JPH04501063A - タイプα血小板由来増殖因子レセプター遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 αタイプ血小板誘導成長因子レセプター遺伝子技術分野 本発明は血小板誘導成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ＤｅｒｉｖｅｄＧｒｏｗｔｈ 　Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ））のためにレセプター蛋白質をコードし、特にヒト の血小板中に見出されるｐｏｃｐの主要１　な型に好んで結合するレセプター蛋 白質をエンコードするヒト遺伝子に関する。また、本発明は組換細胞によるこの ようなＰＤＧＦレセプター遺伝子成長物の合成及びこれらのレセプターをエンコ ードするＤＮＡの同定及びクローニングによって可能とされた他のいくつかの新 規成長物の製造及び使用にも関する。

背景技術 成長因子およびそのレセプターをエンコードする遺伝子は正常な細胞増殖及び成 長のｌ１節に密接な関係を有する。このような遺伝子の発現に影響する遺伝的変 化が悪性化を伴う細胞増殖の変化の一因となる可能性を示す証拠も増加している 。若干の腫瘍遺伝子の正常な同族体がチロシンキナーゼ活性を有する膜伸張成長 因子をエンコードする（Ｊ、　Ｄｏｗｎｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、＋　５ｃｉｅｎ ｃｅ３０７．５２Ｎ１９Ｂ４）；　Ａ、Ｕｌｌｒｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃ ｉｅｎｃｅ　３０９．４１８（１９Ｂ４）；　Ｃ，Ｊ、５ｈｅｒｒ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｃｅ１ｌ　４１．６６５（１９８５）；Ｌ、Ｃｏｕｓｓｅｎｓ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３２０．２７７（１９８６））　、他の腫瘍遺伝子は、 成長因子により活性化された細胞増殖径路でも同じく作用しているように思われ る（Ｊ、Ｍ。

Ｂ１５ｈｏｐ、５ｃｉｅｎｃｅ　２３５，３０５（１９８５）：Ｒ，Ａ、Ｗｅｉ ｎｂｅｒｇ、５ｃｉｅｎｃｅ２３（Ｌ　７７０（１９８５）；　Ｓ、に、Ｈａｎ ｋｓ、　Ａ、）’１．Ｑｕｉｎｎ＋　Ｔ、Ｈｕｎｔｅｒ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２４１．４２（１９８８））、かくして、成長因子調節系一般 の知識の増加は、正常な成長調節および腫瘍形成の双方に決定的に関与する遺伝 子を更に理解するのに役立つことが期待される。

血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ　）は、それが正常な創傷治癒において主要な役 割を果すと考えられる結合組繊細胞の主要な分裂促進因子である故に、とりわけ 重要である。更にＰＤＧＦの異常な発現は癌ばかりでなく、種々の組織病理学的 症状、例えば動脈硬化症、関節炎、および繊維症にも関係している（Ｒ，Ｒｏｓ ｓ、　ＥＪ、Ｒａ１ｎｅｓ。

Ｄ、Ｐ、Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ、　Ｃｅ１１４６．１５５（１９８６））　。

ＰＤＧＦはＡｌ［およびＢｌ［と命名される２種のポリペプチド鎖のジスルフィ ド結合ダイマーから成る。ＡｌまたはＢ鎖または双方を含む３種の可能なダイマ ー構造がすべて天然に生ずる証拠が存在する（Ｒ，Ｐ、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　ｅ ｔａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２１＋　２７５（１９８３）；　Ｍ、ＤＪａｔ ｅｒｆｉｅｌｄｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３０４＋　３５（１９８３）； 　Ｋ、Ｃ，Ｒｏｂｂｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　３０５＋　６０５（１９８３）；Ｃ，−Ｈ，Ｈｅ１ｄｉｎ　ｅｔ 　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ３１Ｌ　５１１（１９８６）；　Ｐ、５ｔｒｏｏｂａｎ ｔ　ａｎｄ　Ｍ、ＤＪａｔｅｒｆｉｅｌｄ。

ＥＭＢＯＪ、　３．２９６３（１９８４））　、成長因子の種々のダイマーの型 は１イソフオーム（ｉｓｏｆｏｒｓ＋）”と呼ばれる０種々の正常および腫瘍細 胞はＡ鎖またはＢ鎖を特異的に発現するように思われる。それにもかかわらず生 理学的な調節過程において最も大切なヒトのインフオームはヒト血小板から分離 されたイソフオーム、即ち、ＡＢヘテロダイマー（即ち１個のＡおよびＢｌｊを 含むダイマー　；　Ａ、　Ｊｏｈｎｓｓｏｎ　、　Ｃ，−Ｈ，Ｈｅ１ｄ　ｆｎ　 、　Ｂ、Ｗｅｓ　ｔｅｒｍａｒｋ＋　Ａ、　Ｗａｓｔｅｏｎ＋Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１０４＋　６６（１９８２））　であ ると信じられている。

ＰＤＧＦ−Ａ鎖およびＢｌｌは、区別可能な特性を有する（Ｐ、Ｂｅｃｋｍａｎ 　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４１．１３４６（１９８Ｂ））、　Ａ鎖 の方がＢ［よりもはるかに能率的に分泌され、かつより低い比分裂促進活性を発 揮する。　ＰＤＧＦのＢ鎖遺伝子は、サルの肉腫ウィルス誘導ｖ−ｓｉｓ腫瘍遺 伝子のヒトにおける正常同族体であることが示されている。更にＰＤＧＦレセプ ターを有する細胞タイプにおいてＢ１１１が発現することにより、これらの細胞 が悪性化への道すじをたどる可能性の証拠が発見されてきている。　Ｂｌｉに比 してＡｌｌは培養マウス（ＮＩＩＩ／３↑３）細胞の腫瘍性形質転換の誘導性は 低い。

マウス、またはヒト繊維芽細胞を使用してＰＤＧＦのイソフオームの結合および 拮抗力を基礎とする最近の研究では、ＰＤＧＦレセプター（ＰＤＧＦ−Ｒ）に２ 種のサブタイプの存在することが暗示されている（Ｃ，−Ｈ，）Ｉｅｌｄｉｎ　 ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　Ｌ　１３８７（１９８Ｂ）；Ｃ，Ｅ、Ｈａｒｔ　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０、１５２９（１９８８））、これらの研究は 、Ｂ鎖ダイマーと選択的に結合する１個のレセプターのサブタイプと、ＰＤＧＦ 分子のすべてのイソフオームと能率的に結合する今１つのレセプターのサブタイ プが存在するという仮説と符号している。しかし、これらの研究の結果は、この ようなレセプターに関連した病気の研究と究極的治療についての異なった意味を もつ２つの別個の可能性（即ちこれらのサブタイプは単一のＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子 が異なって処理されて生じた産物として現われたのかまたこれらは別個の遺伝子 の成長物なのか）を識別することができなかった。

更に、既に同定されているヒトＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子によって成長されたレセプタ ーの種々のＰＤＧＦイソフオームの結合に関して、見解は統一されていない０発 現ベクターによりＰＤＧＦ遺伝子を種々のＰＤＧＦレセプターを欠除するタイプ の細胞に導入することによって、ＰＤＧＦ−ＢＢの選択的結合（Ｒ，Ｇ、に、Ｇ ｒｏｎｗａｌｄ　ｅｔ　ａｉ、＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８８．３４３５（１９８８）；　Ｌ、Ｃ１ａｅｓ ｓａｎ−Ｗｅｌｓｈｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１）、　Ｂｉｏｌ、　８． ３４７６（１９８８））、または、その代りに、３種のイソフオームのすべてに よる効率のよい結合（Ｊ、Ａ、Ｅｓｃｏｂｅｄｏ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎ ｃｅ　２４０＋１５３２（１９８８））に導く方法が報告されている。この結果 のバラツキの根拠は不明である。

このような訳で、既知のＰＤＧＦレセプターの異ったＰＤＧＦのイソフオームに 対して、また特にヒトＰＤＧＦの主要なＡＢヘテロダイマー型に対して反応する 能力に間して不確実性がある。報告された相異点に関しては、既知のＰＤＧＦ− Ｒ遺伝子成長物の翻訳後の処理が細胞特異的に異なるか、または細胞の成るタイ プにおいては附属蛋白質が存在することによって説明されるであろう。

その他としては、種々の研究で報告されている結合特性がそれぞれ異なる点は、 異なったＰＤＧＦレセプターをエンコードする２種の異った遺伝子の存在によっ て説明されるであろう。

上述のＰＤＧＦリガンドおよびレセプター活性の複雑性、およびその際影響され る正常な創傷治癒及び結合組織の異常状態、例えば腫瘍の成長、動脈硬化症、関 節炎および繊維症からなる関連した過程を考えてみると、結合組織の成長の調節 の機構に関する知識および解析の改善を提供する方法と構成、およびバイオアッ セイに対する必要性、また、究極的には内包されるＰＤＧＦレセプターにもとづ く新規の診断および治療法に対する必要性の存在することは明白である。

上述の観察は特にＰＤＧＦレセプター成長の遺伝学的基礎を徹底的に分析するこ とがとりわけ必要であることを示している。更に、チロシンキナーゼ活性を有す る膜伸張成長因子レセプターをエンコードする遺伝子族、すなわち既知のＰＤＧ Ｆレセプター遺伝子およびｂｉｔおよびｊｍｓの腫瘍遺伝子からなる遺伝子族の 新規の関連メンバーを、保存されたチロシンキナーゼをエンコードする領域をプ ローブとして利用することによって同定し、またクローニングできることは既に 示されている（Ｃ，Ｒ，Ｘｉｎｇ、　Ｍ、Ｈ，Ｋｒａｕｓ＋　Ｓ、Ａ、Ａａｒｏ ｎｓｏｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２’１９７４（１９８５）；　Ｇ、Ｄ、　Ｋｒ ｕｈ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４＋　１５４５（１９８６））　 。

従って、本発明は主要なヒトＰＤＧＦの支配的なエフェクターと思われるＰＤＧ Ｆレセプター蛋白質の成長法を発展させかつ上述のニーズを遂行するために組換 えＤＮＡ技術を応用することを企図している０本発明はまた、治癒および病理学 的過程に関連したこれらのレセプターの分子メカニズムの応用も企図している。

特に、既知のＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子と関連するが、異なっており並びにまた他のＰ ＤＧＦ−Ｒ，ｋｉｔおよびｊｔａｓ遺伝子からなるチロシンキナーゼ遺伝子族の メンバーと関連するが異なっている新しいヒト遺伝子のコード配列を分離同定す ることが本発明の目的である。更に本発明の目的は、ＰＤＧＦを含む生理過程に おいてＰＤＧＦの既知および新規の型の相対的役割を樹立するのに必要とされる 分子レベルの道具となるものを開発することである。

発明の開示 本発明は他のペプチド因子を含有しない新規のｐｏｃｐレセプター（ｐｏｃＦ− Ｒ）蛋白質の成長を含む組換ＤＮＡ技術の開発に関する。新しいＤＮＡセグメン ト、ＲＮＡ　、およびバイオアッセイ法もまた包括する。

特に本発明は、部分的には、ＤＮＡセグメントに関し、以下の既知のレセプター 遺伝子、即ち、ＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子と、コロニー形成促進因子−ルセプタ−（ｃ ｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ ：　Ｃ３ＦＩ−Ｒ）遺伝子Ｃｆ＊ｓ　Ｉ！瘍遺伝子のある細胞型、ｃ−ｊｍｓと しても知られる）と、ｋｉｔ　［１瘍遺伝子の細胞型Ｃｃ−ｂｉｔ　（Ｃ，Ｊ、 ５ｈｅｒｒｅｔ　ａｌ、＋　Ｃｅ１ｌ　４１＋　６６５（１９８５）；　Ｌ、Ｃ ｏｕｓｓｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　３２０＋　２７７（１９８６）；　Ｙ、Ｙａｒｄｅｎ　ｅｔ　ａ ｌ−＋　Ｎａｔｕｒｅ３２３＋　２２６（１９８６）；　Ｐ、Ｂｅｓｍｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３２Ｌ　４１５（１９８６）；　ソ、Ｙａｒｄｅ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、６．　３３４Ｎ１９８７））とからなる膜伸張 チロシンキナーゼレセプター遺伝子のサブファミリーの内で新しいヒトレセプタ ーの構造的および／または機能性に特徴を有するメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ Ａ）および蛋白質をエンコードするＤＮＡセグメントに関する。

より具体的には、本発明は、この成長因子レセプターのサブファミリーに属する 別のレセプターに構造的に類似している予測された蛋白質成長物とともに、ゲノ ムＤＮＡ配列または該ゲノムＤＮＡから転写された５ＲＮＡに相補的なりＮＡ配 列を（すなわち、ｃＤＮＡ　）含有するＤＮＡセグメントを含む。これらのレセ プターの中でも、予測された新しい遺伝子成長物は、既知のＰＤＧＦレセプター に対して最も近い配列相同性を示す。

更に本発明のＤＮＡによってコードされた新規の成長物は、正常な種々のタイプ の細胞において既知のＰＤＧＦレセプター遺伝子成長物とともに発現される。該 蛋白質成長物はＰＤＧＦに結合でき、また機能性にＰＤＧＦによって活性化され 得る。しかし、種々のＰＤＧＦのイソフオーム（ｉｓｏｆｏｒ■）の活性は、こ こでタイプαヒトＰＤＧＦレセプターと命名する新しい成長物を、既に同定され ているＰＤＧＦと結合できるレセプターをエンコードする遺伝子の成長物（以前 にＰＤＧＦレセプターと呼ばれ、かつここでタイプβＰＤＧＦ　レセプターと命 名された既知のレセプターを含む）から機能的に区別する。更にここに開示する 相当な証拠から、この新しい遺伝子成長物のタイプαＰＤＧＦ　レセプターは、 人体における最も豊富な型のＰＤＧＦに対する活性の主要なエフェクターである ことが示される。

本発明の一実施例の実施に際して、ＤＮＡセグメントは適当な宿主細胞中で発現 され、その結果、新規のＰＤＧＦレセプター蛋白質を成長できる０本発明はまた 、本発明のＤＮＡセグメントのセンスｌｉ　（ｓｅｎｓｅ　５ｔｒａｎｄ）の転 写の結果として成長されたｍＲＮＡにも関する。更に本発明は、本発明のＤＮＡ セグメントに関連した遺伝子から成長されるヒト細胞における■ＲＮＡおよび蛋 白質の発現のレベルを決定するための新規のバイオアッセイ法を包含する。

主要な実施例において、本発明は以下に例示される如き新しいＰＤＧＦレセプタ ーをエンコードするＤＮＡセグメントを含む、すなわち本発明は、正常ヒト胸腺 ＤＮＡゲノムクローンであってここではＴｌｌ　ゲノムクローンと命名されるも のと、Ｔｌｌ　に含まれ、）ＩＦｌ、　１ｌＢ６．　ＥＦ１７およびＴＲ４と命 名された配列を含む細胞＊ＲＮＡのヒトｃＤＮＡクローンと、上述のヒトＤＮＡ セグメントのいずれかに対するハイブリッド形成によって検出され、既知のＰＤ ＧＦ関連レセプター遺伝子を含まないレセプター遺伝子をエンコードする関連Ｄ ＮＡセグメントとを含む。

