CN104975086A - 一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒及应用 - Google Patents

一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒及应用 Download PDF

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CN104975086A CN201510330248.9A CN201510330248A CN104975086A CN 104975086 A CN104975086 A CN 104975086A CN 201510330248 A CN201510330248 A CN 201510330248A CN 104975086 A CN104975086 A CN 104975086A
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Abstract

本发明涉及一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒及应用，该试剂盒包括：DNA提取试剂，包括缓冲试剂A和细胞裂解试剂B；PCR反应试剂，包括10倍聚合酶链式反应缓冲液、氯化镁溶液、dNTP、引物VP01、引物VP02、Taq酶与无核酸酶灭菌水；PCR杂交液，包括20倍柠檬酸钠缓冲溶液、十二磺基硫酸钠溶液、甲酰胺3-5μL与Denhardt`s溶液。本发明还提供该试剂盒的应用。本发明检测十分快速，5-6h即可得知检测结果；本发明检测灵敏度高；本发明可以检测多种细菌病毒，如黄杆菌属、弧菌属、霍乱弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、副溶血性弧菌、嗜水性气单胞菌、链球菌属等。

Description

一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及一种快速检测水产品细菌性疾病的试剂盒，尤其涉及一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒及应用。
背景技术
近年来，我国海水养殖业迅猛发展，在过去10年间海水养殖产量增加了5-6倍。但是，前阶段海水养殖的大发展带有很大的盲目性、甚至破坏性，导致这两年海水养殖产量增长开始放缓，尤其是病害的问题变得愈来愈严重。
虾的常见细菌性病害有烂鳃病、褐斑病、红点病三种，一般流行于4月、8月中旬-10月中旬，烂鳃病在发病初期，病虾鳃丝末端开始腐烂，严重时鳃丝大部分溃烂发黑，外部几丁质膜皱缩，病虾呼吸困难，活动迟缓；褐斑病发病初期，虾的甲壳上有斑点状褐黑色溃疡，中间凹陷，边缘往往变白色，严重时一直腐蚀到甲壳层下面组织，变成褐黑色，褐斑通常在鳃部、腹部及其附肢上都有出现，严重时新老几丁质发生粘连，造成蜕皮困难而致死；红点病发病时，病虾的尾部、游泳足、步足上出现红点，并逐步扩大，严重时引起虾死亡。
蟹常见细菌性病害有黑鳃病、腐壳病、肠胃炎三种，一般流行于5月、7月-9月，黑鳃病病发时，病蟹鳃部受到致病菌感染，轻时鳃丝部分呈暗灰色或黑色，重时鳃丝全部变为黑色，病蟹呼吸困难，行动迟钝，轻者有退避能力，重者就陆续死亡，发病时间7-9月份，规格在80克/只以上个体常见发生，危害很大；腐壳病病发时，蟹甲壳受破坏几丁质的细菌感染所致，病蟹的甲壳、步足上出现棕色、深褐色或黑色状病灶，或出现白色斑点，斑点逐步发展连成块状，形成黑色溃疡，严重时甲壳被侵蚀成孔，严重影响蟹摄食，进而导致蟹死亡；肠胃炎病发时，蟹肠胃发炎，打开病蟹脐盖，轻压肛门，可见黄色或淡红色粘液流出，病蟹很少摄食，严重的引起死亡。
水产品细菌性病害的主要病原是弧菌、假单胞菌、黄杆菌、气单胞菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌等。
