JP3494693B2 - ウシｉ型ホスホリパーゼａ２レセプター - Google Patents
ウシｉ型ホスホリパーゼａ２レセプターInfo
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウシＩ型ホスホリパー
ゼＡ2レセプター；ウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプタ
ー構造遺伝子；該遺伝子によりコードされるウシＩ型ホ
スホリパーゼＡ2レセプター；該遺伝子を含む発現ベク
ター；該発現ベクターを有する形質転換体；および該形
質転換体を用いたウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプタ
ーの製造方法に関する。
ゼＡ2レセプター；ウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプタ
ー構造遺伝子；該遺伝子によりコードされるウシＩ型ホ
スホリパーゼＡ2レセプター；該遺伝子を含む発現ベク
ター；該発現ベクターを有する形質転換体；および該形
質転換体を用いたウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプタ
ーの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ホスホリパーゼＡ2（PLA2；EC 3.1.1.
4）は、3-sn-ホスホグリセリドの2-アシルエステル結合
を加水分解するリン脂質分解酵素であり、哺乳類の膵臓
やヘビの毒液などに存在することが知られている。これ
までに知られているホスホリパーゼＡ2には、高分子量
細胞質内在型と低分子量分泌型があり、このうち低分子
量分泌型ＰＬＡ2は、グループＩ型とグループII型とに
分けられる。グループＩ型PLA2（PLA2-I）は、哺乳類の
膵臓などに存在している。膵臓のPLA2は、膵液中に分泌
される消化酵素の１つであり、通常は前駆体として存在
し、トリプシンなどのタンパク分解酵素により加水分解
されて活性型となる。一方、グループII型PLA2は、血小
板などに多く存在し、おもに炎症反応に関与していると
考えられる。
4）は、3-sn-ホスホグリセリドの2-アシルエステル結合
を加水分解するリン脂質分解酵素であり、哺乳類の膵臓
やヘビの毒液などに存在することが知られている。これ
までに知られているホスホリパーゼＡ2には、高分子量
細胞質内在型と低分子量分泌型があり、このうち低分子
量分泌型ＰＬＡ2は、グループＩ型とグループII型とに
分けられる。グループＩ型PLA2（PLA2-I）は、哺乳類の
膵臓などに存在している。膵臓のPLA2は、膵液中に分泌
される消化酵素の１つであり、通常は前駆体として存在
し、トリプシンなどのタンパク分解酵素により加水分解
されて活性型となる。一方、グループII型PLA2は、血小
板などに多く存在し、おもに炎症反応に関与していると
考えられる。
【０００３】このPLA2-Iが、肺、胃、脾臓、および腎臓
にも存在することが、最近明らかとなり（Sakataら, Bi
ochim. Biophys. Acta, 1007, 124-126 (1989)、Seilha
merら, DNA, 5, 519-527 (1986)、Yasudaら, Biochim.
Biophys. Acta, 1046, 189-194 (1990)、Tojoら, J. Bi
ol. Chem., 263, 5724-5731 (1988)、HanasakiおよびAr
ita, J. Biol. Chem., 267, 6414-6420 (1992)）、PLA2
−Ｉが、消化酵素としての作用以外の作用も有している
可能性が示唆されている（Kanemasaら, Biochim. Bioph
ys. Acta, 1125, 210-214 (1992)）。
にも存在することが、最近明らかとなり（Sakataら, Bi
ochim. Biophys. Acta, 1007, 124-126 (1989)、Seilha
merら, DNA, 5, 519-527 (1986)、Yasudaら, Biochim.
Biophys. Acta, 1046, 189-194 (1990)、Tojoら, J. Bi
ol. Chem., 263, 5724-5731 (1988)、HanasakiおよびAr
ita, J. Biol. Chem., 267, 6414-6420 (1992)）、PLA2
−Ｉが、消化酵素としての作用以外の作用も有している
可能性が示唆されている（Kanemasaら, Biochim. Bioph
ys. Acta, 1125, 210-214 (1992)）。
【０００４】このPLA2-Iに結合するタンパク質（PLA2-I
レセプター）が、最近確認され、ウシ黄体の膜画分より
精製されたタンパク質が、分子量190,000の１つの糖タ
ンパク質からなることが判った（HanasakiおよびArita,
Biochim. Biophys. Acta, 1127, 233-241 (1992)）。
レセプター）が、最近確認され、ウシ黄体の膜画分より
精製されたタンパク質が、分子量190,000の１つの糖タ
ンパク質からなることが判った（HanasakiおよびArita,
Biochim. Biophys. Acta, 1127, 233-241 (1992)）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
課題を解決するものであり、その目的は、ウシＩ型ホス
ホリパーゼＡ2レセプター；ウシＩ型ホスホリパーゼＡ2
レセプター構造遺伝子；該遺伝子によりコードされるウ
シＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプター；該遺伝子を含む
発現ベクター；該発現ベクターを有する形質転換体；お
よび該形質転換体を用いたウシＩ型ホスホリパーゼＡ2
レセプターの製造方法を、提供することにある。
課題を解決するものであり、その目的は、ウシＩ型ホス
ホリパーゼＡ2レセプター；ウシＩ型ホスホリパーゼＡ2
レセプター構造遺伝子；該遺伝子によりコードされるウ
シＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプター；該遺伝子を含む
発現ベクター；該発現ベクターを有する形質転換体；お
よび該形質転換体を用いたウシＩ型ホスホリパーゼＡ2
レセプターの製造方法を、提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】発明者らは、ウシ黄体よ
り精製されたウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプタータ
ンパク質のアミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列を
もとに、該タンパク質をコードするＤＮＡ配列を決定し
ようと種々の検討を行った。その結果、ウシ胎盤由来の
ｃＤＮＡライブラリーおよびウシ腎臓細胞由来のｃＤＮ
ＡライブラリーにウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプタ
ータンパク質をコードするＤＮＡ配列を見いだした。さ
BR>らに、該タンパク質は細胞膜を貫通しており、その
アミノ末端側である細胞の外側の領域はホスホリパーゼ
Ａ2認識部位と考えられるため、ホスホリパーゼＡ2レセ
プターｃＤＮＡからカルボキシル末端側をコードする部
分を削ったｃＤＮＡを作成した。これを用いて分泌型ホ
スホリパーゼＡ2レセプターを発現した。さらに、ホス
ホリパーゼＡ2結合部位を特定し、結合部位のみをコー
ドするＤＮＡを作製した。これを用いて低分子型ホスホ
リパーゼＡ2レセプターを発現し、本発明を完成するに
至った。
り精製されたウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプタータ
ンパク質のアミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列を
もとに、該タンパク質をコードするＤＮＡ配列を決定し
ようと種々の検討を行った。その結果、ウシ胎盤由来の
ｃＤＮＡライブラリーおよびウシ腎臓細胞由来のｃＤＮ
ＡライブラリーにウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプタ
ータンパク質をコードするＤＮＡ配列を見いだした。さ
BR>らに、該タンパク質は細胞膜を貫通しており、その
アミノ末端側である細胞の外側の領域はホスホリパーゼ
Ａ2認識部位と考えられるため、ホスホリパーゼＡ2レセ
プターｃＤＮＡからカルボキシル末端側をコードする部
分を削ったｃＤＮＡを作成した。これを用いて分泌型ホ
スホリパーゼＡ2レセプターを発現した。さらに、ホス
ホリパーゼＡ2結合部位を特定し、結合部位のみをコー
ドするＤＮＡを作製した。これを用いて低分子型ホスホ
リパーゼＡ2レセプターを発現し、本発明を完成するに
至った。
【０００７】本発明のウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセ
プターは、配列表の配列番号１の４８６位のLeuから９
４０位のProまでのアミノ酸配列を含む。
プターは、配列表の配列番号１の４８６位のLeuから９
４０位のProまでのアミノ酸配列を含む。
【０００８】好ましい実施態様では、上記ウシＩ型ホス
ホリパーゼＡ2レセプターは、配列表の配列番号１の１
位のGluから１３７２位のLysまでのアミノ酸配列を含
む。
ホリパーゼＡ2レセプターは、配列表の配列番号１の１
位のGluから１３７２位のLysまでのアミノ酸配列を含
む。
【０００９】好ましい実施態様では、上記ウシＩ型ホス
ホリパーゼＡ2レセプターは、配列表の配列番号１の、
−２０位のMetから１３７２位のLysまでのアミノ酸配列
を、含む。
ホリパーゼＡ2レセプターは、配列表の配列番号１の、
−２０位のMetから１３７２位のLysまでのアミノ酸配列
を、含む。
【００１０】好ましい実施態様では、上記ウシＩ型ホス
ホリパーゼＡ2レセプターは、配列表の配列番号１の１
位のGluから１４４３位のGlnまでのアミノ酸配列を含
む。
ホリパーゼＡ2レセプターは、配列表の配列番号１の１
位のGluから１４４３位のGlnまでのアミノ酸配列を含
む。
【００１１】好ましい実施態様では、上記ウシＩ型ホス
ホリパーゼＡ2レセプターは、配列表の配列番号１の、
−２０位のMetから１４４３位のGlnまでのアミノ酸配列
を、含む。
ホリパーゼＡ2レセプターは、配列表の配列番号１の、
−２０位のMetから１４４３位のGlnまでのアミノ酸配列
を、含む。
【００１２】本発明のＤＮＡ配列は、上記のいずれかに
記載のウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプターをコード
する。
記載のウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプターをコード
する。
【００１３】好ましい実施態様では、上記ＤＮＡ配列
は、配列表の配列番号１の１７９４位のＣから３１５９
位のＣまででなる塩基配列を有する。
は、配列表の配列番号１の１７９４位のＣから３１５９
位のＣまででなる塩基配列を有する。
【００１４】好ましい実施態様では、上記ＤＮＡ配列
は、配列表の配列番号１の３４０位のＧから４４５５位
のＡまででなる塩基配列を有する。
は、配列表の配列番号１の３４０位のＧから４４５５位
のＡまででなる塩基配列を有する。
【００１５】好ましい実施態様では、上記ＤＮＡ配列
は、配列表の配列番号１の２８０位のＡから４４５５位
のＡまででなる塩基配列を有する。
は、配列表の配列番号１の２８０位のＡから４４５５位
のＡまででなる塩基配列を有する。
【００１６】好ましい実施態様では、上記ＤＮＡ配列
は、配列表の配列番号１の３４０位のＧから４６６８位
のＧまででなる塩基配列を有する。
は、配列表の配列番号１の３４０位のＧから４６６８位
のＧまででなる塩基配列を有する。
【００１７】好ましい実施態様では、上記ＤＮＡ配列
は、配列表の配列番号１の２８０位のＡから４６６８位
のＧまででなる塩基配列を有する。
は、配列表の配列番号１の２８０位のＡから４６６８位
のＧまででなる塩基配列を有する。
【００１８】本発明の発現ベクターは、上記のいずれか
に記載のＤＮＡ配列を有する。
に記載のＤＮＡ配列を有する。
【００１９】本発明の形質転換体は、上記発現ベクター
を宿主に導入して得られる。
を宿主に導入して得られる。
【００２０】好ましい実施態様では、上記宿主は、哺乳
類動物細胞である。
類動物細胞である。
【００２１】本発明のウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセ
プターの製造方法は、上記形質転換体を培養する工程、
および産生されたウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプタ
ーを培養培地から回収する工程を包含する。
プターの製造方法は、上記形質転換体を培養する工程、
および産生されたウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプタ
ーを培養培地から回収する工程を包含する。
【００２２】次に本発明を工程の順に説明する。
【００２３】（１）PLA2レセプタータンパク質をコード
するＤＮＡの配列決定 本発明のPLA2レセプタータンパク質をコードするＤＮＡ
を含むＤＮＡ断片の配列決定方法を以下に例示する。こ
のＤＮＡ断片の配列は、例えば、ウシ胎盤由来のｃＤＮ
Ａライブラリー等をプローブを用いてスクリーニング
し、スクリーニングによって得られたＤＮＡをＤＮＡシ
ークエンシングにより分析することにより、決定され得
る。
するＤＮＡの配列決定 本発明のPLA2レセプタータンパク質をコードするＤＮＡ
を含むＤＮＡ断片の配列決定方法を以下に例示する。こ
のＤＮＡ断片の配列は、例えば、ウシ胎盤由来のｃＤＮ
Ａライブラリー等をプローブを用いてスクリーニング
し、スクリーニングによって得られたＤＮＡをＤＮＡシ
ークエンシングにより分析することにより、決定され得
る。
【００２４】（Ａ）ＤＮＡプローブの作成
PLA2レセプタータンパク質をコードする遺伝子は、例え
ば、ウシ胎盤由来のｃＤＮＡライブラリー等から得るこ
とができる。そのためには、まず、ウシ胎盤ｃＤＮＡラ
イブラリーから、PLA2レセプタータンパク質をコードす
る遺伝子のクローニングを行うためのプローブが、例え
ば、次のようにして作成される。
ば、ウシ胎盤由来のｃＤＮＡライブラリー等から得るこ
とができる。そのためには、まず、ウシ胎盤ｃＤＮＡラ
イブラリーから、PLA2レセプタータンパク質をコードす
る遺伝子のクローニングを行うためのプローブが、例え
ば、次のようにして作成される。
【００２５】まず、PLA2レセプタータンパク質のアミノ
末端のペプチド配列の決定を行う。例えばウシ黄体膜画
分より、一連の分離操作によって、単一な成分にまでPL
A2レセプタータンパク質を精製する（Hanasaki, K., Bi
ochim. Biophys. Acta, 1127, 233-241 (1992)）。この
精製PLA2レセプタータンパク質を、例えば、AppliedBio
systems 477A Protein Sequencerを用いて分析する。こ
の結果、精製PLA2レセプタータンパク質のアミノ末端の
アミノ酸配列が、図１および配列表の配列番号８に示す
ように決定された。
末端のペプチド配列の決定を行う。例えばウシ黄体膜画
分より、一連の分離操作によって、単一な成分にまでPL
A2レセプタータンパク質を精製する（Hanasaki, K., Bi
ochim. Biophys. Acta, 1127, 233-241 (1992)）。この
精製PLA2レセプタータンパク質を、例えば、AppliedBio
systems 477A Protein Sequencerを用いて分析する。こ
の結果、精製PLA2レセプタータンパク質のアミノ末端の
アミノ酸配列が、図１および配列表の配列番号８に示す
ように決定された。
【００２６】このアミノ末端のアミノ酸配列をもとに、
直接的にあるいは間接的に、プローブを作成することが
できる。
直接的にあるいは間接的に、プローブを作成することが
できる。
【００２７】間接的にプローブを作成する場合、例え
ば、上記アミノ末端のアミノ酸配列をもとに、ポリメラ
ーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）用のＤＮＡプライ
マーを合成し、このプライマーを用いて、以下のように
して調製したＰＣＲ用の鋳型を増幅させて、スクリーニ
ング用のプローブとし得る。このＰＣＲ用の鋳型として
は、例えばPLA2レセプタータンパク質が多く存在してい
ることが考えられるウシ黄体から得られるＤＮＡを用い
ることができる。このようなＤＮＡは、例えば、ウシ黄
体から、グアニジウムチオシアナート法（Chomczynski,
