JP7303107B2 - 自己免疫疾患の診断、予防、および/または治療 - Google Patents
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Description
本願は、2016年8月12日に出願された米国特許仮出願第62/374,382号の優先権を主張し、これは参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。
本願は、EFSウェブを介してASCIIテキストファイルとして電子的配列表と共に出願されている。電子的配列表は、72,810バイトの容量を有し、2017年8月11日に作成、最終保存されたIMWO001WOSEQLIST.txtというファイル名で提出されている。電子的配列表の中の情報は、米国特許法第1.52(e)条に従って、その全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。
)、カルゼルシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、5-フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エピルビシン、シスプラチン、5-フルオロウラシルおよびカペシタビンなどの細胞傷害性薬物からなる群から選択される。方法のいくつかの実施形態では、抗PLA2R自己抗体産生B細胞集団の排除効率は、約70%~約100%の範囲である。方法のいくつかの実施形態では、複合体は、T細胞集団も排除し、該T細胞集団は、抗PLA2R自己抗体産生B細胞集団にT細胞ヘルプを提供する。
ン1またはデスモグレイン3エピトープおよび薬物を含む複合体を患者に投与することを含み、該エピトープはデスモグレイン1またはデスモグレイン3フラグメント内に含まれ、それにより患者の抗デスモグレイン1または抗デスモグレイン3自己抗体産生B細胞集団を排除または低減する。
B細胞における抗体産生は、細胞表面B細胞受容体(BCR)と結合する抗原により開始される。BCRとの抗原の初期結合は、B細胞活性をもたらす一連の細胞内シグナル伝達イベントを誘発する。BCRと結合する抗原は、BCR-抗原複合体の迅速な内部移行を開始させる。内部移行後、BCR-抗原複合体は初期エンドソームに仕分けられ、その後、主要組織適合性複合体分類II(MHCII)含有後期エンドソームに仕分けられる。リソソームと融合時、これらのコンパートメントは、抗原を、ヘルパーT細胞に提示するためにMHCII上にロードされるペプチドに分解する(図3)。特異的ヘルパーT細胞の結合は活性化されたB細胞による抗体産生を刺激する(図3)。
ムに関する。いくつかの実施形態では、末梢血液および末梢リンパ器官における自己免疫細胞のこのレパートリーの標的化は、生涯にわたる治療効果をもたらすだろう。
ピトープ上の1つ以上の部位は、1つ以上の溶媒露出システインもしくはリジンまたは両方であり得る。
合する。いくつかの実施形態では、ホルミルグリシンアルデヒドタグを、オキシム化学による非開裂結合により薬物-リンカーと結合する。いくつかの実施形態では、ホルミルグリシンアルデヒドタグを、ピクテ・スペングラー反応による非開裂結合により薬物-リンカーと結合する。いくつかの実施形態では、薬物-リンカー中の薬物は、細胞傷害性試薬である。
テイン残基を含む。
。いくつかの実施形態では、エピトープの変異体は、該エピトープと約65、70、57、80、85、90、95、96、97、98、99、99.25、99.5、99.75、99.99%の同一性を有するか、または前述の値のいずれか2つにより規定された範囲を有する値の同一性を有する。
