CN108531511A - 一种表达非洲猪瘟病毒e183l基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法 - Google Patents

一种表达非洲猪瘟病毒e183l基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法，属于基因工程技术领域。本发明提供一种表达E183L基因重组腺病毒质粒pAD‑E183L，以pAD‑EF1α‑GFP腺病毒表达载体为基础，在多克隆位点处引入E183L基因。本发明还提供了表达E183L基因的重组腺病毒的制备方法，利用构建得到的pAD‑E183L质粒与腺病毒包装体系PEI混合，实现腺病毒包装过程，得到能够直接感染真核细胞的重组腺病毒，从而实现了E183L基因在真核细胞中正常表达的目的，为研究表达E183L基因重组腺病毒载体候选疫苗奠定基础。

Description

一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法 及重组腺病毒制备方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus,ASFV)引起的猪的一种急性、烈性传染病。临床上以高热、全身性出血和高死亡率为特征。该病对养猪业危害巨大，被OIE列为A类疫病。尽管我国尚无该病的传入，却时刻面临传入的风险。因此，对该病开展储备性研究，对于该病的防范具有重要意义。
ASFV为正20面体，直径约175nm～215nm。由外包膜、病毒衣壳、内包膜、核壳、病毒核酸5个组成部分。病毒核酸为双链DNA，长度为170kb～190kb。病毒基因可编码200多种蛋白质，其中结构蛋白有54种。P54蛋白是ASFV的Ⅰ型跨膜结构蛋白，由E183L基因编码，在病毒的复制过程中起重要作用，参与该病毒对细胞的吸附和侵入，能引起宿主细胞凋亡，在病毒变形和感染早期起重要作用。P54蛋白可生成二硫键，在ASFV转染细胞时，形成包膜前体，通过靶向定位内质网膜进行蛋白表达，损伤细胞，P54抗体可中和P54蛋白，部分阻断ASFV的侵入，减轻宿主细胞的损伤。迄今为止，国际上尚未有任何可预防非洲猪瘟病毒感染的疫苗，现有技术中，缺乏对非洲猪瘟防疫的疫苗或其它防范措施的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法，以制备过表达E183L基因的重组腺病毒，用于研究ASFV候选疫苗。
腺病毒(Adenovirus)是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一，可用于在哺乳动物细胞中高水平地表达目的蛋白。因腺病毒感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞。同时其可感染的宿主范围广泛，可感染除人以外的几乎所有类型的细胞，包括大鼠、小鼠、兔、猪、羊、猴、鸡等物种。并且具有病毒滴度高，可用于动物试验以及有较好的生物安全性等特点。因此，利用腺病毒进行表达E183L基因重组腺病毒载体的构建及重组腺病毒的包装，对研究基于表达非洲猪瘟P54蛋白的候选疫苗具有重要意义。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体，包括pAD-EF1α-GFP腺病毒载体、插入pAD-EF1α-GFP载体的非洲猪瘟病毒E183L基因。E183L基因的序列如SEQ No.1所示。
一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，包括如下步骤：
1)将E183L序列在基因合成公司合成，该序列两端加酶切位点AsisⅠ和MLuⅠ。
2)用限制性内切酶AsisⅠ和MLuⅠ分别对基因合成序列E183L和pKO-FH载体进行双酶切，分别得到E183L基因片段和pKO线性化载体片段。
3)将所述步骤2)得到的E183L基因片段和pKO载体片段进行连接，得到pKO-E183L。
4)用限制性内切酶PI-SCE和I-CEU分别对所述步骤3)得到的连接产物pKO-E183L和pAD-EF1α-GFP腺病毒载体进行双酶切，分别得到线性化E183L基因片段和腺病毒pAD载体片段。
5)将所述步骤4)得到的线性化E183L基因片段和腺病毒pAD载体片段进行连接，得到pAD-E183L，使用CMV-F与FH-R进行测序。
6)将所述步骤5)得到的质粒pAD-E183L用限制性内切酶PacⅠ进行单酶切，挑选重组阳性质粒进行后续实验。
优选的，所述步骤2)中双酶切反应的酶切反应体系如下表1：
表1步骤2)的双酶切体系
E183L基因片段或pKO-FH载体 20uL
10×Buffer 3μL
AsisⅠ 1μL
MLuⅠ 1μL
ddH2O 5μL
总计 30μL
所述双酶切的温度为37℃，所述双酶切的时间为1小时。
优选的，所述步骤3)中连接体系如下表2：
表2步骤3)的连接体系
目的基因E183L片段 2～6μL
pKO载体片段 2～4μL
10×T4Buffer 1μL
T4DNA连接酶(10U/μL) 1μL
总计 10μL
所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为2小时。
优选的，所述步骤3)中连接后还包括：对所述连接得到重组质粒进行阳性菌落的构建和鉴定。
优选的，所述步骤4)中双酶切的反应体系如下表3：
表3步骤4)的双酶切反应体系
PI-SCE 1uL
I-CEU 1uL
10×buffer 5uL
KO-E183L或腺病毒AD-EF1α-GFP载体 20uL
BSA 0.5uL
ddH2O 22.5uL
总计 50uL
所述双酶切的酶切程序如下表4：
表4步骤4)的双酶切反应程序
37℃ 2.5小时
65℃ 20分钟
优选的，所述步骤5)中连接体系如下表5：
表5步骤5)的连接体系
目的基因E183L片段 2～6μL
腺病毒pAD载体片段 2～4μL
10×T4Buffer 1μL
T4DNA连接酶(10U/μL) 1μL
总计 10μL
所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为2小时。
优选的，所述步骤6)中单酶切的酶切反应体系如下表6：
表6步骤6)的单酶切反应体系
重组质粒pAD-E183L 20μL
10×Buffer 5μL
ddH2O 24.5μL
PacⅠ 0.5μL
总计 50μL
所述单酶切程序如下表7：
表7步骤6)的单酶切程序
37℃ 3小时
95℃ 5分钟
本发明提供了表达非洲猪瘟病毒E183L基因的重组腺病毒的制备方法，由以下步骤制备得到：
1)将8μL的聚醚酰亚胺PEI和250μL DMEM培养基配制成混合液Mix1，静置5分钟以上。将前述步骤6)中得到的重组阳性质粒与250μL DMEM培养基制成混合液Mix2。将混合液Mix1和Mix2均匀混合并震荡混匀，离心并静置30分钟。
2)在细胞板上铺满细胞数约0.3-0.5×106个/孔的HEK293细胞。
3)将步骤1)得到的静置后的混合液逐滴加入细胞板，十字混匀后置于CO2培养箱培养2-3天。
4)收集具有CPE效应的细胞，破碎细胞，转移至离心管中，离心后收集上清和细胞沉淀，过滤上清得到过表达E183L基因的重组腺病毒。
步骤4)具体为：
收集具有CPE效应的细胞，用电移液枪移至离心管中，并做好相应的标记，离心弃上清，沉淀用A195回溶，得到回溶液；EP管分装回溶液后先干冰冻存6-10min，再置于37℃，待管中冰块即将融化时取出摇匀，反复冻融4次后，12000g离心2min，取上清备用，4℃保存；
病毒的预处理：
a)病毒上清处理：将在4℃条件下保存的上清离心，3500g，4℃，离心30min；离心后弃上清，收集病毒沉淀；用A195将病毒沉淀重悬，收集到管中；
b)细胞沉淀处理：细胞沉淀用A195重悬，混匀，反复冻融四次；冻融时样品置于干冰中冻12-15分钟，然后转移至37℃水浴锅中融2-3分钟，如此反复四次；冻融完毕后，3500g，4℃，离心30min，分别收集上清和细胞沉淀；上清与重悬后的病毒沉淀混合；细胞碎片用A195重悬后加入5mol/L NaCl至终浓度为1moL/L；
c)超声破碎细胞:重悬后的细胞碎片超声破碎3-4次,AMPL值为30％，30s/次，每次间隔20-30s，至液体不粘稠；超声完毕后，12000rpm，4℃离心10min；离心后，与病毒上清和细胞沉淀处理后样品混合；
用电动移液器在离心管中逐层加入不同浓度的碘克沙醇；先加入60％碘克沙醇溶液4.2mL形成第一层，再加入40％碘克沙醇溶液5mL形成第二层，其次加入25％碘克沙醇溶液6mL形成第三层，最后加入15％碘克沙醇溶液9mL形成第四层；
将经过病毒的预处理步骤的病毒液加入到离心管最上层，48000rpm离心2小时30分钟；离心前应将对应的离心管配平，误差控制在0.1g以内；
离心完毕，弃前5mL，收集6-10mL液体至15mL离心管并用PBS、PF68的混合液稀释至体积15mL，然后用0.20μm的滤膜过滤，将过滤后的液体置于超滤管中，3500g离心50min。
将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中，最后加入5×A195储存液至储存液终溶度为1×；
所述的5×A195为含30％胎牛血清的DMEM培养基，PF68为含10％甘油、10％DMSO的DMEM，百分比为质量分数；PBS、PF68的混合液中，PBS溶液、PF68溶液体积比为1：1，其中PBS溶液：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/L。
相对于现有技术，本发明提供了一种E183L基因过表达腺病毒质粒pAD-E183L，以pAD-EF1α-GFP腺病毒表达载体为基础，在多克隆位点引入E183L基因，来构建E183L基因过表达腺病毒载体，所述该载体携带CMV强启动子，以便在真核细胞中过表达其携带的基因，同时该载体携带绿色荧光蛋白，可方便阳性细胞筛选，本发明提供含E183L基因的腺病毒，利用构建得到的线性化的重组质粒pAD-E183L与PEI混合，完成腺病毒包装，得到能直接感染真核细胞的腺病毒，实现E183L基因在真核细胞中正常表达的目的，为进一步研究基于表达E183L重组腺病毒载体疫苗打好基础。
附图说明
图1是本发明重组腺病毒质粒酶切(PacⅠ)结果图，由于重组机制的不同，酶切后条带大小不同，分为两种情况：一条为3kb或5kb左右，一条30kb左右；
图2是本发明实施例中腺病毒感染HEK293的荧光表达图；
图3是本发明实施例中腺病毒感染HEK293的白光表达图；
图4为本发明的pKO-FH载体结构图；
图5为本发明的pAD-EF1α-GFP载体结构图。
具体实施方式
本发明对所述混合的方法没有特殊限制，采用的培养方案没有特殊限制。
本发明中，在重组腺病毒制备过程中，Mix1和Mix2混合液中的DMEM为完全培养基，提供细胞增殖的必要条件。所述完全培养基为含体积浓度为5％血清的DMEM完全培养液。
使用完全培养基后，本发明将细胞在完全培养基的条件下培养48小时以上，反复冻融后，离心，弃细胞碎片，收集细胞上清，使用滤器过滤细胞上清，得到表达E183L基因的重组腺病毒。
本发明中，所述过滤的方法优选采用微滤。所述微滤的孔径优选为0.2μm。
本发明中，所述离心的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的细胞离心方案即可。
本发明中，所述细胞系的种类优选为HEK293细胞。
实施例1
直接合成目的基因片段，并加酶切位点AsisⅠ/MLuⅠ。
实施例2
用限制性内切酶AsisⅠ和MLuⅠ分别对基因合成序列E183L和载体pKO-FH(图4)进行双酶切，分别得到线性化E183L基因片段和pKO载体片段。反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切目的条带大小，并用胶回收试剂盒回收目的片段。双酶切体系见表1。
实施例3
用T4连接酶将线性化E183L基因片段和pKO载体片段进行连接，得到pKO-E183L，连接体系见表2。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，挑取单个菌落，扩大培养后提取质粒，AsisⅠ和MLuⅠ双酶切鉴定阳性克隆，并测序验证，获得正确的pKO-E183L克隆，使用CMV-F(SEQ No.2:5’CAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCA-3’)与FH-R(SEQ No.3:5’CTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCG-3’)进行测序。
转化过程如下：
(1)从-80℃取出提前制备好的DH5a感受态置于冰浴中。
(2)待DH5a感受态细胞融化后，取1μL连接产物于20μL DH5a感受态细胞中，充分混匀，冰浴中静置30分钟。
(3)将离心管放入42℃水浴锅中40秒(期间不要摇动离心管)，然后快速移至冰浴中，静置2分钟。
(4)向离心管中加入200μL的无菌的LB培养基(不加抗生素)，混匀后置于摇床中37℃，200rpm，振摇1小时后，涂布到卡那霉素抗性的固体培养基平皿中。
(5)37℃培养箱中培养过夜。
实施例4
一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)用限制性内切酶PI-SCE和I-CEU分别对连接产物pKO-E183L和腺病毒pAD-EF1α-GFP载体(图5)双酶切线性化(酶切反应体系见表3，酶切反应程序见表4)，胶回收相应片段。连接酶连接E183L基因片段和pAD载体片段(连接反应体系见表5)，将连接产物转化大肠杆菌扩增，而后提取质粒，鉴定正确后获得pADE183L。
2)将步骤1)提取的质粒用PacⅠ单酶切后重组质粒与PEI混匀离心，静置，加入DMEM培养基，其中单酶切反应体系见表6，单酶切反应程序见表7。
3)将步骤2)的重组腺病毒质粒载体混合液转染HEK293细胞，病毒包装完成，即得到含有E183L基因重组腺病毒(图2和图3)。由图2和图3可知，重组病毒包装成功。
步骤2)和步骤3)过程如下：
1.250μl DMEM和8μl PEI配成Mix1，静置5min以上。
2.250μl DMEM和单酶切后的重组质粒配成Mix2。
3.将Mix1和Mix2混合，震荡混匀，离心后静置30min。
4.静置期间铺6孔板HEK293细胞，细胞数约0.3-0.5×106个/孔。
5.将静置后的混合液逐滴加入至6孔板的细胞中。十字混匀后置于CO2培养箱中培养。
在以上技术方案中，步骤1)所述pKO-E183L质粒双酶切后回收的条带大小为目的基因E183L基因序列大小加上1.2kb。
在以上技术方案中，步骤1)所述连接酶为T4DNA连接酶，所述大肠杆菌为DH5α大肠杆菌；步骤2)所述静置时间为30分钟，所述培养基为含5％牛血清的DMEM培养基。
在以上技术方案中，步骤3)所述HEK293细胞装于10cm细胞盘中，十字摇匀后置于CO2培养箱培养2-3天。
实施例5
收集具有CPE效应的细胞，用电移液枪移至15mL离心管中，并做好相应的标记，3500rpm，离心7min。弃上清，沉淀用1mL的1xA195回溶；EP管分装后先干冰冻存6-10min，再置于37℃，待管中冰块即将融化时取出摇匀，反复冻融4次后，12000g离心2min，取上清备用。
实施例6
为获得纯病毒，需对样品进行一系列前处理，具体处理方法如下：
1)病毒上清处理：
将4℃过夜的上清离心，3500g，4℃，离心30min；离心后弃上清，收集病毒沉淀；用2mL A195将病毒沉淀重悬，收集到15mL管中。
2)细胞沉淀处理
细胞沉淀用6mL A195重悬，混匀，反复冻融四次。冻融时样品置于干冰中冻12-15分钟，然后转移至37℃水浴锅中融2-3分钟，如此反复四次；冻融完毕后，3500g，4℃，离心30min，分别收集上清和沉淀；上清与重悬后的病毒沉淀混合；细胞碎片用2mL A195重悬后加入0.5mL 5mol/L NaCl至终浓度为1moL/L。
3)超声破碎细胞
重悬后的细胞碎片超声破碎3-4次(AMPL值为30％，30s/次，每次间隔20-30s)；超声完毕后，12000rpm，4℃离心10min。离心后，与病毒上清和细胞沉淀处理后样品混合，即离心后获得的样品与病毒上清(病毒上清处理步骤获得的产物、细胞沉淀处理步骤中获得的上清)和细胞沉淀处理后的样品(细胞沉淀处理步骤获得的细胞碎片重悬后产物)混合。
实施例7
病毒纯化与浓缩，具体步骤如下：
1)用电动移液器在50mL离心管中逐层加入不同浓度的碘克沙醇。先加入60％碘克沙醇层4.2mL，再加入40％碘克沙醇层5mL，其次加入25％碘克沙醇层6mL，最后加入15％碘克沙醇层9mL。碘克沙醇溶液的浓度为质量浓度，溶剂为150mmol/L KCl、30mmol/L MgCl2、120mmol/L三甲基甘氨酸的KOH溶液，pH7.8。
2)将处理好的病毒液加入到最上层，48000rpm离心2小时30分钟。离心前应将对应的离心管配平，误差控制在0.1g以内。
3)离心完毕，弃前5mL，收集6-10mL液体至15mL离心管并用PBS+PF68稀释至体积15mL，然后用0.20μm的滤膜过滤；将过滤后的液体置于一个15ml的超滤管中，3500g离心50min；如果超滤管中剩下的液体体积还不到理想体积，需要将离心下去的液体弃掉，向超滤管中加入PBS+PF68稀释，再次离心。时间长短可以根据溶液的粘稠程度而定。
4)将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中，最后加入5×A195储存液至储存液终溶度为1×。所述的5×A195为含30％胎牛血清的DMEM培养基，PF68为含10％甘油、10％DMSO的DMEM。PBS、PF68的混合液中，PBS溶液、PF68溶液体积比为1：1，其中PBS溶液：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO42mmol/L。选取的A195、PF68配方，使得对病毒损伤小。
实施例8
对已制备好的病毒进行滴度检测，具体步骤如下：
1)去除病毒外壳，各组成体系如下表8：
表8滴度检测组成成分
组成成分 体积
病毒液 5μL
蛋白酶K(5μg/μL) 1μL
超纯水 4μL
37℃孵育30min，然后95℃维持5min使酶失活。
2)12,000rpm离心2min，取上清。
3)设置7个梯度稀释浓度分别为：2.58╳1012vp/μl，2.58╳1011vp/μl，2.58╳1010vp/μl，2.58╳109vp/μl，2.58╳108vp/μl，2.58╳107vp/μl，并将超纯水作为阴性对照。
4)PCR检测，总共20μL体系，具体反应体系如下表9：
表9滴度检测具体反应体系
组成成分 体积
2X SYBRGreen缓冲液 10μL
F、R引物混合物 0.8μL
超纯水 7.2μL
病毒样品或标准品 2μL
总计 20μL
所述步骤4)中PCR如下95℃5min；95℃15sec；60℃15sec；72℃15sec；40个循环。
5)病毒颗粒数(个/mL)＝与标准品相对值×1000。病毒颗粒数检测结果为2.58╳1010vp/ml。
实施例9
病毒特异性检测，具体步骤如下：
1)去除病毒外壳，各组成体系如下表10：
表10特异性检测组成成分
组成成分 体积
病毒液 5μL
蛋白酶K(5μg/μL) 1μL
超纯水 4μL
37℃孵育30min，然后95℃维持5min使酶失活。
2)12,000rpm离心2min，取上清。
3)PCR反应，总共20μL体系，具体反应体系如下表11：
表11 PCR反应体系
步骤2)中所得产物 1.5μL
10×Taq酶buffer 2μL
dNTP 0.4μL
Taq酶 0.3μL
DMSO 1μL
F,R引物混合物 4μL
超纯水 10.8μL
总计 20μL
所述步骤3)中qPCR反应程序如下：
95℃4min；95℃30sec；64℃45sec；72℃1min 1cycles
95℃30sec；62℃45sec；72℃1min 2cycles
95℃30sec；60℃45sec；72℃1min 3cycles
95℃30sec；58℃45sec；72℃1min 26cycle
72℃10min；4℃无限
4)PCR产物跑胶，胶回收测序。将PCR产物与E183L序列进行序列比对，结果为同源性100％。
以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落进要求保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法
<130> xhx2018032805
<141> 2018-03-28
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 552
<212> DNA
<213> African swine fever virus
<400> 1
atggattctg aattttttca accggtttat ccgcggcatt atggtgagtg tttgtcacca 60
gtcactacac caagcttctt ctccacacat atgtatacta ttctcattgc tatcgtggtc 120
ttagtcatca ttatcatcgt tctaatctat ctattctctt caagaaagaa aaaagctgct 180
gctattgagg aggaagatat acagtttata aatccttatc aagatcagca gtgggtagaa 240
gtcactccac aaccaggtac ctctaaacca gctggagcga ctacagcaag tgtaggcaag 300
ccagtcacgg gcagaccggc aacaaacaga ccagcaacaa acaaaccagt tacggacaac 360
ccagttacgg acagactagt catggcaact ggcgggccgg cggccgcacc tgcggccgcg 420
agtgctcctg ctcatccggc tgagccttac acgacagtca ctactcagaa cactgcttca 480
caaacaatgt cggctattga aaatttacga caaagaaaca cctatacgca taaagaccta 540
gaaaactcct tg 552
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Adenoviridae
<400> 2
caatgggagt ttgttttggc acca 24
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Adenoviridae
<400> 3
cttattagtg gtggtggtgg tggtgctcg 29

Claims (10)

1.一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体，其特征在于，包括pAD-EF1α-GFP腺病毒载体、插入pAD-EF1α-GFP腺病毒载体的非洲猪瘟病毒E183L基因；所述E183L基因具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)合成非洲猪瘟病毒E183L基因序列，该基因序列两端加酶切位点AsisⅠ和MLuⅠ；
2)用限制性内切酶AsisⅠ和MLuⅠ分别对基因序列E183L和pKO-FH载体进行双酶切，分别得到线性化E183L基因片段和pKO-FH载体片段；
3)将所述步骤2)得到的线性化E183L基因片段和pKO-FH载体片段进行连接，得到pKO-E183L；
4)用限制性内切酶PI-SCE和I-CEU分别对所述步骤3)得到的连接产物pKO-E183L和pAD-EF1α-GFP载体进行双酶切，分别得到线性化E183L基因片段和腺病毒pAD-EF1α-GFP载体片段；
5)将所述步骤4)得到的线性化E183L基因片段和pAD-EF1α-GFP载体片段进行连接，得到pAD-E183L，测序；
6)将所述步骤5)得到的质粒pAD-E183L用限制性内切酶PacⅠ进行单酶切，挑选重组阳性质粒用于后续实验。