P.ら, Anal. Biochem., 162, 156-159 (1987)）によっ
て、ＲＮＡを抽出し、このＲＮＡからｃＤＮＡを調製す
る方法により、得られる。ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製
は、まず、プライマーをＲＮＡにアニーリングさせ、逆
転写酵素により該プライマーからＤＮＡを合成していく
ことにより、行われ得る。この時、例えば、ｃＤＮＡ合
成およびプラスミドクローニングのためのSuperScript
プラスミドシステム（BRL社製）が用いられ得る。
ば、上記アミノ末端のアミノ酸配列をもとに、ポリメラ
ーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）用のＤＮＡプライ
マーを合成し、このプライマーを用いて、以下のように
して調製したＰＣＲ用の鋳型を増幅させて、スクリーニ
ング用のプローブとし得る。このＰＣＲ用の鋳型として
は、例えばPLA2レセプタータンパク質が多く存在してい
ることが考えられるウシ黄体から得られるＤＮＡを用い
ることができる。このようなＤＮＡは、例えば、ウシ黄
体から、グアニジウムチオシアナート法（Chomczynski,
P.ら, Anal. Biochem., 162, 156-159 (1987)）によっ
て、ＲＮＡを抽出し、このＲＮＡからｃＤＮＡを調製す
る方法により、得られる。ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製
は、まず、プライマーをＲＮＡにアニーリングさせ、逆
転写酵素により該プライマーからＤＮＡを合成していく
ことにより、行われ得る。この時、例えば、ｃＤＮＡ合
成およびプラスミドクローニングのためのSuperScript
プラスミドシステム（BRL社製）が用いられ得る。
【００２８】ＰＣＲ法は、例えばScience, 239, 487-49
1 (1988)に記載の方法に従い、ＰＣＲ自動化装置（Perk
in Elmer Cetus社製）を用いて行われ得る。
1 (1988)に記載の方法に従い、ＰＣＲ自動化装置（Perk
in Elmer Cetus社製）を用いて行われ得る。
【００２９】このようにして得られたプローブを標識し
て、以下のスクリーニングに用いることができる。
て、以下のスクリーニングに用いることができる。
【００３０】（Ｂ）ライブラリーのスクリーニング
ウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプターをコードするＤ
ＮＡをスクリーニングするためのライブラリーとして、
ウシ由来の様々なライブラリーが用いられ得る。このラ
イブラリーには、例えば、ウシ染色体ライブラリー、ウ
シ胎盤ｃＤＮＡライブラリー、およびウシ腎臓細胞ｃＤ
ＮＡライブラリーなどが含まれる。
ＮＡをスクリーニングするためのライブラリーとして、
ウシ由来の様々なライブラリーが用いられ得る。このラ
イブラリーには、例えば、ウシ染色体ライブラリー、ウ
シ胎盤ｃＤＮＡライブラリー、およびウシ腎臓細胞ｃＤ
ＮＡライブラリーなどが含まれる。
【００３１】ライブラリーのスクリーニングは、当業者
に公知の方法で、上記（Ａ）項で得られたプローブを用
いて行われ得る。このスクリーニング法には、例えば組
換えファージプラークのプラークハイブリダイゼーショ
ン法および組換え大腸菌のコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法が含まれる。
に公知の方法で、上記（Ａ）項で得られたプローブを用
いて行われ得る。このスクリーニング法には、例えば組
換えファージプラークのプラークハイブリダイゼーショ
ン法および組換え大腸菌のコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法が含まれる。
【００３２】（Ｃ）クローンの塩基配列の決定
ライブラリーをスクリーニングして得られたクローンの
挿入断片の塩基配列の決定は、例えば以下のように行わ
れる。まず、クローンの内部に存在する制限酵素部位を
用いて切断し、それぞれのＤＮＡ断片を各々適当なシー
クエンスベクター、例えば、M13mp18（宝酒造社製）お
よびM13mp19（宝酒造社製）にクローニングする。次に
クローニングした断片の塩基配列をジデオキシ法（Sang
er, F., Science, 214, 1205-1210 (1981)）により決定
する。これにより、塩基配列が決定される。配列表の配
列番号１に、クローンを解析して得られた、PLA2レセプ
タータンパク質遺伝子を有するＤＮＡの配列を示す。PL
A2レセプタータンパク質遺伝子のすべてを含む配列が示
されている。
挿入断片の塩基配列の決定は、例えば以下のように行わ
れる。まず、クローンの内部に存在する制限酵素部位を
用いて切断し、それぞれのＤＮＡ断片を各々適当なシー
クエンスベクター、例えば、M13mp18（宝酒造社製）お
よびM13mp19（宝酒造社製）にクローニングする。次に
クローニングした断片の塩基配列をジデオキシ法（Sang
er, F., Science, 214, 1205-1210 (1981)）により決定
する。これにより、塩基配列が決定される。配列表の配
列番号１に、クローンを解析して得られた、PLA2レセプ
タータンパク質遺伝子を有するＤＮＡの配列を示す。PL
A2レセプタータンパク質遺伝子のすべてを含む配列が示
されている。
【００３３】（２）組換え型PLA2レセプタータンパク質
の発現 本発明のPLA2レセプタータンパク質遺伝子は、適当なベ
クターに組み込まれて、PLA2レセプタータンパク質を発
現させるための発現ベクターとされる。
の発現 本発明のPLA2レセプタータンパク質遺伝子は、適当なベ
クターに組み込まれて、PLA2レセプタータンパク質を発
現させるための発現ベクターとされる。
【００３４】この発現ベクターを、例えば、細菌、酵
母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体
が作成される。この形質転換体を培養することにより本
発明のPLA2レセプタータンパク質が産生され得る。
母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体
が作成される。この形質転換体を培養することにより本
発明のPLA2レセプタータンパク質が産生され得る。
【００３５】例えばpSVL SV40後期プロモーターの下流
に本発明のPLA2レセプター遺伝子を含む発現ベクター
を、サル由来細胞COS7に導入することによって形質転換
体を作成し、この形質転換体を５％ＣＯ2存在下、３７
℃で数日間培養することにより、PLA2レセプタータンパ
ク質が産生され得る。
に本発明のPLA2レセプター遺伝子を含む発現ベクター
を、サル由来細胞COS7に導入することによって形質転換
体を作成し、この形質転換体を５％ＣＯ2存在下、３７
℃で数日間培養することにより、PLA2レセプタータンパ
ク質が産生され得る。
【００３６】上記で得られたPLA2レセプタータンパク質
産生培養物、あるいはコントロールとして作成したPLA2
レセプタータンパク質をコードする遺伝子を含まないコ
ントロール培養物を遠心分離し、沈澱画分の培養細胞を
回収する。この培養細胞を洗浄した後、125Ｉ放射性同
位元素で標識したPLA2を加えて、PLA2-PLA2レセプター
間の結合反応を行わせる。このようにして得られるPLA2
の特異的な結合量を測定すれば、細胞表面上に発現した
PLA2レセプタータンパク質の量がわかる（図４参照）。
産生培養物、あるいはコントロールとして作成したPLA2
レセプタータンパク質をコードする遺伝子を含まないコ
ントロール培養物を遠心分離し、沈澱画分の培養細胞を
回収する。この培養細胞を洗浄した後、125Ｉ放射性同
位元素で標識したPLA2を加えて、PLA2-PLA2レセプター
間の結合反応を行わせる。このようにして得られるPLA2
の特異的な結合量を測定すれば、細胞表面上に発現した
PLA2レセプタータンパク質の量がわかる（図４参照）。
【００３７】（３）分泌型PLA2レセプタータンパク質の
発現 本発明のPLA2レセプタータンパク質のうち、膜結合部位
である配列表の配列番号１の１３７３位のGlyからカル
ボキシル末端側の配列を含まないアミノ酸配列からなる
タンパク質は分泌型であり、これを分泌型PLA2レセプタ
ータンパク質という。分泌型PLA2レセプタータンパク質
は、本発明のPLA2レセプタータンパク質をコードする遺
伝子から、例えば、配列表の配列番号１のアミノ酸配列
の１３７３位からカルボキシル末端側をコードする部分
を削ったｃＤＮＡが、ミスマッチを含むＤＮＡオリゴマ
ーを用いて、作成され得る。
発現 本発明のPLA2レセプタータンパク質のうち、膜結合部位
である配列表の配列番号１の１３７３位のGlyからカル
ボキシル末端側の配列を含まないアミノ酸配列からなる
タンパク質は分泌型であり、これを分泌型PLA2レセプタ
ータンパク質という。分泌型PLA2レセプタータンパク質
は、本発明のPLA2レセプタータンパク質をコードする遺
伝子から、例えば、配列表の配列番号１のアミノ酸配列
の１３７３位からカルボキシル末端側をコードする部分
を削ったｃＤＮＡが、ミスマッチを含むＤＮＡオリゴマ
ーを用いて、作成され得る。
【００３８】このｃＤＮＡは、本発明のPLA2レセプター
タンパク質遺伝子と同様に、適当なベクターに組み込ま
れて、分泌型PLA2レセプタータンパク質を発現させるた
めの発現ベクターとされ得る。
タンパク質遺伝子と同様に、適当なベクターに組み込ま
れて、分泌型PLA2レセプタータンパク質を発現させるた
めの発現ベクターとされ得る。
【００３９】この発現ベクターを、例えば、細菌、酵
母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体
が作成される。例えば、発現ベクターをサル由来細胞CO
S7に導入することにより形質転換体を作成し、この形質
転換体を培養することによって、PLA2結合能を有しかつ
細胞膜から培地中に遊離される分泌型PLA2レセプタータ
ンパク質が産生され得る。また、例えば、発現ベクター
をCHO細胞の染色体に組み込むことによって、分泌型PLA
2レセプタータンパク質を恒常的に発現し得る。
母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体
が作成される。例えば、発現ベクターをサル由来細胞CO
S7に導入することにより形質転換体を作成し、この形質
転換体を培養することによって、PLA2結合能を有しかつ
細胞膜から培地中に遊離される分泌型PLA2レセプタータ
ンパク質が産生され得る。また、例えば、発現ベクター
をCHO細胞の染色体に組み込むことによって、分泌型PLA
2レセプタータンパク質を恒常的に発現し得る。
【００４０】（４）低分子型PLA2レセプタータンパク質
の発現 本発明のPLA2レセプタータンパク質のアミノ酸配列のう
ち、PLA2結合部位である配列表の配列番号１のアミノ酸
配列の４８６位のLeuから９４０位のProまでのアミノ酸
配列から主としてなるタンパク質を、低分子型PLA2レセ
プタータンパク質という。低分子型PLA2レセプタータン
パク質をコードする遺伝子は、本発明のPLA2レセプター
タンパク質をコードする遺伝子から、例えば、PLA2結合
部位である配列表の配列番号１のアミノ酸配列の４８６
位から９４０位をコードする部分を含むＤＮＡ断片を、
適当な制限酵素により切断することによって調製でき
る。このＤＮＡ断片は、本発明のPLA2レセプタータンパ
ク質および分泌型PLA2レセプタータンパク質の遺伝子と
同様に、適当なベクターに組み込まれて、低分子型PLA2
レセプタータンパク質を発現させるための発現ベクター
とされ得る。
の発現 本発明のPLA2レセプタータンパク質のアミノ酸配列のう
ち、PLA2結合部位である配列表の配列番号１のアミノ酸
配列の４８６位のLeuから９４０位のProまでのアミノ酸
配列から主としてなるタンパク質を、低分子型PLA2レセ
プタータンパク質という。低分子型PLA2レセプタータン
パク質をコードする遺伝子は、本発明のPLA2レセプター
タンパク質をコードする遺伝子から、例えば、PLA2結合
部位である配列表の配列番号１のアミノ酸配列の４８６
位から９４０位をコードする部分を含むＤＮＡ断片を、
適当な制限酵素により切断することによって調製でき
る。このＤＮＡ断片は、本発明のPLA2レセプタータンパ
ク質および分泌型PLA2レセプタータンパク質の遺伝子と
同様に、適当なベクターに組み込まれて、低分子型PLA2
レセプタータンパク質を発現させるための発現ベクター
とされ得る。
【００４１】この発現ベクターを、例えば、細菌、酵
母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体
が作成される。この形質転換体を培養することにより本
発明の低分子型PLA2レセプタータンパク質が産生され得
る。例えば、低分子型PLA2レセプタータンパク質の発現
ベクターを、サル由来細胞COS7に導入することにより形
質転換体を作成し、この形質転換体を培養することによ
って、PLA2結合能を有する低分子型PLA2レセプタータン
パク質が、培養上清中に産生され得る。また、例えば、
発現ベクターをCHO細胞の染色体に組み込むことによっ
て、低分子型PLA2レセプタータンパク質を恒常的に発現
し得る。
母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体
が作成される。この形質転換体を培養することにより本
発明の低分子型PLA2レセプタータンパク質が産生され得
る。例えば、低分子型PLA2レセプタータンパク質の発現
ベクターを、サル由来細胞COS7に導入することにより形
質転換体を作成し、この形質転換体を培養することによ
って、PLA2結合能を有する低分子型PLA2レセプタータン
パク質が、培養上清中に産生され得る。また、例えば、
発現ベクターをCHO細胞の染色体に組み込むことによっ
て、低分子型PLA2レセプタータンパク質を恒常的に発現
し得る。
【００４２】
【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに説明す
る。
る。
【００４３】本発明の各工程において用いた一般的な分
子生物学的実験手法（DNAのアガロースゲル電気泳動、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、電気泳動分離したDN
Aを透析膜を用いてゲル中から回収する方法、フェノー
ル抽出、クロロフォルム抽出、エタノール沈殿、ライゲ
ーション、大腸菌の形質転換、組換え大腸菌の培養、プ
ラスミドDNAの調製、ファージDNAの調製、DNAの制限酵
素による切断、DNAの放射標識等）は Molecular clonin
g (Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1982)
によった。同じく一般的な分子生物学的実験手法に用い
る試薬（制限酵素、DNA修飾試薬等）は、特に指示のな
いかぎり、宝酒造（株）より購入した。
子生物学的実験手法（DNAのアガロースゲル電気泳動、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、電気泳動分離したDN
Aを透析膜を用いてゲル中から回収する方法、フェノー
ル抽出、クロロフォルム抽出、エタノール沈殿、ライゲ
ーション、大腸菌の形質転換、組換え大腸菌の培養、プ
ラスミドDNAの調製、ファージDNAの調製、DNAの制限酵
素による切断、DNAの放射標識等）は Molecular clonin
g (Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1982)
によった。同じく一般的な分子生物学的実験手法に用い
る試薬（制限酵素、DNA修飾試薬等）は、特に指示のな
いかぎり、宝酒造（株）より購入した。
【００４４】（実施例１）
Ａ．PLA2レセプタータンパク質アミノ末端のペプチドの
アミノ酸配列の決定 遺伝子のクローニングを行うためには、目的の遺伝子を
検出、同定するために用いるDNA断片が必要となる。こ
のようなDNA断片を得るために、まず、精製PLA2レセプ
タータンパク質のアミノ末端のペプチドのアミノ酸配列
から、DNA塩基配列の決定のための情報を得ることを試
みた。
アミノ酸配列の決定 遺伝子のクローニングを行うためには、目的の遺伝子を
検出、同定するために用いるDNA断片が必要となる。こ
のようなDNA断片を得るために、まず、精製PLA2レセプ
タータンパク質のアミノ末端のペプチドのアミノ酸配列
から、DNA塩基配列の決定のための情報を得ることを試
みた。
【００４５】まず、ウシ黄体膜画分より、ジエチルアミ
ノエチル−セファセルクロマトグラフィー、PLA2-I-ア
フィニティーゲルクロマトグラフィー、ゲルフィルトレ
ーションHPLCの一連の分離操作によって単一な成分にま
で精製されたPLA2レセプタータンパク質(Hanasaki, K.
ら, Biochim. Biophys. Acta, 1127, 233-241 (1992))1
5μgを、セントリコン100（米国アミコン社製）によっ
て脱塩した後、10mM HCl, 20mMオクチルチオグルコシド
溶液に溶解し、Applied Biosystems 477A Protein Sequ
encerを用いて分析した。その結果、アミノ末端からの
配列として、図１および配列表の配列番号８に示すよう
に、２３個のアミノ酸のアミノ酸配列を決定することが
できた。
ノエチル−セファセルクロマトグラフィー、PLA2-I-ア
フィニティーゲルクロマトグラフィー、ゲルフィルトレ
ーションHPLCの一連の分離操作によって単一な成分にま
で精製されたPLA2レセプタータンパク質(Hanasaki, K.
ら, Biochim. Biophys. Acta, 1127, 233-241 (1992))1
5μgを、セントリコン100（米国アミコン社製）によっ
て脱塩した後、10mM HCl, 20mMオクチルチオグルコシド
溶液に溶解し、Applied Biosystems 477A Protein Sequ
encerを用いて分析した。その結果、アミノ末端からの
配列として、図１および配列表の配列番号８に示すよう
に、２３個のアミノ酸のアミノ酸配列を決定することが
できた。
【００４６】Ｂ．アミノ末端２３残基に対応するDNAの
合成 上記Ａ項で決定することのできたアミノ酸配列をもとに
DNAオリゴマーを合成し、ポリメラーゼチェーンリアク
ション法 （PCR、Saiki, R. K.ら, Science, 239, 487-
494 (1988)）によってDNAプローブ（以下に示す遺伝子
ライブラリーのスクリーニングに使用するためのプロー
ブ）の作成を行った。このPCRに用いるDNAオリゴマーの
設計、およびその作製は、以下の通りである。各アミノ
酸残基に対応するコドンを考慮して、決定したアミノ酸
配列の、ある領域をコードしうるDNA配列のすべてを網
羅する混合DNAオリゴマーを設計することができる。実
際には、哺乳動物で優先的に使用されるコドンを主に用
い、図１に示した塩基配列のうちアミノ末端側とカルボ
キシル末端側の配列をもとにそれぞれ(I)（配列表の配
列番号２）(II)（配列表の配列番号３）と(III)（配列
表の配列番号４）(IV)（配列表の配列番号５）のDNAオ
リゴマーを合成した。これらのうち(III)および(IV)の
２つは、タンパク質をコードしている遺伝子の相補鎖の
塩基配列に基づくものである。これらのDNAオリゴマー
は短鎖であるため、核酸合成機(PharmaciaLKB Gene Ass
embler Plus, DNA Synthesizer)を用いて化学合成し
た。これらのDNAオリゴマーは図１に示すような位置関
係にあるので、適当な試料を鋳型としてPCRを行えば、
(I)と(IV)のオリゴマーペアーからは６５塩基対、(II)
と(IV)のオリゴマーペアーからは６２塩基対のPLA2レセ
プターcDNA断片が増幅されると予想できる。さらに、初
めにオリゴマー(I)と(IV)のペアーで増幅した産物をゲ
ル電気泳動によって分離し、鎖長が６５塩基対であるDN
Aを分離回収し、これを(II)と(IV)のオリゴマーによる
２回目のPCRの鋳型として用いれば、さらに高い特異性
をもってPLA2レセプターcDNAを得ることができる。
合成 上記Ａ項で決定することのできたアミノ酸配列をもとに
DNAオリゴマーを合成し、ポリメラーゼチェーンリアク
ション法 （PCR、Saiki, R. K.ら, Science, 239, 487-
494 (1988)）によってDNAプローブ（以下に示す遺伝子
ライブラリーのスクリーニングに使用するためのプロー
ブ）の作成を行った。このPCRに用いるDNAオリゴマーの
設計、およびその作製は、以下の通りである。各アミノ
酸残基に対応するコドンを考慮して、決定したアミノ酸
配列の、ある領域をコードしうるDNA配列のすべてを網
羅する混合DNAオリゴマーを設計することができる。実
際には、哺乳動物で優先的に使用されるコドンを主に用
い、図１に示した塩基配列のうちアミノ末端側とカルボ
キシル末端側の配列をもとにそれぞれ(I)（配列表の配
列番号２）(II)（配列表の配列番号３）と(III)（配列
表の配列番号４）(IV)（配列表の配列番号５）のDNAオ
リゴマーを合成した。これらのうち(III)および(IV)の
２つは、タンパク質をコードしている遺伝子の相補鎖の
塩基配列に基づくものである。これらのDNAオリゴマー
は短鎖であるため、核酸合成機(PharmaciaLKB Gene Ass
embler Plus, DNA Synthesizer)を用いて化学合成し
た。これらのDNAオリゴマーは図１に示すような位置関
係にあるので、適当な試料を鋳型としてPCRを行えば、
(I)と(IV)のオリゴマーペアーからは６５塩基対、(II)
と(IV)のオリゴマーペアーからは６２塩基対のPLA2レセ
プターcDNA断片が増幅されると予想できる。さらに、初
めにオリゴマー(I)と(IV)のペアーで増幅した産物をゲ
ル電気泳動によって分離し、鎖長が６５塩基対であるDN
Aを分離回収し、これを(II)と(IV)のオリゴマーによる
２回目のPCRの鋳型として用いれば、さらに高い特異性
をもってPLA2レセプターcDNAを得ることができる。
【００４７】Ｃ．PCRに用いる鋳型試料の調製
ウシ黄体には他の臓器と比較して多くのPLA2レセプター
タンパク質が存在しているので、遺伝子クローニングの
材料としても黄体が適したものであると考えられる。新
鮮な状態で凍結されたウシ黄体７個より、グアニジウム
チオシアネート法(Chomczynski, P.ら, Anal. Bioche
m., 162, 156-159 (1987))によってRNAを抽出した。
タンパク質が存在しているので、遺伝子クローニングの
材料としても黄体が適したものであると考えられる。新
鮮な状態で凍結されたウシ黄体７個より、グアニジウム
チオシアネート法(Chomczynski, P.ら, Anal. Bioche
m., 162, 156-159 (1987))によってRNAを抽出した。
【００４８】PLA2レセプターcDNAの鎖長は、レセプター
タンパク質の分子量から計算して少なくとも４５００塩
基以上であることが予想され、このように長いcDNAの場
合通常のオリゴdTプライマーを用いる方法によるcDNA調
製のための反応では、完全長のcDNAが得られる可能性が
低くなることが知られている。
タンパク質の分子量から計算して少なくとも４５００塩
基以上であることが予想され、このように長いcDNAの場
合通常のオリゴdTプライマーを用いる方法によるcDNA調
製のための反応では、完全長のcDNAが得られる可能性が
低くなることが知られている。
【００４９】従って、PCRによって増幅しようとする領
域の下流側の極く近傍に位置するDNAオリゴマーを、cDN
A化のプライマーとして用いることを試みた。ここでい
うcDNA化に用いたDNAオリゴマーは図１の(III)で示され
るものであり、実際には上記ウシ黄体RNA 10μgから、
このDNAオリゴマー(III)１pmoleをプライマーとしてcDN
Aの調製を行った。このcDNA調製には、cDNA合成および
プラスミドクローニングのためのSuperScriptプラスミ
ドシステム（米国BRL社製）のcDNA合成反応系を使用し
た。
域の下流側の極く近傍に位置するDNAオリゴマーを、cDN
A化のプライマーとして用いることを試みた。ここでい
うcDNA化に用いたDNAオリゴマーは図１の(III)で示され
るものであり、実際には上記ウシ黄体RNA 10μgから、
このDNAオリゴマー(III)１pmoleをプライマーとしてcDN
Aの調製を行った。このcDNA調製には、cDNA合成および
プラスミドクローニングのためのSuperScriptプラスミ
ドシステム（米国BRL社製）のcDNA合成反応系を使用し
た。
【００５０】Ｄ．PCRによるPLA2レセプターcDNAの増幅
と単離 上記Ｂ項で得られたDNAオリゴマー(I)と(IV)を用いて、
上記Ｃ項で得られたcDNA試料を鋳型としてPLA2レセプタ
ーcDNAの増幅を行った。PCRには、酵素として米国Perki
n Elmer Cetus社のAmpliTaq DNA polymeraseを用い、反
応液の組成は当酵素の使用説明書に従った。増幅装置は
Perkin Elmer Cetus社のThermal cyclerを使用し、94℃
1分、37℃ 1分を15サイクル、引き続いて94℃ 1分、50
℃ 1分、72℃ 15秒を15サイクルで、増幅を行った。PCR
反応液200μlをクロロフォルム抽出、エタノール沈殿し
た後、15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、増
幅産物をその分子量にしたがって分離した。PLA2レセプ
ターcDNAが増幅されると予想される６５塩基対に相当す
る付近のゲル断片を切り出して、ゲル断片中に含まれる
DNAを回収した。次に、回収したDNAを鋳型とした２回目
のPCRを、オリゴマー(II)と(IV)を用いて行った(94℃ 1
分、50℃ 1分、72℃ 1分を30サイクル)。このPCRの産物
も上記と同様にクロロフォルム抽出、エタノール沈殿の
後ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、６
２塩基対に相当するDNAをゲルから回収した。得られた
２本鎖のDNAを、適当なクローニングベクター内に挿入
することによって大腸菌内でクローン化した。上記で単
離したDNAは、クローニングベクターpBLUE SCRIPT(KS-)
(米国STRATAGENE社)を制限酵素EcoRVで直鎖状にしジデ
オキシチミジンを付加したもの(Holton, T.A.ら, Nucle
ic Acids Res., 19,1156 (1991))とライゲーションする
ことによって、このクローニングベクター内に挿入し
た。ライゲーション液をフェノール抽出、エタノール沈
殿した後、この精製ライゲーション液を用いて大腸菌C6
00株（米国CLONETECH社製）を形質転換した。形質転換
した大腸菌をアンピシリン50μg/mlを含むＬＢ寒天培地
で選択した。得られた形質転換体の中から６株につい
て、それらの大腸菌が保持するプラスミドDNAを調製し
た。このうち４株に関して、これらのプラスミドDNAのE
coRV部位に挿入されているPCR産物の塩基配列を、ジデ
オキシ法（Sanger, F., Science, 214, 1205-1210 (198
1)）によって決定した。これらのうちの２クローンの塩
基配列は、図１のオリゴマー(II)と(IV)で挟まれる部分
に相当するアミノ酸配列をコードするものであった。
と単離 上記Ｂ項で得られたDNAオリゴマー(I)と(IV)を用いて、
上記Ｃ項で得られたcDNA試料を鋳型としてPLA2レセプタ
ーcDNAの増幅を行った。PCRには、酵素として米国Perki
n Elmer Cetus社のAmpliTaq DNA polymeraseを用い、反
応液の組成は当酵素の使用説明書に従った。増幅装置は
Perkin Elmer Cetus社のThermal cyclerを使用し、94℃
1分、37℃ 1分を15サイクル、引き続いて94℃ 1分、50
℃ 1分、72℃ 15秒を15サイクルで、増幅を行った。PCR
反応液200μlをクロロフォルム抽出、エタノール沈殿し
た後、15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、増
幅産物をその分子量にしたがって分離した。PLA2レセプ
ターcDNAが増幅されると予想される６５塩基対に相当す
る付近のゲル断片を切り出して、ゲル断片中に含まれる
DNAを回収した。次に、回収したDNAを鋳型とした２回目
のPCRを、オリゴマー(II)と(IV)を用いて行った(94℃ 1
分、50℃ 1分、72℃ 1分を30サイクル)。このPCRの産物
も上記と同様にクロロフォルム抽出、エタノール沈殿の
後ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、６
２塩基対に相当するDNAをゲルから回収した。得られた
２本鎖のDNAを、適当なクローニングベクター内に挿入
することによって大腸菌内でクローン化した。上記で単
離したDNAは、クローニングベクターpBLUE SCRIPT(KS-)
(米国STRATAGENE社)を制限酵素EcoRVで直鎖状にしジデ
オキシチミジンを付加したもの(Holton, T.A.ら, Nucle
ic Acids Res., 19,1156 (1991))とライゲーションする
ことによって、このクローニングベクター内に挿入し
た。ライゲーション液をフェノール抽出、エタノール沈
殿した後、この精製ライゲーション液を用いて大腸菌C6
00株（米国CLONETECH社製）を形質転換した。形質転換
した大腸菌をアンピシリン50μg/mlを含むＬＢ寒天培地
で選択した。得られた形質転換体の中から６株につい
て、それらの大腸菌が保持するプラスミドDNAを調製し
た。このうち４株に関して、これらのプラスミドDNAのE
coRV部位に挿入されているPCR産物の塩基配列を、ジデ
オキシ法（Sanger, F., Science, 214, 1205-1210 (198
1)）によって決定した。これらのうちの２クローンの塩
基配列は、図１のオリゴマー(II)と(IV)で挟まれる部分
に相当するアミノ酸配列をコードするものであった。
【００５１】（実施例２）（ウシ染色体ライブラリーの
スクリーニング） 実施例１のＤ項のPCR増幅で得られたPLA2レセプターcDN
A断片は、通常の遺伝子ライブリーのスクリーニングに
プローブとしてそのまま用いることができる。しかしな
がら、感度の面で問題があり更に長いプローブの取得が
望ましい。さらに、このPLA2レセプター遺伝子の発現頻
度が低いものであると予想されたため、cDNAライブラリ
ーではなく、その遺伝子の発現頻度によらず、すべての
遺伝子領域を均等に含むと考えられる染色体ライブラリ
ーのスクリーニングを初めに行い、より長いcDNA断片の
単離を行った。
スクリーニング） 実施例１のＤ項のPCR増幅で得られたPLA2レセプターcDN
A断片は、通常の遺伝子ライブリーのスクリーニングに
プローブとしてそのまま用いることができる。しかしな
がら、感度の面で問題があり更に長いプローブの取得が
望ましい。さらに、このPLA2レセプター遺伝子の発現頻
度が低いものであると予想されたため、cDNAライブラリ
ーではなく、その遺伝子の発現頻度によらず、すべての
遺伝子領域を均等に含むと考えられる染色体ライブラリ
ーのスクリーニングを初めに行い、より長いcDNA断片の
単離を行った。
【００５２】染色体ライブラリーは、米国CLONETECH社
より購入したBovine Genomic Libraryを使用した。プロ
ーブには実施例１のＤ項で得られたcDNA断片を32Ｐ放射
性同位元素標識したものを用い、スクリーニング方法は
ライブラリー添付のプロトコールに従った。具体的には
まず、ファージ液の力価測定を行った後、１枚のプレー
ト当り約４万個のファージプラークを形成するだけのフ
ァージ液をライブラリー添付の大腸菌宿主と混合し、Ｌ
Ｂプレート(10×15cm)に重層した。このプレートを３７
℃で一晩培養後、形成されたプラークをプラークハイブ
リダイゼーション法によってスクリーニングした。
より購入したBovine Genomic Libraryを使用した。プロ
ーブには実施例１のＤ項で得られたcDNA断片を32Ｐ放射
性同位元素標識したものを用い、スクリーニング方法は
ライブラリー添付のプロトコールに従った。具体的には
まず、ファージ液の力価測定を行った後、１枚のプレー
ト当り約４万個のファージプラークを形成するだけのフ
ァージ液をライブラリー添付の大腸菌宿主と混合し、Ｌ
Ｂプレート(10×15cm)に重層した。このプレートを３７
℃で一晩培養後、形成されたプラークをプラークハイブ
リダイゼーション法によってスクリーニングした。
【００５３】約８０万個のクローンのスクリーニングを
行ったところ、１個の陽性クローンが得られた（図２の
pGE-1）。このクローンの塩基配列を解析したところ、
配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、１位から３
８８位までに相当する領域を含んでいた。３８８位の塩
基の下流には介在配列（イントロン）（図２の破線部
分）が見られた。
行ったところ、１個の陽性クローンが得られた（図２の
pGE-1）。このクローンの塩基配列を解析したところ、
配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、１位から３
８８位までに相当する領域を含んでいた。３８８位の塩
基の下流には介在配列（イントロン）（図２の破線部
分）が見られた。
【００５４】（実施例３）（ウシ胎盤cDNAライブラリー
のスクリーニング） 実施例２で明らかにすることのできた塩基配列をもと
に、配列表の配列番号１の２５７位から３８４位までの
１２８塩基対をPCR法によって増幅することのできるＤ
ＮＡオリゴマーをプライマーとして合成した（配列表の
配列番号６および７）。実施例２で得られた陽性クロー
ンのDNA（pGE-1）を鋳型として、上記の１２８塩基対よ
りなるDNA断片をPCR法によって特異的に増幅し、この産
物を32Ｐ放射性同位元素標識し、ウシ胎盤cDNAライブラ
リーのスクリーニングに用いた。ウシ胎盤cDNAライブラ
リーは米国CLONETECH社より購入したBovine Placenta c
DNALibrary(5'Stretch)を使用した。上記ライブラリー
のスクリーニングはライブラリー添付のプロトコールに
従った。具体的には、実施例２に記載の染色体ライブラ
リーのスクリーニング法と同様の工程でスクリーニング
を行った。合計約６４万個のクローンのスクリーニング
を行い、図２のpNH-1で示されるPLA2レセプターcDNA断
片を持つクローンを得た。得られたクローンのcDNAを制
限酵素で切断し、ゲル電気泳動にて分離回収した後、32
Ｐ放射性同位元素標識することによってDNAプローブを
調製した。この新しいプローブを用いて同じライブラリ
ーを再スクリーニング（約３５０万クローン）すること
によって、pNH-1より下流側をコードするクローン（図
２のpMID-1およびpMID-7）を単離することができた。こ
のように、新しく得られたクローンから新しいDNAプロ
ーブを調製して、互いにオーバーラップするクローンを
順次得ることができた。
のスクリーニング） 実施例２で明らかにすることのできた塩基配列をもと
に、配列表の配列番号１の２５７位から３８４位までの
１２８塩基対をPCR法によって増幅することのできるＤ
ＮＡオリゴマーをプライマーとして合成した（配列表の
配列番号６および７）。実施例２で得られた陽性クロー
ンのDNA（pGE-1）を鋳型として、上記の１２８塩基対よ
りなるDNA断片をPCR法によって特異的に増幅し、この産
物を32Ｐ放射性同位元素標識し、ウシ胎盤cDNAライブラ
リーのスクリーニングに用いた。ウシ胎盤cDNAライブラ
リーは米国CLONETECH社より購入したBovine Placenta c
DNALibrary(5'Stretch)を使用した。上記ライブラリー
のスクリーニングはライブラリー添付のプロトコールに
従った。具体的には、実施例２に記載の染色体ライブラ
リーのスクリーニング法と同様の工程でスクリーニング
を行った。合計約６４万個のクローンのスクリーニング
を行い、図２のpNH-1で示されるPLA2レセプターcDNA断
片を持つクローンを得た。得られたクローンのcDNAを制
限酵素で切断し、ゲル電気泳動にて分離回収した後、32
Ｐ放射性同位元素標識することによってDNAプローブを
調製した。この新しいプローブを用いて同じライブラリ
ーを再スクリーニング（約３５０万クローン）すること
によって、pNH-1より下流側をコードするクローン（図
２のpMID-1およびpMID-7）を単離することができた。こ
のように、新しく得られたクローンから新しいDNAプロ
ーブを調製して、互いにオーバーラップするクローンを
順次得ることができた。
【００５５】（実施例４）（ウシ腎臓由来MDBK細胞cDNA
ライブラリーのスクリーニング） 種々の培養細胞あるいは組織でのPLA2レセプターの発現
量を、スキャッチャードプロット解析によって測定した
結果、ウシ腎臓由来の細胞MDBK細胞株（ATCC CCL 22）
が、他の臓器に比べてより多くのPLA2レセプターを発現
していることが認められた。実施例３までで得られてい
たcDNAをプローブとして、MDBK細胞株cDNAライブラリー
のスクリーニングを行った（米国STRATAGENE社のBovine
KidneycDNA Library in the Lambda ZAPII Vectorを使
用した）。この結果、図２に示したpMD-6およびpMD-24
を含む複数の陽性クローンが得られた。また、市販のラ
イブラリーとは別に、MDBK細胞より抽出したRNAからcDN
Aを合成し、cDNA合成およびプラスミドクローニングの
ためのSuperScriptプラスミドシステム（BRL社、前出）
によってcDNAライブラリーを作成した。
ライブラリーのスクリーニング） 種々の培養細胞あるいは組織でのPLA2レセプターの発現
量を、スキャッチャードプロット解析によって測定した
結果、ウシ腎臓由来の細胞MDBK細胞株（ATCC CCL 22）
が、他の臓器に比べてより多くのPLA2レセプターを発現
していることが認められた。実施例３までで得られてい
たcDNAをプローブとして、MDBK細胞株cDNAライブラリー
のスクリーニングを行った（米国STRATAGENE社のBovine
KidneycDNA Library in the Lambda ZAPII Vectorを使
用した）。この結果、図２に示したpMD-6およびpMD-24
を含む複数の陽性クローンが得られた。また、市販のラ
イブラリーとは別に、MDBK細胞より抽出したRNAからcDN
Aを合成し、cDNA合成およびプラスミドクローニングの
ためのSuperScriptプラスミドシステム（BRL社、前出）
によってcDNAライブラリーを作成した。
【００５６】このライブラリーからは、図２に示したpM
DBK-11を含む複数のクローンが得られた。
DBK-11を含む複数のクローンが得られた。
【００５７】（実施例５）（PLA2レセプターcDNAの全一
次構造の決定） 実施例４までで得られたcDNAクローンのうちpNH-1およ
びpMDBK-11の２つの塩基配列情報を重ね合わせると、PL
A2レセプターcDNAの全塩基配列を決定することができ
る。全塩基配列およびアミノ酸配列を配列表の配列番号
１に示す。これらのcDNAは、翻訳開始点と考えられるAT
Gの上流２７９bp、PLA2レセプタータンパク質をコード
する４３８９bp、終止コドンから下流３１０bp（mRNAの
３'端に見られるPolyA tailを含む）からなり、合計４
９７８bpで構成されている。また、実際に、pNH-1とpMD
BK-11の２つのcDNA断片を、予め制限酵素NcoIで切断し
た後に連結させることによって、PLA2レセプタータンパ
ク質全体をコードするcDNA断片を構築することができる
（後述）。
次構造の決定） 実施例４までで得られたcDNAクローンのうちpNH-1およ
びpMDBK-11の２つの塩基配列情報を重ね合わせると、PL
A2レセプターcDNAの全塩基配列を決定することができ
る。全塩基配列およびアミノ酸配列を配列表の配列番号
１に示す。これらのcDNAは、翻訳開始点と考えられるAT
Gの上流２７９bp、PLA2レセプタータンパク質をコード
する４３８９bp、終止コドンから下流３１０bp（mRNAの
３'端に見られるPolyA tailを含む）からなり、合計４
９７８bpで構成されている。また、実際に、pNH-1とpMD
BK-11の２つのcDNA断片を、予め制限酵素NcoIで切断し
た後に連結させることによって、PLA2レセプタータンパ
ク質全体をコードするcDNA断片を構築することができる
（後述）。
【００５８】タンパク質をコードしている部分の鎖長か
らレセプタータンパク質のアミノ酸残基数は１４６３で
あることがわかった。ただし、アミノ末端部分にシグナ
ルペプチド様の配列が見られ、精製タンパク質のアミノ
末端のアミノ酸配列（図１）が配列表の配列番号１のア
ミノ酸配列の２１番目以降に見られることから、アミノ
末端の２０残基はシグナルペプチドであり、シグナルペ
プチド切断後の成熟レセプタータンパク質のアミノ酸残
基数は１４４３と予想される。
らレセプタータンパク質のアミノ酸残基数は１４６３で
あることがわかった。ただし、アミノ末端部分にシグナ
ルペプチド様の配列が見られ、精製タンパク質のアミノ
末端のアミノ酸配列（図１）が配列表の配列番号１のア
ミノ酸配列の２１番目以降に見られることから、アミノ
末端の２０残基はシグナルペプチドであり、シグナルペ
プチド切断後の成熟レセプタータンパク質のアミノ酸残
基数は１４４３と予想される。
【００５９】シグナルペプチドは、細胞内で合成された
PLA2レセプタータンパク質の輸送のため、あるいは膜に
対して正しく配向するために機能し、実際のPLA2結合能
はこの１４４３個のアミノ酸によって保持されていると
考えられる。
PLA2レセプタータンパク質の輸送のため、あるいは膜に
対して正しく配向するために機能し、実際のPLA2結合能
はこの１４４３個のアミノ酸によって保持されていると
考えられる。
【００６０】さらに、既知タンパク質の一次構造データ
バンクとのホモロジー検索を行った結果、レクチンの１
種であるマンノースレセプターとの間に、データバンク
中の他のタンパク質と比較して最も高いホモロジー（一
次構造全体で29％）が検出された。両者間のホモロジー
は一次構造全体にわたっており、特に、タンパク質の立
体構造の規定に重要であるシステイン残基の位置が極め
てよく保存されていた。マンノースレセプタータンパク
質は、多ドメイン構造であることが報告されているため
（Taylor, M. E.ら, J. Biol. Chem., 265, 12156-1216
2 (1990)）、これをもとにPLA2レセプタータンパク質の
ドメイン構造を予想した。図３にPLA2レセプターの推定
されたドメインを示す構造模式図を示す。図の下の数字
は、各ドメインのアミノ末端のアミノ酸残基の番号（配
列表の配列番号１に対応）を表す。PLA2レセプターは、
図３に示すようにアミノ末端から順に、シグナル配列
（Ｓ）、システイン残基を多く含むドメイン（Ｃ）、フ
ァイブロネクチンタイプ２リピート様ドメイン（Ｔ）、
８個の糖結合領域様ドメイン（CRD1〜CRD8、図中の１〜
８）、膜結合領域（Ｍ）、および細胞質内ドメイン
（Ｉ）からなると考えられる。
バンクとのホモロジー検索を行った結果、レクチンの１
種であるマンノースレセプターとの間に、データバンク
中の他のタンパク質と比較して最も高いホモロジー（一
次構造全体で29％）が検出された。両者間のホモロジー
は一次構造全体にわたっており、特に、タンパク質の立
体構造の規定に重要であるシステイン残基の位置が極め
てよく保存されていた。マンノースレセプタータンパク
質は、多ドメイン構造であることが報告されているため
（Taylor, M. E.ら, J. Biol. Chem., 265, 12156-1216
2 (1990)）、これをもとにPLA2レセプタータンパク質の
ドメイン構造を予想した。図３にPLA2レセプターの推定
されたドメインを示す構造模式図を示す。図の下の数字
は、各ドメインのアミノ末端のアミノ酸残基の番号（配
列表の配列番号１に対応）を表す。PLA2レセプターは、
図３に示すようにアミノ末端から順に、シグナル配列
（Ｓ）、システイン残基を多く含むドメイン（Ｃ）、フ
ァイブロネクチンタイプ２リピート様ドメイン（Ｔ）、
８個の糖結合領域様ドメイン（CRD1〜CRD8、図中の１〜
８）、膜結合領域（Ｍ）、および細胞質内ドメイン
（Ｉ）からなると考えられる。
【００６１】（実施例６）（組換え型PLA2レセプタータ
ンパク質の発現） cDNAクローンであるpNH-1とpMDBK-11は、いずれも図２
に示す制限酵素NcoI認識部位（配列表の配列番号１の塩
基配列７９９位に相当）以外の領域にNcoIで切断される
配列を持たないことが確かめられた。そのため、この両
者をNcoIで切断後、ゲル電気泳動によって、pNH-1から
はNcoIより上流側を、pMDBK11からはNcoIより下流側を
分離精製し、得られた２つのcDNA断片をライゲーション
反応によって連結した。連結したDNA断片をPLA2レセプ
ターcDNAと呼ぶ。このPLA2レセプターcDNAを動物細胞用
発現ベクターであるpSVL SV40後期プロモーター発現ベ
クター(Pharmacia LKB)のプロモーター下流域に順方向
に挿入した。このプラスミドをPLA2レセプター発現ベク
ターと呼ぶ。続いてこのPLA2レセプター発現ベクターで
サル由来のCOS7細胞をトランスフェクトした。トランス
フェクションには米国GIBCO/BRL Life Technologies, I
nc.のLipofectin Reagentを用い、方法はそのプロトコ
ールによった。トランスフェクト３日後に、COS7細胞の
解析を、以下のように行った。
ンパク質の発現） cDNAクローンであるpNH-1とpMDBK-11は、いずれも図２
に示す制限酵素NcoI認識部位（配列表の配列番号１の塩
基配列７９９位に相当）以外の領域にNcoIで切断される
配列を持たないことが確かめられた。そのため、この両
者をNcoIで切断後、ゲル電気泳動によって、pNH-1から
はNcoIより上流側を、pMDBK11からはNcoIより下流側を
分離精製し、得られた２つのcDNA断片をライゲーション
反応によって連結した。連結したDNA断片をPLA2レセプ
ターcDNAと呼ぶ。このPLA2レセプターcDNAを動物細胞用
発現ベクターであるpSVL SV40後期プロモーター発現ベ
クター(Pharmacia LKB)のプロモーター下流域に順方向
に挿入した。このプラスミドをPLA2レセプター発現ベク
ターと呼ぶ。続いてこのPLA2レセプター発現ベクターで
サル由来のCOS7細胞をトランスフェクトした。トランス
フェクションには米国GIBCO/BRL Life Technologies, I
nc.のLipofectin Reagentを用い、方法はそのプロトコ
ールによった。トランスフェクト３日後に、COS7細胞の
解析を、以下のように行った。
【００６２】まず、培養細胞を洗浄した後、培養細胞を
125Ｉ放射性同位元素標識したPLA2の存在下におくこと
によって、PLA2-PLA2レセプター間の結合反応を行わせ
た。結合しなかった遊離のPLA2を洗浄にて除去した後、
細胞膜上に捕らえられた放射性同位元素量を測定した。
結果を図４に示す。図中のContおよびPLA2は、それぞ
れ、コントロールプラスミドでトランスフェクトした細
胞およびPLA2レセプター発現プラスミドでトランスフェ
クトした細胞をそれぞれ３回測定した平均値を表す。PL
A2-PLA2レセプター間の結合反応を大過剰の未標識PLA2
存在下で行ったときの放射性同位元素量を非特異的結合
量（図の斜線部分）とみなし、この値をそれぞれの測定
値である全結合量（図の点描部分）から差し引いた値を
PLA2レセプターによる特異的な結合量とした。その結
果、cDNAを挿入していないコントロールプラスミドでト
ランスフェクトした細胞に比べ、PLA2レセプター発現プ
ラスミドでトランスフェクトした細胞が有意に高いPLA2
結合能（全結合量と非特異的結合量の差）を有している
ことが明らかとなった。このようにして、このcDNAが実
際に機能を持つPLA2レセプターをコードしていることが
確認できた。なお、PLA2結合能の測定は前出の論文(Han
asaki, K.ら, Biochim. Biophys. Acta, 1127, 233-241
(1992))に従って行った。
125Ｉ放射性同位元素標識したPLA2の存在下におくこと
によって、PLA2-PLA2レセプター間の結合反応を行わせ
た。結合しなかった遊離のPLA2を洗浄にて除去した後、
細胞膜上に捕らえられた放射性同位元素量を測定した。
結果を図４に示す。図中のContおよびPLA2は、それぞ
れ、コントロールプラスミドでトランスフェクトした細
胞およびPLA2レセプター発現プラスミドでトランスフェ
クトした細胞をそれぞれ３回測定した平均値を表す。PL
A2-PLA2レセプター間の結合反応を大過剰の未標識PLA2
存在下で行ったときの放射性同位元素量を非特異的結合
量（図の斜線部分）とみなし、この値をそれぞれの測定
値である全結合量（図の点描部分）から差し引いた値を
PLA2レセプターによる特異的な結合量とした。その結
果、cDNAを挿入していないコントロールプラスミドでト
ランスフェクトした細胞に比べ、PLA2レセプター発現プ
ラスミドでトランスフェクトした細胞が有意に高いPLA2
結合能（全結合量と非特異的結合量の差）を有している
ことが明らかとなった。このようにして、このcDNAが実
際に機能を持つPLA2レセプターをコードしていることが
確認できた。なお、PLA2結合能の測定は前出の論文(Han
asaki, K.ら, Biochim. Biophys. Acta, 1127, 233-241
(1992))に従って行った。
【００６３】（実施例７）（分泌型PLA2レセプターの発
現） 配列表の配列番号１の１３７３位のGlyをコードするcDN
A配列(GGA)を終止コドンであるTGAに変換するために、
配列表の配列番号９のDNAオリゴマーを合成した。このD
NAオリゴマーは、１３６８位のLysから１３７２位のLys
までの５アミノ酸に対応する15塩基配列、１３７３位の
Glyをコードするコドンを終止コドンであるTGAに変換す
る配列、およびこの終止コドンの３'側に制限酵素NotI
の認識配列であるGCGGCCGCを導入する配列を有する。こ
のDNAオリゴマーと、制限酵素XbaI認識配列（配列表の
配列番号１の塩基配列４１７８位に相当）より上流側に
あってセンス鎖に対応するDNAオリゴマーとを用いて、P
LA2レセプターcDNAを鋳型としたPCRを実施例１のＤ項と
同様の方法で行った。PCR増幅で得られたcDNAを、制限
酵素XbaIとNotIで切断した。実施例６のPLA2レセプター
発現ベクターをXbaIとNotIで切断して、PLA2レセプター
cDNAのXbaI認識配列から３'側を欠いたcDNAを調製し、
先のPCR増幅cDNA断片をこのcDNAへ挿入した。この結果
得られたベクターDNAを分泌型PLA2レセプター発現ベク
ターと呼ぶ。この分泌型PLA2レセプター発現ベクター
は、PLA2レセプター発現ベクターと比較して、PLA2レセ
プターDNAの配列中１３７３位のアミノ酸Glyをコードす
る配列が終止コドンに変わっており、また１３７４位以
降のアミノ酸をコードする部分を欠失している。
現） 配列表の配列番号１の１３７３位のGlyをコードするcDN
A配列(GGA)を終止コドンであるTGAに変換するために、
配列表の配列番号９のDNAオリゴマーを合成した。このD
NAオリゴマーは、１３６８位のLysから１３７２位のLys
までの５アミノ酸に対応する15塩基配列、１３７３位の
Glyをコードするコドンを終止コドンであるTGAに変換す
る配列、およびこの終止コドンの３'側に制限酵素NotI
の認識配列であるGCGGCCGCを導入する配列を有する。こ
のDNAオリゴマーと、制限酵素XbaI認識配列（配列表の
配列番号１の塩基配列４１７８位に相当）より上流側に
あってセンス鎖に対応するDNAオリゴマーとを用いて、P
LA2レセプターcDNAを鋳型としたPCRを実施例１のＤ項と
同様の方法で行った。PCR増幅で得られたcDNAを、制限
酵素XbaIとNotIで切断した。実施例６のPLA2レセプター
発現ベクターをXbaIとNotIで切断して、PLA2レセプター
cDNAのXbaI認識配列から３'側を欠いたcDNAを調製し、
先のPCR増幅cDNA断片をこのcDNAへ挿入した。この結果
得られたベクターDNAを分泌型PLA2レセプター発現ベク
ターと呼ぶ。この分泌型PLA2レセプター発現ベクター
は、PLA2レセプター発現ベクターと比較して、PLA2レセ
プターDNAの配列中１３７３位のアミノ酸Glyをコードす
る配列が終止コドンに変わっており、また１３７４位以
降のアミノ酸をコードする部分を欠失している。
【００６４】この分泌型PLA2レセプター発現ベクターで
サル由来COS7細胞をトランスフェクトした。この細胞の
培養上清中のPLA2結合能を、PLA2とレセプタータンパク
質とをポリエチレングリコールを用いて共沈させる方法
（Hanasaki, K.ら, J. Biol.Chem., 267, 6414-6420 (1
992)) によって測定した。結果を図５に示す。図の網掛
部分は非特異的結合量を、点描部分は全結合量を表す。
その結果、cDNAを挿入していないコントロールプラスミ
ドでトランスフェクトした細胞（Cont）に比べ、分泌型
PLA2レセプター発現プラスミドでトランスフェクトした
細胞（PLA2）が非常に高いPLA2結合能を有しており、こ
の分泌型PLA2レセプター発現ベクターから発現される組
換え型レセプターは実際に培地中に分泌され、野生型レ
セプターと同程度のPLA2結合親和性(Kd値＝0.8nM)を持
っていることが判った。
サル由来COS7細胞をトランスフェクトした。この細胞の
培養上清中のPLA2結合能を、PLA2とレセプタータンパク
質とをポリエチレングリコールを用いて共沈させる方法
（Hanasaki, K.ら, J. Biol.Chem., 267, 6414-6420 (1
992)) によって測定した。結果を図５に示す。図の網掛
部分は非特異的結合量を、点描部分は全結合量を表す。
その結果、cDNAを挿入していないコントロールプラスミ
ドでトランスフェクトした細胞（Cont）に比べ、分泌型
PLA2レセプター発現プラスミドでトランスフェクトした
細胞（PLA2）が非常に高いPLA2結合能を有しており、こ
の分泌型PLA2レセプター発現ベクターから発現される組
換え型レセプターは実際に培地中に分泌され、野生型レ
セプターと同程度のPLA2結合親和性(Kd値＝0.8nM)を持
っていることが判った。
【００６５】（実施例８）（CRD3〜CRD5部分からなる低
分子型PLA2レセプタータンパク質の発現） 配列表の配列番号１に示した塩基配列の１７９４位に存
在する制限酵素StuIの認識部位から３１６５位に存在す
る制限酵素PflMIの認識部位までのDNA断片を、実施例６
のPLA2レセプターcDNAを各制限酵素で切断することによ
り調製し、大腸菌DNAポリメラーゼＩ（Klenow fragmen
t）によってその末端を平滑化した。このDNA断片を、実
施例６のPLA2レセプター発現ベクターを制限酵素XhoIと
XbaIで切断し末端を平滑化したベクターDNAと、ライゲ
ーション反応によって連結した。連結して得られたベク
ターDNAを、低分子型PLA2レセプター発現ベクターと呼
ぶ。この低分子型PLA2レセプター発現ベクター中のPLA2
レセプターcDNA部分は、野生型PLA2レセプターcDNAと比
較して、塩基配列の４２６〜１７９３位および３１６２
〜４１７６位を欠失している。また、２９位のアミノ酸
をコードするコドンが、連結によりGAGからGACに変わっ
たため、Aspがコードされている。同様に９４１位のア
ミノ酸もAsnに変換されている。さらに、連結の結果、
４１７６〜４１８１位のXbaI認識部位中のTAGが終止コ
ドンとして機能するため、塩基配列の４１７８位以降の
cDNA部分はタンパク質には翻訳されない。従って、翻訳
される部分は配列表の配列番号１のアミノ酸配列の−２
０〜２８位と４８６〜９４０位の領域であり、２８位と
４８６位の間にはAspが、９４０位のカルボキシル末端
側にはAsnが付加している。すなわち、発現された低分
子型PLA2レセプターのアミノ酸配列は、配列表の配列番
号１０に示すとおりである。これは、PLA2レセプターの
ドメイン構造のCRD3〜CRD5に相当する領域をすべて含
み、それ以外の部分はほとんど含まない。
分子型PLA2レセプタータンパク質の発現） 配列表の配列番号１に示した塩基配列の１７９４位に存
在する制限酵素StuIの認識部位から３１６５位に存在す
る制限酵素PflMIの認識部位までのDNA断片を、実施例６
のPLA2レセプターcDNAを各制限酵素で切断することによ
り調製し、大腸菌DNAポリメラーゼＩ（Klenow fragmen
t）によってその末端を平滑化した。このDNA断片を、実
施例６のPLA2レセプター発現ベクターを制限酵素XhoIと
XbaIで切断し末端を平滑化したベクターDNAと、ライゲ
ーション反応によって連結した。連結して得られたベク
ターDNAを、低分子型PLA2レセプター発現ベクターと呼
ぶ。この低分子型PLA2レセプター発現ベクター中のPLA2
レセプターcDNA部分は、野生型PLA2レセプターcDNAと比
較して、塩基配列の４２６〜１７９３位および３１６２
〜４１７６位を欠失している。また、２９位のアミノ酸
をコードするコドンが、連結によりGAGからGACに変わっ
たため、Aspがコードされている。同様に９４１位のア
ミノ酸もAsnに変換されている。さらに、連結の結果、
４１７６〜４１８１位のXbaI認識部位中のTAGが終止コ
ドンとして機能するため、塩基配列の４１７８位以降の
cDNA部分はタンパク質には翻訳されない。従って、翻訳
される部分は配列表の配列番号１のアミノ酸配列の−２
０〜２８位と４８６〜９４０位の領域であり、２８位と
４８６位の間にはAspが、９４０位のカルボキシル末端
側にはAsnが付加している。すなわち、発現された低分
子型PLA2レセプターのアミノ酸配列は、配列表の配列番
号１０に示すとおりである。これは、PLA2レセプターの
ドメイン構造のCRD3〜CRD5に相当する領域をすべて含
み、それ以外の部分はほとんど含まない。
【００６６】この低分子型PLA2レセプター発現ベクター
を、実施例７で行ったのと同様にCOS7細胞に導入し、培
養上清中のPLA2結合活性を測定した。その結果を図６に
示す。図の網掛部分は非特異的結合量を、点描部分は全
結合量を表している。その結果、培養上清中にはPLA2結
合活性が検出され、コントロールプラスミドでトランス
フェクトした細胞（Cont）に比べ、低分子型PLA2レセプ
ター発現プラスミドでトランスフェクトした細胞（PL
A2）で高いPLA2結合能が見られた。このことは、PLA2レ
セプターのドメイン構造のうちのCRD3〜5に相当する領
域のみで、PLA2と結合し得ることを示している。
を、実施例７で行ったのと同様にCOS7細胞に導入し、培
養上清中のPLA2結合活性を測定した。その結果を図６に
示す。図の網掛部分は非特異的結合量を、点描部分は全
結合量を表している。その結果、培養上清中にはPLA2結
合活性が検出され、コントロールプラスミドでトランス
フェクトした細胞（Cont）に比べ、低分子型PLA2レセプ
ター発現プラスミドでトランスフェクトした細胞（PL
A2）で高いPLA2結合能が見られた。このことは、PLA2レ
セプターのドメイン構造のうちのCRD3〜5に相当する領
域のみで、PLA2と結合し得ることを示している。
【００６７】
【発明の効果】本発明によれば、このように、ウシＩ型
ホスホリパーゼＡ2レセプター；ウシＩ型ホスホリパー
ゼＡ2レセプター構造遺伝子；該遺伝子によりコードさ
れるウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプター；該遺伝子
を含む発現ベクター；該発現ベクターを有する形質転換
体；および該形質転換体を用いたウシＩ型ホスホリパー
ゼＡ2レセプターの製造方法が提供される。
ホスホリパーゼＡ2レセプター；ウシＩ型ホスホリパー
ゼＡ2レセプター構造遺伝子；該遺伝子によりコードさ
れるウシＩ型ホスホリパーゼＡ2レセプター；該遺伝子
を含む発現ベクター；該発現ベクターを有する形質転換
体；および該形質転換体を用いたウシＩ型ホスホリパー
ゼＡ2レセプターの製造方法が提供される。
【００６８】PLA2-Iは、PLA2-Iレセプターを介して、細
胞増殖作用（Aritaら, J. Biol. Chem., 266, 19139-19
141 (1991)）や肺実質組織の収縮作用（Kanemasaら, FE
BS LETTERS, 303, 217-220 (1992)）を示すことが報告
されている。従って、PLA2-Iレセプターのアゴニストお
よびアンタゴニストは、細胞増殖剤あるいは血管弛緩剤
などとして有用である。すなわち、PLA2-Iレセプター
は、細胞増殖剤あるいは血管弛緩剤などとして期待され
る、PLA2-Iレセプターのアゴニストあるいはアンタゴニ
ストのスクリーニングに有用である。また、分泌型およ
び低分子型PLA2-Iレセプターは野生型のレセプターより
も精製が容易であり、可溶性に保つための界面活性剤を
必要としない。従って、実験操作の簡便化が可能であ
り、PLA2-Iレセプターのアゴニストあるいはアンタゴニ
ストのスクリーニングに極めて有用である。さらに、分
泌型および低分子型PLA2-Iレセプターは、PLA2-Iと結合
した後、細胞内への情報伝達を行わないので、PLA2-I阻
害剤などとしても有用である。さらに、低分子型PLA2-I
レセプターは、PLA2-Iの結合に不必要な領域がないた
め、アゴニストあるいはアンタゴニストの検索を含めた
レセプター−リガンド間の相互作用解析を行うのにも有
用である。
胞増殖作用（Aritaら, J. Biol. Chem., 266, 19139-19
141 (1991)）や肺実質組織の収縮作用（Kanemasaら, FE
BS LETTERS, 303, 217-220 (1992)）を示すことが報告
されている。従って、PLA2-Iレセプターのアゴニストお
よびアンタゴニストは、細胞増殖剤あるいは血管弛緩剤
などとして有用である。すなわち、PLA2-Iレセプター
は、細胞増殖剤あるいは血管弛緩剤などとして期待され
る、PLA2-Iレセプターのアゴニストあるいはアンタゴニ
ストのスクリーニングに有用である。また、分泌型およ
び低分子型PLA2-Iレセプターは野生型のレセプターより
も精製が容易であり、可溶性に保つための界面活性剤を
必要としない。従って、実験操作の簡便化が可能であ
り、PLA2-Iレセプターのアゴニストあるいはアンタゴニ
ストのスクリーニングに極めて有用である。さらに、分
泌型および低分子型PLA2-Iレセプターは、PLA2-Iと結合
した後、細胞内への情報伝達を行わないので、PLA2-I阻
害剤などとしても有用である。さらに、低分子型PLA2-I
レセプターは、PLA2-Iの結合に不必要な領域がないた
め、アゴニストあるいはアンタゴニストの検索を含めた
レセプター−リガンド間の相互作用解析を行うのにも有
用である。
【００６９】
【００７０】
【配列番号：１】
配列の長さ：４９７８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：ウシ
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：280..4668
特徴を決定した方法：S
配列
CCACCCCCTG TTCCTCCTCC TGCTCCAAGC CGCAAAGGGA GAACCTCCGC GACTTTTCCG 60
TCTTCCAGCC AGAGAGCCCC CCCACCGTGG CCACAGGGGT GACTGACGAA GTGGGTCTCG 120
GGGACGCAGG GGTGGCGAGG CCCCCGGGGA GGGTTGGAGC GCGGAGGAGG CTGCGGTCCT 180
GCCCTCCGCC ACCCCACCCA CCGCAGGGCT GGGCGCTGGG CTTCGGCCCT GGCCCCCCGC 240
GGGCGCTACA CCGGGGACCG GCGGGCCAAG TGGTTAGCG ATG CCG CTG CTG TCG 294
Met Pro Leu Leu Ser
-20
CTG TCG CTG CTC CTG CTG CTG CTG CAG GTA CCG GCG GGC TCC GCC GAG 342
Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Val Pro Ala Gly Ser Ala Glu
-15 -10 -5 1
ACC GCG GCG TGG GCA GTC ACC CCC GAG CGG CTC CGC GAG TGG CAA GAT 390
Thr Ala Ala Trp Ala Val Thr Pro Glu Arg Leu Arg Glu Trp Gln Asp
5 10 15
AAA GGA ATC TTC ATT ATC CAA AGT GAG AAC CTC GAG AAA TGT ATT CAA 438
Lys Gly Ile Phe Ile Ile Gln Ser Glu Asn Leu Glu Lys Cys Ile Gln
20 25 30
GCC AGC AAA TCT ACA CTG ACC CTG GAG AAC TGC AAA CCA CCC AAC AAG 486
Ala Ser Lys Ser Thr Leu Thr Leu Glu Asn Cys Lys Pro Pro Asn Lys
35 40 45 50
TAC ATG CTG TGG AAG TGG GTT TCA AAC CAC CGC TTA TTT AAC ATC GGA 534
Tyr Met Leu Trp Lys Trp Val Ser Asn His Arg Leu Phe Asn Ile Gly
55 60 65
GGC AGT GGC TGC CTG GGC CTG AAC GTG TCT AGT CCA GAG CAG CCA CTG 582
Gly Ser Gly Cys Leu Gly Leu Asn Val Ser Ser Pro Glu Gln Pro Leu
70 75 80
AGC ATA TAC GAG TGT GAT TCC ACC CAC GTT TCC TTG AAG TGG CAC TGT 630
Ser Ile Tyr Glu Cys Asp Ser Thr His Val Ser Leu Lys Trp His Cys
85 90 95
AAC AAG AAG ACG ATC ACA GGC CCA CTC CAG TAC CTG GTC CAG GTG AAG 678
Asn Lys Lys Thr Ile Thr Gly Pro Leu Gln Tyr Leu Val Gln Val Lys
100 105 110 115
CAG GAC AAC ACG CTT GTG GCC TCA AGG AAA TAT CTC CAT AAG TGG GTT 726
Gln Asp Asn Thr Leu Val Ala Ser Arg Lys Tyr Leu His Lys Trp Val
120 125 130
TCC TAT ATG TCC GGC GGT GGA GGC ATT TGT GAC TAT CTG CAC AAA GAT 774
Ser Tyr Met Ser Gly Gly Gly Gly Ile Cys Asp Tyr Leu His Lys Asp
135 140 145
TTG TAC ACA ATC AAA GGG AAT GCC CAT GGG ACT CCG TGC ATG TTC CCC 822
Leu Tyr Thr Ile Lys Gly Asn Ala His Gly Thr Pro Cys Met Phe Pro
150 155 160
TTC CAG TAC AAT CAG CAG TGG CAC CAC GAA TGT ACC CGG GAA GGA CGG 870
Phe Gln Tyr Asn Gln Gln Trp His His Glu Cys Thr Arg Glu Gly Arg
165 170 175
GAA GAC AAC TTG CTG TGG TGT GCC ACT ACC AGC CGA TAC GAA AGA GAC 918
Glu Asp Asn Leu Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Arg Tyr Glu Arg Asp
180 185 190
GAG AAG TGG GGA TTT TGC CCA GAT CCT ACA TCC ACA GAG GTG GGC TGC 966
Glu Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Pro Thr Ser Thr Glu Val Gly Cys
195 200 205
GAT GCA GTC TGG GAG AAG GAT CTC CAT TCA CGC ATT TGC TAC CAA TTC 1014
Asp Ala Val Trp Glu Lys Asp Leu His Ser Arg Ile Cys Tyr Gln Phe
210 215 220 225
AAT CTG CTT TCC TCC CTG TCC TGG AGT GAG GCT CAT TCT TCA TGC CAG 1062
Asn Leu Leu Ser Ser Leu Ser Trp Ser Glu Ala His Ser Ser Cys Gln
230 235 240
ATG CAA GGA GCT GCT TTA TTA AGT ATT GCA GAT GAG ACT GAA GAA AAT 1110
Met Gln Gly Ala Ala Leu Leu Ser Ile Ala Asp Glu Thr Glu Glu Asn
245 250 255
TTC GTA AGG AAG CAC TTG GGC AGT GAA GCA GTG GAA GTA TGG ATG GGT 1158
Phe Val Arg Lys His Leu Gly Ser Glu Ala Val Glu Val Trp Met Gly
260 265 270
CTG AAT CAG CTG GAT GAA GAT GCT GGT TGG CAG TGG TCT GAT AGA ACA 1206
Leu Asn Gln Leu Asp Glu Asp Ala Gly Trp Gln Trp Ser Asp Arg Thr
275 280 285
CCA CTC AAC TAT CTG AAC TGG AAG CCA GAA ATA AAT TTT GAG CCA TTT 1254
Pro Leu Asn Tyr Leu Asn Trp Lys Pro Glu Ile Asn Phe Glu Pro Phe
290 295 300 305
GTT GAA TAT CAC TGT GGA ACA TTT AAT GCA TTT ATG CCA AAG GCC TGG 1302
Val Glu Tyr His Cys Gly Thr Phe Asn Ala Phe Met Pro Lys Ala Trp
310 315 320
AAA AGT CGG GAT TGT GAG TCT ACC TTG CCC TAC GTG TGT AAA AAA TAT 1350
Lys Ser Arg Asp Cys Glu Ser Thr Leu Pro Tyr Val Cys Lys Lys Tyr
325 330 335
CTA AAT CCC ACT GAT CAT GGA GTA GTT GAA AAG GAT GCT TGG AAA TAC 1398
Leu Asn Pro Thr Asp His Gly Val Val Glu Lys Asp Ala Trp Lys Tyr
340 345 350
TAT GCT ACC CAC TGT GAG CCT GGC TGG AAT CCC CAC AAC CGT AAT TGC 1446
Tyr Ala Thr His Cys Glu Pro Gly Trp Asn Pro His Asn Arg Asn Cys
355 360 365
TAT AAA CTG CAG AAA GAA AAA AAG ACC TGG AAT GAG GCT TTG CAG TCT 1494
Tyr Lys Leu Gln Lys Glu Lys Lys Thr Trp Asn Glu Ala Leu Gln Ser
370 375 380 385
TGC CAG TCC AAC AAC AGT GTA TTA ACA GAC ATC ACT TCG TTA GCA GAG 1542
Cys Gln Ser Asn Asn Ser Val Leu Thr Asp Ile Thr Ser Leu Ala Glu
390 395 400
GTG GAG TTT CTT GTA ACC CTC CTT GGA GAT GAA AAT GCA TCA GAA ACA 1590
Val Glu Phe Leu Val Thr Leu Leu Gly Asp Glu Asn Ala Ser Glu Thr
405 410 415
TGG ATT GGT TTG AGC AGC CAT AAA ATT CCA GTT TCC TTT GAG TGG TCT 1638
Trp Ile Gly Leu Ser Ser His Lys Ile Pro Val Ser Phe Glu Trp Ser
420 425 430
AAT GGC TCC TCG GTC ACC TTT ACT AAC TGG CAC ACA CTT GAG CCC CAC 1686
Asn Gly Ser Ser Val Thr Phe Thr Asn Trp His Thr Leu Glu Pro His
435 440 445
ATT TTT CCA AAT AGA AGC CAG TTG TGT GTC TCA GCA GAG CAA TCT GAG 1734
Ile Phe Pro Asn Arg Ser Gln Leu Cys Val Ser Ala Glu Gln Ser Glu
450 455 460 465
GGA CAC TGG AAA GTT AAA AAT TGC GAA GAA ACA CTT TTT TAC CTT TGT 1782
Gly His Trp Lys Val Lys Asn Cys Glu Glu Thr Leu Phe Tyr Leu Cys
470 475 480
AAG AAA ACA GGC CTT GTC CTT TCT GAC ACT GAA TCA GGC TGT CAA AAG 1830
Lys Lys Thr Gly Leu Val Leu Ser Asp Thr Glu Ser Gly Cys Gln Lys
485 490 495
GGA TGG GAG AGA CAT GGT AAA TTC TGT TAC AAA ATT GAC ACC GTC CTT 1878
Gly Trp Glu Arg His Gly Lys Phe Cys Tyr Lys Ile Asp Thr Val Leu
500 505 510
CGA AGC TTT GAC CAT GCC TCC AGT GGT TAC TAC TGT CCT CCT GCG CTT 1926
Arg Ser Phe Asp His Ala Ser Ser Gly Tyr Tyr Cys Pro Pro Ala Leu
515 520 525
ATA ACC ATT ACA AGC AGG TTT GAA CAG GCT TTT ATT ACC AGT TTG ATC 1974
Ile Thr Ile Thr Ser Arg Phe Glu Gln Ala Phe Ile Thr Ser Leu Ile
530 535 540 545
AGT AGT GTG GTA AAA ACG AAG GAC ACT TAT TTT TGG ATC GCT CTT CAA 2022
Ser Ser Val Val Lys Thr Lys Asp Thr Tyr Phe Trp Ile Ala Leu Gln
550 555 560
GAT CAA AAT AAT ACA GGA GAA TAC ACT TGG AAG ACG GCA GGG CAG CAG 2070
Asp Gln Asn Asn Thr Gly Glu Tyr Thr Trp Lys Thr Ala Gly Gln Gln
565 570 575
TTG GAG CCA GTG AAG TAC ACA CAC TGG AAC ACA CGT CAG CCC CGC TAC 2118
Leu Glu Pro Val Lys Tyr Thr His Trp Asn Thr Arg Gln Pro Arg Tyr
580 585 590
AGT GGT GGC TGC GTT GTC ATG CGA GGG AGG AGT CAC CCT GGC CGC TGG 2166
Ser Gly Gly Cys Val Val Met Arg Gly Arg Ser His Pro Gly Arg Trp
595 600 605
GAA GTG AGG GAC TGT AGG CAC TTT AAG GCG ATG TCC CTG TGC AAG CAA 2214
Glu Val Arg Asp Cys Arg His Phe Lys Ala Met Ser Leu Cys Lys Gln
610 615 620 625
CCA GTG GAA AAT CGG GAG AAA ACC AAG CAA GAA GAG GGA TGG CCC TTT 2262
Pro Val Glu Asn Arg Glu Lys Thr Lys Gln Glu Glu Gly Trp Pro Phe
630 635 640
CAC CCC TGC TAT TTG GAT TGG GAG TCA GAG CCT GGC CTG GCC AGT TGC 2310
His Pro Cys Tyr Leu Asp Trp Glu Ser Glu Pro Gly Leu Ala Ser Cys
645 650 655
TTC AAG GTA TTT CAT AGT GAA AAA GTC CTG ATG AAA AGA ACA TGG AGA 2358
Phe Lys Val Phe His Ser Glu Lys Val Leu Met Lys Arg Thr Trp Arg
660 665 670
CAA GCT GAA GAA TTT TGT GAA GAA TTT GGA GCT CAT CTT GCA AGC TTT 2406
Gln Ala Glu Glu Phe Cys Glu Glu Phe Gly Ala His Leu Ala Ser Phe
675 680 685
GCC CAT ATT GAG GAA GAG AAT TTT GTG AAT GAG CTT TTA CAT TCA AAA 2454
Ala His Ile Glu Glu Glu Asn Phe Val Asn Glu Leu Leu His Ser Lys
690 695 700 705
TTT AAT CGG ACA GAA GAA AGG CAG TTC TGG ATT GGA TTT AAT AAA AGA 2502
Phe Asn Arg Thr Glu Glu Arg Gln Phe Trp Ile Gly Phe Asn Lys Arg
710 715 720
AAC CCA CTG AAT GCT GGT TCT TGG GAA TGG TCT GAT GGA ACT CCT GTT 2550
Asn Pro Leu Asn Ala Gly Ser Trp Glu Trp Ser Asp Gly Thr Pro Val
725 730 735
GTC TCT TCA TTT TTA GAC AAT TCT TAT TTT GGA GAA GAT GCA AGA AAT 2598
Val Ser Ser Phe Leu Asp Asn Ser Tyr Phe Gly Glu Asp Ala Arg Asn
740 745 750
TGT GCT GTT TAT AAG GCA AAT AAA ACG TTG CTA CCC TCA TAC TGT GGT 2646
Cys Ala Val Tyr Lys Ala Asn Lys Thr Leu Leu Pro Ser Tyr Cys Gly
755 760 765
TCC AAA CGT GAA TGG ATA TGC AAA ATT CCA AGA GAT GTG AGA CCC AAG 2694
Ser Lys Arg Glu Trp Ile Cys Lys Ile Pro Arg Asp Val Arg Pro Lys
770 775 780 785
GTT CCA CCC TGG TAT CAG TAT GAT GCA CCC TGG CTC TTT TAT CAG GAT 2742
Val Pro Pro Trp Tyr Gln Tyr Asp Ala Pro Trp Leu Phe Tyr Gln Asp
790 795 800
GCA GAG TAC CTT TTT CAT ATT TCT GCC TCA GAA TGG TCC TCC TTT GAG 2790
Ala Glu Tyr Leu Phe His Ile Ser Ala Ser Glu Trp Ser Ser Phe Glu
805 810 815
TTT GTC TGT GGC TGG CTG CGC AGT GAT ATT CTC ACT ATT CAT TCT GCA 2838
Phe Val Cys Gly Trp Leu Arg Ser Asp Ile Leu Thr Ile His Ser Ala
820 825 830
CAC GAA CAA GAA TTC ATC CAC AGC AAA ATA AGA GCG CTA TCA AAG TAT 2886
His Glu Gln Glu Phe Ile His Ser Lys Ile Arg Ala Leu Ser Lys Tyr
835 840 845
GGT GTA AAT TGG TGG ATT GGA CTT CGA GAA GAA AGA GCC AGT GAT GAA 2934
Gly Val Asn Trp Trp Ile Gly Leu Arg Glu Glu Arg Ala Ser Asp Glu
850 855 860 865
TTT CGT TGG AGA GAT GGA TCA CCA GTA ATA TAT CAG AAC TGG GAC AAA 2982
Phe Arg Trp Arg Asp Gly Ser Pro Val Ile Tyr Gln Asn Trp Asp Lys
870 875 880
GGA AAA GAA AGA TCT ATG GGC CTT AAT GAG AGC CAG AGG TGT GGC TTC 3030
Gly Lys Glu Arg Ser Met Gly Leu Asn Glu Ser Gln Arg Cys Gly Phe
885 890 895
ATT TCA TCC ATA ACA GGT CTC TGG GCG AGT GAA GAG TGT TCA ATT TCT 3078
Ile Ser Ser Ile Thr Gly Leu Trp Ala Ser Glu Glu Cys Ser Ile Ser
900 905 910
ATG CCT AGC ATC TGT AAG CGA AAA AAG GTT TGG GTC ATA GAA AAA AAG 3126
Met Pro Ser Ile Cys Lys Arg Lys Lys Val Trp Val Ile Glu Lys Lys
915 920 925
AAA GAT ATT CCA AAA CAA CAT GGA ACA TGT CCC AAA GGA TGG TTA TAT 3174
Lys Asp Ile Pro Lys Gln His Gly Thr Cys Pro Lys Gly Trp Leu Tyr
930 935 940 945
TTT GAC TAT AAG TGC CTT TTG CTG AAA ATC CCT GAA GGC CCA AGT GAC 3222
Phe Asp Tyr Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ile Pro Glu Gly Pro Ser Asp
950 955 960
TGG AAG AAC TGG ACA TCT GCT CAA GAT TTT TGT GTT GAA GAA GGG GGG 3270
Trp Lys Asn Trp Thr Ser Ala Gln Asp Phe Cys Val Glu Glu Gly Gly
965 970 975
ACA CTG GTT GCC ATT GAA AAT GAG GTG GAA CAA GCT TTC ATT ACC ATG 3318
Thr Leu Val Ala Ile Glu Asn Glu Val Glu Gln Ala Phe Ile Thr Met
980 985 990
AAT CTT TTT GGC CAT ACC ACT AAT GTG TGG ATA GGG TTA CAA GAT GAT 3366
Asn Leu Phe Gly His Thr Thr Asn Val Trp Ile Gly Leu Gln Asp Asp
995 1000 1005
GAT TAT GAA AAA TGG CTA AAT GGA AGG CCT GTG TCA TAT TCT AAT TGG 3414
Asp Tyr Glu Lys Trp Leu Asn Gly Arg Pro Val Ser Tyr Ser Asn Trp
1010 1015 1020 1025
TCT CCA TTT GAT ACA AAA AAT ATT CCA AAT CAC AAC ACC ACT GAA GTT 3462
Ser Pro Phe Asp Thr Lys Asn Ile Pro Asn His Asn Thr Thr Glu Val
1030 1035 1040
CAA AAA CGC ATT CCT CTC TGT GGC TTG CTG TCA AAT AAT CCT AAT TTT 3510
Gln Lys Arg Ile Pro Leu Cys Gly Leu Leu Ser Asn Asn Pro Asn Phe
1045 1050 1055
CAT TTC ACT GGA AAA TGG TAT TTT GAA GAC TGT AGA GAA GGT TAT GGG 3558
His Phe Thr Gly Lys Trp Tyr Phe Glu Asp Cys Arg Glu Gly Tyr Gly
1060 1065 1070
TTT GTT TGT GAA AAA ATG CAG GAT GCT TCT GGA CAC AGT ATA AAT ACA 3606
Phe Val Cys Glu Lys Met Gln Asp Ala Ser Gly His Ser Ile Asn Thr
1075 1080 995
TCT GAT ATG TAT CCA ATC CCT AAT ACC TTA GAA TAT GGA AAC AGA ACT 3654
Ser Asp Met Tyr Pro Ile Pro Asn Thr Leu Glu Tyr Gly Asn Arg Thr
1090 1095 1100 1105
TAC AAA ATA ATT AAT GCA AAT ATG ACT TGG TAT ACA GCA CTA AAA ACC 3702
Tyr Lys Ile Ile Asn Ala Asn Met Thr Trp Tyr Thr Ala Leu Lys Thr
1110 1115 1120
TGC CTG ATG CAT GGA GCA GAA CTG GCC AGC ATT ACA GAC CAG TAC CAC 3750
Cys Leu Met His Gly Ala Glu Leu Ala Ser Ile Thr Asp Gln Tyr His
1125 1130 1135
CAG TCT TTC CTC ACT GTT ATC CTT AAC CGG GTG GGA TAT GCC CAC TGG 3798
Gln Ser Phe Leu Thr Val Ile Leu Asn Arg Val Gly Tyr Ala His Trp
1140 1145 1150
ATT GGA CTG TTC ACT GAA GAT AAT GGT CTT AGT TTT GAC TGG TCA GAT 3846
Ile Gly Leu Phe Thr Glu Asp Asn Gly Leu Ser Phe Asp Trp Ser Asp
1155 1160 1165
GGC ACC AAA TCC TCC TTC ACT TTT TGG AAA GAT GAT GAA TCA TCC TTC 3894
Gly Thr Lys Ser Ser Phe Thr Phe Trp Lys Asp Asp Glu Ser Ser Phe
1170 1175 1180 1185
CTT GGT GAC TGT GTT TTT GCT GAC ACC AGT GGA CGC TGG AGT AGC ACA 3942
Leu Gly Asp Cys Val Phe Ala Asp Thr Ser Gly Arg Trp Ser Ser Thr
1190 1195 1200
GCC TGC GAG TCG TAT CTG CAA GGA GCC ATT TGT CAA GTG CCC ACT GAA 3990
Ala Cys Glu Ser Tyr Leu Gln Gly Ala Ile Cys Gln Val Pro Thr Glu
1205 1210 1215
ACA AGA CTG TCT GGA CGC CTA GAG TTG TGC TCA GAA ACA TCA ATT CCC 4038
Thr Arg Leu Ser Gly Arg Leu Glu Leu Cys Ser Glu Thr Ser Ile Pro
1220 1225 1230
TGG ATA AAA TTC AAA AGT AAT TGC TAC AGT TTT TCT ACA GTC CTA GAG 4086
Trp Ile Lys Phe Lys Ser Asn Cys Tyr Ser Phe Ser Thr Val Leu Glu
1235 1240 1245
AGT ACA AGT TTT GAG GCT GCT CAT GAA TTT TGC AAA AAG AAA GGC TCT 4134
Ser Thr Ser Phe Glu Ala Ala His Glu Phe Cys Lys Lys Lys Gly Ser
1250 1255 1260 1265
AAT CTT TTA ACA ATC AAA GAT GAA GCT GAA AAC TCT TTT CTT CTA GAA 4182
Asn Leu Leu Thr Ile Lys Asp Glu Ala Glu Asn Ser Phe Leu Leu Glu
1270 1275 1280
GAG CTT TTA GCT TTC CGT TCT TCA GTC CAG ATG ATT TGG CTG AAT GCT 4230
Glu Leu Leu Ala Phe Arg Ser Ser Val Gln Met Ile Trp Leu Asn Ala
1285 1290 1295
CAG TTT GAT GGT GAC AAT GAA ACC ATA AAG TGG TTT GAT GGA ACT CCC 4278
Gln Phe Asp Gly Asp Asn Glu Thr Ile Lys Trp Phe Asp Gly Thr Pro
1300 1305 1310
ACA GAT CAA TCA AAC TGG GGT ATT CGG AAG CCA GAG GTG TAC CAC TTC 4326
Thr Asp Gln Ser Asn Trp Gly Ile Arg Lys Pro Glu Val Tyr His Phe
1315 1320 1325
AAA CCC CAT CTG TGT GTT GCC CTG AGG ATT CCT GAA GGA GTG TGG CAA 4374
Lys Pro His Leu Cys Val Ala Leu Arg Ile Pro Glu Gly Val Trp Gln
1330 1335 1340 1345
TTA TCC TCG TGT CAA GAC AAA AAG GGA TTT ATA TGT AAA ATG GAA GCA 4422
Leu Ser Ser Cys Gln Asp Lys Lys Gly Phe Ile Cys Lys Met Glu Ala
1350 1355 1360
GAT ATT CAC ACA GTA AAG AAG CAT CCA GGA AAA GGA CCA AGT CAC AGT 4470
Asp Ile His Thr Val Lys Lys His Pro Gly Lys Gly Pro Ser His Ser
1365 1370 1375
GTT ATA CCT CTT ACA GTA GCA CTG ACA CTG CTA GTA ATT CTG GCA ATT 4518
Val Ile Pro Leu Thr Val Ala Leu Thr Leu Leu Val Ile Leu Ala Ile
1380 1385 1390
TCC ACA CTT TCC TTC TGC ATG TAC AAG CAC AGT CAC ATT ATC TTC GGG 4566
Ser Thr Leu Ser Phe Cys Met Tyr Lys His Ser His Ile Ile Phe Gly
1395 1400 1405
AGA CTT GCT CAG TTT AGA AAT CCT TAC TAT CCT TCA GCC AAC TTT AGT 4614
Arg Leu Ala Gln Phe Arg Asn Pro Tyr Tyr Pro Ser Ala Asn Phe Ser
1410 1415 1420 1425
ACA GTA CAT TTA GAA GAA AAT ATT CTC ATT TCT GAT CTT GAG AAG AAT 4662
Thr Val His Leu Glu Glu Asn Ile Leu Ile Ser Asp Leu Glu Lys Asn
1430 1435 1440
GAC CAG TAATAACGAA GTGAGAGAAC ATCACGGCGG TGAGAATGAG 4708
Asp Gln
CAAAGAAGAG TATTTTCCTT TACAGCCAGA TGCCACTATA ATGTCAATTG TGTTACCATC 4768
TTCGTTATTC TTAAAATGAT TACTGGTTTT GAATTGTAAC CAAATCAGAT AGGTGTTCAT 4828
TTATTTATTT CCTCAAACTG TGATCTATTC TTAAAAGGGG GAAAATTTAC AGTGCTTATT 4888
ATTCAGAAAA CAAGAACTAT TAAAAGCAAC TCCCAAATGA GACCCCTCAA AAAAAAAAAA 4948
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 4978
【００７１】
【配列番号：２】
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
GAGACCGCNG CNTGGGC 17
【００７２】
【配列番号：３】
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
ACCGCNGCNT GGGCNGT 17
【００７３】
【配列番号：４】
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
CTRTTYRYRT AGAAGTAGTT 20
【００７４】
【配列番号：５】
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
GTYCTRTTYR YRTAGAAGTA 20
【００７５】
【配列番号：６】
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
ACCGGCGGGC CAAGTGGTT 19
【００７６】
【配列番号：７】
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
CCACTCGCGG AGCCGCTCGG 20
【００７７】
【配列番号：８】
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Glu Thr Ala Ala Trp Ala Val Thr Pro Glu Arg Leu Arg Glu Trp Gln
1 5 10 15
Asp Lys Xaa Ile Phe Ile Lys
20
【００７８】
【配列番号：９】
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
ACTGGCGGCC GCTCATTTTC CTGGATGCTT 30
【００７９】
【配列番号：１０】
配列の長さ：５０５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Met Pro Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Ser Ala Glu Thr Ala Ala Trp Ala Val Thr Pro Glu Arg Leu
20 25 30
Arg Glu Trp Gln Asp Lys Gly Ile Phe Ile Ile Gln Ser Glu Asn Leu
35 40 45
Asp Leu Val Leu Ser Asp Thr Glu Ser Gly Cys Gln Lys Gly Trp Glu
50 55 60
Arg His Gly Lys Phe Cys Tyr Lys Ile Asp Thr Val Leu Arg Ser Phe
65 70 75 80
Asp His Ala Ser Ser Gly Tyr Tyr Cys Pro Pro Ala Leu Ile Thr Ile
85 90 95
Thr Ser Arg Phe Glu Gln Ala Phe Ile Thr Ser Leu Ile Ser Ser Val
100 105 110
Val Lys Thr Lys Asp Thr Tyr Phe Trp Ile Ala Leu Gln Asp Gln Asn
115 120 125
Asn Thr Gly Glu Tyr Thr Trp Lys Thr Ala Gly Gln Gln Leu Glu Pro
130 135 140
Val Lys Tyr Thr His Trp Asn Thr Arg Gln Pro Arg Tyr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Cys Val Val Met Arg Gly Arg Ser His Pro Gly Arg Trp Glu Val Arg
165 170 175
Asp Cys Arg His Phe Lys Ala Met Ser Leu Cys Lys Gln Pro Val Glu
180 185 190
Asn Arg Glu Lys Thr Lys Gln Glu Glu Gly Trp Pro Phe His Pro Cys
195 200 205
Tyr Leu Asp Trp Glu Ser Glu Pro Gly Leu Ala Ser Cys Phe Lys Val
210 215 220
Phe His Ser Glu Lys Val Leu Met Lys Arg Thr Trp Arg Gln Ala Glu
225 230 235 240
Glu Phe Cys Glu Glu Phe Gly Ala His Leu Ala Ser Phe Ala His Ile
245 250 255
Glu Glu Glu Asn Phe Val Asn Glu Leu Leu His Ser Lys Phe Asn Arg
260 265 270
Thr Glu Glu Arg Gln Phe Trp Ile Gly Phe Asn Lys Arg Asn Pro Leu
275 280 285
Asn Ala Gly Ser Trp Glu Trp Ser Asp Gly Thr Pro Val Val Ser Ser
290 295 300
Phe Leu Asp Asn Ser Tyr Phe Gly Glu Asp Ala Arg Asn Cys Ala Val
305 310 315 320
Tyr Lys Ala Asn Lys Thr Leu Leu Pro Ser Tyr Cys Gly Ser Lys Arg
325 330 335
Glu Trp Ile Cys Lys Ile Pro Arg Asp Val Arg Pro Lys Val Pro Pro
340 345 350
Trp Tyr Gln Tyr Asp Ala Pro Trp Leu Phe Tyr Gln Asp Ala Glu Tyr
355 360 365
Leu Phe His Ile Ser Ala Ser Glu Trp Ser Ser Phe Glu Phe Val Cys
370 375 380
Gly Trp Leu Arg Ser Asp Ile Leu Thr Ile His Ser Ala His Glu Gln
385 390 395 400
Glu Phe Ile His Ser Lys Ile Arg Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Val Asn
405 410 415
Trp Trp Ile Gly Leu Arg Glu Glu Arg Ala Ser Asp Glu Phe Arg Trp
420 425 430
Arg Asp Gly Ser Pro Val Ile Tyr Gln Asn Trp Asp Lys Gly Lys Glu
435 440 445
Arg Ser Met Gly Leu Asn Glu Ser Gln Arg Cys Gly Phe Ile Ser Ser
450 455 460
Ile Thr Gly Leu Trp Ala Ser Glu Glu Cys Ser Ile Ser Met Pro Ser
465 470 475 480
Ile Cys Lys Arg Lys Lys Val Trp Val Ile Glu Lys Lys Lys Asp Ile
485 490 495
Pro Lys Gln His Gly Thr Cys Pro Asn
500 505
【図１】ウシ黄体膜画分由来のPLA2レセプターのＮ末端
アミノ酸配列およびプローブを作成するためのＰＣＲ用
のプライマーの配列を示す図である。
アミノ酸配列およびプローブを作成するためのＰＣＲ用
のプライマーの配列を示す図である。
【図２】本発明のPLA2レセプターの一部をそれぞれコー
ドする、各クローンの位置および制限酵素地図を示す図
である。
ドする、各クローンの位置および制限酵素地図を示す図
である。
【図３】マンノースレセプターとのホモロジーから推定
されるPLA2レセプターのドメイン構造の模式図である。
されるPLA2レセプターのドメイン構造の模式図である。
【図４】本発明のPLA2レセプターをコードする遺伝子を
有する形質転換体とPLA2レセプターを有さない形質転換
体のPLA2に対する結合能を示す図である。
有する形質転換体とPLA2レセプターを有さない形質転換
体のPLA2に対する結合能を示す図である。
【図５】本発明の分泌型PLA2レセプター発現ベクターお
よびPLA2レセプターcDNAを含まないコントロールベクタ
ーでCOS細胞をトランスフェクトして３日後の培地200μ
l中のPLA2結合能を示す図である。
よびPLA2レセプターcDNAを含まないコントロールベクタ
ーでCOS細胞をトランスフェクトして３日後の培地200μ
l中のPLA2結合能を示す図である。
【図６】本発明の低分子型PLA2レセプター発現ベクター
およびPLA2レセプターcDNAを含まないコントロールベク
ターでCOS細胞をトランスフェクトして３日後の培地200
μl中のPLA2結合能を示す図である。
およびPLA2レセプターcDNAを含まないコントロールベク
ターでCOS細胞をトランスフェクトして３日後の培地200
μl中のPLA2結合能を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/12
C07K 14/705
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ
Ｓ（ＳＴＮ)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
Claims (14)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１の４８６位のＬｅｕ
から９４０位のＰｒｏまでのアミノ酸配列を含む組換え
ウシＩ型ホスホリパーゼＡ２レセプター。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１の１位のＧｌｕから
１３７２位のＬｙｓまでのアミノ酸配列を含む、請求項
１に記載の組換えウシＩ型ホスホリパーゼＡ２レセプタ
ー。 - 【請求項３】 配列表の配列番号１の−２０位のＭｅｔ
から１３７２位のＬｙｓまでのアミノ酸配列を含む、請
求項１に記載の組換えウシＩ型ホスホリパーゼＡ２レセ
プター。 - 【請求項４】 配列表の配列番号１の−２０位のＭｅｔ
から１４４３位のＧｌｎまでのアミノ酸配列を含む、請
求項１に記載の組換えウシＩ型ホスホリパーゼＡ２レセ
プター。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の組換え
ウシＩ型ホスホリパーゼＡ２レセプターをコードする核
酸分子。 - 【請求項６】 配列表の配列番号１の１７９４位のＣか
ら３１５９位のＣまででなる塩基配列からなる、請求項
５に記載の核酸分子。 - 【請求項７】 配列表の配列番号１の３４０位のＧから
４４５５位のＡまででなる塩基配列からなる、請求項５
に記載の核酸分子。 - 【請求項８】 配列表の配列番号１の２８０位のＡから
４４５５位のＡまででなる塩基配列からなる、請求項５
に記載の核酸分子。 - 【請求項９】 配列表の配列番号１の３４０位のＧから
４６６８位のＧまででなる塩基配列からなる、請求項５
に記載の核酸分子。 - 【請求項１０】 配列表の配列番号１の２８０位のＡか
ら４６６８位のＧまででなる塩基配列からなる、請求項
５に記載の核酸分子。 - 【請求項１１】 請求項５〜１０のいずれかに記載の核
酸分子を有する発現ベクター。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載の発現ベクターを宿
主に導入して得られる形質転換体。 - 【請求項１３】 前記宿主が哺乳類動物細胞である、請
求項１２に記載の形質転換体。 - 【請求項１４】 請求項１２に記載の形質転換体を培養
する工程、および産生された組換えウシＩ型ホスホリパ
ーゼＡ２レセプターを培養培地から回収する工程を包含
する、組換えウシＩ型ホスホリパーゼＡ２レセプターの
製造方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04017794A JP3494693B2 (ja) | 1993-03-30 | 1994-03-10 | ウシｉ型ホスホリパーゼａ２レセプター |
| EP94302319A EP0620275A1 (en) | 1993-03-30 | 1994-03-30 | A bovine group I phospholipase A2 receptor |
| US08/220,603 US5612190A (en) | 1993-03-30 | 1994-03-30 | DNA molecule encoding bovine group I phospholipase A2 receptor |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7232393 | 1993-03-30 | ||
| JP20668693 | 1993-08-20 | ||
| JP5-206686 | 1993-08-20 | ||
| JP5-72323 | 1993-08-20 | ||
| JP04017794A JP3494693B2 (ja) | 1993-03-30 | 1994-03-10 | ウシｉ型ホスホリパーゼａ２レセプター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07135982A JPH07135982A (ja) | 1995-05-30 |
| JP3494693B2 true JP3494693B2 (ja) | 2004-02-09 |
Family
ID=27290392
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04017794A Expired - Fee Related JP3494693B2 (ja) | 1993-03-30 | 1994-03-10 | ウシｉ型ホスホリパーゼａ２レセプター |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5612190A (ja) |
| EP (1) | EP0620275A1 (ja) |
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Families Citing this family (3)
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|---|---|---|---|---|
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| CA2788500C (en) * | 2001-10-11 | 2017-08-01 | Biomolecular Products, Inc. | Modifications of solid 3-sn-phosphoglycerides |
| US6727277B1 (en) | 2002-11-12 | 2004-04-27 | Kansas State University Research Foundation | Compounds affecting cholesterol absorption |
-
1994
- 1994-03-10 JP JP04017794A patent/JP3494693B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-03-30 EP EP94302319A patent/EP0620275A1/en not_active Ceased
- 1994-03-30 US US08/220,603 patent/US5612190A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９２年，１１２７，２３３−２４１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5612190A (en) | 1997-03-18 |
| EP0620275A1 (en) | 1994-10-19 |
| JPH07135982A (ja) | 1995-05-30 |
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