CN107741495A - 一种用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心elisa试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用。所述的试剂盒包括塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板以及HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG。本发明使用HRP标记兔抗IgG，替代传统ELISA中的一抗和二抗，简化了操作步骤。同时通过改变包被稳定工艺将SVV豚鼠抗IgG包被到固相载体表面，改变了酶标抗体稀释液的配制工艺，可使酶标抗体工作液稳定保存而不改变其活性和效价，建立了特异检测SVV抗原的双抗夹心ELISA试剂盒及其检测方法。本发明的提出弥补了SVV ELISA抗原检测的空缺，克服了现有病毒分离检测SVV抗原重复性和敏感性低、操作程序繁琐的问题，为SVV抗原检测提供了一种有效的技术手段。

Description

一种用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及一种病毒检测试剂盒及其应用，特别涉及基于塞内卡病毒(SenecaValley virus,SVV)特异性酶标抗体技术建立的用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用。本发明属于生物检测技术领域。
背景技术
SVV也被称为塞内卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)，其对美国猪群来说并不陌生。在过去30年中，共有近20例SVV感染被确认。在美国，SVV通常与特发性猪水疱病有关。在全球范围内都有SVA的报道，包括加拿大、澳大利亚、意大利、新西兰和巴西。SVV是一种无囊膜、单链RNA病毒，与猪口蹄疫(FMD)和猪水疱病毒一样，属小RNA病毒科。它可能是猪特发性水疱病的病原体，但是这种观点尚未得到证实。
2015年9月，美国某种猪场猪群出现跛足、水泡且伴随初生仔猪死亡，PCR检测排除FMDV、PDCoV、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、A/B/C型猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪呼吸与繁殖综合症病毒(PRRSV)的感染，发病猪的血清、皮肤、粪便、蹄部冠状带的PCR检测结果显示为SVV阳性，并通过猪睾丸细胞(ST细胞)分离得到SVV。
2015年3月，我国广东某猪场超期断奶猪被发现跛行，将发情母猪赶去配种舍定位栏冲洗干净后，发现一头猪出现鼻镜水泡，送检水泡液、水泡皮、脚皮样品，检测结果显示口蹄疫、猪水疱病病原检测均阴性而猪场的发病仍在扩大，最终通过对病料进行多种病原的检测送测序后获得一段序列，经与基因数据库比对，发现与SVV序列的相似性最高，继而查找资料，确定发病猪群感染SVV，并分离到SVV细胞株。随后在2015年10月、11月及2016年1月、2月陆续在其他猪场发现猪群感染SVV病例，而且一直呈现上升趋势。
由于SVV感染动物所引起的症状与其他病毒性疾病如口蹄疫、水泡性口炎病、猪水疱病临床表现十分相似，给临床确诊带来了难度。因此，需要实验室技术加以确定。目前主要包括病毒分离、抗体检测和抗原检测等。抗体检测方法主要包括血清中和试验(特异性高，广泛应用于血清学调查)和ELISA法(适用于猪血清大规模普查)。病原学检测方法主要是免疫组化试验，该方法是抗原检测敏感且特异的方法，主要体现在能定位病原在组织细胞中的分布。RT-PCR技术通常具有特异性高、可靠、快速，广泛应用于分子生物学检测。目前应用于SVV诊断的检测方法程序繁多、操作步骤复杂，检测至少需要一天的时间才能获得结果，因此在疫情突发时无法实现大量的样品的即时检测。要克服现状就必须研制新型ELISA诊断技术，本发明所涉及的检测方法是以轻简化或精准为目标的新型定性定量技术。
另外，鉴于目前国内外尚未有血清学诊断方法的报道，唯一能检测抗原的方法为病毒分离，本方法属于首创SVV抗原检测的ELISA试剂盒，相对于病毒分离而言，本发明具有简便、敏感、稳定及省时等特点，为SVV抗原检测提供了一种有效的技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于塞内卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种用于塞内卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒，其中包括塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板以及HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG。