3.根据权利要求2所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中连接后还包括如下步骤：对所述连接得到的重组质粒进行阳性菌落的构建和鉴定。
4.根据权利要求2所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中双酶切反应的酶切反应体系如下：
所述双酶切反应的温度为37℃，所述双酶切反应的时间为1小时。
5.根据权利要求2所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中连接体系如下：
连接反应的温度为22℃，连接反应的时间为2小时。
6.根据权利要求2所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中双酶切反应的反应体系如下：
所述双酶切反应的酶切程序如下：
37℃ 2.5小时
65℃ 20分钟
7.根据权利要求2所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤5)中连接体系如下：
所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为2小时。
8.根据权利要求2所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤6)中单酶切的酶切反应体系如下：
单酶切反应程序如下：
37℃ 3小时
95℃ 5分钟
9.一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于，由以下步骤制备得到：
1)将8μL的聚醚酰亚胺PEI和250μL DMEM培养基配制成混合液Mix1，静置5分钟以上；将权利要求2所述的重组阳性质粒与250μL DMEM培养基制成混合液Mix2；将混合液Mix1和Mix2均匀混合并震荡混匀，离心并静置30分钟；
2)在细胞板上铺满细胞数0.3-0.5×106个/孔的HEK293细胞；
3)将步骤1)得到的静置后的混合液逐滴加入细胞板，十字混匀后置于CO2培养箱中培养2-3天；
4)收集具有CPE效应的细胞，破碎细胞，转移至离心管中离心，收集上清和细胞沉淀，过滤上清得到含E183L基因表达的重组腺病毒。
10.根据权利要求9所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于，步骤4)具体为：
收集具有CPE效应的细胞，用电移液枪移至离心管中，并做好相应的标记，离心弃上清，沉淀用A195回溶，得到回溶液；EP管分装回溶液后先干冰冻存6-10min，再置于37℃，待管中冰块即将融化时取出摇匀，反复冻融4次后，12000g离心2min，取上清备用，4℃保存；
病毒的预处理：
a)病毒上清处理：将在4℃条件下保存的上清离心，3500g，4℃，离心30min；离心后弃上清，收集病毒沉淀；用A195将病毒沉淀重悬，收集到管中；
b)细胞沉淀处理：细胞沉淀用A195重悬，混匀，反复冻融四次；冻融时样品置于干冰中冻12-15分钟，然后转移至37℃水浴锅中融2-3分钟，如此反复四次；冻融完毕后，3500g，4℃，离心30min，分别收集上清和细胞沉淀；上清与重悬后的病毒沉淀混合；细胞碎片用A195重悬后加入5mol/L NaCl至终浓度为1moL/L；
c)超声破碎细胞:重悬后的细胞碎片超声破碎3-4次,AMPL值为30％，30s/次，每次间隔20-30s，至液体不粘稠；超声完毕后，12000rpm，4℃离心10min；离心后，与病毒上清和细胞沉淀处理后样品混合；
用电动移液器在离心管中逐层加入不同浓度的碘克沙醇；先加入60％碘克沙醇溶液4.2mL形成第一层，再加入40％碘克沙醇溶液5mL形成第二层，其次加入25％碘克沙醇溶液6mL形成第三层，最后加入15％碘克沙醇溶液9mL形成第四层；
将经过病毒的预处理步骤的病毒液加入到离心管最上层，48000rpm离心2小时30分钟；离心前应将对应的离心管配平，误差控制在0.1g以内；
离心完毕，弃前5mL，收集6-10mL液体至15mL离心管并用PBS、PF68的混合液稀释至体积15mL，然后用0.20μm的滤膜过滤，将过滤后的液体置于超滤管中，3500g离心50min；
将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中，最后加入5×A195储存液至储存液终溶度为1×；
所述的5×A195为含30％胎牛血清的DMEM培养基，PF68为含10％甘油、10％DMSO的DMEM，百分比为质量分数；PBS、PF68的混合液中，PBS、PF68体积比为1：1，其中PBS溶液：NaCl137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/L。
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