CN108085323B

CN108085323B - 塞尼卡谷病毒svv/ch/nm/2016的全基因组序列及其扩增引物

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Publication number: CN108085323B
Application number: CN201810030599.1A
Authority: CN
Inventors: 陈君彦; 王秀明; 魏学峰; 刘国英; 关平原; 陈九连; 范秀丽; 张燕红; 王云凌; 张贵刚; 王艳杰; 张宸; 刘建奇; 武瑾贤; 谢雪岑; 杜宇荣
Original assignee: Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Inner Mongolia jinmaishi Biotechnology Co., Ltd; THE SPIRIT JINYU BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2038-01-12
Also published as: CN108085323A

Abstract

本发明公开了塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列及其扩增引物。本发明先用一步RT‑PCR方法扩增出SVV/CH/NM/2016株的7个核苷酸序列片段(S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7)，然后对7个核苷酸序列片段进行克隆测序，再将7个核苷酸序列片段的DNA序列依次进行拼接、编辑及校正，最终得到塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列。本发明获得的塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组序列有利于塞尼卡谷病毒致病机制、分子流行病学、反向遗传学等的进一步研究，从而对塞尼卡谷病毒的诊断试剂开发、疫苗研制等奠定重要的数据支持和理论基础。

Description

塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列及其扩增引物

技术领域

本发明属于分子生物学领域中塞尼卡谷病毒的全基因组序列，特别是涉及塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列及其扩增引物。

背景技术

塞尼卡谷病毒(Seneca Valley Virus，SVV)也被称为塞内卡山谷病毒(SVV)、猪塞内加谷病毒(SVV)、A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)。SVV为单股正链、不分节段、无囊膜的RNA病毒，是微RNA病毒科塞尼卡病毒属的唯一成员。SVV病毒粒子呈典型的二十面体对称，直径约27nm，分子量约为30KD。SVV基因组全长约7.2kb，包括两段保守非编码区5’-UTR、3’-UTR和一个开放阅读框(ORF)，在3’末端以一段poly(A)结尾。

塞尼卡谷病毒(SVV)是一种新出现的可感染仔猪及母猪并导致仔猪死亡的病毒。SVV感染可引起猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂创面从而导致跛足甚至死亡。2002年，由美国基因治疗公司在马里兰州使用PER.C6细胞(转化的胎儿成视网膜细胞)培养腺病毒-5(Ad5)病毒载体时分离到塞尼卡谷病毒-001(SVV-001)。2014年11月至2015年4月巴西出现了几次SVV感染猪群并出现严重的临床发病及死亡症状，造成严重的经济损失。2015年9月，美国某种猪场猪群出现跛足、水泡且伴随初生仔猪死亡。2015年3月开始广东某些猪场相继发生水疱性疾病，从发病病料中首次分离得到SVV，将其全基因进行测序并上传GenBank(KT321458)。随后从2015年7月至2016年3月，在多次发生临床水泡的猪群中检测到SVV的存在，特别是还出现了几次SVV和猪流行性腹泻病毒(PEDV)混合感染的情况。华南农业大学从2015-2016年广东省规模化猪场疑似SVV感染病猪的内脏、水疱液及粪便中分离出4株SVV，分别命名为SVV/CH-01-2015、SVV/CH-02-2015、SVV/CH-03-2015和SVV/CH-04-2015。

由于塞尼卡谷病毒(SVV)感染的临床症状类似于口蹄疫(FMD)，使得感染猪的上市存在重大风险。对于SVV这种猪场的新病毒，全世界对其的认知都比较有限，其对于猪场的短期和长期影响难以确切估计，因此应将其列为重大疾病对待。SVV在巴西、美国和我国几乎同时发生，说明其从被发现至今或有进一步扩大和爆发的可能，作为新出现的病毒，其潜在影响是不可估量的，必须足够重视。

在中国内蒙古自治区呼和浩特市周边某猪场发现了SVV病毒，发明人从发病猪只病料分离得到的其中一株被命名为塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016，该病毒株已于2017年11月20日由位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(邮政编码100101)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC14885。塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016通过采集内蒙古自治区呼和浩特市周边某猪场发病猪只病料分离得到，可在人胚肾细胞(293FT细胞)、猪睾丸细胞(ST)和猪肾细胞(PK-15)上培养增殖。根据塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016在PK-15细胞出现CPE的情况，测定其病毒半数组织细胞感染量(TCID₅₀)大于等于10⁶.5TCID₅₀/mL。因此，塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组序列的获得对进一步研究其致病性、致病机制、诊断试剂开发和疫苗研制具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列。

塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列，其核苷酸(DNA)序列如序列表中SEQ ID No:1所示，或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No:1由7292个核苷酸组成，自5’端第1-668bp(669bp)为5’端非编码区(5’UTR),自5’端第669bp-7211bp(6543bp)为开放阅读框(ORF),自5’端第7212-7282bp(71bp)为3’端非编码区(3’UTR),自5’端第7283-7292bp(10bp)为Poly(A)。

塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的开放阅读框(ORF)的核苷酸(DNA)序列由6543个核苷酸组成。

塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列及其开放阅读框(ORF)编码的蛋白序列也属于本发明的保护范围。

塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列及其开放阅读框(ORF)编码的蛋白序列如序列表中SEQ ID No：2所示。

序列表中的SEQ ID No：2由2181个氨基酸残基组成。

本发明的第二个目的是提供用于一步RT-PCR扩增塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组的引物组合。

用于一步RT-PCR扩增塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组的引物组合由7对引物组成，分别用于一步RT-PCR扩增塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组的7个核苷酸序列片段：S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7，引物序列如下：

(1)用于一步RT-PCR扩增S1核苷酸序列片段的引物对，其上游引物具有序列表中SEQ ID No:3的DNA序列，其下游引物具有序列表中SEQ ID No:4的DNA序列；

(2)用于一步RT-PCR扩增S2核苷酸序列片段的引物对，其上游引物具有序列表中SEQ ID No:5的DNA序列，其下游引物具有序列表中SEQ ID No:6的DNA序列；

(3)用于一步RT-PCR扩增S3核苷酸序列片段的引物对，其上游引物具有序列表中SEQ ID No:7的DNA序列，其下游引物具有序列表中SEQ ID No:8的DNA序列；

(4)用于一步RT-PCR扩增S4核苷酸序列片段的引物对，其上游引物具有序列表中SEQ ID No:9的DNA序列，其下游引物具有序列表中SEQ ID No:10的DNA序列；

(5)用于一步RT-PCR扩增S5核苷酸序列片段的引物对，其上游引物具有序列表中SEQ ID No:11的DNA序列，其下游引物具有序列表中SEQ ID No:12的DNA序列；

(6)用于一步RT-PCR扩增S6核苷酸序列片段的引物对，其上游引物具有序列表中SEQ ID No:13的DNA序列，其下游引物具有序列表中SEQ ID No:14的DNA序列；

(7)用于一步RT-PCR扩增S7核苷酸序列片段的引物对，其上游引物具有序列表中SEQ ID No:15的DNA序列，其下游引物具有序列表中SEQ ID No:16的DNA序列。

本发明的第三个目的是提供一种获得塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组序列的方法。

本发明所提供的获得塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组序列的方法，可包括以下步骤：

1)提取塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的总RNA；

2)以RNA为模板，在上述引物组合的引导下，用一步RT-PCR方法扩增塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组的7个核苷酸序列片段：S1(1195bp)、S2(1582bp)、S3(1386bp)、S4(1235bp)、S5(1458bp)、S6(1075bp)和S7(876bp)；

3)将7个目的核苷酸序列片段回收、连接、转化，挑取阳性单克隆菌测序；

4)用生物信息学DNAStar软件依次将步骤3)中得到的7个核苷酸序列片段的DNA序列的重叠部分进行拼接、编辑及校正，得到塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列。

在上述塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组序列的获得方法中，所述步骤2)中的一步RT-PCR反应体系(50μL)包括：总RNA 2μL，2×One Step RT-PCR BufferⅢ25μL，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)1μL，PrimeScript RT enzyme MixⅡ1μL，上游引物(20μM)1μL，下游引物(20μM)1μL，无RNA酶水(RNase FreedH₂O)19μL。

所述步骤2)中的一步RT-PCR反应程序为：先42℃反转录30min，再95℃预变性3min；然后94℃变性10s、50℃-60℃(优选55℃)退火30s-60s(优选45s)、72℃延伸30s-120s(优选60s)，共35个循环；最后72℃延伸10min。

本发明提供了塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列。本发明先用一步RT-PCR方法扩增出SVV/CH/NM/2016株的7个核苷酸序列片段(S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7)，然后对7个核苷酸序列片段进行克隆测序，再将7个核苷酸序列片段的DNA序列依次进行拼接、编辑及校正，最终得到塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列。本发明获得的塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组序列有利于塞尼卡谷病毒致病机制、分子流行病学、反向遗传学等的进一步研究，从而对塞尼卡谷病毒的诊断试剂开发、疫苗研制等奠定重要的数据支持和理论基础。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组的7个核苷酸序列片段(S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7)的一步RT-PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱；

图2为塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016与NCBI微RNA病毒科(塞尼卡谷病毒属、口疮病毒属、肠病毒属、猴禽猪肠病毒属和捷申病毒属)38株参考毒株全基因组核苷酸序列的同源性比较图；

图3为塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016与NCBI微RNA病毒科(塞尼卡谷病毒属、口疮病毒属、肠病毒属、猴禽猪肠病毒属和捷申病毒属)38株参考毒株全基因组核苷酸序列的遗传进化树。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、设计用于一步RT-PCR扩增塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组7个核苷酸序列片段的引物组合

本发明目的之一是获得塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列，从而对塞尼卡谷病毒的分子遗传演化趋势及流行情况在全基因组序列的水平上有更全面、系统地了解，以进一步深入研究。

根据NCBI中塞尼卡谷病毒参考毒株的全基因组核苷酸序列，如SVA/CH/01/2015(GenBank:KT321458.1)、SVA/CH/02/2015(GenBank:KX173339.1)、SVA/CH/DL/01/2016(GenBank:KX751944.1)、SVA/CH/GXI09/2016(GenBank:KY038016.1)、SVA/CH/LX/01/2016(GenBank:KX751945.1)、SVA/CH/ZW/01/2016(GenBank:KX751946.1)、SVA/HLJ/CHA/2016(GenBank:KY419132.1)、SVA/CH/FJ/2017(GenBank:KY747510.1)、SVA/CH/HN/2017(GenBank:KY747511.1)、SVA/CH/HNSL/2017(GenBank:KY747512.1)、SVA/KS15-01(GenBank:KX019804.1)、SVA/US-15-39812IA(GenBank:KU051391.1)、USA/GBI26/2015(GenBank:KT827250.1)、USA/IA40380/2015Passage1(GenBank:KT757280.1)、USA/IN_Purdue_4885/2015(GenBank:KX223836.1)、SVA-OH1(GenBank:KU058182.1)、SVV-001(GenBank:DQ641257.1)、USA/IA44662/2015-P1(GenBank:KU954089.1)、SVV/11-55910-3(GenBank:KC667560.1)、SVA/BRA/GO3/2015(GenBank:KR063109.1)、SVA/BRA/MG1/2015(GenBank:KR063107.1)、G103_SV_1/2016/Thailand(GenBank:KY368743.1)和G103_SV_2/2016/Thailand(GenBank:KY368744.1)，发明人应用生物信息学DNAStar软件进行分析、比对、筛选和优化，最终确定将塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列分成7个核苷酸序列片段：S1(1195bp)、S2(1582bp)、S3(1386bp)、S4(1235bp)、S5(1458bp)、S6(1075bp)和S7(876bp)，并进而分别在保守序列区域内设计一步RT-PCR扩增7个核苷酸序列片段的引物组合，经分析、比对、筛选和优化，最终确定的引物组合各序列如表1所示。

表1用于一步RT-PCR扩增塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组的引物组合

实施例2、获得塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列

基于实施例1得到的引物组合，本发明能够获得塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列，获得方法包括以下步骤：

1、提取塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的总RNA

按照Axyprep^TM Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(购自AXYGEN公司)说明书，提取塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016(保藏号：CGMCC 14885)的总RNA，具体步骤如下：

(1)试剂准备：预先配制含1％(V/V)冰乙酸的异丙醇；分别在试剂Buffer W1A和Buffer W2中添加指定体积的无水乙醇。即，24mL Buffer W1A中加入17mL无水乙醇；24mLBuffer W2中加入56mL无水乙醇。

(2)取200μL待检样品(塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016在猪肾细胞(PK-15)上培养得到的毒液)加入1.5mL离心管中。

(3)加入200μL Buffer V-L，漩涡振荡混合均匀，静置5min。

(4)加入75μL Buffer V-N，漩涡振混合均匀，12000rpm离心5min。

(5)将上清转移至新的2mL离心管(试剂盒内提供)中，加300μL异丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均匀。

(6)将制备管置于2mL离心管(试剂盒内提供)中，取步骤(5)中的混合液移入制备管中，6000rpm离心1min。

(7)弃滤液，将制备管置回到2mL离心管中，加500μL Buffer W1A，室温静置1min,12000rpm离心1min。

(8)弃滤液，将制备管置回到2mL离心管中，加800μL Buffer W2，12000rpm离心1min。

(9)弃滤液，将制备管置回到2mL离心管中，12000rpm离心1min。

(10)将制备管置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加40μL无酶水，室温静置1min，12000g离心1min洗脱RNA，-20℃冻存备用。

2、一步RT-PCR扩增塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组的7个核苷酸序列片段

将步骤1提取的塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的总RNA作为模板，在实施例1中的引物组合的引导下，用一步RT-PCR扩增塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组的7个核苷酸序列片段：S1(1195bp)、S2(1582bp)、S3(1386bp)、S4(1235bp)、S5(1458bp)、S6(1075bp)和S7(876bp)，具体步骤如下：

(1)按照One Step Prime Script^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒(购自TaKaRa公司)说明书中的试剂比例配制反应体系，具体组分如表2所示。

表2 一步RT-PCR扩增塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组的7个基因片段的反应体系

试剂名称	体积(μL)
		2×One Step RT-PCR BufferⅢ	25.0
TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)	1.0
		PrimeScript RT enzyme MixⅡ	1.0
上游引物(Forward Primer，20μM)	1.0
		下游引物(Reverse Primer，20μM)	1.0
总RNA	2.0
		无RNA酶水(RNase Free dH<sub>2</sub>O)	19.0
总体积	50.0

(2)将上述配制好的试剂放入PCR仪中进行RT-PCR扩增，RT-PCR反应程序如表3所示。

表3 一步RT-PCR扩增塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组的7个核苷酸序列片段的反应程序

3、7个目的核苷酸序列片段的回收、连接、转化，挑取阳性单克隆菌测序

3.1回收目的核苷酸序列片段

将步骤2RT-PCR扩增的塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组的7个核苷酸序列片段进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1(泳道1：S1(1195bp)、泳道2：S2(1582bp)、泳道3：S3(1386bp)、泳道4：S4(1235bp)、泳道5：S5(1458bp)、泳道6：S6(1075bp)、泳道7：S7(876bp))所示，RT-PCR扩增的7个目的核苷酸序列片段的长度与预期结果相符。按照TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA ExtractionKit Ver.4.0试剂盒(购自TaKaRa公司)说明书，回收并纯化7个目的核苷酸序列片段，具体步骤如下：

(1)试剂准备：向Buffer WB中添加指定体积(具体为24mL中加入56mL无水乙醇)的无水乙醇。

(2)在紫外灯下，用干净的刀片切下含有目的基因片段的琼脂糖凝胶块，将其放入1.5mL灭菌离心管中(先称空的1.5mL离心管重量，然后再称放入琼脂糖凝胶块的1.5mL离心管重量)。

(3)称量琼脂糖凝胶块重量，按1mg＝1μL计算琼脂糖凝胶块的体积。

(4)向盛有胶块的1.5mL离心管中，加入4个凝胶体积量(琼脂糖凝胶浓度为1.5％)的Buffer GM。

(5)均匀混合后，室温15℃-25℃溶解胶块(若胶浓度较大或比较难溶时可以37℃加热)，此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解(约5-10分钟)。

(6)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

(7)将步骤(5)的溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

(8)将700μL的Buffer WB加入Spin Column中，12,000rpm离心30秒，弃滤液。

(9)重复步骤(8)。

(10)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心1分钟。

(11)将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μL灭菌水或Elution Buffer，室温静置1分钟。

(12)12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。

3.2连接目的基因片段

将步骤3.1回收纯化的7个目的核苷酸序列片段分别连接到pCR^TM4-载体(购自Life technologies invitrogen公司)中，按照pCR^TM4-载体说明书中的试剂比例配制反应体系，反应体系如表4所示。

表4用pCR^TM4-载体连接7个目的核苷酸序列片段的反应体系

将表4中的各种试剂加入0.2mL PCR管中，轻轻混匀，室温连接5-10min。反应结束后将PCR管置于冰上冷却。

3.3转化

将7个目的基因片段的连接产物分别转化到E.Coli JM109感受态细胞(购自TaKaRa公司)中，具体步骤如下：

(1)将E.Coli JM109感受态细胞从－80℃冰箱取出，置于冰盒上融化。

(2)将6μL连接产物移至100μL E.Coli JM109感受态细胞中，混匀，冰浴30min。

(3)42℃热激45s，迅速置于冰上至少2分钟。

(4)加入800μL SOC液体培养基(购自TaKaRa公司)，37℃、150rpm振摇培养1h，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

(5)取200μL步骤(4)中的菌液，转移到含50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，均匀涂板，待全部菌液被吸收后，37℃温箱倒置培养12-14h。

3.4筛选阳性克隆

挑取LB琼脂平板上长出的白色单一菌落，分别接种于3mL LB液体培养基中(含50μg/mL氨苄青霉素)，37℃、200rpm振摇培养过夜(12-16h)。

3.5测序

选取阳性单克隆菌液，送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。

3.6序列拼接、编辑及校正

将步骤3.5测序得到的7个核苷酸序列片段：S1(1195bp)、S2(1582bp)、S3(1386bp)、S4(1235bp)、S5(1458bp)、S6(1075bp)和S7(876bp)的DNA序列的重叠部分用生物信息学DNAStar软件进行DNA序列拼接、信息编辑和校正分析，得到塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列，塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组的核苷酸(DNA)序列如序列表中SEQ ID No:1所示，序列表中的SEQ ID No:1由7292个核苷酸组成，自5’端第1-668bp(669bp)为5’端非编码区(5’UTR),自5’端第669bp-7211bp(6543bp)为开放阅读框(ORF),自5’端第7212-7282bp(71bp)为3’端非编码区(3’UTR),自5’端第7283-7292bp(10bp)为Poly(A)。塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的开放阅读框(ORF)的核苷酸(DNA)序列如序列表中SEQ ID No:1自5’端第7283-7292bp所示，由6543个核苷酸组成。塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列及其开放阅读框(ORF)编码的蛋白序列如序列表中SEQ IDNo：2所示，序列表中的SEQ ID No：2由2181个氨基酸残基组成。

将塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列与NCBI(美国国家生物技术信息中心)中微RNA病毒科(塞尼卡谷病毒属、口疮病毒属、肠病毒属、猴禽猪肠病毒属和捷申病毒属)38株参考毒株的全基因组序列，进行核苷酸同源性比较，结果如图2所示，可以看出SVV/CH/NM/2016与塞尼卡谷病毒属中国参考毒株SVA/CH/HN/2017(GenBankNo.KY747511)、SVA/CH/FJ/2017(GenBank No.KY747510)和SVA/CH/HNSL/2017(GenBankNo.KY747512)的核苷酸同源性相对最高，为99.1％和99.0％；与其它中国参考毒株的同源性在96.3％-98.3％之间。SVV/CH/NM/2016与塞尼卡谷病毒属美国参考毒株的同源性比较，除与SVV/001(GenBank No.DQ641257)株的同源性为93.9％外，与其它参考毒株的同源性在97.8％-98.9％之间。SVV/CH/NM/2016与塞尼卡谷病毒属加拿大参考毒株SVV/11-55910-3(GenBank No.KC667560)的同源性为95.8％。SVV/CH/NM/2016与塞尼卡谷病毒属巴西参考毒株的同源性为97.4％。SVV/CH/NM/2016与塞尼卡谷病毒属泰国参考毒株的同源性为95.4％。但是，SVV/CH/NM/2016与肠病毒属参考毒株的同源性仅为35.4％-36.1％；与口疮病毒属参考毒株的同源性为44.3％-45.3％；与猴禽猪肠病毒属参考毒株的同源性为35.4％；与捷申病毒属参考毒株的同源性为42％。由此表明SVV/CH/NM/2016与Senecavirus病毒属株的同源性最高，属于Senecavirus病毒属塞尼卡谷病毒。

将塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列与NCBI(美国国家生物技术信息中心)中微RNA病毒科(塞尼卡谷病毒属、口疮病毒属、肠病毒属、猴禽猪肠病毒属和捷申病毒属)38株参考毒株的全基因组序列制作遗传进化树，结果如图3所示，可以看出SVV/CH/NM/2016与Senecavirus病毒属的参考毒株位于同一分支内，表明

SVV/CH/NM/2016位于Senecavirus病毒属内，属于Senecavirus病毒属。

序列表

<110> 金宇保灵生物药品有限公司

<120> 塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列及其扩增引物

<130> CGCNB185006W

<141> 2018-01-12

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 17

<211> 7292

<212> DNA

<213> 塞尼卡谷病毒(Senecavirus)

<400> 17

tttgaaatgg ggggctgggc cctcatgccc agtccttcct ttccccttcc ggggggtaaa 60

ccggctgtgt ttgctagagg cacagaggag caacatccaa cctgcttttg tggggaacgg 120

tgcggctcca attcctgcgt cgccaaaggt gttagcgcac ccaaacggcg catctaccaa 180

tgctattggt gtggtctgcg agttctagcc tactcgtttc tcccctactc actcatttac 240

acacaaaaac tgtgttgtaa ctacaagatt tggccctcgc acgggatgtg cgacaaccgc 300

aagattgact caagcgcgga aagcgctgta accacatgct gttagtccct ttatggctgt 360

gagatggcta tccacctcgg atcactgaac tggagctcga ccctccttag taagggaacc 420

gagaggcctt cccgcaacaa gctccgacac agagtccacg tgattgctac caccatgagt 480

acatggttct cccctctcga cccaggactt ctttttgaat atccacggct cgatccagag 540

ggtggggcat gatcccccta gcatagcgag ctacagcggg aactgtagct aggccttagc 600

gtgccttgga tactgcctga tagggcgacg gcctagtcgt gtcggttcta taggtagcac 660

atacaaatat gcagaactct catttttctt tcgatacagc ctccggcacc tttgaagacg 720

taaccggaac aaaagtcaag atcgttgaat accccagatc ggtgaacaat ggtgtttacg 780

attcgtccac tcatttagag atactgaacc tacagggtga aattgaaatt ttaaagtctt 840

tcaacgaata ccaaattcgc gccgccaaac aacaacttgg actggacatc gtatacgaac 900

tacaaggtaa tgttcagaca acctcaaaga acgattttga ttcccgcggc aataatggta 960

acatgacctt caattactac gcaaacactt accagaattc agtagacttc tcgacctcct 1020

cgtcggcgtc aggcgccgga cccgggaact cccggggcgg attagcgggt ctcctcacaa 1080

atttcagtgg aatcttgaac cctcttggct acctcaaaga tcacaatacc gaagaaatgg 1140

aaaactctgc tgatcgagtc ataacgcaaa cggcgggcaa cactgccata aacacgcaat 1200

catcactggg tgtgttgtgt gcctacgttg aagacccgac caaatctgac cctccgtcca 1260

gcagcacaga tcaacccacc accactttta ctgccatcga caggtggtac actggacggc 1320

tcaattcttg gacaaaagct gtaaaaacct tctcttttca ggccgtcccg ctccctggag 1380

ccttcctgtc taggcaggga ggcctcaacg gaggggcctt cacggctacc ctacatagac 1440

atttcttaat gaagtgcggg tggcaagtgc aggtcccatg taatttgaca caattccacc 1500

aaggcgctct tcttgttgcc atggtccccg aaaccaccct tgatgtcaaa cctgacggta 1560

aggcaaagag cttacaagag ctgaatgaag agcagtgggt ggagatgtct gacgattacc 1620

ggaccgggaa aaacatgcct tttcagtctc ttggcactta ctaccggccc cctaactgga 1680

cttggggccc caatttcatt aacccctatc aagtaacagt cttcccacac caaattctga 1740

acgcgagaac ctctacttcg gtagacataa gtgtcccata catcggggag acccctacgc 1800

aatcctcaga gacacagaac tcctggaccc tcctcgttat ggtgcttgtc cccctggact 1860

acaaggaggg agccacaact gacccagaaa ttacattttc tgtaaggcct acaagtcctt 1920

acttcaatgg gcttcgtaac cgtttcaaga ccgggacgga cgaggaacag gggcccattc 1980

ccacagcacc cagagaaaat tcgcttatgt ttctctcaac catccctgac gacactgttc 2040

ctgcttacgg gaatgtgcgt acccctcccg tcaattacct ccctggtgaa ataaccgacc 2100

tcttacaact ggcccgtata cccactctca tggcgtttgg gcgggtgtct gaacccgagc 2160

ctgcctcaga cgcatatgtg ccctacgttg ccgttcctgc ccagttcgac gacaagcctc 2220

tcatctcctt cccgatcacc ctctcagatc ctgtctacca gaacaccctg gtgggcgcca 2280

tcagttcgaa cttcgccaac taccgggggt gtatccaaat cactctgaca ttttgtggac 2340

ccatgatggc aagagggaaa ttcctgctct cgtattctcc cccaaatgga gcacaaccac 2400

agaccctttc tgaagctatg cagtgcacat actctatttg ggatataggc ttgaactcta 2460

gttggacctt tgtcatcccc tatatctcgc ccagtgatta ccgtgaaact cgggctatta 2520

ccaactcagt ttattctgct gatggttggt ttagcttgca caagctgacc aaaattactc 2580

taccacctga ctgcccacag agtccctgta ttctcttttt cgcctctgct ggtgaggatt 2640

acaccctccg tctccctgtt gattgtaatc cttcctacgt gttccactcc accgacaacg 2700

ccgagactgg ggttattgag gcaggtaaca ctgacaccga tttctctggt gaactggcgg 2760

ctcctggctc taaccatact aatgtcaaat tcctgtttga ccgatctcgg ctactgaatg 2820

taattaaggt actggagaag gacgccgtct tcccccgtcc tttccccaca gcaacaggtg 2880

cacagcagga cgatggttac ttttgtcttc taacaccccg cccaacagtc gcttcccgac 2940

ccgccactcg tttcggcctg tacgtcaacc cgtctgacag tggcgttctc gctaacactt 3000

cactggattt caatttttac agtttggcct gtttcactta ctttagatca gaccttgagg 3060

tcacggtggt ctcactagag ccagatttgg aattcgccgt ggggtggttc ccctctggca 3120

gtgagtacca ggcttctagc tttgtctacg accaactgca tgtaccctac cactttactg 3180

ggcgcactcc ccgcgctttc accagcaagg gtggaaaggt atctttcgtg ctcccttgga 3240

actctgtctc ttccgtgctt cccgtgcgct gggggggcgc ctccaagctt tcttctgcca 3300

cgcggggtct gccggctcat gctgactggg ggaccattta cgcctttatc ccccgtccta 3360

acgagaagaa aagcaccgct gtaaagcacg tggcggtgta cgttcggtac aagaacgcgc 3420

gtgcctggtg ccccagcatg cttccctttc gcagctacaa gcagaagatg ctgatgcaat 3480