在本发明所述的试剂盒中，优选的，所述的酶标板按照以下方法制备得到：
(1)获得SVV豚鼠高免血清；
(2)离心去除SVV豚鼠高免血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml 1mol/L CaCl2溶液和0.4ml 5w/v％的硫酸葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟，12000r/min，4℃离心20分钟，收集上清液；
(3)向步骤(2)得到的上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀后于4℃静置4～6小时，离心弃上清，用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀，透析去除硫酸铵；
(4)先用10倍柱体积的0.02mol/L，pH7.0的Na3PO3缓冲液洗亲和层析柱，然后用注射器以1ml/min速度加入步骤(3)透析后的样品，再以5～10倍柱体积的Na3PO3缓冲液洗涤，最后用2～5倍柱体积的0.1M，pH2.7的Glycine-HCl洗脱，收集洗脱液，4℃透析浓缩，得到高纯度SVV豚鼠抗IgG；
(5)SVV豚鼠抗IgG的包被
将制备的高纯度的SVV豚鼠抗血清IgG用pH7.2的碳酸盐缓冲液按照体积比1:3000进行稀释，之后在ELISA板的每孔加50μl稀释后的SVV豚鼠抗IgG，4℃静置8～12小时；
(6)酶标反应板稳定剂的配制
将5g BSA、10g蔗糖、20g海藻糖，加入到1000ml 0.01mol/L PBS(pH7.4)中轻轻震荡至溶解，加0.05w/v％Procline300，保存于4℃备用；
(7)酶标反应板的封闭方法
弃去酶标板孔内的SVV豚鼠抗IgG稀释液，加入洗涤液，室温下振荡洗涤2分钟，甩掉洗涤液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡，同法重复洗涤3次，甩干酶标板；之后按150μl/孔的量加入步骤(6)制备得到的酶标反应板稳定剂，4℃过夜，弃去稳定剂，拍干并置通风厨中吹干酶标板，用铝箔袋加入干燥剂真空包装，4℃保存备用。
在本发明所述的试剂盒中，优选的，HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG按照以下方法制备得到：
(1)获得SVV高免兔血清；
(2)离心去除SVV高免兔血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml 1mol/L CaCl2溶液和0.4ml 5w/v％的硫酸葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟，12000r/min，4℃离心20分钟，收集上清液；
(3)向步骤(2)得到的上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀后于4℃静置4～6小时，离心弃上清，用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀，透析去除硫酸铵；
(4)先用10倍柱体积的0.02mol/L，pH7.0的Na3PO3缓冲液洗亲和层析柱，然后用注射器以1ml/min速度加入步骤(3)透析后的样品，再以5～10倍柱体积的Na3PO3缓冲液洗涤，最后用2～5倍柱体积的0.1M，pH2.7的Glycine-HCl洗脱，收集洗脱液，4℃透析浓缩，得到高纯度SVV兔抗IgG；
(5)HRP标记SVV兔抗IgG的制备
将纯化之后的5mg/mL的SVV兔抗IgG 0.3mL与0.1mL过氧化物酶加入1.5mL的EP管中，轻轻吹打混匀，4℃过夜；向混合物中加入40μL的三乙醇胺，混匀，加入50μL的硼氢化钠，混匀，4℃放置30min，再次加入10μL甘氨酸溶液，混匀，之后将混合液置于透析袋中透析，所用的透析液为pH 7.2的PBS缓冲液。
在本发明所述的试剂盒中，优选的，还包括洗涤液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、阳性对照、阴性对照、显色液以及终止液。
