CN110747293A - 用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents
用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110747293A CN110747293A CN201911230842.5A CN201911230842A CN110747293A CN 110747293 A CN110747293 A CN 110747293A CN 201911230842 A CN201911230842 A CN 201911230842A CN 110747293 A CN110747293 A CN 110747293A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- foot
- disease virus
- kit
- mouth disease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的三重荧光RT‑PCR检测试剂盒,提供了用于检测猪水泡病毒VP1、口蹄疫病毒5’UTR与猪塞尼卡谷病毒聚合酶3D基因的特异性引物对和MGB探针,以及包括它们的试剂盒和试剂盒使用方法。本试剂盒的原理是:以猪水泡病毒VP1基因、口蹄疫病毒5’UTR基因和猪塞尼卡谷病毒3D基因为分子标识,制备猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒三重荧光RT‑PCR检测试剂盒。本试剂盒可快速甄别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒,可为这三种重要的猪水泡性病毒病提供快速、准确的甄别技术和方法,为一类动物疫病口蹄疫和猪水泡病的诊断和净化提供有力的支撑,同时也为新发猪塞尼卡谷病的流行病学调查提供依托。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测猪水泡症状相关病毒的试剂盒,特别涉及一种用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR核酸检测试剂盒,属于生物制品检测和诊断技术领域。
背景技术
猪水泡病(Swine Vesicular Disease, SVD),又称为猪传染性水泡病,是一种由猪水泡病毒(Swine Vesicular Disease Virus, SVDV)引起的传染病,SVDV属于小RNA病毒科肠道病毒属。临床症状为猪鼻颈部、舌面等处发生水泡等。与口蹄疫病毒具有相似的临床症状,通常很难通过临床诊断作出确诊,二者均被我国划分为一类动物疫病,具有严格的检疫防控措施。
口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus, FMDV)引起的,是偶蹄动物易感的一种急性传染病,可以引起猪、牛、羊等家畜发病,也可以感染70多种野生动物。FMDV属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属,主要包括七个血清型,A、C、O、Asia 1和SouthernAfrican Territories (SATs) 1、 2、和 3型。在我国,该病被列为一类动物疫病和强制免疫计划疫病,在猪群中具有一定的感染情况。该病的检疫要求严格,处理措施明确,因此就要就对该病的诊断要及时准确,尤其要与其他水泡症状疾病进行鉴别诊断。
塞尼卡谷病毒A(Seneca Valley virus,SVV)是一种二十面体无囊膜单股正链不分节段的RNA病毒,是小RNA病毒科塞尼卡病毒属的唯一成员。SVV感染的猪会在鼻吻或口腔等黏膜交界处出现完整或破裂的小水泡,也可能出现跛行、冠状带和蹄壁周围发红或发热,出现溃疡性病变,病猪厌食、嗜睡等症状。2002年,在美国首次报道SVV,确认该病毒存在于PER.C6细胞培养物中,认为是细胞培养基的污染物。在对先前患有水泡症状的病猪保藏样品进行测序分析发现,自20世纪80年代,美国猪群中便存在该病毒。2002-2015年,猪感染SVV的病例只有在美国和加拿大零星发生,但自2015年下半年起,在美国、巴西、哥伦比亚、中国等相继出现了SVV感染猪的病例。2015年初,巴西有6个州报告了SVV感染的疫情。同年,美国中西部多个地区的猪群发生水疱性疫情,感染猪的鼻吻、蹄冠状带部位出现水疱样病变,偶见腹泻症状,病情急促,新生仔猪病死率达30%~70%。后经实验室病原学鉴别诊断,排除口蹄疫、猪水疱病和水疱性口炎等重要动物疫病,最终确诊为SVV感染。2015年5月,我国广东省也发生了SVV感染猪的疫情,其特征是鼻吻和蹄冠部出现明显水泡,发病母猪发热、厌食,产房仔猪急性死亡。2016年10月,泰国北部一猪场爆发SVV疫情。2017年初,我国福建和河南再次发生猪感染SVV的疫情。至此,SVV在我国猪群中明确存在,且有蔓延趋势。
针对以上问题,为加强对猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的监测,急需建立一套能够同时检测猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的方法,为猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的流行病学监测和早期预警提供强有力的技术支撑和储备。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒,利用三重荧光RT-PCR技术,可快捷地甄别猪群中猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒。该试剂盒的机理是:以猪水泡病毒衣壳蛋白VP1基因中的保守序列为分子标识设计引物和MGB探针,同时,分别以口蹄疫病毒5’UTR基因和猪塞尼卡谷病毒3D基因中的保守序列为分子标识设计引物和MGB探针,建立猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒三重检测体系,最终组装成猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒。