Ｔｌｌ　クローンに関連するヒト遺伝子を今後Ｔｌｌ遺伝子と呼び、また“Ｔｌ ｌ”の言葉を形容詞として使用する場合は、“Ｔｌｌゲノムクローン”に特別言 及することがなければ、上述の本発明のＤＮＡセグメントのいづれかを含むこと を意味する。

今一つの実施例において、本発明はベクターと本発明のＤＮＡからなる組換ＤＮ Ａ分子に関する。これらの組換分子は、Ｔｌｌ　遺伝子関連のゲノムクローンま たはｃＤＮＡクローン及び次のベクターＤＮＡのいずれか　−即ちλフアージク ローニングベクターまたは挿入されたＤＮＡを哺乳類細胞中に発現できる発現ベ クター−からなる分子によって例示される。

なお、今一つ他の実施例において、本発明は、細胞、好ましくは哺乳類細胞であ って本発明のＤＮＡで形質転換した細胞を含む、更に本発明は、酵母細胞および 、バクテリア細胞を含む細胞、例えばＥ、ｃｏ目またはＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓの 細胞で、本発明のＤＮＡで形質転換した細胞を含む０本発明の今一つの実施例に よれば、形質転換ＤＮＡはこの細胞中において発現され、それにより本ＤＮＡ　 によってエンコードされたＰＤＧＦ−Ｒ蛋白質の量をこの細胞内において増加す ることができる。

また更に、本発明は、本発明のＤＮ＾の発現によりまたは本発明のＲＮＡの翻訳 によって作られた新規のＰＤＧＦ−Ｒ蛋白質を含む、これらのレセプターは機能 の研究に使用でき、更に生化学的および機能の分析、例えばレセプター定性的お よび定量的な結合アッセイのために精製することが可能である。

特に、これらのαタイプのＰＤＧＦレセプターは、ヒトＰＤＧＦの主要型を含む 種々のＰＤＧＦのイソフオームの潜在的類僚体（拮抗体（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ）またはアゴニスト）のレセプター結合および活性化活性をテストすることによ って、ＰＤＧＦとそのレセプターが含まれる異常な過程を含む症状の治療の開発 に使用できるであろう。

本発明のこの側面によれば、この新しいＰＤＧＰ−Ｒ蛋白質は本発明の“非変性 （ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ）″のＤＮＡおよび蒙ＲＮＡの蛋白質成長物であること が可能で、これらの蛋白質は変性されまたは遺伝子工学的に操作された蛋白質成 長物であることも可能である。　ＤＮＡ配列を工学的方法で変異させた結果とし て、変性されたＰＤＧＦ−１？蛋白質は、対応する天然の“野性型（ｗｉ　１ｄ −ｔｙｐｅ）”蛋白質とは、アミノ酸配列中に１個またはそれ以上の相異点を有 している。これらの相異点は、変性された遺伝子成長物に機能性な相異、例えば それらの製造部力の改善またはバイオアッセイでの使用に対する好適性を付与し うる。

本発明はまた、本発明のＤＮＡ関連遺伝子の発現検出のための新規のパイオア・ ンセイ法に関する。このような一つの実施例によれば、本発明のＤＮＡ　、特に 最も好しいＤＮＡ　は、既知のＰＤＧＦレセプター遺伝子のｗＲＮＡにさまたげ られることなく、タイプαＰＤＧＦ　レセプター関連のｍＲＮＡの特定のレベル を決定するプローブとして使用することができる。このようなバイオアッセイは 、例えば、種々のクラスの腫瘍細胞または結合組織の成長および／または治癒反 応における遺伝的欠陥の同定に有用であろう。

本発明は更に、本発明のＤＮＡセグメントまたは関連ＤＮＡによってエンコード されたペプチドに対して作られた新しい抗体類を含む０本発明のこの実施例にお いては、抗体類はモノクロナールまたはポリクロナール起源であり、また天然、 組換または合成化的方法によるＰＤＧＦレセプター関連ポリペプチドを使用して 成長される。これらの抗体は、このようなポリペプチドの配列を含むＰＤＧＦ− Ｒ蛋白質に特異的に結合する。望ましくは、これらの抗体は、αタイプのＰＤＧ Ｆレセプター蛋白質蛋白してのみ、またはその他の場合としてβタイプのＰＤＧ Ｆレセプター蛋白質にだけ結合する。また、本発明の望ましい抗体類は、その蛋 白質がそれの生来の（生物学的に活性の）コンホメーションで存在する場合にＰ ＤＧＦレセプター蛋白質に結合する。

本発明の抗体類の断片、例えば抗原結合活性を保持し、本技術分野において既知 の方法によって調製の可能なＦａｂまたはＦ（ａｂ）’断片もまた本発明の範囲 内に入る。更に本発明は、本発明の抗体類またはそれらの活性断片の薬剤として の配合よりなるが、これらは本技術分野において公知であるポリペプチドを投与 するための薬剤を調製する材料と方法を使用して調製でき、また余計な実験を行 うことなく本抗体類の投与に容易に適応することが可能である。

これらの抗体類、およびこれらの活性断片は、例えば、新しいαタイプのＰＤＧ Ｆレセプターか、またはその代りに既知のβタイプのＰＤＧＦレセプターのいづ れかを特異的な方法で検出し、あるいは精製するのに使用できる。また、かかる 抗体類は、高レベルのＰＤＧＦレセプターを有する組織に対して薬剤を集中させ るための本技術分野における既知の種々の方法において、例えば、このような抗 体と細胞を殺す薬剤との複合体を使用して適当な腫瘍を治療する際に、使用する ことができる。

図面の簡単な説明 第１図、ヒト胎盤および胸腺ＤＮＡにおけるｖ−ｆｌＩｓＰＤＧＦレセプター関 連遺伝子断片の検出、　ｖ−ｆａｓプローブ（Ａ）またはマウスＰＤＧＦレセプ タープローブ（Ｂ）をヒト胎盤（レーン１および３）または胸腺（レーン２およ び４）ＤＮＡに対して緊縮（５０％ホルムアミド；レーン１および２）または緩 和（３０％ホルムアミド；レーン３および４）ハイブリッド形成条件下のハイブ リッド形成、矢印は、ｖ−ｆｍｓおよびマウスＰＤＧＦ−Ｒプローブの双方によ る、緩和条件のもとで検出された１２−ｋｂｐＥｃｏＲＸ断片を示す。

第２図、λＴｌｌ　ゲノム断片並びにＴｌｌ　のｃＤＮＡおよびＰＤＧＦ−Ｒ遺 伝子の分子クローニング、制限地図：すなわちλＴｌｌゲノムクローン（実線） 　；Ｔｅｌ　ｃＤＮＡクローン（中実の棒）；およびＰＤＧＰ−ＲｃＤＮＡクロ ーン（中空の棒）。

ヌクレオチド配列解析によって決定された如く、３個の断片内のコード領域をａ 、ｂおよびＣとラベルされた黒い四辺形で示す。

第３−１〜３−１０図、　Ｔｌｌ　ｃＤＮＡヌクレオチドおよび予測されたアミ ノ酸配列、ヌクレオチドは左側に番号で示す、予測アミノ酸配列の長く開いた読 みとり枠をヌクレオチド配列の上部に示す、アミノ酸は、推定される開始コドン から始めてアミノ酸上部に番号を付す。

潜在的Ｎ末端シグナルの配列には下線を付す、Ｎ結合したグリコジル化の潜在的 部位には上部に線を付し、システィン残基は箱でかこむ、推定の単一膜透過領域 は斜線をつけた棒で示す、キナーゼ領域の潜在的ＡＴＰ結合部位はグリシンの６ ００．６０２および６０５残基上とリジンの６２７残基上にサークルで示す、チ ロシンの８４９残基の推定自動燐酸化部位は＊によって示す、ａ、ｂおよびＣの エキソンによって明示されたＴｌｌのゲノム配列の領域にはアンダーラインを付 す、ポリアデニル化されたｃＤＮＡの３′末端に近接したＡＡＴＡＡＡボックス も同様にアンダーラインを付す。

第４図、ヒドロパシシテ４　（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）プロファイルお よび他のＴｌｌ　レセプター様遺伝子成長物のチロシンキナーゼとの相似性（ｈ ｏｍｏｌｏｇｙ）　＊予測された蛋白質領域の略図は、シグナル配列（Ｓ；黒色 のボックス）、リガンド結合（Ｉ　ｉｇａｎｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ）　８Ｎ域（Ｌ Ｂ）、膜透過（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）　ｆ＋Ｉ域（丁ｈ；２番目の黒色 のボックス）、隣接膜（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ）　９５域（Ｊｌ’ｌ）、 チロシンキナーゼＣｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ）　６３域（ＴＫＩ、　Ｔ Ｋ２　ｉ点を打ったボックス）、インターキナーゼ（ｉｎｔｅｒ−ｋｉｎａｓｅ ）領域（［）およびカルボキシル末端（ｃａｒｂｏｘｙｌ　ｔｅｒｙｓ３ｎｕｓ ）（Ｃ）を示す。ヒドロバシシティーのプロファイルはＸｙｔｅおよびＤｏｏｌ ｉｔｔｌｅ（Ｊ、Ｋｙｔｅ　ａｎｄ　Ｒ，Ｆ、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ＋　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１５７．１０５（１９８２））の方法によって計算した。

相同性の百分率（ｈｏｍｏｉｏｇｙ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）　は各自の領域内 の同じアミノ酸類に関して示される。用語の省略形：ＩＲはインシュリンレセプ ター；　ＥＧＦ−１２は表皮成長因子レセプター；ＮＤは未確定。

第５図、　Ｔｌｌ　遺伝子の染色体マツピング、　（Ａ）Ｉ）Ｔｌｌ−Ｐプロー ブとの切片上ハイブリッド形成による正常ヒト染色体上の銀顆粒の分布（３，６ −ｋｂｐ　Ｐｓｔｌゲノム断片のクローン）（第１図参照）。（Ｂ）第４染色体 上の顆粒の分布。

第６図、Ｔ】１　および既知のＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子のｗＲＮ＾種の正常および腫 瘍細胞における比較。最初に同一のフィルターをｐＴｌｌ−ＨＰ（０，９５−ｋ ｂｐ　＃１ｎｄｌｌＩ−ＰＳｔｌゲノム断片）（Ａ）　からのプローブとハイブ リッドさせそれからＰＤＧＦ−ＲｃＤＮＡプローブ（Ｂ）で再びハイブリッドさ せた。

別のフィルターを最初Ｔｌｌ　ｃＤＮＡ　（エンコード領域全体を含むＴＲ４の ３．５−ｋｂｐ　ＢａｍＨＩ断片）でハイブリッドさせ（Ｃ）それからＰＤＧＦ −ＲｃＤＮＡ（ＨＰＲ２の３．８−ｋｂｐ　Ｎｔｉｅｌ断片）（Ｄ）で再びハイ ブリッドさせた。ＡおよびＢは、ヒト平滑筋（レーン１）、心ｌＩ（レーン２） 、肝臓（レーン３）、膵臓（レーン４）または胎児（レーン５および６）から抽 出したＲＮＡ　（レーン当り５μｇ）とｐｏｌｙ（Ａ）を含有していた。Ｃおよ びＤは、Ｇ４０２１ｅｉｏｓｙｏｂｌａｓｔｏ＠ａ細胞（レーン１　）　、ＳＫ −ＬＭＳ−１１ｅｉｏｍｙｏｓａｒｃｏ＊ａ細胞（レーン２　）　、Ａ１１８６ またはＡ２０４　ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ細胞（レーン３および４　 ）　、８３８７　ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｗａ細胞（レーン５　）　、ａｓｔｒｏ ｃｙｔｏｍａ　＆Ｉ織（レーン６および７）　、Ａ１６９０　ａｓｔｒｏｃｙｔ ｏｍａ細胞（レーン８　）、　Ａｌ２Ｏ？またはＡｌ７２　ｇ１ｉｏｂｌａｓｔ ｏ＊ａ細胞（レーン９および１０）またはＡ３７５　ｍｅｌａｎｏｍａ細胞（レ ーン１１）から抽出した全ＲＮＡ　（レーン当り２０　ｕ　ｇ）を含有した。２ ８Ｓおよび１８３　リボゾームＲＮＡ　（マーカー）の漉走は示す通りである。

第７図、ヒト細胞系（Ａ）およびＣＯ５−１細胞トランスフエクタント（Ｂ）に おける、ペプチドの抗血清によるＴｌｌおよびＰＤＧＦ−Ｒ蛋白質の検出、　（ Ａ）Ａ４２６　ヒト胎児繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）　（レーン１，４ ．７および１０）、８３８７　ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ細胞（レーン２．５． ８および１１）、Ａ２０４　ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｗａ細胞（レーン３ ，６．９および１２）　、（Ｂ）　ＣＯ５−１細胞（レーン１および４　）　、 Ｔｌ１ｃＤＮ＾（レーン２および３）またはＰＤＧＦ−ＲｃＤＮＡ（レーン５お よび６）を運ぶベクターにより移入されたＣＯ５−１細胞。

第８図、マウス対照区（ｃｏｎｔｒｏｌ）　ＮＩＩ（／３Ｔ３と、対照区ＣＯ５ −１と、Ｔｌｌ　または既知のＰＤＧＦ−ＲｃＤＮＡ発現ベクターにより移入さ れたＣＯ５−１細胞とへの目ｓ１でラベルされたヒトＰＤＧＦの結合、結果は３ つの試料による平均値（±ＳＤ）を表わす。

第９図、異ったＰＤＧＦイソフオームによって誘導されたタイプαおよびタイプ βのＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子成長物のチロシンの自動燐酸化（ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈ ｏｒｙｌａｔｉｏｎ）　、　Ａ２０４（ａ）　、８３８７（Ｂ）　、またはＮＨ ｆ／３Ｔ３（Ｃ）細胞を、ＰＯＧＦ−８８（３０ｎｇ／＋ｗｌ）　（レーン２） 、ヒトＰＤＧＦ　（３０ｎｇ／ｍｌ）　（レーン３　）　、ＰＤＧＦ−ＡＡ（３ ００ｎｇ／ｍ１）（レーン４）または３ｍＭ酢酸（媒体対照区（ｖｅｈｉｃｌｅ 　ｃｏｎｔｒｏｌ）　：レーン１）でインキュベートした。細胞溶解物（ｃｅｌ ｌ　Ｉｙｓａｔｅ）を予想されたタイプαまたはタイプβのＰＤＧＦレセプター （それぞれ抗丁ＩＨａｎｔｉ−丁］】）および抗ＨＰＲ（ａｎｔｉ−ＨＰＲ）） に対するペプチド抗血清によって免疫沈澱させた。免疫プロット解析（ｉｗｍｕ ｎｏｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）をレセプターまたはｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏ ｓｉｎｅ（ａｎｔｉ−Ｐ−Ｔｙｓ）（Ｊ、Ｊ、Ｗａｎｇ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ 。

Ｂｉｏｌ、　５．３６４０（１９８５））に対する抗体を用いてプロットの上に 示すように行った。矢印は免疫ペプチドの存在のもとでブロックされた特定のバ ンドを示す。

第１０図０種々の細胞、例えば（Ａ）マウスＮ１１ｌ／３Ｔ３；　（Ｂ）ヒトＭ ４２６；（Ｃ）ヒトＡＧ１５２３；　（Ｄ）　ヒトｈ４１３における、ＰＤＧＦ −ＡＢ（Δ）またはＰＤＧＦ−ＢＢ（０）によるＤＮＡ合成の刺激。