る。例えば、EDCとTCRとの結合は、薬物による免疫寛容の誘発をもたらし得、EDCのAPCへの内部移行は、APCの死をもたらし得る(図21;下図)。いくつかの実施形態では、免疫寛容は1つ以上の公知の機序により起こる。例えば、薬物は自己免疫B細胞、T細胞または両方により1つ以上のサイトカインの放出を阻害、または自己免疫B細胞、T細胞または両方におけるサイトカインシグナル伝達を阻害する。非限定的例としては、クローン除去、レセプター編集、濾胞除去、および免疫不応答が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬物は、自己免疫B細胞によるT細胞への抗原提示を阻害する。いくつかの実施形態では、薬物は、1つ以上のシグナル伝達経路を阻害する。非限定的例としては、IL-6受容体シグナル伝達、NF-κBシグナル伝達、Toll様受容体シグナル伝達、B細胞受容体シグナル伝達、T細胞受容体シグナル伝達、およびインフラマソームシグナル伝達が挙げられる。いくつかの実施形態では、1つ以上のシグナル伝達経路における1つ以上の標的を、薬物により標的としてもよい。非限定的例としては、COX、CCR、ヒスタミン受容体、インターロイキン受容体、gp120/CD4、CXCR、PD-1/PD-L1、MALT、LTR、ROS、NOS、TLR、NADPHオキシダーゼ、およびNrf2が挙げられる。
試薬、タンパク質またはペプチドの1つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、薬物は、アンチセンスRNA、miRNA、siRNAまたはB細胞内の抗体mRNA安定性、ターンオーバー、および/または翻訳に干渉することができるRNAiに関するRNAフラグメントの1つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、薬物は細胞傷害性薬物であり、細胞死をもたらすB細胞およびT細胞に対する細胞傷害効果を有する。いくつかの実施形態では、細胞死は、プログラムされた細胞死、アポトーシス、マクロオートファジー、オートファジー、ネクローシス、ネクロトーシス、分裂期細胞死、活性化誘導細胞死、アノイキス、角質化、興奮毒性、フェロトーシス、ウォーラー変性、および免疫原性アポトーシスの1つ以上により起こる。
レパートリーのみを標的とする。したがって、疾病の進行および再発は軽減され、長続きする保護効果をもたらす。
腔内(intracavitary)、腔内(intracelial)、小脳内(intracelebellar)、脳室内、
結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、筋肉内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、くも膜下腔内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、腟、直腸、口腔、舌下、鼻腔内、または経皮経路の1つ以上によるEDC投与が考えられる。
象の血液循環中に存在する場合、好ましい投与経路は、皮下、皮内、または経口の1つ以上である。このような患者では、送達の皮下および/または皮内経路は、自己抗体によるEDC中和の機会を最小限にし、リンパ組織および/または器官において記憶B細胞(およびT細胞)にEDCが達する機会を最大にする(図22)。一旦、活動性病期が過ぎ、患者が低レベルの血液循環抗体の寛解状態でなったならば、皮内および/または皮下経路によるEDCの投与に加えて、患者に静脈内経路によりEDCを与えて末梢を循環している自己免疫細胞を標的にすることができる。
末梢性ぶどう膜炎)、パーソネージ・ターナー症候群(Parsonnage-Turner syndrome)、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血(PA)、POEMS症候群、結節性多発動脈炎、多発内分泌腺症候群I、II、III型、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆(PRCA)、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群(RLS)、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子&精巣自己免疫病、全身硬直症候群(SPS)、亜急性細菌性心内膜炎(SBE)、スザック症候群、交感性眼炎(SO)、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病(TTP)、トローザ・ハント症候群(THS)、横断性脊髄炎、1型糖尿病、潰瘍性大腸炎(UC)、未分化結合織疾患(UCTD)、ぶどう膜炎、血管炎、白斑症、ウェゲナー肉芽腫症(または多発性血管炎を伴う肉芽腫症(GPA))を含むいずれもの抗原特異的自己免疫疾患を診断、予防および/または効果的に治療することができる。
