融合蛋白之间的X部分不同，但融合蛋白之间的Z部分相同。

可以通过本领域已知的任何方式向细胞或哺乳动物宿主提供融合蛋白。可以将蛋白质输送(delivered)到细胞或宿主中，可以将核酸施用(administered)到细胞或宿主上。可以将转化或转染细胞施用到细胞或宿主上。在后一种情况下，需要相同遗传背景的细胞以降低移植排异。

适用于输送给哺乳动物宿主动物的细胞包括来自任何器官、肿瘤或细胞系的任何哺乳动物细胞类型。例如，可以使用人、鼠、山羊、绵羊、牛、狗、猫和猪的细胞。适用的细胞类型包括，但不限于，成纤维细胞、肝细胞、内皮细胞、角质形成细胞、造血细胞、上皮细胞、肌细胞、神经元细胞和干细胞。

融合蛋白或编码融合蛋白的核酸的输送方式包括表达融合蛋白的细胞的输送、融合蛋白的输送、和编码融合蛋白的核酸的输送。融合蛋白、细胞或核酸可以通过例如注射、导管插入或内窥镜检查直接输送给所需器官或肿瘤。它们也可以静脉内、支气管内、肿瘤内(intra-tumorally)、鞘内、肌肉内、眼内、局部、皮下、透皮或经口输送。可获得有效治疗的患者包括患有湿性年龄相关性黄斑变性、增生性糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎、骨关节炎、葡萄膜炎、哮喘和癌症的患者。治疗会改善症状和/或疾病标记和/或疾病严重性。

核酸可以在任何所需载体中输送给哺乳动物，特别是人类。这些包括病毒的或非病毒的载体，包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体和质粒载体。病毒的示例性类型包括HSV(单纯疱疹病毒)、腺病毒、AAV(腺相关病毒)、HIV(人类免疫缺陷性病毒)、BIV(牛免疫缺陷性病毒)和MLV(鼠白血病病毒)。核酸可以以提供足够有效的输送水平的任何所需形式施用，包括在病毒粒子中、在脂质体中、在纳米粒子中和络合到聚合物上。

可以结合使用蛋白质、核酸联合治疗。例如，可以向患者施用本发明的融合蛋白。如果观察到有利的响应，就可以施用编码融合蛋白的核酸分子以获得长期作用。或者，可以同时或几乎同时施用蛋白质和核酸。在另一选择中，可以在施用对配体的抗体或融合蛋白之后或相伴地，施用对受体的抗体或融合配偶体(partner)。

另一选择是使用核酸组合(combination)，其中一种核酸编码抗体，另一种编码融合蛋白。可以与本发明的Flt-1构建体(无论是蛋白质还是核酸形式)结合使用的一些抗体是贝伐单抗(bevacizumab)和ranibizumab，两者均针对VEGF。这些分别特别可用于治疗癌症和黄斑变性。

除非另行说明，本发明的实践使用在本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的传统技术。在文献中充分解释了这类技术，例如，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Second Edition(Sambrook等，1989)；CurrentProtocols In Molecular Biology(F.M.Ausubel等，eds.，1987)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait.，ed.，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.，1987)；Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook Of Experimental Immunology(D.M.Wei&C.C.Blackwell，eds.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.M.Miller&M.P.Calos，eds.，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction(Mullis等，eds.，1994)；Current Protocols In Immunology(J.E.Coligan等，eds.，1991)；Antibodies：A Laboratory Manual(E.Harlow与D.Lane，eds.(1988))；和PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor eds.(1995))。

基因输送载体是可以将插入的多聚核苷酸带入宿主细胞的任何分子。基因输送载体的例子是脂质体、生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人造病毒外壳(artificial viral envelopes)；金属粒子和细菌、病毒，例如杆状病毒、腺病毒和反转录病毒，噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和本领域通常使用的其它重组载体，它们已经被描述成用于在各种真核和原核宿主中表达，并可用于基因治疗以及用于简单蛋白质表达。

本文所用的基因输送、基因转移之类的术语是指将外源多聚核苷酸(有时称作“转基因(transgene)”)引入宿主细胞，不管引入方法如何。这类方法包括各种公知技术，例如载体介导基因转移(通过，例如，病毒感染/转染，或各种其他基于蛋白质或基于脂质的基因输送复合物)以及促进“裸”多聚核苷酸输送的技术(例如电穿孔、“基因枪”输送和用于引入多聚核苷酸的各种其他技术)。引入的多聚核苷酸可以稳定地或短暂地保持在宿主细胞中。稳定保持通常要求引入的多聚核苷酸含有与宿主细胞相容的复制原点或整合到宿主细胞的复制子中，例如染色体外复制子(例如质粒)或核的或线粒体的染色体中。如本领域已知和本文所述的那样，许多载体已知能够介导基因转移到哺乳动物细胞中。

将外源多聚核苷酸插入载体，例如腺病毒、部分缺失的腺病毒、完全缺失的腺病毒、腺相关病毒(AAV)、反转录病毒、慢病毒、裸质粒、质粒/脂质体复合物等等，以经静脉内、肌肉内、门静脉(intraportal)内或其它施用途径输送给宿主。在本发明的方法和组合物中可用的表达载体包括，例如，病毒载体。最常用的基因治疗施用方法之一(体内和体外)，是使用用于基因输送的病毒载体。许多类型的病毒是已知的，且许多已经研究用于基因治疗用途。最常用的病毒载体包括衍生自腺病毒、腺相关病毒(AAV)和反转录病毒，包括慢病毒，例如人类免疫缺陷性病毒(HIV)的那些。

腺病毒是具有大约36kb基因组的未包膜(non-enveloped)的核DNA病毒，其已经通过在经典遗传学和分子生物学中的研究来充分表征(Hurwitz，M.S.，Adenoviruses Virology，3^rd edition，Fields等，eds.，Raven Press，New York，1996；Hitt，M.M.等，Adenovirus Vectors，TheDevelopment of Human Gene Therapy，Friedman，T. ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York 1999)。将病毒基因分类成早期(名为E1-E4)和晚期(名为L1-L5)转录单元，这是指病毒蛋白的两个时间段(temporal classes)分类的产生。这些事件的分界线是病毒DNA复制。根据包括血红细胞的凝集、致瘤性、DNA和蛋白质氨基酸组成和同源性、和抗原关系在内的性质，将人类腺病毒被划分成许多血清型(大约47，相应地编号并分成6类：A、B、C、D、E和F)。

重组腺病毒载体对于用作基因输送载体具有一些优点，包括对分裂和未分裂细胞的向性、最小致病可能、复制至高滴定度以制备载体原料的能力，和携带大插入物的能力(Berkner，K.L.，Curr.Top.Micro.Immunol.158：39-66，1992；Jolly，D.，Cancer Gene Therapy 1：51-641994)。具有各种腺病毒基因序列缺失的腺病毒载体，例如假腺病毒(pseudoadenoviral)载体(PAVs)和部分缺失的腺病毒(被称作“DeAd”)经过设计以利用腺病毒的合意特征，这使其成为适用于将核酸输送给受体细胞的载体。

特别地，也被称作“空壳腺病毒(gutless adenovirus)”或“微小腺病毒(mini-adenoviral)”载体的假腺病毒载体(PAVs)，是由含有载体基因组的复制和包装(packaging)所需的最小顺式作用核苷酸序列和可以含有一个或多个转基因的腺病毒基因组衍生成的腺病毒载体(参见，美国专利5,882,877，其涵盖假腺病毒载体(PAV)和制造PAV的方法，作为参考并入本文)。PAVs经过设计以利用腺病毒的合意特征，这使其成为适用于基因输送的载体。尽管腺病毒载体通常可以通过删除对病毒生长而言不必要的区域而带有最多8kb大小的插入物，但可以使用含有多数病毒编码序列包括PAVs的缺失的腺病毒载体，实现最大承载能力。参见Gregory等人的美国专利5,882,877；Kochanek等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：5731-5736，1996；Parks等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：13565-13570，1996；Lieber等人，J.Virol.70：8944-8960，1996；Fisher等人，Virology 217：11-22，1996；美国专利5,670,488；1996年10月24日公开的PCT申请公开WO96/33280；1996年12月19日公开的PCT申请公开WO96/40955；1997年7月19日公开的PCT申请公开WO97/25446；1995年11月9日公开的PCT申请公开WO95/29993；1997年1月3日公开的PCT申请公开WO97/00326；Morral等人，Hum.Gene Ther.10：2709-2716，1998。可以容纳最多大约36kb外来核酸的这种PAVs是有利的，因为载体的承载能力最优化，同时降低宿主对载体的免疫响应可能或有复制能力的(replication-competent)病毒的生成。PAV载体含有5’反向末端重复(ITR)和含有复制原点的3’ITR核苷酸序列，和PAV基因组的包装所需的顺式作用核苷酸序列，并可以容纳一个或多个带有适当的调节元件(例如启动子、增强子等等)的转基因。

其他部分缺失的腺病毒载体提供了部分缺失的腺病毒(被称作“DeAd”)载体——其中从载体中删除病毒复制所需的大部分腺病毒早期基因并在条件启动子的控制下置于生产(producer)细胞染色体内。置于生产细胞中的可删除腺病毒基因可以包括E1A/E1B、E2、E4(仅需要将ORF6和ORF6/7置入细胞中)、pIX和pIVa2。也可以从载体中删除E3，但因为这对于载体制造不是必须的，这可以从生产细胞中省略。腺病毒晚期基因，通常在主要晚期启动子(MLP)的控制下，存在于载体中，但MLP可以被条件启动子取代。

适合用在DeAd载体和生产细胞系中的条件启动子包括具有下列特征的那些：在未诱导状态下的低基本表达，从而不以对细胞有害的程度表达细胞毒性或细胞抑制性腺病毒基因；在诱导状态下的高水平表达，从而制造足够量的病毒蛋白以支持载体复制和装配。适用在DeAd载体和生产细胞系中的优选条件启动子包括以免疫抑制剂FK506和雷帕霉素为基础的二聚体基因控制体系，蜕皮激素基因控制体系和四环素基因控制系统。同样可用于本发明的是在Abruzzese等人，Hum.Gene Ther.1999 10：1499-507中描述的GeneSwitch^TM技术(Valentis，Inc.，Woodlands，TX)，其公开的内容作为参考并入本文。在WO99/57296中进一步描述了部分缺失的腺病毒表达系统，其公开的内容作为参考并入本文。

腺相关病毒(AAV)是基因组大小为4.6kb的单链人类DNA细小病毒。AAV基因组含有两种主要基因：编码rep蛋白质(Rep76、Rep68、Rep52和Rep40)的rep基因，和编码AAV复制、恢复(rescue)、转录和整合(integration)的cap基因，同时cap蛋白质形成AAV病毒粒子。AAV的名字源自其对腺病毒或其他辅助病毒(例如疱疹病毒)的依赖性以供应允许AAV经历生产性感染(即在宿主细胞中自我复制)的必需基因产品。在不存在辅助病毒时，AAV作为前病毒整合到宿主细胞的染色体中，直至通过辅助病毒(通常腺病毒)对宿主细胞的重复感染将其恢复(rescue)(Muzyczka，Curr.Top.Micor.Immunol.158：97-127，1992)。

AVV作为基因转移载体的重要性来自其生物学的一些独特特征。在AAV基因组的两个末端均有被称作反向末端重复(ITR)的核苷酸序列，其含有病毒复制、恢复、包装和整合所需的顺式作用核苷酸序列。反式下的rep蛋白质介导的ITR整合作用能够使AAV基因组在不存在辅助病毒的情况下整合到感染后的细胞染色体中。病毒的这种独特性质与AVV在基因转移中的使用有关，因为其允许含有相关基因的重组AAV整合到细胞染色体中。因此，可以使用rAAV载体实现对基因转移的许多目标而言理想的稳定基因转化。此外，AAV用的整合位点是非常确定的并定位于人类的染色体19(Kotin等，Proc.Natl.Acad.Sci.87：2211-2215，1990)。整合位点的这种可预测性降低了任意插入细胞基因组中的危险，这可能激活或钝化宿主基因或打断编码序列，结果可能限制了载体的应用——其中AVV的整合、在rAAV载体设计中这种基因的去除可能导致使用rAAV载体已经观察到的改变的整合模式(Ponnazhagan等人，Hum Gene Ther.8：275-284，1997)。

使用AAV进行基因转移具有其他优点。AAV的宿主范围很宽。此外，与逆转录病毒不同，AAV可以感染休眠和分裂细胞。此外，AAV尚未与人类疾病联系在一起，这消除了使用逆转录病毒衍生基因转移载体引起的许多顾虑。

重组rAAV载体生成的标准方法要求一系列细胞内事件的配合：用含有在侧面与AAV ITR序列相接的所需转基因的rAAV载体基因组转染宿主细胞，通过编码反向(in trans)所需的AAV rep和cap蛋白质基因的质粒转染宿主细胞，和用辅助病毒感染转染细胞以提供intrans所需的非AAV辅助功能(Muzyczka，N.，Curr.Top.Micor.Immunol.158：97-129，1992)。腺病毒(或其他辅助病毒)蛋白质激活AAV rep基因的转录，而rep蛋白质随后激活AAV cap基因的转录。Cap蛋白质随后利用ITR序列将rAAV基因组包入rAAV病毒粒子。因此，足量结构蛋白质的可得性以及rAAV载体基因组所需的任何顺式作用包装(packaging)序列的可达性(accessibility)部分决定包装效率。

逆转录病毒载体是基因输送的常用工具(Miller，Nature(1992)357：455-460)。逆转录病毒载体将非重新排列的单副本基因输送到多种啮齿动物、灵长动物和人类体细胞中的能力使逆转录病毒载体非常适合将基因转移到细胞中。

逆转录病毒是RNA病毒，其中病毒基因组是RNA。当用逆转录病毒感染宿主细胞时，将基因组RNA逆转录为非常有效地整合到受感染细胞的染色体DNA中的DNA中间体。这种整合的DNA中间体被称作前病毒。前病毒的转录和装配为传染性病毒，在存在适当辅助病毒的情况下或在含有能够在不同时产生污染辅助病毒的情况下实现壳体化的适当序列的细胞系中发生。如果通过与适当载体的共转染提供用于壳体化的序列，重组逆转录病毒的制造就不需要辅助病毒。

逆转录病毒基因组和前病毒DNA具有三种基因：gag、pol和env，其两侧是两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核壳体)蛋白；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)，env基因编码病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTRs用以促进病毒粒子RNAs的转录和多聚腺苷酸化。LTR含有病毒复制所需的所有其他顺式作用序列。慢病毒具有附加的基因，包括vit vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-1、HIV-2和/或SIV中)。与5’LTR相邻的是基因组的逆转录(tRNA引物结合位点)和病毒RNA有效壳体化到粒子中(Psi位点)所必须的序列。如果壳体化(或逆转录病毒RNA包装到传染性病毒粒子中)所必须的序列从病毒基因组中丢失，结果是防止基因组RNA壳体化的顺式缺陷。但是，所得突变体仍然能够指导所有varion蛋白质的合成。

慢病毒(lentiviruses)是复合逆转录病毒，其除了普通逆转录病毒基因gag、pol和env外还含有具有调节或结构功能的其他基因。在潜伏性感染过程中那样，较高的复杂性能够使慢病毒调节其生存周期。典型的慢病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)，AIDS的病原体。在体内，HIV可以感染极少分裂的末端分化细胞，例如淋巴细胞和巨噬细胞。在体外，HIV可以感染单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)以及通过用aphidicolin或γ辐射处理而停滞在细胞周期中的HeLa-Cd4或T淋巴样细胞的原代培养。细胞的感染取决于HIV整合前复合物通过目标细胞的核孔的活性核输入。这通过复合物中的多个部分冗余的分子决定子与目标细胞的核输入系统的相互作用产生。识别出的决定子包括gag基质(MA)蛋白质中的功能性核定位信号(NLS)、亲核(karyophilic)病毒粒子相关蛋白、vpr和gag MA蛋白质中的C-末端磷酸酪氨酸残基。例如，在美国专利6,013,516和美国专利5,994,136中描述了使用反转录病毒进行基因治疗，其公开的内容作为参考并入本文。

向细胞输送DNA的其他方法不使用病毒进行输送。例如，可以使用阳离子两亲化合物输送本发明的核酸。因为用于促进生物活性分子的细胞内输送的化合物必须与非极性和极性环境相互作用(在例如质膜、组织液、细胞内的隔室和生物活性分子本身之中或之上)，这类化合物通常被设计成含有极性和非极性结构域。含有这两种结构域的化合物可以被称作两亲物，且已经被公开用于促进这种细胞内输送的许多脂质和合成脂质(无论是用于体外还是体内用途)符合这一定义。这些两亲物的一个特别重要的类型是阳离子型两亲物。一般而言，阳离子型两亲物具有能够在生理pH值下带正电荷的极性基团，这种性质在本领域中被认为在确定两亲物与许多类型的生物活性(治疗性)分子(包括，例如，带负电荷的多聚核苷酸，例如DNA)如何相互作用时是重要的。

在例如美国专利5,049,386；US 5,279,833；US 5,650,096；US5,747,471；US 5,767,099；US 5,910,487；US 5,719,131；US 5,840,710；US 5,783,565；US 5,925,628；US 5,912,239；US 5,942,634；US 5,948,925；US 6,022,874；US 5,994,317；US 5,861,397；US 5,952,916；US 5,948,767；US 5,939,401和US 5,935,936中描述了使用含有阳离子两亲化合物的组合物进行基因输送，其公开的内容作为参考并入本文。

此外，本发明的核酸可以使用“裸DNA”输送。美国专利5,580,859；US 5,963,622；US 5,910,488描述了在不与转染促进蛋白质、病毒粒子、脂质体制剂、带电脂质和磷酸钙沉淀剂结合的情况下，输送编码所需多肽或可连接到启动子上的肽的非传染性、非整合的DNA序列的方法；其公开的内容作为参考并入本文。

还报道了结合病毒和非病毒成分的基因转移系统。Cristiano等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11548；Wu等人，(1994)J.Biol.Chem.269：11542；Wagner等人，(1992)Proc.Natl. Acad.Sci.USA89：6099；Yoshimura等人，(1993)J.Biol.Chem.268：2300；Curiel等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8850；Kupfer等人，(1994)HumanGene Ther.5：1437和Gottschalk等人，(1994)Gene Ther.1：185。在多数情况下，将腺病毒并入基因输送系统以利用其溶内体(endosomolytic)性质。所报道的病毒和非病毒成分的组合通常涉及腺病毒共价连接到基因输送复合物上或未结合的腺病毒与阳离子型脂质：DNA复合物的共同内在化(co-internalization)。