caggcgacgt cgagaccaac cctggccctg cttctgacaa cccgatcttg gagtttcttg 3540

aagcggaaaa cgatctagtc actctggcct ctctctggaa gatggtacac tctgttcaac 3600

agacctggag aaagtacgtg aagaatgaca atttttggcc caacttgctc agtgagctag 3660

tgggggaagg ctccatcgcc ttggccgcca cgctatctaa ccaagcttca gtgaaagctc 3720

tcttgggcct gcattttctc tctcgagggc tcaattacac agatttttac tctttactga 3780

tagagaaatg ctctagtttc tttactgtag aaccgcctcc tccaccagct gaaaatctga 3840

tgaccaagcc ctccgtgaag tcgaaattcc gaaagctgtt taagatgcaa ggacccatgg 3900

acacagtcaa agactggaac caaatagccg ccggcttgaa gaatttccaa tttgttcgtg 3960

acctagtcaa ggaggtggtc gactggctcc aggcctggat caataaagag aaagccagcc 4020

ctgtcctcca gtaccagctg gagatgaaga agctcgggcc cgtggctttg gctcatgatg 4080

ccttcatggc cggttccggg ccccctcttg gtgacgacca gattgaatac ctccagaacc 4140

tcaaatctct tgccctgacg ctgggaaaga ctaatttggc ccaaagtctc accactatga 4200

tcaatgccaa gcagagctcc gcccaacgag tcgaacccgt tgtggtggtc ctcagaggca 4260

agccgggatg cggcaaaagc ttggcctcca cgttgattgc ccaggctgtg tccaagcgtc 4320

tctacggctc gcaaagtgtg tattctctcc ctccggatcc agacttcttc gacggatata 4380

aaggacagtt tgtaaccttg atggacgatc tgggacaaaa cccggatggg caagatttct 4440

ccaccttttg tcagatggtg tcgaccgccc aatttcttcc caatatggcg gaccttgcag 4500

agaaggggcg tcccttcacc tccaatctta tcattgcaac tacaaacctc cctcacttta 4560

gccctgtcac cattgctgat ccttctgcag tctctcggcg tatcaactac gacctgactc 4620

tagaagtatc tgaggcttac aagaagcaca cacggctgaa tttcgacctg gctttcagac 4680

gcactgacgc cccccccatt tatccttttg ctgcccacgt gcccttcgtg gacgtggctg 4740

tgcgcttcaa aaatggacat caaagcttca atctcctgga gttggtcgac tccatttgtg 4800

cagacattcg ggccaagcaa caaggtgccc gaaatatgca gactctggtt ctacagagcc 4860

ctaacgagaa cgacgacacc cccgtcgacg aggcgttggg tagagttctc acccccgctg 4920

cggtcgacga ggcgcttgtc gacctcgctc cagatgccga cccggttggc cgcttggcta 4980

ttctcgccaa gctaggtctt gccctagctg cggtcacccc tggtttgata atcttggcag 5040

cgggactcta caagtacttc tctggctctg atacagacca agaagaaaca gaaactgagg 5100

agcctgctaa agcgcctagg agcgagaatg cttatgacgg cccgaagaaa aactccaagc 5160

cccctggagc gctctctctt atggaaatgc aacagcccaa cgtggacatg ggctttgagg 5220

ctgcagttgc taagaaagtg gtcgtcccca ttaccttcat ggttcccaac agaccttctg 5280

gacttacaca gtccgctctt cttgtggccg gccggacctt cctaatcaat gagcatacat 5340

ggtccaaccc ctcctggacc agcttcacaa tccgtggtga ggtgcacaca cgtgatgagc 5400

ctttccaaac ggttcatttt actcaccatg gtcttcccac agatctgatg gtggtacgtc 5460

tcggaccggg caactctttc cctaataatc tagacaagtt tggacttgac cagatgccgg 5520

cacgtaactc ccgtgtggtt ggcgtttcag ctagttacgg taacttcttc ttttctggga 5580

acttcctcgg gtttgttgac tccatcacct ctgaccaagg aacctatgcg agacttttca 5640

ggtacagggt gacgacttac aaggggtggt gcggttcggc cctggtctgt gaggccggtg 5700

gtgtccgacg catcattggt atgcattctg ctggtgccgc tggtatcggc gccgggactt 5760

acatctcaaa attaggactg atcaaagccc ttaaacacct cggtgagcct ttggctacta 5820

tgcaaggact gatgactgag ctagagcctg gagtcaccgt acatgtaccc cgaaaatcta 5880

aattgagaaa gacgaccgca cacgcggtgt acaaaccgga gtttgaacct gctgtgttgt 5940

caaaatttga tcccagactg aacaaggatg ttgacctaga tgaggtaatt tggtctaaac 6000

acaccgccaa cgtcccttat caacctcctt tgttctacac atacatgtca gagtacgctc 6060

atcgggtttt ctcctttttg ggaaaagaca atgacattct gaccgtcaaa gaagcaatcc 6120

tgggcatccc tggactagac cctatggatc cccacacagc tccgggtttg ccctacgcca 6180

ttagcggtct tcgacgtact gatctcgtcg attttgcgaa cggcacggta gacccggcac 6240

tggccatgca gatccagaaa ttcttagacg gtgactactc tgatcatgtc ttccaaactt 6300

ttctgaaaga tgaaatcaga ccctcagaga aggtccgggc gggaaaaacc cgcattgtcg 6360

acgtgccctc cctggcgcac tgcattgtgg gcagaatgct gcttgggcgc tttgccgcca 6420

agtttcaatc ccatcctggc tttctccttg gctccgctat cgggtctgac cccgatgtct 6480

tctggaccgt cataggggct cagctcgagg gaagaaagaa cacgtatgac gtggactaca 6540

gtgcctttga ctcttcacac ggcactggct ccttcgaggc tctcatctct cactttttca 6600

ccgtggacaa tggtttcagc cctgcgctgg gaccgtatct cagatccctg gctgtctcgg 6660

tgcacgctta cggcgagcgt cgcatcaaga ttaccggagg cctcccctct ggttgtgccg 6720

cgaccagcct gctgaacaca gtgctcaaca atgtgatcat caggactgct ctggcattga 6780

cctacaagga atttgaatat gacatggttg atatcatcgc ctacggtgac gaccttctgg 6840

ttggtacgga ttacgatctg gacttcaatg aggtggcgcg gcgcgctgcc aaactggggt 6900

ataagatgac tcctgccaac aagggttctg tcttccctcc gacttcctct ctctccgatg 6960

ctgtttttct aaaacgcaaa ttcgtccaaa acaacgacgg cttatataaa ccagttatgg 7020

atttaaagaa tttggaagcc atgctctcct acttcaaacc aggaacacta ctcgagaagc 7080

tgcaatctgt ttctatgttg gctcaacatt ctggaaaaga agaatatgat agattgatgc 7140

accccttcgc tgactacggt gccgtaccga gtcacgagta cctgcaggca agatggaggg 7200

ccttgttcga ctgacctgga tagtccaacg cgcttcggtg ctgccggcga ttctgggaga 7260

actcagtcgg aacagaaaag ggaaaaaaaa aa 7292

<210> 2

<211> 2181

<212> PRT

<213> 塞尼卡谷病毒(Senecavirus)

<400> 2

Met Gln Asn Ser His Phe Ser Phe Asp Thr Ala Ser Gly Thr Phe Glu

1 5 10 15

Asp Val Thr Gly Thr Lys Val Lys Ile Val Glu Tyr Pro Arg Ser Val

20 25 30

Asn Asn Gly Val Tyr Asp Ser Ser Thr His Leu Glu Ile Leu Asn Leu

35 40 45

Gln Gly Glu Ile Glu Ile Leu Lys Ser Phe Asn Glu Tyr Gln Ile Arg

50 55 60

Ala Ala Lys Gln Gln Leu Gly Leu Asp Ile Val Tyr Glu Leu Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Gln Thr Thr Ser Lys Asn Asp Phe Asp Ser Arg Gly Asn Asn

85 90 95

Gly Asn Met Thr Phe Asn Tyr Tyr Ala Asn Thr Tyr Gln Asn Ser Val

100 105 110

Asp Phe Ser Thr Ser Ser Ser Ala Ser Gly Ala Gly Pro Gly Asn Ser

115 120 125

Arg Gly Gly Leu Ala Gly Leu Leu Thr Asn Phe Ser Gly Ile Leu Asn

130 135 140

Pro Leu Gly Tyr Leu Lys Asp His Asn Thr Glu Glu Met Glu Asn Ser

145 150 155 160

Ala Asp Arg Val Ile Thr Gln Thr Ala Gly Asn Thr Ala Ile Asn Thr

165 170 175

Gln Ser Ser Leu Gly Val Leu Cys Ala Tyr Val Glu Asp Pro Thr Lys

180 185 190

Ser Asp Pro Pro Ser Ser Ser Thr Asp Gln Pro Thr Thr Thr Phe Thr

195 200 205

Ala Ile Asp Arg Trp Tyr Thr Gly Arg Leu Asn Ser Trp Thr Lys Ala

210 215 220

Val Lys Thr Phe Ser Phe Gln Ala Val Pro Leu Pro Gly Ala Phe Leu

225 230 235 240

Ser Arg Gln Gly Gly Leu Asn Gly Gly Ala Phe Thr Ala Thr Leu His

245 250 255

Arg His Phe Leu Met Lys Cys Gly Trp Gln Val Gln Val Pro Cys Asn

260 265 270

Leu Thr Gln Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Ala Met Val Pro Glu

275 280 285

Thr Thr Leu Asp Val Lys Pro Asp Gly Lys Ala Lys Ser Leu Gln Glu

290 295 300

Leu Asn Glu Glu Gln Trp Val Glu Met Ser Asp Asp Tyr Arg Thr Gly

305 310 315 320

Lys Asn Met Pro Phe Gln Ser Leu Gly Thr Tyr Tyr Arg Pro Pro Asn

325 330 335

Trp Thr Trp Gly Pro Asn Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Val Thr Val Phe

340 345 350

Pro His Gln Ile Leu Asn Ala Arg Thr Ser Thr Ser Val Asp Ile Ser

355 360 365

Val Pro Tyr Ile Gly Glu Thr Pro Thr Gln Ser Ser Glu Thr Gln Asn

370 375 380

Ser Trp Thr Leu Leu Val Met Val Leu Val Pro Leu Asp Tyr Lys Glu

385 390 395 400

Gly Ala Thr Thr Asp Pro Glu Ile Thr Phe Ser Val Arg Pro Thr Ser

405 410 415

Pro Tyr Phe Asn Gly Leu Arg Asn Arg Phe Lys Thr Gly Thr Asp Glu

420 425 430

Glu Gln Gly Pro Ile Pro Thr Ala Pro Arg Glu Asn Ser Leu Met Phe

435 440 445

Leu Ser Thr Ile Pro Asp Asp Thr Val Pro Ala Tyr Gly Asn Val Arg

450 455 460

Thr Pro Pro Val Asn Tyr Leu Pro Gly Glu Ile Thr Asp Leu Leu Gln

465 470 475 480

Leu Ala Arg Ile Pro Thr Leu Met Ala Phe Gly Arg Val Ser Glu Pro

485 490 495

Glu Pro Ala Ser Asp Ala Tyr Val Pro Tyr Val Ala Val Pro Ala Gln

500 505 510

Phe Asp Asp Lys Pro Leu Ile Ser Phe Pro Ile Thr Leu Ser Asp Pro

515 520 525

Val Tyr Gln Asn Thr Leu Val Gly Ala Ile Ser Ser Asn Phe Ala Asn

530 535 540

Tyr Arg Gly Cys Ile Gln Ile Thr Leu Thr Phe Cys Gly Pro Met Met

545 550 555 560

Ala Arg Gly Lys Phe Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Asn Gly Ala Gln

565 570 575

Pro Gln Thr Leu Ser Glu Ala Met Gln Cys Thr Tyr Ser Ile Trp Asp

580 585 590

Ile Gly Leu Asn Ser Ser Trp Thr Phe Val Ile Pro Tyr Ile Ser Pro

595 600 605

Ser Asp Tyr Arg Glu Thr Arg Ala Ile Thr Asn Ser Val Tyr Ser Ala

610 615 620

Asp Gly Trp Phe Ser Leu His Lys Leu Thr Lys Ile Thr Leu Pro Pro

625 630 635 640

Asp Cys Pro Gln Ser Pro Cys Ile Leu Phe Phe Ala Ser Ala Gly Glu

645 650 655

Asp Tyr Thr Leu Arg Leu Pro Val Asp Cys Asn Pro Ser Tyr Val Phe

660 665 670

His Ser Thr Asp Asn Ala Glu Thr Gly Val Ile Glu Ala Gly Asn Thr

675 680 685

Asp Thr Asp Phe Ser Gly Glu Leu Ala Ala Pro Gly Ser Asn His Thr

690 695 700

Asn Val Lys Phe Leu Phe Asp Arg Ser Arg Leu Leu Asn Val Ile Lys

705 710 715 720

Val Leu Glu Lys Asp Ala Val Phe Pro Arg Pro Phe Pro Thr Ala Thr

725 730 735

Gly Ala Gln Gln Asp Asp Gly Tyr Phe Cys Leu Leu Thr Pro Arg Pro

740 745 750

Thr Val Ala Ser Arg Pro Ala Thr Arg Phe Gly Leu Tyr Val Asn Pro

755 760 765

Ser Asp Ser Gly Val Leu Ala Asn Thr Ser Leu Asp Phe Asn Phe Tyr

770 775 780

Ser Leu Ala Cys Phe Thr Tyr Phe Arg Ser Asp Leu Glu Val Thr Val

785 790 795 800

Val Ser Leu Glu Pro Asp Leu Glu Phe Ala Val Gly Trp Phe Pro Ser

805 810 815

Gly Ser Glu Tyr Gln Ala Ser Ser Phe Val Tyr Asp Gln Leu His Val

820 825 830

Pro Tyr His Phe Thr Gly Arg Thr Pro Arg Ala Phe Thr Ser Lys Gly

835 840 845

Gly Lys Val Ser Phe Val Leu Pro Trp Asn Ser Val Ser Ser Val Leu

850 855 860

Pro Val Arg Trp Gly Gly Ala Ser Lys Leu Ser Ser Ala Thr Arg Gly

865 870 875 880

Leu Pro Ala His Ala Asp Trp Gly Thr Ile Tyr Ala Phe Ile Pro Arg

885 890 895

Pro Asn Glu Lys Lys Ser Thr Ala Val Lys His Val Ala Val Tyr Val

900 905 910

Arg Tyr Lys Asn Ala Arg Ala Trp Cys Pro Ser Met Leu Pro Phe Arg

915 920 925

Ser Tyr Lys Gln Lys Met Leu Met Gln Ser Gly Asp Val Glu Thr Asn

930 935 940

Pro Gly Pro Ala Ser Asp Asn Pro Ile Leu Glu Phe Leu Glu Ala Glu

945 950 955 960

Asn Asp Leu Val Thr Leu Ala Ser Leu Trp Lys Met Val His Ser Val

965 970 975

Gln Gln Thr Trp Arg Lys Tyr Val Lys Asn Asp Asn Phe Trp Pro Asn

980 985 990

Leu Leu Ser Glu Leu Val Gly Glu Gly Ser Ile Ala Leu Ala Ala Thr

995 1000 1005

Leu Ser Asn Gln Ala Ser Val Lys Ala Leu Leu Gly Leu His Phe Leu

1010 1015 1020

Ser Arg Gly Leu Asn Tyr Thr Asp Phe Tyr Ser Leu Leu Ile Glu Lys

1025 1030 1035 1040

Cys Ser Ser Phe Phe Thr Val Glu Pro Pro Pro Pro Pro Ala Glu Asn

1045 1050 1055

Leu Met Thr Lys Pro Ser Val Lys Ser Lys Phe Arg Lys Leu Phe Lys

1060 1065 1070

Met Gln Gly Pro Met Asp Thr Val Lys Asp Trp Asn Gln Ile Ala Ala

1075 1080 1085

Gly Leu Lys Asn Phe Gln Phe Val Arg Asp Leu Val Lys Glu Val Val

1090 1095 1100

Asp Trp Leu Gln Ala Trp Ile Asn Lys Glu Lys Ala Ser Pro Val Leu

1105 1110 1115 1120

Gln Tyr Gln Leu Glu Met Lys Lys Leu Gly Pro Val Ala Leu Ala His

1125 1130 1135

Asp Ala Phe Met Ala Gly Ser Gly Pro Pro Leu Gly Asp Asp Gln Ile

1140 1145 1150

Glu Tyr Leu Gln Asn Leu Lys Ser Leu Ala Leu Thr Leu Gly Lys Thr

1155 1160 1165

Asn Leu Ala Gln Ser Leu Thr Thr Met Ile Asn Ala Lys Gln Ser Ser

1170 1175 1180

Ala Gln Arg Val Glu Pro Val Val Val Val Leu Arg Gly Lys Pro Gly

1185 1190 1195 1200

Cys Gly Lys Ser Leu Ala Ser Thr Leu Ile Ala Gln Ala Val Ser Lys

1205 1210 1215

Arg Leu Tyr Gly Ser Gln Ser Val Tyr Ser Leu Pro Pro Asp Pro Asp

1220 1225 1230

Phe Phe Asp Gly Tyr Lys Gly Gln Phe Val Thr Leu Met Asp Asp Leu

1235 1240 1245

Gly Gln Asn Pro Asp Gly Gln Asp Phe Ser Thr Phe Cys Gln Met Val

1250 1255 1260

Ser Thr Ala Gln Phe Leu Pro Asn Met Ala Asp Leu Ala Glu Lys Gly

1265 1270 1275 1280

Arg Pro Phe Thr Ser Asn Leu Ile Ile Ala Thr Thr Asn Leu Pro His

1285 1290 1295

Phe Ser Pro Val Thr Ile Ala Asp Pro Ser Ala Val Ser Arg Arg Ile

1300 1305 1310

Asn Tyr Asp Leu Thr Leu Glu Val Ser Glu Ala Tyr Lys Lys His Thr

1315 1320 1325

Arg Leu Asn Phe Asp Leu Ala Phe Arg Arg Thr Asp Ala Pro Pro Ile

1330 1335 1340

Tyr Pro Phe Ala Ala His Val Pro Phe Val Asp Val Ala Val Arg Phe

1345 1350 1355 1360

Lys Asn Gly His Gln Ser Phe Asn Leu Leu Glu Leu Val Asp Ser Ile

1365 1370 1375

Cys Ala Asp Ile Arg Ala Lys Gln Gln Gly Ala Arg Asn Met Gln Thr

1380 1385 1390

Leu Val Leu Gln Ser Pro Asn Glu Asn Asp Asp Thr Pro Val Asp Glu

1395 1400 1405

Ala Leu Gly Arg Val Leu Thr Pro Ala Ala Val Asp Glu Ala Leu Val

1410 1415 1420

Asp Leu Ala Pro Asp Ala Asp Pro Val Gly Arg Leu Ala Ile Leu Ala

1425 1430 1435 1440

Lys Leu Gly Leu Ala Leu Ala Ala Val Thr Pro Gly Leu Ile Ile Leu

1445 1450 1455

Ala Ala Gly Leu Tyr Lys Tyr Phe Ser Gly Ser Asp Thr Asp Gln Glu

1460 1465 1470

Glu Thr Glu Thr Glu Glu Pro Ala Lys Ala Pro Arg Ser Glu Asn Ala

1475 1480 1485

Tyr Asp Gly Pro Lys Lys Asn Ser Lys Pro Pro Gly Ala Leu Ser Leu

1490 1495 1500

Met Glu Met Gln Gln Pro Asn Val Asp Met Gly Phe Glu Ala Ala Val

1505 1510 1515 1520

Ala Lys Lys Val Val Val Pro Ile Thr Phe Met Val Pro Asn Arg Pro

1525 1530 1535

Ser Gly Leu Thr Gln Ser Ala Leu Leu Val Ala Gly Arg Thr Phe Leu

1540 1545 1550

Ile Asn Glu His Thr Trp Ser Asn Pro Ser Trp Thr Ser Phe Thr Ile

1555 1560 1565

Arg Gly Glu Val His Thr Arg Asp Glu Pro Phe Gln Thr Val His Phe

1570 1575 1580

Thr His His Gly Leu Pro Thr Asp Leu Met Val Val Arg Leu Gly Pro

1585 1590 1595 1600

Gly Asn Ser Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys Phe Gly Leu Asp Gln Met

1605 1610 1615

Pro Ala Arg Asn Ser Arg Val Val Gly Val Ser Ala Ser Tyr Gly Asn

1620 1625 1630

Phe Phe Phe Ser Gly Asn Phe Leu Gly Phe Val Asp Ser Ile Thr Ser

1635 1640 1645

Asp Gln Gly Thr Tyr Ala Arg Leu Phe Arg Tyr Arg Val Thr Thr Tyr

1650 1655 1660

Lys Gly Trp Cys Gly Ser Ala Leu Val Cys Glu Ala Gly Gly Val Arg

1665 1670 1675 1680

Arg Ile Ile Gly Met His Ser Ala Gly Ala Ala Gly Ile Gly Ala Gly

1685 1690 1695

Thr Tyr Ile Ser Lys Leu Gly Leu Ile Lys Ala Leu Lys His Leu Gly

1700 1705 1710

Glu Pro Leu Ala Thr Met Gln Gly Leu Met Thr Glu Leu Glu Pro Gly

1715 1720 1725

Val Thr Val His Val Pro Arg Lys Ser Lys Leu Arg Lys Thr Thr Ala

1730 1735 1740

His Ala Val Tyr Lys Pro Glu Phe Glu Pro Ala Val Leu Ser Lys Phe

1745 1750 1755 1760

Asp Pro Arg Leu Asn Lys Asp Val Asp Leu Asp Glu Val Ile Trp Ser

1765 1770 1775

Lys His Thr Ala Asn Val Pro Tyr Gln Pro Pro Leu Phe Tyr Thr Tyr

1780 1785 1790

Met Ser Glu Tyr Ala His Arg Val Phe Ser Phe Leu Gly Lys Asp Asn

1795 1800 1805

Asp Ile Leu Thr Val Lys Glu Ala Ile Leu Gly Ile Pro Gly Leu Asp

1810 1815 1820

Pro Met Asp Pro His Thr Ala Pro Gly Leu Pro Tyr Ala Ile Ser Gly

1825 1830 1835 1840

Leu Arg Arg Thr Asp Leu Val Asp Phe Ala Asn Gly Thr Val Asp Pro

1845 1850 1855

Ala Leu Ala Met Gln Ile Gln Lys Phe Leu Asp Gly Asp Tyr Ser Asp

1860 1865 1870

His Val Phe Gln Thr Phe Leu Lys Asp Glu Ile Arg Pro Ser Glu Lys

1875 1880 1885

Val Arg Ala Gly Lys Thr Arg Ile Val Asp Val Pro Ser Leu Ala His

1890 1895 1900

Cys Ile Val Gly Arg Met Leu Leu Gly Arg Phe Ala Ala Lys Phe Gln

1905 1910 1915 1920

Ser His Pro Gly Phe Leu Leu Gly Ser Ala Ile Gly Ser Asp Pro Asp

1925 1930 1935

Val Phe Trp Thr Val Ile Gly Ala Gln Leu Glu Gly Arg Lys Asn Thr

1940 1945 1950

Tyr Asp Val Asp Tyr Ser Ala Phe Asp Ser Ser His Gly Thr Gly Ser

1955 1960 1965

Phe Glu Ala Leu Ile Ser His Phe Phe Thr Val Asp Asn Gly Phe Ser

1970 1975 1980

Pro Ala Leu Gly Pro Tyr Leu Arg Ser Leu Ala Val Ser Val His Ala

1985 1990 1995 2000

Tyr Gly Glu Arg Arg Ile Lys Ile Thr Gly Gly Leu Pro Ser Gly Cys

2005 2010 2015

Ala Ala Thr Ser Leu Leu Asn Thr Val Leu Asn Asn Val Ile Ile Arg

2020 2025 2030

Thr Ala Leu Ala Leu Thr Tyr Lys Glu Phe Glu Tyr Asp Met Val Asp

2035 2040 2045

Ile Ile Ala Tyr Gly Asp Asp Leu Leu Val Gly Thr Asp Tyr Asp Leu

2050 2055 2060

Asp Phe Asn Glu Val Ala Arg Arg Ala Ala Lys Leu Gly Tyr Lys Met

2065 2070 2075 2080

Thr Pro Ala Asn Lys Gly Ser Val Phe Pro Pro Thr Ser Ser Leu Ser

2085 2090 2095

Asp Ala Val Phe Leu Lys Arg Lys Phe Val Gln Asn Asn Asp Gly Leu

2100 2105 2110

Tyr Lys Pro Val Met Asp Leu Lys Asn Leu Glu Ala Met Leu Ser Tyr

2115 2120 2125

Phe Lys Pro Gly Thr Leu Leu Glu Lys Leu Gln Ser Val Ser Met Leu

2130 2135 2140

Ala Gln His Ser Gly Lys Glu Glu Tyr Asp Arg Leu Met His Pro Phe

2145 2150 2155 2160

Ala Asp Tyr Gly Ala Val Pro Ser His Glu Tyr Leu Gln Ala Arg Trp

2165 2170 2175

Arg Ala Leu Phe Asp

2180

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttgaaatgg ggggctgggc cct 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgtgtttat ggcagtgttg cc 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tagcgggtct cctcacaaat t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtgtaatcct caccagcaga 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtatccaaat cactctgaca tt 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atagcgtggc ggccaaggcg a 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctagtcactc tggcctctct ctg 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcgaccaact ctaggagatt 20

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgtgtggtgg tccttag 17

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acagcaggct caaactcc 18

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agtttggact tgaccagatg ccg 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gagccagtgc cgtgtgaaga gt 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gccaagtttc aatcccatcc tg 22

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tttttttttt cccttttctg ttccga 26

Claims

1.塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo:1所示。

2.根据权利要求1所述的塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的全基因组序列，其特征在于：塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016的开放阅读框的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1中自5’端第669bp-7211bp所示。

3.一种获得权利要求1所述塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016全基因组序列的方法，包括以下步骤：

1)提取塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016 CGMCC 14885的总RNA；

2)以RNA为模板，在上述引物组合的引导下，用一步RT-PCR方法扩增塞尼卡谷病毒SVV/CH/NM/2016株全基因组的7个核苷酸序列片段：S1，长度为1195bp、S2，长度为1582bp、S3，长度为1386bp、S4，长度为1235bp、S5，长度为1458bp、S6，长度为1075bp和S7，长度为876bp；

3)将7个目的基因片段回收、连接、转化，挑取阳性单克隆菌测序；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中的一步RT-PCR的50μL反应体系包括：总RNA 2μL，2×One Step RT-PCR BufferⅢ25μL，5U/μL的TaKaRa Ex Taq HS 1μL，PrimeScript RT enzyme MixⅡ1μL，20μM的上游引物1μL，20μM的下游引物1μL，无RNA酶水19μL。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中的一步RT-PCR反应程序为：先42℃反转录30min，再95℃预变性3min；然后94℃变性10s、50℃-60℃退火30s-60s、72℃延伸30s-120s，共35个循环；最后72℃延伸10min。