CN102747149B - 溶血性链球菌检测用引物组及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种溶血性链球菌检测用引物组，包括下列引物：F3引物：CTC ACAATC GTC TTA GTA；B3引物：CAT AAC ACA CTG GGT TCT TGAAT；FIP引物：CTC TAT GAA TCG CCG GTC TAG ATG TAG ACT GCT CATGTT GTT AGC CTG；BIP引物：CTT CGT GCA TGA TAG GTG GAC GTGAAT CGG GTC AAT CCT ATA GC。本发明还提供一种使用上述引物组检测溶血性链球菌的方法。本发明的检测方法具有特异性高、重复性好、快速可靠的优点，为溶血性链球菌的检测提供一强力有效的手段。
Description
【技术领域】
本发明属于食品安全领域，涉及环介导等温扩增技术，具体涉及一种溶血性链球菌检测用引物组及方法。
【背景技术】
溶血性链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、粘膜伤口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。（1）α-溶血性链球菌：菌落周围有1-2mm宽的草绿色溶血环，也称甲型溶血，这类链球菌多为条件致病菌。（2）β-溶血性链球菌：菌落周围形成一个2-4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，也称乙型溶血，因而这类菌亦称为溶血性链球菌，该菌的致病力强，常引起人类和动物的多种疾病。溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。溶血性链球菌的致病性与其产生的毒素及其侵袭性酶有关。上呼吸道感染患者、人畜化脓性感染部位常成为食品污染的污染源。一般来说，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品：1、食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染；2、食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染；3、熟食制品因包装不善而使食品受到污染。
虽然传统溶血性链球菌检测方法是可靠的，但却很费力、耗时，需要4～7天才能完成。由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时， 通常不被采用。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感且适用的溶血性链球菌检测方法，其中许多可以在48h内检出溶血性链球菌，这些方法通称为快速检测。
环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是日本的荣研株式会的Notomi T等2000年在Nucleic.Acids.Res.杂志上报道的一种新的核酸扩增方法。LAMP方法是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件保温几十分钟，完成核酸扩增反应。可以在1小时之内，将靶基因DNA片段扩增109-1010倍，并且只要用肉眼观察白色混浊沉淀，就能鉴定是否扩增，不需要电泳检测过程。
LAMP方法的原理决定了它具有许多其它DNA扩增方法无法比拟的优点：（1）操作简单，无需特殊设备。LAMP反应在等温状态下就能进行，无需预先进行双链的变性。同时LAMP反应不需要特殊仪器和试剂，只需要将PCR反应中的Taq DNA聚合换成具有链置换活性的Bst DNA聚合酶。（2）灵敏度高。LAMP方法能检测到比PCR方法还少的拷贝数，其灵敏度可以比PCR法高10～100倍。（3）特异性强。LAMP应体系要求四条引物完全匹配才能进行扩增，信息量大，因此反应体系中的其他模板对反应的干扰很小。（4）速度快，耗时短。LAMP反应不需要加热变性，省去了热循环步骤，40～60min即完成扩增反应。（5）可直接扩增RNA。扩增RNA时，只要在扩增DNA试剂的基础上加上逆转录酶和酶阻抑剂，就能一步实现RNA的扩增。科学家们已经建立了逆转录LAMP（RT-LAMP）方，该方法的灵敏度是RT-PCR方法的100倍。（6）产物检测方便、快捷。LAMP反应只要用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能够判断扩增与否，进行实时验证。
【发明内容】
本发明要解决的一个技术问题是，提供一种对溶血性链球菌具有特异性的引物组。
上述技术问题通过以下技术方案实现：