第１１図、それぞれｃＤＮＡをになうベクターを使用するトランスフエフシラン によりタイプα（開いた印）またはタイプβ（閉じた印）のＰＤＧＦレセプター で再構成されたしト　０３２細胞のレセプターとＰＤＧＦ−ＡＢ（Δ）またはＰ ＤＧＦ−ＢＢ（０）との結合、挿入図は、標準（セミログの）スキ中ツチャード ）　（Ｓｃａ　ｔｃｈａｒｄ）形式により再プロットされた同一のデータを表わ す。

第１２図、タイプα（上部パネル）またはタイプβ（下部パネル）　ＰＤＧＦレ セプターで再構成されたヒ）　Ｄ３２細胞によるＰＤＧＦ−ＡＢ（Δ）またはＰ ＤＧＦ−ＢＢ　（０）に対するＤＮＡ合成刺激反応。

第１３図、タイプα（上部パネル）またはタイプβ（下方パネル”）　ＰＤＧＦ レセプターにより再構成されたヒトＤ３２細胞によるＰＤＧＦ−ＡＢ　（Δ）ま たはＰＤＧＦ−ＢＢ（０）に対する走化性反応。

第１４図、タイプα（上方パネル）またはタイプβ（下方パネル）　ＰＤＧＦレ セプターで再構成されたヒトＤ３２細胞によるＰＤＧＦ−ＡＢ（Δ）またはＰＤ ＧＦ−ＢＢ（○）に対する燐酸イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ　ｐｈｏｓｐｈ ａｔｅ）形成およびサイドシルのカルシウムイオン起動（すなわち（Ｃａ”）ｉ ；データーは挿入図中）の反応。

具体例の説明 本発明のＤＮＡ　は、Ｔｌｌ　ゲノムのクローン、および、Ｔｌｌ　ゲノムのク ローンに含まれた配列を有する細胞ｍＲＮＡクローンのヒトｃＤＮＡクローンか らなるＨＦＩ、　ＢＢ６゜ＨＦＩ７およびＴＲ４クローンとここで呼ばれるＤＮ Ａによって例示される。

Ｔｌｌ　ゲノムのクローンおよびＴＲ４ｃＤＮＡクローンは、本発明における好 ましいＤＮＡである。ｐＴｌｌ−ＨＰ（ゲノムクｏ−７Ｔ１１　のＨｉｎｄ、１ １１−Ｐｓｔ■０．９５−ｋｂｐ断片）と命名されたクローンおよびＴｌｌ　ｃ ＤＮＡからの特定の制限断片（エンコードする全域を含むＴＲ４の３．５−ｋｂ ｐ　ＢａｍＨＩ断片）は、本発明の中で最も好ましいＤＮＡである。

ＨＦ１．　ＢＢ６．　ＨＦ１７およびＴＲ４のｃＤＮＡクローンの制限酵素によ る消化地図、およびこれらのゲノムクローンＴ１１に対するマツピングの関係を 第２図に表わす、ＴＩＪ遺伝子関連の最大のｃＤＮＡクローンである、ＴＲ４ｃ ＤＮＡクローンについてセンス＠　（ｓｅｎｓｅ　５ｔｒａｎｄ）　ＤＮＡヌク レオチド配列および予想され、エンコードされた主要蛋白質配列を第３図に示す 。

実験セクションで記載するように、Ｔｌｌ　ゲノムクローンは、制限酵素のＥｃ ＯＲＴの認識部位によって境界づけられた１２−ｋｂｐ配列を含む正常ヒト胸腺 ＤＮＡゲノム断片のクローンを含むが、その断片はウィルス腫瘍遺伝子ｖ−／ｆ ｍｓおよびマウスの細胞ＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子（第１図を参照）のチロシンキナー ゼ領域に由来するＤＮＡプローブと他の断片に比して、プロット法ハイブリッド 形成による分析に際してはるかに強くハイブリッドした（第１図参照）。Ｔｌｌ 　ゲノムのクローンは、ｍＲＮＡに見出されない介在遺伝子配列（すなわちイン トロン）に加えて、Ｔｌｌ　遺伝子の■ＲＮＡ成長物に見出される配列のブロッ ク（すなわちエキソン）のほとんどを含む。

本発明の他のＤＮＡは、本発明のＴＩ！関連のゲ２ツムまたはｃＤＮＡクローン および次のＤＮＡベクターのいづれか：例えばλバクテリオファージクローニン グベクター（例証としてλＥ　Ｍ　Ｂ　ｔ、４またはλｇｔｌｌ）　、または〔 挿入されたＤＮＡを哺乳類（例えば、ｃｏｓ−１）細胞において発現できる〕哺 乳類発現ベクター（例えば、猿のｓａｒｃｏｔｍａウィルスプロモータ・−を工 学的に組入れたｐＳＶ２ｇｐｔベクター）からなる組換分子を包含する。

ゲノムのクローンＴｌｌＤＮＡは、当該技術分野において公知の標準的な遺伝子 クローニング法により、すなわちＥｃｏＲＩで消化された正常ヒト胸腺ＤＮＡ　 （蔗糖密度勾配法によっ大きさが選別され、ＥＭＢＬ−４ベクター系へとクロー ン化されたちの）より構成されたゲノムライブラリーから分離された。λＴｌｌ 　クローンは、ｖ−ｆａｓおよびマウスＰＤＧＦ−Ｒプローブを用いるハイブリ ッド形成を基礎にして同定され、緩和されてはいるが緊縮されていないハイブリ ッド形成の条件のもとでのみ行なわれた。更なるクローニングの戦略およびプロ ーブの詳細を、以下およびそれにつづく実験セクションで提供する。

ｐＨＦｌと命名される、ＨＦＩ　ｃＤＮＡクローンを含むプラスミドは公知の標 準的方法により、本発明の中で最も好ましいＤｔＪＡのλＴｌｌ　の０．９−ｋ ｂｐ　ＨｉｎｄＴｌｌ−Ｐｓｔｌ断片を使用して０ｋａｙａ＠ａ−Ｂｅｒｇ発現 ベクターの中で、正常ヒト繊維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーから緊縮条件のもと で分離された。これは正常ヒト繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）における６ 、４−ｋｂＲＮＡ転写体にハイブリッドした３、９−ｋｂｐｃＤＮＡ挿入片を含 み、その３′末端にｐｏｌｙ（＾）尾部が後続しているポリアデニル化シグナル を含む、これはまたλＴｌｌＤＮＡ内にコード配列およびＣ５ＦＩ−Ｒ関連の１ ７０個のヌクレオチドおよびエキソン（ａ）上流のＰＤＧＦ−Ｒチロシンキナー ゼ領域を含む。

ｃＤＮＡクローンであるλＨＢ６　は、ヒト小児脳ｃＤＮＡライブラリーをλｇ ｔｌｌベクター中でスクリーニングするために、クローン１１　Ｆ　１の０．４ −ｋｂｐ５’末端を使用する標準的方法によって分離された。

今１つのｃＤＮＡクローンであるλＥＦ１７は、ｍＲＮＡの鋳型上でＤＮＡ合成 のランダムなブライミングおよびλｇｔｌｌベクター中のクローニングによって 調製されたヒト胎児繊維芽細胞（Ｍ４２６１胞系）のｃＤＮＡライブラリーをλ ）Ｉ８６の０．２−Ｋｂｐ５’断片をプローブとしてスクリーニングすることに よって分離された。可能なＡＴＧの開始コドンはＥＦ１７内部で同定された。

３種のオーバーラツプしたクローン（ｐＨＦｌ、λＨＢ６及びλＥＦ１７）は、 翻訳されない配列の１３８−ｂｐ５’および３′の３−ｋｂｐに加えて、全コー ド領域を含む（第２図）。

ｃＤＮＡクローンのＴＲ４は、”ｐｈａｇｅｍｉｄ″　（ファージとプラスミド のハイブリッド）ベクター中でＭ４２６ヒト胎児繊維芽細胞ｃＤＮＡライブラリ ーをスクリーニングするためにλＥＦ１７の５’０．２−ｋｂｐのサブフラグメ ントを使用して得られた（米国特許出願の内容、Ｎａ０７／３８６，０５３、標 Ｂ“効率的指向性クローニング系（ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ　５ｙｓｔｅｖ）”１９８９年７月２８日出ＩＩＩ）。

６．４−ｋｂｐ　ＴＲ４ｃＤＮＡクローンは、ヌクレオチド部位１３９において 可能なＡＴ開始コドンで始まり、３４０６部位のＴＡＡ終止コドンまで伸びる開 いた読みとり枠を含む（第３図参照）、更に最初の２３個のアミノ酸は、切断可 能な疎水性のシグナルペプチド特性を発揮した（第３図および第４図）、この開 いた読みとり枠には、翻訳されない配列の−３−ｋｂｐおよびｃＤＮＡの３′末 端のｐｏｌｙ（＾）配列からヌクレオチド２５個分上流に位置するポリアデニル 化シグナル（ＡＡＴＡＡ＾）が続いた。

ｃＤＮＡ発現プラスミドは、ヌクレオチドの１から３４５４迄（第３図）を包含 するＴｌｌ関連ｃＤＮＡをｐｓＶ２ｇｐｔベクター中に導入することにより当該 技術分野において公知の標準的クローニング法を使用して組立てられたが、ｐＳ Ｖ２ｇｐｔベクター中にはサルのｓａｒｃｏｍａ　ウィルスの長い反覆末端（Ｌ ＴＲ）が、以前に詳細に記載したようにしてプロモーターとして工学的に組入れ られた（Ｃ，Ｒ，Ｋｉｇ。

Ｎ、Ａ、Ｇｉｅｓｅ、に、Ｃ，Ｒｏｂｂｉｎｓ、　Ｓ、Ａ、Ａａｒｏｎｓｏｎ、 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　８２．５２９５（１９８５））。

本発明のＤＮＡおよびセンス鎖のＲＮＡ　は、当該技術分野において既知の蛋白 質成長方法と組合わせて、他のＰＤＧＦレセプターの不在の下で、新しい遺伝子 から機能性タイプαＰＤＧＦ−１？蛋白質を発現する細胞を作るために使用でき る。これらの新規のレセプターは、細胞における機能の研究、例えば定性および 定量のレセプター結合アンセイに使用できる。

従って、本発明のこの側面における実施例の１つは、好ましくは哺乳類の細胞で あって、本発明のＤＮＡにより形質転換され、そこにおいて形質転換ＤＮＡを発 現できる細胞を含む。’ｒｉｔ関連ｃＤＮＡを保持するｐＳＶ２ｇｐｔベクター で形質転換した哺乳類細胞（ｃｏｓ−１）は、公知の方法に従って調製され、１ ８５ｋｄおよび１６０ｋｄ種（ｓｐｅｃｉｅｓ）（第７Ｂ図）としてＴｌｌ遺伝 子成長物を発現することが示された。これらの成長物は、以下の実験セクション 第８図参照）に示される如く、血小板から分離されたヒトＰＤＧＦと結合するこ とができた。

実験セクションの他の研究によれば、本発明のＤＮＡは、ＰＤＧＦレセプターの 存在しない他の細胞中にタイプαＰＤＧＦレセプター遺伝子機能を再構成するの に使用可能で、また各々のαまたはβタイプのレセプターは、細胞分裂シグナル の形質導入、走化性およびホスホイノシチドのターンオーバーの刺激を含む既知 のＰＤＧＦの主要な活性を有効に仲介することが更に示されている。

更にこれらの研究によって、タイプαのＰＤＧＦレセプターが血小板由来のヒト ＰＤＧＦの主要な型に対する主なレセプターであることが明らかになっている。

かくして、遺伝子発現方法における本発明のＤＮＡ　。

特にここであげられた有利なＴＲ４ｃＤＮＡクローンをこのように使用すること によって、当該分野に習熟した人々は、ＰＤＧＦの調節過程のメカニズムを決定 し、新規なＰＤＧＦレセプター蛋白質を大量に成長するために、不要な実験をく りかえすことなく、本発明の範囲内の細胞系を構築することができる。

本発明は更に、本発明のＤＮＡに関連したの遺伝子の発現を検出するための新規 のバイオアッセイ法を含む。

このような実施例によれば、本発明のＤＮＡは関連−ＲＮＡのレベルを決定する プローブとして使用されうる。この実施例は、丁１１　のｍＲＮＡ種と正常およ び腫瘍細胞における既知のＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子の比較によって例証される（第６ 図）、全体またはポリアデニル化されたＲＮＡは、ホルムアルデヒド中での変性 ゲル電気泳動によって分離しくＨ，Ｄ、Ｌｅｈｒａｃｈ、Ｄ、Ｄｉａｓｏｎｄ＋ 　Ｊ、ＭＪｏｚｎｅｙ＋Ｈ，Ｂｏｅｄｋｅｒ＋Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６ ．４７４３（１９７７））、ニトロセルローズに移行し、緊縮条件のもとて３Ｉ Ｐでラベル゛したプローブでハイブリッドさせた。該プローブは、以下の本発明 のＤＮＡ　のいづれか、例えばクローンＰＴＩＩ−ＨＰ（ゲノムのクローンＴｌ ｌ　の０．９５−ｋｂｐ　ＨｉｎｄｌＴＩ−ＰｓｔＴ　断片）から；またはＴｌ ｌ　ｃＤＮＡ　（コード領域全体を含むＴＲ４の３．５−ｋｂｐＢａｗｒＨ１断 片）から調製した。

従って、本発明のＤＮＡおよびＲＮＡ　（特にここであげられた最も好ましいＤ ＮＡ　）を既知のハイブリッド形成法を使用することによりいわゆる当業者は、 無駄な実験をくりかえすことなく、タイプαのＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子の発現レベル を、タイプβのＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子または他の関連腫瘍遺伝子のｍＲＮＡから妨 害されることなく測定できる。

本発明はまた、本発明のＤＮＡセグメントまたは他の関連ＤＮＡによってエンコ ードされたペプチドに対する新規の抗体類を含む。本発明によるこの実施例は、 タイプαのＰＤＧＦ−Ｒ蛋白質またはその代りとして、ここではタイプβと命名 された既知のＰＤＧＦ−Ｒ蛋白質に特異的に結合する抗体類を含むウサギ抗血清 によって例証される。

かかるタイプ特異的な抗血清（ｔｙｐｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｒ＋ｔｉ−ｓｅ ｒａ）　は、それぞれのＰＤＧＦ−Ｒ蛋白質（第３図に示されたタイプα配列の ９５９−９７３残基およびそれぞれのｃＤＮＡ配列によって予測される、既知の 対応するタイプβ配列の９６７−９８１残基）のカルボキシル末端領域から１５ のアミノ酸配列を示す合成ペプチドに対１７て作られた。

これらのペプチドは、次の基準に合致するように選択された。即ち２種のＰＤＧ Ｆ−Ｒタイプ間の配列関連性の欠除（５０％以下の配列の相同性）；相対親水性 、およびもとの蛋白質と反応性の抗体を成長する比較的高い可能性と関連するこ とが知られているカルボキシル末端の配置である。

