JPH07278196A - ヒトｉ型ホスホリパーゼａ２レセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒトＩ型ホスホリパーゼＡ₂(PLA₂-I)レセプ
ターおよびPLA₂-Iレセプターをコードする遺伝子を提供
する。さらに、該遺伝子を有する発現ベクター、および
該発現ベクターを導入した形質転換体を提供し、該形質
転換体を培養することによりPLA₂-Iレセプタータンパク
質を製造する方法も提供する。 【構成】 ヒトPLA₂-Iレセプタータンパク質をコードす
る遺伝子が得られた。この遺伝子を有する発現ベクタ
ー、および該発現ベクターを導入した形質転換体が得ら
れ、該形質転換体を培養することによりヒトPLA₂-Iレセ
プタータンパク質が生産される。さらに、ウシPLA₂-Iレ
セプターをコードする遺伝子中のPLA₂-Iに対して結合能
を有するドメインをコードする遺伝子に対応する部分
を、適当な宿主に導入することにより、PLA₂-Iに対して
結合能を有するヒトPLA₂-Iレセプタータンパク質が効果
的に生産され得る。これらのヒトPLA₂-Iレセプタータン
パク質は、PLA₂-Iレセプターのアゴニストおよびアンタ
ゴニストのスクリーニングに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＩ型ホスホリパー
ゼＡ₂レセプター；ヒトＩ型ホスホリパーゼＡ₂レセプタ
ー遺伝子；該遺伝子を含む発現ベクター；該発現ベクタ
ーを有する形質転換体；および該形質転換体を用いたヒ
トＩ型ホスホリパーゼＡ₂レセプターの製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ホスホリパーゼＡ₂（PLA₂；EC 3.1.1.
4）は、3-sn-ホスホグリセリドの2-アシルエステル結合
を加水分解するリン脂質分解酵素であり、哺乳類の膵臓
やヘビの毒液などに存在することが知られている。これ
までに知られているホスホリパーゼＡ₂には、高分子量
細胞質内在型と低分子量分泌型があり、このうち低分子
量分泌型ＰＬＡ₂は、グループＩ型とグループII型とに
分けられる。グループＩ型PLA₂（PLA₂-I）は、哺乳類の
膵臓などに存在している。膵臓のPLA₂は、膵液中に分泌
される消化酵素の１つであり、通常は前駆体として存在
し、トリプシンなどのタンパク分解酵素により加水分解
されて活性型となる。一方、グループII型PLA₂は、血小
板などに多く存在し、おもに炎症反応に関与していると
考えられる。

【０００３】このPLA₂-Iが、肺、胃、脾臓、および腎臓
にも存在することが、最近明らかとなり（Sakataら, Bi
ochim. Biophys. Acta, 1007, 124-126 (1989)、Seilha
merら, DNA, 5, 519-527 (1986)、Yasudaら, Biochim.
Biophys. Acta, 1046, 189-194 (1990)、Tojoら, J. Bi
ol. Chem., 263, 5724-5731 (1988)）、PLA₂-Iが、消化
酵素としての作用以外の作用も有している可能性が示唆
されている（Kanemasaら, Biochim. Biophys. Acta, 11
25, 210-214 (1992)）。

【０００４】このPLA₂-Iに結合するタンパク質（PLA₂-I
レセプター）が、最近確認され、ウシ黄体の膜画分より
精製されたタンパク質が、分子量190,000の１つの糖タ
ンパク質からなることが判った（HanasakiおよびArita,
Biochim. Biophys. Acta, 1127, 233-241 (1992)）。
さらに、ウシPLA₂-Iレセプター遺伝子のクローニングが
報告された（Ishizakiら, J. Biol. Chem., 269, 5897-
5904 (1994)）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
課題を解決するものであり、その目的は、ヒトＩ型ホス
ホリパーゼＡ₂レセプター；ヒトＩ型ホスホリパーゼＡ₂
レセプター遺伝子；該遺伝子を含む発現ベクター；該発
現ベクターを有する形質転換体；および該形質転換体を
用いたヒトＩ型ホスホリパーゼＡ₂レセプターの製造方
法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】発明者らはこれまでに、
ウシ黄体より精製されたウシＩ型ホスホリパーゼＡ₂レ
セプタータンパク質のアミノ酸配列を決定し、遺伝子組
換えの技術により、そのＤＮＡ配列およびウシＩ型ホス
ホリパーゼＡ₂結合部位のみをコードするＤＮＡを作成
し、これを用いてウシ低分子型ホスホリパーゼＡ₂レセ
プターを発現させている（特願平6-40177）。このウシ
低分子型Ｉ型ホスホリパーゼＡ₂レセプターのアミノ酸
配列をもとに、ヒト胎盤由来のｃＤＮＡライブラリーか
ら、ウシ低分子型Ｉ型ホスホリパーゼＡ₂レセプターに
対応するヒト低分子型Ｉ型ホスホリパーゼＡ₂レセプタ
ーのｃＤＮＡを得て、本発明を完成するに至った。

【０００７】本発明のヒトＩ型ホスホリパーゼＡ₂レセ
プターは、配列表の配列番号１の１位のValから４１１
位のValまでのアミノ酸配列を含む。

【０００８】本発明のＤＮＡ配列は、上記のヒトＩ型ホ
スホリパーゼＡ₂レセプターをコードする。

【０００９】好ましい実施態様では、上記ＤＮＡ配列
は、配列表の配列番号１の１位のＧから１２３３位のＴ
まででなる塩基配列を有する。

【００１０】本発明の発現ベクターは、上記のいずれか
に記載のＤＮＡ配列を有する。

【００１１】本発明の形質転換体は、上記発現ベクター
を宿主に導入して得られる。

【００１２】好ましい実施態様では、上記宿主は、哺乳
類動物細胞である。

【００１３】本発明のヒトＩ型ホスホリパーゼＡ₂レセ
プターの製造方法は、上記形質転換体を培養する工程、
および産生されたヒトＩ型ホスホリパーゼＡ₂レセプタ
ーを培養培地から回収する工程を包含する。

【００１４】本発明のヒトＩ型ホスホリパーゼＡ₂レセ
プタータンパク質およびそのＤＮＡ配列は、上記のよう
にウシＩ型ホスホリパーゼＡ₂レセプタータンパク質お
よびそのＤＮＡを利用して決定された。以下に、その工
程を説明する。

【００１５】（１）ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質を
コードするＤＮＡの配列決定 ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを
含むＤＮＡ断片の配列決定方法を以下に例示する。この
ＤＮＡ断片の配列は、例えば、ウシ胎盤由来のｃＤＮＡ
ライブラリー等をプローブを用いてスクリーニングし、
スクリーニングによって得られたＤＮＡをＤＮＡシーク
エンシングにより分析することにより、決定され得る。

【００１６】（Ａ）ＤＮＡプローブの作成 ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質をコードする遺伝子
は、例えば、ウシ胎盤由来のｃＤＮＡライブラリー等か
ら得ることができる。そのためには、まず、ウシ胎盤ｃ
ＤＮＡライブラリーから、ウシPLA₂-Iレセプタータンパ
ク質をコードする遺伝子のクローニングを行うためのプ
ローブが、例えば、次のようにして作成される。

【００１７】まず、ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質の
アミノ末端のペプチド配列の決定を行う。例えばウシ黄
体膜画分より、一連の分離操作によって、単一な成分に
までウシPLA₂-Iレセプタータンパク質を精製する（Hana
saki, K., Biochim. Biophys. Acta, 1127, 233-241 (1
992)）。この精製ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質を、
例えば、Applied Biosystems 477A Protein Sequencer
を用いて分析する。この結果、精製ウシPLA₂-Iレセプタ
ータンパク質のアミノ末端部分のアミノ酸配列が、図１
および配列表の配列番号１４に示すように決定された。

【００１８】このアミノ末端のアミノ酸配列をもとに、
直接的にあるいは間接的に、プローブを作成することが
できる。

【００１９】間接的にプローブを作成する場合、例え
ば、上記アミノ末端のアミノ酸配列をもとに、ポリメラ
ーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）用のＤＮＡプライ
マーを合成し、このプライマーを用いて、以下のように
して調製したＰＣＲ用の鋳型を増幅させて、スクリーニ
ング用のプローブとし得る。このＰＣＲ用の鋳型として
は、例えばウシPLA₂-Iレセプタータンパク質が多く存在
していることが考えられるウシ黄体から得られるＤＮＡ
を用いることができる。このようなＤＮＡは、例えば、
ウシ黄体から、グアニジウムチオシアナート法（Chomcz
ynski, P.ら, Anal. Biochem., 162, 156-159 (1987)）
によって、ＲＮＡを抽出し、このＲＮＡからｃＤＮＡを
調製する方法により、得られる。ＲＮＡからのｃＤＮＡ
の調製は、まず、プライマーをＲＮＡにアニーリングさ
せ、逆転写酵素により該プライマーからＤＮＡを合成し
ていくことにより、行われ得る。この時、例えば、ｃＤ
ＮＡ合成およびプラスミドクローニングのためのSuperS
criptプラスミドシステム（BRL社製）が用いられ得る。

【００２０】ＰＣＲ法は、例えばScience, 239, 487-49
1 (1988)に記載の方法に従い、ＰＣＲ自動化装置（Perk
in Elmer Cetus社製）を用いて行われ得る。

【００２１】このようにして得られたプローブを標識し
て、以下のスクリーニングに用いることができる。

【００２２】（Ｂ）ライブラリーのスクリーニング ウシＩ型ホスホリパーゼＡ₂レセプターをコードするＤ
ＮＡをスクリーニングするためのライブラリーとして、
ウシ由来の様々なライブラリーが用いられ得る。このラ
イブラリーには、例えば、ウシ染色体ライブラリー、ウ
シ胎盤ｃＤＮＡライブラリー、およびウシ腎臓細胞ｃＤ
ＮＡライブラリーなどが含まれる。

【００２３】ライブラリーのスクリーニングは、当業者
に公知の方法で、上記（Ａ）項で得られたプローブを用
いて行われ得る。このスクリーニング法には、例えば組
換えファージプラークのプラークハイブリダイゼーショ
ン法および組換え大腸菌のコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法が含まれる。

【００２４】（Ｃ）クローンの塩基配列の決定 ライブラリーをスクリーニングして得られたクローンの
挿入断片の塩基配列の決定は、例えば以下のように行わ
れる。まず、クローンの内部に存在する制限酵素部位を
用いて切断し、それぞれのＤＮＡ断片を各々適当なシー
クエンスベクター、例えば、M13mp18（宝酒造社製）お
よびM13mp19（宝酒造社製）にクローニングする。次に
クローニングした断片の塩基配列をジデオキシ法（Sang
er, F., Science, 214, 1205-1210 (1981)）により決定
する。これにより、塩基配列が決定される。配列表の配
列番号７に、クローンを解析して得られた、ウシPLA₂-I
レセプタータンパク質遺伝子を有するＤＮＡの配列を示
す。ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質遺伝子のすべてを
含む配列が示されている。

【００２５】（２）ウシ組換え型PLA₂-Iレセプタータン
パク質の発現 ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質遺伝子は、適当なベク
ターに組み込まれて、ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質
を発現させるための発現ベクターとされる。

【００２６】この発現ベクターを、例えば、細菌、酵
母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体
が作成される。この形質転換体を培養することによりウ
シPLA₂-Iレセプタータンパク質が産生され得る。