本发明通过以下技术方案来实现:用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒,由A盒和B盒组成,A盒含有裂解液、1.5 mL Eppendorf管,B盒含有阳性对照、阴性对照、RT反应液和PCR反应液;所述PCR反应液中有3对引物和3个MGB探针,引物分别用于扩增猪水泡病毒VP1基因片段、口蹄疫病毒5’UTR基因片段和塞尼卡谷病毒3D基因片段,探针分别用于识别猪水泡病毒VP1基因、口蹄疫病毒5’UTR基因和塞尼卡谷病毒3D基因。
进一步的,用于检测猪水泡病毒VP1基因的引物对及其探针序列如下:
SVDV-F:5’-TGTCGATACCATTCATTG-3’
SVDV-R:5’-CGTGTCTCATATATAGTGTC-3’
SVDV-P:5’-FAM-CATCGGCAACGCATACAGCAT-BHQ1-MGB-3’
其中FAM为荧光基团,BHQ-1为淬灭基团;
用于检测猪口蹄疫病毒5’UTR基因的引物对及其探针序列如下:
FMDV-F:5’-CCGGTTAGTACTCTTAACAC-3’
FMDV-R:5’-CGTAGAGCGTCGAACTAA-3’
FMDV-P:5’-ROX-CTCCGCCTACTTGGTCGTCA-BHQ2-MGB-3’
其中ROX为荧光基团,BHQ-2为淬灭基团;
用于检测猪塞尼卡谷病毒3D基因的引物对及其MGB探针序列如下:
SVV-F:5’-CTGGTTGGTACGGATTAC-3’
SVV-R:5’-GGCAGGAGTCATCTTATAC-3’
SVV-P:5’-HEX-CGCCACCTCATTGAAGTCCAG-BHQ1-MGB-3’
其中HEX为荧光基团,BHQ-1为淬灭基团。
进一步的,A盒用于样本核酸的提取,室温保存;B盒用于RNA的逆转录和PCR扩增反应,-20℃保存。
本发明的积极效果是:
1.本发明提供了一种同时检测猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR试剂盒,应用本试剂盒可同时鉴定猪水泡病毒VP1基因、口蹄疫病毒5’UTR基因和塞尼卡谷病毒3D基因。相对于市场上其他核酸检测试剂,本试剂盒为猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的诊断、监测、防控与净化提供了快捷的检测工具,具有重要的实践意义。
2.本发明试剂盒涉及的MGB-Taqman探针,回避了多重RT-PCR中探针、引物以及扩增产物之间干扰的问题。具体如下:首先,探针3’末端利用了本身不产生荧光的BHQ作为淬灭基团,具有灵敏度高且荧光背景低等优点;其次,探针3’末端偶联MGB可以与DNA中小沟结合,形成较为稳定的异源双链,提高Tm值10℃左右,从而增加了荧光RT-PCR检测方法的特异性;最后,MGB探针较短,一般长度约为14-20 bp,尤其适用于变异序列较多的特异性识别,易于设计。同时,3’端的淬灭基团和报告基因的空间位置较近,将较大程度地提升检测结果的准确性以及分辨率。
3.本发明无柱式核酸提取方法,操作快捷简单,且对实验仪器设备的要求较低,大大提高了检测效率和检测成本。此外,本试剂盒将RNA逆转录试剂和PCR反应试剂整合为RT反应液和PCR反应液,使用简单,操作方便,极大的提高了工作效率,方便在临床实践中推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。实施例中的实验材料,若无特别说明,均是来源于商业途径。所述的实验方法,若无特别说明,均为常规实验方法。
用于鉴别检测猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR试剂盒,试剂盒内包括A盒和B盒。A盒内设有裂解液、1.5 mL Eppendorf管,B盒内设有阳性对照、阴性对照、RT反应液、PCR反应液。
所述PCR反应液中有3对引物和3个MGB探针,引物分别用于扩增猪水泡病毒VP1基因片段、口蹄疫病毒5’UTR基因片段和塞尼卡谷病毒3D基因片段,探针分别用于识别猪水泡病毒VP1基因、口蹄疫病毒5’UTR基因和塞尼卡谷病毒3D基因。
一、检测猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的引物及探针
参考GeneBank中收录的猪水泡病毒(No. Y14516.1)、口蹄疫病毒(No. X83209.1)与塞尼卡谷病毒(No. EU271772.1)毒株序列,应用NCBI提供的在线引物设计工具Primer-BLAST进行引物设计,其核苷酸序列如表1所示。
表1 引物和探针序列信息
上述引物和探针由金维智生物科技有限公司合成提供。
二、试剂盒内各试剂的来源和制备过程
2.1 裂解液的制备
称取异硫氰酸胍47.25g,250mmol/L柠檬酸钠(ph7.0)10ml,加DEPC水至100ml;加入0.2mmol/L NaCl(ph4.5)10 ml,氯仿20ml,b-硫基乙醇1ml,混匀,分装,6mL/瓶,置0~4℃保存。
2.2 阳性对照的制备
参考GeneBank中收录猪水泡病毒(No. Y14516.1)、口蹄疫病毒(No. X83209.1)与塞尼卡谷病毒(No. EU271772.1)毒株序列,设计引物分别扩增猪水泡病毒VP1基因、口蹄疫病毒5’UTR基因和塞尼卡谷病毒3D基因片段连接到pMD18-T载体上。用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒,用无RNase纯化水稀释至1×106 copies/µL,分装120 µL/瓶,置于-20℃保存。