一种溶血性链球菌检测用引物组，其特征在于，包括下列引物：
F3引物：CAGTCAATCCTCGGTCAG；
B3引物：GATTTCACATAAGGATGTGTCTA；
FIP引物：
CAGTATGTATGGCAGGTATCGAAGTAAACAGGTCTTGATGTTAGCCTG；
BIP引物：
GCGTGGGCTTGATAGGTGGACGTTTATACGGTCCTTCGTAAAGC。
本发明要解决的另一个技术问题是，提供一种利用上述引物组基于环介导等温扩增法检测溶血性链球菌的方法。
上述技术问题通过以下技术方案实现：
一种溶血性链球菌的检测方法，具体为：
（101）对待检样品提取待检模板DNA
待检样品用增菌液进行培养，得待检增菌液，取1mL待检增菌液，7000×g离心2min，尽量吸弃上清液；加入80μL DNA提取液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min；7000×g离心2min，取上清液作为待检模板DNA；
（102）溶血性链球菌的环介导等温扩增
按下述LAMP反应体系，在反应管中加入相应反应液、Bst DNA聚合酶，混匀，然后加入稳定液，最后在反应管中加入待检模板DNA，进行65℃环介导等温扩增反应60min；
LAMP反应体系为：
| 组分 | 反应体系终浓度 |
| F3引物 | 0.2μmol/L |
| B3引物 | 0.2μmol/L |
| FIP引物 | 1.6μmol/L |
| BIP引物 | 1.6μmol/L |
| dNTPs | 1.6mmol/L |
| 甜菜碱 | 0.8mol/L |
| MgSO4 | 8mmol/L |
| ThermoPol缓冲液 | 1× |
| Bst DNA聚合酶 | 0.16U/μL |
| 待检模板DNA | / |
| 去离子水 | / |
（103）设置空白对照、阴性对照、阳性对照
（131）空白对照：以水替代待检模板DNA另外操作步骤（102）；
（132）阴性对照：以DNA提取液替代待检模板DNA另外操作步骤（102）；
（133）阳性对照：以溶血性链球菌标准菌株模板DNA替代待检模板DNA另外操作步骤（102）；
（104）检测结果判定
（141）在各反应管中分别加入2μL显色液，轻轻混匀并在黑色背景下观察；
（142）在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：待检模板DNA反应管液体呈绿色，该待检样品结果为溶血性链球菌初筛阳性；待检模板DNA反应管液体呈橙色，该待检样品结果为溶血性链球菌阴性。
（143）若与上述条件不符，则本次检测结果无效，重新检测。
当LAMP反应体系的总体积为25μL，LAMP反应体系具体为：
| 组分 | 工作液浓度 | 加样量（μL） | 反应体系终浓度 |
| F3引物 | 10μmol/L | 0.5 | 0.2μmol/L |
| B3引物 | 10μmol/L | 0.5 | 0.2μmol/L |
| FIP引物 | 40μmol/L | 1.0 | 1.6μmol/L |
| BIP引物 | 40μmol/L | 1.0 | 1.6μmol/L |
| dNTPs | 10mmol/L | 4 | 1.6mmol/L |
| 甜菜碱 | 5mol/L | 4 | 0.8mol/L |
| MgSO4 | 150mmol/L | 1 | 8mmol/L |
| ThermoPol缓冲液 | 10× | 2.5 | 1× |
| Bst DNA聚合酶 | 8U/μL | 0.5 | 0.16U/μL |
| 待检模板DNA | / | 2.5 | / |
| 去离子水 | / | 7.5 | / |
所述标准菌株模板DNA，通过如下方法取得：将溶血性链球菌标准菌株接种于葡萄糖肉浸液肉汤中36℃±1℃培养18h～24h，用无菌生理盐水稀释至约106～108CFU/mL（约麦氏浊度0.4），得稀释液，然后取1mL稀释液加到1.5mL无菌离心管中，7000×g离心2min，吸弃上清液；加入80μL DNA提取液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min；7000×g离心2min，取上清液作为标准菌株模板DNA。
本发明的检测方法具有特异性高、重复性好、快速可靠的优点，为溶血性链球菌的检测提供一强力有效的手段。
【附图说明】
图1为实施例四PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果。
【具体实施方式】
实施例一
本实施例一提供的一种溶血性链球菌检测用引物组，包括下列引物：
F3引物：CTC ACA ATC GTC TTA GTA；
B3引物：CAT AAC ACA CTG GGT TCT TGA AT；
