CN102747148B - 副溶血性弧菌检测用引物组及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种副溶血性弧菌检测用引物组，包括下列引物：F3引物：GAC GTACCATGTACTAGATC；B3引物：GCCATCACTAGCCATAGCG；FIP引物：CGATCGCCAGCATGCGCGGCATGTCTATTGGTGAGAGGTCTTG；BIP引物：CATGATTTCAATGACGTCCCATTCTGAACCCAAAATCCGGGC。本发明还提供一种使用上述引物组检测副溶血性弧菌的方法。本发明的检测方法具有特异性高、重复性好、快速可靠的优点，为副溶血性弧菌的检测提供一强力有效的手段。
Description
【技术领域】
本发明属于食品安全领域，涉及环介导等温扩增技术，具体涉及一种基于副溶血性弧菌检测用引物组及方法。
【背景技术】
副溶血性弧菌（Bibrio Parahemolyticus），又称嗜盐杆菌，属于非霍乱弧菌，临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状，副溶血性弧菌是最常见的食源性细菌病原体，在多种食物如水产品、腌制品中常会发生副溶血性弧菌污染，在广东、广西、海南、江苏、浙江等养殖老区尤为严重，已成为我国重要的食源性致病菌。
传统副溶血性弧菌检测方法是一种简单的微生物增殖步骤，专门针对以食品为传播载体的病原，虽然可靠的，但却很费力、耗时，需要4～7天才能完成。因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。随着DNA和抗体技术的发展，近10～15年间发展了无数改进的方法，其中许多可以在48h内检出副溶血性弧菌，这些方法通称为快速检测。
环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是日本的荣研株式会的Notomi T等2000年在Nucleic.Acids.Res.杂志上报道的一种新的核酸扩增方法。LAMP方法是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件保温几十分钟，完成核酸扩增反应。可以在1小时之内，将靶基因DNA片段扩增109-1010倍，并且只要用肉眼观察白色混浊沉淀，就能鉴定是否扩增，不需要电泳检测过程。
LAMP方法的原理决定了它具有许多其它DNA扩增方法无法比拟的优点：（1）操作简单，无需特殊设备：LAMP反应在等温状态下就能进行，无需预先进行双链的变性。同时LAMP反应不需要特殊仪器和试剂，只需要将PCR反应 中的Taq DNA聚合换成具有链置换活性的Bst DNA聚合酶；（2）灵敏度高：LAMP方法能检测到比PCR方法还少的拷贝数，其灵敏度可以比PCR法高10～100倍；（3）特异性强：LAMP应体系要求四条引物完全匹配才能进行扩增，信息量大，因此反应体系中的其他模板对反应的干扰很小；（4）速度快，耗时短：LAMP反应不需要加热变性，省去了热循环步骤，40～60min即完成扩增反应；（5）可直接扩增RNA：扩增RNA时，只要在扩增DNA试剂的基础上加上逆转录酶和酶阻抑剂，就能一步实现RNA的扩增；科学家们已经建立了逆转录LAMP（RT-LAMP）方，该方法的灵敏度是RT-PCR方法的100倍；（6）产物检测方便、快捷：LAMP反应只要用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能够判断扩增与否，进行实时验证。
【发明内容】
本发明要解决的一个技术问题是，提供一种对副溶血性弧菌具有特性的引物组。
上述技术问题通过以下技术方案实现：
一种副溶血性弧菌检测用引物组，其特征在于，包括下列引物：
F3引物：GAC GTA CCA TGT ACT AGA TC；
B3引物：GCC ATC ACT AGC CAT AGC G；
FIP引物：
CGA TCG CCA GCA TGC GCG GCA TGT CTA TTG GTG AGA GGT CTTG；
BIP引物：
CAT GAT TTC AAT GAC GTC CCA TTC TGAACC CAAAAT CCG GGC。