2.3阴性对照的制备
将焦炭酸二乙酯与ddH2O按1:1 000的体积比混匀, 4℃放置约14小时。高压灭菌121℃,30min,分装,120 µL/瓶,置于-20℃保存。
2.4 RT反应液的制备
RT缓冲液的配制:取20 mL 0.1mol/L的Tris-HCl(pH 8.4),25 mL 1.0 mol/L的KCl溶液,3mL 0.1mol/L的MgCl2溶液,用无RNase超纯水定容至100 mL,充分混匀。RT反应液的配制:RT缓冲液8 mL,dNTPs(2.5mmol/L) 8 L,反转录酶1 mL,RNA酶抑制剂1 mL,充分混匀,用0.22 μm的除菌滤器过滤,无菌分装成300 µL/瓶,置于-20℃保存。
2.5 PCR反应液的制备
PCR缓冲液配置:取25 mL 1.0 mol/L的Tris-HCl(pH 9.0),20 mL 2.0 mol/L的(NH4)2SO4溶液,2 mL 2.0mol/L的MgSO4溶液,10 mL甘油,用无RNase超纯水定容至100 mL,充分振荡混匀。PCR反应液的配制:5 mL PCR缓冲液,4 mL dNTPs(2.5 mM),1 mL Taq酶,1 mLSVDV-F(20 pmol/µL),1 mL SVDV-R(20 pmol/µL),1 mL SVV-F(20 pmol/µL),1 mL SVV-R(20 pmol/µL),1 mL SVDV -P(20 pmol/µL),1 mL SVV -P(20 pmol/µL),4 mL无Rnase超纯水,充分振荡混匀,用0.22 μm的除菌滤器过滤,无菌分装成600 µL/瓶,置于-20℃保存。
三、测试过程和原理
3.1 测试过程
3.1.1 待检样品的核酸提取
(1)水泡液或血液样品:将20 µL水泡液或血液加入到无菌的1.5 ml Eppendorf管,然后加入100 µL的裂解液,金属浴加热60℃5分钟,12 000 r/min离心2 min,轻轻地将上清吸出置于无RNase的Eppendorf管中,用于检测。
(2)新鲜水泡皮、淋巴结、脾脏、肌肉等组织样品:将4-6 mg组织与100 µL的裂解液充分研磨或用匀浆机打碎,金属浴加热60℃5分钟,12 000 r/min离心2 min,轻轻地将上清吸出置于无RNase的Eppendorf管中,用于检测。
3.1.2 RT-PCR
取出RT反应液和PCR反应液,置于室温融化,按每份取RT反应液5 µL、PCR反应液10 µL的比例预混两种反应液(操作过程要避光),按15 µL/管分装到荧光PCR专用管中;分别向分装好的荧光PCR管中加入5 µL待检样本核酸或阴性对照或阳性对照,在荧光定量PCR仪上运行以下程序: 42℃ 30 min,95℃ 3 min;然后进行94℃ 10 s,60℃ 20 s; 40个循环。
荧光通道选择FAM、ROX和HEX,其中FAM用于检测猪水泡病毒VP1基因,ROX用于检测猪口蹄疫病毒5’UTR基因,HEX用于检测猪塞尼卡谷病毒3D基因,在每个循环的60℃时收集荧光信号。设置扩增体系为20 µL,同时要选择passive reference和quencher为none的模式。
3.1.3 结果判定
基线和阈值设定:基线调整取3-12个循环的荧光信号,阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照检测荧光曲线的最高点;
质量控制:反应结束后,阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线或Ct值>35或无Ct值;阳性对照Ct值均≤35.0,且出现二条明显的扩增曲线,否则实验视为无效;
样品判定:待检样品若FAM通道荧光信号呈指数型增加,且结果显示Ct值<35.0,则报告为猪水泡病毒阳性;待检样品若ROX通道荧光信号呈指数型增加,且结果显示Ct值<35.0,则报告为猪口蹄疫病毒阳性;待检样品若HEX通道荧光信号呈指数型增加,且结果显示Ct值<35.0,则报告为猪塞尼卡谷病毒阳性;待检样品若任何两个通道荧光信号呈指数型增加,且结果显示Ct值<35.0,则报告为通道荧光信号所对应的两种病毒为阳性;待检样品若FAM、ROX和HEX通道荧光信号均呈指数型增加,且结果显示Ct值<35.0,则报告为猪水泡病毒、口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒均为阳性。
3.2试剂盒特异性试验
如表2所示,本试剂盒具有良好的特异性,检测结果不受其他猪水泡症状相关病毒以及常见猪类病毒的干扰。此外,在对猪水泡病毒、口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒毒株核酸样本检测中,试剂盒表现出准确的鉴别区分能力。
表2 试剂盒的特异性试验
注:SVDV代表猪水泡病毒,FMDV代表口蹄疫病毒,SVV代表塞尼卡谷病毒, VSV代表水泡性口炎病毒,PRRSV代表猪繁殖与呼吸综合征病毒,CSFV代表猪瘟病毒,PCV2代表猪圆环病毒2型,PCV3代表猪圆环病毒3型,JEV代表日本乙型脑炎病毒,PRV代表伪狂犬病毒,PEDV代表猪流行性腹泻病毒;括号内为Ct值;“+”代表检测结果阳性,“-”代表检测结果阴性。
3.3 试剂盒敏感性试验
将猪水泡病毒、口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒阳性质粒混合,107 copy/µL,按10倍梯度进行稀释。用本发明的试剂盒检测稀释样本,灵敏度可以达到106稀释度,见表3。
表3 试剂盒的敏感性试验
注:括号内为Ct值;“+”代表检测结果阳性,“-”代表检测结果阴性;猪水泡病毒、口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒毒株阳性核酸由河南省动物疫病防控与营养免疫院士工作站提取保存。
四、试剂盒组装
将各试剂组装成试剂盒,按表4取各组份分别进行密封,粘贴内包装标签。
表4 试剂盒组份