FIP引物：
CTC TAT GAA TCG CCG GTC TAG ATG TAG ACT GCT CAT GTT GTTAGC CTG；
BIP引物：
CTT CGT GCA TGA TAG GTG GAC GTG AAT CGG GTC AAT CCT ATA GC。
利用上述引物对待检样品进行检测溶血性链球菌，具体如下：
（101）对待检样品提取待检模板DNA
待检样品用待检样品用葡萄糖肉浸液肉汤增菌液进行培养，得待检增菌液，取1mL待检增菌液加到1.5mL无菌离心管中，7000×g离心2min，吸弃上清液；加入80μL DNA提取液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min；7000×g离心2min，取上清液作为待检模板DNA，上清液置-20℃可保存6个月备用；
（102）溶血性链球菌的环介导等温扩增
按下述表一LAMP反应体系（反应总体积为25μL），在反应管中加入相应的引物、dNTPs、ThermoPol缓冲液、MgSO4、Bst DNA聚合酶、水，混匀，然后加入甜菜碱，进行65℃环介导等温扩增反应60min；
表一 LAMP反应体系
| 组分 | 工作液浓度 | 加样量（μL） | 反应体系终浓度 |
| F3引物 | 10μmol/L | 0.5 | 0.2μmol/L |
| B3引物 | 10μmol/L | 0.5 | 0.2μmol/L |
| FIP引物 | 40μmol/L | 1.0 | 1.6μmol/L |
| BIP引物 | 40μmol/L | 1.0 | 1.6μmol/L |
| dNTPs | 10mmol/L | 4 | 1.6mmol/L |
| 甜菜碱 | 5mol/L | 4 | 0.8mol/L |
| MgSO4 | 150mmol/L | 1 | 8mmol/L |
| ThermoPol缓冲液 | 10× | 2.5 | 1× |
| Bst DNA聚合酶 | 8U/μL | 0.5 | 0.16U/μL |
| 待检模板DNA | / | 2.5 | / |
| 去离子水 | / | 7.5 | / |
（103）设置空白对照、阴性对照、阳性对照
（131）空白对照：以水替代待检模板DNA另外操作步骤（102）；
（132）阴性对照：以非溶血性链球菌基因组DNA替代待检模板DNA另外操作步骤（102）；
（133）阳性对照：以溶血性链球菌标准菌株模板DNA替代待检模板DNA另外操作步骤（102）；
溶血性链球菌标准菌株模板DNA可以通过如下方法取得：将溶血性链球菌标准菌株接种于葡萄糖肉浸液肉汤中36℃±1℃培养18h～24h，用无菌生理盐水稀释至约106～108CFU/mL（约麦氏浊度0.4），得稀释液，然后取1mL稀释液加到1.5mL无菌离心管中，7000×g离心2min，吸弃上清液；加入80μL DNA提取液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min；7000×g离心2min，取上清液作为标准菌株模板DNA；
（104）检测结果判定
（141）在上述反应管中分别加入2μL显色液，轻轻混匀并在黑色背景下观察；
（142）在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：待检模板DNA反应管液体呈绿色，该样品结果为溶血性链球菌初筛阳性；待检模板DNA反应管液体呈橙色，该样品结果为溶血性链球菌阴性。
（143）若与上述条件不符，则本次检测结果无效，重新检测。
实施例二
在本实例中，主要对实施例一提供的检测方法进行验证可行性，以下分别给出特异性实验、干扰实验的操作及结果。
一、特异性实验，对表二中菌株（经过国标方法确认）经培养所得的菌液，分别进行下述操作以对实施例一提供的检测方法进行验证：
（201）对菌株提取待检模板DNA：取上述菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，7000×g离心2min，尽量吸弃上清液；加入80μL DNA提取液，混匀后 沸水浴10min，置冰上10min；7000×g离心2min，上清液即为待检模板DNA；
（202）按表一溶血性链球菌LAMP反应体系，在反应管中加入22μL的反应液、0.5μL的Bst DNA聚合酶、30μL的稳定液、2.5μL的待检模板DNA；65℃环介导等温扩增反应60min；
（203）往反应管中加入2μL显色液，封管后轻轻摇匀观察，反应管液体呈绿色，为溶血性链球菌阳性；反应管液体呈橙色则为溶血性链球菌阴性。
结果：3株乙型溶血性链球菌检测结果阳性，10株乙型溶血性链球菌分离株为阳性，其它菌株均为阴性。
表二 溶血性链球菌及其它菌株
二、干扰实验
