CN106191086A

CN106191086A - 蚕类蜕皮激素受体EcR/USP蛋白复合物的表达及纯化的方法

Info

Publication number: CN106191086A
Application number: CN201510224941.8A
Authority: CN
Inventors: 吴桃利; 王涛; 汪俊; 陈春麟
Original assignee: China Pharmaceutical University; Shanghai Medicilon Inc
Current assignee: China Pharmaceutical University; Shanghai Medicilon Inc
Priority date: 2015-05-05
Filing date: 2015-05-05
Publication date: 2016-12-07

Abstract

本发明涉及蚕类蜕皮激素受体EcR/USP蛋白复合物的表达及纯化的方法，包括以下步骤：构建USP-pET-28a(+)重组载体和EcR-pET21b-MDX12重组载体；将所述USP-pET-28a(+)重组载体和EcR-pET21b-MDX12重组载体转化表达菌，培养，诱导表达重组目的蛋白复合物；将所得的重组目的蛋白复合物经镍离子亲和层析及分子筛层析进行纯化。本发明通过构建重组表达载体EcR-pET21b-MDX12、USP-pET-28a(+)，将两个载体进行共转，诱导两种蛋白的共表达，从而得到大量的重组目的蛋白复合物，然后经镍离子亲和层析柱和分子筛分离纯化可以得到纯度较高的目的蛋白。

Description

蚕类蜕皮激素受体EcR/USP蛋白复合物的表达及纯化的方法

技术领域

本发明涉及家蚕蜕皮激素受体(ecdysterod receptor，EcR)及超气门蛋白(ultraspiracle，USP)蛋白复合物的表达及纯化方法。

背景技术

昆虫由幼虫发育为成虫的形态变化过程称为变态(Metamorphosis)，蚕属于完全变态的昆虫，在蚕的发育过程中，要经历卵、幼虫、蛹、成虫(蛾)四个发育阶段才能完成生命周期。在蚕的生长发育过程中，要经过多次蜕皮才能成熟。蚕的蜕皮过程包括：胚胎孵化蜕皮、幼虫各年龄期间的蜕皮以及从幼虫到蛹和蛹到成虫的蜕皮。蚕的蜕皮和变态发育主要受体内蜕皮激素的控制，20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)是由包括昆虫类和甲壳类在内的节肢动物分泌的一种甾体类蜕皮激素，在蜕皮和蜕变的发展过渡阶段以及细胞分化和生殖的过程中起着重要的调节作用。

20E的作用靶标由蜕皮激素接受子(ecdysteroid receptor，EcR)和过剩气门蛋白(ultraspiracle，USP)组成，两者都是蜕皮激素受体超家族的成员，前者包括5个特征结构域，分别为A/B域(转录激活域transactivation domain)、C域(DNA结合域DNA-bindingdomain，DBD)、D域(铰链域hinge region)、E域(配体结合域ligand binding domain，LBD)和F域5部分组成，各部分都具有特殊的结构和功能。

只有EcR和USP形成异二聚体后，蜕皮激素才能结合在EcR上形成蜕皮激素-EcR/USP三聚体，然后结合在DNA上，诱导产生蜕皮调节转录因子，由蜕皮调节转录因子再调控蜕皮级联反应的相关基因族的表达。EcR与USP的异源二聚体复合物对配体和DNA的高亲和力有着极其重要的作用，EcR的空间结构具有很强的柔韧性和适应性，USP与EcR结合后起到稳定EcR配体结合域(LBD)空间结构的作用。

目前已有20余种昆虫的EcR、USP被同时或单独克隆测序，并且大多已在细菌、酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞系中实现了离体表达和提取纯化。研究表明在细菌、酵母、昆虫细胞系中表达的EcR和USP蛋白，无论其粗提液，还是纯化蛋白，均可用于活性筛选及三维结构研究。目前家蚕EcR基因(BmEcR，GeneBank登录号：692756)和USP基因(BmUSP，GeneBank登录号：U06073)已经被克隆和测序。但是，目前还没有家蚕EcR/USP蛋白复合物的表达及纯化方法。

因此有必要建立一种家蚕EcR/USP蛋白复合物表达及纯化方法，从而可以利用该方法指导进一步的活性筛选及三维结构研究。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种家蚕蜕皮激素受体EcR/USP蛋白复合物的表达及纯化方法。

为达到上述目的，本发明提供一种蚕类蜕皮激素受体EcR/USP蛋白复合物的表达及纯化方法，包括以下步骤：

(a)构建USP-pET-28a(+)重组载体和EcR-pET21b-MDX12重组载体；

(b)将所述USP-pET-28a(+)重组载体和EcR-pET21b-MDX12重组载体转化表达菌，培养，诱导表达重组目的蛋白复合物；

(c)将所得的重组目的蛋白复合物经镍离子亲和层析及分子筛层析进行纯化。

本发明通过构建重组表达载体EcR-pET21b-MDX12、USP-pET-28a(+)，将两个载体进行共转，诱导两种蛋白的共表达，从而得到大量的重组目的蛋白复合物，然后经镍离子亲和层析柱和分子筛分离纯化可以得到纯度较高的目的蛋白，为以后研究其三维功能和生物学功能奠定了及其重要的基础，本发明还解决了蚕蜕皮激素受体蛋白可溶性差、难纯化的问题。

较佳地，步骤(a)中，构建USP-pET-28a(+)重组载体包括以下步骤：

(a-1)设计上游引物F：5'CCGGAATTCATGCATCCCAGCAGCTCTGTAC 3'，其中下划线部分为限制性内切酶EcoR Ⅰ酶切位点、和

下游引物R：5'GGGTTCGAAGGCCTTAAGTTACATGATGTTGG 3'，其中下划线部分为限制性内切酶Hind Ⅲ酶切位点；

(a-2)以蚕类USP基因为模板，用所设计的引物F和R扩增特异性片段，胶回收产物USP基因，所述USP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(a-3)将PCR割胶回收产物和pET-28a(+)载体利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ同时进行双酶切，将酶切产物用T4连接酶连接并转化E.col TOP10感受态细胞，挑取长势良好的单菌落培养后提取重组质粒USP-pET-28a(+)。

较佳地，步骤(a)中，构建EcR-pET21b-MDX12重组载体包括以下步骤：

(a-1’)设计上游引物F-1：

5'GGTACCGAGAACCTGTACTTCCAATCCAAGAACATACCACCATTGTCG 3'，其中下划线部分为限制性内切酶KpnI酶切位点，斜体部分为TEV酶碱基序列、和

下游引物R-1：5'CTCGAGTTATAGCACCACCGGGTTG 3'，其中下划线部分为限制性内切酶XhoI酶切位点；

(a-2’)以蚕类EcR基因为模板，所述蚕类EcR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，利用引物F-1和R-1添加5’KpnI、TEV、3’TAA和3’XhoI，构建基因KpnI-TEV-EcR-XhoI；

(a-3’)设计无缝(infusion)克隆上游引物F-2：

5'GTGCCAGGCGGTTCT GGTACCGAGAACCTGTACTTC 3'，其中下划线部分为与线性载体互补序列、和

下游无缝克隆引物R-2：

5'GTGGTGGTGGTGGTG CTCGAGTTATAGCACCACCG 3'，其中下划线部分为与线性载体互补序列；

(a-4’)利用通过引物F-1、R-1进行PCR扩增的产物为模板扩增目的片段，同时用KpnI和XhoI两种酶线性化载体pET21b-MDX12，将目的DNA片段和线性化载体按摩尔比为3:1的比例进行重组反应，反应完成后将产物转化E.col TOP10感受态细胞，挑取长势良好的单菌落培养后进行菌落PCR；

(a-5’)将PCR、双酶切鉴定正确且测序正确的菌落摇菌培养后提取重组质粒EcR-pET21b-MDX12。

较佳地，在步骤(a-3)和/或步骤(a-5’)中，用碱裂解法提取重组质粒。

较佳地，步骤(b)中，将所述USP-pET-28a(+)重组载体和EcR-pET21b-MDX12重组载体转化表达菌包括以下步骤：

将构建好的且测序正确的表达载体USP-pET-28a(+)转化宿主菌，得到第一重组菌，并制备第一重组菌的感受态；

用EcR-pET21b-MDX12转化第一重组菌的感受态，得到第二重组菌。

较佳地，所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)、plysS、或Rossetta(DE3)，优选为E.coliBL21(DE3)。

较佳地，通过CaCl₂法制备第一重组菌的感受态。

较佳地，步骤(b)中，培养，诱导表达重组目的蛋白复合物包括以下步骤：

在含50μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素的LB培养基中37℃，180rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为3mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，16℃诱导表达过夜，得到重组蛋白。

较佳地，步骤(b)中，重组蛋白EcR/USP蛋白复合物的表达为共表达。

较佳地，步骤(c)中，纯化包括以下步骤：

(c-1)将收集的菌体超声破碎后，将得到的可溶性重组目的蛋白复合物经离心后，与镍离子亲和层析柱结合，用不同浓度的咪唑缓冲液进行洗脱；

(c-2)经镍柱纯化后的重组蛋白复合物超滤浓缩，过分子筛进行分离纯化。

较佳地，步骤(c-1)中，咪唑缓冲液的浓度依次为20mM、50mM、100mM、250mM。

较佳地，步骤(c-2)中，分子筛为Superdex^TM200 16/60。

较佳地，在将重组目的蛋白复合物纯化后，还包括蛋白活性测定步骤。

较佳地，所述蛋白活性测定步骤包括：用经0.22μM纤维素膜过滤过的与样品一致的缓冲液清洗样品池等，20E溶液20次注射到ITC池中，滴定EcR/USP蛋白复合体溶液，收集数据并矫正原始数据，矫正后的数据非线性回归得出热力学参数。

较佳地，所述滴定是用1mM的20E滴定100μM的EcR/USP蛋白复合体。

附图说明

图1USP PCR扩增结果的图；

图2USP PCR产物和载体pET-28a(+)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切图；

图3USP-pET-28a(+)菌落PCR的图；

图4USP-pET-28a(+)酶切鉴定图；

图5EcR第一次PCR扩增结果的图；

图6EcR第二次PCR扩增结果的图；

图7pET21b-MDX12双酶切结果的图；

图8EcR-pET21b-MDX12菌落PCR的图；

图9EcR-pET21b-MDX12酶切鉴定图；

图10表达测试图；

图11镍离子亲和层析图；

图12镍离子亲和层析结果SDS-PAGE图；

图13S200分子筛层析图；

图14S200分子筛结果SDS-PAGE图；

图15ITC图。

具体实施方式

以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明通过构建重组表达载体EcR-pET21b-MDX12、USP-pET-28a(+)，将两个载体进行共转，诱导两种蛋白的共表达，从而得到大量的重组目的蛋白复合物，然后经镍离子亲和层析柱和分子筛分离纯化可以得到纯度较高的目的蛋白。

USP-pET-28a(+)重组载体的构建可以采用双酶切法，具体地，可以包括以下步骤：

(1)USP密码子优化及基因合成；

(2)设计上游引物F：5'CCGGAATTCATGCATCCCAGCAGCTCTGTAC 3'(下划线部分为限制性内切酶EcoR Ⅰ酶切位点)

下游引物R：5'GGGTTCGAAGGCCTTAAGTTACATGATGTTGG 3'(下划线部分为限制性内切酶Hind Ⅲ酶切位点)；

(3)以蚕类USP基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)为模板，用所设计的引物F和R扩增特异性片段，扩增的具体程序可为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸30s，72℃延伸10min，扩增完成后胶回收产物USP基因；

(4)将USP基因和pET-28a(+)载体利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ同时进行双酶切，将酶切回收的产物用T4连接酶连接过夜并转化E.col TOP10感受态细胞，挑取长势良好的单菌落培养后进行菌落PCR；

(5)将PCR鉴定和双酶切鉴定正确且测序正确的菌落摇菌培养后提取重组质粒USP-pET-28a(+)，提取方法包括但不限于碱裂解法。

EcR-pET21b-MDX12重组载体的构建可以采用无缝克隆法，具体地，可以包括以下步骤：

(1)EcR密码子优化及基因合成；

(2)设计上游引物F-1：

5'GGTACCGAGAACCTGTACTTCCAATCCAAGAACATACCACCATTGTCG 3'(下划线部分为限制性内切酶KpnI酶切位点，斜体部分为TEV酶碱基序列)

下游引物R-1：

5'CTCGAGTTATAGCACCACCGGGTTG 3'(下划线部分为限制性内切酶XhoI酶切位点)；

(3)以蚕EcR基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)为模板，利用引物添加5’KpnI、TEV、3’TAA和3’XhoI，构建基因KpnI-TEV-ECR-XhoI；

(4)设计无缝克隆上游引物F-2：

5'GTGCCAGGCGGTTCT GGTACCGAGAACCTGTACTTC 3'(下划线部分为与线性载体互补序列)

无缝克隆下游引物R-2：

5'GTGGTGGTGGTGGTG CTCGAGTTATAGCACCACCG 3'(下划线部分为与线性载体互补序列)；

(5)利用引物F-1、R-1的PCR产物为模板扩增目的片段，同时用KpnI和XhoI两种酶线性化载体pET21b-MDX12，将目的DNA片段和线性化载体以3:1的比例进行重组反应(例如将反应体系37℃反应15min、50℃反应15min)，完成后将产物转化E.col TOP10感受态细胞，挑取长势良好的单菌落培养后进行菌落PCR；

(6)将PCR鉴定且测序正确的菌落摇菌培养后用碱裂解法提取重组质粒EcR-pET21b-MDX12。

将所构建的EcR-pET21b-MDX12重组载体和USP-pET-28a(+)共转化表达菌。例如，可以先将USP-pET-28a(+)转化宿主菌，得到第一重组菌并将其制备成感受态后，再用EcR-pET21b-MDX12转化第一重组菌感受态，得到第二重组菌；也可以先用EcR-pET21b-MDX12转化，再用USP-pET-28a(+)转化。感受态的制备可以采用CaCl₂法。

宿主菌可为E.coli BL21(DE3)、plysS、或Rossetta(DE3)。另外，可以通过表达测试来选择更加合适的宿主菌及培养条件。例如，可以通过如下步骤来选择：

将构建好的且测序正确的表达载体USP-pET-28a(+)转化E.coli BL21(DE3)、plysS、Rossetta(DE3)等宿主菌，得到重组菌，并用CaCl₂法分别制备USP-pET-28a(+)in E.coliBL21(DE3)、plysS、Rossetta(DE3)感受态，然后用EcR-pET21b-MDX12分别转化USP-pET-28a(+)in E.coli BL21(DE3)、plysS、Rossetta(DE3)感受态，得到重组菌，挑选单菌落，在含50μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素的5ml LB培养基中37℃，250rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为3mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，16℃诱导表达过夜，并设置诱导前对照组，即对照组不加IPTG诱导；

各取2ml诱导前和诱导后的菌液，离心弃上清，菌体分别用400μl PBS混悬，取50μl诱导前溶液作为诱导前对照样品，取50μl诱导后溶液作为诱导后全菌样品。诱导后样品超声破碎仪冰浴超声破碎，超6次，每次1s，间隔5s，功率400W，破碎后菌液将破碎后的菌液12000rpm，4℃，离心5min，分别上清和沉淀制备蛋白质样品，SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。最终选择BL21(DE3)为宿主菌进行扩大培养及表达纯化。

对第二重组菌进行培养，诱导表达重组目的蛋白。在一个示例中，包括以下步骤：取100μl甘油菌，转接至100ml含抗生素的LB中，37℃250rpm培养过夜。第二天，取20ml种子液加入2L含抗生素LB中(1％接种)，37℃180rpm培养至OD₆₀₀0.6后，0.3mMIPTG16℃诱导过夜。收菌，5000rpm×10min离心，弃上清，收集菌体。

将收集到的菌体进行分离纯化，以得到高纯度的重组目的蛋白。优选地，经镍离子亲和层析柱和分子筛进行纯化。在一个示例中，分离纯化包括以下步骤：

(1)将收集的菌体超声破碎后，将得到的可溶性重组目的蛋白复合物离心。例如可以将收集的菌体用10倍体积的裂解液(50mM Tris-HCl，PH8.0，300mM NaCl，10％甘油(Glycerol))重悬，超声破碎仪冰浴超声破碎30min，超3s，间隔6s，功率400W。4℃12000rpm离心30min；

(2)离心后的上清与镍离子亲和层析柱结合，然后用不同浓度的含有咪唑的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，PH8.0，300mM NaCl，10％Glycerol，250mM咪唑(Imidazole))进行梯度洗脱。经纯化条件的摸索，用浓度为20mM、50mM、100mM的咪唑缓冲液可以洗去非特异性结合在柱子上的杂蛋白，用250mM的咪唑缓冲液可以洗脱下所有的重组目的蛋白且纯度很高，洗脱样品跑SDS-PAGE凝胶电泳显示重组目的蛋白复合物在含250mM咪唑的洗脱缓冲液中被洗脱下来。因此，可以使用20mM、50mM、100mM、250mM的咪唑缓冲液进行梯度洗脱；

(3)经Ni柱纯化过后的重组蛋白复合物经超滤浓缩后，过分子筛进行分离纯化。超滤浓缩可以使用50ml的Millipore超滤浓缩管浓缩至2ml。分子筛可以选用superdex 200。具体地，可以包括以下步骤：

平衡：将superdex 200分子筛层析柱接入蛋白纯化仪AKTA Explorer系统用洗脱缓冲液(elution buffer)(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，150Mm KCl，5％Glycerol，pH8.0)平衡一个柱体积，平衡至基线平衡；

上样：用2ml注射器将蛋白质样品注入2ml上样环中；

洗脱：用洗脱缓冲液(elution buffer)(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，150Mm KCl，5％Glycerol，pH8.0)进行洗脱，流速1ml/min；

收集：按峰收集，2ml/管收集洗脱下来的蛋白；

收集的蛋白进行SDS-PAGE检测。

获得EcR/USP蛋白复合物后，还可以对其进行活性测定。例如可以采用等温滴定量热法(ITC)。在一个示例中，活性测定包括以下步骤：用1mM的20E滴定100μM的EcR/USP蛋白复合体(两者buffer完全一致)，首先用0.22μM纤维素膜过滤过的透析液清洗样品池等，20E溶液20次注射到ITC池的缓冲溶液中，滴定EcR/USP蛋白复合体溶液，滴定的蛋白溶液体积至少40μl，被滴定的溶液体积至少200μl。每个注射峰下方的区域与注射所释放的总热量相等。当这种综合的热量相对添加到池中的配体摩尔比作图时，就获得了相互作用的完整结合等温线注射所释放的总热量相等。当这种综合的热量相对添加到池中的配体摩尔比作图时，就获得了相互作用的完整结合等温线。

本发明通过构建重组表达载体USP-pET-28a(+)、EcR-pET21b-MDX12，并通过共转诱导表重组目的蛋白复合体的共表达，得到大量的重组蛋白，经镍离子亲和层析和分子筛层析等简易技术可以得到纯度较高的重组目的蛋白，为以后研究其三维结构和生物学功能奠定了及其重要的基础。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：USP-pET-28a(+)、EcR-pET21b-MDX12重组载体构建

＜pET-28a-USP重组载体构建＞

(1)引物设计

扩增USP基因，基因序列如SEQ ID NO.1所示，引物设计如下：

上游引物F：5'CCGGAATTCATGCATCCCAGCAGCTCTGTAC 3'(下划线部分为限制性内切酶EcoR Ⅰ酶切位点)

下游引物R：5'GGGTTCGAAGGCCTTAAGTTACATGATGTTGG 3'(下划线部分为限制性内切酶Hind Ⅲ酶切位点)

(2)重组载体构建

以蚕类USP为模板，用所设计的引物F和R扩增特异性片段，具体程序为：

最后胶回收得到产物USP基因(见图1)；

(3)在PCR管中，加入下列组分

各组分混合均匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环；

(4)将PCR割胶回收产物和pET-28a(+)载体利用限制性内切酶EcoR Ⅰ(购自Takara公司)和Hind Ⅲ(购自Takara公司)同时进行双酶切(见图2)，将酶切产物用T4连接酶连接过夜，并转化E.col TOP10感受态细胞，挑取长势良好的单菌落培养后利用碱裂解法抽提重组质粒，用双酶切和PCR鉴定(如图3、4所示)，说明克隆成功，并送上海美吉生物医药科技有限公司测序，与预期结果相同。

＜EcR-pET21b-MDX12重组载体构建＞

(1)设计上游引物F-1：

下游引物R-1：

(2)从模板中扩增基因ECR，利用引物添加5’KpnI、TEV-tag、3’TAA和3’XhoI，PCR反应组分同USP，具体程序如下

(3)设计无缝克隆上游引物F-2：

下游无缝克隆引物R-2：

利用引物F-1、R-1的PCR产物为(见图5)为模板扩增目的片段(见图6)

(4)同时用KpnI和XhoI两种酶线性化载体pET21b-MDX12，将目的DNA片段和线性化载体以3:1的比例进行重组反应，反应体系如下：

将反应体系37℃反应15min、50℃反应15min，完成后将产物转化E.col TOP10感受态细胞，挑取长势良好的单菌落培养挑取长势良好的单菌落培养后利用碱裂解法抽提重组质粒，用双酶切和PCR鉴定(如图7、8所示)，说明克隆成功，并送上海美吉生物医药科技有限公司测序，与预期结果相同。

实施例2：重组蛋白表达测试

将构建好的重组质粒USP-pET-28a(+)转化至E.coli BL21(DE3)、plysS、Rossetta(DE3)(均由实验室自制)宿主菌感受态中，1μl的质粒转化100μl的感受态细胞，冰浴30min，热激90s，冰浴2min，加500μl LB培养基(无抗)，37℃，250rpm震荡1h，取50μl涂板(50μg/ml卡那霉素)，37℃恒温培养箱过夜得到重组菌；

次日，CaCl₂法制备USP-pET-28a(+)in E.coli BL21(DE3)、plysS、Rossetta(DE3)感受态。分别挑单克隆，在含50μg/ml的卡那霉素的5ml LB培养基中37℃，250rpm震荡过夜；取100μl培养液，转接至100ml含抗生素的LB中，37℃250rpm培养至OD₆₀₀至0.4；将菌液转移至50ml EP管中，冰上放置10min；4℃，4000rpm，离心10min，倒出培养基；用0.1MCaCl₂-MgCl₂溶液30mL重悬细胞沉淀，冰上放置30min；4℃，4000rpm，离心10min，倒出上清液；用2ml预冷0.1MCaCl₂-15％甘油重选细胞沉淀，将其100μl管分装至灭菌EP管中，-80℃冻存；

用重组质粒EcR-pET21b-MDX12分别转化USP-pET-28a(+)in E.coli BL21(DE3)、plysS、Rossetta(DE3)感受态(转化方法同上，固体培养基含50μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素)，得到重组菌。分别挑单克隆，在含50μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素的5mlLB培养基中37℃，250rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为3mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，16℃诱导表达过夜，并设置诱导前对照组，即对照组不加IPTG诱导；

各取2ml诱导前和诱导后的菌液，离心弃上清，菌体分别用400μlPBS混悬，取50μl诱导前溶液作为诱导前对照样品，取50μl诱导后溶液作为诱导后全菌样品。诱导后样品超声破碎仪冰浴超声破碎，超6次，每次1s，间隔5s，功率400W，破碎后菌液将破碎后的菌液12000rpm，4℃，离心5min，取上清50μl，作为上清样品；将沉淀用400μlPBS溶解，作为沉淀样品；各样品分别加等体积的2×SDS Loading Buffer，加热煮沸5min，跑SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。结果如(图10所示)，表明利用上述方法成功表达了蚕类蜕皮激素受体EcR/USP蛋白复合物且表达量很高，且重组蛋白复合物是以可溶的形式存在于缓冲液中。最终选择BL21(DE3)为宿主菌进行扩大培养及表达纯化。

实施例3重组蛋白扩大表达及纯化

取100μl种子液，转接至100ml含抗生素(终浓度为50μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素)的LB中，37℃250rpm培养过夜。第二天，取20ml培养液加入2L含抗生素LB培养基中(1％接种，含终浓度为50μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素)，37℃180rpm培养至OD₆₀₀为0.6后，0.3mM IPTG16℃诱导过夜。收菌，4℃，5000rpm，10min离心，弃上清，收集菌体；

菌体用十倍体积的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，10％Glycerol，PH8.0)重悬，超声破碎仪超声破碎30min，超3s，间隔6s，功率400W。4℃12000rpm离心30min，离心后的上清与镍离子亲和层析柱结合(填料购自GE Healthcare)，用浓度为20mM、50mM、100mM、250mM的咪唑缓冲液进行梯度洗脱，分别取不同浓度的咪唑缓冲液的洗脱液配置蛋白样品，SDS-PAGE鉴定，结果如图11、12所示，说明20mM、50mM、100mM的咪唑缓冲液可以洗去非特异性结合在柱子上的杂蛋白，用250mM的咪唑缓冲液可以系脱下所有的重组目的蛋白,且纯度可以达到95％；

经镍柱纯化后的重组蛋白复合物用Millipore超滤浓缩管进行浓缩，浓缩至2mL，过分子筛进行分离纯化：所用的分子筛层析柱为Superdex^TM200 16/60。具体操作步骤如下：

平衡：将Superdex^TM200分子筛层析柱接入蛋白纯化仪AKTA Explorer系统，以elutionbuffer(20mM Tris-HCl 50mM NaCl 150Mm KCl 5％Glycerol pH8.0)平衡至少一个柱体积，流速设为1.2ml/min，平衡至基线水平；

上样：用2ml的注射器将浓缩及离心去沉淀后的蛋白质样品注入2ml的上样环中；

洗脱：用Elution Buffer(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，150Mm KCl，5％Glycerol，pH8.0)进行洗脱，流速1ml/min(较慢的流速有利于提高柱子分辨率)；

收集：按峰收集，2ml每管收集系脱下来的蛋白，进行SDS-PAGE检测。结果如图13、14所示，说明两步色谱柱纯化成功得到了可溶性的EcR/USP蛋白复合体，且目的蛋白复合物纯度可达99％。

实施例4ITC重组蛋白复合物活性测定

该试验完成于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所细胞分析技术平台，所使用ITC仪器为MicroCal ITC200，首先通过预实验确定合适的反应物浓度，最终确定用1mM的20E滴定100μM的EcR/USP蛋白复合体(两者缓冲液完全一致20mM Tris-HCl，50mM NaCl，150Mm KCl，5％Glycerol，pH8.0，1％DMSO)，首先用0.22μM纤维素膜过滤过的与样品一致的缓冲液清洗样品池等，20E溶液20次注射到ITC池中，滴定EcR/USP蛋白复合体溶液，滴定的蛋白溶液体积至少40μl，被滴定的溶液体积至少200μl。每个注射峰下方的区域与注射所释放的总热量相等。收集数据并矫正原始数据，矫正后的数据非线性回归得出热力学参数，结果如图15所示，结果表明EcR/USP蛋白复合体与20E在体外结合并相互作用，说明纯化得到的EcR/USP蛋白复合体具有良好的生物活性。

Claims

1.一种蚕类蜕皮激素受体EcR/USP蛋白复合物的表达及纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)构建USP-pET-28a(+)重组载体和EcR-pET21b-MDX12重组载体；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，构建USP-pET-28a(+)重组载体包括以下步骤：

(a-1)设计上游引物F：5'CCGGAATTCATGCATCCCAGCAGCTCTGTAC 3'，其中下划线部分为限制性内切酶EcoRⅠ酶切位点、和

下游引物R：5'GGGTTCGAAGGCCTTAAGTTACATGATGTTGG 3'，其中下划线部分为限制性内切酶HindⅢ酶切位点；

(a-3)将PCR割胶回收产物和pET-28a(+)载体利用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ同时进行双酶切，将酶切产物用T4连接酶连接并转化E.col TOP10感受态细胞，挑取长势良好的单菌落培养后提取重组质粒USP-pET-28a(+)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，构建EcR-pET21b-MDX12重组载体包括以下步骤：

(a-1’)设计上游引物F-1：

(a-2’)以蚕类EcR基因为模板，所述蚕类EcR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，利用引物F-1、R-1添加5’KpnI、TEV、3’TAA和3’XhoI，构建基因KpnI-TEV-EcR-XhoI；

(a-3’)设计无缝克隆上游引物F-2：

下游无缝克隆引物R-2：

(a-4’)利用引物F-1、R-1的PCR产物为模板扩增目的片段，同时用KpnI和XhoI两种酶线性化载体pET21b-MDX12，将目的DNA片段和线性化载体以3:1的比例进行重组反应，反应完成后将产物转化E.col TOP10感受态细胞，挑取长势良好的单菌落培养后进行菌落PCR；

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在步骤(a-3)和/或步骤(a-5’)中，用碱裂解法提取重组质粒。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，将所述USP-pET-28a(+)重组载体和EcR-pET21b-MDX12重组载体转化表达菌包括以下步骤：

用EcR-pET21b-MDX12转化第一重组菌的感受态，得到第二重组菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)、plysS、和/或Rossetta(DE3)，优选为E.coli BL21(DE3)。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，通过CaCl₂法制备第一重组菌的感受态。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，培养，诱导表达重组目的蛋白复合物包括以下步骤：

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，重组蛋白EcR/USP蛋白复合物的表达为共表达。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，纯化包括以下步骤：

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(c-1)中，咪唑缓冲液的浓度依次为20mM、50mM、100mM、250mM。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，步骤(c-2)中，分子筛为Superdex^TM20016/60。