ペプチドに対する抗血清は、ペプチドを化学的に合成し、それらを担体（ｔｈｙ ｒｏｇｌｏｈｕｌｉｎ）に結合させ、かつペプチド免疫の標準の方法に従って、 完全なＦｒｅｕｎｄのアジュバントとともに、ペプチド結合体をウサギに注射す ることによって調製された。

これらの抗体は、蛋白質成長物の検出または精製に使用できる。かくして第７図 は、対応するタイプ特異的ペプチドに対して作られた２種の異ったウサギ抗体〔 抗Ｔｌｌ　（タイプαのＰＤＧＦ−Ｒ）および抗−ＨＰＲ（タイプβのＰＤＧＦ −Ｒ）　）の−ｅｓ　ｔｅｒｎ　プロット実験における使い方を示す、図から明 らかなよ・うに、特定のＰＤＧＦ−１’ｉり・イブは、合成ペプチドで免疫した ウサギ抗血清によって種々の細胞中に特異的に検出さｔ＋、る。

実験セフシラン 基セクションは、ＰＤＧＦレセブクー／Ｃ５ｉ’ｌ−１レセプターの・ナプノ１ ミリ−のレセプ々〜・に類似した新規な遺伝子のゲノム配列およびｃＤＮＡの同 定およびクローニングのための実験的研究につい″Ｃ記載す、点１１本遺伝子に よって正常ヒト組織中に既知の５．３−ｋｂ　１）ＤＧＦ　レセプター＊ＲＮＡ とともに発現する６、４−ｋｂＲＮＡ転写体を生ずる。

この新規のＰＤＧＦレセプター遺伝子は、、先祖関係のある染色体４および５の 上に存在するごのＬ−セブターサゾファミリーのその他の遺伝子のクラスタと両 立し、昧：包体４の４ｑｌｌ−１２の位置の染色体４に局在し、た。

クローンされたｃＤＮＡに機能性のあることば、ＣＯ５−１細胞に新規な遺伝子 のｃＤＮΔを導入することによって（ウィルスのベクターを使用するトランスフ ェクションによる）、蛋白質の発現が、予測されたベグーブ・トに対する抗血清 により特異的に検出されＳという観察結果によって示される。トランスフェクト されたが、対照区ではないＣＯ５−１細胞は、１′１〜ヒ）　ＰＤＧＦと特異的 結合を示すが、このＰＤＧＦはヒト血小板で見出された主要なＡＢ型を含む３種 のＰＤＧＦイソフオームのすべてによって有効に競合される。対照的に、ＣＯ５ −１細胞における既知のＰＤＧＦレセプターｃＤＮＡの発現は、ＰＤＧＦのＢＢ 型に対する顕著な選好性を特徴とする、同一のＰＤＧＦイソフオームによる異な った競合パターンを有するＰＤＧＦ結合を引きおこす。

新しいレセプター遺伝子が独特のＰＤＧＦレセプターを工：／コードするという 更なる証拠は、元来ＰＤＧＦレセプターのないヒトの細胞の調査に由来している が、その場合ＰＤＧＦレセプターの活性は、それぞれのＣｆ１ＮＡをになうベク ターを使用し、トランスフェクトすることによって導入されたタイプαまたはタ イプβのレセプターによって再構成される。タイプαのレセプターを有する細胞 は、以下のＰＤＧＦにより仲介ざｈ４る細胞活性のすべて、すなわちレセプター 遺伝子成長物のヂロシンの燐酸化、ＤＮＡ合成およびその結果とｂ″Ｃの細胞増 殖の刺部、走化性、トス７にイノシチド（ｐｂｃｓｐｔｉｏｉｐｏｓｉｔｉｄｅ ）のう）解、お・上びサイドシルのカルら／・シムの起動（（Ｃａ”　）　ｉ） において、ＰＤＧＦ−ＡＢに対し゛こ相当により高い反応性を有する。

かくして、再構成されたＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子成長物の各すのタイプば、ＰＤＧＦ −ＢＢに対して独自に同様な生化学的並びに生物学的反応を誘発するが、タイプ αのＰＤＧ！’−Ｒは、血小板に見出されるヒトＰＤＧＦの主要なイソ゛２オー ムであるＰＤＧＦ−ＡＢについてより好ましいし七ゲタ・−である。従って、タ イプαのＰＤＧＦレセプターの構造または発現の異常性は、深刻な病理学的影響 を有するであろうし、それに対して本発明は、診断および治療の手段を提供する 。

材料および方法 旦上肛　および　ＤＮＡに二史ｊノ〜」鼾二杢−とでＰＤＧＦ士セブ、−′−一 の　。ゲノムＤＮＡ　２０μｓをＥｃｏＲＩで消化し、０．８％のアガロースゲ ル中での電気泳動により分離して、ニトロセルローズ紙に移行させた（Ｅ、Ｍ、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ｍｅｄ、　Ｂｉａｓ、　９８＋　５０３（１９７５）） 　ｅ　”Ｐでラベルしたプローブに対するハイブリッド形成は（Ｐ、Ｗ、Ｊ、Ｒ ４ｇｂｙ、Ｍ、Ｄｉｅｃｋｅｒｍａｎ、　Ｃ，Ｒｈｏｄｅｓ、　Ｐ、Ｂｅｒｇ、 　Ｊ。

Ｍｅｄ、　Ｂｉｏｌ、　１１３．２３７（１９７７））、５０％または３０％の ホルムアミド、０．７５Ｍ　ＮａＣｌ、および０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム の溶液中で４２℃で行われた（Ｇ、ＭＪａｈｌ、　Ｍ、５ｔｅｒｎ。

Ｇ、Ｒ，５ｔａｒｋ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｄａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓ Ａ　７６、３６８３（１９７９））　、ハイブリッド形成後、プロットを室温で ２倍の５ＳＣ（０，３Ｍ　ＮａＣｌ；０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）で洗って から、５０°Ｃで０．１倍または０．６倍のＳＳＣ＜それぞれ緊縮または緩和条 件）で洗った。　ｖ−ｆｔａｓのプローブは、ｖ−ｊａｓ　１ｍ瘍遺伝子（Ａ、 Ｈａｍｐｅ、　Ｍ、Ｇｏｂｅｔ、　Ｃ，Ｊ、５ｈｅｒｒ＋　Ｆ。

Ｇａ１ｉｂｅｒｔ＋　Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　８Ｌ　８５（１９８４））　の３８９１から４４１９のヌクレオチ ドを包含する０、４４−ｋｂｐ　Ｘｈｏｌ−ＢｇＬＩＩ断片であった。マウスＰ ＤＧＦレセプターのプローブは、そのｃＤＮＡのヌクレオチド２４９０から２９ ９５を包含する０、５−ｋｂｐ　５ｉｎｌ−Ｐｖｕｌ断片であった（Ｙ。

Ｙａｒｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３２３＋　２２６　（１９８６ ））。

λＴｌｌ　°ツム　ＩＩびに丁１１　のｃＤＮ＾゛　びＰＤ旺」ｌ−の　ローニ ック。特定のｃＤＮＡクローン（カッコ中）が分離されたライブラリーは、例え ば０ｋａｙｓ＋ａ−Ｂｅｒｇベクター（ｐＨＦ）中のヒト繊維芽細胞＋ｍＲＮＡ 　Ａ　ｇｔｌｌ中のヒト幼児脳ｍＲＮＡ　（λ）ＩＢ）、λｇｔｌｌ中のヒト胎 児繊維芽細胞のランダムにプライムされたｍＲＮＡ　（λＥＦ）　、および指向 性クローニングｐｈａｇｅｍｉｄ　（ＴＲ４またはＨＰＲ）中のヒト胎児繊維芽 細胞ｍＲＮＡを包含した。制限部位は、−重および二重の消化による成長物を電 気泳動で分析することによって決定した。ｖ−ｊａｓまたはマウスのＰＤＧＦレ セプタープローブに対して相同のλＴｌｌ　領域は、第１図に記載したように、 ハイブリッド形成によって同定された。ｖ−／ｆｍｓおよびマウスＰＤＧＦレセ プタープローブに相同な領域を含む３個の制限断片（０，９５−ｋｂｐ＃ｆｎｄ ｌＩＩ−ＰｓｔＩ、０．５ｋｂｐ　Ａｖａｌ−５ａｃＴ　、および０．３５−ｋ ｂｐＫｐｎＩ−Ｘｂａｌ＞は、プラスミド中にサブクローンされたｄｉｄｅｏｘ ｙｌｌ終止方法（Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ、　Ｓ、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ａ、Ｒ，Ｃｏｕ ｌｓ。

ｎ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５４６３（ １９７７））によって配列が決定された。

：ｕＬＪＬｍ−の　マ・ピング、プローブを、変形ニック翻訳キット（Ａｍｅｒ ｓｈａｍ＋　ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅＡｒｌｌｎ、　Ｉｔ）を使用して、４種の ″Ｈヌクレオチド（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ＋ 　ＭＡ）すべてにより、比活性が２．５×１０’　ｃｐｓ／ｎｇＤＮＡになるよ うに、ラベルした。　ｗｅｔｈｏｔｒｅ−ｘａｔｅでシンクロナイズされたヒト 周辺部淋巴球培養体からのヒトのメタフ７−ゼおよびプロメタファーゼとの切片 上ハイブリッド形成を、以前記載されたようにして行った（Ｍ、Ｅ、Ｈａｒｐｅ ｒ　ａｎｄ　Ｇ、Ｆ、５ａｕｎｄｅｒｓ＋　Ｃｈｒｏｓｏｓｏｍａ（Ｒｅｒｌ、 ）８３．４３１（１９８１）；Ｎ、Ｃ，Ｐｏｐｅｓｃｕ　ｅｔ　ａｌ、＋ｃｙｔ ｏｇｅｎｅｔ。

Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ　３９．７３（１９８５））。

Ｎｏｒｔｈｅｒｎプロ・・　バイブ１　・　／　によるーＲＮ＾亘ｌ笠、全部ま たはポリアデニル化されたＲＮＡをホルムアルデヒド中で変性ゲル電気泳動の実 施によって分離しくＨ，Ｄ、　Ｌｅｈｒａｃｈ、　Ｄ、Ｄｉａｍｏｎｄ＋　Ｊ、 Ｍ、Ｗｏｚｎｅｙ、　Ｈ。

Ｂｏｅｄｔｋｅｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｘ６．４７４３（１９７７） ）、ニトロセルローズ膜に移して、！ｔｐでラベルしたプローブを用いてＶ！縮 の条件で（５０％ホルムアミド、０．０７５Ｍ　ＮａＣ１゜０．７５Ｍ　クエン 酸ナトリウム、４２°Ｃ）でハイプリントさせた。

ペプチド　゛によるＴＩＬＩ　びＰＤＧＦ−Ｒの−出−０抗Ｔｌｌ　（ａｎｔｉ −Ｔｌ　１）および抗ＰＤＧＦ−Ｒ血清（ａｎｔｉ−ＰＤＧＦ−Ｒ５ｅｒａ）を 、予想レセプターの対応するカルボキシル末端領域から１５個のアミノ酸ペプチ ドによりウサギを免疫することによって得た。これらのペプチド配列の相同性は 、５０％以下であった。ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ発現プラスミドをヌクレオチドの１〜３ ４５４を包含するＴｌｌ　ｃＤＮＡ（第３図）またはヌクレオチドの１〜３９３ ９を包含するＰＤＧＦ−ＲｃＤＮ八を、サルのＳａｒｃｏｍａ　ウィルスＬＴＲ がプロモーターとして工学的に組入れられたｐＳＶ２ｇｐｔベクター中に導入す ることによって組立てた（Ｃ，Ｒ，Ｋｉｎｇ、　Ｎ、Ａ、　Ｇｉｅｓｅ、Ｋ。

Ｃ，Ｒｏｂｂｉｎｓ、　Ｓ、Ａ、Ａａｒｏｎｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８２、５２９５（１９８５））　、　ｌ０ＣＩのベト リ皿に約１０６のＣＯ３−１細胞を、１０％の牛胎児血清を添加したＤｕｌｂｅ ｃｃｏの変法によるＥａｇｌｅの培地（ＤＭＥＭ）中で、トランスフェクシタン の２４時間前にインキュベートした。　ＤＮＡのトランスフェクシヨンは、燐酸 カルシウム沈澱法によって分析の４８時間前に実施された（Ｍ、Ｗｉｇｌｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　１１＋２２３（１９７７））、培養体を５ｔａｐｈ −Ａバンフｙ　（１０ｓＭ燐酸ナトリウムｐＨ７，５，１００ｍＭ　ＮａＣ１， １％↑ｒｉｔｏｎＸ−１００，０，１％ＳＤＳ、　０．５％ｄｅｏｘｙｃｈｏｌ ａｔｅ、　０．１％ａｐｒｏ−ｔｉｎｉｎ＋　１ｍＭＰＭＳＦ、および１ｗＭ　 ｓｏｄｉｕｍ　ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ）で溶解し曳１０．０００　ｘ　ｇ 、　３０分間の遠心分離により透明にした。蛋白質類（１００μｇ／レーン）を ７％のＳＯＳポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で溶解させ、ニトロセルロ ーズフィルターに移して、”’Ｉ−ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ（Ｈ，Ｔｏｗｂｉｒ＋Ｔ 。

５ｔａｅｈｅｌｉｎ＋　Ｊ、Ｇｏｒｄｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７６、４３５０（１９７９））を使用して免疫プロット 分析（ペプチドブロッキングを使用または不使用）によって調べた。

＋！Ｊで−ベル゛たヒトＰＤＧＦの　のレセプ　−に一対」二重」［金−０Ｃ０ Ｓ−１ｍ胞を１２ウエルのプレートにうえつけて、第７図に記載されているよう にアッセイ前の４８時間にトランスフェクトした。ヒトＰＤＧＦをｃｈｌｏｒａ ｗｉｎｅ−Ｔ法で１１５Ｉでラベルし、比活性を３．７　Ｘ　１０’ｃｐｍ／ｎ ｇとした（Ｌ　Ｍ、Ｈｕｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｆ、Ｃ，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ＋　Ｎ ａｔｕｒｅ　１９Ｃ４９５（１９６２））。ヒト血小板から分離されＩｔＳＩで ラベルされたＰＤＧＦの、５０〜１００倍過剰の未ラベルのヒトＰＤＧＦ　（Ａ Ｂ）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｆｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）または組換ヒトＰＤＧ Ｆ−Ｂｅ（ＡｍＧｅｎ）または組換ＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐ、Ｂｅｃｋｍａｎ　ｅｔ 　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ２４１、１３４６（１９８８））の不在または存在の もとにおける結合を（ＥＪ、Ｒａ１ｎｅｓ　ａｎｄ　Ｒ，Ｒｏｓｓ、Ｊ、Ｂｉｏ ｌ＋Ｃｈｅｗ　２５Ｌ　５１５４（１９Ｂ２））　、４℃で２時間行った。結合 しない目’ＩＰＤＧＦを、結合に用いた緩衝液で４回継続して洗うことによって 除去した（牛血清アルブミンをｍｌあたり１■ｇ含有するＤＭＥＭ）、続いて細 胞を可溶化緩衝液で（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐ Ｈ１，４，１０％［ｖ／ｖｌ　グリセロール）で溶解し、Ｔカウンターを使用し て放射能を測定した。

イ　α゛ＰＤＧＦ−１−〇　ロジン ｌＬ隣」［北、。ＰＤＧＦを加えて５分間３７℃でインキュベート後、細胞溶解 物を抗ペプチド抗血清によって免疫沈澱させた。全細胞溶解物または免疫沈澱物 を、レセプターまたはｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ　（抗−Ｐ−Ｔｙｒ）　 （Ｊｊ、Ｗａｎｇ、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ＋、５．３６４０（１９８５））に対する抗体を使用して、 免疫ブロン）　（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）法によって分析した。抗ｐｈｏｓｐｈ ｏｔｙｒｏｓｉｎｅ抗体を遮断用の１０ｍＭのｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓ　５ｎ ｅとともに、予めインキュベートした。

結　果 いヒ　ＰＤＧＦ−ＲＣＳＦ　−Ｒ”　−の　、　ＰＤＧＦ−Ｒ／Ｃ５ＦＩ−Ｒ族 の既知の成長因子レセプター遺伝子に関連した新規な配列を探究するために、ヒ ト胎盤および胸腺から調製された高分子量ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化しｖ−ｆｌ ｌｌｓのチロシンキナーゼ領域由来のＤＮＡプローブおよびマウスＰＤＧＦ−Ｒ 遺伝子（第１図）由来のＤＮＡプローブを使用して、プロットハイブリッド形成 法によって分析した。緊縮条件下では、ｖ−ｆＩＩｓプローブは、以前報告され たこの部位（Ｄ、Ｑ、Ｘｕ、　Ｓ、Ｇｕｉｌｈｏｔ、　Ｆ、Ｇａ１ｉｂｅｒＬ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．２８６２（１ ９８５））における制限多形性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ ｉｓｍ）にもとづいて、２７−　ｋｂｐおよび／または２Ｏ−ｋｂｐのＥｃｏＲ Ｉ制限断片を検出した。低い緊縮条件のもとでは、いくつかのｖ−ｆｗｉｓのプ ローブにハイブリッドした１２−、６．８−、５−、２．７−。

２．２−ｋｂｐの断片が更に観察された。対応したマウスのＰＤＧＦ−ＲｃＤＮ Ａの領域は、緊縮条件のもとでは単一の２１−　ｋｂｐ断片とハイブリッドした （第１図）。

より低い緊縮度では、同じプローブは更にいくつかの断片を検出し、その内の若 干は、上述のｖ−／ｆｒａｓ関連の断片の大きさに部位のサイズを有していた。

これらの中で、１２−ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩ断片は、他の断片より以上につよく双 方のプローブとハイブリッドした。更に、比較的小さい若干のバンドは、ヒトｃ −ｋｉｔに対して報告された制限断片に対応した（Ｐ、Ｂｅｓｍｅｒ　ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ　３２０＋４１５（１９８６）：Ｙ、Ｙａｒｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、 、ＥＭＢＯＪ、　６．３３４１（１９Ｂ？））。

かくして、１２−ｋｂｐ　Ｌ？ｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片をクローンし、またその性 質を一層十分に検討することが決定された。

λＥＭＢＬ−４ベクター系を使用して、蔗糖勾配によって大きさの選択されたゲ ノムライブラリーをＥｃｏＲＩ消化正常ヒト胸腺ＤＮＡから組立てた。第２図は １２−ｋｂｐＥｃｏＲＩ挿入片を含むλ↑１１の制限地図を示すが、これはシー ｆａｓおよびマウスのＰＤＧＰ−Ｒのプローブでもっばら緩和されているが緊縮 でないハイブリッド形成条件下でのみハイブリッドさせたものを表わす、　ｖＪ ａ＋Ｓ／ＰＤＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ領域に相同の領域は、λＴｌｌＤＮＡの 制限エンドヌクレアーゼ消化物に対するハイブリッド形成によって配置が決定さ れた。

λＴｌｌ　の０．９５−ｋｂｐ　ＨｉｎｄＩＴｌ−Ｐｓｔｌ、　０．５−ｋｂｐ 　Ａｖａｌ、５ａｃＴ　、および０．３５−ｋｂｐ　ＫｐｒＬＩ−Ｘｂａｌ断片 にハイブリッドする配列を含む３個のプラスミドサブクローンをヌクレオチド配 列分析で調べた。これらの別個の開いた読みとり枠（第３図）は、ヒトｃ−ｆｍ ｓ並びにマウスＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子に対する関連性を示したが、これらの遺伝子 の各々からは容易に区別され（Ｃ，Ｊ、５ｈｅｒｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ１ｌ　４Ｌ　６６５　（１９８５）；　Ｌ、Ｃｏｕｓｓｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｎａｔｕｒｅ３２０、２７７（１９８６）；　Ｙ、Ｙａｒｄｅｎ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３２３．２２６（１９８６））　、さらに、ｃ−ｋｉ ｔ（Ｐ、Ｂｅｓｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ３２０、４１５（１９８ ６）；　Ｙ、Ｙａｒｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　６．３３４１（１ ９８７））からも区別された。この３個の推定のコード領域は、真核生物の遺伝 子のエキソン（Ｒ，Ｂｒｅａｔｈｎａｄａｎｄ　Ｐ、Ｃｈａｓ＋ｂｏｎ、Ａｎｎ ｕ、Ｒｅｖ、Ｂｔｏｃｈｅｓ、５０＋　３４９（１９８１））に面するＡＧおよ びＧＴジヌクレオチドによってそれぞれ境界を接した。

Ｔｌｌ配列が転写されたか否かを査定するために種々の細胞のＮｏｒｔｈｅｒｎ プロット分析が、エキソン（ａ）（第２図）を含み、かつヒトの反復配列を欠如 する０、９５−ｋｂｐＮｉ？ｔｄＴＩＩ−ＰＳｔＩ断片（ｐＴｌｌ−）ＩＰ）　 のクローンを使用し、て実施された。緊縮な条件のもとで、単一の６．４−ｋｂ 、　ＲＮＡ転写体が正常ヒト繊維芽細胞から調製されたｐｏｌｙ（Ａ）＋　ＲＮ Ａ０中に検出された（データ省略）、この転写体は、以前に報告されているＰＤ ＧＦ−Ｒ（Ｙ、Ｙａｒｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　３２３．２２６（１９８６））、　ｃ−ｆｒａｓ　（３）または ｃ−ｋｉｔ遺伝子（Ｐ、Ｂｅｓｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２０， ４１５（１９８６）；Ｙ、Ｙａｒｄｅｎｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　６．３ ３４Ｎ１９８７））に対する転写体とは大きさにおいて異っていた。これらの発 見のすべてにより、Ｔｌｌ　配列が既知のチロシンキナーゼレセプターのサブフ ァミリーの既知メンバーとは異なる遺伝子を表わしていることが示された。

な゛　−のｃＤＮＡ　ロー−７’Ｉ　、　Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ発現ベクタ ーにおける正常ヒト繊維芽細胞のｃＤＮＡライブラリーを、最初にλＴｌｌ　の ０．９−ｋｂｐ　ＨｉｎｄＩＴｌ−Ｐｓｔｌ断片のｐＴｉ　１−　ＨＰクローン を使用して緊縮条件のもとでスクリーニングした。　３．９−ｋｂｐ　ｃＤＮＡ 挿入片を含む】個の強く対合するクローンを分離した（第２図）。ＰＨＦＩと命 名された該クローンは、正常なヒト・繊維芽細胞における６、４−ｋｂ転写体と ハイブリッドし、またその３′末端にｐｏｌｙ（Ａ）の尾部がつづくポリアデニ ル化のシグナルを含んでいた。これはまた、１ＴｉｌＤＮＡ内にエンコードする 配列、４およびエキソン（ａ）の上流に−ＣＳＦＩ−１１−ＰＤＧＦ−Ｒチロシ ンキナーゼ謂域に関連した１７０個のヌクレオチドも含んでいた。

ｐ）ＩＦＩの０．４−ｋｂｐ　５’末端をヒト幼児脳ライブラリーのオーバーラ ツプしたｃＤＮＡクローンを探すために使用した。緊縮条件のもとで、類似した 制限地図を有する多くのｆｌｐｏｓｉｔｉｖｅ）のクローンを分離した（データ は図示せず）。最長のλＨＢ６（第２図）を配列分析にかけた。

可能なＡＴＧ開始コドンは、別のクローン、すなわちλＥＦ１７内部で、同定さ れた。このλＥＦ１７は、λＨＢ６の０．２−ｋｂｐ　５’断片をプローブとし て使用し、λｇｔｌｌベクターの中で、Ｍ４２６ヒト胎児繊維芽細胞のｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーニングすることによって分離されたものである。この３ 種のオーバーラフ・ブしたクローン（ｐＨＦｌ、λＨＢ６およびλＥＦ１７）　 は、３′の翻訳されない配列（第２図）の１３８−ｂｐ　５’および−５−ｋｂ ｐに加えて、全コード領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）を包含していた。

ヒト小児脳のライブラリーをスクリーニングする際にプラークハイブリッド形成 （ｐｌａｑｕｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）において比較弱いシグナルを与 えた２つのクローンのλＨＢ３　とλ）ｌＢ４の配列も決定した。これらは、マ ウスＰＤＧＦ−ＲｃＤＮＡ（Ｙ、Ｙａｒｄｅｎ　ｅｔ　ａｌｌＮａｔｕｒｅ　３ ２３．２２６（１９８６））の配列に近い類似性を示した。更に、λＨＢ４の２ ．０−ｋｂｐ挿入片を正常のヒト繊維芽細胞ＲＮＡにハイブリッドさせた際に、 ＰＤＧＦ−Ｒの動写体に符号する５、３−ｋｂの転写体を検出した（Ｙ、Ｙａｒ ｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２３．２２６（１９８６））。

λＨＢ４の５′末端からさらに上流の配列を含むクローンはいずれも、λｇｔｌ ｌ中でヒト小児脳ｃＤＮ＾ライブラリーをスクリーニングすることによって得る ことはできなかった。これは別に記載（標題“効率的指向性クローニング系（Ｅ ｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍ）” の米国特許明細書のテーマ、１９８９年２月出りｔｆｉ）されたようにして組立 てられた新しいｐｈａｇｅｓ＋ｉｄベクター中でＭ４２６ヒト胎児繊維芽細胞ｃ ＤＮＡライブラリーを利用することによって完成した。このライブラリーをλＨ Ｂ３のｏ、ａ−ｋｂｐ　ｓ’サブフラグメントでスクリーニングすることによっ て、２個のオーバラップしたクローン、ＨＰＲ２およびＨＰＲ５を得た。これら には、既知のヒトのＰＤＧＦ−Ｈのエンコード配列の全部、その完全な３′非翻 訳領域（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ）　、およびその５′非翻訳 領域の３６０個のヌクレオチドを含んでいた（第２図）。

新しい関連遺伝子の６．４−ｋｂｐ　ｃＤＮＡクローン（ＴＲ４）　はまた、同 じライブラリーから、λＥＰ１７の５’０．２−ｋｂｐサブフラグメントにより スクリーニングすることによって転子の６．４−ｋｂｐ　ｃＤＮＡの完全なヌク レオチド配列を第３図に示す、ヌクレオチドの位置１３９において、可能なＡＴ Ｇ開始コドンで始まる開いた読みとり枠は、部位３４０６におけるＴＡ＾終止コ ドン迄伸張した。この開いた読みとり枠は、更に上流に伸びたが、推定される開 始ＡτＧコドンは、真正開始コドンのＫｏｚａｋの規準（Ｍ、Ｋｏｚａ’に＋Ｃ ｅ１ｌ　４４．２８３（１９８６））をみたす配列に隣接していた。

更に最初の２３のアミノ酸の伸びは、切断可能な疎水性のシグナルペプチドの特 性を発揮した（図３および４）。

３′末端で、開いた読みとり枠には、非翻訳配列の３’−ｋｂｐが後続した。ポ リアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）はｃＤＮＡの３′端のｐｏｌｙ（Ａ）配 列から２５ヌクレオチド上流に位置していた。

このシグナルペプチドに対する指定切断部位に従うて（Ｇ、ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎ ｅ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４＋　４６８３（１９８６） ）　、成熟成長物のアミノ末端は、１０６６個のアミノ酸が後続する２４番目の アミノ酸におけるグルタミンと予測された。この略１２０ｋｄ　（キロダルトン ）の計算分子量値を有するポリペプチド配列は、膜伸張チロシンキナーゼレセプ ターのすべての特徴を含んでいた。

２４個のアミノ酸（５２５〜５４８残蟇）からなる疎水性のセグメントは、レセ プターの膜透過領域の特徴を発揮した（図３および４）、このシグナルペプチド と膜透過領域の間に、ＰＤＧＦ−Ｒ／Ｃ３ＦＩ−Ｒのサブファミリー領域を結合 する細胞外リガンドとの構造上の相同性が存在した。１０個のシスティン残基が このサブファミリーの他のレセプターと同一の部位の配置を有し、また８個の潜 在的なＮ連１１（Ｎ−１ｉｎｋｅｄ）グリコジル化部位がその推定細胞外領域に 分布していた（第３図）。

細胞質領域は、保存されたチロシンキナーゼ領域および親水性カルボキシル末端 の尾部から成っていた（図３および４）。チロシンキナーゼ領域は、共通（ｃｏ ｎｓｅｎｓｕｓ）ＡＴＰ結合配列（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ、、、 、Ｌｙｓ残基）および、４１６部位にあるｐｐ６０ｖ−ｓｒｃの主要な自動燐酸 化部位に相同な８４９部位のチロシン残基を含んでいた（Ｊ、Ｅ、Ｓｍａｒｔ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ−＋ｔｌｓＡ　７ Ｂ、　６０１３（１９８１））　、更に、チロシンキナーゼを、以前にｃ−ｆａ ｓ　／Ｃ３ＦＩ−Ｒ，ＰＤＧＦ−Ｒおよびｃ−ｋｉｔ　に対して示したように、 親水性インターキナーゼ配列によって２つの領域に分けた（第４図）。

ＰＤＧＦ−Ｒ、Ｃ５ＦＩ−Ｒ１およびｃ−ｋｉｔ　のアミノ酸と細胞外領域のア ミノ酸の相同性は、それぞれ３１％、１８％および１９％であった。Ｔ１１遺伝 子の２個のキナーゼの領域は、ｃ−ｆａｓおよびｃ−ｋｉｔ　に対する６７〜７ ０％に比較して、ヒトＰＤＧＦレセプターのキナーゼの領域に対して最も相同で あった（それぞれ８５％および７５％）（第４図）。

インターキナーゼの領域においてさえも、このアミノ酸の配列は、ｃ−ｆａｓま たはｃ−ｋｉｔの１０および１９％の相同性と比較して、２７％の相同性でＰＤ ＧＦ−Ｒにより接近して並列するものであった。これらの観察によって、↑１１ 成長物は、ＰＤＧＦ−Ｒ／Ｃ５ＦＩ−Ｒのサブファミリー中にあり、またＰＤＧ Ｆ−Ｈに最も深く関連しているという結論に導かれる。

今一つのｃＤＮＡクローンの推定されるアミノ酸配列は（ＴＲ４ｃＤＮＡクロー ンを製造したのと同じ実験により得られた）、その成長物を既知のヒトＰＤＧＦ レセプターとして確定した。その配列は、最近発表された既知のヒ）　ＰＤＧＦ レセプターの配列と殆ど完全に一致した（Ｐ、Ｇ。

Ｋ、Ｇｒｏｎｗａｌｄ　ａｔ　ａｔ、＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ８８．３４３５（１９８Ｂ）；　Ｌ、Ｃ１ａｅｓｓｏｎ− Ｗｅｌｓｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　８．３４７６（１９８８））、１個のヌクレオチドの相異は、残基 ２４０をアスパラギン（Ａｓｎ）からセリン（Ｓｅｔ）　に変えた。また、マウ スＰＤＧＦレセプターｃＤＮＡアミノ酸配列との比較により、リガンド結合領域 （７９％）、膜透過領域（ｔｒａｎｓｗｅｍｂｒａｎｅ　ｄｏｓｌａｉｎ）　（ ９６％）、近接膜領域（ｊｕｘｔａｓｅｍｂｒａｎｅ　ｄｏｍａｉｎ）　（９７ ％）、分裂チロシンキナーゼ（ｓｐｌｉｔ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ） 　ｗｉ域（Ｔ）［１，９９％およびＴＲ２，９７％）、インターキナーゼ領域（ ８６％）およびカルボキシル末端（８５％）を含むすべての機能領域を通じて、 高い類似性のあることが判明した。

Ｔ１１゛　−の　マ・ピング、染色体の位置に関して新しい遺伝子特定するため に、１０４個の染色体の展開をｐＴｌｌ−ｐのプローブを使用して切片上ハイブ リッド形成によって検討した。全部で１３６個の小粒（ｇｒａｉｎ）を４００バ ンドの抜型図式（ｉｄｅｏｇｒａｍ）の上に分布させた（第５図）、全小粒のう ち、５０個（３７％）がｑｌｌ−１２のバンドの長腕のアセントロメア領域（ａ ｃｅｎｔｒｏ■ｅｒｉｃｒｅｇｉｏｎ）近くに密集する４５個の大多数の小粒と 共に染色体４の上に存在した。７個の小粒からなる染色体５９１１．１−１１． ２上の２番目のハイブリッド形成の部位は、全小粒の５％に達した（第５図）。

Ｔｌｌ遺伝子プローブはまた、転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）Ｂ；５（ｐ ２２．　ｑ２３）転座より生ずる大型の異常なマーカー染色体を有するＢｕｒｋ ｉｔｔ　ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞系の由来の細胞体ともハイブリッドした。染色体 ５における小粒の存在を検討した３００以上の染色体の展開の中で、この再配列 された染色体５のラベル化は検出されなかった。

かくして切片上のハイブリッド形成によりＴｌｌ遺伝子は、染色体４のＱｌｌ− １２部位に割当てられた。この位置測定によりこの新規な遺伝子は、ｃ−ｂｉｔ 癌原遺伝子と同じ領域内にあることがわかった（Ｌ、　ｄ’Ａｕｒｏｉｏｌ　ｅ ｔａｌ、＋　Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ　７８．３７４（１９８８））　、血小板因子 ４（Ｃ，Ａ、Ｇｒｉｆｆｉｎｅｔ　ａｌ、＋　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｃｅ１ ｌ　Ｇｅｎｅｔ　４５＋　６７（１９８７））　、インターフェロンＴ誘導因子 ；　ｒ　ＩＰ−１０（Ａ。

Ｄ、Ｌｕ５ｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　８Ｌ２８６Ｂ（１９８７））およびメラノーマ成長刺激活性（ ＭＧＳＡ）　（Ａ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　ｅｔａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　７．２０２５（１９８Ｂ）） に対する構造的に関連した遺伝子群並びにα−フエ）　（ｆｅｔｏ）蛋白質、ア ルブミン（Ｍ、Ｅ、Ｈａｒｐｅｒ　ａｎｄ　Ｇ、Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ、　Ｊ、Ｈ ｕｓ。

Ｇｅｎｅｔ、　３５．５６５（１９８３））　、ＨＰＡＦＰ　（Ｍ、Ａ、Ｆｕｒ ｇｎｓｏｎ−Ｓｍｉｔｈｅｔ　ａｌ、、　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅ ｎｅｔ　４０＋　６２８（１９８５）に対する遺伝子群および遺伝子デンチン形 成不全症（ｄｅｎｔｉｎｏ−ｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ）の遺伝子 が４ａｌｌ−１３にマツピングされている　（Ｓ、Ｐ、Ｂａ１１．　Ｐ、Ｊ、Ｌ 、Ｃｏｏｋ、　Ｍ、Ｍａｒｓ＋　Ｋ、Ｂ。

Ｂｑｃｋｔｏｎ、Ａｕｎ　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ　４６．３５（１９８２））。

いレセプター様遺伝子の組織特異的発現を調べるために、本発明の中で最も好ま しいＤＮＡのうちのいづれか、すなわちＴｌｌ　ゲノムのクローンのＨｉｎｄＩ ｌｌ−ＰＳｔＩｏ、９５−ｋｂｐ断片、またはＴＲ４のｃＤＮＡ挿入片を、Ｎｏ ｒｔｈｅｒｎプロットハイブリッド形成実験に使用した。単一の６．４−ｋｂ転 写体が種々のヒト組織および細胞系のＲＮＡを含有するｐｏｌｙ（Ａ）内で検出 された。第６図に示すように、比較的高レベルの転写体を平滑筋、心臓、および ヒト胎児に見出したが、ヒト肝臓および肺臓では、これらの条件のもとでは、検 出されないか、またはやっと検出できる程度の転写体を示した。既知のヒトＰＤ ＧＦレセプター遺伝子に対するプローブを使用して、Ｔ１１　および５．３−ｋ ｂ　ＰＤＧＦ−Ｒ転写体が、それぞれ類似したレベルで、これらの同一の各組織 において同時に発現することがわかった。ヒト骨格筋、胎児脳、胎盤並びに培養 繊維芽細胞およびダリア細胞（ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌ）もまた、高レベルの双方 の転写体を発現した（データ省略）。

かくして、この新しい遺伝子および既知のＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子は、協調して嘴査 された正常組織に発現するように思われ、ｃ−ｆｌＩｓ　／Ｃ５ＦＩ−Ｒまたは ｃ−ｋｉｔ　に関して報告されたデータとは非常に異ったパターンを示した　（ Ｄ。

Ｊ、５ｈｅｒｒｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　４Ｌ　６６５（１９８５）；　Ｌ、 Ｃｏｕｓｓｅｎｓ　ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２０＋　２７７（１９８６） ；Ｐ、Ｂｅｓｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ３２０、４１５（１９８６） ；　Ｙ、Ｙａｒｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ　６．３３４１（１９Ｂ？ ））　。

また、Ｔ１１およびＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子の発現を、ヒト腫瘍細胞において比較し た。ここでは、これらの表現のパターンを容易に区別することが可能であった。

い（つかの腫瘍細胞系は、Ｔｌｌ　またはＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子転写体のいずれか を含むが、双方は含まないことが見出された（第６０およびＤ図）。

な　Ｊ　のＰＤＧＦレセ　−　に・ 、ｑ」Ｌ鍾よ。この新しい遺伝子による蛋白質成長物を同定するために、ペプチ ド類に対する抗血清を、予測されたその配列にもとづいて調製した。既知のＰＤ ＧＦ−Ｒの予測された配列の類似領域を利用して抗血清をも成長した。最初にＴ ｌｌ遺伝子成長物の特異的発現を検出するために、双方のレセプターのｃＤＮＡ が分離されているＭ４２６胎児繊維芽細胞を利用した。　ＰＤＧＰ−ＲまたはＴ １！遺伝子転子体を特異的に発現した８３８７およびＡ２０４細胞系をそれぞれ 同様に分析した（第７Ａ図）。

Ｔｌｌ遺伝子成長物に対する抗血清（抗Ｔ１１）を使用したＭ４２６ｍ胞の−ｅ ｓ　ｔｅｒｎプロット分析法によって、１８０ｋｄおよび１６０ｋｄの蛋白質種 が免疫ペプチドと特異的に競合することが判明した。抗ＰＤＧＦ−Ｒ（ａｎｔｉ −ＰＤＧＦ−Ｒ）ペプチド血清（抗）ＩＰＲと命名）により、同じ細胞中に１８ ０および１６５ｋｄの蛋白質が検出された。　８３８７細胞の−ｅｓｔｅｒｎプ ロット分析により、抗−ＨＰＩＩによって認知されたが、抗Ｔ１２　血清によっ ては認知されない１８０および１６５ｋｄの種（ｓｐｅｃｉｅｓ）が判明した。

これとは反対に、Ａ２０４細胞は、抗Ｔｌｌ　によって特異的に検出されたが抗 ＨＰＲ血清によっては認知されなかった１８０および１６０ｋｄの種を含んでい た。

これらの発見すべてによって、本発明のこれらの抗体は、同族のレセプター遺伝 子成長物の検出に関しては特異的であり、かつＴｌｌ遺伝子成長物は、その転写 体を含む細胞において発現されることが示された。

ベ　−、に　冒るＴｅｌ　ｃＤＮＡの　、更にＴｌｌ遺伝子成長物を免疫学的に 検出する能力のテスト並びにそのｃＤＮＡの機能の発現調査として、ＬＴＲを基 礎とした発現ベクター（ＬＴＲ−ｂａｓｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔ ｏｒ）をヌクレオチド１から３４５４　（第３図）を包含するＴｌ１ｃＤＮＡお よび対応する既知のＰＤＧＦ−ＲｃＤＮＡに対して同様に組立てた。

ｃｏｓ−１細胞における過渡的発現により、ＰＤＧＦ−Ｒは１８５ｋｄおよび１ ６５ｋｄ蛋白質として出現したが、Ｔｌｌ遺伝子成長物は１８５ｋｄおよび１６ ０ｋｄ種として特異的に検出された（第７Ｂ図）、各レセプターのそれぞれの低 分子量のものは、分析された細胞の間では、大きさに変化はなかった。しかし、 比較的に分子量が大きい種の中には、若干の大きさの異ったものが観察されたが 、これはグリコジル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の細胞特異的な相異にも とづくようである。

ＰＤＧＦのＴ１１　との　人によ　」」韮、ＬＬＬ仮ｌヨＵ定工その構造的およ び推定アミノ酸配列の類似性並びにＰＤＧＦに反応することの知られる正常な細 胞タイプによるその共通の発現性を理由として、Ｔｌｌ遺伝子成長物が既知のＰ ＤＧＦ−Ｒ成長物に何等かの機能性関連性を示したか否かを決定する研究が行わ れた。

かくして、１２５１でラベルされたヒトＰＤＧＦを、対照区（ｃｏｎｔｒｏｌ） およびトランスフェクトされたｃｏｓ−１細胞とともに、未ラベルのＰＤＧＦイ ソフオームの存在または不在のもとで、インキュベートシタ。

第８図に示すように、新しいレセプター遺転子テトランスフェクトされたｃｏｓ −１細胞には、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対するように、それだけ多くの’　”Ｉ− ＰＤＧＦが特異的に結合した。過剰のヒトＰＤＧＦ　（ＡＢが支配的）　、ＰＤ ＧＦ−ＢＢ、またはＰＤＧＦ−ＡＡ　との競合によって、結合はトランスフェク トされていないｃｏｓ−１細胞のレベル迄減少した。また、目Ｊ−ＰＤＧＦのＰ ＤＧＦ−ＲｃＤＮＡ　によりトランスフェクトされたｃｏｓ＝１細胞に対する特 異的結合も観察された。しかしこの場合には、結合はヒ１−ＰＤＧＦ（ずなわち 、ＰＤＧＦ−ＡＢ）およびＰＤＧＦ−ＢＢにより競合されたが、ＰＤＧＦ−ＡＡ によっては競合されなかった（第８図）。

かくして、Ｔｌｌ遺伝子とＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子の成長物の双方は、ヒトＰＤＧＦ と結合したが、ＰＤＧＦの異なるイソフオームによる競合のパターンによって、 ２種のレセプターが区別された。これらの結果は、丁１１遺伝子がＰＤＧＦの３ 種のダイマー型に対して異なった親和性を有する新しいＰＤＧＦレセプターをエ ンコードすることを意味した。従って、Ｔｌｌ　レセプター遺伝子成長物は、Ｐ ＤＧＦ結合がＡＡ並びにＢＢイソフオームと競合したので、仮にタイプαＰＤＧ Ｆ−Ｒと命名せられ、また以前にクローンされたＰＤＧＦレセプター遺伝子の成 長物は、タイプβと命名された。

ＰＤＧＦのイン７　−ムは　および　のＰＤＧＦレセブーの　バ２−ンの　１　 。

レセプターにＰＤＧＦが結合した後、レセプター蛋白質のチロシン残基の燐酸化 （ρｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を含む分子間の多数の変化が生体内におい て（ｉｎ　ｖｉν０）で迅速に触発される（Ａ、Ｒ，Ｆｒａｃｋｅｌｔｏｎ、　 Ｐ、Ｍ、Ｔｒｅｍｂｌｅ　Ｊｒ、、　Ｌ。

Ｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５９．７９０９　（ １９８４）；　Ｔ、Ｏ。

Ｄａｎｉｅｌ　ｅｔ　ａｉ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 　８Ｌ　２６８４（１，９８５））。各ＰＤＧＦのインフオームによる２種のＰ ＤＧＦ−Ｒ遺伝子成長物の相対的自動燐酸化を比較するために、タイプαおよび タイプβのＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子を発現するＡ２０４および８３８７細胞の反応を それぞれ分析した。

第９Ａ図に示すように、リガンド処理に続いて５分間溶解（Ｉｙｓｅ）されたＡ ２０４細胞のイムノプロットにより、容易に検出可能でかつ非常に類似したレベ ルの１８０ｋｄ種（ｓｐｅｃ　１ｅｓ）の自動燐酸化が３種のＰＤＧＦのイソフ オームの各々に応じて行われることが判明した。誘導された自動燐酸化がタイプ αのレセプター遺伝子成長物に特異的であるという更なる証拠として、リガンド で刺激されたＡ２０４細胞の溶解Ｔｈ（ｌｙｎｓａｔｅ）を最初に抗タイプαＰ ＤＧＦ−Ｉ？血清（抗−Ｔ１１）で免疫沈澱させ、つづいて抗ｐｈｏｓｐｈｏｔ ｙｒｏｓｉｎｅ血清を用いて免疫プロット法を行った。この試みによって、１８ ０ｋｄのタイプαＰＤＧＦレセプターは、各々３Ｗ１のリガンドに反応して同様 の強度でチロシンが燐酸化されることがｆ！認された。

タイプβのＰＤＧＰ遺伝子成長物のみを発現した８３８７１［！胞を各々同量の ＰＤＧＦイソフオームで処理すると、非常に異ったパターンのレセプターの自動 燐酸化がみられた。ここでＰＤＧＦ−ＢＢ　は、抗タイプβＰＤＧＦ−Ｒ血清（ 抗）ＩＰＲ）によって特異的に認識される１８０ｋｄ種の最高レベルの自動燐酸 化を誘導し、またヒ）　ＰＤＧＦは、検出可能な自動燐酸化を同じく誘導した（ 第９Ｂ図）。これとは対照的に、Ｐ［１ｌＧＦ−ＡＡは、検出可能な燐酸化を誘 導しなかった。

