CN103103209B

CN103103209B - 一种家蚕气味结合蛋白BmOBP2的表达纯化方法

Info

Publication number: CN103103209B
Application number: CN201310025720.9A
Authority: CN
Inventors: 张耀洲; 刘玲玲; 杜瑶瑶; 陈剑清; 舒特俊
Original assignee: TIANJIN YAOYU BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: TIANJIN YAOYU BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-01-22
Filing date: 2013-01-22
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2033-01-22
Also published as: CN103103209A

Abstract

本发明涉及一种家蚕气味结合蛋白BmOBP2的表达纯化方法。通过设计引物，构建重组表达载体pET-32a-BmOBP2，诱导表达得到大量重组目的蛋白，重组蛋白经镍离子亲和层析和阴离子交互那层析两步纯化等简易的技术可以得到纯度较高的重组蛋白，为以后研究其三维结构和生物学功能奠定了极其重要的基础，该还方法解决了天然膜蛋白表达量低、难纯化的问题。

Description

一种家蚕气味结合蛋白BmOBP2的表达纯化方法

技术领域

本发明涉及一种家蚕气味结合蛋白BmOBP2的表达纯化方法，属于基因工程蛋白质技术领域。

背景技术

膜蛋白不仅参与和调节细胞的各种代谢活动，还是细胞与外界进行物质能量交换和信号传递的桥梁。绝大多数疾病都是由于某一特定膜蛋白的缺陷而引起的，现在市场上销售的80％的药物都是通过与膜蛋白的结合而起作用的。虽然跨膜蛋白有着如此重要的生物学功能，但是由于其丰度低、疏水性强，具有微观不均一性，分离纯化天然膜蛋白并做结晶具有很大的难度。几乎所有的OBPs中都含有6个保守的半胱氨酸，通过3个二硫桥相连，对OBPs的结构起到加固的作用。由于OBPs除了二硫键的形成不经过翻译后的修饰过程，实验证明异源表达的OBPs与天然OBPs的二硫键的构成配对相同，因此在异源系统中表达的OBPs能够满足对OBPs结构和功能的进一步研究。因此，利用基因工程方法表达重组膜蛋白仍然是BmOBP2的另一条有效的途径。大肠杆菌是膜蛋白表达尝试中最常用的表达宿主，通过对表达载体、宿主菌、培养基和表达条件的筛选，获得膜蛋白的成功表达是膜蛋白研究中极为关键的一步。另外用大肠杆菌表达系统表达膜蛋白有效地解决了天然膜蛋白表达量低、纯化困难的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种家蚕气味结合蛋白BmOBP2的表达纯化方法，通过设计引物，构建重组表达载体pET-32a-BmOBP2，诱导表达得到大量重组目的蛋白，然后经20mM、50mM浓度的咪唑缓冲液洗掉未结合的蛋白，150mM浓度的咪唑缓冲液洗脱目的蛋白，可以得到纯度较高的目的蛋白。

为达到上述目的，本发明提供一种家蚕气味结合蛋白BmOBP2的表达纯化方法，包括以下步骤：

(a) BmOBP2基因的合成；

(b)分别双酶切BmOBP2基因和载体pET-32a，连接构建重组表达载体；

(c)转化表达菌，培养，诱导表达重组目的蛋白；

(d)经镍离子亲和层析纯化以及阴离子交换层析纯化所得重组目的蛋白。

优选地，其中所述步骤(a) 具体包括：

(1)设计上游引物F: 5’- CGCGGATCCATGAAGAGCAAAACAAAAC-3’ (下划线为限制性内切酶BamH I酶切位点)

下游引物R：5’- CCGCTCGAGTTATAGTTCATCTTTAAC-3’(下划线为限制性内切酶Xho I酶切位点)；

(2)以家蚕蚕蛹cDNA为模板，用所设计引物F和R扩增特异性片段，具体程序为：94℃预变性5min，94℃变性1 min，62℃退火45s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸10 min，回收产物得到BmOBP2基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，其中所述步骤(b)具体包括：

BmOBP2基因和pET-32a载体利用限制性内切酶BamH I和Xho I同时进行双酶切，将酶切回收的产物用Ligation High进行连接30min并转化E.coli TG1感受态细胞，挑取长势良好的单菌落摇菌培养后用碱裂法提取重组质粒pET-32a-BmOBP2。