【００２７】例えばpSVL SV40後期プロモーターの下流
にウシPLA₂-Iレセプター遺伝子を含む発現ベクターを、
サル由来細胞COS7に導入することによって形質転換体を
作成し、この形質転換体を５％ＣＯ₂存在下、３７℃で
数日間培養することにより、ウシPLA₂-Iレセプタータン
パク質が産生され得る。

【００２８】上記で得られたウシPLA₂-Iレセプタータン
パク質産生培養物、あるいはコントロールとして作成し
たウシPLA₂-Iレセプタータンパク質をコードする遺伝子
を含まないコントロール培養物を遠心分離し、沈澱画分
の培養細胞を回収する。この培養細胞を洗浄した後、
¹²⁵Ｉ放射性同位元素で標識したPLA₂-Iを加えて、PLA₂-
I−PLA₂-Iレセプター間の結合反応を行わせる。このよ
うにして得られるPLA₂-Iの特異的な結合量を測定すれ
ば、細胞表面上に発現したウシPLA₂-Iレセプタータンパ
ク質の量がわかる（図４参照）。

【００２９】（３）ウシ分泌型PLA₂-Iレセプタータンパ
ク質の発現 ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質のうち、膜結合部位で
ある配列表の配列番号７の１３７３位のGlyからカルボ
キシル末端側の配列を含まないアミノ酸配列からなるタ
ンパク質は分泌型であり、これをウシ分泌型PLA₂-Iレセ
プタータンパク質という。ウシ分泌型PLA₂-Iレセプター
タンパク質は、ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質をコー
ドする遺伝子から、例えば、配列表の配列番号７のアミ
ノ酸配列の１３７３位からカルボキシル末端側をコード
する部分を削ったｃＤＮＡが、ミスマッチを含むＤＮＡ
オリゴマーを用いて、作成され得る。

【００３０】このｃＤＮＡは、ウシPLA₂-Iレセプタータ
ンパク質遺伝子と同様に、適当なベクターに組み込まれ
て、ウシ分泌型PLA₂-Iレセプタータンパク質を発現させ
るための発現ベクターとされ得る。

【００３１】この発現ベクターを、例えば、細菌、酵
母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体
が作成される。例えば、発現ベクターをサル由来細胞CO
S7に導入することにより形質転換体を作成し、この形質
転換体を培養することによって、PLA₂-I結合能を有しか
つ細胞膜から培地中に遊離されるウシ分泌型PLA₂-Iレセ
プタータンパク質が産生され得る。また、例えば、発現
ベクターをCHO細胞の染色体に組み込むことによって、
ウシ分泌型PLA₂-Iレセプタータンパク質を恒常的に発現
し得る。

【００３２】（４）ウシ低分子型PLA₂-Iレセプタータン
パク質の発現 ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質のアミノ酸配列のう
ち、PLA₂-I結合部位である配列表の配列番号７のアミノ
酸配列の４８６位のLeuから９４０位のProまでのアミノ
酸配列から主としてなるタンパク質を、ウシ低分子型PL
A₂-Iレセプタータンパク質という。ウシ低分子型PLA₂-I
レセプタータンパク質は、ウシPLA₂-Iレセプタータンパ
ク質をコードする遺伝子から、例えば、PLA₂-I結合部位
である配列表の配列番号７のアミノ酸配列の４８６位か
ら９４０位をコードする部分を含むＤＮＡ断片が、適当
な制限酵素により切断され得る。このＤＮＡ断片は、ウ
シPLA₂-Iレセプタータンパク質およびウシ分泌型PLA₂-I
レセプタータンパク質の遺伝子と同様に、適当なベクタ
ーに組み込まれて、ウシ低分子型PLA₂-Iレセプタータン
パク質を発現させるための発現ベクターとされ得る。

【００３３】この発現ベクターを、例えば、細菌、酵
母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体
が作成される。この形質転換体を培養することによりウ
シ低分子型PLA₂-Iレセプタータンパク質が産生され得
る。例えば、ウシ低分子型PLA₂-Iレセプタータンパク質
の発現ベクターを、サル由来細胞COS7に導入することに
より形質転換体を作成し、この形質転換体を培養するこ
とによって、PLA₂-I結合能を有するウシ低分子型PLA₂-I
レセプタータンパク質が、培養上清中に産生され得る。
また、例えば、発現ベクターをCHO細胞の染色体に組み
込むことによって、ウシ低分子型PLA₂-Iレセプタータン
パク質を恒常的に発現し得る。

【００３４】（５）ヒト低分子型PLA₂-Iレセプタータン
パク質をコードするＤＮＡの配列決定 本発明のヒト低分子型PLA₂-Iレセプタータンパク質をコ
ードするＤＮＡの配列は、例えば以下のように行われ
る。まず、ヒト胎盤由来のｃＤＮＡライブラリー等を鋳
型として、ウシ低分子型PLA₂-Iレセプタータンパク質の
アミノ酸配列をもとに設計されたＤＮＡオリゴマーをプ
ライマーとして用いてＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ産
物を鋳型として、適当な合成ＤＮＡオリゴマーをプライ
マーとして用いて再度ＰＣＲを行い、２回目のＰＣＲ産
物を得る。この２回目のＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片
を、ウシPLA₂-Iレセプターの場合と同様に、M13mp18
（宝酒造社製）およびM13mp19（宝酒造社製）などの適
当なシークエンスベクターにクローニングし、例えば、
ジデオキシ法により塩基配列を決定し得る。決定された
塩基配列およびそれに対応するアミノ酸配列を配列表の
配列番号１に示す。

【００３５】（６）ヒト低分子型PLA₂-Iレセプタータン
パク質の発現 本発明のヒト低分子型PLA₂-Iレセプタータンパク質遺伝
子は、ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質の遺伝子と同様
に適当なベクターに組み込まれて、ヒト低分子型PLA₂-I
レセプタータンパク質を発現させるための発現ベクター
とされ得る。

【００３６】この発現ベクターを、例えば、細菌、酵
母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体
が作成される。この形質転換体を培養することによりヒ
ト低分子型PLA₂-Iレセプタータンパク質が産生され得
る。例えば、ヒト低分子型PLA₂-Iレセプタータンパク質
の発現ベクターを、サル由来細胞COS7に導入することに
より形質転換体を作成し、この形質転換体を培養するこ
とによって、PLA₂-I結合能を有するヒト低分子型PLA₂-I
レセプタータンパク質が、培養上清中に産生され得る。
また、例えば、発現ベクターをCHO細胞の染色体に組み
込むことによって、ヒト低分子型PLA₂-Iレセプタータン
パク質を恒常的に発現し得る。

【００３７】

【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに説明す
る。

【００３８】本発明の各工程において用いた一般的な分
子生物学的実験手法（DNAのアガロースゲル電気泳動、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、電気泳動分離したDN
Aを透析膜を用いてゲル中から回収する方法、フェノー
ル抽出、クロロフォルム抽出、エタノール沈殿、ライゲ
ーション、大腸菌の形質転換、組換え大腸菌の培養、プ
ラスミドDNAの調製、ファージDNAの調製、DNAの制限酵
素による切断、DNAの放射標識等）は Molecular clonin
g (Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1982)
によった。同じく一般的な分子生物学的実験手法に用い
る試薬（制限酵素、DNA修飾試薬等）は、特に指示のな
いかぎり、宝酒造（株）より購入した。

【００３９】（実施例１） Ａ．ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質アミノ末端のペプ
チドのアミノ酸配列の決定 遺伝子のクローニングを行うためには、目的の遺伝子を
検出、同定するために用いるDNA断片が必要となる。こ
のようなDNA断片を得るために、まず、ウシ精製PLA₂-I
レセプタータンパク質のアミノ末端のペプチドのアミノ
酸配列から、DNA塩基配列の決定のための情報を得るこ
とを試みた。

【００４０】まず、ウシ黄体膜画分より、ジエチルアミ
ノエチル−セファセルクロマトグラフィー、PLA₂-I−ア
フィニティーゲルクロマトグラフィー、ゲルフィルトレ
ーションHPLCの一連の分離操作によって単一な成分にま
で精製されたウシPLA₂-Iレセプタータンパク質(Hanasak
i, K.ら, Biochim. Biophys. Acta, 1127, 233-241 (19
92))15μgを、セントリコン100（米国アミコン社製）に
よって脱塩した後、10mM HCl, 20mMオクチルチオグルコ
シド溶液に溶解し、Applied Biosystems 477AProtein S
equencerを用いて分析した。その結果、アミノ末端から
の配列として、図１および配列表の配列番号１４に示す
ように、２３個のアミノ酸のアミノ酸配列を決定するこ
とができた。

【００４１】Ｂ．アミノ末端２３残基に対応するDNAの
合成 上記Ａ項で決定することのできたアミノ酸配列をもとに
DNAオリゴマーを合成し、ポリメラーゼチェーンリアク
ション法 （PCR、Saiki, R. K.ら, Science, 239, 487-
494 (1988)）によってDNAプローブ（以下に示す遺伝子
ライブラリーのスクリーニングに使用するためのプロー
ブ）の作成を行った。このPCRに用いるDNAオリゴマーの
設計、およびその作製は、以下の通りである。各アミノ
酸残基に対応するコドンを考慮して、決定したアミノ酸
配列の、ある領域をコードしうるDNA配列のすべてを網
羅する混合DNAオリゴマーを設計することができる。実
際には、哺乳動物で優先的に使用されるコドンを主に用
い、図１に示した塩基配列のうちアミノ末端側とカルボ
キシル末端側の配列をもとにそれぞれ(I)（配列表の配
列番号８）(II)（配列表の配列番号９）と(III)（配列
表の配列番号１０）(IV)（配列表の配列番号１１）のDN
Aオリゴマーを合成した。これらのうち(III)および(IV)
の２つは、タンパク質をコードしている遺伝子の相補鎖
の配列に基づくものである。これらのDNAオリゴマーは
短鎖であるため、核酸合成機(PharmaciaLKB Gene Assem
bler Plus, DNA Synthesizer)を用いて化学合成した。
これらのDNAオリゴマーは図１に示すような位置関係に
あるので、適当な試料を鋳型としてPCRを行えば、(I)と
(IV)のオリゴマーペアーからは６５塩基対、(II)と(IV)
のオリゴマーペアーからは６２塩基対のウシPLA₂-Iレセ
プターcDNA断片が増幅されると予想できる。さらに、初
めにオリゴマー(I)と(IV)のペアーで増幅した産物をゲ
ル電気泳動によって分離し、鎖長が６５塩基対であるDN
Aを分離回収し、これを(II)と(IV)のオリゴマーによる
２回目のPCRの鋳型として用いれば、さらに高い特異性
をもってウシPLA₂-IレセプターcDNAを得ることができ
る。

【００４２】Ｃ．PCRに用いる鋳型試料の調製 ウシ黄体には他の臓器と比較して多くのPLA₂-Iレセプタ
ータンパク質が存在しているので、遺伝子クローニング
の材料としても黄体が適したものであると考えられる。
新鮮な状態で凍結されたウシ黄体７個より、グアニジウ
ムチオシアネート法(Chomczynski, P.ら, Anal. Bioche
m., 162, 156-159 (1987))によってRNAを抽出した。