其中，优选的，所述的洗涤液是含有5v/v％Tween-20、8w/w％氯化钠、0.2w/w％氯化钾、2.9w/w％磷酸氢二钠和0.2w/w％磷酸二氢钾的水溶液，pH7.4，使用时稀释10倍使用；所述的样品稀释液是含有5w/w％牛血清白蛋白、5v/v％Tween-20、8w/w％氯化钠、0.2w/w％氯化钾、2.9w/w％磷酸氢二钠和0.2w/w％磷酸二氢钾的水溶液，pH7.4，使用时稀释10倍使用；所述的酶标抗体稀释液是含有1v/v％甘油、0.5w/v％牛血清白蛋白、1w/v％酪蛋白以及0.05w/v％Procline300的0.01mol/L PBS缓冲液，pH7.4；所述的显色液为ABTS或TMB显色液；所述的终止液为2mol/L的H2SO4溶液；所述的阳性对照为塞内卡病毒灭活抗原，所述的阴性对照为不含塞内卡病毒的培养液。
使用本发明所述的试剂盒用于塞内卡病毒抗原检测时，按照以下方法进行：
(1)样本稀释
将待测样本、阳性对照以及阴性对照用样品稀释液按照体积比1:5进行稀释；
(2)加样
从4℃冰箱中取出塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板，将稀释后的待测样本加入酶标板中，每孔50μL，同时设阳性对照孔、阴性对照孔，37℃孵育1h；
(3)洗涤
取出酶标板，将其甩干，用洗涤液洗涤3～5次，在吸水纸上甩干；
(4)加入酶标抗体
每孔加入50μl稀释后的HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG，37℃孵育1h；
(5)显色
每孔加入显色液50μL，于37℃温箱静置避光反应5～10分钟；
(6)终止
每孔加入50μL终止液；
(7)结果判定
在酶标仪450nm波长处，测定酶标板的每孔光吸收值，若待检样本OD450nm≥0.4为阳性，若待检样本OD450nm≤0.3为阴性，介于二者之间为疑似阳性。
其中，优选的，HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG用PBS缓冲液用酶标抗体稀释液以1:5000倍稀释后作为工作液。
进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备塞内卡病毒抗原检测试剂中的用途。
本发明所涉及的诊断关键标识物——塞内卡病毒兔抗IgG，具有特异识别SVV的特点，避免了与口蹄疫等水泡性疾病的交叉反应；通过HRP标记SVV兔抗IgG，突破了传统ELISA需要一抗和二抗等反应过程，大幅度缩短检测时间。本发明所制备的检测试剂可为SVV流调及抗体水平监测提供支持。
附图说明
图1为检测SVV兔抗血清及豚鼠抗血清的特异性；
图2为SDS-PAGE分析纯化的SVV兔抗血清；
M：蛋白分子Marker；1.未纯化的兔抗血清电泳结果；2.纯化后的兔抗血清电泳结果；
图3为SVV-HRP的特异性的ELISA检测结果；
图4为SVV-HRP的效价的检测结果；
图5为SVV-HRP工作液稳定性分析结果；
图6为酶标反应板稳定性分析结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。应当理解的是，以下所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
实施例1用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心ELISA检测方法的建立
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物及抗原
用1.5～2.0kg健康公兔，购买于中国农业科学院兰州兽医研究所；猪塞内卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)灭活抗原由中国农业科学院兰州兽医研究所制备并提供。
1.1.2主要试剂
96孔酶标板购自Costar公司，2mol/L的H2SO4由兰州兽医研究所检测组提供，胎牛血清购自GIBICO公司，TMB购自SurModics公司，碳酸盐缓冲液胶囊购自Sigma公司，未预染蛋白Marker购自Fermentas。
1.2方法
1.2.1SVV兔抗高免血清的制备
1.2.1.1抗原沉淀
取适量(2000ml以上)灭活的SVV病毒抗原加入聚乙二醇6000和NaCl使其终浓度分别达到8w/v％和4w/v％，在2～8℃搅拌4小时后，置2～8℃过夜。次日，4℃、以8000r/min离心45分钟，弃上清，用0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液悬浮沉淀物至原体积的1/10。然后，加入二倍体积的三氯乙烯振摇2分钟，4℃、以10000r/min离心15分钟，取上层水相。4℃，以45000r/min离心120分钟，弃上清，再用10-15ml缓冲液(0.1mol/L Tris-HCL)重悬沉淀物，得到浓缩抗原。
