CN105510575A - 抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒及检测方法。该试剂盒内有预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板,以及瓶装的以下试剂:抗磷脂酶A2受体抗体IgG校准品,阳性对照,阴性对照,浓缩洗涤液,样本稀释液,酶标液,底物液和终止液。本发明检测可非创伤、低风险、安全、廉价、精确的定量检测血清、血浆的抗磷脂酶A2受体抗体IgG的含量,对特发性膜性肾病患者阳性检出率高,测定结果精确、客观、方法简便,易于推广应用。对特发性膜性肾病的诊断、指导治疗及疗效评价有重要意义,对治疗方案的制定、方法的选择有重要的临床参考价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种定量检测人血清、血浆中抗磷脂酶A2受体抗体IgG的酶联免疫分析试剂盒及检测方法。
背景技术
膜性肾病按发病原因可分为特发性和继发性膜性肾病,其诊断上要依靠临床表现,肾脏穿刺术的组织学检查或肾组织电镜检查。肾脏穿刺术是一种侵入式的诊断方法,对病人有一定的伤害;肾组织电镜检测对设备要求很高,难以普及使用。2009年国外首次报道了特发性膜性肾病的自身免疫基质,其实质是自身抗体与磷脂酶A2受体反应的结果。磷脂酶A2受体是在人肾小球足细胞表面表达,参与调节细胞中磷脂酶的结合过程。目前已经确认了磷脂酶A2受体是自身抗体的主要靶抗原,研究发现约75%的特发性膜性肾病患者可以通过血清学检测检出抗PLA2R抗体,国内也有文献显示在国人中检测阳性率更高,达到82%,而继发性膜性肾病及其他类型肾小球疾病患者的检出率很低,健康人群均为阴性。血清学PLA2R抗体的定量检测可以为特发性膜性肾病的初筛和病情监测提供辅助作用。因此,开发非创伤、低风险、安全、廉价、精确和快速的PLA2R定量测定试剂盒有极其重要的意义。
目前报道的抗磷脂酶A2受体抗体检测技术主要有免疫印迹法、间接免疫荧光法和时间分辨荧光法。免疫印迹法还在实验室研究阶段,主要在进行与组织病理学检测方法的对比试验研究,方法的灵敏度、特异性相对较低;间接免疫荧光法,其采用转染的细胞作为基质检测抗磷脂酶A2受体抗体,阳性样本的结果有荧光出现,阴性则无,属于定性检测方法,不能精确的进行不同阶段的抗体滴度定量比较;时间分辨荧光法相对较复杂,需要时间分辨荧光的专门检测仪器,试剂成本高,正处于研究阶段。
发明内容
有鉴于此,为了提高磷脂酶A2受体抗体检测的灵敏度、特异性,能够定量检测且试剂成本低,简单,操作简便的方法,本发明提供一种抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒及检测方法。
本发明是基于免疫反应和酶促反应,能够检测人血清、血浆样本中的磷脂酶A2受体抗体IgG的含量,其测定原理是利用重组的磷脂酶A2受体抗原包被微孔板,用含0.5-5%的BSA封闭液封闭,干燥,然后分别加入校准品和样品,其中抗磷脂酶A2受体抗体IgG与包被在微孔板的抗原特异性结合,未结合的成分跟过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG抗体,进行第二次结合反应,结果洗涤去除过量的HRP标记的抗人IgG抗体,加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB),在HRP的催化下显色,最后加入终止剂,显色的深浅与样品中的待测物含量成比例,在酶标仪上进行450/630nm双波长检测。按照校准品对应的OD值做标准曲线,即可由标准曲线算出各样本中抗磷脂酶A2受体抗体IgG的浓度值。
酶联免疫吸附试验(ELISA),其原理是酶分子与抗体或抗抗体共价结合,酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。加入底物液后,底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型,出现颜色反应。因此,可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应,颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定,这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来,使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。ELISA法对试剂的要求低,成本低,且能够定量检测,作为一种灵敏度高,可定量,能够替代价格昂贵的进口试剂和其他复杂的检测系统而言,是一种临床实验室理想的检测方法。
本发明解决其技术问题,所采用的技术方案是提供一种抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒及检测方法,所述抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒内设置有预包被重组人磷脂酶A2受体抗原的微孔板,以及瓶装的以下试剂:一组抗磷脂酶A2受体抗体IgG校准品,阳性对照,阴性对照,浓缩洗涤液,样本稀释液,酶标液,底物液和终止液。