で、EDCの形態の薬物の開始用量は、薬物の用量が単独であるよりも、より低くあり得る(例えば、体内の比較的近接不能な位置における腫瘍/がんのため)。例えば、EDCの形態の薬物の開始用量は、EDC中の薬物を疾病の治療のために使用する用量の約5分の1、10分の1、15分の1、20分の1、25分の1、30分の1、35分の1、40分の1、45分の1、50分の1、55分の1、60分の1、65分の1、70分の1、75分の1、80分の1、85分の1、90分の1、95分の1、100分の1、200分の1、250分の1、500分の1、1000分の1、2000分の1もしくは5000分の1、または前述の値のいずれか2つにより規定された範囲内であり得る。
疾病診断および治療後疾病進行のモニタリングは、患者治療選択肢、治療に対する患者応答、および患者疾病管理の確認にとって欠かせない。
リングは、1つ以上のアッセイによる。いくつかの実施形態では、アッセイは、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、FACS、エリスポット法(Enzyme-Linked ImmunoSpot)(ELISPOT)、放射免疫アッセイ、磁性免疫アッセイなどの免疫アッセイの1つ以上であり得る。
ら採取することができる。第一時点は、診療所への患者の最初の訪問であり得、患者は自己免疫疾患と診断されておらず、以前に自己免疫疾患の治療をした経験がない。
使用し、第一時点における患者のエピトープ特異的自己免疫細胞数を決定する。第一時点における患者のエピトープ特異的自己免疫細胞数が所定の閾値(患者が疾病のための1つ以上の治療を必要とすることを示す)より上である場合、単独または1つ以上の補助療法と併用のいずれかで薬物を含む1つ以上のEDCを患者に投与する。エピトープ特異的自己免疫細胞数を、フルオロフォアを含む1つ以上のEDCを用いて第二時点において再評価する。第二時点におけるエピトープ特異的自己免疫細胞数が所定の閾値未満である場合、治療を中断する。第二時点におけるエピトープ特異的自己免疫細胞数が所定の閾値より上である場合、治療を継続し、その後評価を行う。
膜性腎症(MN)(原発性MNまたは特発性MNとも呼ぶ)は、一般的糸球体疾患である。MNの罹患率は40歳を超えた患者で高い。頻繁な疾病の再発は、臨床治療の大きな課題である。高用量のステロイドホルモンおよび免疫抑制剤を使用すること以外に効果的な治療はなく、患者は現在の治療では5~10年で腎不全に進行する。米国では4,000~6,000件の新たな症例/年があり、欧州では10,000件の新たな症例/年があり、世界では80,000件の新たな症例/年がある。
。
(配列番号13)は、受容体の細胞外部分に位置し、立体配座であり、還元されやすく、自己抗体に対する非常に高い親和性を有する。
患者からの抗PLA2R自己抗体の除去は、自己抗体の病理学的影響を軽減し得る。しかしながら、患者からの自己抗体の除去は、依然として患者は疾病再発しやすいままである。これは、PLA2R自己抗体産生B細胞が、患者血液から病原自己抗体を除去したにもかかわらず、自己抗体を産生し続けているからである。したがって、PLA2Rエピトープ認識免疫細胞(例えば、B細胞およびT細胞)の特異的な標的化は、他の免疫細胞の正常な機能に影響を及ぼすことなく、病原性自己抗体の産生を排除することができる。
つかの実施形態では、患者は、以前に、MNに対する治療(免疫抑制剤もしくはステロイドホルモンまたは両方のいずれか)を受けた。いくつかの実施形態では、患者は、以前に、免疫抑制剤もしくはステロイドホルモンまたは両方のいずれかを用いたMNに対する治療に成功した。いくつかの実施形態では、患者は、以前に、免疫抑制剤もしくはステロイドホルモンまたは両方のいずれかを用いたMNに対する治療に成功しなかった。
実施形態では、遊離システイン残基を、PLA2RフラグメントのC末端に導入し、該遊離システインのチオ基を、デュオカルマイシン類似体とあらかじめ結合された開裂可能なバリン-シトルリンリンカーと結合する。