（301）取溶血性链球菌CMCC(B)32210，副溶血弧菌ATCC17802；李斯特 氏菌CCTCCAB97021；金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003；志贺氏菌CMCC51334-20；大肠杆菌CCTCCAB200068；沙门氏菌CCTCCAB94006，用增菌液分别培养到麦氏浊度约为0.4；
（302）将上述菌液分别取1ml对应混合，分别取得七种待检菌液：（321）1mL溶血性链球菌+1mL副溶血弧菌；（322）1mL溶血性链球菌+1mL李斯特氏菌；（323）1mL溶血性链球菌+1mL金黄色葡萄球菌；（324）1mL溶血性链球菌+1mL志贺氏菌；（325）1mL溶血性链球菌+1mL大肠杆菌；（326）1mL溶血性链球菌+1mL沙门氏菌；（327）1mL混合菌液（副溶血性弧菌，李斯特氏菌，金黄色葡萄球菌，志贺氏菌，大肠杆菌，沙门氏菌）；
（303）对各待检菌液提取待检模板DNA：取待检菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，7000×g离心2min，尽量吸弃上清液；加入80μL DNA提取液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min；7000×g离心2min，上清液即为待检模板DNA；
（304）对步骤（303）的各待检模板DNA进行溶血性链球菌的环介导等温扩增：按表一溶血性链球菌LAMP反应体系，在反应管中加入22μL的反应液、0.5μL的Bst DNA聚合酶、30μL的稳定液、2.5μL的待检模板DNA；65℃环介导等温扩增反应60min；往反应管中加入2μL显色液，封管后轻轻摇匀观察，反应管液体呈绿色，为溶血性链球菌阳性，呈橙色则为阴性。
溶血性链球菌分别与副溶血弧菌、李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌的混合液为阳性；干扰菌株的混合菌液为阴性。
综合以上实验结果，表明本方法方法对溶血性链球菌检测具有良好的特异性与抗干扰性，结果见表三，P表示检测结果为阳性，N表示检测结果为阴性。
表三 抗干扰性实验结果
实施例三
在本实例中，主要对实施例一提供的检测方法进行灵敏度实验，具体如下：
将溶血性链球菌肉汤培养到麦氏浊度约为0.4（106～108CFU/mL），进行10倍梯度稀释，得稀释度分别为10-1-10-10的十种溶血性链球菌菌液；分别取各梯度的溶血性链球菌菌液1mL，同时取等体积生理盐水为空白对照，依据实施例一的检测方法进行检测，确定实施例一的检测方法的检出限；取10-4～10-6浓度的溶血性链球菌菌液1mL，用菌落数在30～300之间的平板计算10-4～10-6浓度的溶血性链球菌菌液的菌落数。比对LAMP反应结果和菌落计数，在本次实验中判断实施例一的检测方法灵敏度可达到6.1×104CFU/mL;实验结果见表三。
表三 确定方法检出限的实验结果
实施例四
在本实例中，将实施例一提供的检测方法与PCR方法性能比较，具体如下：
提取溶血性链球菌DNA模板，进行10倍梯度稀释为10-1-10-10浓度菌液，同步进行LAMP和PCR，各分别设置一个空白对照；以LAMP外引物为PCR引物；PCR扩增反应后进行2％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1。从图中可以看出，随着模板浓度的降低，条带逐渐变淡，至10-4时没有扩增产物。LAMP扩增反应后进行2％的琼脂糖凝胶电泳，LAMP方法可检至10-3。该LAMP方法的灵敏度是所用PCR方法的10倍。
实施例五
在本实例中，提供的是人工模拟样品实验，即对食品样品进行人工污染，再通过实施例一提供的检测方法进行检测，进一步来检验本发明方法的灵敏度；具体如下：
（501）接种菌株的制备：取标准溶血性链球菌菌株接入适当的培养基中，培养至麦氏浊度约为0.4，得接种菌原液，再对接种菌原液使用无菌水进行10倍梯度稀释；在本实施例中，需要稀释有稀释度分别为10-5-10-9的5种溶血性链球菌菌液；
（502）溶血性链球菌的菌落计数：吸取溶血性链球菌菌液1mL，用平板计数法对接种液中溶血性链球菌进行菌落计数；
（503）人工模拟样品菌液的制备：取25g（mL）食品（以下食品中一种：盒装牛奶、奶粉、贝类、鱼糜、猪肉、冻去骨牛肉、鸡蛋、咖喱酱、冻水饺、方便面），在225mL无菌生理盐水进行匀浆，加入1mL溶血性链球菌菌液，进行食品样品人工污染，增菌处理，得人工模拟样品菌液；在本实施例中，对应稀释度分别为10-5-10-9的5种溶血性链球菌菌液，每种食品有5种人工模拟样品菌液；
（504）对人工模拟样品菌液提取待测模板DNA的制备：