试剂盒各组分制备方法如下:
预包被抗原微孔板的制备:将重组的人磷脂酶A2受体全分子或其片段,用浓度0.05mol/L,pH9.6的碳酸盐缓冲液按1:50-1:1000稀释,所述碳酸盐缓冲液含0.159gNa2CO3,0.293gNaHCO3和1000mlH2O,按照每孔100μl包被,在4℃过夜包被。之后弃去包被液,洗涤3次,每孔再加入150μl的稳定剂,所述稳定剂是磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液基质,其中含0.5-5%的BSA或酪蛋白,0.1-5%的蔗糖或海藻糖,0.01-0.5%的Proclin300,室温孵育15min-4h,弃去稳定剂,干燥,放入铝箔袋封口后4℃保存。
所述抗磷脂酶A2受体抗体IgG校准品是由校准品稀释液与抗磷脂酶A2受体抗体IgG阳性血清配制而成,各校准品浓度分别为2RU/ml、20RU/ml、80RU/ml、400RU/ml、1600RU/ml,每瓶中分装1ml。
所述阳性对照是由质控品稀释液与抗磷脂酶A2受体抗体IgG阳性血清配制而成;阴性对照是由质控品稀释液与抗磷脂酶A2受体抗体IgG阴性血清配制而成。
所述浓缩洗涤液的配制:按每升水中,12.11g三羟甲基氨基甲烷(Tris),5ml的吐温20,调pH7.8,定容1L,即浓缩洗涤液。
所述样本稀释液的配制:按每升水中,1.21g三羟甲基氨基甲烷(Tris),0.02-2g的牛血清白蛋白(BSA),0.5ml的吐温20,调pH7.8,定容1L,即样本稀释液。
所述酶标液是由酶标记的抗人IgG抗体与酶标稀释液按合适浓度配制而成。所述的酶为辣根过氧化物酶(HRP);根据所选用的酶标类型,底物为3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)显色底物。终止液为0.25-2mol/L的硫酸或氢氧化钠。我们优选的终止液为1mol/L的硫酸。
一种抗磷脂酶A2受体抗体IgG的检测方法,包括以下步骤:
①样本孵育:在预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板的微孔内分别加入一组校准品,阳性对照与阴性对照,以及稀释后的待测样本各100μl,室温孵育30分钟;
②一次洗涤:甩掉反应液,每孔用300μl稀释10倍的浓缩洗涤液洗3次,拍干;
⑧酶结合物孵育:在预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板的每个微孔内加入酶标液100μl,室温孵育30分钟;
④二次洗涤:甩掉反应液,每孔用300μl稀释10倍的浓缩洗涤液洗3次,拍干;
⑤底物孵育:在预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板的每个微孔内加入底物液100μl,室温孵育10分钟;
⑥终止:在预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板的每个微孔内加入终止液100ul,混匀;
⑦读值:加入终止液30分钟内将微孔板至于酶标仪上,用450/630nm双波长检测得到各样本的OD值;按照校准品对应的OD值做标准曲线,将样本的OD值带入标准曲线中,计算得到样本中抗磷脂酶A2受体抗体IgG的浓度值。
有益效果:本发明是对抗磷脂酶A2受体抗体IgG进行定量检测,量值更易于临床上的应用,便于比较治疗前后,病程周期病情的变化,定量优于定性的方法。另外,几乎所有类型的医院都有ELISA试剂配套使用的酶标仪,容易推广使用,能够解决目前临床的迫切需求;另外相比其他复杂的检测系统而言,操作便利,是一种临床实验室理想的检测方法。同时,ELISA法对试剂的要求低,成本低,能够替代价格昂贵的进口试剂,降低检测成本。该试剂盒非创伤、低风险、安全、廉价、精确和快速的定量检测血清、血浆和全血中的PLA2R抗体含量,可以为特发性膜性肾病的初筛和病情监测提供辅助作用。
以下将结合附图和实施例,对本发明进行较为详细的说明。
附图说明
图1为本发明经典的校准曲线图。
具体实施方式
本发明公开了一种定量检测人血清、血浆中抗磷脂酶A2受体抗体IgG的酶联免疫分析试剂盒及检测方法,本领域的技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域的技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已通过较佳实例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供抗磷脂酶A2受体抗体IgG酶联免疫分析试剂盒及检测方法中所用的生物材料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
一、包被微孔板的制备方法:
利用重组的人磷脂酶A2受体全分子或其片段,用浓度0.05mol/L,pH9.6的碳酸盐缓冲液按1:50-1:1000稀释,其中,碳酸盐缓冲液由0.159gNa2CO3,0.293gNaHCO3和1000mlH2O配置而成,每孔加入100μl稀释后的重组的人磷脂酶A2受体全分子或其片段进行包被,在4℃过夜包被。之后弃去包被液,洗涤3次,之后每孔再加入150μl的稳定剂,所述稳定剂是磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液基质,其中含0.5-5%的BSA或酪蛋白,0.1-5%的蔗糖或海藻糖,0.01-0.5%的Proclin300,室温孵育15min-4h,弃去稳定剂,干燥,放入铝箔袋封口后4℃保存。