【００４３】ウシPLA₂-IレセプターcDNAの鎖長は、レセ
プタータンパク質の分子量から計算して少なくとも４５
００塩基以上であることが予想され、このように長いcD
NAの場合通常のオリゴdTプライマーを用いる方法による
cDNA調製のための反応では、完全長のcDNAが得られる可
能性が低くなることが知られている。

【００４４】従って、PCRによって増幅しようとする領
域の下流側の極く近傍に位置するDNAオリゴマーを、cDN
A化のプライマーとして用いることを試みた。ここでい
うcDNA化に用いたDNAオリゴマーは図１の(III)で示され
るものであり、実際には上記ウシ黄体RNA 10μgから、
このDNAオリゴマー(III)１pmoleをプライマーとしてｃ
ＤＮＡの調製を行った。このｃＤＮＡ調製には、cDNA合
成およびプラスミドクローニングのためのSuperScript
プラスミドシステム（米国BRL社製）のcDNA合成反応系
を使用した。

【００４５】Ｄ．PCRによるウシPLA₂-IレセプターcDNA
の増幅と単離 上記Ｂ項で得られたDNAオリゴマー(I)と(IV)を用いて、
上記Ｃ項で得られたcDNA試料を鋳型としてウシPLA₂-Iレ
セプターcDNAの増幅を行った。PCRには、酵素として米
国Perkin Elmer Cetus社のAmpliTaq DNA polymeraseを
用い、反応液の組成は当酵素の使用説明書に従った。増
幅装置はPerkin Elmer Cetus社のThermal cyclerを使用
し、94℃ 1分、37℃ 1分を15サイクル、引き続いて94℃
1分、50℃ 1分、72℃ 15秒を15サイクルで、増幅を行
った。PCR反応液200μlをクロロフォルム抽出、エタノ
ール沈殿した後、15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけ、増幅産物をその分子量にしたがって分離した。
ウシPLA₂-IレセプターcDNAが増幅されると予想される６
５塩基対に相当する付近のゲル断片を切り出して、ゲル
断片中に含まれるDNAを回収した。次に、回収したDNAを
鋳型とした２回目のPCRを、オリゴマー(II)と(IV)を用
いて行った(94℃ 1分、50℃ 1分、72℃ 1分を30サイク
ル)。このPCRの産物も上記と同様にクロロフォルム抽
出、エタノール沈殿の後ポリアクリルアミドゲル電気泳
動によって分離し、６２塩基対に相当するDNAをゲルか
ら回収した。得られた２本鎖のDNAを、適当なクローニ
ングベクター内に挿入することによって大腸菌内でクロ
ーン化した。上記で単離したDNAは、クローニングベク
ターpBLUE SCRIPT(KS-)(米国STRATAGENE社)を制限酵素E
coRVで直鎖状にしジデオキシチミジンを付加したもの(H
olton, T.A.ら, Nucleic Acids Res., 19, 1156 (199
1))とライゲーションすることによって、このクローニ
ングベクター内に挿入した。ライゲーション液をフェノ
ール抽出、エタノール沈殿した後、この精製ライゲーシ
ョン液を用いて大腸菌C600株（米国CLONETECH社製）を
形質転換した。形質転換した大腸菌をアンピシリン50μ
g/mlを含むＬＢ寒天培地で選択した。得られた形質転換
体の中から６株について、それらの大腸菌が保持するプ
ラスミドDNAを調製した。このうち４株に関して、これ
らのプラスミドDNAのEcoRV部位に挿入されているPCR産
物の塩基配列を、ジデオキシ法（Sanger,F., Science,
214, 1205-1210 (1981)）によって決定した。これらの
うちの２クローンの塩基配列は、図１のオリゴマー(II)
と(IV)で挟まれる部分に相当するアミノ酸配列をコード
するものであった。

【００４６】（実施例２）（ウシ染色体ライブラリーの
スクリーニング） 実施例１のＤ項のPCR増幅で得られたウシPLA₂-Iレセプ
ターcDNA断片は、通常の遺伝子ライブリーのスクリーニ
ングにプローブとしてそのまま用いることができる。し
かしながら、感度の面で問題があり更に長いプローブの
取得が望ましい。さらに、このウシPLA₂-Iレセプター遺
伝子の発現頻度が低いものであると予想されたため、cD
NAライブラリーではなく、その遺伝子の発現頻度によら
ず、すべての遺伝子領域を均等に含むと考えられる染色
体ライブラリーのスクリーニングを初めに行い、より長
いcDNA断片の単離を行った。

【００４７】染色体ライブラリーは、米国CLONETECH社
より購入したBovine Genomic Libraryを使用した。プロ
ーブには実施例１のＤ項で得られたcDNA断片を³²Ｐ放射
性同位元素標識したものを用い、スクリーニング方法は
ライブラリー添付のプロトコールに従った。具体的には
まず、ファージ液の力価測定を行った後、１枚のプレー
ト当り約４万個のファージプラークを形成するだけのフ
ァージ液をライブラリー添付の大腸菌宿主と混合し、Ｌ
Ｂプレート(10×15cm)に重層した。このプレートを３７
℃で一晩培養後、形成されたプラークをプラークハイブ
リダイゼーション法によってスクリーニングした。

【００４８】約８０万個のクローンのスクリーニングを
行ったところ、１個の陽性クローンが得られた（図２の
pGE-1）。このクローンの塩基配列を解析したところ、
配列表の配列番号７に示す塩基配列のうち、１位から３
８８位までに相当する領域を含んでいた。３８８位の塩
基の下流には介在配列（イントロン）（図２の破線部
分）が見られた。

【００４９】（実施例３）（ウシ胎盤cDNAライブラリー
のスクリーニング） 実施例２で明らかにすることのできた塩基配列をもと
に、配列表の配列番号７の２５７位から３８４位までの
１２８塩基対をPCR法によって増幅することのできるＤ
ＮＡオリゴマーをプライマーとして合成した（配列表の
配列番号１２および１３）。実施例２で得られた陽性ク
ローンのDNA（pGE-1）を鋳型として、上記の１２８塩基
対よりなるDNA断片をPCR法によって特異的に増幅し、こ
の産物を³²Ｐ放射性同位元素標識し、ウシ胎盤cDNAライ
ブラリーのスクリーニングに用いた。ウシ胎盤cDNAライ
ブラリーは米国CLONETECH社より購入したBovine Placen
ta cDNA Library(5'Stretch)を使用した。上記ライブラ
リーのスクリーニングはライブラリー添付のプロトコー
ルに従った。具体的には、実施例２に記載の染色体ライ
ブラリーのスクリーニング法と同様の工程でスクリーニ
ングを行った。合計約６４万個のクローンのスクリーニ
ングを行い、図２のpNH-1で示されるウシPLA₂-Iレセプ
ターcDNA断片を持つクローンを得た。得られたクローン
のcDNAを制限酵素で切断し、ゲル電気泳動にて分離回収
した後、³²Ｐ放射性同位元素標識することによってDNA
プローブを調製した。この新しいプローブを用いて同じ
ライブラリーを再スクリーニング（約３５０万クロー
ン）することによって、pNH-1より下流側をコードする
クローン（図２のpMID-1およびpMID-7）を単離すること
ができた。このように、新しく得られたクローンから新
しいDNAプローブを調製して、互いにオーバーラップす
るクローンを順次得ることができた。

【００５０】（実施例４）（ウシ腎臓由来MDBK細胞cDNA
ライブラリーのスクリーニング） 種々の培養細胞あるいは組織でのウシPLA₂-Iレセプター
の発現量を、スキャッチャードプロット解析によって測
定した結果、ウシ腎臓由来の細胞MDBK細胞株（ATCC CCL
22）が、他の臓器に比べてより多くのウシPLA₂-Iレセ
プターを発現していることが認められた。実施例３まで
で得られていたcDNAをプローブとして、MDBK細胞株cDNA
ライブラリーのスクリーニングを行った（米国STRATAGE
NE社のBovine Kidney cDNA Library in the Lambda ZAP
II Vectorを使用した）。この結果、図２に示したpMD-6
およびpMD-24を含む複数の陽性クローンが得られた。ま
た、市販のライブラリーとは別に、MDBK細胞より抽出し
たRNAからcDNAを合成し、cDNA合成およびプラスミドク
ローニングのためのSuperScriptプラスミドシステム（B
RL社、前出）によってcDNAライブラリーを作成した。

【００５１】このライブラリーからは、図２に示したpM
DBK-11を含む複数のクローンが得られた。

【００５２】（実施例５）（ウシPLA₂-IレセプターcDNA
の全一次構造の決定） 実施例４までで得られたcDNAクローンのうちpNH-1およ
びpMDBK-11の２つの塩基配列情報を重ね合わせると、ウ
シPLA₂-IレセプターcDNAの全塩基配列を決定することが
できる。全塩基配列およびアミノ酸配列を配列表の配列
番号７に示す。これらのcDNAは、翻訳開始点と考えられ
るATGの上流２７９bp、ウシPLA₂-Iレセプタータンパク
質をコードする４３８９bp、終止コドンから下流３１０
bp（mRNAの３'端に見られるpoly A tailを含む）からな
り、合計４９７８bpで構成されている。また、実際に、
pNH-1とpMDBK-11の２つのcDNA断片を、予め制限酵素Nco
Iで切断した後に連結させることによって、ウシPLA₂-I
レセプタータンパク質全体をコードするcDNA断片を構築
することができる（後述）。

【００５３】タンパク質をコードしている部分の鎖長か
らレセプタータンパク質のアミノ酸残基数は１４６３で
あることがわかった。ただし、アミノ末端部分にシグナ
ルペプチド様の配列が見られ、精製タンパク質のアミノ
末端のアミノ酸配列（図１）が配列表の配列番号７のア
ミノ酸配列の２１番目以降に見られることから、アミノ
末端の２０残基はシグナルペプチドであり、シグナルペ
プチド切断後の成熟レセプタータンパク質のアミノ酸残
基数は１４４３と予想される。

【００５４】シグナルペプチドは、細胞内で合成された
ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質の輸送のため、あるい
は膜に対して正しく配向するために機能し、実際のPLA₂
結合能はこの１４４３個のアミノ酸によって保持されて
いると考えられる。

【００５５】さらに、既知タンパク質の一次構造データ
バンクとのホモロジー検索を行った結果、レクチンの１
種であるマンノースレセプターとの間に、データバンク
中の他のタンパク質と比較して最も高いホモロジー（一
次構造全体で29％）が検出された。両者間のホモロジー
は一次構造全体にわたっており、特に、タンパク質の立
体構造の規定に重要であるシステイン残基の位置が極め
てよく保存されていた。マンノースレセプタータンパク
質は、多ドメイン構造であることが報告されているため
（Taylor, M. E.ら, J. Biol. Chem., 265, 12156-1216
2 (1990)）、これをもとにウシPLA₂-Iレセプタータンパ
ク質のドメイン構造を予想した。図３にウシPLA₂-Iレセ
プターの推定されたドメインを示す構造模式図を示す。
図の下の数字は、各ドメインのアミノ末端のアミノ酸残
基の番号（配列表の配列番号７に対応）を表す。ウシPL
A₂-Iレセプターは、図３に示すようにアミノ末端から順
に、シグナル配列（Ｓ）、システイン残基を多く含むド
メイン（Ｃ）、ファイブロネクチンタイプ２リピート様
ドメイン（Ｔ）、８個の糖結合領域様ドメイン（CRD1〜
CRD8、図中の１〜８）、膜結合領域（Ｍ）、および細胞
質内ドメイン（Ｉ）からなると考えられる。