为了向眼输送DNA和蛋白质，施用通常是局部的。这具有限制需要施用的DNA量和限制全身副作用的优点。可以使用许多可能的输送方式，包括但不限于：通过基因枪在角膜上局部施用；结膜下注射、前眼房(intracameral)注射、经眼滴到角膜上、通过termporal缘(limbus)注入前房、基质内注射、与电脉冲、角膜内(intracorneal)注射、视网膜下注射、玻璃体内注射和眼内注射结合的角膜应用。或者，细胞可以离体转染或转导并通过眼内植入输送。参见，Auricchio，Mol.Ther.6：490-494，2002；Bennett，Nature Med.2：649-654，1996；Borras，Experimental Eye Research 76：643-652，2003；Chaum，Survey ofOphthalmology 47：449-469，2002；Campochiaro，Expert Opinions inBiological Therapy 2：537-544(2002)；Lai，Gene Therapy 9：804-813，2002；Pleyer，Progress in Retinal and Eye Research，22：277-293，2003。

可以以适用于特定疾病的动物模型测试各种提出的治疗剂和施用方式的效果。例如，可以如Smith，Investigative Ophthalmology & VisualScience，35：101-111，1994中所述，在鼠中的氧诱导视网膜病模型中测试早产儿视网膜病变。可以使用鼠中的激光诱导的脉络膜新生血管作为模型，用于在例如与年龄相关性黄斑变性的疾病中发生人类脉络膜新生血管(CNV)。Tobe，American Journal of Pathology 153：1641-1646，1998。已经在灵长动物、大鼠、小种猪和兔子中开发出其他CNV模型。已经在基因缺陷鼠中开发出年龄相关性黄斑变性的鼠模型。缺乏单核细胞趋化蛋白(chemoattractant)蛋白-1或C-C趋化因子受体-2的鼠发展出年龄相关性黄斑变性的特征。Ambati，Nature Med.9：1390-1397，2003。

尽管已经参照具体实施例，包括本发明目前优选的实施方式描述了本发明，但本领域技术人员会认识到，可以在如所述权利要求中所列的本发明的精神和范围内对上述系统和技术进行许多变动和重排。

实施例

实施例1

生成两种构建体：第一种，含有多聚甘氨酸9-mer(9Gly)连接体的D2-9Gly-Fc，第二种，除9Gly连接体外具有相同序列的D2-Fc(图1)。

我们使用序列分析程序Mac Vector 6.5.1.(IBI，New Haven，CT)的蛋白质分析工具箱(Protein Analysis Toolbox)分析D2-9Gly-Fc和D2-Fc蛋白质的氨基酸序列。D2-9Gly-Fc序列中的多聚甘氨酸9-mer连接体被确认为是通过Karpus and Schultz(1985)Naturwiss，72：212-213的柔韧性预测方法得出的柔韧性高于平均水平的区域。在D2-Fc序列中没有检出这样的区域(图1)。

实施例2

我们测试了通过柔韧多聚甘氨酸9-mer连接体连接到IgG1 Fc区域上的分离的Flt-1 Flt-1 Ig样结构域2(D2-9Gly-Fc)。D2-9Gly-Fc融合蛋白能够有效结合VEGF并抑制VEGF依赖型人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖。参见图2。相反，当Flt-1Ig样结构域2直接连接到IgG1重链(Fc)上以形成D2-Fc时，仅观察到轻微的VEGF结合。参见图2。通过IgG1 Fc的二聚和柔韧连接体的插入似乎促进了VEGF结合到Flt-1结构域2上。通过免疫印迹分析确定D2-9Gly-Fc和D2-Fc中二聚形式的存在。参见图3。

实施例3

对新生的(P0)或1天大(P1)C57BL/6的鼠施用AAV载体(在0.0005毫升体积中1×10⁸至1×10⁹个粒子)的玻璃体内注射液。通过使P7幼畜和它们的看护母畜暴露在高氧中5天，在C57BL/6鼠中引发视网膜血管新生(NV)。使幼畜在P12回到室内空气并在P17安乐死(euthanized)(最高NV的时间)。(Smith LEH，Weslowski E，McLellan A，Kostyk SK，D’Amato R，Sullivan and D’Amore PA.Oxygen-Induced Retinopathy in the Mouse.Invest Opth Vis Sci.1994；35：101-111.)将整个石蜡包埋的眼以5微米为间隔连续切片。通过在每隔100微米截取的切片中数出在内界膜内部的内皮细胞核数，测定NV程度。

用编码抗血管生成剂的AAV载体处理的动物组与用编码不相关转基因的载体或用不编码转基因的载体处理的组进行比较。将每一处理过的眼中内皮细胞核的平均数与每一动物的未处理的对侧眼进行比较。

实施例4

D2-9Gly-Ex3/CH3的生成

Flt-1的结构域2已经证实对于VEGF₁₆₅结合是必不可少的。但是，已经证明，Flt-1结构域2单独不能结合VEGF A(Davis-Smyth等人，1996)。VEGF A在作为二聚体存在时，通过酸性残基(成熟蛋白质的氨基酸63-67)结合到Flt-1上，这能够实现配体引发的受体二聚的可行机制(Keyt等人，1996)。

因此，Flt-1的结构域2的二聚被用作恢复Flt-1的结构域2与VEGFA的结合的对策。与IgG重链片段的融合可用于蛋白质的二聚(Davis-Smyth等人，1996)。在此，我们证实，VEGF A(SEQ ID NO：12)的氨基酸75-88(即PSCVPLMRCGGCCN；SEQ ID NO：13)提高了sFlt-1杂交蛋白质的生物活性。

首先，设计三种杂交蛋白质：D2-9Gly-Fc、D2-Fc和D2-9Gly-Ex3/CH3(图4)。所有三种杂交蛋白质含有与D2-9Gly-Fc相同的Flt-1结构域D2。使用不含多聚甘氨酸9-mer(9Gly)连接体的D2-Fc，没有观察到VEGF结合。第三种蛋白质，D2-9Gly-Ex3/CH3，含有多聚甘氨酸9-mer(9Gly)连接体和VEGF的多聚结构域(aaPSCVPLMRCGGCCN；SEQ ID NO：13；VEGF Ex3)，但其还含有人类IgG1重链Fc的CH3区(SEQ ID NO：10的aa 371-477)。

蛋白质D2-Fc在HUVEC增殖检测(图5)中没有表现出有效的抑制活性，且暗示未有效结合到VEGF₁₆₅上。但是，第三种杂交蛋白质D2-9Gly-Ex3/CH3(其含有通过9Gly连接体和VEGF165的多聚区域(Ex3)融合到CH3区域上的Flt-1的结构域2)在VEGF-依赖型HUVECs增殖检测(图5)种确实表现出抑制活性。这意味着，这种杂交蛋白有效结合到VEGF₁₆₅上。

实施例5

在Flt-1D2构建体中使用连接体(Gly₄Ser)₃

数种多聚甘氨酸连接体之前已经被描述用于改进蛋白质特征(Mouz等人，1996；Qiu等人，1998)。对于下一种构建体，我们已经使用另一种连接体，15-mer(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(Huston等人，1988)。生成D2-(Gly₄Ser)₃-Fc蛋白质，其含有Flt-1结构域2、(Gly₄Ser)₃连接体和人类IgG1重链的Fc区域。

在HUVECs增殖检测中进一步表征D2-(Gly₄Ser)₃-Fc。通过HUVEC增殖的抑制测得的D2-(Gly₄Ser)₃-Fc的生物活性与D2-9Gly-Fc和D2-9Gly-Ex3/CH3的类似(图6)。

通过免疫印迹法进一步表征D2-(Gly₄Ser)₃-Fc构建体并与D2-9Gly-Fc进行比较(图9)。这两种构建体均多数以二聚体形式存在，并在还原样品分离后检测单体形式。

实施例6

9Gly或VEGF Ex3在Flt-1(D2)构建体中的作用

为了调查9Gly连接体或VEGF二聚序列Ex3在可溶受体VEGF结合中的作用，生成三种其他构建体：D2-9Gly-CH3、D2-CH3和D2-Ex3/CH3(图8)。生成所有三种构建体，并与之前的构建体类似地也置于CMV启动子的控制下。在HUVECs增殖检测中评定它们的VEGF抑制活性(图9)。

含IgG1的CH3区的蛋白质的HUVEC增殖检测已经表明，D2-9Gly-CH3(无Ex3)和蛋白质D2-Ex3/CH3(无9Gly连接体)与母体D2-9Gly-Ex3/CH3蛋白质相比，具有类似的VEGF抑制效力。但是，在所有这些中，蛋白质D2-CH3似乎是最弱的VEGF抑制剂(图9中)。

来自转染293细胞的条件培养基的Flt-1 ELISA数据已经表明了D2-9Gly-Ex3/CH3、D2-9Gly-CH3和D2-Ex3/CH3和D2-CH3的类似的Flt-1水平(70-90纳克/毫升)，和D2-CH3的最低活性形式的略高水平(～150纳克/毫升)。D2-9Gly-CH3和D2-CH3构建体的免疫印迹(图10)表明二聚体形式在未还原条件下的优势。

实施例7

D2-9Gly-Fc结合VEGF优于所有构建体

VEGF结合检测使我们能够比较我们的可溶VEGF受体在无细胞体系中的相对VEGF结合亲合力。

简要地说，将含有已知浓度的可溶受体(浓度为0.29-150pM)的条件培养基连续稀释并用10pM VEGF混合。然后通过ELISA测量未结合的VEGF的量。在0.001至大约0.2pM的受体浓度下，D2-9Gly-Fc以比所有其他构建体高的亲合力结合VEGF。D2-CH3具有最低的结合VEGF的亲合力(图11)。