1.2.1.2免疫及采血
用1.5～2.0kg健康公兔，将浓缩的抗原加等体积量的弗氏完全佐剂乳化，皮下多点免疫注射家兔，抗原的免疫剂量为30μg/只。首免后28日，再用不完全弗氏佐剂乳化浓缩的抗原，皮下多点免疫注射家兔，加强免疫一次，146S抗原免疫剂量为50μg/只。于加强免疫后7日，经耳静脉少量采血，分离血清，作双向琼脂(1.0％)扩散试验，检测血清效价。若血清效价达1:64或以上，前腔静脉采血、分离血清，得到SVV兔抗血清。
1.2.1.3SVV兔抗血清特异性的检测
将灭活的口蹄疫病毒O型、A型、Asia1型和SVV抗原包被于酶标板，100μL/孔，4℃过夜。采用间接ELISA方法对SVV兔抗血清的特异性进行测定：每孔加入100μL PBS稀释的SVV兔抗血清(1:9000)，37℃孵育1h。洗板，每孔加入100μL PBS稀释的山羊抗兔IgG-HRP(1:10000)，37℃孵育1h。洗板，每孔加入50μL TMB，37℃孵育15min，加入2M H2SO4，用酶标仪读取OD450值。
1.2.2高纯度SVV兔抗IgG的制备
5000r/min离心去除SVV高免兔血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml CaCl2溶液(1mol/L)和0.4ml 5w/v％硫酸葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟。12000r/min，4℃离心20分钟，收集上清。加入等体积饱和硫酸铵溶液(50％的饱和度)，混匀后于4℃静置4～6小时，离心弃上清。用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀。透析去除硫酸铵，样品经HiTrap Protein G(GE公司，产品编号17-0404-03)亲和层析柱：先用10倍柱体积的0.02mol/L的Na3PO3缓冲液(pH7.0)洗柱，然后用注射器以1ml/min速度加入蛋白样品，再以5～10倍柱体积的Na3PO3缓冲液洗涤，最后用2～5倍柱体积的0.1M的Glycine-HCl(pH2.7)洗脱，收集洗脱液，4℃透析浓缩，得到高纯度SVV兔抗IgG。
1.2.3HRP标记SVV兔抗IgG
将纯化之后浓度为5mg/ml的SVV兔抗IgG 0.3mL与0.1mL过氧化物酶加入1.5mL的EP管中，轻轻吹打混匀，4℃过夜。向混合物中加入40μL的三乙醇胺，混匀，加入50μL的硼氢化钠，混匀，4℃放置30min。再次加入10μL甘氨酸溶液，混匀。之后将混合液置于透析袋中透析(pH 7.2的PBS)。
1.2.4酶标抗体工作液的配制及37℃热稳定性试验
(1)酶标抗体稀释液的配制
将10ml甘油、5g BSA、10g酪蛋白，加入到990ml 0.01mol/L PBS(pH7.4)中轻轻震荡至溶解，加0.05w/v％Procline300，保存于4℃备用。
(2)酶标抗体工作液的37℃热稳定性试验
将1.2.3节制备得到的HRP标记的SVV兔抗IgG用酶标抗体稀释液按1:5000(v/v)进行稀释，4℃保存备用。
将制备的酶标抗体工作液分装于15个1.5ml ep管中，置于37℃温箱中，每天取出一管于4℃保存，15天后统一检测酶标抗体的活性。
1.2.5SVV豚鼠抗高免血清的制备
1.2.5.1抗原沉淀
取适量(2000ml以上)灭活的SVV病毒抗原加入聚乙二醇6000和NaCl使其终浓度分别达到8w/v％和4w/v％，在2～8℃搅拌4小时后，置2～8℃过夜。次日，4℃、以8000r/min离心45分钟，弃上清，用0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液悬浮沉淀物至原体积的1/10。然后，加入二倍体积的三氯乙烯振摇2分钟，4℃、以10000r/min离心15分钟，取上层水相。4℃，以45000r/min离心120分钟，弃上清，再用10-15ml缓冲液(0.1mol/L Tris-HCL)重悬沉淀物，得到浓缩抗原。
1.2.5.2免疫及采血
用2～3月龄健康豚鼠，将浓缩的抗原加等量弗氏完全佐剂乳化，皮下多点免疫注射豚鼠，抗原的免疫剂量为15μg/只。首免后28日，再用不完全福氏佐剂乳化SVV灭活抗原，皮下多点免疫注射豚鼠，加强免疫一次，SVV抗原免疫剂量为25μg/只。于加强免疫后7日，经心脏少量采血，分离血清，作双向琼脂(1.0％)扩散试验，检测血清效价。若血清效价达1:64或以上，心脏采血、分离血清。