【００５６】（実施例６）（ウシ組換え型PLA₂-Iレセプ
タータンパク質の発現） cDNAクローンであるpNH-1とpMDBK-11は、いずれも図２
に示す制限酵素NcoI認識部位（配列表の配列番号７の塩
基配列７９９位に相当）以外の領域にNcoIで切断される
配列を持たないことが確かめられた。そのため、この両
者をNcoIで切断後、ゲル電気泳動によって、pNH-1から
はNcoIより上流側を、pMDBK11からはNcoIより下流側を
分離精製し、得られた２つのcDNA断片をライゲーション
反応によって連結した。連結したDNA断片をウシPLA₂-I
レセプターcDNAと呼ぶ。このウシPLA₂-IレセプターcDNA
を動物細胞用発現ベクターであるpSVL SV40後期プロモ
ーター発現ベクター(Pharmacia LKB)のプロモーター下
流域に順方向に挿入した。このプラスミドをウシPLA₂-I
レセプター発現ベクターと呼ぶ。続いてこのウシPLA₂-I
レセプター発現ベクターでサル由来のCOS7細胞をトラン
スフェクトした。トランスフェクションには米国GIBCO/
BRL Life Technologies, Inc.のLipofectin Reagentを
用い、方法はそのプロトコールによった。トランスフェ
クト３日後に、COS7細胞の解析を以下のように行った。

【００５７】まず、培養細胞を洗浄した後、培養細胞を
¹²⁵Ｉ放射性同位元素標識したPLA₂-Iの存在下におくこ
とによって、PLA₂-I−PLA₂-Iレセプター間の結合反応を
行わせた。結合しなかった遊離のPLA₂-Iを洗浄にて除去
した後、細胞膜上に捕らえられた放射性同位元素量を測
定した。結果を図４に示す。図中のContおよびPLA₂は、
それぞれ、コントロールプラスミドでトランスフェクト
した細胞およびウシPLA₂-Iレセプター発現プラスミドで
トランスフェクトした細胞をそれぞれ３回測定した平均
値を表す。PLA₂-I−PLA₂-Iレセプター間の結合反応を大
過剰の未標識PLA₂-I存在下で行ったときの放射性同位元
素量を非特異的結合量（図の斜線部分）とみなし、この
値をそれぞれの測定値である全結合量（図の点描部分）
から差し引いた値をウシPLA₂-Iレセプターによる特異的
な結合量とした。その結果、cDNAを挿入していないコン
トロールプラスミドでトランスフェクトした細胞に比
べ、ウシPLA₂-Iレセプター発現プラスミドでトランスフ
ェクトした細胞が有意に高いPLA₂-I結合能（全結合量と
非特異的結合量の差）を有していることが明らかとなっ
た。このようにして、このcDNAが実際に機能を持つウシ
PLA₂-Iレセプターをコードしていることが確認できた。
なお、PLA₂-I結合能の測定は前出の論文(Hanasaki, K.
ら, Biochim. Biophys. Acta, 1127, 233-241 (1992))
に従って行った。

【００５８】（実施例７）（ウシ分泌型PLA₂-Iレセプタ
ーの発現） 配列表の配列番号７の１３７３位のGlyをコードするcDN
A配列(GGA)を終止コドンであるTGAに変換するために、
配列表の配列番号１５のDNAオリゴマーを合成した。こ
のDNAオリゴマーは、１３６８位のLysから１３７２位の
Lysまでの５アミノ酸に対応する15塩基配列、１３７３
位のGlyをコードするコドンを終止コドンであるTGAに変
換する配列、およびこの終止コドンの３'側に制限酵素N
otIの認識配列であるGCGGCCGCを導入する配列を有す
る。このDNAオリゴマーと、制限酵素XbaI認識配列（配
列表の配列番号７の塩基配列４１７８位に相当）より上
流側にあってセンス鎖に対応するDNAオリゴマーとを用
いて、ウシPLA₂-IレセプターcDNAを鋳型としたPCRを実
施例１のＤ項と同様の方法で行った。PCR増幅で得られ
たcDNAを、制限酵素XbaIとNotIで切断した。実施例６の
ウシPLA₂-Iレセプター発現ベクターをXbaIとNotIで切断
して、ウシPLA₂-IレセプターcDNAのXbaI認識配列から
３'側を欠いたcDNAを調製し、先のPCR増幅cDNA断片をこ
のcDNAへ挿入した。この結果得られたベクターDNAをウ
シ分泌型PLA₂-Iレセプター発現ベクターと呼ぶ。このウ
シ分泌型PLA₂-Iレセプター発現ベクターは、ウシPLA₂-I
レセプター発現ベクターと比較して、ウシPLA₂-Iレセプ
ターDNAの配列中１３７３位のアミノ酸Glyをコードする
配列が終止コドンに変わっており、また１３７４位以降
のアミノ酸をコードする部分を欠失している。

【００５９】このウシ分泌型PLA₂-Iレセプター発現ベク
ターでサル由来COS7細胞をトランスフェクトした。この
細胞の培養上清中のPLA₂-I結合能を、PLA₂-Iとレセプタ
ータンパク質とをポリエチレングリコールを用いて共沈
させる方法（Hanasaki, K.ら, J. Biol. Chem., 267, 6
414-6420 (1992)) によって測定した。結果を図５に示
す。図の網掛部分は非特異的結合量を、点描部分は全結
合量を表す。その結果、cDNAを挿入していないコントロ
ールプラスミドでトランスフェクトした細胞（Cont）に
比べ、ウシ分泌型PLA₂-Iレセプター発現プラスミドでト
ランスフェクトした細胞（PLA₂）が非常に高いPLA₂-I結
合能を有しており、このウシ分泌型PLA₂-Iレセプター発
現ベクターから発現される組換え型レセプターは実際に
培地中に分泌され、野生型レセプターと同程度のPLA₂-I
結合親和性(Kd値＝0.8nM)を持っていることが判った。

【００６０】（実施例８）（CRD3〜CRD5部分からなるウ
シ低分子型PLA₂-Iレセプタータンパク質の発現） 配列表の配列番号７に示した塩基配列の１７９４位に存
在する制限酵素StuIの認識部位から３１６５位に存在す
る制限酵素PflMIの認識部位までのDNA断片を、実施例６
のウシPLA₂-IレセプターcDNAを各制限酵素で切断するこ
とにより調製し、大腸菌DNAポリメラーゼＩ（Klenow fr
agment）によってその末端を平滑化した。このDNA断片
を、実施例６のウシPLA₂-Iレセプター発現ベクターを制
限酵素XhoIとXbaIで切断し末端を平滑化したベクターDN
Aと、ライゲーション反応によって連結した。連結して
得られたベクターDNAを、ウシ低分子型PLA₂-Iレセプタ
ー発現ベクターと呼ぶ。このウシ低分子型PLA₂-Iレセプ
ター発現ベクター中のウシPLA₂-IレセプターcDNA部分
は、ウシ野生型PLA₂-IレセプターcDNAと比較して、塩基
配列の４２６〜１７９３位および３１６２〜４１７６位
を欠失している。また、２９位のアミノ酸をコードする
コドンが、連結によりGAGからGACに変わったため、Asp
がコードされている。同様に９４１位のアミノ酸もAsn
に変換されている。さらに、連結の結果、４１７６〜４
１８１位のXbaI認識部位中のTAGが終止コドンとして機
能するため、塩基配列の４１７８位以降のcDNA部分はタ
ンパク質には翻訳されない。従って、翻訳される部分は
配列表の配列番号７のアミノ酸配列の−２０〜２８位と
４８６〜９４０位の領域であり、２８位と４８６位の間
にはAspが、９４０位のカルボキシル末端側にはAsnが付
加している。すなわち、発現されたウシ低分子型PLA₂-I
レセプターのアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６に
示すとおりである。これはウシPLA₂-Iレセプターのドメ
イン構造のCRD3〜CRD5に相当する領域をすべて含み、そ
れ以外の部分はほとんど含まない。

【００６１】このウシ低分子型PLA₂-Iレセプター発現ベ
クターを、実施例７で行ったのと同様にCOS7細胞に導入
し、培養上清中のPLA₂-I結合活性を測定した。その結果
を図６に示す。図の網掛部分は非特異的結合量を、点描
部分は全結合量を表している。その結果、培養上清中に
はPLA₂-I結合活性が検出され、コントロールプラスミド
でトランスフェクトした細胞（Cont）に比べ、ウシ低分
子型PLA₂-Iレセプター発現プラスミドでトランスフェク
トした細胞（PLA₂）で高いPLA₂-I結合能が見られた。こ
のことは、ウシPLA₂-Iレセプターのドメイン構造のうち
のCRD3〜CRD5に相当する領域のみで、PLA₂-Iと結合し得
ることを示している。

【００６２】（実施例９）（ヒト低分子型PLA₂-Iレセプ
ターcDNAの一次構造の決定） Ａ．DNAオリゴマーの合成 実施例５で決定したウシPLA₂-Iレセプタータンパク質の
PLA₂-I結合部位のアミノ酸配列をもとにDNAオリゴマー
を合成し、PCRを行った。このPCRにプライマーとして用
いるDNAオリゴマーの設計、およびその作製は、以下の
通りである。ウシPLA₂-Iレセプタータンパク質のPLA₂-I
結合部位付近（配列表の配列番号７のアミノ酸配列の５
０５位〜１０６８位付近）のコドンの縮重の少ないアミ
ノ酸配列を選び、哺乳動物で優先的に使用されるコドン
を主に用いて、オリゴマー(V)（配列表の配列番号
２）、オリゴマー(VI)（配列表の配列番号３）、オリゴ
マー(VII)（配列表の配列番号４）、およびオリゴマー
(VIII)（配列表の配列番号５）の混合DNAオリゴマーを
合成した。これらのうち、オリゴマー(VII)および(VII
I)は、タンパク質をコードしている遺伝子の相補鎖の塩
基配列に基づくものである。これらのDNAオリゴマーは
短鎖であるため、核酸合成機(Pharmacia LKB Gene Asse
mbler Plus, DNA Synthesizer)を用いて化学合成した。
さらに、以下で明らかになったヒトPLA2-IレセプターcD
NA断片の相補鎖の塩基配列をもとに、DNAオリゴマー(I
X)（配列表の配列番号６）を合成した。

【００６３】Ｂ．PCRによるヒト低分子型PLA₂-Iレセプ
ターcDNAの増幅と単離 ウシの場合と同様に、ヒト胎盤にはPLA₂-Iレセプターが
多く存在すると考えられる。そこで、ヒト胎盤より、グ
アニジウムチオシアネート法(Chomczynski, P.ら, Ana
l. Biochem., 162, 156-159 (1987))によってRNAを抽出
し、このRNAからオリゴdTプライマーを用いてcDNAを調
製してPCRの鋳型とした。

【００６４】上記Ａ項で得られた合成プライマーである
オリゴマー(V)および(VIII)を用いて、上記cDNA試料を
鋳型としてPCRを行った。PCRには、酵素として米国Perk
in Elmer Cetus社のAmpliTaq DNA polymeraseを用い、
反応液の組成は当酵素の使用説明書に従った。増幅装置
はPerkin Elmer Cetus社のThermal cyclerを使用し、94
℃ 0.5分、45℃ 1分、72℃ 2分を30サイクルで、増幅を
行った。PCR反応液10μlをクロロフォルム抽出、エタノ
ール沈殿した後、アガロースゲル電気泳動にかけ、増幅
産物をその分子量にしたがって分離した。PLA₂-Iレセプ
ターcDNAが増幅されると予想される１６８０塩基対に相
当する付近のゲル断片を切り出して、ゲル断片中に含ま
れるDNAを回収した。次に、回収したDNAを鋳型とした２
回目のPCRを、オリゴマー(VI)と(VII)を用いて行った(9
4℃ 0.5分、45℃ 1分、72℃ 1分を30サイクル)。このPC
Rの産物も上記と同様にクロロフォルム抽出、エタノー
ル沈殿の後アガロースゲル電気泳動によって分離し、８
７０塩基対に相当するDNAをゲルから回収した。得られ
た２本鎖のDNAを、クローニングベクターpBLUE SCRIPT
(KS-)(米国STRATAGENE社)を制限酵素EcoRVで直鎖状にし
ジデオキシチミジンを付加したもの(Holton, T.A.ら, N
ucleic Acids Res., 19, 1156 (1991))とライゲーショ
ンすることによって、このクローニングベクター内に挿
入した。ライゲーション液をフェノール抽出、エタノー
ル沈殿した後、この精製ライゲーション液を用いて大腸
菌C600株（米国CLONETECH社製）を形質転換した。形質
転換した大腸菌をアンピシリン50μg/mlを含むＬＢ寒天
培地で選択した。得られた形質転換体から、その大腸菌
が保持するプラスミドDNAを調製し、プラスミドDNAのEc
oRV部位に挿入されているPCR産物の塩基配列を、ジデオ
キシ法（Sanger, F., Science, 214, 1205-1210 (198
1)）によって決定した。上記オリゴマー(VI)と(VII)と
で挟まれた部分の塩基配列は、配列表の配列番号１の１
３５位のLeuから４１１位のValのアミノ酸配列をコード
することが明らかになり、これはウシPLA₂-Iレセプター
の配列表の配列番号７の６４６位のLeuから９２３位のV
alに相当するものであった。

【００６５】さらに上流のcDNA断片を得るために、上記
の１回目のPCR産物を鋳型として、上記Ａ項で得られた
(V)および(IX)の合成プライマーを用いてPCRを行った(9
4℃0.5分、50℃ 1分、72℃ 1分を30サイクル)。このPCR
の産物も上記と同様にクロロフォルム抽出、エタノール
沈殿の後アガロースゲル電気泳動によって分離し、約６
００塩基対に相当するDNAをゲルから回収した。得られ
た２本鎖のDNAを、クローニングベクターであるpBLUE S
CRIPT(KS-)(米国STRATAGENE社)内に挿入し、上記と同様
にジデオキシ法によって塩基配列を決定した。上記オリ
ゴマー(V)と(IX)とで挟まれた部分の塩基配列は、配列
表の配列番号１の１位のValから１８６位のPheのアミノ
酸をコードすることが明らかになり、これはウシPLA₂-I
レセプターの配列表の配列番号７の５１２位のValから
６９７位のPheに相当するものであった。上記で得られ
たアミノ酸配列の情報と重ね合わせることにより、配列
表の配列番号１に示すヒト低分子型PLA₂-Iレセプターの
アミノ酸配列が明らかになり、これはウシPLA₂-Iレセプ
ターのPLA₂-I結合部位に相当する領域であった。

【００６６】

【発明の効果】本発明によれば、このように、ヒトＩ型
ホスホリパーゼＡ₂レセプター；ヒトＩ型ホスホリパー
ゼＡ₂レセプター遺伝子；該遺伝子を含む発現ベクタ
ー；該発現ベクターを有する形質転換体；および該形質
転換体を用いたヒトＩ型ホスホリパーゼＡ₂レセプター
の製造方法が提供される。

【００６７】PLA₂-Iは、PLA₂-Iレセプターを介して、細
胞増殖作用（Aritaら, J. Biol. Chem., 266, 19139-19
141 (1991)）や肺実質組織の収縮作用（Kanemasaら, FE
BS LETTERS, 303, 217-220 (1992)）を示すことが報告
されている。従って、PLA₂-Iレセプターのアゴニストお
よびアンタゴニストは、細胞増殖剤あるいは血管弛緩剤
などとして有用である。すなわち、ヒトPLA₂-Iレセプタ
ーは、細胞増殖剤あるいは血管弛緩剤などとして期待さ
れる、PLA₂-Iレセプターのアゴニストあるいはアンタゴ
ニストのスクリーニングに有用である。また、低分子型
のPLA₂-Iレセプターであるため、野生型のレセプターよ
りも精製が容易であり、可溶性に保つための界面活性剤
を必要としない。従って、実験操作の簡便化が可能であ
り、PLA₂-Iレセプターのアゴニストあるいはアンタゴニ
ストのスクリーニングに極めて有用である。さらに、ヒ
ト低分子型PLA₂-Iレセプターは、PLA₂-Iと結合した後、
細胞内への情報伝達を行わないので、PLA₂-I阻害剤など
としても有用であり、特にヒトに対して特異性の高い阻
害剤として有用である。さらに、ヒト低分子型PLA₂-Iレ
セプターは、PLA₂-Iの結合に不必要な領域がないため、
アゴニストあるいはアンタゴニストの検索を含めたレセ
プター−リガンド間の相互作用解析を行うのにも有用で
ある。

【００６８】

【配列表】

【００６９】

【配列番号：１】 配列の長さ：１２３３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1233 特徴を決定した方法：S 配列 GTC CTT CGA AGC TTT GAC CAA GCT TCC AGC GGT TAT TAC TGT CCT CCT 48 Val Leu Arg Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ser Gly Tyr Tyr Cys Pro Pro 1 5 10 15 GCA CTT GTA ACC ATT ACA AAC AGG TTT GAA CAG GCT TTT ATT ACC AGT 96 Ala Leu Val Thr Ile Thr Asn Arg Phe Glu Gln Ala Phe Ile Thr Ser 20 25 30 TTG ATC AGT AGT GTG GTA AAA ATG AAG GAC AGT TAT TTT TGG ATA GCT 144 Leu Ile Ser Ser Val Val Lys Met Lys Asp Ser Tyr Phe Trp Ile Ala 35 40 45 CTT CAG GAC CAA AAT GAT ACG GGA GAA TAC ACT TGG AAG CCA GTA GGG 192 Leu Gln Asp Gln Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Thr Trp Lys Pro Val Gly 50 55 60 CAG AAA CCC GAG CCG GTG CAG TAC ACA CAC TGG AAC ACA CAC CAG CCG 240 Gln Lys Pro Glu Pro Val Gln Tyr Thr His Trp Asn Thr His Gln Pro 65 70 75 80 CGC TAC AGT GGT GGC TGT GTT GCC ATG CGA GGA AGG CAT CCA CTT GGT 288 Arg Tyr Ser Gly Gly Cys Val Ala Met Arg Gly Arg His Pro Leu Gly 85 90 95 CGC TGG GAA GTG AAG CAC TGT CGG CAC TTT AAG GCA ATG TCC TTG TGC 336 Arg Trp Glu Val Lys His Cys Arg His Phe Lys Ala Met Ser Leu Cys 100 105 110 AAG CAG CCA GTT GAA AAT CAG GAA AAA GCA GAG TAT GAA GAG AGA TGG 384 Lys Gln Pro Val Glu Asn Gln Glu Lys Ala Glu Tyr Glu Glu Arg Trp 115 120 125 CCC TTT CAC CCC TGC TAT TTG GAC TGG GAG TCA GAG CCT GGT CTG GCC 432 Pro Phe His Pro Cys Tyr Leu Asp Trp Glu Ser Glu Pro Gly Leu Ala 130 135 140 AGT TGC TTC AAG GTA TTT CAT AGT GAA AAA GTT CTG ATG AAA AGA ACA 480 Ser Cys Phe Lys Val Phe His Ser Glu Lys Val Leu Met Lys Arg Thr 145 150 155 160 TGG AGA GAA GCT GAA GCA TTT TGC GAA GAA TTT GGA GCT CAT CTT GCA 528 Trp Arg Glu Ala Glu Ala Phe Cys Glu Glu Phe Gly Ala His Leu Ala 165 170 175 AGC TTT GCC CAT ATT GAG GAA GAG AAT TTT GTG AAT GAG CTC TTA CAT 576 Ser Phe Ala His Ile Glu Glu Glu Asn Phe Val Asn Glu Leu Leu His 180 185 190 TCA AAA TTT AAT TGG ACA GAA GAA AGG CAG TTC TGG ATT GGA TTT AAT 624 Ser Lys Phe Asn Trp Thr Glu Glu Arg Gln Phe Trp Ile Gly Phe Asn 195 200 205 AAA AGA AAC CCA CTG AAT GCC GGC TCA TGG GAG TGG TCT GAT AGA ACT 672 Lys Arg Asn Pro Leu Asn Ala Gly Ser Trp Glu Trp Ser Asp Arg Thr 210 215 220 CCT GTT GTC TCT TCG TTT TTA GAC AAC ACT TAT TTT GGA GAA GAT GCA 720 Pro Val Val Ser Ser Phe Leu Asp Asn Thr Tyr Phe Gly Glu Asp Ala 225 230 235 240 AGA AAC TGT GCT GTT TAT AAG GCA AAC AAA ACA TTG CTG CCC TTA CAC 768 Arg Asn Cys Ala Val Tyr Lys Ala Asn Lys Thr Leu Leu Pro Leu His 245 250 255 TGT GGT TCC AAA CGT GAA TGG ATA TGC AAA ATC CCA AGA GAT GTG AAA 816 Cys Gly Ser Lys Arg Glu Trp Ile Cys Lys Ile Pro Arg Asp Val Lys 260 265 270 CCC AAG ATT CCG TTC TGG TAC CAG TAC GAT GTA CCC TGG CTC TTT TAT 864 Pro Lys Ile Pro Phe Trp Tyr Gln Tyr Asp Val Pro Trp Leu Phe Tyr 275 280 285 CAG GAT GCA GAA TAC CTT TTT CAT ACC TTT GCC TCA GAA TGG TTG AAC 912 Gln Asp Ala Glu Tyr Leu Phe His Thr Phe Ala Ser Glu Trp Leu Asn 290 295 300 TTT GAG TTT GTC TGT AGC TGG CTG CAC AGT GAT CTT CTC ACA ATT CAT 960 Phe Glu Phe Val Cys Ser Trp Leu His Ser Asp Leu Leu Thr Ile His 305 310 315 320 TCT GCA CAT GAG CAA GAA TTC ATC CAC AGC AAA ATA AAA GCG CTA TCA 1008 Ser Ala His Glu Gln Glu Phe Ile His Ser Lys Ile Lys Ala Leu Ser 325 330 335 AAG TAT GGT GCA AGT TGG TGG ATT GGA CTT CAA GAA GAA AGA GCC AAT 1056 Lys Tyr Gly Ala Ser Trp Trp Ile Gly Leu Gln Glu Glu Arg Ala Asn 340 345 350 GAT GAA TTT CGC TGG AGA GAT GGA ACA CCA GTG ATA TAC CAG AAC TGG 1104 Asp Glu Phe Arg Trp Arg Asp Gly Thr Pro Val Ile Tyr Gln Asn Trp 355 360 365 GAC ACA GGA AGA GAA AGA ACT GTG AAT AAT CAG AGC CAG AGA TGT GGC 1152 Asp Thr Gly Arg Glu Arg Thr Val Asn Asn Gln Ser Gln Arg Cys Gly 370 375 380 TTT ATT TCT TCT ATA ACA GGA CTC TGG GGT AGT GAA GAG TGT TCA GTT 1200 Phe Ile Ser Ser Ile Thr Gly Leu Trp Gly Ser Glu Glu Cys Ser Val 385 390 395 400 TCT ATG CCT AGT ATC TGT AAG CGA AAA AAG GTT 1233 Ser Met Pro Ser Ile Cys Lys Arg Lys Lys Val 405 410