当前病原检测技术主要是以下几种：1、常规生化检测技术，它是将纯化后的细菌接种到含不同生化物质的培养基中，由于不同种的细菌代谢的物质不完全相同，与培养基中显色剂反应的结果也不相同，将这些结果与标准菌株和文献记录结果对照，就可以得出结论。这种方法结果比较准确，但是十分耗时，而且对新的种类的检测结果并不十分可靠；2、API-20E等快速细菌鉴定试剂盒，它采用检测少数几个生化指标后统计分析得出鉴定结论，相对比较节约时间，但结果不太可靠。
中国专利公开号CN 1410550A，公开日2003年4月16日，名称为一种快速检测对虾桃拉病毒试剂盒，该申请案公开了一种快速检测对虾桃拉病毒试剂盒，主要由以下几种试剂组成，试剂A，组织裂解液；试剂B：RNA提取液；试剂C：桃拉病毒RNA反转录反应液，其中含有特定引物TSV-R15’-TCACCAGGCAGTCCGGCATAAG；试剂D：PCR反应液，其中含有特定引物TSV-F15’-CGAAAGTTGGGTACACGGCAGA。其不足之处在于，只能检测一种病毒。
发明内容
本发明的目的在于为了解决现有常规生化检测技术十分耗时，而且对新的种类的检测结果并不十分可靠的缺陷而提供一种可靠，快速的水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒，所述快速检测试剂盒包括：
a)DNA提取试剂一份：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，缓冲试剂A含有NaCl 0.1-0.3mol/L，pH为7.8-8.2的三羟基甲基氨基甲烷1-80mmol/L，pH为7.8-8.2的乙二胺四乙酸0.1-8mmol/L与体积分数为10-20％的曲拉通X-100；细胞裂解试剂B含有浓度为1-10mg/mL的溶菌酶与pH为7.8-8.2的三羟基甲基氨基甲烷1-80mmol/L；所述快速检测试剂盒还包括：
b)PCR反应试剂甲一份：PCR反应试剂甲含有10倍聚合酶链式反应缓冲液2-4μL、22-27mmol/L的氯化镁溶液1-3μL、2.2-2.7mmol/L的dNTP 1-3μL、3-7mmol/L的引物VP010.1-1μL、3-7mmol/L的引物VP020.1-1μL、3-7U的Taq酶0.1-0.5μL与无核酸酶灭菌水10-15μL；
c)PCR反应试剂乙一份：PCR反应试剂乙含有10倍聚合酶链式反应缓冲液2-4μL、22-27mmol/L的氯化镁溶液1-3μL、2.2-2.7mmol/L的dNTP 1-3μL、3-7mmol/L的引物VP030.1-1μL、3-7mmol/L的引物VP040.1-1μL、3-7U的Taq酶0.1-0.5μL与无核酸酶灭菌水10-15μL；
d)PCR杂交液一份：PCR杂交液由20倍柠檬酸钠缓冲溶液1-5μL、体积分数为10％的十二磺基硫酸钠溶液0.1-0.5μL、质量分数为25％的甲酰胺3-5μL与50倍Denhardts溶液1-3μL组成。
在本技术方案中，试剂A和试剂B将样品中的细菌进行裂解，释放出细菌DNA，然后通过PCR反应试剂进行多聚酶链式反应，对样品释放出的DNA进行特异性的扩增，然后将PCR反应产物与PCR杂交液进行杂交反应，根据碱基互补配对的原则，使得PCR反应产物与基因芯片上的探针杂交形成稳定的双链，间接的对待测序列进行了定性分析。
作为优选，VP01指16SrRNA引物F：GGTTTCGGATGTTACAGCGTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO.1)；
VP02指16SrRNA引物R：GACGGGCGGTGTGTGCA(SEQ ID NO.2)；
VP03指gyrB-F：TGCACTGCAGAAGCGTCCAGCGATGTATATCGG(SEQ ID NO.3)；
VP04指gyrB-R：AGCTGAGCTCCCGGCTGAATCTCCCTCGAC(SEQ ID NO.4)。