1.2.5.3SVV豚鼠抗血清特异性的检测
将灭活的口蹄疫病毒O型、A型、Asia1型和SVV抗原包被于酶标板，100μL/孔，4℃过夜。采用间接ELISA方法对SVV豚鼠抗血清的特异性进行测定：每孔加入100μL PBS稀释的SVV豚鼠抗血清(1:9000)，37℃孵育1h。洗板，每孔加入100μL PBS稀释的山羊抗豚鼠IgG-HRP(1:10000)，37℃孵育1h。洗板，每孔加入50μL TMB，37℃孵育15min，加入2M H2SO4，用酶标仪读取OD450值。
1.2.6SVV豚鼠抗血清IgG的制备
5000r/min离心去除SVV豚鼠高免血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml CaCl2溶液(1mol/L)和0.4ml 5w/w％硫酸葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟。12000r/min，4℃离心20分钟，收集上清。按加入等体积饱和硫酸铵溶液(50％的饱和度)，混匀后于4℃静置4～6小时，离心弃上清。用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀。透析去除硫酸铵，样品经HiTrap Protein G(GE公司，产品编号17-0404-03)亲和层析柱：先用10倍柱体积的0.02mol/L的Na3PO3缓冲液(pH7.0)洗柱，然后用注射器以1ml/min速度加入蛋白样品，再以5～10倍柱体积的Na3PO3缓冲液洗涤，最后用2～5倍柱体积的0.1M的Glycine-HCl(pH2.7)洗脱，收集洗脱液，4℃透析浓缩，得到高纯度SVV豚鼠抗IgG。
1.2.7SVV灭活抗原的固相包被及稳定方法
1.2.7.1SVV灭活抗原的包被
将制备的高纯度SVV豚鼠抗IgG用pH7.2的碳酸盐缓冲液进行1:3000的稀释，之后在ELISA板的每孔加50μl稀释后的SVV豚鼠抗IgG，4℃静置8～12小时。
1.2.7.2酶标反应板稳定剂的配制及37℃热稳定性试验
(1)酶标反应板稳定剂的配制
将5g BSA、10g蔗糖、20g海藻糖，加入到1000ml 0.01mol/L PBS(pH7.4)中轻轻震荡至溶解，加0.05w/w％Procline300，保存于4℃备用。
(2)酶标反应板的封闭方法
弃去1.2.7.1节中酶标板孔内包被液，加入洗涤液，室温下振荡洗涤2分钟，甩掉洗涤液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡，同法重复洗涤3次，甩干酶标板。之后按150μl/孔的量加入酶标反应板稳定剂，4℃过夜，弃去稳定剂，拍干并置通风厨中吹干酶标板。用铝箔袋加入干燥剂真空包装，4℃保存备用。
(3)酶标反应板稳定剂的37℃热稳定性试验
将用铝箔袋包装的酶标反应板置于37℃，连续放置15天，每天取出1块4℃保存备用。15天后将所有酶标板与SVV灭活抗原进行反应，读取OD450nm值，分析酶标板的包被SVV豚鼠抗IgG的稳定性。
1.2.8基于酶标抗体的SVV双抗夹心ELISA检测方法的建立
1.2.8.1各试剂最佳使用浓度的确定
本发明利用SVV豚鼠抗IgG和HRP标记的SVV兔抗IgG建立双抗夹心ELISA方法。采用方阵滴定法确立该方法中包被抗体和检测抗体的最佳使用浓度。
1.2.8.2双抗夹心ELISA临界值的确定
对19份阳性抗原样品和51份阴性抗原样品分别进行1:5、1:10、1:15及1:20稀释，按照双抗ELISA方法的反应模式进行检测，统计每个样品不同稀释度的OD450nm值，确定所有阴性和阳性抗原的OD450nm值不重叠时的抗原稀释度，以该稀释度稀释39份阴性血清，计算平均OD450nm，以平均OD450nm±3SD为临界值。
1.2.8.3双抗夹心ELISA方法的特异性
利用所建立的ELISA方法检测口蹄疫O型、A型、Asia1型等传染病阳性抗原样品。同时,用该ELISA方法检测已知SVV阳性的抗原(10份)，统计检测结果，分析试剂盒特异性。
1.2.8.4双抗夹心ELISA方法的敏感性
将SVV阳性抗原进行1:2、1:4、1:8、1:16、1:32倍比稀释，每个稀释度的抗原作为一个独立的样本，按照所建立的方法进行测试，计算每个稀释度的OD450nm值，以此来判定试剂盒的敏感性。
1.2.8.5双抗夹心ELISA方法的重复性
批内重复：用同一批次制备的ELISA反应板、HRP标记的检测抗体及其他试剂，在相同条件下用所建立的方法对7份阳性抗原样品进行检测独立检测5次，统计检测结果，计算标准差和变异系数。