【００７０】

【配列番号：２】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 TTYTGTTACA ARATYGAYAC 20

【００７１】

【配列番号：３】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 TGGCCSTTYC AYCCCYGYTA 20

【００７２】

【配列番号：４】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 TTCTYYTTYT CKATGACCCA 20

【００７３】

【配列番号：５】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 CARTCRTCRA AATACCAYTT 20

【００７４】

【配列番号：６】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 GAATGTAAGA GCTCATTCAC 20

【００７５】

【配列番号：７】 配列の長さ：４９７８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ウシ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２８０．．４６６８ 特徴を決定した方法：S 配列 CCACCCCCTG TTCCTCCTCC TGCTCCAAGC CGCAAAGGGA GAACCTCCGC GACTTTTCCG 60 TCTTCCAGCC AGAGAGCCCC CCCACCGTGG CCACAGGGGT GACTGACGAA GTGGGTCTCG 120 GGGACGCAGG GGTGGCGAGG CCCCCGGGGA GGGTTGGAGC GCGGAGGAGG CTGCGGTCCT 180 GCCCTCCGCC ACCCCACCCA CCGCAGGGCT GGGCGCTGGG CTTCGGCCCT GGCCCCCCGC 240 GGGCGCTACA CCGGGGACCG GCGGGCCAAG TGGTTAGCG ATG CCG CTG CTG TCG 294 Met Pro Leu Leu Ser -20 CTG TCG CTG CTC CTG CTG CTG CTG CAG GTA CCG GCG GGC TCC GCC GAG 342 Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Val Pro Ala Gly Ser Ala Glu -15 -10 -5 1 ACC GCG GCG TGG GCA GTC ACC CCC GAG CGG CTC CGC GAG TGG CAA GAT 390 Thr Ala Ala Trp Ala Val Thr Pro Glu Arg Leu Arg Glu Trp Gln Asp 5 10 15 AAA GGA ATC TTC ATT ATC CAA AGT GAG AAC CTC GAG AAA TGT ATT CAA 438 Lys Gly Ile Phe Ile Ile Gln Ser Glu Asn Leu Glu Lys Cys Ile Gln 20 25 30 GCC AGC AAA TCT ACA CTG ACC CTG GAG AAC TGC AAA CCA CCC AAC AAG 486 Ala Ser Lys Ser Thr Leu Thr Leu Glu Asn Cys Lys Pro Pro Asn Lys 35 40 45 TAC ATG CTG TGG AAG TGG GTT TCA AAC CAC CGC TTA TTT AAC ATC GGA 534 Tyr Met Leu Trp Lys Trp Val Ser Asn His Arg Leu Phe Asn Ile Gly 50 55 60 65 GGC AGT GGC TGC CTG GGC CTG AAC GTG TCT AGT CCA GAG CAG CCA CTG 582 Gly Ser Gly Cys Leu Gly Leu Asn Val Ser Ser Pro Glu Gln Pro Leu 70 75 80 AGC ATA TAC GAG TGT GAT TCC ACC CAC GTT TCC TTG AAG TGG CAC TGT 630 Ser Ile Tyr Glu Cys Asp Ser Thr His Val Ser Leu Lys Trp His Cys 85 90 95 AAC AAG AAG ACG ATC ACA GGC CCA CTC CAG TAC CTG GTC CAG GTG AAG 678 Asn Lys Lys Thr Ile Thr Gly Pro Leu Gln Tyr Leu Val Gln Val Lys 100 105 110 CAG GAC AAC ACG CTT GTG GCC TCA AGG AAA TAT CTC CAT AAG TGG GTT 726 Gln Asp Asn Thr Leu Val Ala Ser Arg Lys Tyr Leu His Lys Trp Val 115 120 125 TCC TAT ATG TCC GGC GGT GGA GGC ATT TGT GAC TAT CTG CAC AAA GAT 774 Ser Tyr Met Ser Gly Gly Gly Gly Ile Cys Asp Tyr Leu His Lys Asp 130 135 140 145 TTG TAC ACA ATC AAA GGG AAT GCC CAT GGG ACT CCG TGC ATG TTC CCC 822 Leu Tyr Thr Ile Lys Gly Asn Ala His Gly Thr Pro Cys Met Phe Pro 150 155 160 TTC CAG TAC AAT CAG CAG TGG CAC CAC GAA TGT ACC CGG GAA GGA CGG 870 Phe Gln Tyr Asn Gln Gln Trp His His Glu Cys Thr Arg Glu Gly Arg 165 170 175 GAA GAC AAC TTG CTG TGG TGT GCC ACT ACC AGC CGA TAC GAA AGA GAC 918 Glu Asp Asn Leu Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Arg Tyr Glu Arg Asp 180 185 190 GAG AAG TGG GGA TTT TGC CCA GAT CCT ACA TCC ACA GAG GTG GGC TGC 966 Glu Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Pro Thr Ser Thr Glu Val Gly Cys 195 200 205 GAT GCA GTC TGG GAG AAG GAT CTC CAT TCA CGC ATT TGC TAC CAA TTC 1014 Asp Ala Val Trp Glu Lys Asp Leu His Ser Arg Ile Cys Tyr Gln Phe 210 215 220 225 AAT CTG CTT TCC TCC CTG TCC TGG AGT GAG GCT CAT TCT TCA TGC CAG 1062 Asn Leu Leu Ser Ser Leu Ser Trp Ser Glu Ala His Ser Ser Cys Gln 230 235 240 ATG CAA GGA GCT GCT TTA TTA AGT ATT GCA GAT GAG ACT GAA GAA AAT 1110 Met Gln Gly Ala Ala Leu Leu Ser Ile Ala Asp Glu Thr Glu Glu Asn 245 250 255 TTC GTA AGG AAG CAC TTG GGC AGT GAA GCA GTG GAA GTA TGG ATG GGT 1158 Phe Val Arg Lys His Leu Gly Ser Glu Ala Val Glu Val Trp Met Gly 260 265 270 CTG AAT CAG CTG GAT GAA GAT GCT GGT TGG CAG TGG TCT GAT AGA ACA 1206 Leu Asn Gln Leu Asp Glu Asp Ala Gly Trp Gln Trp Ser Asp Arg Thr 275 280 285 CCA CTC AAC TAT CTG AAC TGG AAG CCA GAA ATA AAT TTT GAG CCA TTT 1254 Pro Leu Asn Tyr Leu Asn Trp Lys Pro Glu Ile Asn Phe Glu Pro Phe 290 295 300 305 GTT GAA TAT CAC TGT GGA ACA TTT AAT GCA TTT ATG CCA AAG GCC TGG 1302 Val Glu Tyr His Cys Gly Thr Phe Asn Ala Phe Met Pro Lys Ala Trp 310 315 320 AAA AGT CGG GAT TGT GAG TCT ACC TTG CCC TAC GTG TGT AAA AAA TAT 1350 Lys Ser Arg Asp Cys Glu Ser Thr Leu Pro Tyr Val Cys Lys Lys Tyr 325 330 335 CTA AAT CCC ACT GAT CAT GGA GTA GTT GAA AAG GAT GCT TGG AAA TAC 1398 Leu Asn Pro Thr Asp His Gly Val Val Glu Lys Asp Ala Trp Lys Tyr 340 345 350 TAT GCT ACC CAC TGT GAG CCT GGC TGG AAT CCC CAC AAC CGT AAT TGC 1446 Tyr Ala Thr His Cys Glu Pro Gly Trp Asn Pro His Asn Arg Asn Cys 355 360 365 TAT AAA CTG CAG AAA GAA AAA AAG ACC TGG AAT GAG GCT TTG CAG TCT 1494 Tyr Lys Leu Gln Lys Glu Lys Lys Thr Trp Asn Glu Ala Leu Gln Ser 370 375 380 385 TGC CAG TCC AAC AAC AGT GTA TTA ACA GAC ATC ACT TCG TTA GCA GAG 1542 Cys Gln Ser Asn Asn Ser Val Leu Thr Asp Ile Thr Ser Leu Ala Glu 390 395 400 GTG GAG TTT CTT GTA ACC CTC CTT GGA GAT GAA AAT GCA TCA GAA ACA 1590 Val Glu Phe Leu Val Thr Leu Leu Gly Asp Glu Asn Ala Ser Glu Thr 405 410 415 TGG ATT GGT TTG AGC AGC CAT AAA ATT CCA GTT TCC TTT GAG TGG TCT 1638 Trp Ile Gly Leu Ser Ser His Lys Ile Pro Val Ser Phe Glu Trp Ser 420 425 430 AAT GGC TCC TCG GTC ACC TTT ACT AAC TGG CAC ACA CTT GAG CCC CAC 1686 Asn Gly Ser Ser Val Thr Phe Thr Asn Trp His Thr Leu Glu Pro His 435 440 445 ATT TTT CCA AAT AGA AGC CAG TTG TGT GTC TCA GCA GAG CAA TCT GAG 1734 Ile Phe Pro Asn Arg Ser Gln Leu Cys Val Ser Ala Glu Gln Ser Glu 450 455 460 465 GGA CAC TGG AAA GTT AAA AAT TGC GAA GAA ACA CTT TTT TAC CTT TGT 1782 Gly His Trp Lys Val Lys Asn Cys Glu Glu Thr Leu Phe Tyr Leu Cys 470 475 480 AAG AAA ACA GGC CTT GTC CTT TCT GAC ACT GAA TCA GGC TGT CAA AAG 1830 Lys Lys Thr Gly Leu Val Leu Ser Asp Thr Glu Ser Gly Cys Gln Lys 485 490 495 GGA TGG GAG AGA CAT GGT AAA TTC TGT TAC AAA ATT GAC ACC GTC CTT 1878 Gly Trp Glu Arg His Gly Lys Phe Cys Tyr Lys Ile Asp Thr Val Leu 500 505 510 CGA AGC TTT GAC CAT GCC TCC AGT GGT TAC TAC TGT CCT CCT GCG CTT 1926 Arg Ser Phe Asp His Ala Ser Ser Gly Tyr Tyr Cys Pro Pro Ala Leu 515 520 525 ATA ACC ATT ACA AGC AGG TTT GAA CAG GCT TTT ATT ACC AGT TTG ATC 1974 Ile Thr Ile Thr Ser Arg Phe Glu Gln Ala Phe Ile Thr Ser Leu Ile 530 535 540 545 AGT AGT GTG GTA AAA ACG AAG GAC ACT TAT TTT TGG ATC GCT CTT CAA 2022 Ser Ser Val Val Lys Thr Lys Asp Thr Tyr Phe Trp Ile Ala Leu Gln 550 555 560 GAT CAA AAT AAT ACA GGA GAA TAC ACT TGG AAG ACG GCA GGG CAG CAG 2070 Asp Gln Asn Asn Thr Gly Glu Tyr Thr Trp Lys Thr Ala Gly Gln Gln 565 570 575 TTG GAG CCA GTG AAG TAC ACA CAC TGG AAC ACA CGT CAG CCC CGC TAC 2118 Leu Glu Pro Val Lys Tyr Thr His Trp Asn Thr Arg Gln Pro Arg Tyr 580 585 590 AGT GGT GGC TGC GTT GTC ATG CGA GGG AGG AGT CAC CCT GGC CGC TGG 2166 Ser Gly Gly Cys Val Val Met Arg Gly Arg Ser His Pro Gly Arg Trp 595 600 605 GAA GTG AGG GAC TGT AGG CAC TTT AAG GCG ATG TCC CTG TGC AAG CAA 2214 Glu Val Arg Asp Cys Arg His Phe Lys Ala Met Ser Leu Cys Lys Gln 610 615 620 625 CCA GTG GAA AAT CGG GAG AAA ACC AAG CAA GAA GAG GGA TGG CCC TTT 2262 Pro Val Glu Asn Arg Glu Lys Thr Lys Gln Glu Glu Gly Trp Pro Phe 630 635 640 CAC CCC TGC TAT TTG GAT TGG GAG TCA GAG CCT GGC CTG GCC AGT TGC 2310 His Pro Cys Tyr Leu Asp Trp Glu Ser Glu Pro Gly Leu Ala Ser Cys 645 650 655 TTC AAG GTA TTT CAT AGT GAA AAA GTC CTG ATG AAA AGA ACA TGG AGA 2358 Phe Lys Val Phe His Ser Glu Lys Val Leu Met Lys Arg Thr Trp Arg 660 665 670 CAA GCT GAA GAA TTT TGT GAA GAA TTT GGA GCT CAT CTT GCA AGC TTT 2406 Gln Ala Glu Glu Phe Cys Glu Glu Phe Gly Ala His Leu Ala Ser Phe 675 680 685 GCC CAT ATT GAG GAA GAG AAT TTT GTG AAT GAG CTT TTA CAT TCA AAA 2454 Ala His Ile Glu Glu Glu Asn Phe Val Asn Glu Leu Leu His Ser Lys 690 695 700 705 TTT AAT CGG ACA GAA GAA AGG CAG TTC TGG ATT GGA TTT AAT AAA AGA 2502 Phe Asn Arg Thr Glu Glu Arg Gln Phe Trp Ile Gly Phe Asn Lys Arg 710 715 720 AAC CCA CTG AAT GCT GGT TCT TGG GAA TGG TCT GAT GGA ACT CCT GTT 2550 Asn Pro Leu Asn Ala Gly Ser Trp Glu Trp Ser Asp Gly Thr Pro Val 725 730 735 GTC TCT TCA TTT TTA GAC AAT TCT TAT TTT GGA GAA GAT GCA AGA AAT 2598 Val Ser Ser Phe Leu Asp Asn Ser Tyr Phe Gly Glu Asp Ala Arg Asn 740 745 750 TGT GCT GTT TAT AAG GCA AAT AAA ACG TTG CTA CCC TCA TAC TGT GGT 2646 Cys Ala Val Tyr Lys Ala Asn Lys Thr Leu Leu Pro Ser Tyr Cys Gly 755 760 765 TCC AAA CGT GAA TGG ATA TGC AAA ATT CCA AGA GAT GTG AGA CCC AAG 2694 Ser Lys Arg Glu Trp Ile Cys Lys Ile Pro Arg Asp Val Arg Pro Lys 770 775 780 785 GTT CCA CCC TGG TAT CAG TAT GAT GCA CCC TGG CTC TTT TAT CAG GAT 2742 Val Pro Pro Trp Tyr Gln Tyr Asp Ala Pro Trp Leu Phe Tyr Gln Asp 790 795 800 GCA GAG TAC CTT TTT CAT ATT TCT GCC TCA GAA TGG TCC TCC TTT GAG 2790 Ala Glu Tyr Leu Phe His Ile Ser Ala Ser Glu Trp Ser Ser Phe Glu 805 810 815 TTT GTC TGT GGC TGG CTG CGC AGT GAT ATT CTC ACT ATT CAT TCT GCA 2838 Phe Val Cys Gly Trp Leu Arg Ser Asp Ile Leu Thr Ile His Ser Ala 820 825 830 CAC GAA CAA GAA TTC ATC CAC AGC AAA ATA AGA GCG CTA TCA AAG TAT 2886 His Glu Gln Glu Phe Ile His Ser Lys Ile Arg Ala Leu Ser Lys Tyr 835 840 845 GGT GTA AAT TGG TGG ATT GGA CTT CGA GAA GAA AGA GCC AGT GAT GAA 2934 Gly Val Asn Trp Trp Ile Gly Leu Arg Glu Glu Arg Ala Ser Asp Glu 850 855 860 865 TTT CGT TGG AGA GAT GGA TCA CCA GTA ATA TAT CAG AAC TGG GAC AAA 2982 Phe Arg Trp Arg Asp Gly Ser Pro Val Ile Tyr Gln Asn Trp Asp Lys 870 875 880 GGA AAA GAA AGA TCT ATG GGC CTT AAT GAG AGC CAG AGG TGT GGC TTC 3030 Gly Lys Glu Arg Ser Met Gly Leu Asn Glu Ser Gln Arg Cys Gly Phe 885 890 895 ATT TCA TCC ATA ACA GGT CTC TGG GCG AGT GAA GAG TGT TCA ATT TCT 3078 Ile Ser Ser Ile Thr Gly Leu Trp Ala Ser Glu Glu Cys Ser Ile Ser 900 905 910 ATG CCT AGC ATC TGT AAG CGA AAA AAG GTT TGG GTC ATA GAA AAA AAG 3126 Met Pro Ser Ile Cys Lys Arg Lys Lys Val Trp Val Ile Glu Lys Lys 915 920 925 AAA GAT ATT CCA AAA CAA CAT GGA ACA TGT CCC AAA GGA TGG TTA TAT 3174 Lys Asp Ile Pro Lys Gln His Gly Thr Cys Pro Lys Gly Trp Leu Tyr 930 935 940 945 TTT GAC TAT AAG TGC CTT TTG CTG AAA ATC CCT GAA GGC CCA AGT GAC 3222 Phe Asp Tyr Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ile Pro Glu Gly Pro Ser Asp 950 955 960 TGG AAG AAC TGG ACA TCT GCT CAA GAT TTT TGT GTT GAA GAA GGG GGG 3270 Trp Lys Asn Trp Thr Ser Ala Gln Asp Phe Cys Val Glu Glu Gly Gly 965 970 975 ACA CTG GTT GCC ATT GAA AAT GAG GTG GAA CAA GCT TTC ATT ACC ATG 3318 Thr Leu Val Ala Ile Glu Asn Glu Val Glu Gln Ala Phe Ile Thr Met 980 985 990 AAT CTT TTT GGC CAT ACC ACT AAT GTG TGG ATA GGG TTA CAA GAT GAT 3366 Asn Leu Phe Gly His Thr Thr Asn Val Trp Ile Gly Leu Gln Asp Asp 995 1000 1005 GAT TAT GAA AAA TGG CTA AAT GGA AGG CCT GTG TCA TAT TCT AAT TGG 3414 Asp Tyr Glu Lys Trp Leu Asn Gly Arg Pro Val Ser Tyr Ser Asn Trp 1010 1015 1020 1025 TCT CCA TTT GAT ACA AAA AAT ATT CCA AAT CAC AAC ACC ACT GAA GTT 3462 Ser Pro Phe Asp Thr Lys Asn Ile Pro Asn His Asn Thr Thr Glu Val 1030 1035 1040 CAA AAA CGC ATT CCT CTC TGT GGC TTG CTG TCA AAT AAT CCT AAT TTT 3510 Gln Lys Arg Ile Pro Leu Cys Gly Leu Leu Ser Asn Asn Pro Asn Phe 1045 1050 1055 CAT TTC ACT GGA AAA TGG TAT TTT GAA GAC TGT AGA GAA GGT TAT GGG 3558 His Phe Thr Gly Lys Trp Tyr Phe Glu Asp Cys Arg Glu Gly Tyr Gly 1060 1065 1070 TTT GTT TGT GAA AAA ATG CAG GAT GCT TCT GGA CAC AGT ATA AAT ACA 3606 Phe Val Cys Glu Lys Met Gln Asp Ala Ser Gly His Ser Ile Asn Thr 1075 1080 1085 TCT GAT ATG TAT CCA ATC CCT AAT ACC TTA GAA TAT GGA AAC AGA ACT 3654 Ser Asp Met Tyr Pro Ile Pro Asn Thr Leu Glu Tyr Gly Asn Arg Thr 1090 1095 1100 1105 TAC AAA ATA ATT AAT GCA AAT ATG ACT TGG TAT ACA GCA CTA AAA ACC 3702 Tyr Lys Ile Ile Asn Ala Asn Met Thr Trp Tyr Thr Ala Leu Lys Thr 1110 1115 1120 TGC CTG ATG CAT GGA GCA GAA CTG GCC AGC ATT ACA GAC CAG TAC CAC 3750 Cys Leu Met His Gly Ala Glu Leu Ala Ser Ile Thr Asp Gln Tyr His 1125 1130 1135 CAG TCT TTC CTC ACT GTT ATC CTT AAC CGG GTG GGA TAT GCC CAC TGG 3798 Gln Ser Phe Leu Thr Val Ile Leu Asn Arg Val Gly Tyr Ala His Trp 1140 1145 1150 ATT GGA CTG TTC ACT GAA GAT AAT GGT CTT AGT TTT GAC TGG TCA GAT 3846 Ile Gly Leu Phe Thr Glu Asp Asn Gly Leu Ser Phe Asp Trp Ser Asp 1155 1160 1165 GGC ACC AAA TCC TCC TTC ACT TTT TGG AAA GAT GAT GAA TCA TCC TTC 3894 Gly Thr Lys Ser Ser Phe Thr Phe Trp Lys Asp Asp Glu Ser Ser Phe 1170 1175 1180 1185 CTT GGT GAC TGT GTT TTT GCT GAC ACC AGT GGA CGC TGG AGT AGC ACA 3942 Leu Gly Asp Cys Val Phe Ala Asp Thr Ser Gly Arg Trp Ser Ser Thr 1190 1195 1200 GCC TGC GAG TCG TAT CTG CAA GGA GCC ATT TGT CAA GTG CCC ACT GAA 3990 Ala Cys Glu Ser Tyr Leu Gln Gly Ala Ile Cys Gln Val Pro Thr Glu 1205 1210 1215 ACA AGA CTG TCT GGA CGC CTA GAG TTG TGC TCA GAA ACA TCA ATT CCC 4038 Thr Arg Leu Ser Gly Arg Leu Glu Leu Cys Ser Glu Thr Ser Ile Pro 1220 1225 1230 TGG ATA AAA TTC AAA AGT AAT TGC TAC AGT TTT TCT ACA GTC CTA GAG 4086 Trp Ile Lys Phe Lys Ser Asn Cys Tyr Ser Phe Ser Thr Val Leu Glu 1235 1240 1245 AGT ACA AGT TTT GAG GCT GCT CAT GAA TTT TGC AAA AAG AAA GGC TCT 4134 Ser Thr Ser Phe Glu Ala Ala His Glu Phe Cys Lys Lys Lys Gly Ser 1250 1255 1260 1265 AAT CTT TTA ACA ATC AAA GAT GAA GCT GAA AAC TCT TTT CTT CTA GAA 4182 Asn Leu Leu Thr Ile Lys Asp Glu Ala Glu Asn Ser Phe Leu Leu Glu 1270 1275 1280 GAG CTT TTA GCT TTC CGT TCT TCA GTC CAG ATG ATT TGG CTG AAT GCT 4230 Glu Leu Leu Ala Phe Arg Ser Ser Val Gln Met Ile Trp Leu Asn Ala 1285 1290 1295 CAG TTT GAT GGT GAC AAT GAA ACC ATA AAG TGG TTT GAT GGA ACT CCC 4278 Gln Phe Asp Gly Asp Asn Glu Thr Ile Lys Trp Phe Asp Gly Thr Pro 1300 1305 1310 ACA GAT CAA TCA AAC TGG GGT ATT CGG AAG CCA GAG GTG TAC CAC TTC 4326 Thr Asp Gln Ser Asn Trp Gly Ile Arg Lys Pro Glu Val Tyr His Phe 1315 1320 1325 AAA CCC CAT CTG TGT GTT GCC CTG AGG ATT CCT GAA GGA GTG TGG CAA 4374 Lys Pro His Leu Cys Val Ala Leu Arg Ile Pro Glu Gly Val Trp Gln 1330 1335 1340 1345 TTA TCC TCG TGT CAA GAC AAA AAG GGA TTT ATA TGT AAA ATG GAA GCA 4422 Leu Ser Ser Cys Gln Asp Lys Lys Gly Phe Ile Cys Lys Met Glu Ala 1350 1355 1360 GAT ATT CAC ACA GTA AAG AAG CAT CCA GGA AAA GGA CCA AGT CAC AGT 4470 Asp Ile His Thr Val Lys Lys His Pro Gly Lys Gly Pro Ser His Ser 1365 1370 1375 GTT ATA CCT CTT ACA GTA GCA CTG ACA CTG CTA GTA ATT CTG GCA ATT 4518 Val Ile Pro Leu Thr Val Ala Leu Thr Leu Leu Val Ile Leu Ala Ile 1380 1385 1390 TCC ACA CTT TCC TTC TGC ATG TAC AAG CAC AGT CAC ATT ATC TTC GGG 4566 Ser Thr Leu Ser Phe Cys Met Tyr Lys His Ser His Ile Ile Phe Gly 1395 1400 1405 AGA CTT GCT CAG TTT AGA AAT CCT TAC TAT CCT TCA GCC AAC TTT AGT 4614 Arg Leu Ala Gln Phe Arg Asn Pro Tyr Tyr Pro Ser Ala Asn Phe Ser 1410 1415 1420 1425 ACA GTA CAT TTA GAA GAA AAT ATT CTC ATT TCT GAT CTT GAG AAG AAT 4662 Thr Val His Leu Glu Glu Asn Ile Leu Ile Ser Asp Leu Glu Lys Asn 1430 1435 1440 GAC CAG TAATAACGAA GTGAGAGAAC ATCACGGCGG TGAGAATGAG 4708 Asp Gln CAAAGAAGAG TATTTTCCTT TACAGCCAGA TGCCACTATA ATGTCAATTG TGTTACCATC 4768 TTCGTTATTC TTAAAATGAT TACTGGTTTT GAATTGTAAC CAAATCAGAT AGGTGTTCAT 4828 TTATTTATTT CCTCAAACTG TGATCTATTC TTAAAAGGGG GAAAATTTAC AGTGCTTATT 4888 ATTCAGAAAA CAAGAACTAT TAAAAGCAAC TCCCAAATGA GACCCCTCAA AAAAAAAAAA 4948 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 4978

【００７６】

【配列番号：８】 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 GAGACCGCNG CNTGGGC 17

【００７７】

【配列番号：９】 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 ACCGCNGCNT GGGCNGT 17

【００７８】

【配列番号：１０】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 CTRTTYRYRT AGAAGTAGTT 20

【００７９】

【配列番号：１１】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 GTYCTRTTYR YRTAGAAGTA 20

【００８０】

【配列番号：１２】 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 ACCGGCGGGC CAAGTGGTT 19

【００８１】

【配列番号：１３】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 CCACTCGCGG AGCCGCTCGG 20

【００８２】

【配列番号：１４】 配列の長さ：２３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Thr Ala Ala Trp Ala Val Thr Pro Glu Arg Leu Arg Glu Trp Gln 1 5 10 15 Asp Lys Xaa Ile Phe Ile Lys 20

【００８３】

【配列番号：１５】 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 ACTGGCGGCC GCTCATTTTC CTGGATGCTT 30

【００８４】

【配列番号：１６】 配列の長さ：５０５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Pro Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Val Pro 1 5 10 15 Ala Gly Ser Ala Glu Thr Ala Ala Trp Ala Val Thr Pro Glu Arg Leu 20 25 30 Arg Glu Trp Gln Asp Lys Gly Ile Phe Ile Ile Gln Ser Glu Asn Leu 35 40 45 Asp Leu Val Leu Ser Asp Thr Glu Ser Gly Cys Gln Lys Gly Trp Glu 50 55 60 Arg His Gly Lys Phe Cys Tyr Lys Ile Asp Thr Val Leu Arg Ser Phe 65 70 75 80 Asp His Ala Ser Ser Gly Tyr Tyr Cys Pro Pro Ala Leu Ile Thr Ile 85 90 95 Thr Ser Arg Phe Glu Gln Ala Phe Ile Thr Ser Leu Ile Ser Ser Val 100 105 110 Val Lys Thr Lys Asp Thr Tyr Phe Trp Ile Ala Leu Gln Asp Gln Asn 115 120 125 Asn Thr Gly Glu Tyr Thr Trp Lys Thr Ala Gly Gln Gln Leu Glu Pro 130 135 140 Val Lys Tyr Thr His Trp Asn Thr Arg Gln Pro Arg Tyr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Cys Val Val Met Arg Gly Arg Ser His Pro Gly Arg Trp Glu Val Arg 165 170 175 Asp Cys Arg His Phe Lys Ala Met Ser Leu Cys Lys Gln Pro Val Glu 180 185 190 Asn Arg Glu Lys Thr Lys Gln Glu Glu Gly Trp Pro Phe His Pro Cys 195 200 205 Tyr Leu Asp Trp Glu Ser Glu Pro Gly Leu Ala Ser Cys Phe Lys Val 210 215 220 Phe His Ser Glu Lys Val Leu Met Lys Arg Thr Trp Arg Gln Ala Glu 225 230 235 240 Glu Phe Cys Glu Glu Phe Gly Ala His Leu Ala Ser Phe Ala His Ile 245 250 255 Glu Glu Glu Asn Phe Val Asn Glu Leu Leu His Ser Lys Phe Asn Arg 260 265 270 Thr Glu Glu Arg Gln Phe Trp Ile Gly Phe Asn Lys Arg Asn Pro Leu 275 280 285 Asn Ala Gly Ser Trp Glu Trp Ser Asp Gly Thr Pro Val Val Ser Ser 290 295 300 Phe Leu Asp Asn Ser Tyr Phe Gly Glu Asp Ala Arg Asn Cys Ala Val 305 310 315 320 Tyr Lys Ala Asn Lys Thr Leu Leu Pro Ser Tyr Cys Gly Ser Lys Arg 325 330 335 Glu Trp Ile Cys Lys Ile Pro Arg Asp Val Arg Pro Lys Val Pro Pro 340 345 350 Trp Tyr Gln Tyr Asp Ala Pro Trp Leu Phe Tyr Gln Asp Ala Glu Tyr 355 360 365 Leu Phe His Ile Ser Ala Ser Glu Trp Ser Ser Phe Glu Phe Val Cys 370 375 380 Gly Trp Leu Arg Ser Asp Ile Leu Thr Ile His Ser Ala His Glu Gln 385 390 395 400 Glu Phe Ile His Ser Lys Ile Arg Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Val Asn 405 410 415 Trp Trp Ile Gly Leu Arg Glu Glu Arg Ala Ser Asp Glu Phe Arg Trp 420 425 430 Arg Asp Gly Ser Pro Val Ile Tyr Gln Asn Trp Asp Lys Gly Lys Glu 435 440 445 Arg Ser Met Gly Leu Asn Glu Ser Gln Arg Cys Gly Phe Ile Ser Ser 450 455 460Ile Thr Gly Leu Trp Ala S
er Glu Glu Cys Ser Ile Ser Met Pro Ser 465 470 475 480 Ile Cys Lys Arg Lys Lys Val Trp Val Ile Glu Lys Lys Lys Asp Ile 485 490 495 Pro Lys Gln His Gly Thr Cys Pro Asn 500 505

【図面の簡単な説明】

【図１】ウシ黄体膜画分由来のPLA₂-IレセプターのＮ末
端アミノ酸配列およびプローブを作成するためのＰＣＲ
用のプライマーの配列を示す図である。

【図２】ウシPLA₂-Iレセプターの一部をそれぞれコード
する、各クローンの位置および制限酵素地図を示す図で
ある。

【図３】マンノースレセプターとのホモロジーから推定
されるウシPLA₂-Iレセプターのドメイン構造の模式図で
ある。

【図４】ウシPLA₂-Iレセプターをコードする遺伝子を有
する形質転換体とウシPLA₂-Iレセプターを有さない形質
転換体のPLA₂-Iに対する結合能を示す図である。

【図５】ウシ分泌型PLA₂-Iレセプター発現ベクターおよ
びウシ分泌型PLA₂-IレセプターcDNAを含まないコントロ
ールベクターでCOS細胞をトランスフェクトして３日後
の培地200μl中のPLA₂-I結合能を示す図である。

【図６】ウシ低分子型PLA₂-Iレセプター発現ベクターお
よびウシ分泌型PLA₂-IレセプターcDNAを含まないコント
ロールベクターでCOS細胞をトランスフェクトして３日
後の培地200μl中のPLA₂-I結合能を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/00 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１の１位のValから４
   １１位のValまでのアミノ酸配列を含むヒトＩ型ホスホ
   リパーゼＡ₂レセプター。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のヒトＩ型ホスホリパー
   ゼＡ₂レセプターをコードするＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１の１位のＧから１２
   ３３位のＴまででなる塩基配列を有する、請求項２に記
   載のＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 請求項２または３に記載のＤＮＡ配列を
   有する、発現ベクター。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の発現ベクターを宿主に
   導入して得られる形質転換体。
6. 【請求項６】 前記宿主が哺乳類動物細胞である、請求
   項５に記載の形質転換体。
7. 【請求項７】 請求項５に記載の形質転換体を培養する
   工程、および産生されたヒトＩ型ホスホリパーゼＡ₂レ
   セプターを培養培地から回収する工程を包含する、ヒト
   Ｉ型ホスホリパーゼＡ₂レセプターの製造方法。