二、抗磷脂酶A2受体抗体IgG校准品制备方法:
取临床上的阳性标本,经鉴定未检测出传染源的样本,多支混合,灭活、过滤、分装,-40℃以下深冷保存。根据GB/T21415-2008国家标准(体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性)并结合临床实践确定了校准曲线的浓度点分别为2RU/ml、20RU/ml、80RU/ml、400RU/ml、1600RU/ml(RU/ml中的RU为ReletiveUnit即相对单位)。在制备每一批校准品时候,分别用校准品稀释液按照1:10-500倍稀释即可。
三、阳性对照与阴性对照的制备方法:
取临床上的阳性标本,经鉴定未检测出传染源的样本,多支混合,灭活、过滤、分装,-40℃以下深冷保存。根据GB/T21415-2008国家标准(体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性)确定阳性对照的靶值范围,在每一批制备时,直接用阳性对照稀释液按照1:10-500倍稀释即可。
取健康人的标本,经鉴定未检测出传染源的样本,多支混合,灭活、过滤、分装,-40℃以下深冷保存,确定为阴性对照。在每一批制备时,直接用阳性对照稀释液按照1:10-500倍稀释即可。
四、酶标液与终止液的制备方法:
将商品化的HRP标记的抗人IgG抗体按照经过滴配试验确定了工作浓度的比例,用酶标稀释液稀释后,分装即可。终止液为0.25-5mol/L硫酸配制而成,分装即可。
五、校准曲线的绘制方法:
按照以校准品的浓度值为横坐标(对数坐标),以各浓度校准品的OD值为纵坐标,绘制半对数校准曲线,经典的校准曲线如图1所示。
所述阳性对照和阴性对照是对校准品的校准曲线质控的作用,如果从校准曲线中求出的阳性对照的值在阳性对照的靶值范围内,求出的阴性对照的值也在阴性对照的靶值范围内,则校准曲线可以用于定量检测;若阳性对照或阴性对照有一个计算结果不在相应的靶值范围内,则本次试验无效,需要重新试验,建立校准曲线。
六、抗磷脂酶A2受体抗体IgG酶联免疫分析试剂盒的检测步骤:
①样本孵育:在预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板的微孔内分别加入2RU/ml、20RU/ml、80RU/ml、400RU/ml、1600RU/ml校准品,阳性对照与阴性对照各100μl,以及稀释后的待测样本各100μl,室温孵育30分钟;
②一次洗涤:甩掉反应液,每孔用300μl洗涤液洗3次,拍干;
⑧酶结合物孵育:在预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板的每个微孔内加入酶标液100μl,室温孵育30分钟;
④二次洗涤:甩掉反应液,再每孔用300μl磷酸盐漂洗液洗3次,拍干;
⑤底物孵育:在预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板的每个微孔内加入底物液100μl,室温孵育10分钟;
⑥终止:在预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板的每个微孔内加入终止液100ul,混匀;
⑦读值:加入终止液30分钟内将微孔板至于酶标仪上,用450/630nm双波长检测得到各样本的OD值;按照校准品对应的OD值做标准曲线,将样本的OD值带入标准曲线中,计算得到样本中抗磷脂酶A2受体抗体IgG的浓度值。
七、试剂盒性能指标测定
1、检测限
用5%牛血清白蛋白溶液作为空白样本,在一次运行中将空白样本重复测定20次。20次平均值为0.27RU/ml,标准差为0.04RU/ml。以空白均值加两倍标准差报告方法的检测限,本试剂盒的检测限为0.35RU/ml。
2、参考范围
该抗体过高有病理意义,过低无病理意义,参考值为正常值上限,故本试剂盒的正常值范围采用单侧范围。检测了208例健康体检者血清,平均值为3.8RU/ml,标准差为3.1RU/ml。由于样本检测数据符合正态分布,本试剂盒采用正态分布法,推算参考范围。即以平均值+3倍标准差为检测含量的正常参考范围上限,故确定正常参考值为0-13.1RU/ml。
3、特异性
选取类风湿关节炎病人的血清、甲状腺炎病人血清、干燥综合症病人血清各4份,结果均在正常参考范围内。
4、精密度
批内变异系数(CV,单位为%):选取高、中、低值3份质控血清,在同次试验内每份重复测定10次,计算得批内CV分别为9.7%、7.4%和7.1%;
批内变异系数:选取高、中、低值3份质控血清,每天测定1次,连续测定10天,计算批间CV分别为11.3%、8.0%和6.6%;
5、准确性:
选择抗体浓度为100RU/ml的血清3份,分别加入38RU/ml、100RU/ml和500RU/ml后,混合均匀,用试剂盒检测浓度分别为134.64RU/ml、203.4RU/ml、619.1RU/ml,计算回收率分别为97.6%、101.7%、103.2%,平均回收率在100.8%。