尋常性天疱瘡(PV)は、細胞間接着喪失を原因とする上皮内水疱形成を特徴とする潜在的な重篤な自己免疫性水疱形成疾患である。PVは、皮膚および粘膜の両方に影響を及ぼし、ケラチノサイト細胞表面分子デスモグレイン1(Dsg1)およびデスモグレイン3(Dsg3)に向けられた循環病原性自己抗体により媒介される。
は、それぞれ、221個のアミノ酸を含む。エピトープにおけるカルシウム結合部位は、自己抗体結合にとって重要である(図26)(Ohyama, B., et al.)。
つ以上に組み込むために、本明細書で提供されるDsg1またはDsg3フラグメントのうち1つ以上を大量に得ることができる。
例えば、いくつかの実施形態では、ポリHisタグDsg1またはDsg3フラグメントを哺乳類細胞(例えば、HEK293細胞)内で発現し、Ni-アフィニティ精製を用いて、細胞培養培地から精製することができる。それから、ポリHisタグをタンパク質消化(例えば、トロンビンを用いて)により除去することができ、Dsg1またはDsg3フラグメントを、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いてさらに精製し、トロンビン酵素ならびに遊離したポリHisタグを除去する。
MN患者から血液を採取する。血液から全B細胞を単離する。FACSを使用して、PLA2Rエピトープに対する受容体を発現する細胞を特定し分離する。PLA2Rエピトープに対する受容体を運搬する細胞にEDCを添加する。PLA2Rエピトープに対する受容体を発現しない細胞をコントロールとして使用する。EDCを、各細胞集団に、該EDC中の薬物の通常の用量の1000分の1の用量で添加する。細胞集団を、EDCと共に一夜インキュベートする。PLA2Rエピトープ受容体を発現する細胞はEDCによって殺されるが、受容体を発現しない細胞は影響を受けず生き残る。細胞をトリパンブルーで染色してPLA2Rエピトープに対する受容体を発現する細胞を殺すことにおけるEDCの有効性を評価することができる。
MN患者から血液を採取する。PLA2Rエピトープに対する受容体を発現する細胞に蛍光標識PLA2Rエピトープで標識化する。標識化および標識化していない細胞を、顕微鏡を用いて分離する。標識化していない細胞をコントロールとして使用する。EDCを、各細胞集団に、該EDC中の薬物の通常の用量の1000分の1の用量で添加する。細胞集団を、EDCと共に一夜インキュベートする。PLA2Rエピトープ受容体を発現する細胞をEDCにより殺すが、受容体を発現しない細胞は影響を受けず生き残る。細胞をトリパンブルーで染色してPLA2Rエピトープに対する受容体を発現する細胞を殺すEDCの有効性を評価することができる。
1つの例では、本明細書で提供される1つ以上の治療選択肢を用いた治療後、MN患者は、以前に治療レジメンを受けて約6か月と比較して、約1か月で回復した。患者の回復を、尿中タンパク質レベルにより測定した。
PLA2Rエピトープは、最低でも3つのドメイン、すなわち、N末端システインリッチドメイン(CysR)、フィブロネクチン様II型ドメイン(FnII)、およびC型レクチン様ドメイン1(CTLD1)を含む(図1、図2、および図23)。エピトープと自己抗体および/またはB細胞受容体(BCR)との相互作用の性質は、いまだに明らかでない。エピトープとの化学物質の結合は、抗体抗原相互作用と干渉しないことは重要である。
で、TEVが開裂されHisタグを除去した。それから、タンパク質を蛍光剤(例えば、FITC)または細胞傷害性試薬(例えば、モノメチルアウリスタチンE(MMAE))と結合する。
PMNは、B細胞媒介自己免疫疾患である。病原性自己抗体は、PLA2Rエピトープと特異的に結合する固有のB細胞受容体(BCR)を有し、記憶B細胞群由来血漿細胞から分泌される。記憶B細胞のこの群を識別し、PLA2Rエピトープ薬物複合体が記憶B細胞群のこの群の表面上のBCRと効果的に結合することができるか否かを評価するため、PMN患者の血液サンプルから単離された全B細胞に対するPLA2Rエピトープ-FITC分析を用いて結合アッセイを行った。患者末梢血液から単離された全B細胞を、ウシ胎仔血清および抗生物質を添加したRPMI培地中で、37℃、5%CO2において一夜培養した。それから、細胞を、上下にピペッティングして分散し、集めて、氷冷PBSで2回洗浄した。その後、細胞を、4℃で1時間、PBS中PLA2Rエピトープ-FITCと共にインキュベートした。細胞を氷冷PBSで3回洗浄し、励起波長488nmおよび発光波長520nmにおいて蛍光顕微鏡下で撮像した。図24は、PLA2Rエピトープ-FITCで標識化されたB細胞集団が、PMN患者のPLA2Rエピトープ結合記憶B細胞の特定集団の存在、およびこれらの記憶B細胞表面上でのPLA2Rエピトープ-FITCとBCRとの強力な結合を示していることを示す。
PMN患者から単離されたPLA2Rエピトープ特異的記憶B細胞の排除に対するPLA
2Rエピトープ-MMAEの有効性を評価した。MMAEは、細胞死を引き起こすチューブリン重合を阻害する強力な細胞傷害性薬剤である。MMAEは、リンパ腫治療用抗体-薬物複合体、ブレンツキシマブベドチン(商品名アドセトリス(Adcetris))の開発のために使用され、2011年にFDAにより認可された。患者末梢血液から単離された全B細胞を、RPMI培地中一夜培養してから、12ウェル細胞培養プレート(2ml/ウェル)の2つのウェル中に等しく分割した。1つのウェルの細胞をMMAEと共にインキュベートし、他を細胞培養インキュベーター内で24時間PLA2Rエピトープ-MMAEと共にインキュベートした。それから、両方のウェルからの細胞を集め、氷冷PBSで洗浄し、4℃で1時間、PLA2Rエピトープ-FITCと共にインキュベートした。細胞を氷冷PBSで3回洗浄し、励起波長488nmおよび発光波長520nmにおいて蛍光顕微鏡下で撮像した。
自己抗体結合にとって重要であるDsg3エピトープ中にカルシウム結合部位を保存するために、Dsg3 EC1~4ドメイン(450アミノ酸;図32;配列番号17)を薬物結合のためのエピトープとして選択した。Dsg3 EC1~4における特異的結合部位を開発するために、全ての内在性システイン(図32の下線部)を構造類似アミノ酸セリンと置き換えた。加えて、2つの内在性N-グリコシル化部位(Asn61およびAsn131;図32の下線部)を構造類似アミノ酸グルタミンと置き換えた。薬物結合のためDsg1エピトープを設計するために同様なアプローチをして、改変Dsg1 EC1~3ドメイン(336アミノ酸)を選択した(図31;配列番号16)。生成されたエピトープを、Dsg1 EC1~3およびDsg3 EC1~4と名付けた。Dsg1 EC1~3エピトープの分子量は約35kDaであり、Dsg3 EC1~4エピトープの分子量は約60kDaであった。
。ウェスタンブロットの結果により、Dsg1およびDsg3の操作および化学結合したエピトープは自己抗体と強力に反応し、タンパク質Gビーズとよく免疫沈降し、エピトープタンパク質の操作および化学結合が自己抗体-抗原相互作用と干渉しないことを示すことが分かった。
粘膜皮膚PV患者の血液サンプルから単離された記憶B細胞における特定のBCRと結合するDsgエピトープ-FITCの能力を評価した。まず、末梢血液単核細胞を、密度勾配遠心分離(ヒストパック(Histopaque)-1077)を用いて全血から単離し、次いで、B細胞ネガティブ単離キットを用いてB細胞を単離した。それから、単離された全B細胞を、ウシ胎仔血清および抗生物質を添加したRPMI培地中、37℃、5%CO2において一夜培養した。それから、細胞を処理し、PBS中、4℃で1時間、Dsgエピトープ-FITCで染色し、励起波長488nmおよび発光波長520nmにおいて蛍光顕微鏡で撮像した。図29は、Dsgエピトープ-FITCはB細胞群を強力に染色し、これらの記憶B細胞表面上のBCRとのDsgエピトープ-FITCの強い結合を示す。
粘膜皮膚PV患者から単離された、それぞれ、Dsg1およびDsg3エピトープ特異的記憶B細胞を排除するためのMMAEと結合したDsg1およびDsg3エピトープの有効性を評価した。患者末梢血液から単離された全B細胞を、RPMI培地中で一夜培養してから、12ウェル細胞培養プレート(2ml/ウェル)の2つのウェル中に等しく分割した。1つのウェルの細胞をMMAEと共にインキュベートし、他を細胞培養インキュベーター内で24時間Dsg1およびDsg3エピトープ-MMAEと共にインキュベートした。それから、両方のウェルからの細胞を集め、氷冷PBSで洗浄し、4℃で1時間、Dsg1およびDsg3エピトープ-FITCと共にインキュベートした。細胞を氷冷PBSで3回洗浄し、励起波長488nmおよび発光波長520nmにおいて蛍光顕微鏡下で撮像した。
prise)」、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(contain)」、「含む(contains)」、「含む(containing)」、「含む(include)」、「含む(includes)」、および「含む(including)」の使用は限定的でないことを意図している。
ラグメント、および天然源から単離、組換え技術により製造または化学的に合成されたかにかかわらずペプチドが挙げられる。ポリペプチドは、通常、少なくとも約6アミノ酸を含む。より短いポリペプチド、例えば、約50アミノ酸長未満のものは、通常、「ペプチド」と呼ぶ。
本開示中に引用された全ての参考文献は、その全文を参照することにより本明細書に組
み入れられるものとする。
Claims (9)
- 患者における膜性腎症(MN)の存在を決定するためのデータを取得する方法であって、前記方法が:
患者から得られたB細胞を含むサンプルを、PLA2Rフラグメント内に含まれるPLA2Rエピトープと接触させること;
結合を検出するフルオロフォアベースアッセイ、放射免疫アッセイまたは磁性免疫アッセイを行うことにより、前記サンプルにおけるPLA2RエピトープのB細胞への結合を検出することによって、前記サンプルにおける抗PLA2Rエピトープ自己抗体産生B細胞の量を決定すること;
前記サンプルにおける抗PLA2Rエピトープ自己抗体産生B細胞の量と、MNを有さない対象から得られたB細胞を含むコントロールサンプルにおいて予想される抗PLA2Rエピトープ自己抗体産生B細胞の量と、を比較することであって、前記コントロールサンプルにおいて予想される抗PLA2Rエピトープ自己抗体産生B細胞の量と比較した前記サンプルにおける抗PLA2Rエピトープ自己抗体産生B細胞の量の増加が、患者がMNの存在を示唆する自己免疫細胞を有しており且つMNの治療候補であることを示唆するものであること、
を含む、方法。 - 前記PLA2Rエピトープの配列が、配列番号13で定められた通りである、請求項1に記載の方法。
- 前記PLA2Rフラグメントの配列が、配列番号1で定められた通りである、配列番号2で定められた通りである、配列番号2で定められた通りの配列及び配列番号3で定められた配列の少なくとも5%の配列である、配列番号4で定められた通りである、配列番号5で定められた通りである、又は配列番号5で定められた通りの配列及び配列番号6で定められた配列の少なくとも5%の配列である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記コントロールサンプルにおける抗PLA2Rエピトープ自己抗体産生B細胞の量と比較した、前記サンプルにおける抗PLA2Rエピトープ自己抗体産生B細胞の量の増加が、少なくとも10%である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、体液又は組織若しくは臓器の生検サンプルである、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が複数のタイムポイントで実施されるものである、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、患者がMNの存在を示唆する自己免疫細胞を有しており且つPLA2Rエピトープと薬物を含む複合体による治療の候補であるかを決定するために実行されるものである、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複合体が、患者において抗PLA2R自己抗体産生B細胞集団を排除又は減少させることによって、膜性腎症(MN)の治療に使用するためのものである、請求項7に記載の方法。
- 前記複合体が、T細胞集団も排除するものであって、前記T細胞集団が抗PLA2R自己抗体産生B細胞集団にT細胞ヘルプを提供するものである、請求項8に記載の方法。
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