CN117304276B - 含口蹄疫病毒o型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒，属于分子生物技术领域。本发明提供的含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒不仅完全耐受DNaseI和RNaseA的攻击，并且在‑70℃保存18个月，荧光RT‑PCR检测结果均无显著差异。该病毒样颗粒符合临床检测质控样品的要求，可用于制备口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒双重核酸检测试剂盒（PCR‑荧光探针法）试剂盒的阳性参考品。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体的说，涉及含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒。
背景技术
口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）可以引起猪、牛、羊等主要家畜和其他家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、恶性、高度接触性传染病;易感动物达70多种，该病传播途径多、速度快。
塞内卡病毒（Seneca Valley virus，SVV），在遗传上与小RNA病毒科、心病毒属病毒关系相近。临床上能引起猪的鼻吻、蹄冠状带部位出现水疱样病变，偶见腹泻症状，病情急促，新生仔猪病死率达30%～70%。虽然 SVV不会引起重大的经济损失，但由于其感染后表现的临床症状与跨界动物疾病如口蹄疫、猪水疱病、水泡性口炎、猪水泡疹感染后症状相似，常常引起混淆。如果未能及时做出准确的鉴别诊断;将导致防控措施采取不当，养殖成本提高。
鉴于SVV与FMDV 同属于小核糖核酸病毒科，染病猪临床症状相似，主要表现为水泡性病变，及时准确地鉴别检测对疫病防控意义重大。
阳性参考品的制备常用的方法为重组质粒技术，通过酶切技术将目的基因转载入质粒，形成含有目的基因的重组质粒。装甲RNA病毒样颗粒是一种由非病毒自身核酸被病毒衣壳蛋白或包膜蛋白包裹而形成的具有感染性的病毒样颗粒，其只有一个感染周期而无复制能力，无致病性,因而安全性好同时也可模拟真病毒的结构，在核酸提取过程中对病毒体内RNA有很好的模拟作用。在RNA标本的检测过程中，装甲RNA病毒样颗粒能真正做到从样品处理到扩增的全程质量监测，同时病毒RNA不易对实验仪器和环境造成交叉污染而导致假阳性结果。此外装甲RNA病毒样颗粒具有耐核酸酶作用，稳定性好，易于保存和运输等特点。因此,目前，在用于病毒核酸检测试剂盒研发中，以装甲RNA病毒样颗粒代替质粒，作为试剂盒检测的阳性参考品，具有稳定性好、可全程监测的特点和优势。
MS2噬菌体装甲RNA技术是指利用MS2噬菌体外壳蛋白包裹重组RNA的技术。大肠杆菌MS2噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，编码成熟酶蛋白、外壳蛋白、复制酶蛋白及裂解蛋白4种蛋白质分子。MS2噬菌体外壳蛋白与操纵子序列有特异性相互作用，这种作用可在引发噬菌体外壳组装的同时，将噬菌体基因组包装到包膜内。将MS2噬菌体的成熟酶蛋白基因和外壳蛋白基因以及包含基因调节元件的5’非编码序列的基因克隆到表达载体中，经过诱导表达得到成熟酶蛋白和外壳蛋白，并在成熟酶以及噬菌体基因组RNA片段的协同作用下，外壳蛋白可组装为成熟的病毒样颗粒，并具备耐RNase作用的特性。利用基因工程手段，将包含有大肠杆菌MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和外壳蛋白基因以及包含基因调节元件的5’非编码序列基因和外源片段一起克隆到表达载体中，载体将噬菌体基因和外源基因转录成重组，同时载体表达的外壳蛋白进行包装，将重组RNA包装到外壳蛋白内最终形成病毒样颗粒，因其具有稳定、无生物传染性、可以真实模拟病毒粒子结构、耐 RNase、容易制备等特点，已成为RNA病毒核酸检测质控品和标准物质发展的重要方向，在艾滋病病毒、丙型肝炎病毒等核酸检测质控样品和标准物质的研究中显示出良好的应用前景。
发明内容
本发明目的在于提供了一种含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒，可作为口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒双重核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）的阳性参考品进行质量控制，具有稳定性好、可全程监测的特点和优势。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒，该病毒样颗粒含有MS2噬菌体成熟酶蛋白、外壳蛋白和包裹在外壳蛋白内部的重组基因序列，所述重组基因序列由依次相连的口蹄疫病毒O型VP2基因片段和塞内卡病毒P3基因片段组成；所述重组基因序列具有如SEQ ID NO .1所示的核苷酸序列。
本发明提供了一种含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建含有口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒的目的基因的重组质粒，并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌体；
(2)培养使重组菌体大量繁殖传代；
(3)诱导表达，平板挑菌，冷冻离心、Biolonase消化酶消化破碎菌体以获取所述病毒样颗粒粗提物；
(4)纯化粗提物得到所述病毒样颗粒，稀释标定，分装。
含有口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒的目的基因的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：
1）选取口蹄疫病毒O型VP2基因（长度231bp）和塞内卡病毒P3基因（长度140bp）为目的基因片段，将两段目的基因片段拼接在一起形成一条新的基因片段（长度408bp），记为FM-SVA基因片段；
2）在FM-SVA基因片段的两端分别添加HindIII和NotI两个限制性内切酶位点；以pET32表达载体为载体，利用限制性酶切技术在表达载体多克隆位点插入包含有大肠杆菌MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和外壳蛋白基因以及包含基因调节元件的5'非编码序列基因和FM-SVA基因片段，人工合成pAR重组质粒；
3）pAR重组质粒转入TOP10感受态细胞进行克隆培养，经筛选调菌提取质粒，利用HindIII和NotI双酶切及PCR等方法鉴定后得到含有口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒的目的基因的重组质粒。
上述含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒在制备口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒双重核酸检测用阳性质控品中的的应用。
本发明还提供了一种试剂盒，包含上述含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒。
本发明的有益效果：
该技术难点在于在基因片段作为阳性质控品时被口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒的引物探针识别并扩增，为克服拼接基因可能不被引物探针识别扩增的问题，本发明通过筛选目的基因片段及连接序列，最终确定了选用口蹄疫病毒O型VP2基因和塞内卡P3基因作为目的基因片段。经证实，本发明提供的病毒样颗粒不仅完全耐受DNaseI和RNaseA的攻击，并且在-70 ℃保存18个月，荧光RT-PCR检测结果均无显著差异。该病毒样颗粒符合临床检测质控样品的要求，可用于制备口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒双重核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）试剂盒的阳性参考品。
附图说明
图1是口蹄疫病毒O型-塞内卡病毒重组质粒的酶切鉴定结果；图中，1为单酶切结果，M为双酶切结果；
图2是MS2噬菌体PCR鉴定结果图；图中，M为标准DNA参照条带，W1、W2和W3均为MS2噬菌体目的基因PCR产物片段条带；
图3是含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒的荧光RT-PCR鉴定结果；
图4是含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒在-70 ℃保存条件下稳定性结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例1口蹄疫病毒O型-塞内卡病毒重组质粒的构建
1. 质粒信息
选取口蹄疫病毒O型（VP2基因、231bp）和塞内卡病毒（P3基因、140bp）为目的基因片段，将两段目的基片段拼接在一起形成一条新的基因片段（长度408bp），记为FM-SVA基因片段；在FM-SVA基因片段的两端分别添加HindIII和NotI两个限制性内切酶位点；以pET32表达载体为载体，利用限制性酶切技术在表达载体多克隆位点插入包含有大肠杆菌MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和外壳蛋白基因以及包含基因调节元件的5'非编码序列基因和FM-SVA基因片段，人工合成pAR重组质粒；pAR重组质粒转入TOP10感受态细胞进行克隆培养，经筛选调菌提取质粒，鉴定得到含有口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒的目的基因的重组质粒；采用dmem稀释液进行样本的稀释分装；采用冷冻干燥机进行样本冻干，0.37mbar，25小时，即得。以上操作由武汉金开瑞生物工程有限公司代工完成。
口蹄疫病毒O型-塞内卡病毒重组质粒冻干粉，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒的目的基因截短序列并构建以pAR为载体的重组质粒，靶序列均由本实验室自行设计。
含有口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒的目的基因的重组质粒靶序列如下：
CGGAAGCTTGACCTCGACAACCCAGTCGAGCGTTGGAGTCACTTACGGGTACGCAACAGCTGAGGACTTTGTGAGCGGACCAAACACATCTGGGCTTGAGACCAGGGTTGTGCAGGCAGAGCGGTTCTTCAAAACCCACTTGTTCGACTGGGTCACCAGTGACCCGTTTGGACGGTGCTATCTGCTGGAACTCCCAACTGACCACAAAGGTGTCTACGGCAGCCTGACCGACTCTTATGCTTACATGAGAAACGGCTACATTCTGACCGTCAAAGAAGCAATCTTGGGCATCCCTGGACTAGACCCTATGGATCCCCACACAGCTCCGGGTCTGCCCTACGCCATTAGCGGCCTTCGACGTACTGATCTCGTCGATTTTGCGAACGGCACGGTAGACGCGGCCGCACT
口蹄疫病毒O型实时荧光RT-PCR检测方法引物探针序列（T/CVMA 25-2020）：
上游引物：5’-GCTCTTTCCCCACCAGTTCA-3’
下游引物：5’-TTGTACTGGTCGTAGCGGTTGA-3’
探针：5’-FAM-CGGACGAACATGACGGCGCACA-BHQ1-3'
塞内卡病毒实时荧光RT-PCR检测方法引物探针序列（T/CVMA 18-2020 ）：
上游引物：5’-CTGCGCTGGGACCGTATCTCA-3’
下游引物：5’-CGCCGCGCCACCTCATT-3’
探针：5’-FAM-TCGCCGTAAGCGTGCACCGAGACAG-BHQ1-3'
2.主要试剂
胰蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司；氯化钠购自国药试剂有限公司，PEG6000、BSA、琼脂粉、琼脂糖购自广州威佳科技有限公司，BL21感受态细胞、IPTG、RnaseA、甘油购自上海生工有限公司，Biolose购自上海精赛生物科技有限公司，HindII和NotI购自NEB公司。
3.口蹄疫病毒O型-塞内卡病毒重组质粒的检验鉴定
（1）酶切鉴定
对口蹄疫病毒O型-塞内卡病毒重组质粒分别用限制性内切酶HindII和NotI对获得的口蹄疫病毒O型-塞内卡病毒重组质粒进行双酶切，观察是否出现预期目的条带。
具体反应体系见表1。
表1 口蹄疫病毒O型-塞内卡病毒重组质粒酶切反应体系（20μL）
（2）测序鉴定
将 口蹄疫病毒O型-塞内卡病毒重组质粒送去上海生工有限公司测序，确定插入的序列与预期是否一致。
（3）PCR鉴定
以pAR载体内含MS2噬菌体为参考MS2上游引物：5'-CCCATGTCGAAGACAACAAAGA-3'；MS2下游引物： 5'-GTGGTGGTGGTG CTCGAGT-3'进行PCR反应，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后出现预期条带。
4.检验鉴定结果
（1）酶切鉴定
分别用限制性内切酶HindIII、NtoI对获得的口蹄疫病毒O型-塞内卡病毒重组质粒进行单酶切和双酶切，经1%琼脂糖电泳鉴定，酶切片段的大小都约为400bp（图1）。
（2）测序结果
对获得的口蹄疫病毒O型-塞内卡病毒重组质粒进行序列测定，获得的测序序列与设计的序列进行比对分析，两者序列信息一致，碱基准确性为100%。
（3）PCR鉴定
产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后出现预期条带，大小都约为200bp，制备的pAR重组质粒经鉴定后合格，可用于阳性对照的生产制备（图2）。
实施例2 含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒的制备
（1）将重组质粒冻干粉12000r/min离心15min，加入100μL 1×TE溶解备用。
（2）取 BL21 感受态细胞（100μL），冰上解冻10min后加入5μL重组质粒，轻柔混匀，冰浴30min。
（3）42℃热激90s，冰上淬灭5min后加入LB液体培养基900μL，120r/min，37℃振荡培养1h。LB液体培养基配方见表2 ：
表2 LB液体培养基配方
（4）4000r/min离心1min，弃上清，100μL LB液体培养基重悬细菌沉淀，混匀后均匀涂布于LA培养平板（100mL的LB液体培养基中加入1.5g琼脂粉溶解后，高压灭菌，温度降至50-60℃时加入100μL 100mg/mL Amp，轻摇混匀后快速倒平板）。待其表面干燥后，37℃倒置培养过夜（12-16h），可见转化单菌落。
（5）挑取单菌落于1mL的LA液体培养基（100mL的LB液体培养基中加入100μL100mg/mL Amp）中，120r/min，37℃，振荡培养2h后，按照菌液：LA液体培养基=1：100的比例混合，120r/min，37℃，振荡培养2h。
（6）加入1mol/L的IPTG至终浓度为1.0mmol/l，120r/min，37℃振荡培养过夜（约15-16h），转移菌液至15mL离心管，冷冻高速离心机5000r/min离心3min，弃上清。
（7）加入3mL的BSA Buffer洗涤，涡旋振荡混匀后5000r/min离心3min，弃上清；重复一次。BSA Buffer配方见表3：
表3 BSA Buffer配方
（8）1mL BSA Buffer重悬菌体。置于-70℃，15min和 37℃，10min反复冻融三次。加入25U/μL的Biolonase消化酶4μL，37℃水浴消化2.5h，12000r/min离心5min，上清即为装甲RNA病毒粗提物。
（9）取99μL装甲RNA病毒粗提物中加入700μL PBS和200μL 5MNaCl，混匀，冰上放置1h后，加入0.1g PEG6000，充分溶解后，冰上放置2h。12000r/min 4℃ 离心20min，弃上清。
（10）加入500μL LB缓冲液，室温下涡旋振荡2min，静置5min后，12000 r/min离心5min，上清转移至新的EP管。加入 1/10 体积的无菌甘油，充分混匀，短暂低速离心，即完成装甲RNA病毒的制备，获得含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒。
LB缓冲液配方见表4。
表4 LB缓冲液配方
实施例3含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒的鉴定
为验证所制备的含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒含有口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒目的基因 RNA 并且无质粒DNA残留。将实施例2制备得到的装甲RNA病毒悬浮液稀释105倍，使用商品化试剂盒提取RNA，将其分为两份：一份加入反转录酶，一份不加反转录酶，采用OIE推荐的方法进行实时荧光RT-PCR反应。
鉴定结果：
将口蹄疫病毒O型-塞内卡病毒重组质粒转化 BL21 (DE3)感受态细胞，加入IPTG诱导表达，经转录、翻译后，重组表达的噬菌体衣壳蛋白自主装配形成病毒样颗粒，并将SVV的P3基因和FMDV-O的VP2基因的RNA片段包装到粒子内部。表达产物经PEG6000沉淀，加入核酸酶作用后，获得含口蹄疫病毒O型-塞内卡病毒拼接基因序列的装甲RNA病毒悬浮液。利用商品试剂盒提取RNA，进行荧光RT-PCR鉴定。实时荧光RT-PCR检测结果证实，加入反转录酶可以出现典型扩增曲线，而不加反转录酶则未出现扩增曲线(图3)。试验结果表明所制备的装甲RNA病毒包裹了目的基因RNA片段，并且无质粒DNA的残留。
实施例4含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒的稳定性检测
1.保存期试验
将含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒经去离子水适当稀释，每管100 μL分装后分别置于-70 ℃放置3个月、6个月、12个月、18个月后采用商品化试剂盒提取RNA，进行实时荧光 RT-PCR 检测，观察其稳定性。
2.RNase 处理试验
将含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒分别稀释105倍后，每个稀释度做10个复管，分两组进行试验，一组加入RNase A(1 μg/mL) 37 ℃放置 60 min，另一组不做处理。之后同时提取 RNA 进行实时荧光 RT-PCR 检测，采用两样品均数显著性进行Ct值统计学分析。
3. 含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒的稳定性检测结果
（1）采用去离子水将含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒做105倍稀释后，每管 100μL分装之后置于-70 ℃放置3个月、6个月、12个月、18个月后，提取 RNA 进行荧光RT-PCR检测，结果表明含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒在-70 ℃至少可以保存18个月 (图4)，表明含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒具有良好的稳定性。
（2）RNase 处理试验
将含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒分别稀释105倍后，分为RNase 处理组和对照组进行实时荧光RT-PCR检测，每组样品各10份复管，处理组与对照组检测数据作t检验分析，结果表明差异均无统计学意义(p>0.05) (表5)，裸露RNA经处理后检测为无Ct值无扩增曲线，表明制备的含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒能够抵抗RNase的降解。
表5 含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒RNase处理与未处理Ct值t检验结果