6、与金标准对比:
选取通过组织病理学检验确诊为特发性膜性肾病患者血清89份,非特发性膜性肾病患者血清34份,以组织病理学检验为金标准,用四格表统计如下:
特异性=真阴性/阴性总数×100%
敏感性=真阳性/阳性总数×100%
表1.四格表统计结果
因此本试剂盒的特异性为100%,敏感性为74.2%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒,其特征在于:所述试剂盒内设置有预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板,以及瓶装的以下试剂:一组抗磷脂酶A2受体抗体IgG校准品,阳性对照,阴性对照,浓缩洗涤液,样本稀释液,酶标液,底物液和终止液。
2.如权利要求l所述抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒,其特征在于:所述微孔板预包被的人磷脂酶A2受体抗原是由导入了含有人磷脂酶A2受体基因的重组载体的大肠杆菌、酵母细胞或哺乳动物细胞表达产生的;该人磷脂酶A2受体抗原的包被是用浓度0.05mol/L,pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释到一定浓度后包被的。
3.如权利要求l所述抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒,其特征在于:所述抗磷脂酶A2受体抗体IgG校准品是由校准品稀释液与抗磷脂酶A2受体抗体IgG阳性血清配制而成,该组抗磷脂酶A2受体抗体IgG校准品浓度分别为2RU/ml、20RU/ml、80RU/ml、400RU/ml、1600RU/ml;
所述阳性对照是由质控品稀释液与抗磷脂酶A2受体抗体IgG阳性血清配制而成;所述阴性对照是由质控品稀释液与抗磷脂酶A2受体抗体IgG阴性血清配制而成。
4.如权利要求l所述抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒,其特征在于:所述浓缩洗涤液按以下方法配制,按每升水中,加入12.11g三羟甲基氨基甲烷和5ml的吐温20,调pH7.8,定容1L,即得浓缩洗涤液;
所述样本稀释液按以下方法配制,按每升水中,加入1.21g三羟甲基氨基甲烷,7.5g的牛血清白蛋白,0.5ml的吐温20,调pH7.8,定容1L,即得样本稀释液。
5.如权利要求l所述抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒,其特征在于:所述酶标液是由酶标记的兔抗人IgG抗体与酶标稀释液按一定浓度配制而成;所述的酶为过氧化物酶类,所述终止液为0.25-5mol/L的硫酸。
6.如权利要求5所述抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒,其特征在于:所述的酶为辣根过氧化物酶,所述底物液为3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液。
7.如权利要求2所述抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒,其特征在于:所述碳酸盐缓冲液含按以下方法配制,按1000ml水中加入0.159gNa2CO3和0.293gNaHCO3制得。
8.如权利要求3所述抗磷脂酶A2受体抗体IgG试剂盒,其特征在于:所述校准品稀释液的配制方法为按100ml水中加入1.21g三羟甲基氨基甲烷,10g牛血清白蛋白,0.5ml吐温20,0.5mlProclin300,PH调至7.4制得,所述质控品稀释液的配制方法与校准品稀释液的配制方法相同。
9.一种抗磷脂酶A2受体抗体IgG的检测方法,其特征在于:包括以下步骤:
①样本孵育:在预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板的微孔内分别加入一组校准品,阳性对照与阴性对照,以及稀释后的待测样本各100μl,室温孵育30分钟;
②一次洗涤:甩掉反应液之后,每孔用300μl稀释10倍的浓缩洗涤液洗3次,拍干;
⑧酶结合物孵育:在预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板的每个微孔内加入酶标液100μl,室温孵育30分钟;
④二次洗涤:甩掉反应液,之后,每孔用300μl稀释10倍的浓缩洗涤液洗3次,拍干;
⑤底物孵育:在预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板的每个微孔内加入底物液100μl,室温孵育10分钟;
⑥终止:在预包被人磷脂酶A2受体抗原的微孔板的每个微孔内加入终止液100ul,混匀;
⑦读值:加入终止液30分钟内将微孔板至于酶标仪上,用450/630nm双波长检测得到各样本的OD值;按照校准品对应的OD值做标准曲线,将样本的OD值带入标准曲线中,计算得到样本中抗磷脂酶A2受体抗体IgG的浓度值。
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