批间重复：用三个批次制备的ELISA反应板、HRP标记的检测抗体及其他试剂，在相同条件下用所建立的方法对7份阳性抗原样品进行检测独立检测1次，统计检测结果，计算标准差和变异系数
2.结果
2.1检测SVV兔抗及豚鼠抗血清特异性结果
经间接ELISA的检测，制备的SVV兔抗及豚鼠抗血清与SVV灭活抗原反应性很好，与口蹄疫O型、A型和Asia1型抗原及PK15细胞均不反应，具有良好的特异性(图1)。
2.2纯化后SVV兔抗血清的SDS-PAGE分析
将经饱和硫酸铵沉淀纯化的SVV兔抗血清进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示纯化后的兔抗血清有两条带，分别是IgG的重链和轻链，大小分别约为45kDa和25kDa，与预期结果相符(图2)，使用紫外分光光度计测得抗体的浓度为7.926mg/mL。
2.3标记后兔抗IgG特异性及效价的检测结果
从ELISA结果可以看出，标记HRP后的SVV兔抗IgG特异性很高，且效价较高，1:5000稀释的SVV兔抗IgG的OD450nm值接近1.5(图3、图4)。
2.4酶标抗体工作液稳定性分析
将酶标抗体工作液与包被SVV灭活抗原的ELISA板反应，从检测结果可以看出，直到37℃保存的第15天，其酶活性没有发生太大变化，OD值基本维持在1.5左右(图5)。根据Arrhenius equation理论，37℃存放1d相当于2～8℃存放1.5个月计算(Geoffrey et al.,1991)，该酶标抗体工作液至少保存期在22个月以上(1.5×15＝22.5)。
2.5酶标反应板稳定性分析
将酶标反应板与SVV灭活抗原进行反应，从检测结果可以看出，直到37℃保存的第15天，其与SVV灭活抗原的反应性没有发生太大变化，OD450nm值基本维持在1.5左右(图6)。根据Arrhenius equation理论，37℃存放1d相当于2～8℃存放1.5个月计算(Geoffrey etal.,1991)，该酶标反应板至少保存期在22个月以上(1.5×15＝22.5)。
2.6各试剂最佳使用浓度及临界值的确定
本发明应用HRP标记SVV兔抗IgG及SVV豚鼠抗IgG建立的SVV双抗夹心ELISA检测方法。用方阵滴定法确定的SVV豚鼠抗IgG的最佳使用浓度1:3000，HRP标记兔抗IgG的最佳使用浓度为1:5000，抗原样本的最佳稀释比例为1:5。
测定SVV阴性对照的OD450nm平均值为0.3，标准差为0.033，以OD450nm±3SD为判定标准，即：待检样品OD450nm≥0.4为阳性，OD450nm≤0.3为阴性，介于二者之间为疑似阳性。
2.7双抗夹心ELISA方法的特异性
利用所建立的ELISA方法检测口蹄疫O型、A型、Asia1型、猪瘟及猪蓝耳等传染病阳性样本，根据判定方法均为阴性(表1)。这些数据表明,所建立的ELISA方法具有良好的特异性，与口蹄疫O型、A型、Asia1型、猪瘟及猪蓝耳抗原之间不存在交叉反应。同时,用该ELISA方法检测已知SVV阳性的样本(10份)均为阳性。由此可见所建立的SVV双抗夹心ELISA抗原检测方法具有良好的特异性。
表1特异性检测结果
抗血清 OD450nm 判定结果
A型口蹄疫 0.121 -
Asia1型口蹄疫 0.109 -
O型口蹄疫 0.179 -
猪瘟 0.123 -
猪蓝耳 0.192 -
SVV阳性抗体 >0.4 +
2.8双抗夹心ELISA方法的敏感性
将SVV阳性样本进行1:2、1:4、1:8、1:16、1:32倍比稀释，每个稀释度作为一个独立的样本，按照所建立的方法进行测试，结果如表2所示。在1:16稀释的阳性抗原，其OD450nm大于0.4，按试剂盒判定标准应为阳性，在1:32稀释的阳性抗原，其OD450nm小于0.3，判为阴性。因此该方法的敏感性至少为1:16稀释的阳性抗原检测为阳性，说明其敏感性高。
表2敏感性检测结果
2.9双抗夹心ELISA方法的重复性
批内重复：用同一批次制备的多抗、HRP标记的检测抗体及其他试剂，在相同条件下用所建立的方法对7份抗原样品(其中阳性抗原5份，阴性抗原2份)进行独立检测，统计检测结果，计算标准差和变异系数，结果如表3所示。
表3批内重复
批间重复：用三个批次制备的多抗、HRP标记的检测抗体及其他试剂，在相同条件下用所建立的方法对7份抗原样品(其中阳性抗原5份，阴性抗原2份)进行独立检测，统计检测结果，计算标准差和变异系数，结果如表4所示。
表4批间重复
实施例2试剂盒的组装及使用方法
1、试剂盒的组装
(1)酶标板：塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板，按照实施例1方法制备，4℃冰箱保存。