将组装好的试剂盒A盒置于室温保存,B盒置于-20℃保存,间隔45天测定其敏感性和特异性,以确定试剂盒的保存期。本发明的试剂盒保质期为6个月。
序列表
<110> 安阳工学院
<120> 用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Thr Gly Thr Cys Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala Thr Thr Cys Ala Thr
1 5 10 15
Thr Gly
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
Cys Gly Thr Gly Thr Cys Thr Cys Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Gly
1 5 10 15
Thr Gly Thr Cys
20
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
Cys Ala Thr Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Cys Ala Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ala Gly Cys Ala Thr
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
Cys Cys Gly Gly Thr Thr Ala Gly Thr Ala Cys Thr Cys Thr Thr Ala
1 5 10 15
Ala Cys Ala Cys
20
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
Cys Gly Thr Ala Gly Ala Gly Cys Gly Thr Cys Gly Ala Ala Cys Thr
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
Cys Thr Cys Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys Thr Thr Gly Gly Thr Cys
1 5 10 15
Gly Thr Cys Ala
20
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly Gly Ala Thr Thr
1 5 10 15
Ala Cys
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
Gly Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly Thr Cys Ala Thr Cys Thr Thr Ala
1 5 10 15
Thr Ala Cys
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Thr Cys Ala Thr Thr Gly Ala Ala Gly
1 5 10 15
Thr Cys Cys Ala Gly
20
Claims (3)
1.用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒,其特征在于:由A盒和B盒组成,A盒含有裂解液、1.5 mL Eppendorf管,B盒含有阳性对照、阴性对照、RT反应液和PCR反应液;所述PCR反应液中有3对引物和3个MGB探针,引物分别用于扩增猪水泡病毒VP1基因片段、口蹄疫病毒5’UTR基因片段和塞尼卡谷病毒3D基因片段,探针分别用于识别猪水泡病毒VP1基因、口蹄疫病毒5’UTR基因和塞尼卡谷病毒3D基因。
2.根据权利要求1所述的用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒,其特征在于:用于检测猪水泡病毒VP1基因的引物对及其探针序列如下:
SVDV-F:5’-TGTCGATACCATTCATTG-3’
SVDV-R:5’-CGTGTCTCATATATAGTGTC-3’
SVDV-P:5’-FAM-CATCGGCAACGCATACAGCAT-BHQ1-MGB-3’
其中FAM为荧光基团,BHQ-1为淬灭基团;
用于检测猪口蹄疫病毒5’UTR基因的引物对及其探针序列如下:
FMDV-F:5’-CCGGTTAGTACTCTTAACAC-3’
FMDV-R:5’-CGTAGAGCGTCGAACTAA-3’
FMDV-P:5’-ROX-CTCCGCCTACTTGGTCGTCA-BHQ2-MGB-3’
其中ROX为荧光基团,BHQ-2为淬灭基团;
用于检测猪塞尼卡谷病毒3D基因的引物对及其MGB探针序列如下:
SVV-F:5’-CTGGTTGGTACGGATTAC-3’
SVV-R:5’-GGCAGGAGTCATCTTATAC-3’
SVV-P:5’-HEX-CGCCACCTCATTGAAGTCCAG-BHQ1-MGB-3’
其中HEX为荧光基团,BHQ-1为淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒,其特征在于:A盒用于样本核酸的提取,室温保存;B盒用于RNA的逆转录和PCR扩增反应,-20℃保存。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911230842.5A CN110747293B (zh) | 2019-12-05 | 2019-12-05 | 用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911230842.5A CN110747293B (zh) | 2019-12-05 | 2019-12-05 | 用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110747293A true CN110747293A (zh) | 2020-02-04 |