优选地，其中所述步骤(c) 具体包括：

将PCR鉴定和双酶切鉴定正确且测序正确的表达载体转化至E.coli BL21中，得到重组菌，在含50 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃，220 rpm振荡培养至OD₆₀₀=0.5，加入终浓度为1 mM 的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，37℃诱导表达5h，得到重组目的蛋白。

优选地，其中所述步骤(d) 具体包括：

(1)将得到的可溶的融合蛋白通过0.45μm纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱结合，用浓度为20Mm、50mM、80mM、100mM、150mM、200mM、500mM的咪唑缓冲液进行洗涤；

(2)经洗涤条件的摸索(取10ml的上清液与2ml的镍离子亲和层析柱填料结合，反复3次，每次4℃温和震荡孵育10 min，以步骤(1)中所述的咪唑浓度进行洗脱，分别洗涤20ml，其中上述上清液为所述步骤(c)所得重组目的蛋白经超声(超声功率为60%，超声总时间为4s，超1s，停3s)破碎后，4℃，12000rpm离心20 min后的上清液)，用浓度为20mM、50mM的咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，用浓度为150mM的咪唑缓冲液洗脱重组蛋白。

(3)经Ni柱纯化后的融合蛋白经RESOURCE Q(1 mL )阴离子交换层析分离：所用到的阴离子交换层析柱为RESOURCE Q(1 mL)。具体操作步骤如下：

平衡：将RESOURCE Q 阴离子交换层析柱接入蛋白纯化仪 AKTA Explorer 10系统，以Elution Buffer(20 mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris），1 M氯化钠(NaCl)，1%(w:v) 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS），pH 8.0)冲洗10 个柱体积，再以Start Buffer(20 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris），1%(w:v) 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS），pH 8.0)平衡10 个柱体积。如此交替清洗三次，最后用Start Buffer(20 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris），1%(w:v) 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS），pH 8.0)平衡10 个柱体积(10 mL)，为上样做准备。流速设为4 mL/min。平衡至基线水平；

经凝胶过滤层析分离所得样品的各个峰分别用Millipore超滤浓缩管进行浓缩后，分别过0.22 μm滤膜，置于冰上备用；

上样：以2 mL/min的流速将蛋白样品注入2 mL的上样环中(较慢的上样流速有利于蛋白样品与阴离子交换层析树脂的结合)；

平衡：以Start Buffer(20 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris），1%(w:v) 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS），pH 8.0)冲洗，流速 2 mL/min，使未结合的蛋白样品流出，1.5 mL/管收集穿透液，平衡至基线水平；

洗脱：用Elution Buffer(20 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris），1 M 氯化钠(NaCl)，1%(w:v) 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS），pH 8.0)进行盐浓度梯度洗脱，流速4 mL/min；

收集：按峰收集，1.5 mL/管收集洗脱下来的蛋白；

共出现3个峰，进行SDS-PAGE检测。

(4)双向电泳：双向电泳参照GE Healthcare 双向电泳手册操作，将凝胶过滤层析分离后的蛋白样品进行超滤除盐并进行蛋白浓度的测定，取250μg 蛋白样品上样，加入0.625μL IPG Buffer以及水化液(8 mol/L 尿素（Urea），2% (w:v) 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS），0.002% 溴酚蓝，1 mol/L二硫苏糖醇（DTT）至终体积125μL，充分混匀后加入到胶条槽中，将7 cm IPG 干胶条置于其上，并加入少许覆盖油；第一向，胶条主动水化12 h，进行等电聚焦：20℃，电流不超过 50μA/胶条，500 V 30 min，1000 V 1.5 h，5000 V 8000 Vhs。聚焦完成，将胶条分别在含 1%（w:v）二硫苏糖醇（DTT），和含2.5%(w:v)碘乙酰胺的平衡缓冲液(75 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris） pH 8.8，6 mol/L 尿素（Urea），29.3%(v:v)甘油，2%(w:v)十二烷基硫酸钠( SDS)，0.002%(w:v)溴酚蓝)中各平衡15 min。胶条放入预灌好的SDS-PAGE 胶板，加5μL 预染 Marker，用 0.5%(w:v)低熔点琼脂糖固定胶条；第二向SDS-PAGE 电泳：12℃循环水冷却，电泳条件为10 mA衡流电泳15 min后转为20 mA恒流继续电泳5 h，电泳结束后对胶进行考马斯亮蓝染色以备挖点做质谱分析。