在本技术方案中，VP01、VP02、VP03、VP04作为进行PCR反应的特异引物和必需成分，是PCR反应的主要成分。
一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒的应用，依次包括以下步骤：
1)样品处理：取0.1-0.5g样品，用100-300μL的缓冲试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；10000-12000g离心2-4min，留下沉淀，弃上清液；
2)DNA提取：用100-300μL缓冲试剂A再次悬浮步骤1)得到的沉淀，并加入20-80μL细胞裂解试剂B混匀，室温下放置4-5min，再在沸水浴中保温5-10min；然后10000-12000g离心8-10min，取上清液，向上清液中加入上清液体积2-4倍的无水乙醇；在室温下放置5-10min后，10000-12000离心5-8min；弃上清液，用质量分数75-80％的乙醇洗涤沉淀2-3次，待乙醇完全挥发后，将所得沉淀溶于10-50μL灭菌双蒸水中，得到DNA提取液；
3)PCR扩增：取步骤2)得到的DNA提取液1-3μL与PCR反应试剂甲混合，在93-95℃反应3-5min，然后93-95℃变性0.5-1min，在54-58℃复性0.5-1min，72℃下延伸1min-2min，然后变性、复性、延伸步骤循环30-50次，最后在70-75℃下保温5-8min，得到一号PCR产物；另取步骤2)得到的DNA提取液1-3μL与PCR反应试剂乙混合，在93-95℃反应3-5min，然后93-95℃变性0.5-1min，在54-58℃复性0.5-1min，72℃下延伸1min-2min，然后变性、复性、延伸步骤循环30-50次，最后在70-75℃下保温5-8min，得到二号PCR产物；
4)杂交反应：取2.5-3.5μL步骤3)得到的一号PCR产物与2.5-3.5μL步骤3)得到的二号PCR产物混匀，得到PCR产物，然后与PCR杂交液混匀，3000-3500rpm离心25-35s，在93-95℃下变性2-4min，然后骤冷冰浴1-3min，得到PCR杂交反应液；
5)点样检测：将步骤4)得到PCR杂交反应液在基因芯片上均匀点样，放入40-45℃恒温水浴锅中杂交2-2.5h，然后移出基因芯片，并在微生物基因芯片监测系统软件判读，得到结果。
点样所用探针为检测探针与质控探针。
检测探针的设计：从RDPII(http://rdp.cme.msu.edu/)中下载所需要的细菌的核酸序列，分析流程为下载序列数据，整理后导入数据库，抽取所有细菌的通用引物所包括的序列，进行全局联配，根据联配图得到某指定细菌的特征区段，在特征区域设计种特异性探针，再进行引物特异性检验、性能评价和分级，调整Tm值和弃用特异性有问题的探针，最终得到表1所示的检测探针序列。
表1、检测探针表
表2、质控探针表
表3、基因芯片点样表
Hex Hex Hex
PC NC QC
Vib-1 Vib-2 Vib chol-2
Vib chol-3 Vib har Vib alg-1
Vib ang-3 Vib ang-4 Vib par-2
Nac ser-2 Aer-1 Aer-2
Aer hysrophia Str-1 Str-2
Str iniae-1 Str iniae-2 BC
Hex Hex Hex
本发明的主要原理是，试剂A和试剂B将样品中的细菌进行裂解，释放出细菌DNA，然后通过PCR反应试剂进行多聚酶链式反应，对样品释放出的DNA进行特异性的扩增，然后将PCR反应产物与PCR杂交液进行杂交反应，使样品中的DNA与探针根据碱基互补配对的原则充分反应，带有荧光标记的PCR产物与基因芯片上的互补探针杂交结合形成稳定的双链，然后在微生物基因芯片监测系统软件进行判读，得出定性分析结果，判定该细菌的菌属。
本发明基于核酸的检测技术，包括DNA探针和PCR技术，相对于其它的病原检测技术而言，本发明的有益效果是：
1)该方法检测十分快速，5-6h即可得知检测结果，而其他方法则至少需要3天或一个星期以上；
2)该方法检测灵敏度高；
3)该方法可以检测多种细菌病毒，如黄杆菌属、嗜冷黄杆菌、弧菌属、霍乱弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、副溶血性弧菌、诺卡氏菌属、嗜水性气单胞菌、链球菌属等，而其他检测方法则只能检测一种细菌病毒。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步的解释：
曲拉通X-100购自上海研域生物科技有限公司；Taq酶购自凡科维试剂北京分公司，编号为M0091；Denhardt`s购自研域(上海)化学试剂有限公司；基因芯片购自博奥生物有限公司生物芯片北京国家工程研究中心；探针购自上海英俊生物技术有限公司；基因芯片的点样由博奥生物有限公司生物芯片北京国家工程研究中心生产的SmartArrayerTM48微阵列芯片点样系统完成的。
实施例1
一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒，所述快速检测试剂盒包括：
a)DNA提取试剂：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，缓冲试剂A含有0.1mol/L的NaCl，pH为7.8的三羟基甲基氨基甲烷1mmol/L，pH为7.8的乙二胺四乙酸0.1mmol/L与体积分数为10％的曲拉通X-100；细胞裂解试剂B含有浓度为1mg/mL的溶菌酶与pH为7.8的三羟基甲基氨基甲烷1mmol/L；所述快速检测试剂盒还包括：
b)PCR反应试剂甲：PCR反应试剂甲反应试剂含有10倍聚合酶链式反应缓冲液2μL、22mmol/L的氯化镁溶液1μL、2.2mmol/L的dNTP 1μL、3mmol/L的VP010.1μL、3mmol/L的VP020.1μL、3U的Taq酶0.1μL与无核酸酶灭菌水10μL；
c)PCR反应试剂乙：PCR反应试剂乙含有10倍聚合酶链式反应缓冲液2μL、22mmol/L的氯化镁溶液1μL、2.2mmol/L的dNTP 1μL、3mmol/L的VP030.1μL、3mmol/L的VP040.1μL、3U的Taq酶0.1μL与无核酸酶灭菌水10μL；
d)PCR杂交液：PCR杂交液由20倍柠檬酸钠缓冲溶液1μL、体积分数为10％的十二磺基硫酸钠溶液0.1μL、质量分数为25％的甲酰胺3μL与50倍Denhardts溶液1μL组成。其中，VP01指16SrRNA引物F：GGTTTCGGATGTTACAGCGTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQID NO.1)；
VP02指16SrRNA引物R：GACGGGCGGTGTGTGCA(SEQ ID NO.2)；
VP03指gyrB-F：TGCACTGCAGAAGCGTCCAGCGATGTATATCGG(SEQ ID NO.3)；
VP04指gyrB-R：AGCTGAGCTCCCGGCTGAATCTCCCTCGAC(SEQ ID NO.4)。
一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒的应用，依次包括以下步骤：
1)样品处理：取0.1g样品，用100μL的缓冲试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；10000g离心2min，留下沉淀，弃上清液；
2)DNA提取：用100μL缓冲试剂A再次悬浮步骤1)得到的沉淀，并加入20μL细胞裂解试剂B混匀，室温下放置4min，再在沸水浴中保温5min；然后10000g离心8min，向上清液中加入上清液体积2倍的无水乙醇；在室温下放置5min后，10000离心5min；弃上清液，用质量分数75％的乙醇洗涤沉淀2次，待乙醇完全挥发后，将所得沉淀溶于10μL灭菌双蒸水中，得到DNA提取液；