CN110747293B CN110747293B (zh) | 2022-12-23 |
Family
ID=69285537
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201911230842.5A Active CN110747293B (zh) | 2019-12-05 | 2019-12-05 | 用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110747293B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111394367A (zh) * | 2020-03-24 | 2020-07-10 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种塞内卡病毒重组核酸、重组疫苗株及其制备方法和应用 |
CN117304276A (zh) * | 2023-11-30 | 2023-12-29 | 江门海关技术中心 | 含口蹄疫病毒o型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002095074A1 (en) * | 2001-05-18 | 2002-11-28 | Tetracore, Inc. | Foot and mouth disease virus diagnostic and methods |
CN105695628A (zh) * | 2016-03-07 | 2016-06-22 | 华南农业大学 | 一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的hrm检测引物及方法 |
CN107326100A (zh) * | 2017-07-17 | 2017-11-07 | 河南省动物疫病预防控制中心 | 口蹄疫和塞尼卡谷病毒二重实时荧光定量pcr检测试剂盒 |
CN107955840A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-04-24 | 华南农业大学 | 用于检测猪口蹄疫病毒与塞内加谷病毒的双重pcr引物、检测方法及试剂盒 |
CN108384893A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-08-10 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 用于检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的实时荧光定量rt-pcr试剂盒及其应用 |
CN110205405A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-09-06 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种检测和鉴别塞尼卡谷病毒、口蹄疫病毒O、A和Asial型的试剂盒及引物和探针 |
CN110358864A (zh) * | 2019-07-24 | 2019-10-22 | 金宇保灵生物药品有限公司 | Sva、fmdv、svdv和vsv的一步法多重实时荧光定量pcr检测引物和探针 |
-
2019
- 2019-12-05 CN CN201911230842.5A patent/CN110747293B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002095074A1 (en) * | 2001-05-18 | 2002-11-28 | Tetracore, Inc. | Foot and mouth disease virus diagnostic and methods |
CN105695628A (zh) * | 2016-03-07 | 2016-06-22 | 华南农业大学 | 一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的hrm检测引物及方法 |
CN107326100A (zh) * | 2017-07-17 | 2017-11-07 | 河南省动物疫病预防控制中心 | 口蹄疫和塞尼卡谷病毒二重实时荧光定量pcr检测试剂盒 |
CN107955840A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-04-24 | 华南农业大学 | 用于检测猪口蹄疫病毒与塞内加谷病毒的双重pcr引物、检测方法及试剂盒 |
CN110205405A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-09-06 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种检测和鉴别塞尼卡谷病毒、口蹄疫病毒O、A和Asial型的试剂盒及引物和探针 |
CN108384893A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-08-10 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 用于检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的实时荧光定量rt-pcr试剂盒及其应用 |