本发明要解决的另一个技术问题是，提供一种利用上述引物组基于环介导等温扩增法检测副溶血性弧菌的方法。
上述技术问题通过以下技术方案实现：
一种副溶血性弧菌的检测方法，具体为：
（101）对待检样品提取待检模板DNA
待检样品用增菌液进行培养，得待检增菌液，取1mL待检增菌液，7000×g离心2min，尽量吸弃上清液；加入80μLDNA提取液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min；7000×g离心2min，取上清液作为待检模板DNA；
（102）副溶血性弧菌的环介导等温扩增
按下述LAMP反应体系，在反应管中加入相应反应液、Bst DNA聚合酶，混匀，然后加入稳定液，最后在反应管中加入待检模板DNA，进行65℃环介导等温扩增反应60min；
LAMP反应体系为：
（103）设置空白对照、阴性对照、阳性对照
（131）空白对照：以水替代待检模板DNA另外操作步骤（102）；
（132）阴性对照：以DNA提取液替代待检模板DNA另外操作步骤（102）；
（133）阳性对照：以标准菌株模板DNA替代待检模板DNA另外操作步骤（102）；
（104）检测结果判定
（141）在各反应管中分别加入2μL显色液，轻轻混匀并在黑色背景下观察；
（142）在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：待检模板DNA反应管液体呈绿色，该待检样品结果为副溶血性弧菌初筛阳性；待检模板DNA反应管液体呈橙色，该待检样品结果为副溶血性弧菌阴性。
（143）若与上述条件不符，则本次检测结果无效，重新检测。
当副溶血性弧菌LAMP反应体系的总体积为25μL，副溶血性弧菌LAMP反应体系具体为：
| 组分 | 工作液浓度 | 加样量(μL) | 反应体系终浓度 |
| F3引物 | 10μmol/L | 0.5 | 0.2μmol/L |
| B3引物 | 10μmol/L | 0.5 | 0.2μmol/L |
| FIP引物 | 40μmol/L | 1.0 | 1.6μmol/L |
| BIP引物 | 40μmol/L | 1.0 | 1.6μmol/L |
| dNTPs | 10mmol/L | 4 | 1.6mmol/L |
| 甜菜碱 | 5mol/L | 4 | 0.8mol/L |
| MgSO4 | 150mmol/L | 1 | 8mmol/L |
| ThermoPol缓冲液 | 10× | 2.5 | 1× |
| Bst DNA聚合酶 | 8U/μL | 0.5 | 0.16U/μL |
| 待检模板DNA | / | 2.5 | / |
| 去离子水 | / | 7.5 | / |
所述标准菌株模板DNA，通过如下方法取得：将副溶血性弧菌标准菌株接种于6%胰蛋白胨水中36℃±1℃培养18h～24h，用无菌生理盐水稀释至约106～108CFU/mL，得稀释液，然后取1mL稀释液加到1.5mL无菌离心管中， 7000×g离心2min，尽量吸弃上清液；加入80μLDNA提取液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min；7000×g离心2min，取上清液作为标准菌株模板DNA。
本发明的检测方法具有特异性高、重复性好、快速可靠的优点，为副溶血性弧菌的检测提供一强力有效的手段。
【附图说明】
图1为实施例四PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果。
【具体实施方式】
实施例一
本实施例一提供的一种副溶血性弧菌检测用引物组，包括下列引物：
一种副溶血性弧菌检测用引物组，其特征在于，包括下列引物：
F3引物：GAC GTA CCA TGT ACT AGA TC；
B3引物：GCC ATC ACTAGC CAT AGC G；
FIP引物：
CGA TCG CCA GCA TGC GCG GCA TGT CTA TTG GTG AGA GGT CTTG；
BIP引物：
CAT GAT TTC AAT GAC GTC CCA TTC TGAACC CAAAAT CCG GGC。
利用上述引物对待检样品进行检测副溶血性弧菌，具体如下：