3)PCR扩增：取1μL的DNA提取液与PCR反应试剂甲混合，在93℃反应3min，然后93℃变性30s，在54℃复性30s，72℃下延伸1min，然后变性、复性、延伸步骤循环30次，最后在70℃下保温5min，得到一号PCR产物；另取1μL的DNA提取液与PCR反应试剂乙混合，在93℃反应3min，然后93℃变性30s，在54℃复性30s，72℃下延伸1min，然后变性、复性、延伸步骤循环30次，最后在70℃下保温5min，得到二号PCR产物；
4)杂交反应：取2.5μL步骤3)得到的一号PCR产物取2.5μL步骤3)得到的二号PCR产物混匀,然后与PCR杂交液混匀，3000rpm离心25s，在93℃下变性2min，然后骤冷冰浴1min，得到PCR杂交反应液；
5)点样检测：将步骤4)得到PCR杂交反应液在基因芯片上均匀点样，放入40℃恒温水浴锅中杂交2h，然后移出基因芯片，并在微生物基因芯片监测系统软件判读，得到结果。
实施例2
一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒，所述快速检测试剂盒包括：
a)DNA提取试剂：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，缓冲试剂A含有0.1mol/L的NaCl，pH为8的三羟基甲基氨基甲烷30mmol/L，pH为8的乙二胺四乙酸5mmol/L与体积分数为15％的曲拉通X-100；细胞裂解试剂B含有浓度为5mg/mL的溶菌酶与pH为8的三羟基甲基氨基甲烷40mmol/L；所述快速检测试剂盒还包括：
b)PCR反应试剂甲：PCR反应试剂甲含有10倍聚合酶链式反应缓冲液3μL、25mmol/L的氯化镁溶液2μL、2.4mmol/L的dNTP 2μL、5mmol/L的VP010.5μL、5mmol/L的VP020.5μL、5U的Taq0.3μL与无核酸酶灭菌水12μL；
c)PCR反应试剂乙：PCR反应试剂乙含有10倍聚合酶链式反应缓冲液3μL、25mmol/L的氯化镁溶液2μL、2.4mmol/L的dNTP 2μL、5mmol/L的VP030.5μL、5mmol/L的VP040.5μL、5U的Taq0.3μL与无核酸酶灭菌水12μL；
d)PCR杂交液：杂交液由20倍柠檬酸钠缓冲溶液3μL、体积分数为10％的十二磺基硫酸钠溶液0.3μL、质量分数为25％的甲酰胺4μL与50倍Denhardts溶液2μL组成。其中，
VP01指16SrRNA引物F：GGTTTCGGATGTTACAGCGTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQID NO.1)；
VP02指16SrRNA引物R：GACGGGCGGTGTGTGCA(SEQ ID NO.2)；
VP03指gyrB-F：TGCACTGCAGAAGCGTCCAGCGATGTATATCGG(SEQ ID NO.3)；
VP04指gyrB-R：AGCTGAGCTCCCGGCTGAATCTCCCTCGAC(SEQ ID NO.4)。
一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒的应用，依次包括以下步骤：
1)样品处理：取0.2g样品，用200μL的缓冲试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；11000g离心6min，留下沉淀，弃上清液；
2)DNA提取：用200μL缓冲试剂A再次悬浮步骤1)得到的沉淀，并加入50μL细胞裂解试剂B混匀，室温下放置5min，再在沸水浴中保温8min；然后11000g离心9min，向上清液中加入上清液体积3倍的无水乙醇；在室温下放置8min后，11000离心6min；弃上清液，用质量分数78％的乙醇洗涤沉淀3次，待乙醇完全挥发后，将所得沉淀溶于30μL灭菌双蒸水中，得到DNA提取液；
3)PCR扩增：取2μL的DNA提取液与PCR反应试剂甲混合，在94℃反应4min，然后94℃变性45s，在56℃复性45s，72℃下延伸1.5min，然后变性、复性、延伸步骤循环40次，最后在72℃下保温6min，得到一号PCR产物；另取2μL的DNA提取液与PCR反应试剂乙混合，在94℃反应4min，然后94℃变性45s，在56℃复性45s，72℃下延伸1.5min，然后变性、复性、延伸步骤循环40次，最后在72℃下保温6min，得到二号PCR产物；
4)杂交反应：各取3μL步骤3)得到的一号PCR产物与二号PCR产物混匀，然后与PCR杂交液混匀，3200rpm离心25-35s，在94℃下变性3min，然后骤冷冰浴2min，得到PCR杂交反应液；
5)点样检测：将步骤4)得到PCR杂交反应液在基因芯片上均匀点样，放入42℃恒温水浴锅中杂交2.75h，然后移出基因芯片，并在微生物基因芯片监测系统软件判读，得到结果。
实施例3
一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒，所述快速检测试剂盒包括：
a)DNA提取试剂：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，缓冲试剂A含有0.3mol/L的NaCl，pH为8.2的三羟基甲基氨基甲烷80mmol/L，pH为8.2的乙二胺四乙酸8mmol/L与体积分数为20％的曲拉通X-100；细胞裂解试剂B含有浓度为10mg/mL的溶菌酶与pH为8.2的三羟基甲基氨基甲烷80mmol/L；所述快速检测试剂盒还包括：
b)PCR反应试剂甲：PCR反应试剂甲含有10倍聚合酶链式反应缓冲液4μL、27mmol/L的氯化镁溶液3μL、2.7mmol/L的dNTP 3μL、7mmol/L的VP011μL、7mmol/L的VP021μL、7U的Taq0.5μL与无核酸酶灭菌水15μL；
c)PCR反应试剂乙：PCR反应试剂乙含有10倍聚合酶链式反应缓冲液4μL、27mmol/L的氯化镁溶液3μL、2.7mmol/L的dNTP 3μL、7mmol/L的VP031μL、7mmol/L的VP041μL、7U的Taq0.5μL与无核酸酶灭菌水15μL；
d)PCR杂交液：杂交液由20倍柠檬酸钠缓冲溶液5μL、体积分数为10％的十二磺基硫酸钠溶液0.5μL、质量分数为25％的甲酰胺5μL与50倍Denhardts溶液3μL组成。其中，
VP01指16SrRNA引物F：GGTTTCGGATGTTACAGCGTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQID NO.1)；
VP02指16SrRNA引物R：GACGGGCGGTGTGTGCA(SEQ ID NO.2)；
VP03指gyrB-F：TGCACTGCAGAAGCGTCCAGCGATGTATATCGG(SEQ ID NO.3)；
VP04指gyrB-R：AGCTGAGCTCCCGGCTGAATCTCCCTCGAC(SEQ ID NO.4)。
一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒的应用，依次包括以下步骤：
1)样品处理：取0.5g样品，用300μL的缓冲试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；12000g离心4min，留下沉淀，弃上清液；
2)DNA提取：用300μL缓冲试剂A再次悬浮步骤1)得到的沉淀，并加入80μL细胞裂解试剂B混匀，室温下放置5min，再在沸水浴中保温10min；然后12000g离心10min，向上清液中加入上清液体积4倍的无水乙醇；在室温下放置10min后，12000离心8min；弃上清液，用质量分数80％的乙醇洗涤沉淀3次，待乙醇完全挥发后，将所得沉淀溶于50μL灭菌双蒸水中，得到DNA提取液；