取1mL人工模拟样品菌液至离心管中，7000×g离心2min，弃上清液；加入80μL DNA提取液，混匀，沸水浴10-20min，置冰上10min；7000×g离心2min，上清液即为待测模板DNA；-20℃保存备用；
（505）LAMP方法检测：按表一溶血性链球菌LAMP反应体系，在反应管中加入22μL的反应液、0.5μL的Bst DNA聚合酶、30μL的稳定液、2.5μL的待检模板DNA，65℃环介导等温扩增反应60min；
（506）阴性对照、阳性对照设置：以TE缓冲液代替待检模板DNA另外操作步骤（505）作为阴性对照；以副溶血性弧菌DNA代替待检模板DNA另外操作步骤（505）作为阳性对照；
（507）结果观察：在反应管中分别加入2μL显色液后观察结果；在阴性对照反应管为橙色，阳性对照反应管呈绿色的条件下，人工模拟样品菌液反应管呈绿色，则为阳性；人工模拟样品菌液反应管呈橙色，则可报告为阴性；若与上述条件不符，则本次检测结果无效，重新检测；
（508）每种食品的5种人工模拟样品菌液分别重复3次进行步骤（504）-步骤（507）。
实验结果见表四；步骤（501）中的接种菌原液的菌落计数结果表明其浓度为4.8×108CFU/mL，因此，在本实施例中，按实施例一提供的检测方法的检测灵敏度可达100CFU/25g(mL)。
表四 人工模拟样品结果
实施例六
抽取市场食品样品180份，其中肉制品50份、水产品50份、调味品30份、乳制品30及蛋制品20份，分别采用本发明提供的方法及传统生化方法检测溶血性链球菌，以评价LAMP方法与传统生化方法的符合程度。见表五，本发明 提供的方法假阳性率1.1%（（4+1+5-2-1-5）/180=2/180），与传统生化方法结果一致性较好。
表五 自然样品检测结果
| 食品种类 | 采样数量 | 传统法检测阳性数 | LAMP检测阳性数 |
| 肉和肉制品 | 50 | 2 | 4 |
| 水产品 | 50 | 1 | 1 |
| 调味品 | 30 | 0 | 0 |
| 乳制品 | 30 | 5 | 5 |
| 蛋制品 | 20 | 0 | 0 |
本发明不局限于上述实施例，基于上述实施例的、未做出创造性劳动的简单替换，应当属于本发明揭露的范围。
序列表
<110>
<120>溶血性链球菌检测用引物组及方法
<160>4
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
CTC ACA ATC GTC TTA GTA
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
CAT AAC ACA CTG GGT TCT TGA AT
<210>3
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
CTC TAT GAA TCG CCG GTC TAG ATG TAG ACT GCT CAT GTT GTT AGC CTG
<210>4
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
CTT CGT GCA TGA TAG GTG GAC GTG AAT CGG GTC AAT CCT ATA GC。
Claims (1)
1.一种溶血性链球菌检测用引物组，其特征在于，包括下列引物：
F3引物：CTC ACA ATC GTC TTA GTA；
B3引物：CAT AAC ACA CTG GGT TCT TGA AT；
FIP引物：
CTC TAT GAA TCG CCG GTC TAG ATG TAG ACT GCT CAT GTT GTTAGC CTG；
BIP引物：
CTT CGT GCA TGA TAG GTG GAC GTG AAT CGG GTC AAT CCT ATAGC。
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| CN101153330A (zh) * | 2007-09-21 | 2008-04-02 | 珠海市疾病预防控制中心 | 副溶血性弧菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒 |
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| 于兆婉等.一起战士乙群溶血性链球菌感染暴发的调查.《解放军预防医学杂志》.2005,第23卷(第6期),第453页. |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102747149A (zh) | 2012-10-24 |
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