(2)10×洗涤液：所述10×洗涤液是含有5v/v％Tween-20、8w/w％氯化钠、0.2w/w％氯化钾、2.9w/w％磷酸氢二钠和0.2w/w％磷酸二氢钾的水溶液，pH7.4；
(3)10×样品稀释液：所述10×样品稀释液是含有5w/w％牛血清白蛋白、5v/v％Tween-20、8w/w％氯化钠、0.2w/w％氯化钾、2.9w/w％磷酸氢二钠和0.2w/w％磷酸二氢钾的水溶液，pH7.4；
(4)酶标抗体稀释液：含有1v/v％甘油、0.5w/v％BSA、1w/v％酪蛋白以及0.05w/v％Procline300的0.01mol/L PBS缓冲液，pH7.4，按照实施例1制备。
(5)酶标抗体工作液：HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG(实施例1制备)，用酶标抗体稀释液以体积比1:5000倍稀释；
(6)显色液：TMB底物显色液；
(7)终止液：2mol/L的H2SO4溶液；
(8)标准阳性对照样品：塞内卡病毒灭活抗原；
(9)标准阴性对照样品：不含塞内卡病毒的培养液；
2、使用方法
用于塞内卡病毒检测时，按照以下方法进行：
(1)样本稀释
将待测样本、阳性对照以及阴性对照用样品稀释液按照体积比1:5进行稀释；
(2)加样
从4℃冰箱中取出塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板，将稀释后的待测样本加入酶标板中，每孔50μL，同时设阳性对照孔、阴性对照孔，37℃孵育1h；
(3)洗涤
取出酶标板，将其甩干，用洗涤液洗涤3～5次，在吸水纸上甩干；
(4)加入酶标抗体
每孔加入50μl稀释后的HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG，37℃孵育1h；
(5)显色
每孔加入显色液50μL，于37℃温箱静置避光反应5～10分钟；
(6)终止
每孔加入50μL终止液；
(7)结果判定
在酶标仪450nm波长处，测定酶标板的每孔光吸收值，若待检样本OD450nm≥0.4为阳性，若待检样本OD450nm≤0.3为阴性，介于二者之间为疑似阳性。

Claims (8)

1.一种用于塞内卡病毒(Seneca Valleyvirus,SVV)抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于包括塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板以及HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标板按照以下方法制备得到：
(1)获得SVV豚鼠高免血清；
(2)离心去除SVV豚鼠高免血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml 1mol/L CaCl2溶液和0.4ml 5w/v％的硫酸葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟，12000r/min，4℃离心20分钟，收集上清液；
(3)向步骤(2)得到的上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀后于4℃静置4～6小时，离心弃上清，用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀，透析去除硫酸铵；
(4)先用10倍柱体积的0.02mol/L，pH7.0的Na3PO3缓冲液洗亲和层析柱，然后用注射器以1ml/min速度加入步骤(3)透析后的样品，再以5～10倍柱体积的Na3PO3缓冲液洗涤，最后用2～5倍柱体积的0.1M，pH2.7的Glycine-HCl洗脱，收集洗脱液，4℃透析浓缩，得到高纯度SVV豚鼠抗IgG；
(5)SVV豚鼠抗IgG的包被
将制备的高纯度SVV豚鼠抗IgG用pH7.2的碳酸盐缓冲液按照体积比1:3000进行稀释，之后在ELISA板的每孔加50μl稀释后的SVV豚鼠抗IgG，4℃静置8～12小时；
(6)酶标反应板稳定剂的配制
将5g BSA、10g蔗糖、20g海藻糖，加入到1000ml 0.01mol/L PBS(pH7.4)中轻轻震荡至溶解，加0.05w/v％Procline300，保存于4℃备用；
(7)酶标反应板的封闭方法
弃去酶标板孔内的SVV豚鼠抗IgG稀释液，加入洗涤液，室温下振荡洗涤2分钟，甩掉洗涤液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡，同法重复洗涤3次，甩干酶标板；之后按150μl/孔的量加入步骤(6)制备得到的酶标反应板稳定剂，4℃过夜，弃去稳定剂，拍干并置通风厨中吹干酶标板，用铝箔袋加入干燥剂真空包装，4℃保存备用。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG按照以下方法制备得到：