3)PCR扩增：取3μL的DNA提取液与PCR反应试剂甲混合，在95℃反应5min，然后95℃变性1min，在58℃复性1min，72℃下延伸2min，然后变性、复性、延伸步骤循环50次，最后在75℃下保温8min，得到一号PCR产物；另取3μL的DNA提取液与PCR反应试剂乙混合，在95℃反应5min，然后95℃变性1min，在58℃复性1min，72℃下延伸2min，然后变性、复性、延伸步骤循环50次，最后在75℃下保温8min，得到二PCR产物；
4)杂交反应：各取取3.5μL步骤3)得到的一号PCR产物与二号PCR产物混匀，然后与PCR杂交液混匀，3500rpm离心35s，在95℃下变性4min，然后骤冷冰浴3min，得到PCR杂交反应液；
5)点样检测：将步骤4)得到PCR杂交反应液在基因芯片上均匀点样，放入45℃恒温水浴锅中杂交2.5h，然后移出基因芯片，并在微生物基因芯片监测系统软件判读，得到结果。
使用本发明的水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒对表4中各样品进行检测。其中，检测探针选自表1；质控探针选自表2；基因芯片上的点样分布如表3所示。
表4、标准菌株及样品列表
表中，vpa-1、ahy-1、Sin-1、val-1、Aso-1、Nse-1、Van-1、Vha-1为标准菌株。
待杂交反应完成后，用微生物基因芯片检测系统软件进行判读，判读结果为：vpa-1、vpa-2、vpa-3、vpa-4和vpa-5均杂交弧菌属特异性探针Vib-1、Vib-2，判读它们均属弧菌属细菌，其中vpa-1、vpa-2、vpa-3、vpa-4与种特异性探针Vib-par-2杂交，非特异性杂交溶藻弧菌种特异性探针Vib-alg-2，非特异性杂交诺卡氏菌属探针Nac-1，判读Vib-1、Vib-2，vpa-1、vpa-2、vpa-3、vpa-4为副溶血弧菌种；vpa-5非特异性杂交溶藻弧菌种特异性探针Vib-alg-1、Vib-alg-2，且信号较强，判读vpa-5为溶藻弧菌种。
Ahy-1、Ahy-2、Ahy-3、Ahy-4和Ahy-5均杂交气单胞菌属特异性探针Aer-1、Aer-2，判读它们均属气单胞菌属细菌，Ahy-1、Ahy-2、Ahy-3与嗜水气单胞菌种特异性探针Aerhydrophila杂交，判读Ahy-1、Ahy-2、Ahy-3为嗜水气单胞菌种。
Sin-1、Sin-2和Sin-3均杂交链球菌属特异性探针Str-1、Str-2和海豚链球菌种特异性探针Str iniae-1、Str iniae-2，判读Sin-1、Sin-2和Sin-3为链球菌海豚链球菌种细菌。
Val-1、Val-2和Val-3均杂交弧菌属特异性探针Vib-1、Vib-2及溶藻弧菌种特异性探针Vib alg-1、Vib alg-2，判读Val-1、Val-2和Val-3弧菌属溶藻弧菌种细菌。
Aso-1和Aso-3均杂交气单胞菌属特异性探针Aer-1、Aer-2，Aso-2与弧菌属探针Vib-2、诺卡氏菌属探针Nac-1、Nac-2、鰤鱼诺卡氏菌中探针Nac ser-1、Nac ser-2有非特异杂交，判读Aso-1和Aso-3为气单胞菌属细菌，Aso-2可能有污染。
Nse-1、Nse-2和Nse-3均杂交诺卡氏菌属特异性探针Nac-1、Nac-2和鰤鱼诺卡氏菌种特异性探针Nac ser-1、Nac ser-2，判读Nse-1、Nse-2和Nse-3为诺卡氏菌属鰤鱼诺卡氏菌种细菌。
Van-1、Van-2和Van-3均杂交弧菌属特异性探针Vib-1、Vib-2和鳗弧菌种特异性探针Vib ang-1、Vib ang-2、Vib ang-3、Vib ang-4，判读Van-1、Van-2和Van-3为弧菌属鳗弧菌种细菌。
Vha-1、Vha-2和Vha-3均杂交弧菌属特异性探针Vib-1、Vib-2和哈维氏弧菌种特异性探针Vib har，判读Vha-1、Vha-2和Vha-3为弧菌属哈维氏弧菌种细菌。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  浙江省海洋开发研究院
 
<120>  一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒及应用
 
<130>  ZH10012
 
<160>  8    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  40
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  1
ggtttcggat gttacagcgt agagtttgat cctggctcag                           40
 
 
<210>  2
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  2
gacgggcggt gtgtgca                                                    17
 
 
<210>  3
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  3
tgcactgcag aagcgtccag cgatgtatat cgg                                  33
 
 
<210>  4
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  4
agctgagctc ccggctgaat ctccctcgac                                      30
 
 
<210>  5
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  5
gctgcctccc gtaggagt                                                   18
 
 
<210>  6
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  6
ctcatgccca tgccgatgc                                                  19
 
 
<210>  7
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  7
gttgcttctg gaatgagttt gct                                             23
 
 
<210>  8
<211>  50
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  8
gtcacatgcg atggatcgag ctcctttatc atcgttccca ccttaatgca                50
 
 

Claims (3)

1.一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒，所述快速检测试剂盒包括：
a)DNA提取试剂一份：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，缓冲试剂A含有NaCl 0.1-0.3mol/L，pH为7.8-8.2的三羟基甲基氨基甲烷1-80mmol/L，pH为7.8-8.2的乙二胺四乙酸0.1-8mmol/L与体积分数为10-20％的曲拉通X-100；细胞裂解试剂B含有浓度为1-10mg/mL的溶菌酶与pH为7.8-8.2的三羟基甲基氨基甲烷1-80mmol/L；其特征在于，所述快速检测试剂盒还包括：
b)PCR反应试剂甲一份：PCR反应试剂甲含有10倍聚合酶链式反应缓冲液2-4μL、22-27mmol/L的氯化镁溶液1-3μL、2.2-2.7mmol/L的dNTP 1-3μL、3-7mmol/L的引物VP010.1-1μL、3-7mmol/L的引物VP020.1-1μL、3-7U的Taq酶0.1-0.5μL与无核酸酶灭菌水10-15μL；
c)PCR反应试剂乙一份：PCR反应试剂乙含有10倍聚合酶链式反应缓冲液2-4μL、22-27mmol/L的氯化镁溶液1-3μL、2.2-2.7mmol/L的dNTP 1-3μL、3-7mmol/L的引物VP030.1-1μL、3-7mmol/L的引物VP040.1-1μL、3-7U的Taq酶0.1-0.5μL与无核酸酶灭菌水10-15μL；
d)PCR杂交液一份：PCR杂交液由20倍柠檬酸钠缓冲溶液1-5μL、体积分数为10％的十二磺基硫酸钠溶液0.1-0.5μL、质量分数为25％的甲酰胺3-5μL与50倍Denhardts溶液1-3μL组成。
2.根据权利要求1所述的一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒，其特征在于，VP01指16SrRNA引物F：GGTTTCGGATGTTACAGCGTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ IDNO.1)；VP02指16SrRNA引物R：GACGGGCGGTGTGTGCA(SEQ ID NO.2)；
VP03指gyrB-F：TGCACTGCAGAAGCGTCCAGCGATGTATATCGG(SEQ ID NO.3)；
VP04指gyrB-R：AGCTGAGCTCCCGGCTGAATCTCCCTCGAC(SEQ ID NO.4)。
3.一种如根据权利要求1所述的水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒的应用，其特征在于，依次包括以下步骤：
1)样品处理：取0.1-0.5g样品，用100-300μL的缓冲试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；10000-12000g离心2-4min，留下沉淀，弃上清液；
2)DNA提取：用100-300μL缓冲试剂A再次悬浮步骤1)得到的沉淀，并加入20-80μL细胞裂解试剂B混匀，室温下放置4-5min，再在沸水浴中保温5-10min；然后10000-12000g离心8-10min，取上清液，向上清液中加入上清液体积2-4倍的无水乙醇沉淀；在室温下放置5-10min后，10000-12000离心5-8min；弃上清液，用质量分数75-80％的乙醇洗涤沉淀2-3次，待乙醇完全挥发后，将所得沉淀溶于10-50μL灭菌双蒸水中，得到DNA提取液；
3)PCR扩增：取步骤2)得到的DNA提取液1-3μL与PCR反应试剂甲混合，在93-95℃反应3-5min，然后93-95℃变性0.5-1min，在54-58℃复性0.5-1min，72℃下延伸1min-2min，然后变性、复性、延伸步骤循环30-50次，最后在70-75℃下保温5-8min，得到一号PCR产物；另取步骤2)得到的DNA提取液1-3μL与PCR反应试剂乙混合，在93-95℃反应3-5min，然后93-95℃变性0.5-1min，在54-58℃复性0.5-1min，72℃下延伸1min-2min，然后变性、复性、延伸步骤循环30-50次，最后在70-75℃下保温5-8min，得到二号PCR产物；
4)杂交反应：取2.5-3.5μL步骤3)得到的一号PCR产物与2.5-3.5μL步骤3)得到的二号PCR产物混匀，得到PCR产物，然后与PCR杂交液混匀，3000-3500rpm离心25-35s，在93-95℃下变性2-4min，然后骤冷冰浴1-3min，得到PCR杂交反应液；
5)点样检测：将步骤4)得到PCR杂交反应液在基因芯片上均匀点样，放入40-45℃恒温水浴锅中杂交2-2.5h，然后移出基因芯片，并在微生物基因芯片监测系统软件判读，得到结果。
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