装甲RNA作为质控样品具有高度稳定性，可以耐受DNaseI及RNaseA的攻击，本发明提供的含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒不仅完全耐受DNaseI和RNaseA的攻击，并且在-70 ℃保存18个月，荧光RT-PCR检测结果均无显著差异。综上所述，该病毒样颗粒符合临床检测质控样品的要求，可用于制备口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒双重核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）试剂盒的阳性参考品。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (5)
1.含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于：所述病毒样颗粒含有MS2噬菌体成熟酶蛋白、外壳蛋白和包裹在外壳蛋白内部的重组基因序列，所述重组基因序列由依次相连的口蹄疫病毒O型VP2基因片段和塞内卡病毒P3基因片段组成；所述重组基因序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于：所述病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建含有口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒的目的基因的重组质粒，并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌体；
(2)培养使重组菌体大量繁殖传代；
(3)诱导表达，平板挑菌，冷冻离心、Biolonase消化酶消化破碎菌体以获取所述病毒样颗粒粗提物；
(4)纯化粗提物得到所述病毒样颗粒，稀释标定，分装。
3.根据权利要求2所述的含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于：含有口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒的目的基因的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：
1)选取长度231bp的口蹄疫病毒O型VP2基因和长度140bp的塞内卡病毒P3基因为目的基因片段，将两段目的基因片段拼接在一起形成一条新的基因片段，长度为408bp，记为FM-SVA基因片段；
2)在FM-SVA基因片段的两端分别添加HindIII和NotI两个限制性内切酶位点；以pET32表达载体为载体，利用限制性酶切技术在表达载体多克隆位点插入包含有大肠杆菌MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和外壳蛋白基因以及包含基因调节元件的5'非编码序列基因和FM-SVA基因片段，人工合成pAR重组质粒；
3)pAR重组质粒转入TOP10感受态细胞进行克隆培养，经筛选调菌提取质粒，利用HindIII和NotI双酶切及PCR方法鉴定后得到含有口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒的目的基因的重组质粒。
4.如权利要求1-3任一项所述的含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒在制备口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒双重核酸检测用阳性质控品中的的应用。
5.一种试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1-3任一项所述的含口蹄疫病毒O型和塞内卡病毒核酸的病毒样颗粒。
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| 表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组塞内卡病毒的构建与鉴定;黄凯等;动物医学进展;第44卷(第1期);第1-7页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117304276A (zh) | 2023-12-29 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhang Zhan Inventor after: Chen Xinquan Inventor after: Zhou Weiguang Inventor after: Liu Wei Inventor after: Feng Guojin Inventor before: Zhang Zhan Inventor before: Chen Xinquan Inventor before: Zhou Weiguang Inventor before: Liu Wei Inventor before: Feng Guojin |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |