CN105039324B - 一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物及其检测试剂盒，其目的在于克服现有引发中华鳖爆发性死亡的病毒性病原无法确诊的局限，提供一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物，采用该特异性扩增引物检测中华鳖出血病病毒，检测结果特异，结果易判断，有利于中华鳖病毒病的确诊。同时本发明还提供了包含上述引物的检测中华鳖出血病病毒的检测试剂盒，具有普通RT‑PCR和荧光定量RT‑PCR两种，两种试剂盒特异性强，灵敏度高，而且操作简便快捷，填补了目前尚无引发中华鳖出血病病毒的核酸分子检测方法的空白，适合中华鳖出血病病毒的确诊、筛查和预防。

Description

一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物及其检测试 剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物及其检测试剂盒。

背景技术

中华鳖因其特有的营养保健价值，成为我国淡水名优养殖品种，主要分布于浙江、广东、广西、湖南、湖北、江西等省份。其中浙江是中华鳖养殖大省，2014年产量达14万吨，产值达80亿元，是渔业增效、渔民增收的重要支柱产业。鳖病害威胁是养殖业可持续发展的重要瓶颈。常见细菌性病害大多可通过养殖密度控制、水质调控等良好的养殖管理模式来加以控制。但病毒性病害，尤其是高致病性病毒常导致爆发性死亡，给中华鳖养殖业带来巨大威胁。加之苗种的省际、国际流通日益频繁，给鳖病毒性病害的爆发带来了更多不确定因素。苗种产地检疫是水产动物病毒性病害的有效防控措施之一。但由于鳖病毒相关研究滞后，对种鳖或鳖苗开展检疫无从谈起。加之病害一旦发生，因病毒基础信息的缺失，无法确诊，易与细菌性病害混淆，导致滥用药，给食品安全和生态环境也带来极大隐患。加强对中华鳖病毒性病害的基础研究，有利于采取有效的防控措施，为渔业增效、渔民增收保驾护航，并减少食品安全与生态安全的隐患。

据2014年全国中华鳖病害监测报告，在红底板病、腐皮病、胃肠炎病、鳃腺炎病、溃疡综合症5种常见病害中，鳃腺炎死亡率最高，养殖户对该病也是谈之色变。但现有的病害监测手段仅根据临床表现来诊断，无相关的确诊技术。养殖户常提到的“鳃腺炎病”仅是从鳃腺红肿、吐血等症状来判断，实际上各病例病原及发病机理不尽相同，致死率也有很大差异。

中华鳖(Trionyx sinensis) 在分类学上隶属爬行纲，主要分布于中国、日本及东南亚等国家和地区。相对于鱼病而言，有关鳖病害的基础研究较为薄弱，大部分报道只是疾病的诊断和治疗试验。我国对于中华鳖病毒病的研究较为零星，大都基于电镜观察结果。国内已先后报道过中华鳖虹彩病毒(Irido-like virus)、疱疹病毒(Herpes-like virus)、呼肠孤样病毒(Reo-like virus)、弹状样病毒(Rhabdo-like virus)、30-39nm球状病毒等。胡嗣基曾报道疱疹病毒可引起中华鳖体表明显溃疡，腹部有红色出血点或出血斑块（胡嗣基.用盐酸吗啉呱防治甲鱼疱疹病[J].水产科技情报，1995，22（1）：21-22.）；叶普仁报道了鳖鳃腺炎病的病原体可能是病毒，其证据主要来自抗菌药物不能治疗的控制疾病，而病毒灵可很快治愈（叶普仁.鳖鳃腺炎病及治疗[J].淡水渔业，1996，26(1)：42-43.）。陈在贤等从患“红脖子病”的鳖体内分离到一种虹彩病毒，直径120-160 nm左右（陈在贤，郑坚川，江育林.从患“红脖子病”甲鱼体分离到虹彩病毒[J].中国兽医学报1998 ,18(2):135-139.），是目前唯一分类地位被确定、全基因组序列被解析的中华鳖病毒。在此基础上，虹彩病毒相关的免疫学研究、分子生物学鉴定方法等报道也相继出现。但有关虹彩病毒在养殖中未见单独引起爆发性死亡的报道。

目前中华鳖出血病只能临床观察诊断，存在主观性和不确定性，现在尚无引发中华鳖出血病病毒的核酸分子检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有引发中华鳖爆发性死亡的病毒性病原无法确诊的局限，提供一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物，采用该特异性扩增引物检测中华鳖出血病病毒，检测结果特异，结果易判断，有利于中华鳖病毒病的确诊。

同时本发明还提供了包含上述引物的检测中华鳖出血病病毒的检测试剂盒，具有普通RT-PCR和荧光定量RT-PCR两种，两种试剂盒特异性强，灵敏度高，而且操作简便快捷，填补了目前尚无引发中华鳖出血病病毒的核酸分子检测方法的空白，适合中华鳖出血病病毒的确诊、筛查和预防。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物，包括用于普通RT-PCR的特异性扩增引物和用于荧光定量RT-PCR的特异性扩增引物，所述用于普通RT-PCR的特异性扩增引物为引物对TSHSV-F1和TSHSV-R1，TSHSV-F1的核苷酸序列为SEQ ID No：1所示， TSHSV-R1的核苷酸序列为SEQ ID No：2所示； 所述用于荧光定量RT-PCR的特异性扩增引物为引物对TSHSV-F2和TSHSV-R2，TSHSV-F2的核苷酸序列为SEQ ID No：3所示， TSHSV-R2的核苷酸序列为SEQ ID No：4所示。

一种检测中华鳖出血病病毒的普通RT-PCR病毒核酸检测试剂盒，包括反转录反应液和PCR扩增反应液，20-50μL的PCR扩增反应液包括：10-15mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl，50-80mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L 氯化镁，1-2mmol/L dNTP，20-200nmol/L TSHSV-F1引物，20-200nmol/L TSHSV-R1引物， 1-3U DNA聚合酶，1-4μL反转录产物；TSHSV-F1的核苷酸序列为SEQ ID No：1所示， TSHSV-R1的核苷酸序列为SEQ ID No：2所示。

反转录产物为反转录反应液反应后得到。

作为优选，所述反转录反应液包括反应液A和反应液B，反转录反应液总体积10-20μL中反应液A的体积为5-10μL，余量为反应液B；反应液A包括：0.2-0.4μmol/L引物Olig（dT）₁₅，1-3μg 待检样品RNA作为模板；反应液B包括：30-50mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl，50-80mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L 氯化镁，2-10mmol/L 二硫苏糖醇，1-2mmol/L dNTP，10-15vol% DMSO ，5-15wt% PEG-6000，0.1-0.2μg/μL BSA，10-20U RNase 抑制剂，50-200U的 MMLV反转录试剂（Takara，大连来源）。

待检样品RNA的提取方法为：取20-30mg病毒感染的中华鳖肺、脾、肾等组织匀浆，加入350-500μL裂解液匀浆，离心；取上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；用（无核糖核酸酶水，洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA。

一种检测中华鳖出血病病毒的荧光定量RT-PCR病毒核酸检测试剂盒，包括反转录反应液和荧光定量PCR扩增反应液，20-50μL的荧光定量PCR扩增反应液包括：10-15mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 50-80mmol/L 氯化钾，10-50 mmol/L 氯化镁，1-2mmol/L dNTP，20-200nmol/L TSHSV-F2引物，20-200nmol/L TSHSV-R2引物，0.3-0.5μL SYBGreen荧光染料，1-5μL稀释后的反转录产物，1-3U 热启动DNA聚合酶；TSHSV-F2的核苷酸序列为SEQ IDNo：3所示， TSHSV-R2的核苷酸序列为SEQ ID No：4所示。

作为优选，所述反转录反应液包括反应液A和反应液B，反转录反应液总体积10-20μL中反应液A的体积为5-10μL，余量为反应液B；反应液A包括：0.2-0.4μmol/L引物Olig（dT）₁₅，1-3μg待检样品RNA作为模板；反应液B包括：30-50mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl，50-80mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L 氯化镁，2-10mmol/L 二硫苏糖醇，1-2mmol/L dNTP，10-15vol% DMSO ，5-15wt% PEG-6000，0.1-0.2μg/μL BSA，10-20U RNase 抑制剂，50-200U的 MMLV反转录试剂（Takara，大连来源）。

作为优选，稀释后的反转录产物为反转录产物稀释5-10倍所得。

发明人在前期的研究中先后分析了3个不同中华鳖养殖场、被养殖户称之为“鳃腺炎病”的爆发性死亡病样，其内脏各器官组织均出现严重出血症状，发病急，死亡率极高，同一养殖塘一旦发病，一周之内几乎全军覆没。经多次回感试验均可复制出典型临床症状，目前已证实该病原为一高致死性病毒，是中华鳖重大疫病病原。为方便后续研究，依据其症状，暂将该病毒命名为中华鳖出血症病毒（Trionyx Sinensis Hemorrhagic SyndromeVirus，TSHSV)。

本发明针对上述新发现的引起中华鳖出血病的病毒TSHSV，专门设计了针对性的特异性引物，进一步的设计了检测试剂盒，检测结果特异，结果易判断，有利于中华鳖病毒病的确诊，填补了目前尚无引发中华鳖出血病病毒的核酸分子检测方法的空白，适合中华鳖出血病病毒的确诊、筛查和预防。

本发明的有益效果是：

1、试剂盒特异性强，灵敏度高，而且操作简便快捷，填补了目前尚无引发中华鳖出血病病毒的核酸分子检测方法的空白，适合中华鳖出血病病毒的确诊、筛查和预防。

2、避免了临床诊断的主观性和不确定性。

3、本发明首次发现的引起中华鳖重大疫病的新病毒的部分特异性核酸序列为今后的新病毒研究和检测提供了重要基础。

附图说明

图1是普通RT-PCR检测TSHSV病毒核酸特异性序列的凝胶电泳结果图。

图中：M. DNA Marker DL2000； 1. 正常鳖组织匀浆滤液；2. 病鳖组织匀浆滤液

图2是荧光定量RT-PCR检测TSHSV病毒核酸特异性序列的凝胶电泳结果图。

图中：M. DNA Marker DL2000； 1. 病鳖组织匀浆滤液

图3是荧光定量RT-PCR检测TSHSV病毒核酸特异性序列的扩增曲线（显示引物的扩增效率）。

图4是荧光定量RT-PCR检测TSHSV病毒核酸特异性序列的扩增产物的溶解曲线（显示引物的特异性--单峰）。

图5是利用引物TSHSV-F1和TSHSV-F2制备长度为308bp的地高辛标记的核酸探针。

图中：M. DNA marker DL2000; 1. 未标记的对照PCR产物；2.DIG-label 的PCR产物。

图6是利用地高辛标记的核酸探针进行斑点杂交检测组织中病毒特异性核酸序列。

图7是荧光定量RT-PCR检测病毒在不同组织中的分布。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Habor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

操作1：TSHSV部分核酸序列的获取

步骤一：病毒RNA提取

将病鳖（病鳖症状为具有腮腺红肿、糜烂，肝、肠、肺、肾等组织明显出血的症状），病鳖来自湖州当地养殖场）的肝、脾、肺、肾、肠组织取出，冰上匀浆。匀浆液12000g离心20min，取上清，0.22μm细菌过滤器过滤，滤液40000g离心3h，TEN缓冲液(50 mmol Tris-HCL、50 mmol NaCl、5 mmol Na₂EDTA、pH7.4)重悬沉淀，作为含病毒的粗提液。用RNaseA（Takara大连）和DNaseI（Takara大连）处理病毒粗提液以去除样本中大部分宿主自身的核酸（背景核酸）。取356μL的病毒粗提液，加入40μL的DNaseI Buffer，2μL DNaseI，2μLRNaseA ( TaKaRa大连)，短暂离心混匀后，置于37 ℃作用3 h，之后在75℃水浴10 min，灭活核酸酶。取上述核酸酶消化液200μL，用QIAamp MinElute Virus Spin Kit( QIAGEN 德国) 试剂盒提取病毒RNA。

步骤二：随机引物扩增

随机引物扩增使用的反转录引物为FR26V-N 5’-GCCGGAGCTCTGCAGATATCNNNNNN-3’，随机PCR扩增单引物为FR20RV 5’-GCCGGAGCTCTGCAGATATC-3’（ FR26V-N、FR20RV引物参见Huang YH, Huang XH, Liu H, et al. Complete sequence determination of anovel reptile iridovirus isolated from soft-shelled turtle and evolutionaryanalysis of Iridoviridae[J]. BMC Genomics. 2009,10:224-238.）。扩增前首先进行PCR模板的制备。将步骤一提取的病毒RNA作为RNA样品进行后续实验。

RNA样品利用Invitrogen公司的反转录试剂盒（SuperScript Ⅲ ReveseTranscriptase）进行反转录，反转录引物为 FR26 RV-N 。反转录体系为：5× First –Strand Buffer 4 μL，DTT (100 mM）2μL，dNTP（10 mM）1μL，Super Script Ⅲ ReverseTranscriptase 0.5μL，RRI 0.5μL，RNA 模板3μg， FR26 RV-N 引物（1 0 μM）2μL，加水补足反应总体系达20μL。反转录结束后，将产物94℃ 变性3 min ，迅速置于冰上冷却 2 min，加入0.5μL 3’-5 ' exo-Klenow DNA Polymerase（NEB，美国）合成cDNA第二链，反应条件为37℃ 延伸1 h，75℃条件下灭活10 min。产物（双链cDNA）作为后续扩增模板。

上述合成的双链cDNA应用FR20 RV单引物进行随机PC R扩增，反应体系为：10× ExTaq Buffer 5μL，2.5 mM MgCl₂ 5μL，2.5 mM dNTP 4μL，10 μM FR20RV引物4μL，ExTaq 0.5μL，模板5μL，水26. 5μL，反应总体系50μL。PCR反应程序为94 ℃预变性2min，之后进入94℃1min，65 ℃100 s，72℃ 2min循环扩增，循环数40次，最后72℃延伸10min。取5μL PCR产物经琼脂糖电泳检测后，其PCR扩增产物用PCR 产物纯化试剂盒纯化。

步骤三：PCR产物克隆、筛选及测序

步骤二PCR扩增产物经纯化后，用限制性内切酶EcoR V （Takara大连）将引物切除。酶切反应体系为25 μL，其中纯化的PC R产物20μL，EcoR V 2.5 μL，Buffer 2.5 μL。反应条件为37℃，作用时间3 h 。回收500 ~1500 b p目的片段，连接至pSIMPLE 18 EcoRV /BAP Vector（Takara），16℃条件下连接过夜。连接产物转化大肠杆菌 TOP10感受态细胞（天根，北京）。经PCR鉴定，筛选500bp以上片段大小不等的阳性克隆送苏州金维智生物技术有限公司进行测序。

步骤四：病毒部分核酸序列的确定

测序结果应用Blastn和Blastx工具在NCBI数据库中进行核苷酸序列和框架阅读翻译的氨基酸序列比对。在序列比对结果基础上，得到一段453nt与GenBank中猪繁殖与呼吸综合综合症病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的RNA聚合酶部分序列具有32%左右的同源性，该序列即为该病毒的部分核酸序列，该病毒的部分核酸序列已在GenBank登录(GenBank登录号: KR187104)。

操作2：特异性引物的验证

分别采用两对引物检测感染组织匀浆滤液中病毒RNA，同时以未感染的组织匀浆作为对照。根据序列信息，分别设计用于普通RT-PCR的特异性引物TSHSV-F1为5’-AACCGACATCTGACCCATTT-3’（ SEQ ID No：1所示）， TSHSV-R1为5’-AAGAGGGCAGACCAGCGAAG-3’ （ SEQ ID No：2所示），扩增靶序列为308bp（反转录反应体系及条件，PCR扩增反应体系见具体实施方式1的步骤（3）和（4））。PCR扩增的反应条件为：95℃ 预变性5min,95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，35个循环,72℃延伸10min。取10μL上述PCR扩增产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测，判断样品是否含有TSHSV；所述判断具体为：凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯照射下观察电泳结果，如果出现308bp的单一扩增条带，则说明样品中含有TSHSV；反之，则样品中不含TSHSV。

用于荧光定量RT-PCR的特异性引物TSHSV-F2为5’- GGCATGGTAACCAGGCGATTTCAAG-3’ （ SEQ ID No：3所示）， TSHSV-R2为5’-AGAACAAGAGCCGAGACCACGCAAG -3’ （ SEQ IDNo：4所示）， 扩增靶序列为197bp（反转录反应体系及条件，PCR扩增反应体系见具体实施方式2的步骤（4）和（5））。荧光定量RT-PCR采用绝对定量方法。阳性对照样品及标准液配制：阳性对照样品同“普通RT-PCR病毒核酸检测试剂盒”中的阳性模板。使用时，用无核糖核酸酶水将标准质粒稀释，即稀释成浓度分别为1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴拷贝/μl的标准液，作为阳性对照样品标准曲线制作的反应模板。荧光定量RT-PCR采用SybGreen染料。PCR扩增反应条件为：95℃ 10min, 95℃ 30s，60℃ 15s，72℃ 30s，40个循环。荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成获得各样品CT值，并经阳性质粒模板的标准曲线制作，可获得样品的病毒含量。

普通RT-PCR的引物及检测方法的验证结果见图1，在感染鳖组织中扩增出明显特异性条带，片段大小为308bp，与预期相符，而在健康鳖组织样品中未扩增出相应片段，表明该序列仅来自感染后的鳖组织。荧光定量RT-PCR引物及检测方的法验证结果见图2-图4，在感染鳖组织匀浆滤液中检测到特异性核酸片段，从扩增产物的电泳检测及溶解曲线可见，检测的特异性较好。

操作3：利用特异性引物进行斑点杂交检测各组织中的病毒核酸

采用斑点杂交检测病毒在各组织中的分布。杂交探针制备采用PCR DIG ProbeSynthesis Kit (Roche )合成。提取病鳖肺组织总RNA，经MMLV反转录酶（Takara，大连来源）的合成cDNA，以此为模板，引物为TSHSV-F1和TSHSV-R1，合成探针片段大小为308bp。分别提取病鳖肝、脾、肺、肾、肠、心的总RNA，各取3μg总RNA加入RNA inhibitor，短暂离心混匀后点样在尼龙膜上，晾干后，于1200lux紫外交联2min，即可用于杂交。45℃预杂交20min。沸水浴5min变性处理的DIG 标记的DNA 探针加入预热的DIG Easy Hyb，45℃温育过夜。先用2×SSC，0.1% SDS 15℃~25℃洗脱2次，每次5min；再用0.5×SSC，0.1% SDS于65℃~68℃洗脱2 次，每次15min。之后按NBT 显色试剂盒操作说明进行化学显色。利用特异性引物扩增制备长度为308bp的地高辛标记探针的结果见图5。以该探针通过进行斑点杂交、采用化学显色法检测感染鳖各组织的病毒分布，结果见图6，显示在感染鳖各组织中均呈阳性，且肺组织的阳性显色最强，对照鳖各组织均无阳性显色，再次证实该核酸片段特异性存在于感染鳖的各组织中。操作4：利用荧光定量RT-PCR特异性引物检测病毒在组织中的分布

分别取感染4d后的中华鳖肝、脾、肺、肾、肠、心，提取总RNA。以2μg总RNA为模板，用MMLV反转录试剂（Takara，大连来源）合成cDNA，并按1:5稀释cDNA产物，作为后续PCR模板。荧光定量RT-PCR的反应体系为： 10mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl，50mmol/L 氯化钾，15mmol/L 氯化镁，1mmol/L dNTP，5μM的TSHSV-F2和TSHSV-R2引物各0.5μL，0.35μL SybGREEN荧光染料， 5μL稀释后的反转录产物,1 U 热启动DNA聚合酶，无菌双蒸水补足至25μL。

反应条件为：95℃ 10min, 95℃ 30s，60℃ 15s，72℃ 30s，40个循环。以0.5℃/5s的速率从60℃缓慢递增到95℃，连续测定样品的荧光强度以获取熔解曲线。荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成获得各样品CT值，并经阳性质粒模板的标准曲线制作，可获得样品的病毒含量。采用荧光定量方法检测病毒在各组织的分布的结果见图7，也显示肺组织中最高。

具体实施方式1

普通RT-PCR病毒核酸检测试剂盒操作流程为：

（1）阳性模板制备：将利用TSHSV-F1 和TSHSV-R1为特异性引物、病毒感染组织RNA为模板，按照上述操作2普通RT-PCR扩增的308bp靶序列，采用基因克隆技术构建含有308bp特异性序列的阳性质粒分子，所用的标准质粒为T载体，由大连宝生生物Takara公司提供。使用时0.1-1.0ng作为阳性模板。 （2）待测样品RNA的提取：取20-30mg病毒感染的中华鳖肺、脾、肾等组织匀浆，加入350-500μL裂解液匀浆，离心；取上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；用（无核糖核酸酶水，洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA。 （3）反转录反应体系及条件：所述反应液总体积为10-20μL，包括反应液A和反应液B。

配制反应液A，包括：0.2-0.4μmol/L引物Olig（dT）₁₅（Takara，大连），1-3μg上述步骤（2）提取的病毒RNA作为模板，70℃5min后冰浴2min。配制反应液B，包括： 30-50mmol/L的pH8.0-8.5Tris-HCl， 50-80mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L 氯化镁，2-10mmol/L 二硫苏糖醇，1-2mmol/L dNTP，10-15% DMSO（体积分数） ，5-15% PEG-6000（质量分数），0.1-0.2μg/μL BSA（Takara，大连来源），10-20U RNase 抑制剂（Takara，大连来源），50-200U的 MMLV反转录试剂（Takara，大连来源）；待反应液A按上述条件处理后，加入反应液B，混匀，42℃反应1 h得反转录产物。 （4）PCR扩增反应体系：所述反应体系为20-50μL ，配制反应液包括：10-15mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 50-80mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L 氯化镁，1-2mmol/L dNTP，20-200nmol/L TSHSV-F1引物，20-200 nmol/L TSHSV-R1引物，1-4μL上述步骤（3）得到的反转录产物，1-3U DNA聚合酶（Takara，大连来源）。

扩增反应条件及检测： 93-99℃ 预变性3-5min,93-99℃ 30-45s，58-60℃ 15-30s，70-74℃ 25-45s，30-40个循环,70-74℃延伸5-10min。5-10μL扩增产物用1-2%琼脂糖电泳检测。（5）结果判断：出现308bp的单一扩增条带，则说明样品种含有TSHSV；反之，则样品中不含TSHSV。

具体实施方式2

荧光定量RT-PCR病毒核酸检测试剂盒操作流程为：

（1）阳性对照样品及标准液配制：阳性对照样品的制备同具体实施方式21步骤（1）中的阳性模板。使用时，用无核糖核酸酶水将阳性对照样品稀释，即稀释成浓度分别为1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴拷贝/μl的标准液，作为阳性对照样品标准曲线制作的反应模板。 （2）待测样品RNA提取：取20-30mg病毒感染的中华鳖肺、脾、肾等组织匀浆，加入350-500μL裂解液匀浆，离心；取上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；用（无核糖核酸酶水，洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA。 （3）阴性对照样品：健康中华鳖组织RNA 500-1000ng/μL。后续使用同待测样品RNA。 （4）病毒核酸反转录反应体系及条件：所述反应液总体积为10-20μL，包括反应液A和反应液B。

配制反应液A，包括：0.2-0.4μmol/L引物Olig（dT）₁₅（Takara，大连来源），1-3μg上述步骤（2）提取的病毒RNA作为模板，70℃5min后冰浴2min。配制反应B液，包括： 30-50mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 50-80mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L 氯化镁，2-10mmol/L 二硫苏糖醇，1-2mmol/L dNTP，10-15% DMSO（体积分数） ，5-15% PEG-6000（质量分数），0.1-0.2μg/μL BSA（Takara，大连来源），10-20U RNase 抑制剂（Takara，大连来源），50-200U的 MMLV反转录试剂（Takara，大连来源）；待反应液A按上述条件处理后，加入反应液B，混匀，42℃反应1 h得反转录产物。反转录产物稀释5-10倍作为后续荧光定量RT-PCR的模板。 （5）PCR扩增反应体系：所述反应体系为20-50μL ，配制反应液包括：10-15mmol/L的pH8.0-8.5Tris-HCl， 50-80mmol/L 氯化钾，10-50 mmol/L 氯化镁，1-2mmol/L dNTP，20-200nmol/L TSHSV-F2引物，20-200 nmol/L TSHSV-R2引物，0.3-0.5ul SybGREEN荧光染料,1-5μL步骤（4）稀释后的反转录产物,1-3U 热启动DNA聚合酶。将加样后的PCR试剂管放入荧光定量PCR仪中进行扩增，反应循环程序为：93-99℃预变性10min,93-99℃ 30s，58-60℃15s，70-74℃ 30s，35-40个循环。 （6）荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成获得各样品CT值，并经阳性对照样品的标准曲线制作，可获得样品的病毒含量。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省淡水水产研究所

<120> 一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物及其检测试剂盒

<130> 2015.06.30

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaccgacatc tgacccattt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagagggcag accagcgaag 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcatggtaa ccaggcgatt tcaag 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agaacaagag ccgagaccac gcaag 25

Claims (6)

1.一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物，其特征在于：包括用于普通RT-PCR的特异性扩增引物和用于荧光定量RT-PCR的特异性扩增引物，所述用于普通RT-PCR的特异性扩增引物为引物对TSHSV-F1和TSHSV-R1，TSHSV-F1的核苷酸序列为SEQ ID No：1所示，TSHSV-R1的核苷酸序列为SEQ ID No：2所示； 所述用于荧光定量RT-PCR的特异性扩增引物为引物对TSHSV-F2和TSHSV-R2，TSHSV-F2的核苷酸序列为SEQ ID No：3所示， TSHSV-R2的核苷酸序列为SEQ ID No：4所示。

2.一种检测中华鳖出血病病毒的普通RT-PCR病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：包括反转录反应液和PCR扩增反应液，20-50μL的PCR扩增反应液包括：10-15mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 50-80mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L 氯化镁，1-2mmol/L dNTP，20-200nmol/L TSHSV-F1引物，20-200nmol/L TSHSV-R1引物， 1-3U DNA聚合酶，1-4μL反转录产物；TSHSV-F1的核苷酸序列为SEQ ID No：1所示， TSHSV-R1的核苷酸序列为SEQ ID No：2所示。

3.根据权利要求2所述的普通RT-PCR病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述反转录反应液包括反应液A和反应液B，反转录反应液总体积10-20μL中反应液A的体积为5-10μL，余量为反应液B；反应液A包括：0.2-0.4μmol/L引物Olig（dT）₁₅，1-3μg待检样品RNA作为模板；反应液B包括：30-50mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 50-80mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L氯化镁，2-10mmol/L 二硫苏糖醇，1-2mmol/L dNTP，10-15vol% DMSO ，5-15wt% PEG-6000，0.1-0.2μg/μL BSA，10-20U 核糖核酸酶抑制剂，50-200U的 MMLV反转录试剂。

4.一种检测中华鳖出血病病毒的荧光定量RT-PCR病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：包括反转录反应液和荧光定量PCR扩增反应液，20-50μL的荧光定量PCR扩增反应液包括：10-15mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 50-80mmol/L 氯化钾，10-50 mmol/L 氯化镁，1-2mmol/L dNTP，20-200nmol/L TSHSV-F2引物，20-200n mol/L TSHSV-R2引物，0.3-0.5μLSYBGreen荧光染料，1-5μL稀释后的反转录产物，1-3U 热启动DNA聚合酶；TSHSV-F2的核苷酸序列为SEQ ID No：3所示， TSHSV-R2的核苷酸序列为SEQ ID No：4所示。

5.根据权利要求4所述的荧光定量RT-PCR病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述反转录反应液包括反应液A和反应液B，反转录反应液总体积10-20μL中反应液A的体积为5-10μL，余量为反应液B；反应液A包括：0.2-0.4μmol/L引物Olig（dT）₁₅，1-3μg待检样品RNA作为模板；反应液B包括：30-50mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 50-80mmol/L 氯化钾， 10-50mmol/L 氯化镁，2-10mmol/L 二硫苏糖醇，1-2mmol/L dNTP，10-15vol% DMSO ，5-15wt%PEG-6000，0.1-0.2μg/μL BSA，10-20U 核糖核酸酶抑制剂，50-200U的 MMLV反转录试剂。

6.根据权利要求4所述的荧光定量RT-PCR病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：稀释后的反转录产物为反转录产物稀释5-10倍所得。