(1)获得SVV高免兔血清；
(2)离心去除SVV高免兔血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml 1mol/L CaCl2溶液和0.4ml 5w/v％的硫酸葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟，12000r/min，4℃离心20分钟，收集上清液；
(3)向步骤(2)得到的上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀后于4℃静置4～6小时，离心弃上清，用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀，透析去除硫酸铵；
(4)先用10倍柱体积的0.02mol/L，pH7.0的Na3PO3缓冲液洗亲和层析柱，然后用注射器以1ml/min速度加入步骤(3)透析后的样品，再以5～10倍柱体积的Na3PO3缓冲液洗涤，最后用2～5倍柱体积的0.1M，pH2.7的Glycine-HCl洗脱，收集洗脱液，4℃透析浓缩，得到高纯度SVV兔抗IgG；
(5)HRP标记SVV兔抗IgG的制备
将纯化之后的5mg/mL的SVV兔抗IgG0.3mL与0.1mL过氧化物酶加入1.5mL的EP管中，轻轻吹打混匀，4℃过夜；向混合物中加入40μL的三乙醇胺，混匀，加入50μL的硼氢化钠，混匀，4℃放置30min。再次加入10μL甘氨酸溶液，混匀，之后将混合液置于透析袋中透析，所用的透析液为pH 7.2的PBS缓冲液。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括洗涤液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、阳性对照、阴性对照、显色液以及终止液。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液是含有5v/v％Tween-20、8w/w％氯化钠、0.2w/w％氯化钾、2.9w/w％磷酸氢二钠和0.2w/w％磷酸二氢钾的水溶液，pH7.4，使用时稀释10倍使用；所述的样品稀释液是含有5w/w％牛血清白蛋白、5v/v％Tween-20、8w/w％氯化钠、0.2w/w％氯化钾、2.9w/w％磷酸氢二钠和0.2w/w％磷酸二氢钾的水溶液，pH7.4，使用时稀释10倍使用；所述的酶标抗体稀释液是含有1v/v％甘油、0.5w/v％牛血清白蛋白、1w/v％酪蛋白以及0.05w/v％Procline300的0.01mol/L PBS缓冲液，pH7.4；所述的显色液为ABTS或TMB显色液；所述的终止液为2mol/L的H2SO4溶液；所述的阳性对照为塞内卡病毒灭活抗原，所述的阴性对照为不含塞内卡病毒的培养液。
6.如权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，用于塞内卡病毒抗原检测时，按照以下方法进行：
(1)样本稀释
将待测样本、阳性对照以及阴性对照用样品稀释液按照体积比1:5进行稀释；
(2)加样
从4℃冰箱中取出塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板，将稀释后的待测样本加入酶标板中，每孔50μL，同时设阳性对照孔、阴性对照孔，37℃孵育1h；
(3)洗涤
取出酶标板，将其甩干，用洗涤液洗涤3～5次，在吸水纸上甩干；
(4)加入酶标抗体
每孔加入50μl稀释后的HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG，37℃孵育1h；
(5)显色
每孔加入显色液50μL，于37℃温箱静置避光反应5～10分钟；
(6)终止
每孔加入50μL终止液；
(7)结果判定
在酶标仪450nm波长处，测定酶标板的每孔光吸收值，若待检样本OD450nm≥0.4为阳性，若待检样本OD450nm≤0.3为阴性，介于二者之间为疑似阳性。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG用PBS缓冲液用酶标抗体稀释液以1:5000倍稀释后作为工作液。
8.权利要求1-7任一项所述的试剂盒在制备塞内卡病毒抗原检测试剂中的用途。
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