（101）对待检样品提取待检模板DNA
待检样品用3%氯化钠碱性蛋白胨水增菌液进行培养，待检样品用增菌液进行培养，得待检增菌液，取1mL待检增菌液加到1.5mL无菌离心管中，7000×g离心2min，尽量吸弃上清液；加入80μLDNA提取液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min；7000×g离心2min，取上清液作为待检模板DNA，上清液置-20℃可保存6个月备用；
（102）副溶血性弧菌的环介导等温扩增
按下述表一LAMP反应体系（反应总体积为25μL），在反应管中加入相应的引物、dNTPs、ThermoPol缓冲液、MgSO4、Bst DNA聚合酶、水，混匀，然后加入甜菜碱，最后在反应管中加入待检模板DNA，进行65℃环介导等温扩增反应60min；
表一LAMP反应体系
| 组分 | 工作液浓度 | 加样量(μL) | 反应体系终浓度 |
| F3引物 | 10μmol/L | 0.5 | 0.2μmol/L |
| B3引物 | 10μmol/L | 0.5 | 0.2μmol/L |
| FIP引物 | 40μmol/L | 1.0 | 1.6μmol/L |
| BIP引物 | 40μmol/L | 1.0 | 1.6μmol/L |
| dNTPs | 10mmol/L | 4 | 1.6mmol/L |
| 甜菜碱 | 5mol/L | 4 | 0.8mol/L |
| MgSO4 | 150mmol/L | 1 | 8mmol/L |
| ThermoPol缓冲液 | 10× | 2.5 | 1× |
| Bst DNA聚合酶 | 8U/μL | 0.5 | 0.16U/μL |
| 待检模板DNA | / | 2.5 | / |
| 去离子水 | / | 7.5 | / |
（103）设置空白对照、阴性对照、阳性对照
（131）空白对照：以水替代待检模板DNA另外操作步骤（102）；
（132）阴性对照：以非副溶血性弧菌基因组DNA替代待检模板DNA另外操作步骤（102）；
（133）阳性对照：以标准菌株模板DNA替代待检模板DNA另外操作步骤（102）；
标准菌株模板DNA可以通过如下方法取得：将副溶血性弧菌标准菌株接种于6%胰蛋白胨水中36℃±1℃培养18h～24h，用无菌生理盐水稀释至约106～ 108CFU/mL（约麦氏浊度0.4），得稀释液，然后取1mL稀释液加到1.5mL无菌离心管中，7000×g离心2min，尽量吸弃上清液；加入80μLDNA提取液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min；7000×g离心2min，取上清液作为标准菌株模板DNA；
（104）检测结果判定
（141）在上述反应管中分别加入2μL显色液，轻轻混匀并在黑色背景下观察；
（142）在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：待检模板DNA反应管液体呈绿色，该样品结果为副溶血性弧菌初筛阳性；待检模板DNA反应管液体呈橙色，该样品结果为副溶血性弧菌阴性。
（143）若与上述条件不符，则本次检测结果无效，重新检测。
实施例二
在本实例中，主要对实施例一提供的检测方法进行验证可行性，以下分别给出特异性实验、干扰实验的操作及结果。
一、特异性实验，对表二中菌株（经过国标方法确认）的培养液，分别进行下述操作以对实施例一提供的检测方法进行验证：
（201）对菌株提取待检模板DNA：取菌株的培养液1mL加到1.5mL无菌离心管中，7000×g离心2min，尽量吸弃上清液；加入80μL DNA提取液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min；7000×g离心2min，上清液即为待检模板DNA；
（202）按表一副溶血性弧菌LAMP反应体系，在反应管中加入22μL的反应液、0.5μL的Bst DNA聚合酶、30μL的稳定液、2.5μL的待检模板DNA；65℃环介导等温扩增反应60min；
（203）往反应管中加入2μL显色液，封管后轻轻摇匀观察，反应管液体呈绿色，为副溶血性弧菌阳性；反应管液体呈橙色则为副溶血性弧菌阴性。
结果：3株目标菌检测结果阳性，27株临床分离株为阳性，1株拟态弧菌为阳性，其它13株菌均为阴性。
表二副溶血性弧菌及其它菌株
二、干扰实验
（301）取副溶血性弧菌ATCC17802、河弧菌AS 1.1609、霍乱弧菌Vb0、创伤弧菌AS 1.1758，用增菌液分别培养到麦氏浊度约为0.4，分别使用无菌水 进行10倍梯度稀释，以使对应每种菌有稀释度分别为10-1-10-10的十种菌液；
（302）将上述菌液对应混合，分别取得四种待检菌液：（321）终浓度为10-6副溶血性弧菌+10-4河弧菌；（322）终浓度为10-6副溶血性弧菌+10-4霍乱弧菌；（323）终浓度为10-6副溶血性弧菌+10-4创伤弧菌；（324）终浓度为10-5干扰菌株混合菌液（河弧菌AS 1.1609、霍乱弧菌Vb0、创伤弧菌AS 1.1758）；
（303）对各待检菌液提取待检模板DNA：取待检菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，7000×g离心2min，尽量吸弃上清液；加入80μL DNA提取液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min；7000×g离心2min，上清液即为待检模板DNA；
（304）按表一副溶血性弧菌LAMP反应体系，在反应管中加入22μL的反应液、0.5μL的Bst DNA聚合酶、30μL的稳定液、2.5μL的待检模板DNA；65℃环介导等温扩增反应60min；往反应管中加入2μL显色液，封管后轻轻摇匀观察，反应管液体呈绿色，为副溶血性弧菌阳性，呈橙色则为阴性。
结果：副溶血性弧菌分别与河弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌的混合液为阳性，干扰菌株混合菌液为阴性。
综合以上实验结果，表明本方法对副溶血性弧菌检测具有较好的特异性与抗干扰性，但是对拟态弧菌有交叉阳性反应。
实施例三
在本实例中，主要对实施例一提供的检测方法进行灵敏度实验，具体如下：
将副溶血性弧菌液体培养或调节到麦氏浊度约为0.4，再使用无菌水进行10倍梯度稀释，得稀释度分别为10-1-10-10的十种副溶血性弧菌菌液；分别取各梯度的副溶血性弧菌液1mL，同时取等体积生理盐水为空白对照，依据实施例一的检测方法进行检测，确定实施例一的检测方法的检出限；取各梯度的副溶血性弧菌菌液1mL，用平板计数法进行菌落计数，取菌落数在30～300之间的平板计算各稀释度的菌落数；比对LAMP反应结果和菌落计数，确定本检测方法 的检出限2.9×102CFU/mL；实验结果见表三。
表三确定方法检出限的实验结果
实施例四
在本实例中，将实施例一提供的检测方法与PCR方法性能比较，具体如下：
提取副溶血性弧菌的模板DNA，分光光度计法定量稀释为梯度浓度l0-1mg/mL－10-9mg/mL；分别以浓度梯度10-1mg/mL－10-9mg/mL的副溶血性弧菌模板DNA同步进行LAMP和PCR，各分别设置一个空白对照；以LAMP外引物为PCR引物；PCR扩增反应后进行2％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1；从图1中可以看出，随着模板浓度的降低，条带逐渐变淡，至10-8mg/mL时没有扩增产物；LAMP扩增反应后进行2％的琼脂糖凝胶电泳，LAMP方法可检至10-9mg/mL。可见，实施例一提供的检测方法的灵敏度是所用PCR方法的100倍。
实施例五
在本实例中，提供的是人工模拟样品实验，即对食品样品进行人工污染，再通过实施例一提供的检测方法进行检测，进一步来检验本发明方法的灵敏度；具体如下：
（501）接种菌株的制备：取标准副溶血性弧菌菌株接入适当的培养基中，培养至麦氏浊度约为0.4，得接种菌原液，再对接种菌原液使用无菌水进行10倍梯度稀释；在本实施例中，需要稀释有稀释度分别为10-5-10-9的5种副溶血性弧菌菌液；
（502）副溶血性弧菌的菌落计数：吸取副溶血性弧菌菌液1mL，用平板计数法对接种液中副溶血性弧菌进行菌落计数；