优选地，其中所述方法在步骤(a)之前还包括：

经家蚕蚕蛹cDNA文库筛选，筛选出一条家蚕气味结合蛋白BmOBP2，通过SignalP4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对BmOBP2进行信号肽预测，并经TMHMM服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM对该蛋白进行跨膜区分析，得知此蛋白是含有一个跨膜区的膜蛋白。

本发明通过设计引物，构建重组表达载体pET-32a-BmOBP2，诱导表达得到大量重组目的蛋白，经镍离子亲和层析和阴离子交换层析等简易的技术可以得到纯度较高的重组目的蛋白，为以后研究其三维结构和生物学功能奠定了极其重要的基础；膜蛋白的表达和纯化就本身而言是一个世界性的难题，此文用基因工程的手段成功表达了膜蛋白且以可溶性的形式存在，是目前研究膜蛋白的另一种途径；此外，该方法还解决了天然膜蛋白表达量低、难纯化的问题。

附图说明

图1是本发明BmOBP2基因的PCR扩增回收结果图；M：DNA Ladder Mix；1： PCR扩增条带；

图2是本发明重组质粒的PCR和双酶切鉴定图：M：DNA Ladder Mix；1：PCR扩增产物；2：双酶切的产物；

图3 A是本发明重组蛋白表达的SDS-PAGE分析图；M：蛋白分子量标准；1：pET-32a(+)空载诱导对照；2：pET-32a(+)-BmOBP2未诱导对照；3：pET-32a(+)-BmOBP2诱导表达；

图3 B是本发明重组蛋白表达的Western blotting分析图；M：蛋白分子量标准；1：pET-32a(+)空载诱导对照；2：pET-32a(+)-BmOBP2未诱导对照；3：pET-32a(+)-BmOBP2诱导表达；

图4是本发明重组蛋白在上清、沉淀中的分布图；M：蛋白分子量标准；1：pET-32a(+)-BmOBP2未诱导对照；2：pET-32a(+)-BmOBP2诱导表达；3：超声后的上清；4：超声后的沉淀；

图5是本发明重组蛋白在不同浓度下咪唑缓冲液的洗涤图；M：蛋白分子量标准；1：20mM；2：50mM；3：80mM ；4：100mM；5：150mM；6：200mM； 7：500mM；

图6A是本发明重组蛋白的SDS-PAGE分析图；M: 蛋白分子量标准; 1: 经Ni柱纯化后的融合蛋白浓缩后的样品；

图6B是本发明重组蛋白的Western blotting分析图；M: 蛋白分子量标准; 1: 经Ni柱纯化后的融合蛋白浓缩后的样品；

图7是Ni柱纯化后的重组蛋白经RESOURCE Q阴离子交换层析分离色谱图；

图8是Ni柱纯化后的重组蛋白经RESOURCE Q阴离子交换层析分离后经SDS-PAGE检测图；M：低分子量蛋白标准；1：2#洗脱峰；

图9是本发明重组蛋白的双向电泳图；

图10A是本发明重组蛋白的色谱图；

图10B是本发明重组蛋白的一级质谱图；

图10C是本发明重组蛋白的二级质谱图；

图11是本发明重组蛋白的匹配肽段图。

具体实施方式

应该指出，以下具体说明都是事例性的，旨在对本发明提供进一步说明，除非另有说明，本文中使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：引物设计

扩增BmOBP2目的基因，基因序列如SEQ ID NO.1所示，引物设计如下：

上游引物F: 5’- CGCGGATCCATGAAGAGCAAAACAAAAC-3’ (下划线为限制性内切酶BamH I酶切位点)，如SEQ ID NO.3所示；