参考文献：

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序列表格

934140_3.TXT

SEQ ID NO	克隆名称	长度	类型
SEQ ID NO	克隆名称	长度	类型	12345678910111213141516171819202122232425262728293031	FLT1D29GLYFCFLT1D29GLYFCFLT1D2DEL9GLYFLT1D2DEL9GLYFLT1D29GLYVEGFLT1D29GLYVEGFLT1D29GLYVEGFLT1D29GLYVEGiGg1 HEAVYIgG1 HEAVYVEGFVEGFVEGF 外显子3FLT-1FLT-1KDRKDRD2-CH3D2-CH3D2-EX3-CH3D2-EX3-CH3D2-9GLY-CH3D2-9GLY-CH3D2(G4S)3-FcD2(G4S)3-Fc随机连接体连接体连接体连接体连接体连接体	1077358105034942614174424714344776482151457771338583013566752247172387022331095364999997	DNA蛋白质DNA蛋白质DNA蛋白质DNA蛋白质DNA蛋白质DNA蛋白质蛋白质DNA蛋白质DNA蛋白质DNA蛋白质DNA蛋白质DNA蛋白质DNA蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质

934140_3.TXT

323334

连接体连接体连接体

13923

蛋白质蛋白质蛋白质

序列表

<110>A·斯卡里

P·佩汉

S·沃兹沃思

<120>多聚构建体

<130>003482.00025

<150>60/658209

<151>2005-03-04

<150>60/608887

<151>2004-09-13

<160>34

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>1077

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400> 1

atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60

acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240

agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360

ggtggaggtg gaggtggagg tcctaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 420

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 480

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 540

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 600

aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 660

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 720

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 780

accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 840

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 900

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 960

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1020

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatag 1077

<210>2

<211>358

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>2

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

00025GENZ SEQ

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser

20 25 30

Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile

35 40 45

Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe

50 55 60

Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser

65 70 75 80

Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu

85 90 95

Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr

100 105 110

Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro

115 120 125

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

130 135 140

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

145 150 155 160

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

165 170 175

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

180 185 190

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

195 200 205

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

210 215 220

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

225 230 235 240

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

245 250 255

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

260 265 270

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

275 280 285

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

290 295 300

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

305 310 315 320

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

325 330 335

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

340 345 350

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355

<210>3

<211>1050

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>3

atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60

acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240

agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aacccctaaa 360

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 420

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 480

00025GENZ SEQ

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 540

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 600

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 660

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 720

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 780

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 840

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 900

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 960

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1020

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatag 1050

<210>4

<211>349

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>4

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser

20 25 30

Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile

35 40 45

Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe

50 55 60

Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser

65 70 75 80

Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu

85 90 95

Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr

100 105 110

Leu Thr His Arg Gln Thr Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

115 120 125

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

130 135 140

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

145 150 155 160

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

165 170 175

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

180 185 190

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

195 200 205

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

210 215 220

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

225 230 235 240

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

245 250 255

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

260 265 270

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

275 280 285

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

290 295 300

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

305 310 315 320

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

325 330 335

00025GENZ SEQ

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345

<210>5

<211>426

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>5

atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60

acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240

agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360

ggtggaggtg gaggtggagg tccttcctgt gtgcccctga tgcgatgcgg gggctgctgc 420

aattag 426

<210>6

<211>141

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>6

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser

20 25 30

Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile

35 40 45

Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe

50 55 60

Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser

65 70 75 80

Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu

85 90 95

Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr

100 105 110

Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro

115 120 125

Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn

130 135 140

<210>7

<211>744

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>7

atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60

acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120

00025GENZ SEQ

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240

agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360

ggtggaggtg gaggtggagg tccttcctgt gtgcccctga tgcgatgcgg gggctgctgc 420

aatcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 480

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 540

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 600

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 660

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 720

ctctccctgt ctccgggtaa atag 744

<210>8

<211>247

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>8

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser

20 25 30

Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile

35 40 45

Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe

50 55 60

Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser

65 70 75 80

Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu

85 90 95

Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr

100 105 110

Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro

115 120 125

Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Gln Pro Arg

130 135 140

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

145 150 155 160

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

165 170 175

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

180 185 190

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

195 200 205

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

210 215 220

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

225 230 235 240

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

245

<210>9

<211>1434

<212>DNA

<213>人类

<400>9

atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120

Page 5

0002 5GENZ SEQ

tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtaat tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180

ggcaaggggc tggagtgggt ggcagctata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gttgtatatg 300

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt attgtgcgag agagggtcgg 360

tgggtacgat atactacggt gactactatc ggatactact ttgactactg gggccaggga 420

accctggtca ccgtctcctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc 480

tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 540

cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 600

ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 660

agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag 720

gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 780

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 840

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 900

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 960

ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1020

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1080

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1140

ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1200

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1260

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc 1320

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1380

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctCtccctgt ccccgggtaa atga 1434

<210>10

<211>477

<212>PRT

<213>人类

<400>10

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Met Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Arg Trp Val Arg Tyr Thr Thr Val Thr

115 120 125

Thr Ile Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

130 135 140

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

145 150 155 160

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

165 170 175

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

180 185 190

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

195 200 205

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val yal Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

210 215 220

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

225 230 235 240

Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

260 265 270

00025GENZ SEQ

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

275 280 285

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

290 295 300

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

305 310 315 320

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

325 330 335

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

340 345 350

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

355 360 365

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

370 375 380

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

385 390 395 400

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

405 410 415

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

420 425 430

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

435 440 445

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

450 455 460

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<210>11

<211>648

<212>DNA

<213>人类

<400>11

atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60

gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120

gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180

atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240

atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300

aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360

agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420

aaaaaatcag ttcgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa agcgcaagaa atcccggtat 480

aagtcctgga gcgttccctg tgggccttgc tcagagcgga gaaagcattt gtttgtacaa 540

gatccgcaga cgtgtaaatg ttcctgcaaa aacacagact cgcgttgcaa ggcgaggcag 600

cttgagttaa acgaacgtac ttgcagatgt gacaagccga ggcggtga 648

<210>12

<211>215

<212>PRT

<213>人类

<400>12

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

20 25 30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

35 40 45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

50 55 60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65 70 75 80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

85 90 95

00025GENZ SEQ

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

100 105 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

115 120 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val

130 135 140

Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His

165 170 175

Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr

180 185 190

Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys

195 200 205

Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

210 215

<210>13

<211>14

<212>PRT

<213>人类

<400>13

Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn

1 5 10

<210>14

<211>5777

<212>DNA

<213>人类

<400>14

gcggacactc ctctcggctc ctccccggca gcggcggcgg ctcggagcgg gctccggggc 60

tcgggtgcag cggccagcgg gcctggcggc gaggattacc cggggaagtg gttgtctcct 120

ggctggagcc gcgagacggg cgctcagggc gcggggccgg cggcggcgaa cgagaggacg 180

gactctggcg gccgggtcgt tggccggggg agcgcgggca ccgggcgagc aggccgcgtc 240

gcgctcacca tggtcagcta ctgggacacc ggggtcctgc tgtgcgcgct gctcagctgt 300

ctgcttctca caggatctag ttcaggttca aaattaaaag atcctgaact gagtttaaaa 360

ggcacccagc acatcatgca agcaggccag acactgcatc tccaatgcag gggggaagca 420

gcccataaat ggtctttgcc tgaaatggtg agtaaggaaa gcgaaaggct gagcataact 480

aaatctgcct gtggaagaaa tggcaaacaa ttctgcagta ctttaacctt gaacacagct 540

caagcaaacc acactggctt ctacagctgc aaatatctag ctgtacctac ttcaaagaag 600

aaggaaacag aatctgcaat ctatatattt attagtgata caggtagacc tttcgtagag 660

atgtacagtg aaatccccga aattatacac atgactgaag gaagggagct cgtcattccc 720

tgccgggtta cgtcacctaa catcactgtt actttaaaaa agtttccact tgacactttg 780

atccctgatg gaaaacgcat aatctgggac agtagaaagg gcttcatcat atcaaatgca 840

acgtacaaag aaatagggct tctgacctgt gaagcaacag tcaatgggca tttgtataag 900

acaaactatc tcacacatcg acaaaccaat acaatcatag atgtccaaat aagcacacca 960

cgcccagtca aattacttag aggccatact cttgtcctca attgtactgc taccactccc 1020

ttgaacacga gagttcaaat gacctggagt taccctgatg aaaaaaataa gagagcttcc 1080

gtaaggcgac gaattgacca aagcaattcc catgccaaca tattctacag tgttcttact 1140

attgacaaaa tgcagaacaa agacaaagga ctttatactt gtcgtgtaag gagtggacca 1200

tcattcaaat ctgttaacac ctcagtgcat atatatgata aagcattcat cactgtgaaa 1260

catcgaaaac agcaggtgct tgaaaccgta gctggcaagc ggtcttaccg gctctctatg 1320

aaagtgaagg catttccctc gccggaagtt gtatggttaa aagatgggtt acctgcgact 1380

gagaaatctg ctcgctattt gactcgtggc tactcgttaa ttatcaagga cgtaactgaa 1440

gaggatgcag ggaattatac aatcttgctg agcataaaac agtcaaatgt gtttaaaaac 1500

ctcactgcca ctctaattgt caatgtgaaa ccccagattt acgaaaaggc cgtgtcatcg 1560

tttccagacc cggctctcta cccactgggc agcagacaaa tcctgacttg taccgcatat 1620

ggtatccctc aacctacaat caagtggttc tggcacccct gtaaccataa tcattccgaa 1680

gcaaggtgtg acttttgttc caataatgaa gagtccttta tcctggatgc tgacagcaac 1740

atgggaaaca gaattgagag catcactcag cgcatggcaa taatagaagg aaagaataag 1800

atggctagca ccttggttgt ggctgactct agaatttctg gaatctacat ttgcatagct 1860

0025GENZ SEQ

tccaataaag ttgggactgt gggaagaaac ataagctttt atatcacaga tgtgccaaat 1920

gggtttcatg ttaacttgga aaaaatgccg acggaaggag aggacctgaa actgtcttgc 1980

acagttaaca agttcttata cagagacgtt acttggattt tactgcggac agttaataac 2040

agaacaatgc actacagtat tagcaagcaa aaaatggcca tcactaagga gcactccatc 2100

actcttaatc ttaccatcat gaatgtttcc ctgcaagatt caggcaccta tgcctgcaga 2160

gccaggaatg tatacacagg ggaagaaatc ctccagaaga aagaaattac aatcagagat 2220

caggaagcac catacctcct gcgaaacctc agtgatcaca cagtggccat cagcagttcc 2280

accactttag actgtcatgc taatggtgtc cccgagcctc agatcacttg gtttaaaaac 2340

aaccacaaaa tacaacaaga gcctggaatt attttaggac caggaagcag cacgctgttt 2400

attgaaagag tcacagaaga ggatgaaggt gtctatcact gcaaagccac caaccagaag 2460

ggctctgtgg aaagttcagc atacctcact gttcaaggaa cctcggacaa gtctaatctg 2520

gagctgatca ctctaacatg cacctgtgtg gctgcgactc tcttctggct cctattaacc 2580

ctccttatcc gaaaaatgaa aaggtcttct tctgaaataa agactgacta cctatcaatt 2640

ataatggacc cagatgaagt tcctttggat gagcagtgtg agcggctccc ttatgatgcc 2700

agcaagtggg agtttgcccg ggagagactt aaactgggca aatcacttgg aagaggggct 2760

tttggaaaag tggttcaagc atcagcattt ggcattaaga aatcacctac gtgccggact 2820

gtggctgtga aaatgctgaa agagggggcc acggccagcg agtacaaagc tctgatgact 2880

gagctaaaaa tcttgaccca cattggccac catctgaacg tggttaacct gctgggagcc 2940

tgcaccaagc aaggagggcc tctgatggtg attgttgaat actgcaaata tggaaatctc 3000

tccaactacc tcaagagcaa acgtgactta ttttttctca acaaggatgc agcactacac 3060

atggagccta agaaagaaaa aatggagcca ggcctggaac aaggcaagaa accaagacta 3120

gatagcgtca ccagcagcga aagctttgcg agctccggct ttcaggaaga taaaagtctg 3180

agtgatgttg aggaagagga ggattctgac ggtttctaca aggagcccat cactatggaa 3240

gatctgattt cttacagttt tcaagtggcc agaggcatgg agttcctgtc ttccagaaag 3300

tgcattcatc gggacctggc agcgagaaac attcttttat ctgagaacaa cgtggtgaag 3360

atttgtgatt ttggccttgc ccgggatatt tataagaacc ccgattatgt gagaaaagga 3420

gatactcgac ttcctctgaa atggatggct cccgaatcta tctttgacaa aatctacagc 3480

accaagagcg acgtgtggtc ttacggagta ttgctgtggg aaatcttctc cttaggtggg 3540

tctccatacc caggagtaca aatggatgag gacttttgca gtcgcctgag ggaaggcatg 3600

aggatgagag ctcctgagta ctctactcct gaaatctatc agatcatgct ggactgctgg 3660

cacagagacc caaaagaaag gccaagattt gcagaacttg tggaaaaact aggtgatttg 3720

cttcaagcaa atgtacaaca ggatggtaaa gactacatcc caatcaatgc catactgaca 3780

ggaaatagtg ggtttacata ctcaactcct gccttctctg aggacttctt caaggaaagt 3840

atttcagctc cgaagtttaa ttcaggaagc tctgatgatg tcagatatgt aaatgctttc 3900

aagttcatga gcctggaaag aatcaaaacc tttgaagaac ttttaccgaa tgccacctcc 3960

atgtttgatg actaccaggg cgacagcagc actctgttgg cctctcccat gctgaagcgc 4020

ttcacctgga ctgacagcaa acccaaggcc tcgctcaaga ttgacttgag agtaaccagt 4080

aaaagtaagg agtcggggct gtctgatgtc agcaggccca gtttctgcca ttccagctgt 4140

gggcacgtca gcgaaggcaa gcgcaggttc acctacgacc acgctgagct ggaaaggaaa 4200

atcgcgtgct gctccccgcc cccagactac aactcggtgg tcctgtactc caccccaccc 4260

atctagagtt tgacacgaag ccttatttct agaagcacat gtgtatttat acccccagga 4320

aactagcttt tgccagtatt atgcatatat aagtttacac ctttatcttt ccatgggagc 4380

cagctgcttt ttgtgatttt tttaatagtg cttttttttt ttgactaaca agaatgtaac 4440

tccagataga gaaatagtga caagtgaaga acactactgc taaatcctca tgttactcag 4500

tgttagagaa atccttccta aacccaatga cttccctgct ccaacccccg ccacctcagg 4560

gcacgcagga ccagtttgat tgaggagctg cactgatcac ccaatgcatc acgtacccca 4620

ctgggccagc cctgcagccc aaaacccagg gcaacaagcc cgttagcccc aggggatcac 4680

tggctggcct gagcaacatc tcgggagtcc tctagcaggc ctaagacatg tgaggaggaa 4740

aaggaaaaaa agcaaaaagc aagggagaaa agagaaaccg ggagaaggca tgagaaagaa 4800

tttgagacgc accatgtggg cacggagggg gacggggctc agcaatgcca tttcagtggc 4860

ttcccagctc tgacccttct acatttgagg gcccagccag gagcagatgg acagcgatga 4920

ggggacattt tctggattct gggaggcaag aaaaggacaa atatcttttt tggaactaaa 4980

gcaaatttta gacctttacc tatggaagtg gttctatgtc cattctcatt cgtggcatgt 5040

tttgatttgt agcactgagg gtggcactca actctgagcc catacttttg gctcctctag 5100

taagatgcac tgaaaactta gccagagtta ggttgtctcc aggccatgat ggccttacac 5160

tgaaaatgtc acattctatt ttgggtatta atatatagtc cagacactta actcaatttc 5220

ttggtattat tctgttttgc acagttagtt gtgaaagaaa gctgagaaga atgaaaatgc 5280

agtcctgagg agagttttct ccatatcaaa acgagggctg atggaggaaa aaggtcaata 5340

aggtcaaggg aagaccccgt ctctatacca accaaaccaa ttcaccaaca cagttgggac 5400

ccaaaacaca ggaagtcagt cacgtttcct tttcatttaa tggggattcc actatctcac 5460

actaatctga aaggatgtgg aagagcatta gctggcgcat attaagcact ttaagctcct 5520

tgagtaaaaa ggtggtatgt aatttatgca aggtatttct ccagttggga ctcaggatat 5580

tagttaatga gccatcacta gaagaaaagc ccattttcaa ctgctttgaa acttgcctgg 5640

00025GENZ SEQ

ggtctgagca tgatgggaat agggagacag ggtaggaaag ggcgcctact cttcagggtc 5700

taaagatcaa gtgggccttg gatcgctaag ctggctctgt ttgatgctat ttatgcaagt 5760

tagggtctat gtattta 5777

<210>15

<211>1338

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>结构域

<222>(235)...(336)

<223>结构域3

<400>15

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro

20 25 30

Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr

35 40 45

Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro

50 55 60

Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala

65 70 75 80

Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr

85 90 95

Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val

100 105 110

Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile

115 120 125

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

130 135 140

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

145 150 155 160

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

165 170 175

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

180 185 190

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

195 200 205

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

210 215 220

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val

225 230 235 240

Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr

245 250 255

Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys

260 265 270

Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His

175 280 285

Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys

290 295 300

Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys

305 310 315 320

Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val

325 330 335

Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser

340 345 350

Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val

355 360 365

00025GENZ SEQ

Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu

370 375 380

Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala

385 390 395 400

Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys

405 410 415

Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn Val Lys Pro Gln Ile Tyr Glu

420 425 430

Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser

435 440 445

Arg Gln Ile Leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Ile Pro Gln Pro Thr Ile

450 455 460

Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His Asn His Ser Glu Ala Arg Cys

465 470 475 480

Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe Ile Leu Asp Ala Asp Ser

485 490 495

Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile Thr Gln Arg Met Ala Ile Ile

500 505 510

Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Val Val Ala Asp Ser Arg

515 520 525

Ile Ser Gly Ile Tyr Ile Cys Ile Ala Ser Asn Lys Val Gly Thr Val

530 535 540

Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr Asp Val Pro Asn Gly Phe His

545 550 555 560

Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly Glu Asp Leu Lys Leu Ser

565 570 575

Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val Thr Trp Ile Leu Leu

580 585 590

Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser Ile Ser Lys Gln Lys

595 600 605

Met Ala Ile Thr Lys Glu His Ser Ile Thr Leu Asn Leu Thr Ile Met

610 615 620

Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ala Cys Arg Ala Arg Asn

625 630 635 640

Val Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gln Lys Lys Glu Ile Thr Ile Arg

645 650 655

Asp Gln Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu Ser Asp His Thr Val

660 665 670

Ala Ile Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His Ala Asn Gly Val Pro

675 680 685

Glu Pro Gln Ile Thr Trp Phe Lys Asn Asn His Lys Ile Gln Gln Glu

690 695 700

Pro Gly Ile Ile Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ile Glu Arg

705 710 715 720

Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala Thr Asn Gln

725 730 735

Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gln Gly Thr Ser

740 745 750

Asp Lys Ser Asn Leu Glu Leu Ile Thr Leu Thr Cys Thr Cys Val Ala

755 760 765

Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ile Arg Lys Met Lys

770 775 780

Arg Ser Ser Ser Glu Ile Lys Thr Asp Tyr Leu Ser Ile Ile Met Asp

785 790 795 800

Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gln Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp

805 810 815

Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu Lys Leu Gly Lys Ser

820 825 830

Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Gln Ala Ser Ala Phe Gly

835 840 845

Ile Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys

850 855 860

Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala Leu Met Thr Glu Leu Lys

00025GENZ SEQ

865 870 875 880

Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly

885 890 895

Ala Cys Thr Lys Gln Gly Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu Tyr Cys

900 905 910

Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp Leu Phe

915 920 925

Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met Glu Pro Lys Lys Glu Lys

930 935 940

Met Glu Pro Gly Leu Glu Gln Gly Lys Lys Pro Arg Leu Asp Ser Val

945 950 955 960

Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly Phe Gln Glu Asp Lys Ser

965 970 975

Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Gly Phe Tyr Lys Glu

980 985 990

Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg

995 1000 1005

Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala

1010 1015 1020

Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn Val Val Lys Ile Cys Asp

1025 1030 1035 1040

Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Pro Asp Tyr Val Arg Lys

1045 1050 1055

Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe

1060 1065 1070

Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Leu

1075 1080 1085

Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Val Gln

1090 1095 1100

Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu Arg Glu Gly Met Arg Met Arg

1105 1110 1115 1120

Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu Ile Tyr Gln Ile Met Leu Asp Cys

1125 1130 1135

Trp His Arg Asp Pro Lys Glu Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Val Glu

1140 1145 1150

Lys Leu Gly Asp Leu Leu Gln Ala Asn Val Gln Gln Asp Gly Lys Asp

1155 1160 1165

Tyr Ile Pro Ile Asn Ala Ile Leu Thr Gly Asn Ser Gly Phe Thr Tyr

1170 1175 1180

Ser Thr Pro Ala Phe Ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser Ala

1185 1190 1195 1200

Pro Lys Phe Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp Val Arg Tyr Val Asn Ala

1205 1210 1215

Phe Lys Phe Met Ser Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Glu Glu Leu Leu

1220 1225 1230

Pro Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr Gln Gly Asp Ser Ser Thr

1235 1240 1245

Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr Asp Ser Lys

1250 1255 1260

Pro Lys Ala Ser Leu Lys Ile Asp Leu Arg Val Thr Ser Lys Ser Lys

1265 1270 1275 1280

Glu Ser Gly Leu Ser Asp Val Ser Arg Pro Ser Phe Cys His Ser Ser

1285 1290 1295

Cys Gly His Val Ser Glu Gly Lys Arg Arg Phe Thr Tyr Asp His Ala

1300 1305 1310

Glu Leu Glu Arg Lys Ile Ala Cys Cys Ser Pro Pro Pro Asp Tyr Asn

1315 1320 1325

Ser Val Val Leu Tyr Ser Thr Pro Pro Ile

1330 1335

<210>16

<211>5830

00025GENZ SEQ

<212>DNA

<213>人类

<400>16

actgagtccc gggaccccgg gagagcggtc agtgtgtggt cgctgcgttt cctctgcctg 60

cgccgggcat cacttgcgcg ccgcagaaag tccgtctggc agcctggata tcctctccta 120

ccggcacccg cagacgcccc tgcagccgcc ggtcggcgcc cgggctccct agccctgtgc 180

gctcaactgt cctgcgctgc ggggtgccgc gagttccacc tccgcgcctc cttctctaga 240

caggcgctgg gagaaagaac cggctcccga gttctgggca tttcgcccgg ctcgaggtgc 300

aggatgcaga gcaaggtgct gctggccgtc gccctgtggc tctgcgtgga gacccgggcc 360

gcctctgtgg gtttgcctag tgtttctctt gatctgccca ggctcagcat acaaaaagac 420

atacttacaa ttaaggctaa tacaactctt caaattactt gcaggggaca gagggacttg 480

gactggcttt ggcccaataa tcagagtggc agtgagcaaa gggtggaggt gactgagtgc 540

agcgatggcc tcttctgtaa gacactcaca attccaaaag tgatcggaaa tgacactgga 600

gcctacaagt gcttctaccg ggaaactgac ttggcctcgg tcatttatgt ctatgttcaa 660

gattacagat ctccatttat tgcttctgtt agtgaccaac atggagtcgt gtacattact 720

gagaacaaaa acaaaactgt ggtgattcca tgtctcgggt ccatttcaaa tctcaacgtg 780

tcactttgtg caagataccc agaaaagaga tttgttcctg atggtaacag aatttcctgg 840

gacagcaaga agggctttac tattcccagc tacatgatca gctatgctgg catggtcttc 900

tgtgaagcaa aaattaatga tgaaagttac cagtctatta tgtacatagt tgtcgttgta 960

gggtatagga tttatgatgt ggttctgagt ccgtctcatg gaattgaact atctgttgga 1020

gaaaagcttg tcttaaattg tacagcaaga actgaactaa atgtggggat tgacttcaac 1080

tgggaatacc cttcttcgaa gcatcagcat aagaaacttg taaaccgaga cctaaaaacc 1140

cagtctggga gtgagatgaa gaaatttttg agcaccttaa ctatagatgg tgtaacccgg 1200

agtgaccaag gattgtacac ctgtgcagca tccagtgggc tgatgaccaa gaagaacagc 1260

acatttgtca gggtccatga aaaacctttt gttgcttttg gaagtggcat ggaatctctg 1320

gtggaagcca cggtggggga gcgtgtcaga atccctgcga agtaccttgg ttacccaccc 1380

ccagaaataa aatggtataa aaatggaata ccccttgagt ccaatcacac aattaaagcg 1440

gggcatgtac tgacgattat ggaagtgagt gaaagagaca caggaaatta cactgtcatc 1500

cttaccaatc ccatttcaaa ggagaagcag agccatgtgg tctctctggt tgtgtatgtc 1560

ccaccccaga ttggtgagaa atctctaatc tctcctgtgg attcctacca gtacggcacc 1620

actcaaacgc tgacatgtac ggtctatgcc attcctcccc cgcatcacat ccactggtat 1680

tggcagttgg aggaagagtg cgccaacgag cccagccaag ctgtctcagt gacaaaccca 1740

tacccttgtg aagaatggag aagtgtggag gacttccagg gaggaaataa aattgaagtt 1800

aataaaaatc aatttgctct aattgaagga aaaaacaaaa ctgtaagtac ccttgttatc 1860

caagcggcaa atgtgtcagc tttgtacaaa tgtgaagcgg tcaacaaagt cgggagagga 1920

gagagggtga tctccttcca cgtgaccagg ggtcctgaaa ttactttgca acctgacatg 1980

cagcccactg agcaggagag cgtgtctttg tggtgcactg cagacagatc tacgtttgag 2040

aacctcacat ggtacaagct tggcccacag cctctgccaa tccatgtggg agagttgccc 2100

acacctgttt gcaagaactt ggatactctt tggaaattga atgccaccat gttctctaat 2160

agcacaaatg acattttgat catggagctt aagaatgcat ccttgcagga ccaaggagac 2220

tatgtctgcc ttgctcaaga caggaagacc aagaaaagac attgcgtggt caggcagctc 2280

acagtcctag agcgtgtggc acccacgatc acaggaaacc tggagaatca gacgacaagt 2340

attggggaaa gcatcgaagt ctcatgcacg gcatctggga atccccctcc acagatcatg 2400

tggtttaaag ataatgagac ccttgtagaa gactcaggca ttgtattgaa ggatgggaac 2460

cggaacctca ctatccgcag agtgaggaag gaggacgaag gcctctacac ctgccaggca 2520

tgcagtgttc ttggctgtgc aaaagtggag gcatttttca taatagaagg tgcccaggaa 2580

aagacgaact tggaaatcat tattctagta ggcacggcgg tgattgccat gttcttctgg 2640

ctacttcttg tcatcatcct acggaccgtt aagcgggcca atggagggga actgaagaca 2700

ggctacttgt ccatcgtcat ggatccagat gaactcccat tggatgaaca ttgtgaacga 2760

ctgccttatg atgccagcaa atgggaattc cccagagacc ggctgaagct aggtaagcct 2820

cttggccgtg gtgcctttgg ccaagtgatt gaagcagatg cctttggaat tgacaagaca 2880

gcaacttgca ggacagtagc agtcaaaatg ttgaaagaag gagcaacaca cagtgagcat 2940

cgagctctca tgtctgaact caagatcctc attcatattg gtcaccatct caatgtggtc 3000

aaccttctag gtgcctgtac caagccagga gggccactca tggtgattgt ggaattctgc 3060

aaatttggaa acctgtccac ttacctgagg agcaagagaa atgaatttgt cccctacaag 3120

accaaagggg cacgattccg tcaagggaaa gactacgttg gagcaatccc tgtggatctg 3180

aaacggcgct tggacagcat caccagtagc cagagctcag ccagctctgg atttgtggag 3240

gagaagtccc tcagtgatgt agaagaagag gaagctcctg aagatctgta taaggacttc 3300

ctgaccttgg agcatctcat ctgttacagc ttccaagtgg ctaagggcat ggagttcttg 3360

gcatcgcgaa agtgtatcca cagggacctg gcggcacgaa atatcctctt atcggagaag 3420

aacgtggtta aaatctgtga ctttggcttg gcccgggata tttataaaga tccagattat 3480

gtcagaaaag gagatgctcg cctccctttg aaatggatgg ccccagaaac aatttttgac 3540

00025GENZ SEQ

agagtgtaca caatccagag tgacgtctgg tcttttggtg ttttgctgtg ggaaatattt 3600

tccttaggtg cttctccata tcctggggta aagattgatg aagaattttg taggcgattg 3660

aaagaaggaa ctagaatgag ggcccctgat tatactacac cagaaatgta ccagaccatg 3720

ctggactgct ggcacgggga gcccagtcag agacccacgt tttcagagtt ggtggaacat 3780

ttgggaaatc tcttgcaagc taatgctcag caggatggca aagactacat tgttcttccg 3840

atatcagaga ctttgagcat ggaagaggat tctggactct ctctgcctac ctcacctgtt 3900

tcctgtatgg aggaggagga agtatgtgac cccaaattcc attatgacaa cacagcagga 3960

atcagtcagt atctgcagaa cagtaagcga aagagccggc ctgtgagtgt aaaaacattt 4020

gaagatatcc cgttagaaga accagaagta aaagtaatcc cagatgacaa ccagacggac 4080

agtggtatgg ttcttgcctc agaagagctg aaaactttgg aagacagaac caaattatct 4140

ccatcttttg gtggaatggt gcccagcaaa agcagggagt ctgtggcatc tgaaggctca 4200

aaccagacaa gcggctacca gtccggatat cactccgatg acacagacac caccgtgtac 4260

tccagtgagg aagcagaact tttaaagctg atagagattg gagtgcaaac cggtagcaca 4320

gcccagattc tccagcctga ctcggggacc acactgagct ctcctcctgt ttaaaaggaa 4380

gcatccacac cccaactccc ggacatcaca tgagaggtct gctcagattt tgaagtgttg 4440

ttctttccac cagcaggaag tagccgcatt tgattttcat ttcgacaaca gaaaaaggac 4500

ctcggactgc agggagccag tcttctaggc atatcctgga agaggcttgt gacccaagaa 4560

tgtgtctgtg tcttctccca gtgttgacct gatcctcttt tttcattcat ttaaaaagca 4620

ttatcatgcc cctgctgcgg gtctcaccat gggtttagaa caaagagctt caagcaatgg 4680

ccccatcctc aaagaagtag cagtacctgg ggagctgaca cttctgtaaa actagaagat 4740

aaaccaggca acgtaagtgt tcgaggtgtt gaagatggga aggatttgca gggctgagtc 4800

tatccaagag gctttgttta ggacgtgggt cccaagccaa gccttaagtg tggaattcgg 4860

attgatagaa aggaagacta acgttacctt gctttggaga gtactggagc ctgcaaatgc 4920

attgtgtttg ctctggtgga ggtgggcatg gggtctgttc tgaaatgtaa agggttcaga 4980

cggggtttct ggttttagaa ggttgcgtgt tcttcgagtt gggctaaagt agagttcgtt 5040

gtgctgtttc tgactcctaa tgagagttcc ttccagaccg ttagctgtct ccttgccaag 5100

ccccaggaag aaaatgatgc agctctggct ccttgtctcc caggctgatc ctttattcag 5160

aataccacaa agaaaggaca ttcagctcaa ggctccctgc cgtgttgaag agttctgact 5220

gcacaaacca gcttctggtt tcttctggaa tgaataccct catatctgtc ctgatgtgat 5280

atgtctgaga ctgaatgcgg gaggttcaat gtgaagctgt gtgtggtgtc aaagtttcag 5340

gaaggatttt acccttttgt tcttccccct gtccccaacc cactctcacc ccgcaaccca 5400

tcagtatttt agttatttgg cctctactcc agtaaacctg attgggtttg ttcactctct 5460

gaatgattat tagccagact tcaaaattat tttatagccc aaattataac atctattgta 5520

ttatttagac ttttaacata tagagctatt tctactgatt tttgcccttg ttctgtcctt 5580

tttttcaaaa aagaaaatgt gttttttgtt tggtaccata gtgtgaaatg ctgggaacaa 5640

tgactataag acatgctatg gcacatatat ttatagtctg tttatgtaga aacaaatgta 5700

atatattaaa gccttatata taatgaactt tgtactattc acattttgta tcagtattat 5760

gtagcataac aaaggtcata atgctttcag caattgatgt cattttatta aagaacattg 5820

aaaaacttga 5830

<210>17

<211>1356

<212>PRT

<213>人类

<400>17

Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu

1 5 10 15

Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro

20 25 30

Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr

35 40 45

Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro

50 55 60

Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser

65 70 75 80

Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn

85 90 95

Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser

100 105 110

Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser

00025GENZ SEQ

115 120 125

Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys

130 135 140

Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser

145 150 155 160

Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg

165 170 175

Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile

180 185 190

Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser

195 200 205

Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr

210 215 220

Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu

225 230 235 240

Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile

245 250 255

Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu

260 265 270

Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe

275 280 285

Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu

290 295 300

Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr

305 310 315 320

Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met

325 330 335

Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala

340 345 350

Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly

355 360 365

Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr

370 375 380

Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu

385 390 395 400

Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val

405 410 415

Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val

420 425 430

Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr

435 440 445

Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu

450 455 460

Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr

465 470 475 480

Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys

485 490 495

Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys

500 505 510

Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr

515 520 525

Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser

530 535 540

Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln

545 550 555 560

Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser

565 570 575

Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro

580 585 590

Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr

595 600 605

Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile

610 615 620

00025GENZ SEQ

Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr

625 630 635 640

Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val

645 650 655

Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn

660 665 670

Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys

675 680 685

Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn

690 695 700

Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg

705 710 715 720

Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr

725 730 735

Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe

740 745 750

Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu

755 760 765

Val Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile

770 775 780

Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly

785 790 795 800

Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His

805 810 815

Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp

820 825 830

Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val

835 840 845

Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr

850 855 860

Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg

865 870 875 880

Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu

885 890 895

Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu

900 905 910

Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu

915 920 925

Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg

930 935 940

Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys

945 950 955 960

Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly

965 970 975

Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro

980 985 990

Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr

995 1000 1005

Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys

1010 1015 1020

Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn

1025 1030 1035 1040

Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp

1045 1050 1055

Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met

1060 1065 1070

Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val

1075 1080 1085

Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser

1090 1095 1100

Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys

1105 1110 1115 1120

Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr

00025GENZ SEQ

1125 1130 1135

Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr

1140 1145 1150

Phe Ser Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala

1155 1160 1165

Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu

1170 1175 1180

Ser Met Glu Glu Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser

1185 1190 1195 1200

Cys Met Glu Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn

1205 1210 1215

Thr Ala Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg

1220 1225 1230

Pro Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu

1235 1240 1245

Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met ValLeu

1250 1255 1260

Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu Ser Pro

1265 1270 1275 1280

Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser Val Ala Ser

1285 1290 1295

Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly Tyr His Ser Asp

1300 1305 1310

Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu Ala Glu Leu Leu Lys

1315 1320 1325

Leu Ile Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser Thr Ala Gln Ile Leu Gln

1330 1335 1340

Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser Pro Pro Val

1345 1350 1355

<210>18

<211>675

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>18

atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60

acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240

agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aacccagccc 360

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 420

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 480

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 540

ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 600

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 660

tctccgggta aatag 675

<210>19

<211>224

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>19

00025GENZ SEQ

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser

20 25 30

Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile

35 40 45

Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe

50 55 60

Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser

65 70 75 80

Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu

85 90 95

Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr

100 105 110

Leu Thr His Arg Gln Thr Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

115 120 125

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

145 150 155 160

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

165 170 175

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

180 185 190

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

195 200 205

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210>20

<211>717

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>20

atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60

acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240

agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccccttcc 360

tgtgtgcccc tgatgcgatg cgggggctgc tgcaatcagc cccgagaacc acaggtgtac 420

accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 480

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 540

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 600

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 660

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatag 717

<210>21

<211>238

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>21

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

00025GENZ SEQ

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser

20 25 30

Glu Tle Pro Glu Tle Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile

35 40 45

Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Tle Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe

50 55 60

Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser

65 70 75 80

Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu

85 90 95

Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr

100 105 110

Leu Thr His Arg Gln Thr Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly

115 120 125

Gly Cys Cys Asn Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

130 135 140

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

145 150 155 160

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

165 170 175

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

180 185 190

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

195 200 205

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

210 215 220

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230 235

<210>22

<211>702

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>22

atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60

acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240

agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360

ggtggaggtg gaggtggagg tcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 420

cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 480

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 540

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 600

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 660

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ag 702

<210>23

<211>233

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>23

00025GENZ SEQ

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser

20 25 30

Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile

35 40 45

Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe

50 55 60

Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser

65 70 75 80

Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu

85 90 95

Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr

100 105 110

Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gln

115 120 125

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

138 135 140

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

165 170 175

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

195 200 205

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

210 215 220

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210>24

<211>1095

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>24

atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60

acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240

agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360

ggtggatcgg gtggaggtgg atcgggtgga ggtggatcgc ctaagagctg cgacaaaact 420

cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 480

cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 540

gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 600

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 660

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 720

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 780

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 840

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 900

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 960

ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1020

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1080

tctccgggta aatag 1095

<210>25

<211>364

00025GENZ SEQ

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>重组融合蛋白或编码相同的序列

<400>25

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser

20 25 30

Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile

35 40 45

Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe

50 55 60

Pro Leu Asp Thr Leu Tle Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser

65 70 75 80

Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu

85 90 95

Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr

100 105 110

Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

130 135 140

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

145 150 155 160

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

165 170 175

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

180 185 190

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

195 200 205

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

210 215 220

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

225 230 235 240

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

245 250 255

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

260 265 270

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

275 280 285

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

290 295 300

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

305 310 315 320

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

325 330 335

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

340 345 350

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355 360

<210>26

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的连接体

00025GENZ SEQ

<400>26

Gly Asp Leu Ile Tyr Arg Asn Gln Lys

1 5

<210>27

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的连接体部分

<400>27

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210>28

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的连接体部分

<400>28

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

1 5

<210>29

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的连接体部分

<400>29

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

1 5

<210>30

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的连接体部分

<400>30

Gly Gly Gly Gly Gly Cys Pro Pro Cys

1 5

<210>31

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的连接体部分

<400>31

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser

1 5

00025GENZ SEQ

<210>32

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的连接体部分

<400>32

Sir Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn

1 5 10

<210>33

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的连接体部分

<400>33

Gly Asp Leu Ile Tyr Arg Asn Gln Cys

1 5

<210>34

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的连接体部分

<400>34

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Ser Cys Val Pro Leu Met

1 5 10 15

Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn

20

Claims

1.式X-Y-Z的融合蛋白，其中

X包含选自选自细胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子或生长因子的多肽；

Y基本由5-25氨基酸残基多肽构成，

Z是IgG重链分子的CH3区。

2.权利要求1的融合蛋白，其中X包含细胞外受体，且所述受体选自酪氨酸激酶受体或丝氨酸苏氨酸激酶受体。

3.权利要求1的融合蛋白，其中X包含细胞外受体，且所述受体是VEGF受体。

4.权利要求1的融合蛋白，其中X是VEGF-R1(FLT-1)的IgG-样结构域2。

5.权利要求1的融合蛋白，其中多肽Y是柔韧的。

6.权利要求1的融合蛋白，其中多肽Y选自gly₉(SEQ ID NO：27)、glu₉(SEQ ID NO：28)、ser₉(SEQ ID NO：29)、gly₅cyspro₂cys(SEQ ID NO：30)、(gly₄ser)₃(SEQ ID NO：31)、SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：32)、Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg CysGly Gly Cys Cys Asn(SEQ ID NO：13)、Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys(SEQ ID NO：26)或Gly₉ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：34)。

7.权利要求1的融合蛋白，其中Z是IgG1 CH3区域。

8.权利要求7的融合蛋白，其中Z是IgG2 CH3区域。

9.包含权利要求1的融合蛋白的组合物，其进一步包含一种或多种可药用赋形剂或载体。

10.权利要求9的组合物，其中所述组合物是液体制剂。

11.权利要求9的组合物，其中所述组合物是冻干制剂。

12.包含一种或多种权利要求1的融合蛋白的组合物，其中所述组合物

包含所述融合蛋白的多聚体。

13.权利要求12的组合物，其中所述组合物基本由形成同源多聚体的单种融合蛋白构成。

14.权利要求12的组合物，其中所述组合物基本由融合蛋白构成，其中组合物中所述融合蛋白中的X部分是异源的。

15.权利要求12的组合物，其中X部分是细胞外受体，且所述受体选自酪氨酸激酶受体或丝氨酸苏氨酸激酶受体。

16.权利要求12的组合物，其中X部分是细胞外受体，且所述受体是VEGF受体或其部分。

17.权利要求12的组合物，其中X部分是VEGF-R1(FLT-1)的IgG-样结构域2。

18.权利要求12的组合物，其中Y是柔韧多肽。

19.权利要求12的组合物，其中Y选自gly₉(SEQ ID NO：27)、glu₉(SEQID NO：28)、ser₉(SEQ ID NO：29)、gly₅cyspro₂cys(SEQ ID NO：30)、(gly₄ser)₃(SEQ ID NO：31)、SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：32)、Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly CysCys Asn(SEQ ID NO：13)、Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys(SEQID NO：26)或Gly₉ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGly CysCysAsn(SEQ ID NO：34)。

20.权利要求12的组合物，其中Z是CH3区域且所述区域是IgG1 CH3区域。

21.权利要求12的组合物，其进一步包含一种或多种可药用赋形剂或载体。

22.权利要求21的组合物，其中所述组合物是液体制剂。

23.权利要求21的组合物，其中所述组合物是冻干制剂。

24.式X-Y-Z的多肽，其中

X包含选自细胞外受体、抗体可变区、细胞因子、趋化因子或生长因子的多肽；

Y基本由提供5-25氨基酸残基的空间隔离的连接体部分构成；且

Z是IgG重链分子的CH3区。

25.权利要求24的多肽，其中连接体部分是10-100个乙二醇单体残基的低聚物。

26.式X-Y-Z的融合蛋白，其中

Y基本由5-25氨基酸残基多肽构成；且

Z是抗体分子的Fc部分。

27.权利要求26的融合蛋白，其中Fc是IgG Fc。

28.权利要求27的融合蛋白，其中IgG Fc是IgG1 Fc。

29.包含权利要求26的融合蛋白的组合物，其进一步包含一种或多种可药用赋形剂或载体。

30.权利要求29的组合物，其中Z是抗体分子的Fc部分，其是IgG Fc。

31.权利要求29的组合物，其中Z是抗体分子的Fc部分，其是IgG1 Fc。

32.式X-Y-Z的融合蛋白，其中

Y基本由提供5-25氨基酸残基的空间隔离的连接体部分构成；

Z是抗体分子的Fc部分。

33.权利要求32的融合蛋白，其中Fc是IgG Fc。

34.权利要求33的融合蛋白，其中IgG Fc是IgG1 Fc。

35.权利要求32的融合蛋白，其中连接体部分是10-100个乙二醇单体残基的低聚物。

36.包含权利要求32的融合蛋白的组合物，其进一步包含一种或多种可药用赋形剂或载体。

37.权利要求36的组合物，其中Z是抗体分子的Fc部分，其是IgG Fc。

38.权利要求36的组合物，其中Z是抗体分子的Fc部分，其是IgG1 Fc。

39.使多肽X多聚的方法，包括：

多肽X通过多肽Y连接到多肽Z上以形成多肽XYZ，其中

Y基本由5-25氨基酸残基多肽构成，且

Z是IgG重链分子的CH3区；

由此多肽XYZ多聚。

40.权利要求39的方法，其中连接步骤包括构建以单个开放阅读框形式编码各个X、Y和Z的核酸分子，其中所述多肽XYZ由宿主细胞中的核酸构建体表达。

41.使多肽X多聚的方法，包括：

多肽X通过Y部分连接到多肽Z上以形成聚合物XYZ，

Y基本由提供5-25氨基酸残基的空间隔离的连接体部分构成，

Z是IgG重链分子的CH3区；

由此多肽XYZ多聚。

42.权利要求41的方法，其中连接体部分基本由10-100个乙二醇单体残基的低聚物构成。

43.编码权利要求1的融合蛋白的核酸分子。

44.编码权利要求26的融合蛋白的核酸分子。

45.权利要求43或44的核酸，其中X是VEGF-R1(Flt-1)的Ig样结构域2。

46.权利要求43的核酸，其中X是VEGF-R1(Flt-1)的Ig样结构域2，且融合蛋白包含选自SEQ ID NO：8、21或23的序列。

47.权利要求44的核酸，其中X是VEGF-R1(Flt-1)的Ig样结构域2，且融合蛋白包含选自SEQ ID NO：2或25的序列。

48.权利要求1或26的融合蛋白，其中X是VEGF-R1(Flt-1)的Ig样结构域2。

49.权利要求1的融合蛋白，其中X是VEGF-R1(Flt-1)的Ig样结构域2，且融合蛋白包含选自SEQ ID NO：8、21或23的序列。

50.权利要求26的融合蛋白，其中X是VEGF-R1(Flt-1)的Ig样结构域2，且融合蛋白包含选自SEQ ID NO：2或25的序列。

51.包含权利要求43或44的核酸的哺乳动物细胞。

52.权利要求51的哺乳动物细胞，其是人类细胞。

53.权利要求52的哺乳动物细胞，其选自成纤维细胞、肝细胞、内皮细胞、角化细胞、造血细胞、滑膜细胞、上皮细胞、视网膜细胞或干细胞。

54.体外方法，包括：

将权利要求43或44的核酸分子输送到分离的哺乳动物细胞中以形成表达所述融合蛋白的细胞。

55.权利要求54的方法，其中融合蛋白包含选自SEQ ID NO：2、8、21、23或25的序列。

56.权利要求54的方法，进一步包括：

将表达所述融合蛋白的细胞输送给哺乳动物。

57.一种方法，包括：

将权利要求51的哺乳动物细胞输送给哺乳动物。

58.一种方法，包括：

将权利要求43或44的核酸输送给哺乳动物，由此在哺乳动物中表达所述融合蛋白。

59.权利要求58的方法，其中融合蛋白包含选自SEQ ID NO：2、8、21、23或25的序列。

60.权利要求57的方法，其中哺乳动物患有湿性年龄相关性黄斑变性或增生性糖尿病视网膜病变。

61.权利要求58的方法，其中哺乳动物患有癌症。

62.权利要求58的方法，其中哺乳动物患有类风湿性关节炎。

63.权利要求58的方法，其中哺乳动物患有哮喘。

64.权利要求58的方法，其中哺乳动物患有骨关节炎。

65.一种方法，包括：

将权利要求1或26的融合蛋白输送给哺乳动物。

66.权利要求65的方法，其中哺乳动物患有湿性年龄相关性黄斑变性或增生性糖尿病视网膜病变。

67.权利要求65的方法，其中哺乳动物患有癌症。

68.权利要求65的方法，其中哺乳动物患有类风湿性关节炎。

69.权利要求65的方法，其中哺乳动物患有哮喘。

70.权利要求65的方法，其中哺乳动物患有骨关节炎。

71.权利要求65的方法，其中融合蛋白包含选自SEQ ID NO：2、8、21、23或25的序列。