（503）人工模拟样品菌液的制备：取25g（mL）食品（以下食品中一种：盒装牛奶、奶粉、贝类、鱼糜、猪肉、冻去骨牛肉、鸡蛋、咖喱酱、冻水饺、方便面），加入1mL副溶血性弧菌菌液，在225mL无菌水进行匀浆，进行食品样品人工污染，增菌处理，得人工模拟样品菌液；在本实施例中，对应稀释度分别为10-5-10-9的5种副溶血性弧菌菌液，每种食品有5种人工模拟样品菌液；
（504）对人工模拟样品菌液提取待测模板DNA的制备：
取1mL人工模拟样品菌液至离心管中，7000×g离心2min，弃上清液；加入80μL DNA提取液，混匀，沸水浴10-20min，置冰上10min；7000×g离心2min，上清液即为待测模板DNA；-20℃保存备用；
（505）LAMP方法检测：按表一副溶血性弧菌LAMP反应体系，在反应管中加入22μL的反应液、0.5μL的Bst DNA聚合酶、30μL的稳定液、2.5μL的待检模板DNA，65℃环介导等温扩增反应60min；
（506）阴性对照、阳性对照设置：以TE缓冲液代替待检模板DNA另外操作步骤（505）作为阴性对照；以副溶血性弧菌DNA代替待检模板DNA另外操作步骤（505）作为阳性对照；
（507）结果观察：在反应管中分别加入2μL显色液后观察结果；在阴性对照反应管为橙色，阳性对照反应管呈绿色的条件下，人工模拟样品菌液反应管呈绿色，则为阳性；人工模拟样品菌液反应管呈橙色，则可报告为阴性；若与上述条件不符，则本次检测结果无效，重新检测；
（508）每种食品的5种人工模拟样品菌液分别重复3次进行步骤（504）-步骤（507）。
实验结果见表四；步骤（501）中的接种菌原液的菌落计数结果表明其浓度为2.8×108CFU/mL，因此，在本实施例中，按实施例一提供的检测方法的检测灵敏度可达100CFU/25g(mL)。
表四人工模拟样品结果
实施例六
抽取市场食品样品180份，其中肉制品50份、水产品50份、调味品30份、乳制品30及蛋制品20份，分别采用本发明提供的方法及传统生化方法检测副溶血性弧菌，以评价LAMP方法与传统生化方法的符合程度。见表五，本发明提供的方法假阳性率4.4%（（15+4+2-12-1）/180=8/180），与传统生化方法结果一致性较好。
表五自然样品检测结果
| 食品种类 | 采样数量 | 传统法检测阳性数 | LAMP检测阳性数 |
| 肉和肉制品 | 50 | 0 | 4 |
| 水产品 | 50 | 12 | 15 |
| 调味品 | 30 | 1 | 2 |
| 乳制品 | 30 | 0 | 0 |
| 蛋制品 | 20 | 0 | 0 |
本发明不局限于上述实施例，基于上述实施例的、未做出创造性劳动的简单替换，应当属于本发明揭露的范围。
序列表
<110>
<120>副溶血性弧菌检测用引物组及方法
<160>4
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
GAC GTA CCA TGT ACT AGA TC
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
GCC ATC ACT AGC CAT AGC G
<210>3
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
CGA TCG CCA GCA TGC GCG GCA TGT CTA TTG GTG AGA GGT CTT G
<210>4
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
CAT GAT TTC AAT GAC GTC CCA TTC TGA ACC CAA AAT CCG GGC 。
Claims (1)
1.一种副溶血性弧菌检测用引物组，其特征在于，包括下列引物：
F3引物：GAC GTA CCA TGT ACT AGA TC；
B3引物：GCC ATC ACT AGC CAT AGC G；
FIP引物：
CGA TCG CCA GCA TGC GCG GCA TGT CTA TTG GTG AGA GGT CTTG；
BIP引物：
CAT GAT TTC AAT GAC GTC CCATTC TGA ACC CAA AAT CCG GGC。
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