下游引物R： 5’- CCGCTCGAGTTATAGTTCATCTTTAAC-3’(下划线为限制性内切酶Xho I酶切位点) ，如SEQ ID NO.4所示；

实施例2：pET-32a-BmOBP2重组表达载体的构建

(1)以家蚕蚕蛹cDNA为模板，用实施例1所设计引物F和R扩增特异性片段，具体程序为： 94℃预变性5min，94℃变性1 min，62℃退火45s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸10 min，回收产物得到BmOBP2基因(见图1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在50μL离心管中，加入下列组分：

ddH₂O 32.5μL

TAQ Buffer 5μL

2mM dNTPs 5μL

F 1.5μL

R 1.5μL

cDNA 3μL

TAQ Polymerase(2U/μL) 1.5μL

各组分混合均匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时割胶回收目的片段；

(2)将PCR割胶回收产物和pET-32a载体利用限制性内切酶BamH I(购自Fermentas公司)和Xho I(购自Fermentas公司)同时进行双酶切，将酶切回收的产物用Ligation High(购自 TOYOBO)室温连接30min，并转化到E.coli TG1感受态细胞(购自Fermentas公司)中；挑取长势良好的单菌落摇菌培养后利用碱裂法抽提重组质粒，用PCR和双酶切进行鉴定，挑选pET-32a-BmOBP2重组表达载体，将重组好的表达载体进行双酶切、PCR鉴定如图2所示，说明克隆成功，并送华大基因测序，其结果与预期相同。

实施例3：重组蛋白的表达

将实施例2重组好的表达载体转化至E.coli BL21(购自Fermentas公司)中得到重组菌，在含50 mg/mL氨苄青霉素(上海恒远生物科技有限公司)的LB培养基(购自Oxoid公司)中37℃，220 rpm振荡培养至OD₆₀₀≈0.5，加入异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(终浓度 1 mM)，37℃诱导培养5h，取1.5mL菌液12000rpm离心后，将沉淀加入50μL20mM 三羟甲基氨基甲烷（Tris） (pH 8.0)重悬，然后取40μL，加入10μL 5×上样缓冲液，于100℃煮10min，然后在12000rpm下离心5min得到重组蛋白样品，取15μL进行SDS-PAGE，结果如图3A所示，表明利用上述方法成功表达了含有HIS标签的重组蛋白且表达量很高，并进行Western blotting鉴定，如图3B所示。

将重组菌扩大培养，超声(超声的目的是为了让菌体破碎，释放出包裹在里面的蛋白)后分别取上清和沉淀制备蛋白样品，进行SDS-PAGE，如图4所示，结果说明该重组蛋白是以可溶的形式存在于缓冲液中。

实施例4：重组目的蛋白的纯化

(1)将实施例3收集的上清中的可溶的重组目的蛋白通过0.45μm纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱(购自GE Healthcare)结合，用浓度为20 mM、50 mM、80 mM、100 mM、150 mM、200 mM、500 mM的咪唑缓冲液进行洗涤，分别取不同浓度的咪唑缓冲液的洗脱液制备蛋白样品，走SDS-PAGE，结果如图5所示，说明20 mM、50 mM浓度的咪唑缓冲液可以洗去几乎所有与镍柱未结合的蛋白，150 mM浓度的咪唑缓冲液就可以洗下重组蛋白。

(2)经洗涤条件的摸索，SDS-PAGE发现，用浓度为20 mM、50 mM的咪唑缓冲液可以洗脱未结合在柱子上的杂蛋白，用浓度为150 mM的咪唑缓冲液可以洗脱下所有的重组目的蛋白且纯度很高，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE分析，如图6A所示，并经Western Blotting鉴定，如图6B所示(图6A、图6B所选的洗脱杂蛋白的咪唑条件是以实施例3中的洗脱条件为基础的，图6A、图6B表明重组蛋白可以通过镍离子亲和层析柱一步纯化可得到纯度较高的目的蛋白)。

平衡：将RESOURCE Q 阴离子交换层析柱接入蛋白纯化仪 AKTA Explorer 10系统，以Elution Buffer(20 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris），1 M 氯化钠(NaCl)，1%(w:v)3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS），pH 8.0)冲洗10 个柱体积，再以Start Buffer(20 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris），1%(w:v)3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS），pH 8.0)平衡10 个柱体积；如此交替清洗三次，最后用Start Buffer(20 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris），1%(w:v) 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS），pH 8.0)平衡10 个柱体积(10 mL)，为上样做准备。流速设为4 mL/min，平衡至基线水平；

收集：按峰收集，1.5 mL/管收集洗脱下来的蛋白；

共出现3个峰，如图7所示，进行SDS-PAGE检测如图8所示。

(4)双向电泳：双向电泳参照GE Healthcare 双向电泳手册操作，将凝胶过滤层析分离后的蛋白样品进行超滤除盐并进行蛋白浓度的测定，取250μg 蛋白样品上样，加入0.625μL IPG Buffer以及水化液(8 mol/L 尿素（Urea），2%(w:v) 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS），0.002%(w:v)溴酚蓝，1 mol/L 二硫苏糖醇（DTT）) 至终体积125μL，充分混匀后加入到胶条槽中，将7 cm IPG 干胶条置于其上，并加入少许覆盖油。第一向，胶条主动水化12 h，进行等电聚焦：20℃，电流不超过 50μA/胶条，500 V 30 min ，1000 V 1.5 h，5000 V 8000 Vhs。聚焦完成，将胶条分别在含 1%二硫苏糖醇（DTT）和含2.5% (v:v)碘乙酰胺的平衡缓冲液(75mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）-Cl pH 8.8，6 mol/L 尿素（Urea），29.3%（v:v）甘油，2%（w:v）SDS，0.002%（w:v）溴酚蓝)中各平衡15 min。胶条放入预灌好的SDS-PAGE 胶板，加 5μL预染 Marker，用 0.5%（w:v）低熔点琼脂糖固定胶条。第二向SDS-PAGE 电泳：12℃循环水冷却，电泳条件为10 mA衡流电泳15 min后转为20 mA恒流继续电泳5 h。电泳结束后对胶进行考马斯亮蓝染色以备挖点做质谱分析。双向电泳图如图9所示。

实施例5：重组目的蛋白的LTQ质谱鉴定

重组目的蛋白经挖点经LTQ质谱鉴定如图10A、图10B、图10C所示，通过西南大学膜蛋白库比对得到匹配的肽段（见图11），结果表明所表达的未知重组蛋白确定为家蚕气味结合蛋白BmOBP2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明通过设计引物，构建重组表达载体pET-32a-BmOBP2，诱导表达得到大量重组目的蛋白，重组蛋白经镍离子亲和层析和阴离子交换层析等纯化可以得到纯度较高的重组蛋白，为以后研究其三维结构和生物学功能奠定了极其重要的基础；此外，该方法还解决了天然膜蛋白表达量低、难纯化的问题。

以上所述，仅为本发明的实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做若干的改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津耀宇生物技术有限公司

<120> 一种家蚕气味结合蛋白BmOBP2的表达纯化方法

<130> 130050-I-CP-TJYU

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 633

<212> DNA

<213> 家蚕气味结合蛋白BmOBP2基因

<400> 1

atgaagagcaaaacaaaacgtgcgcgggaaaatcgtcagaccgccaatatggccgtgtcggaaatttctagaattttaacgtttttaactatcgtgtcattcatatacatcgtttactcatttaagccgctcactaaagatgaacatatcgagagatataataaaatgaacgaagacattgaaccgtttagaaaaaatttgacagaatgcgctcgtcaagtcaaagcttccatggcggacgtcgagaagtttcttaaacgaataccacagtcgaatatggaggggaaatgtttcgtggcttgcattctcaaacggaattcgcttataaaaaacaataaattgagccaggagaatcttcttgaagtaaacagggctgtgtacggtgacgacagcgaagttatgtcccgcctcaagacagccattttagaatgttcaaaaatcgttgaagatatatttgaaatttgcgaatacgcttcagttttcaacgattgcatgcatatgaaaatggaacatatactcgataaaataactatggaaagaaggatggaggctttagggcagatgtcttcaaatcccgatgaatggagcgaggaagaagatgaaatgttaaaacttgttaaagatgaactataa

<210> 2

<211> 211

<212> PRT

<213> 家蚕气味结合蛋白BmOBP2

<400> 2

Met Lys Ser Lys Thr Lys Arg Ala Arg Glu Asn Arg Gln Thr Ala

1 5 10 15

Asn Met Ala Val Ser Glu Ile Ser Arg Ile Leu Thr Phe Leu Thr

20 25 30

Ile Val Ser Phe Ile Tyr Ile Val Tyr Ser Phe Lys Pro Leu Thr

35 40 45

Lys Asp Glu His Ile Glu Arg Tyr Asn Lys Met Asn Glu Asp Ile

50 55 60

Glu Pro Phe Arg Lys Asn Leu Thr Glu Cys Ala Arg Gln Val Lys

65 70 75

Ala Ser Met Ala Asp Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ile Pro Gln

80 85 90

Ser Asn Met Glu Gly Lys Cys Phe Val Ala Cys Ile Leu Lys Arg

95 100 105

Asn Ser Leu Ile Lys Asn Asn Lys Leu Ser Gln Glu Asn Leu Leu

110 115 120

Glu Val Asn Arg Ala Val Tyr Gly Asp Asp Ser Glu Val Met Ser

125 130 135

Arg Leu Lys Thr Ala Ile Leu Glu Cys Ser Lys Ile Val Glu Asp

140 145 150

Ile Phe Glu Ile Cys Glu Tyr Ala Ser Val Phe Asn Asp Cys Met

155 160 165

His Met Lys Met Glu His Ile Leu Asp Lys Ile Thr Met Glu Arg

170 175 180

Arg Met Glu Ala Leu Gly Gln Met Ser Ser Asn Pro Asp Glu Trp

185 190 195

Ser Glu Glu Glu Asp Glu Met Leu Lys Leu Val Lys Asp Glu Leu

200 205 210

Ter

211

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物

<400> 3

Cgcggatccatgaagagcaaaacaaaac

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物

<400> 4

ccgctcgagttatagttcatctttaac

Claims

1.一种家蚕气味结合蛋白BmOBP2的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)BmOBP2基因的合成：(1)设计上游引物F: 5’-CGCGGATCCATGAAGAGCAAAACAAAAC-3’，下划线为限制性内切酶BamHⅠ酶切位点；下游引物R： 5’-CCGCTCGAGTTATAGTTCATCTTTAAC-3’，下划线为限制性内切酶XhoⅠ酶切位点； (2)以家蚕蚕蛹cDNA为模板，用所设计引物F和R扩增特异性片段，程序为：94℃预变性5min，94℃变性1 min，62℃退火45s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸10 min，回收产物得到BmOBP2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(b)构建重组表达载体：BmOBP2基因和pET-32a载体利用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ同时进行双酶切，将酶切回收的产物用Ligation High室温连接30min，并转化E.coli TG1感受态细胞，挑取单菌落摇菌培养后提取重组表达载体pET-32a-BmOBP2；

(c)转化表达菌，培养，诱导表达重组目的蛋白：将PCR鉴定和双酶切鉴定正确且测序正确的表达载体转化至E.coli BL21(DE3)中，得到重组菌，在含50 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃，220 rpm振荡培养至OD₆₀₀=0.5，加入终浓度为1 mM 的异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷，37℃诱导表达5h，得到重组目的蛋白His-BmOBP2；

(d)纯化目的蛋白：(1)将得到的可溶的重组蛋白通过0.45μm纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱结合，用浓度为20Mm、50mM、80mM、100mM、150mM、200mM、500mM的咪唑缓冲液进行洗涤；(2)经纯化条件的摸索，用浓度为20 mM、50 mM的咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，用浓度为150 mM的咪唑缓冲液洗脱重组目的蛋白His-BmOBP2。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中的重组表达载体pET-32a- BmOBP2通过碱裂法提取重组质粒。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)中纯化条件的摸索的具体操作为：取10ml的上清液与2ml的镍离子亲和层析柱填料结合，反复3次，每次4℃温和震荡孵育10 min，以所述步骤(1)中所述不同浓度的咪唑缓冲液进行洗脱，分别洗涤20ml；其中上述上清液为所述步骤(c)所得重组目的蛋白经超声破碎后，4℃，12000rpm离心20 min后的上清液。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)中超声功率为60%，超声总时间为4s。