かくして、ＰＤＧＦ−ＡＢ　とＰＤＧＰ−ＢＢ　は双方のＩ／セプターを触発し たが、ＢＢホモダイマーに対するβタイプレセプターのはるかに強力な反応並び にＡＡホモダイマーに対する検出可能な反応の欠如は、容易にレセプターを機能 性に区別した。

異ったＰＤＧＦイソフオームによる２種のレセプターの自動燐酸化のパターンを 同じ細胞で検討するために、最初にＮＩＨ／３Ｔ３細胞を異なるリガンドによっ て触発し、つづいて抗タイプαまたはβのＰＤＧＦ−Ｒ血清により免疫沈澱（ｔ ｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉ、ｔａｔ、１ｏｎ）せしめた。続いて免疫沈澱したレ セプター蛋白質を抗ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ血清を使用して免疫プロッ ト法によって解析した。

第９Ｃ図に示すように、タイプαＰＤＧＦ−Ｒ抗血清によって免疫沈澱した１８ ０ｋｄ　ｃＤ蛋白質は、ＰＤＧＦのすべての３種のダイマー形式によって燐酸化 された。対照的に、抗タイプβレセプター血清によって免疫沈澱した１８０ｋｄ の燐量白質は、ヒトＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢ刺激後にのみ検出され た。このようにして、異なったＰｒＪＧＦリガンドに対する反応のパターンは、 自然に双方のＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子を発現する形質未転換細胞の一例においてレセ プター特異的なままであった。

イ　αのＰＤＧＦ　レセブ　一番ＰＤＧＦイ’／７　−１．ＡＢｅ・　ＤＮＡＡ 　°　に　′　・　玉。

他の繊維芽細胞系における２種のレセプターの発現を次に分析した。　Ｗｅｓｔ ｅｒｎプロット分析（データ省略）によって分析された系（］　ｔｉｅ）の中で 、２種のレセプターの比率に相当の変化の存在することが判明した。マウス繊維 芽細胞は、類似したレベルのタイプαおよびβのレセプターを発現したが、ヒト 繊維芽細胞、例えばＡＧ１５３２またはＭ４１３は、マウス繊維芽細胞またはＭ ４２６ヒト繊維芽細胞に比べて、比較的低いレベルのタイプαのレセプターを発 現した。

飽和量のＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢは、各々の細胞系において同じ樟 にＤＮＡ合成の増加を示した（データ省略）、シかし、最高に次ぐ用量のＰＤＧ Ｆ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢは、観察された分裂促進活性レベルの相当な相異 を示した（第１０図）。ＮＩ）ｌ／３Ｔ３．　ＢＡＬＢ／３Ｔ３および？１４２ ６細胞は、同等な効率でＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＢに反応したが、Ｐ ＤＧＦ−ＡＢ　は、ＡＧ１５２３またはＭ４１３細胞に対して相当に低い活性を 示した。　ＰＤＧＦ−ＡＢに対する比較的低い分裂促進性の反応性は、これらの 細胞における免疫学的に検出されたαレセプターに比してβレセプターの高い比 率と相関関係があるように思われた。

異なったＰＤＧＦイソフオームによるＮ１）Ｉ／３Ｔ３細胞中の２種のレセプタ ーの燐酸化について見られる用量反応曲線とまとめて考えると、これらの結果は 、タイプβレセプターの存在における、ＰＤＧＦ−ＡＢ並びにＰＤＧＦ−ＡＡに よるタイプαレセプターの選択的な誘発を強く示唆した。

ＰＤＧＦレセプ　−のない告　ヘＣＤＮＡ　’ののＰＤＧＦ′　−イブの　した 　、各ＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子成長物に対する特異的な生物学的および生化学的反応 を調査するために、各々のタイプが独立して導入され発現される可能性のある細 胞において該レセプターを調べるためのシステムを開発した。これらのシステム は、３２Ｄ細胞系である、生存および増殖のため通常１１−３に依存するマウス 造血細胞系を基礎とした。最近の研究は、ＥＧＰ−Ｈに対する発現ベクターをこ れらの細胞中に導入することにより、ＥＧＦの分裂促進シグナルの導入経路との 効果的カップリングに結びつくことを確認した。

ｇｐｔ選択可能なマーカーを保持する上述の哺乳類の発現ベクターが、３２Ｄ細 胞をタイプαまたはタイプβのＰＤＧＦ−ＲｃＤＮＡを使用するエレクトロポレ ーション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によってトランスフェクトする ために、使用された。形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒ＋５ａｎｔ）を１１ｙｃｏ ｐｈｅｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄを加えた培地を用いで選択した。

選択培地中で２週間後、成育培養体を得た。

３２Ｄ−αＲおよび３２Ｄ−βＲと命名された培養体を、上述したようにそれぞ れＮｏｒｔｈｅｒｎプロ、ト分析にかけた。

ＮＩＨ／３７３１１ｉ維芽細胞においてマウスの各ＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子転写体の 検出を可能ならしめる緩和されたハイブリッド形成条件のもとでさえも、いずれ のタイプのＰＤＧＦ−ＲｍＲＮＡ　も３２Ｄの親細胞中には検出されなかった。

対照的に、３２Ｄ−αＲおよび３２０−θＲのトランスフェクト体（ｔｒａｎｓ ｆｅｃｔａｎｔ）は、ヒトのタイプαおよびタイプβの各ＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子に それぞれ特異的な転写体を豊富に発現した。これらのトランスフクト体の膜溶解 物を免疫プロット分析にかけると、抗タイプαＰＤＧＦ−Ｒペプチド血清は、１ ８０ｋｄおよび１６０ｋｄ蛋白質種を３２０−αＲ中に検出したが、３２Ｄ−β 細胞中には検出しなかった。更にこれらの蛋白質は、免疫ペプチドと特異的に競 合した。

３２０−βＲ細胞は、これとは反対に、抗タイプβＰＤＧＦ−Ｒ血清によって特 異的に検出される１８０−２００ｋｄおよび１６５ｋｄ種を含有した。これらの 蛋白質種のいずれも、対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）である３２ｒ＋細胞中には検出さ れなかった。

イ　αのレセ　−はＰＤＧＦ−ＡＢイ゛フ　−ムにｔ４　い　Ａ　る、　ＰＤＧ Ｆ−ＢＢ結合を３２０−αＲまたは３２０−βＲトランスフェクト体において比 較したが、両者は高い親和性結合を示した。スキャンチャード分析によって、単 一親和性クラスの結合部位を有する１細胞当り約２０００のレセプターの存在が 明らかとなった。にα値は、３２Ｄ−αＲおよび３２Ｄ−βＲｗｊ胞に対してそ れぞれ０．４ｎＭおよび０．５ｎＦＩ　であった（第１１図）、また、３２Ｄ− αＲ細胞は、’　”Ｊ−ＰＤＧＦ−ＡＢに対して高い結合親和性（ｋ、＝０．４ ｎＭ）を示し、ＰＤＧＦ−ＢＢに対するものと同数の結合部位を現わした。

対照的に、３２Ｄ−βＲ細胞はしかしながら、３２［１−αＲ細胞にくらべて、 ’　”Ｊ−ＰＤＧＦ−ＡＢに対して１０倍も低い結合能を示した。かくして、こ れらの類似したＰＤＧＦ−ＢＢの結合をもとに標準化すると、タイプβのレセプ ターは、ＰＤＧＦ−ＡＢに対して橿端に低い親和性を示した。

イブαおよび　のＰＤＧＦ　’　−によ　てに６　た社゛の　・　。有線分裂促 進性（ｓ＋ｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）および退化性は、ＰＤＧＦに対する繊維芽従 って、３２Ｄ−αＲまたはβＲ細胞系がこれらの生物学的反応のどちらを仲介す るかが調べられた。

３２Ｄ細胞の増殖は、通常インターロイキン３（以後、ＩＬ−３）に厳密に依存 し、ＩＬ３を培地から除去することは、トランスフェクト体および対照の３２０ 細胞の双方の生存能力を迅速に失わせた。第１２図に示すごとく、ＰＤＧＦ−Ｂ Ｂは、分裂促進のシグナル形質導入経路と効率的にカップルし、また双方のトラ ンスフェクト体においてＩＬ−３依存性を類似した用量依存を示しながら排除す ることができたが、対照の３２０細胞においては効果がなかった。こうして、α またはβタイプのいずれがの存在がＰＤＧＦ−ＢＢに対する分裂促進反応（ｓｋ ｉ　ｔｏｇｅｎｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅ）にとって必要かつ十分であった。しかし ながら、３２Ｄ細胞を含むタイプαのレセプターがＰＤＧＦ−ＢＨに対するのと 同じようにＰＤＧＦ−ＡＢに対しても反応性があったのに対して、３２Ｄ−βＲ 細胞においてＰＤＧＦ−ＡＢは相当に低いＤＮＡ合成反応を誘発した（第１２図 ）。

これらの発見を寒天を含む半固形の培地中のコロニー形成分析によって確認した ０両方のトランスフェクト体がＰＤＧＦ−ＢＢ添加培地で容易にコロニーを形成 したが、３２Ｄ−αＲ細胞のみがＰＤＧＦ−ＡＢ添加培地でコロニーを形成した （データ省略）、かくして、３２Ｄ−αＲおよびβＲトランスフェクト体により 観察された分裂促進反応は、各々の細胞系によってそれぞれ発現されたαおよび βの【・セプターに対する同一のＰＤＧＦイソフオームの結合特性とよく相関し た。

走化性がタイプαまたばβのいずれかのＰＤＧＦし七ブタ−によって特異的に仲 介されたか否かを調べるために、当該分野で公知の変形Ｂｏｙｄｅｎチェンバー 技術を使用して走化性のアッセイを行った。ＰＤＧＦレセプターが欠如している ３２Ｄ細胞は、ＰＤＧＰ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢに反応しなか−１，だが、 ＰＤＧＦ−ＢＢは、αおよびβレセプター発現ｌ−ンンスフ５、クト体の双方に 対して走化性を示した。　Ｉ’ＤＧＰ−ＡＢ　は３２Ｄ−αＲ細胞に対して比較 的により活性であった（第１３図）３ かくして、各ＰＤＧＦレセグターは、それぞれ独自に３２Ｄ細胞に遺伝的に内在 する分裂促進および走化性のシグナル経路とカップルした。更に、これらの生物 的機能は、いずれかのレセプターに対するＰＤＧＦのイソフオームの相対的結合 能に応じて誘発された。

豆１　たレセ　−　丑′　るイノシ ール　゛および　イト・ルのＵＳ 最近の研究によれば、ＰＤＧＦで誘導された分裂促進のシグナルの導入に際して 、細胞内の遊離カルシウムおよびジアシルグリセロールといった第２メツセンジ ヤーの増加をおこすイノシトール脂質のレセプター仲介による代謝回転（ｔｕｒ ｎｏｖｅｒ）の重要な役割が示唆されている。かくしてイノシトール脂質代謝お よび細胞内遊離Ｃａ”　（（Ｃａ”）　ｔ）に対するＰＤＧＦ−ＡＨおよびＰＤ ＧＦ−ＢＢの効果を、３２Ｄ細胞を含むタイプαおよびタイプβのＰＤＧＦ−Ｒ において研究した。

放射性燐酸イノシトールの蓄積を、８Ｈミオイノシトール（”ＩＩ−＊ｙｏｉｎ ｏｓｉｔｏｌ）で培養体をラヘルし、当該分野で公知の方法に従−２てＰＤＧＦ のイソフオームを３７°Ｃで１、ｉＣｌの存在で誘発し、測定した。ＣＣａ”〕 ｉ　を、ｓＡ濁液中の３２０細胞において螢光（Ｃａ”）ｉ　インジケーターｆ ｕｒａ２で負両し、また完全なインキブ、ベーション培地中でＰＤＧＦで処理し て、測定したや 第１４図に燐酸イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に対す るＰＤＧＦ−／ｉＢおよびＰＤＧＦ−ＰＩＢの効果と、タイプαおよびタイプβ のＰＤＧＦ−Ｒ３２Ｄ細胞における（Ｃａ”）　ｉ　と杏示ず、第１４図（パネ ルＡ）に示すようＬこ、ＰＩＩＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＢは、炉酸イノシ トールの用量依存性の蓄積を同様な相）・１的効力で誘発することがｉｉ能でｔ ｒｙっだ。同ｅ−イソフォ・−ムは、夕・１プαのＰＤＧＦ−Ｒ３２Ｄ細胞ｔコ おいても（Ｉ；、己゛〕ｉを殆ど同様に増加さゼた（第１４図、パネル、ｌ＼、 挿入しλ１）。ＰＤＧＦ−ＢＢ　もまた、タイプβのＰＤＧＦ−Ｒ３ハ細ｉｆｆ におけ２イノシトール脂實の代謝および細胞内のＣａ”ｅ動を１１に！？＋！激 し、ＰＤＧＦ−ＲＢ　ｌこ反応して酷似Ｌ７だ生化学的反応がこれらの異なった ｉ’ＤＧＦ−Ｒ遺伝子成長物によって３２１１細胞中に誘発されＺｒことが確認 された。

第１４図（パネル′ｆ３）は、タイプβのＰＤｆ；Ｆ−Ｒ３２０細胞における燐 酸イノシトールＴ積を促進する際に、Ｐ旧；Ｆ−ＡＢがＰＤＧＦ−ＢＢよりも相 当６ご効果が低かったことなテず。検出可能な燐酸イノシトールの放出は１、Ｐ ＤＧＦ−Ａｎの濃度が高い場合のみ起った。同様（、、ＰＤＧＦ−ＡＢ　＋よ、 殆どまたは全＜（Ｃ，ａ″２）ｉ反応を誘発しなかった。

論　考 本研究は、２種の異ったヒトＰＤＧＦレセプター遺伝子の存在を示ずｅ更に、本 研究は、本発明の２つの主要な具体例ＰＤＧＦ−Ｒ／Ｃ３ＦＩ−Ｒサブファミリ ー内における新規遺伝子のゲノム５およびｃＤＮＡクローンの検出および分離を 例証する。この遺伝子は、既知のＰＤＧＦ−Ｉｔ遺伝子とは異なるが、最も深く 関連している。自然な発現の条件のもと、並びにこの新規のｃＤＮＡを発現ベク ターを使用して適当なターゲントの細胞内に導入に次いて、その成長物のＰＤＧ Ｆに対−３る機能性反らは、既に同定されているＰＤＧＦし七ブタ−のチロシン 燐酸化を結合し触発した濃度において示された。

一定量のＰＤＧＨによって誘導されたＰＤＧＦｉｌ遺伝子成長物のチロシン燐酸 化（および幾つかのその他の活性）の類似したレベルをもとにして標準化すると 、新規のしむニブターは、ＡＡのホモダイマー（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）に対し′ 、二既知のＰＤＧＦ−Ｉｆよりもよく反応することが示された。

反対に、既知のレセプターは、ＢＢのホモダイマー・に選択的に反応した。今回 の発見をもとにしで、この新規の遺伝子成長物をタイプαＰＤＧＦ−Ｒと命名し 、また以前に同定されているＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子成長物をタイプβのし七ブタ− として部名した。

ＡＡホモダイマーは、Ｎ）Ｉ！／３Ｔ３細胞における検出可能のβタイプレセプ ターのチロシン燐酸化を刺激できなかったが、該細胞系ｌこおいてｒｌＮＡ自成 を誘導できる（Ｐ。

Ｂｅｃｋｓａｎ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４ｉ＋　Ｌ３４６（１９８ ８））　＊　これは、αタイプのレセプターが繊維芽細胞における分裂促進シグ ナルの経路とカップルできることを示した。タイプβのレセプターもまた、ＰＤ ＧＦを分裂促進経路とカップルさせることが報告されている　（Ｊ、Ａ、Ｅｓｃ ｃｂｅｄｏ　ａｔａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０．１５３２（Ｉ９８８）） 　、これらの結果は、両方の遺伝子成長物が増殖反応を誘導できることを示唆し た。

本発明の構成と方法に従って、ヌル細胞中にこれらの異ったレセプター遺伝子に 対する発現ベクターを安定して導入できることは、このような示唆をヒト細胞に おいて確認することを可能とした。このような細胞における研究は、走化性（） １．５ｅｐｐａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

９２、５８４（１９８２）；　Ｇ、Ｒ，Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１１３＋　２６Ｈ１９８２）；　Ｔ、Ｆ 、Ｄｅｕｅｌ、　Ｒ，Ｍ、５ｅｎｉｏｒ、　Ｊ。

Ｓ、Ｈｕａｎｇ、　Ｇ、Ｌ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ 、　６Ｌ　１０４６（１９８２））、膜の波うち（ｒｕｆｆｌｉｎｇ）（ＬＭｅ ｌｌｓｔｒｏｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ｒｅｓ、　Ｃ５８９ （ｉ９８３））、並びに非相同（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）レセプターの転移 調整（Ｌｒａｎｓｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）（Ｅ、Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ、　Ｍ、Ｒ ｏｄｒｉｑｕｅｚ−Ｐｎｅｎａ＋に、Ａ、Ｓｍ１ｔｈ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８（Ｌ　７２４４（１９８３）；　Ｒ，Ｊ、 Ｄａｖｉｓ　ａｎｄ　Ｍ、Ｐ、Ｃｚｅｃｈ＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．４０８０（１９８５））を含む既知のその他のＰＤＧ Ｆの機能は、タイプαまたはβのＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子成長物によって特異的には 仲介されないことを更に示した。

このような知識は、これらのＰＤＧＦＩＩ能に影響を与える病態の理解と診断へ の必要な前奏となるものであり、本発明を更に実施することによって推進するこ とができる。

本発明の方法を使用して解析されたヒト腫瘍細胞系のうちで、２種のＰＤＧＦ− Ｒ遺伝子の発現が不調和のいくつかの例が観察された。更に、いずれかの遺伝子 からの−ＲＮＡを発現する代表的腫瘍細胞系は、細胞に結合しかつＰＤＧＦに反 応してチロシンが燐酸化される代表的蛋白質成長物をそれぞれ含有することが示 された。

本発明のタイプαあるいはタイプβのＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子成長物に対して特異的 な免疫学的並びに分子生物学的プローブが利用できることは、ＰＤＧＦ−Ａ鎖ま たはＢ鎖の発現が、いづれかのレセプター遺伝子との組合せにおいて、腫瘍の発 生に因果的に関連しているヒトの腫瘍の同定を可能とする。同時に、各タイプの 成分を特異的に検出する試薬を利用できることは、他の慢性病態、例えば動脈硬 化症、関節炎、および繊維症における該成長因子とレセプターの複雑なネットワ ークの異常な発現の関与を発見しようとする努力に対して、決定的な援助となる （Ｒ，Ｒｏｓｓ＋　ＥＪ、Ｒａｊｎｅｓ、　Ｄ、　Ｆ、Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ。

Ｃｅ１ｌ　４６．１５５（１９８６））　、更に、科学的に重要な観察は、ここ に記載されたように本発明の実施によって既に与えられている０例えば、新しい 遺伝子の染色体上の配置は、本発明のＤＮＡを使用して確定せられ、該レセプタ ー遺伝子族の進化の可能性に対する見通しを与える。

かくして、この染色体の配置の特定は、タイプαのＰＤＧＦレセプター遺伝子が 染色体４上の関連レセプター様遺伝子、ｃ−ｋｉｔ　（Ｌ、　ｄ’Ａｕｒｉｏｌ 　ｅｔ　ａｌ、＋Ｈｕｉ、　Ｇｅｎｅｔ７８、３７４（１９８８））と同一領域 の４ｑｌｌ−１２にあることを示す、その他のこのサブファミリーの遺伝子は、 染色体５の上にあることがわかった。これらは、５ｑ２３−３１　に位置するこ とがわかったタイプβのＰＤＧＦ−Ｒ（Ｙ、Ｙａｒｄｅｎｅｔ　ａｌ、、　Ｎａ ｔｕｒｅ　３２３．２２６（１９８６））および５ｑ３３．２−３３．３上のＣ ５ＦＩ−Ｒ遺伝子ＣＭ、　Ｍ、ＬｅＢｅａｕ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ 　２３１゜９８４　（１９８６）を含む、ヒト染色体の４および５が共通の祖先 に由来する証拠が存する（Ｄ、Ｅ、Ｃｏｍｉｎｇｓ、　Ｎａｔｕｒｅ２３８、４ ５５（１９７２））。これらの関連レセプター遺伝子は、４ｑ上のセントロメア （ｃｅｎｔｒｏ＠ｅｒｅ）近（または５ｑの末端半分に集まる。かくして、これ らの遺伝子の先祖が単一の祖先の染色体に限定されたならば、リンケージの切断 は長腕（ｌｏｎｇ　ａｒｍ）内の逆位によって説明されるであろう。

また本研究は、異なったＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子が、それぞれが発現される細胞とは 明らかに独立した結合特性を有する２種のレセプタータイプをエンコードするこ とを明らかにしている。この観察の示唆するところは、他のレセプターに関する 知識を考慮すれば一層よく評価することができる。

より複雑な生物が進化するにつれて、細胞間伝達機構の複雑性も同じく増大して いる証拠が浮上してきている。関連したＥＧＦおよびＴＦＧα分子が類似した親 和性をもって共通のレセプターであるＥＧＦレセプターと作用する　（Ｊ、Ｍａ ｓｓａｇｕｅ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５８＋　１３６１４（１９８ ３））。

これらの成長因子の発生および組織発現の色々のパターンは（Ｒ，Ｄｅｒｙｎｃ ｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４７＋　７０７（１９８７）Ｈ Ｄ、Ｃ，Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉａｓ、　５．３６ ４４（１９８５）；　Ｄ、Ｒ，丁−ａｒｄｚｉｋ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４５ ．　５４１３（１９８５）；Ｒｊ、Ｃｏｆｆｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒ ｅ　３２８．８１７（１，９８７））　、これらの現在存在する意味を説明する ものと考えられる。

進化論的に多岐にわたるレセプター遺伝子の例も増加している。このような遺伝 子の成長物は、ＰＤＧＦやＣ５Ｆ−１レセプターの例のように、全く異ったりガ ントに対応可能であるか（Ｅ、Ｓ、Ｋａｗａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｔ、　５ｃｉｅ ｎｃｅ２３０２９１（１９８５）；　Ｃ，Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｎａｔｕｒｅ　３２０＋６９５　（１９８６）　）、またはその代りに、ＩＧ Ｆ−１およびインシュリンレセプターにおける如く関連リガンドに反応できる（ Ａ、Ｕｌｌｒｉｃｈｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１３（１９８５）；　Ｙ 、Ｅｂｉｎａｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　４０．７４７（１９８５）；　Ａ、Ｕ ｌｌｒｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、。

ＥＭＢＯＪ、　５．２５０３（１９８６））、ここで、レセプター並びにそれら のりガントの発生および組織の特異的発現、さらに触発された生化学的反応は１ 、生体の複雑性とともに進化してきている。

本研究で示されたように、ＰＤＧＦによって仲介された反応は、２種の遺伝子に よってエンコ・−ドされた異なったダイマー型の関連リガンドを含むだけでなく 、異なったＰＤＧＦレセプターを同じ（エンコードする２種の関連遺伝子をも含 む、それらの組織特異的発現（Ｃ。

Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２０．６９５（１９８６ ）；Ｒ，Ａ、５ｅｉｆｅｒｔ。

Ｓ、Ｍ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ＋　Ｄ、Ｆ、Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ　Ｎａｔｕｒｅ　 ３４．６６９（１９８４）；Ｍ、Ｊａｙｅ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　 ２２８＋　８８２（１９８５）；　Ｊ、Ｎｉ１ｓｓｏｎｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２．４４１８（１９８５）； Ｔ、Ｃｏ１１ｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１６．７４８（１９８ ５））における相異に加えて、この２種のＰＤＧＦ遺伝子成長物は、彼等の相対 的な分泌能において異なることが知られている。

ＰＤＧＰ−Ａ鎖はＢ鎖よりもはるかに効果的に遊離され（Ｐ。

Ｂｅｃｋｓａｎ　ｅｔ、　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４１．１３４６（１９ ８８）、このことがＰＤＧＦ−Ａｌに比較的大きく離れても作用する可能性を与 える。

今迄調査されたすべての正常な組織中に２種のＰＤＧＦレセプター遺伝子が同時 に発現する今回の証拠を考えると、これらの組織特異的発現は、これらの機能の 主要な決定因子ではないのであろう。しかしながら、本発明の方法を胎児発生期 間および正常な同質の細胞集団における各レセプタータイプ発現の包括的な調査 に通用することによって、示差調節（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｒｅｇｕｌａｔ ｉｏｎ）の証拠が明らかにされ得る。

記載の背景および今回の発表を完成するため各発表論文、特許および今迄本文中 で同定された特許明細書をここで参考文献として明細書中に引用する。

上述のように本発明が明瞭に理解できるよう若干詳細に記載した０本発明の範囲 から逸脱することなく形式や詳細を色々と組合わせることができることもまた明 らかであろう。

Ｆ工ＧｔＪＲＥ１ ＦＸＧＵＢＸ　２ Ｆｉｇｕｒｅ　コ・ Ｑ Ｆｉｇｕｒｅ　６゜ Ａ　Ｉ２３４５１５　Ｂ　１２３４５１５Ｃ１２３４５ｅｙａｅ１ｏ１１ ＦＩＧ、７Ａ Ｑ）　１２５１−ＨｕｍａｎＰＤＧＦｂｉｎｄｉｎｇ（ｃｐｍｘｌｏ−２／ｗｅ 川１山マ贋ｔｉ１〒； ＦＩＧＵＲＥ　９ ＦＩＧ、１２ ＰＤＧＦ　（ｎｇ／ｍ１） ＦＩＧ、＋３ ２０　４０　６０　８０　ｔｏ０ ＰＤＧＦ　（ｎｑ／ｍ１） ＰＤＧＦ　（ｎｇ／ｍｌ＞ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年８月９日園

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトのタイプαＰＤＧＦレセプター蛋白質をエンコードするＤＮＡ　セグメ ント。
2. ２．該セグメントがゲノムクローンＴＩＩ　またはｃＤＮＡクローンＴＲ４から なる請求の範囲第１項に記載のＤＮＡセグメント。
3. ３．該蛋白質が第３図に明示されたアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項に記 載のＤＮＡセグメント。
4. ４．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡセグメントおよびベクターからなる組換Ｄ ＮＡ　分子。
5. ５．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ　セグメントで形質転換した細胞の培養。
6. ６．ヒトのタイプαＰＤＧＦレセプター蛋白質を成長する方法において、該蛋白 質が成長される条件下で請求の範囲第５項記載の細胞を培養し、かつ該細胞から 該蛋白質を分離することからなるヒトのタイプαＰＤＧＦレセプター蛋白質を成 長する方法。
7. ７．第３図に明示されたアミノ酸配列を有するヒトのタイプαＰＤＧＦレセプタ ー蛋白質。
8. ８．請求の範囲第７項記載のタイプαのヒトＰＤＧＦレセプター蛋白質のアミノ 酸配列を有する蛋白質に対して特異的な抗体。
9. ９．該抗体がタイプαのＰＤ６Ｆレセプター蛋白質に対してのみ特異的な請求の 範囲第８項記載の抗体。
10. １０．該抗体がタイプβのヒトＰＤＧＦレセプター蛋白質に対してのみ特異的な タイプβのヒトＰＤＣＦレセプター蛋白質のアミノ酸配列を有する蛋白質に対し て特異的な抗体。
11. １１．タイプαＰＤＧＦレセプター遺伝子の発現に対するバイオアッセイにおい て、ｉ）該ＤＮＡプローブおよび相補ＲＮＡを含むＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド 分子が成長される条件のもとでＲＮＡを含むと推定される生物試料を請求の範囲 第１項記載のＤＮＡセグメントを含むＤＮＡプローブと接触させ、かつ、ｉｉ） 該ハイブリッド分子に存在する該ＤＮＡプローブの量を定の量するステップから なるタイプαのＰＤＧＦレセプター遺伝子発現のバイオアッセイ。
12. １２．タイプαＰＤＧＦレセプター抗原に対するバイオアッセイにおいて、ｉ） 該抗体および該抗原の特異的複合体が成長される条件のもとで、ポリペプチドを 含むと推定される生物試料を請求の範囲第８項記載の抗体と接触させ、かつｉｉ ）該複合体における該抗体の量を定量するステップからなるタイプαＰＤＧＦレ セプター抗原に対するバイオアッセイ。
13. １３．タイプβＰＤＧＦレセプター抗原に対するバイオアッセイにおいて、ｉ） 該抗体および該抗原の特異的複合体が成長ずる条件のもとでポリペプチドを含む と推定される生物試料を請求の範囲第１０項記載の抗体と接触させ、かつ、ｉｉ ）該複合体における該抗体の量を定量するステップからなるタイプβＰＤＧＦレ セプター抗原に対するバイオアッセイ。
14. １４．ＰＤＧＦの潜在的類似体のタイプαのＰＤＧＦレセプターによって仲介さ れた活性をテストするためのバイオアッセイにおいて、ｉ）ＰＤＧＦの類似体で あると想定される分子を請求の範囲第５項記載の細胞によって成長されたαタイ プのＰＤＣＦレセプターと接触させ、該ＤＮＡセグメントで形質転換する前の該 細胞の生存率は通常インターロイキン３に依存する、かつｉｉ）該細胞において 該タイプαレセプターによって仲介された生物学的活性の量を定量するステップ からなるＰＤＧＦの潜在的類似体のタイプαＰＤＧＦレセプターによって仲介さ れた活性をテストするためのバイオアッセイ。
15. １５．ＰＤＧＦの潜在的類似体の、タイプβのＰＤＧＦレセプターによって仲介 された活性をテストするバイオアッセイにおいて、ｉ）ＰＤＧＦの類似体である と想定される分子をタイプβＰＤＧＦレセプター蛋白質をエンコードするＤＮＡ セグメントによって形質転換した細胞によって成長したタイプβのＰＤＧＦレセ プターと接触させ、該ＤＮＡによって形質転換される前該細胞の生存率は通常イ ンターロイキン３に依存する、かつｉｉ）該細胞における該タイプβレセプター によって仲介された生物学的活性の量を定量するステップからなるＰＤＧＦの潜 在的類似体のタイプβのＰＤＧＦレセプターによって仲介された活性をテストす るためのバイオアッセイ。