CN110358864A (zh) * | 2019-07-24 | 2019-10-22 | 金宇保灵生物药品有限公司 | Sva、fmdv、svdv和vsv的一步法多重实时荧光定量pcr检测引物和探针 |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111394367A (zh) * | 2020-03-24 | 2020-07-10 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种塞内卡病毒重组核酸、重组疫苗株及其制备方法和应用 |
CN111394367B (zh) * | 2020-03-24 | 2021-05-14 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种塞内卡病毒重组核酸、重组疫苗株及其制备方法和应用 |
CN117304276A (zh) * | 2023-11-30 | 2023-12-29 | 江门海关技术中心 | 含口蹄疫病毒o型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒 |
CN117304276B (zh) * | 2023-11-30 | 2024-04-12 | 江门海关技术中心 | 含口蹄疫病毒o型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110747293B (zh) | 2022-12-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP4015654A1 (en) | Composition, kit and method for detecting and typing coronaviruses | |
EP4015655B1 (en) | Composition, kit and method for detecting and classifying pathogens causing respiratory tract infections, and application | |
CN111020062A (zh) | 一种检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重实时荧光定量pcr试剂盒 | |
CN111808989A (zh) | 一种冠状病毒/流感病毒/鼻病毒核酸联合检测试剂盒及使用方法 | |
CN110273027B (zh) | 诺如病毒gⅰ、gⅱ和gⅳ型核酸分型检测试剂盒及检测方法 | |
CN107529559B (zh) | 一种手足口病病毒的多重荧光pcr检测试剂盒、及应用 | |
WO2020034317A1 (zh) | 塞内卡病毒和口蹄疫病毒双重实时荧光定量pcr检测试剂及试剂盒 | |
CN111455107A (zh) | 用于检测猫呼吸道病原体的引物组、产品、方法及应用 | |
CN110747293B (zh) | 用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂盒 | |
US20240084402A1 (en) | Detection kit for salmonella typhi , preparation method and application thereof | |
CN107699635B (zh) | 猪流行性腹泻病毒荧光rpa检测方法 | |
CN103695561B (zh) | 检测日本乙型脑炎病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用 | |
CN110205405B (zh) | 一种检测和鉴别塞尼卡谷病毒、口蹄疫病毒O、A和Asial型的试剂盒及引物和探针 | |
CN110656163A (zh) | 一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法 | |
CN114790490A (zh) | 一种可区分牛种和羊种布鲁氏菌的分子标记和检测方法 | |
CN113249517A (zh) | 一种牛疫病实时荧光定量pcr检测用引物和探针及试剂盒 | |
CN106754911B (zh) | 用于鉴定牛支原体、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒的引物组及其应用 | |
CN112195274A (zh) | 一种新型冠状病毒的病毒样本处理液和处理方法及检测病毒的快速恒温反转录扩增试剂盒 | |
CN111321233A (zh) | 一种检测日本吸血虫的荧光raa引物、探针及检测方法 | |
CN116814859A (zh) | 鉴别非洲猪瘟病毒基因ⅰ型和ⅱ型的引物探针组合物、试剂盒及方法 | |
Mudhigeti et al. | Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay for detection and typing of human papilloma virus 16 and 18 from endocervical samples | |
CN105969913A (zh) | 一种同时鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的引物组合及GeXP检测方法 | |
CN110157836B (zh) | 一种检测ibrv和bvdv的引物、探针及方法 | |
CN104830853A (zh) | 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测试剂盒及应用 | |
RU2756474C1 (ru) | Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |