JP3024983B2 - 癌胎児性抗原関連蛋白質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はヒトの癌胎児性抗原（carcinoembryonic ant
igen:以下ヒトCEAと略す）関連抗原に属する非特異的交
差抗原（nonspecific cross−reacting antigen:以下NC
Aと略す）及び胆汁糖蛋白質（biliary glycoprotein−
I:以下BGPIと略す）の蛋白質および該蛋白質をコードす
る遺伝子に関する。

（従来の技術） 癌胎児性抗原（CEA）は1965年、GoldおよびFreedman
により、ヒト結腸癌と２〜６ケ月齢胎児消化管に共通に
存在する抗原として発見され（Gold,P.およびFreedman,
S.O.:J.Exp.Med.,121,439,1965およびFreedman,S.O.:J.
Exp.Med.,122,467,1965）、現在、臨床検査で最も広く
用いられている臨床マーカーの一つである。

しかしながら、CEAを腫瘍マーカーとして用いる際の
重大な問題として、正常組織にも存在するCEA関連抗原
の存在がある。CEA関連抗原とは、蛋白質化学的にCEAに
きわめて類似しており、免疫学的にも通常の抗CEA抗体
ではCEAと区別できないような共通の抗原決定基を有し
ていると考えられる抗原の総称である。代表的なCEA関
連抗原としては、正常人の肺や脾臓中に見出されている
分子量約９万の糖蛋白質である非特異的交差抗原（NC
A）が知られている（von Kleist,S.ら,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA.69,2492,1972）。その他にも胎児の便中に見出
されたNCA−２（Burtin,P.ら,J.Immunol.,111,1926,197
3）、正常胆汁中に発見された胆汁糖蛋白質−１（bilia
ry glycoprotein−Ｉ（BGP−１）（Svenberg,T.,Int.J.
Cancer,17,588−596,1976）および正常成人糞便中に発
見されたNFA（normal fecal antigen）（Matsuoka,Y.
ら,Gann,64,203,1973）等がある。NFAは３つの分子種か
らなり、それぞれNFA−1,NFA−２およびNFCA（normal f
ecal cross−reacting antigen）と名付けられている
が、いずれもその構造や物理化学的性質など、その実体
はあきらかにされていない（Kuroki,M.ら,Cancer Res.4
1,713,1981）。

ところで、現在市販されているCEA測定用ラジオイム
ノアッセイ（RIA）またエンザイムイムノアッセイ（EI
A）キットで使用されている殆どのまたは大部分の抗体
は、CEAとCEA関連抗原の共通の抗原部分を認識するもの
であるため、これらのCEA関連抗原とCEAを区別して測定
できないという欠点がある。さらに、従来のキットで同
一CEA検体を測定した場合、キット間でその測定値が異
なるという問題も提起されている（Kuroki,M.ら,J.Immu
nol.Methods,60,221,1983） （発明が解決しようとする問題点） 上記の問題を解消し、CEAのみを特異的に測定する方
法を開発するためには、CEAおよびCEA関連抗原の構造を
解明し、特異性の高い抗体を製造することが要望され
る。CEAに関してはすでに及川らによりその一次構造が
明らかにされている（Oikawa,S.ら,Biochem.Biophys.Re
s.Commun.,142,511,1987および特開昭62−6851号公
報）。

従って、次に問題になるのは、CEA関連抗原の構造で
ある。前述のCEA関連抗原の中で、NCAは、肺や脾臓中に
多く含まれる（von Kleist,S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,69,2492,1972）とともに、白血球（おもに、顆粒球
と単球）で生産されており（Bordes,M.ら,Eur.J.Cance
r.11,783,1975）、また、血中濃度もかなり高いのでCEA
の血中濃度を測定する場合や免疫組織化学的にCEAを検
出する際、もっとも注意すべき抗原である。NCAの分子
量は、組織によって異なっており、小さいものでは50kD
a,大きいものでは130kDaという報告がある。例えばBuch
eggerらは、顆粒球には55kDaと95kDaのNCAが存在する
が、上皮細胞には、55kDaのものしか存在しないことを
報告しており（Buchegger,F.ら,Int.J.Cancer,33,643,1
984）、また、Grunertらは、上記２種のNCA以外に結腸
癌から75kDaのNCAを単離している（Grunert,F.ら,Int.
J.Cancer,36,357,1985）。さらに顆粒球NCAについて
は、Audettらは、分子量160kDaと90kDaのものを報告し
ているが、Matsuokaらのグループは（Kuroki,Mo.ら、Ja
p.J.Cancer Res.（Gann）79,82,1988,およびKuroki,Mo.
ら、Biochem.Biophys.Res.Commun 166,701,1990）顆粒
球を³⁵Sメチオニンで標識する系で、160k,95k,90k,80k,
58k及び26kDaのNCAの発現を報告している。このような
分子量の相違は、NCAがCEA同様糖蛋白質であり、重量に
して20〜50％の糖を含むことから考えて糖鎖構造の違い
による可能性が先ず考えられるが、蛋白質として複数の
NCAが存在する可能性も否定はできない。

最近肺癌に見出されるNCA（tumor NCA）のcDNAがクロ
ーン化され、当該抗原の蛋白質の一次構造が明らかとな
った（Tawaragi,Y.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.15
0,89,1988,及びNeumaier,M.ら、J.Biol.Chem.263,3202,
1988,及び特開平１−120289号公報）。さらにCEA関連抗
原としては、BGP−ＩのcDNAがクローン化され、（Hinod
a,Y.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,6959,1988）当該蛋
白質の一次構造が明らかになり、更に、BGP−Ｉ遺伝子
は選択スプライシングにより複数個のメッセンジャーRN
A、複数個の蛋白質をコードする事が判明した（Barnet
t,T.R.,ら,J.Cell Biol.108,267,1989）。

しかしこのような進展にもかかわらず、まだNCAの全
分子種の相互関係に関しては、現在のところ明らかにさ
れていない点が多い。そこで、本発明者はヒト顆粒球NC
A遺伝子をクローニングし、そのDNA塩基配列を決定する
ことにより、ヒト顆粒球NCAの全アミノ酸配列を明らか
にするため、鋭意研究を行った。

（問題点を解決するための手段） 本発明者は、ヒト顆粒球NCA遺伝子をクローニングす
るため、ヒト末梢血より抽出したメッセンジャーRNAを
用いてcDNAライブラリーを作成した。そこからNCAの遺
伝子を単離・同定し、さらにその塩基配列を解析・決定
した。その解明された塩基配列をもとにヒト顆粒球NCA
の全構造を明らかにし、本発明を完成するにいたった。

本発明のヒト顆粒球NCA蛋白質をコードする遺伝子
は、次のようにして得ることができる。

先ず、130人分の血液より、デキストラン法を用いて
白血球画分を分離し、そのメッセンジャーRNAを用い
て、cDNAライブラリーを調製する。cDNAライブラリーの
調製は、公知の適当な方法で行うことができる。

こうして調製されたcDNAライブラリー（大腸菌）から
の目的とするクローン（ヒト顆粒球NCA蛋白質を発現す
るクローン）のスクリーニングは、既にクローン化され
ている、tumor NCAのcDNAを適当な制限酵素で切断して
調製した断片をラベルし、これをプローブとして用いて
行うことが出来る。

次に、上記のようにしてスクリーニングされた陽性ク
ローン（大腸菌）からファージDNAを常法により分離
し、制限酵素解析により、目的とするcDNA（ヒト顆粒球
NCAのcDNA）が該ファージDNA中に挿入されていることを
確認し、その挿入cDNAの塩基配列を常法により決定す
る。

次に、上記のようにして得られたcDNAの塩基配列の翻
訳可能領域（オープンリーディング領域）を、常法に従
って翻訳することによりヒト顆粒球NCAをコードする遺
伝子ならびにヒト顆粒球NCA蛋白質の構造（アミノ酸配
列）を知ることができる。こうして塩基配列が判明した
ヒト顆粒球NCAの構造遺伝子は、化学的に合成すること
によっても得ることができる。

さらに上記のようにして得られるヒト顆粒球NCA遺伝
子を用いて、大腸菌や酵母のような微生物あるいは動物
細胞でヒト顆粒球NCA蛋白質を製造することが可能であ
る。即ち、上記で得られたヒト顆粒球NCAの構造遺伝子
の５′側に適当なプロモーター領域を付加し、これを適
当なプラスミドに挿入したのち、大腸菌や酵母のような
微生物あるいは動物細胞に導入して、培養すればよい。
このような操作は公知の技術を用いることにより行うこ
とができ、また不要なペプチド領域、例えばCEAやtumor
NCAと共通するペプチド領域を除いた、特異的な抗原ペ
プチドを微生物や動物細胞で製造することも可能であ
る。そして、これらのペプチドを抗原として、ヒト顆粒
球NCAにのみ特異的に反応するポリクローナルもしくは
モノクローナル抗体を常法により作ることができる。ま
た、CEAやtumor NCAをコードするcDNAとの塩基配列の比
較から、CEA、tumor NCAと顆粒球NCAとを区別できるよ
うな特異的なDNAプローブの調製が可能となり、このよ
うなプローブを用いることによって、正常組織、癌組織
に含まれるCEA,tumor NCA,顆粒球NCAのmRNA発現量を正
確に知ることも可能である。以下、本発明を実施例をも
ってさらに詳しく説明する。

（実施例） （１）RNA抽出 正常成人末梢血（130人分、９リットル）よりデキス
トラン法を用いて白血球分画を分離し、シャーグインの
方法（Chirgwin,J.M.ら、Biochemistry,18,5294,1979）
に従い、5Mグアニジウムイソチオシアネート存在下でホ
モジェナイズし、CsCl密度勾配遠心法により2.6mgのRNA
を調製した。次に全量のRNAより0.5M LiCl,10mM EDTA,
0.5％ SDSを含む10mMトリス塩酸（pH7.2）を結合バッフ
ァーとして用いオリゴdTセルロースに結合したメッセン
ジャーRNA（poly（Ａ）⁺）57μｇを調製した。

（２）cDNAライブラリー作製 上記のpoly（Ａ）⁺RNA 5μｇをテンプレート、４μｇ
のオリゴ（dT）12−18をプライマーとし、逆転写酵素を
用いてファーストストランドcDNAを合成し、大腸菌（E.
coli）RNase Hで鋳型のRNAを消化し、DNAポリメラーゼ
ＩでセカンドストランドcDNAを合成した。さらにT4ポリ
メラーゼのエキソヌクレアーゼ活性で２本鎖cDNAを平滑
端末化し、２本鎖cDNAを合成した。以上までの操作は合
成システム・プラス（Amersham,U.S.A.:code RPN.1256Y
/Z）を用い、その説明書に従った。

次に、このcDNAをEcoRIメチラーゼでEcoRI部位を保護
し、EcoRIリンカー（Amersham,U.S.A.）をT4 DNAリガー
ゼを用いて連結した。そして制限酵素EcoRIで切断し、
バイオゲル（Bio gel）A50（BioRad,U.S.A.）に通し、E
coRI末端を有するcDNAを精製した。

続いて、λZAP R II/EcoRI/CIAP Vector KIT（Strata
gene,U.S.A.）を用いて、cDNAをT4 DNAリガーゼでλZAP
II EcoRIアームに連結し、λ−DNAインビトロ・パッケ
ージング・キット・ギガパック・プラス（in vitro Pac
kaging kit Gigapack Plus）（Stratagene,U.S.A.）でi
n vitroパッケージングを行い、cDNAライブラリーを作
製した。mRNA1μｇあたり、約80万個の組み換えファー
ジプラーク（cDNAライブラリー）が得られた。

（３）スクリーニング 前記（２）で得られた約200万個の組み換え体ファー
ジを宿主大腸菌BB4（ストラタジーン（US））に感染さ
せ、プレーティングし、プレート上にプラークを形成さ
せた後、ニトロセルロースフィルターにファージを吸着
させ、1.5M NaClを含む0.5M NaOHで30秒処理することに
より変性させ、3.0M NaClを含む0.5MTris（pH7.5）で15
分処理することにより中和後、風乾し、80℃で２時間焼
付けをした。

続いて先に取得したtumor NCA（Tawaragi Y.ら、Bioc
hem..Biophys.Res.Commun.,150,89−96,1988、大腸菌
（Escherichia coli）SBM294と命名され、工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第9687号（FERM P−96
87）として寄託されている）のＮ−ドメイン（domain）
のNcoI−Bgl II381bp断片を、ヘキサヌクレオチド、ク
レノウ断片、〔α³²P〕dCTP等を用いるマルチプライム
法で³²P標識してプローブを作製した。これにはDNAラベ
リングキット（labelling kit）（ニッポンジーン）を
使用し，その使用法に従った。このプローブと、上記の
フィルターに固定化されたDNA分子とのハイブリダイゼ
ーションを、以下のように行った。

先ずフィルターを３％スキムミルクと100μg/mlニシ
ン精子DNAを含む6X SSC中で65℃,3時間保温し、プレハ
イブリダイゼーションを行った。続いてプレハイブリダ
イゼーションを溶液に³²P標識プローブを加え、更に65
℃、16時間保温し、ハイブリダイゼーションを行った。
続いてフィルターを0.1％SDSを含む2x SSC,65℃で４回
洗浄し、風乾したのちオートラジオグラフィーにかけ
た。この操作で得られた約200個の陽性プラークから、1
00個のプラークを選択した。陽性プラークからのファー
ジを新たに宿主大腸菌BB4に感染させ99個の陽性プラー
クを得、それらを単離した。

（４）自動切り離し制限酵素地図 陽性クローンファージは、M13ヘルパーファージＲ−4
08（ストラタジーン）と宿主菌XL1−Blue（ストラタジ
ーン）を用いλZAP II（ストラタジーン）の自動切り離
しによりDNAインサートをpBlue−script SK（−）に組
み込ませた。

プラスミドDNAはアルカリーSDS法（Molecular Clonin
g（第２版）,J.Sambrookら,pl−25,CSH Lプレス,New Yo
rk）で調製した。

このプラスミドDNAを用いて制限酵素地図を作製し
た。使用した制限酵素はいずれもニッポンジーンのもの
で以下に示す。

・pBluescript SK（−） ポリリンカー酵素 SacI,XbaI,BamHI,SmaI,PstI,EcoRI,EcoRV,HindIII,Hi
ncII,SalI.XhoI,ApaI,KpnI ・ノンポリリンカー酵素 SphI,BalI,NcoI,NsiI,StuI,Bg1II 自動切り離し制限酵素地図（第1A,2A,3A,4A,5A及び6A
図）に於いて、DNA部分は白抜き箱型で示し、その上部
に制限酵素切断部位と当該酵素名を、下に数字でヌレオ
チド残基数を示した。横の矢印は配列解析の方向と範囲
を示している。

（５）サブクローニング DNAインサートをEcoRI部位で切り出し、pUCI18（宝酒
造）に組み込み、制限酵素地図をもとに適当な制限酵素
部位でサブクローニングを行った。制限酵素によりプラ
スミドを切断し、５′末端突出のものに対してはクレノ
ウフラグメント、３′末端突出のものに対してはT4 DNA
ポリメラーゼＩを使用し、平滑末端化し、T4 DNAリガー
ゼで両末端を連結した。このDNAをコンピテント細胞DH5
α（クロンテック（Clontech）（US））にトランスフォ
ーメンションし、アルカリ−SDS法でプラスミドDNAを調
製した。

（６）デレーション プラスミドDNAをインサートDNA側を５′末端突出もし
くは平滑末端になる制限酵素で、シークエンス時のプラ
イマーアニーリング側を３′末端突出になる制限酵素で
それぞれ切断し、エクソヌクレアーゼIIIで３′側から
５′側へ分解し、これを時間毎にサンプリングし、ヤエ
ナリ（Mung Bean）ヌクレアーゼで一本鎖DNA部分を切
断、さらにウレノウフラグメントで完全に平滑末端に
し、T4 DNAリガーゼで両末端を連結した。コンピテント
細胞DH5αにトランスフォーメンションし、アルカリ−S
DS法でプラスミドDNAを調製し、インサートDNAのサイズ
をEcoRI−Hindで切断して調べた。デレーションにはキ
ロシークエンス用デレーションキット（宝酒造）を使用
した。

（７）塩基配列の決定 上記のプラスミドDNA（pBluescript SK（−）,pUC11
8,サブクローニング、デレーションで得たプラスミドDN
A）をコンピテント細胞MV1184（宝酒造）とヘルパーフ
ァージM13 K07（プロメガ（Promega）（US））を使用し
て一本鎖DNAを調製した。

また一本鎖DNAを鋳型とし、相補的なオリゴヌグレオ
チドをプライマーとしDNAを５′側から３′側方向へ伸
長させるジデオキシ法を使用した。この操作にはSequen
ase（T7 DNAポリメラーゼ）を使用したシークエンシン
グキット（Sequencing Kit）（United States Biochemi
cal）を用いた。プライマーはpUC系プラスミドに対して
はシークエンシングプライマー（Sequencing Primer）,
M13（ストラタジーン）を、またpBluescript SK（−）
系プラスミドには、Reverse PrimerもしくはSK（−）Pr
imer（ストラタジーン）を使用した。また標識ヌクレオ
チドには〔α−³⁵S〕チオ−dATPを使用し両側から塩基
配列を決定した。

以下に塩基配列を決定するのに用いたプラスミドを示
す。尚、制限酵素断片の左側の制限酵素部位は、ポリリ
ンカー中の、右側は挿入DNA中の部位を示す。WBC236 プラスミドBluescript SK（−） （インサートDNA順向） プラスミドpUC118 （インサート逆向） ・サブクローニング プラスミドBluescript SK（−） （インサートDNA順向） BamHI−BamHI,XbaI−NcoI,SmaI−
SmaI デレーション プラスミドpUC118 （インサートDNA逆向） 使用制限部位 SphI,XbaIWBC264 プラスミドBluescript SK（−） （インサートDNA順向） プラスミドpUC118 （インサート逆向） ・サブクローニング プラスミドpUC118 （インサートDNA順向） XbaI−BglII,HincII−StuI デレーション プラスミドpUC118 （インサートDNA逆向） 使用制限部位 PstI,XbaIWBC282 プラスミドpUC118 （インサートDNA 順、逆向） ・サブクローニング プラスミドpUC118 （インサートDNA順向） PstI−PstI,SmaI−BalI デレーション プラスミドpUC118 （インサートDNA逆向） 使用制限部位 SphI,XbaIWBC211 プラスミドpUC118 （インサートDNA 順、逆向） ・サブクローニング プラスミドBluescript SK（−） （インサートDNA順向） PstI−PstI,BamHI−BamHI,SacI−
SacI XbaI−NsiIWBC233 プラスミドpUC118 （インサートDNA 順、逆向） ・サブクローニング プラスミドBluescript SK（−） （インサートDNA順向） PstI−PstI,BamHI−BamHI プラスミドpUC118 （インサートDNA逆向） BamHI−BamHI,PstI−PstIWBC239 プラスミドpUC118 （インサートDNA 順、逆向） ・サブクローニング プラスミドBluescript SK（−） （インサートDNA順向） PstI−PstI,BamHI−BamHI,SacI−
SacI プラスミドpUC118 （インサートDNA逆向） BamHI−BamHI 各クローンの塩基配列とアミノ酸配列は、それぞれ第
1B,2B,3B,4B,5B及び6B図に示した。上段に塩基配列、下
段にはその塩基配列のコードするアミノ酸を三文字標記
で示した。右端の数字はそれぞれのクローンのcDNAの
５′−末端を１としたヌクレオチド残基数を、中程の数
字はCEA、NCA〔Oikawa S.ら、Biochem.Biophys.Res.Com
mun.142,511−518（1987）＆ Oikawa S.ら、Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.146,464−469（1987）〕を参考に推
定した成熟蛋白質のＮ−末端を１として数えたアミノ酸
残基数をしめす。一数字はシグナル配列に付けた。尚、
塩基配列はcDNAのセンスストランドのものである。

尚、クローンWBC211,WBC233,WBC236,WBC239,WBC264,W
BC282はそれぞれ大腸菌（Escherichia coli）SBM312、E
scherichia coli SBM313、Escherichia coli SBM314、E
scherichia coli SBM315、Escherichia coli SBM316、E
scherichia coli SBM317と命名され、工業技術院微生物
工業技術研究所に各々、微工研菌寄第11510号（FERM P
−11510）、微工研菌寄第11511号（FERM P−11511）、
微工研菌寄第11512号（FERM P−11512）、微工研菌寄第
11513号（FERM P−11513）、微工研菌寄第11514号（FER
M P−11514）、微工研菌寄第11515号（FERM P−11515）
として寄託されている。

以下にcDNA各クローン及び、それら各クローンによっ
てコードされる蛋白質の性質を記述する。

（ｉ）W236（第1A及び1B図） 当クローンは３′−末端の18A残基を含めて1208残基
よりなり、３′−非翻訳領域UTRはポリＡの18A残基を含
む全ての領域、５′−UTRも97ヌクレオチドを有する、
下に説明するような蛋白質をコードするメッセンジャー
RNAの殆ど全域を代表するものである。ヌクレオチド112
4−1129に所謂ポリＡシグナルAATAAA配列をもつ。ヌク
レオチド98−829の翻訳枠（オープンリーディングフレ
ーム、ORF）は34アミノ酸よりなるシグナル配列及びそ
れに続く210アミノ酸よりなる総アミノ酸数244の新規な
蛋白質プレープローW236をコードする。プローW236は既
知のCEAファミリーメンバーとの比較により、Ｎ−末よ
り順に、108アミノ酸よりなるＮ−ドメイン、102アミノ
酸よりなる細胞膜貫通領域−細胞内ドメインとよりな
る。Ｎ−グリコシル化可能アスパラギン残基は、Ｎ−ド
メインには４個あり、細胞膜貫通領域−細胞内ドメイン
及びシグナル配列には無い。

（ii）W264（第2A及び2B図） 当クローンは３′−末端の110A残基を含めて1259残基
よりなり、３′−UTRはポリＡの110A残基を含む全ての
領域、５′−UTR末端も74ヌレオチドを有する、下に説
明するような蛋白質をコードするメッセンジャーRNAの
殆ど全域を代表するものである。ヌクレオチド1128−11
33に所謂ポリＡシグナルAATAAA配列をもつ。ヌクレオチ
ド75−830のORFは34アミノ酸よりなるシグナル配列及び
それに続く218アミノ酸よりなる総アミノ酸数252の新規
な蛋白質プレープローW264をコードする。プローW264は
既知のCEAファミリーメンバーとの比較により、Ｎ−末
より順に、108アミノ酸よりなるＮ−ドメイン、110アミ
ノ酸よりなる細胞膜貫通領域−細胞内ドメインとよりな
る。Ｎ−グリコシル化可能アスパラギン残基は、Ｎ−ド
メインには４個あり、細胞膜貫通領域−細胞内ドメイン
及びシグナル配列には無い。

（iii）W282（第3A及び3B図） 当クローンは３′−末端の68A残基を含めて1587残基
よりなり、３′−UTRはポリＡの68A残基を含む全ての領
域、５′−UTRも61ヌレオチドを有する、下に説明する
ような蛋白質をコードすメッセンジャーRNAの殆ど全域
を代表するものである。ヌクレオチド1498−1503に所謂
ポリＡシグナルAATAAA配列をもつ。ヌクレオチド62−59
2のORFは34アミノ酸よりなるシグナル配列及びそれに続
く143アミノ酸よりなる総アミノ酸数177の新規な蛋白質
プレープローW282をコードする。プローW282は既知のCE
Aファミリーメンバーとの比較により、Ｎ−末より順
に、108アミノ酸よりなるＮ−ドメイン、tumer NCAのド
メイン−ＩのＮ末配列と極めて類似した35アミノ酸より
なるＣ−末ドメインとよりなる。Ｎ−グリコシル化可能
アスパラギン残基は、Ｎ−ドメインには２個、Ｃ＝末様
ドメインに１個あり、シグナル配列には無い。

（iv）W211（第4A及び4B図） 当クローンは３′−末端の17A残基を含めて1759残基
よりなり、３′UTRはポリＡの17A残基を含む全ての領
域、５′−UTRも64ヌレオチドを有する、下に説明する
ような蛋白質をコードするメッセンジャーRNAの殆ど全
域を代表するものである。３′−UTRには所謂ポリＡシ
グナルAATAAA配列をもたない。ヌクレオチド65−1315の
ORFは34アミノ酸よりなるシグナル配列及びそれに続く3
83アミノ酸よりなる総アミノ酸数417のプレ−プロ−W21
1をコードする。プロ−W211は既知のCEAファミリーメン
バーとの比較により、Ｎ−末より順に、108アミノ酸よ
りなるＮ−ドメイン、92アミノ酸よりなるA1,86アミノ
酸よりなるB1,92アミノ酸よりなるA2ドメインとよりな
る。Ｎ−グリコシル化可能アスパラギン残基は、Ｎ−ド
メインより順に、３、５、５、７個あり、シグナル配列
には無い。

（ｖ）W233（第5A及び5B図） 当クローンは３′−末端の14A残基を含めて1797残基
よりなり、３′−UTRはポリＡの14A残基を含む全ての領
域、５′−UTRも103ヌクレオチドを有する、下に説明す
るような蛋白質をコードするメッセンジャーRNAの殆ど
全域を代表するものである。３′−UTRには所謂ポリＡ
シグナルAATAAA配列をもたない。ヌクレオチド104−106
6のORFは34アミノ酸よりなるシグナル配列及びそれに続
く287アミノ酸よりなる総アミノ酸数321のプレ−プロ−
W233をコードする。プロ−W233は既知のCEAファミリー
メンバーとの比較により、Ｎ−末より順に、108アミノ
酸よりなるＮ−ドメイン、92アミノ酸よりなるA1,86ア
ミノ酸よりなるB1ドメインとよりなる。Ｎ−グリコシル
化可能アスパラギン残基は、Ｎ−ドメインより順に、
３、６、５個あり、シグナル配列には無い。

（vi）W239（第6A及び6B図） 当クローンは３′−末端の12A残基を含めて1631残基
よりなり、３′−UTRはポリＡの12A残基を含む全ての領
域、５′−UTRも75ヌレオチドを有する、下に説明する
ような蛋白質をコードするメッセンジャーRNAの殆ど全
域を代表するものである。３′−UTRには所謂ポリＡシ
グナルAATAAA配列をもたない。ヌクレオチド76−1128の
ORFは34アミノ酸よりなるシグナル配列及びそれに続く3
17アミノ酸よりなる総アミノ酸数351のプレ−プロ−W23
9をコードする。プロ−W239は既知のCEAファミリーメン
バーとの比較により、Ｎ−末より順に、108アミノ酸よ
りなるＮ−ドメイン、92アミノ酸よりなるA1,86アミノ
酸よりなるB1、31アミノ酸よりなる不完全なA2ドメイン
とよりなる。Ｎ−グリコシル化可能アスパラギン残基
は、Ｎ−ドメインより順に、３、６、５個あり、シグナ
ル配列には無い。

尚、（iv），（ｖ），（vi）に記載したクローンは
（iv），（ｖ），（vi）に記載した蛋白質をコードする
メッセンジャーRNAのcDNAクローンであり、これらの遺
伝子配列は、第７図に示した様にBGP−Ｉの染色体遺伝
子の選択スプライシングにより新しいドメインの組み合
わせによる新しい蛋白質が生合成されたものであり、顆
粒球NCAグループに属すると思われる。

（発明の効果） （１）本発明の遺伝子を使用して６種のヒト顆粒球NCA
または種々のヒト顆粒球NCAフラグメントを細胞（大腸
菌、酵母、動物細胞等）で発現させ大量に調製すること
が可能になった。その結果得られるヒト顆粒球NCAある
いはヒト顆粒球NCAフラグメントを用いて抗CEA抗体を吸
収することにより、CEA特異抗体を得ることができる。

（２）本発明によりCEA、tumor NCAと顆粒球NCAの構造
上の違いが明確になった。例えば、顆粒球NCAのアミノ
酸７−10の配列は、CEA及びtumor NCAのどのドメインの
それに対応するアミノ酸配列とも異なっている。従っ
て、この部分を含むペプチドフラグメントを遺伝子工学
的手法あるいは合成法を用いて作製し抗原として用いれ
ば、CEA、tumor NCAと顆粒球NCAを区別する抗体を得る
ことが可能である。さらに詳細に比較することにより、
各抗原を区別する特異抗体を得ることが可能である。

（３）前記のとおり、本発明者によりヒトCEAおよびそ
れぞれのNCAに特異的な抗体の作製が可能となるため、
癌の診断、例えば癌のスクリーニング、確定診断、癌の
進行度判定、治療のモニタリング、標識抗CEA抗体によ
る癌の局在診断が可能となり、加えてミサイル療法など
の治療にも利用することが期待される。

（４）本発明により、CEAおよびそれぞれのNCAに特異的
なDNAプローブの調製が可能となる。このようなプロー
ブを用いれば、従来抗体を用いた免疫組織化学的手段に
代えて、ヒトCEAを産生する腫瘍等の組織を、インスイ
トゥー（in situ）ハイブリダイゼーションによって、
より特異的に検出することも可能と考えられる。

以上のように本発明の使用分野は多岐にわたり、その
利用価値は大きい。

【図面の簡単な説明】

第1A図は、本発明によるクローンW236の自動切り離し制
限酵素地図であり、塩基配列解析戦略をも示している。 第1B図は、本発明によるクローンW236のcDNA配列のアミ
ノ酸および塩基配列を示す図である。 第2A図は、本発明によるクローンW264の自動切り離し制
限酵素地図であり、塩基配列解析戦略をも示している。 第2B図は、本発明によるクローンW264のcDNA配列のアミ
ノ酸および塩基配列を示す図である。 第3B図は、本発明によるクローンW282の自動切り離し制
限酵素地図であり、塩基配列解析戦略をも示している。 第3B図は、本発明によるクローンW282のcDNA配列のアミ
ノ酸および塩基配列を示す図である。 第4A図は、本発明によるクローンW211の自動切り離し制
限酵素地図であり、塩基配列解析戦略をも示している。 第4B−１図および第4B−２図は、一緒になって本発明に
よるクローンW211のcDNA配列のアミノ酸および塩基配列
を示す一連の図である。 第5A図は、本発明によるクローンW233の自動切り離し制
限酵素地図であり、塩基配列解析戦略をも示している。 第5B−１図および第5B−２図は、一緒になって本発明に
よるクローンW233のcDNA配列のアミノ酸および塩基配列
を示す一連の図である。 第6A図は、本発明によるクローンW239の自動切り離し制
限酵素地図であり、塩基配列解析戦略をも示している。 第6B−１図および第6B−２図は、一緒になって本発明に
よるクローンW239のcDNA配列のアミノ酸および塩基配列
を示す一連の図である。 第７図は、本発明によるクローンW211,W233,W239のメッ
センジャーRNAが如何にGBP−Ｉの染色体遺伝子から選択
スプライシングにより、生成するかを示した模式図であ
り、白抜き及び斜線長方形はそれぞれBGP遺伝子及び、W
211,233,239のmRNA中のエクソン部分を示し、横線はイ
ントロンの一部を示し、各エクソン部分をつなぐＶ字状
の線はスプライシングを示し、そして打点長方形は３′
−UTRを示す。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C07K 14/00 ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】第1B図の第98番目の塩基Ａから第829番目
   の塩基Ｔまでの塩基配列を有するcDNA。
2. 【請求項２】第1B図の第200番目の塩基Ｃから第829番目
   の塩基Ｔまでの塩基配列を有するcDNA。
3. 【請求項３】第2B図の第75番目の塩基Ａから第830番目
   の塩基Ｔまでの塩基配列を有するcDNA。
4. 【請求項４】第2B図の第177番目の塩基Ａから第830番目
   の塩基Ｔまでの塩基配列を有するcDNA。
5. 【請求項５】第3B図の第62番目の塩基Ａから第592番目
   の塩基Ｇまでの塩基配列を有するcDNA。
6. 【請求項６】第3B図の第164番目の塩基Ａから第592番目
   の塩基Ｇまでの塩基配列を有するcDNA。
7. 【請求項７】請求項１〜６のいずれか１項に記載のcDNA
   によりコードされるアミノ酸配列を有するヒト顆粒球由
   来の癌胎児性抗原関連抗原。