UA74129C2 - Виділене антитіло або фрагмент антитіла, що є специфічним до онкоембріонального домену ed-b фібронектину (fn) та таким, що безпосередньо з ним зв'язується - Google Patents

Abstract

Винахід належить до антитіла, що є специфічним до онкоембріонального домену ED-B фібронектину (FN) та такого, що безпосередньо з ним зв'язується. Цей винахід також стосується способів продукування згаданого антитіла, фармкомпозиції, діагностичного набору, що його містить, та застосування виділеного антитіла для виготовлення лікарського засобу для спрямованої доставки до пухлин.

Description

Опис винаходу

Цей винахід має відношення до специфічних зв'язувальних агентів для ембріональної ізоформи 2 фібронектину, ЕО-В, яка експресується також у новоутворюваній судинній сітці пухлин, що демонструється як результатами імуноцитохімічних досліджень, так і спрямованою доставкою лікарського препарату до пухлин іп мімо. Цей винахід має також відношення до матеріалів та способів, пов'язаних з такими специфічними зв'язувальними агентами.

Головною метою більшості існуючих форм терапії пухлин є забиття максимальної кількості складових клітин 70 пухлини. Обмежений успіх, якого було досягнуто за допомогою хіміотерапії та променевої терапії, пов'язується з відносною відсутністю специфічності згаданих, способів лікування та їх схильністю до токсичного побічного впливу на нормальні тканини. Один з шляхів поліпшення пухлинної вибірковості терапії полягає у доставці лікарського засобу до пухлини за посередництвом зв'язувального білку, який, як правило, включає зв'язувальний домен антитіла зі специфічністю до маркерного антигену, який експресується на поверхні пухлини, але є 12 відсутнім у нормальних клітин.

Прикладом цієї форми спрямованої терапії, яка позначається розпливчастім терміном "магічні кулі", були, головним чином, моноклональні антитіла (птАБбз) гризунів, які є специфічними до так званих пухлиноспецифічних антигенів, експресованих на поверхні клітини. Подібні тАбБ5з можуть хімічним шляхом кон'югуватись з цитотоксичною складовою (наприклад, токсином або лікарським засобом) або ж продукуватись, як рекомбінантний злитий білок, причому гени, які кодують згадане моноклональне антитіло та згаданий токсин, зв'язуються докупи і експресуються послідовно.

Підхід "магічна куля" має обмежений, але суттєвий вплив під час лікування раку у людей, що знаходить найбільший прояв у спрямованій доставці лікарських препаратів до пухлин лімфоїдного походження, коли злоякісні клітини стають найдосяжнішими для терапевтичної дози лікарського засобу, який вводять до с кровообігу. Однак, лікування твердих пухлин залишається серйозною клінічною проблемою, оскільки впливу Ге) терапевтичних імунокон'югатів, які циркулюють у кровообізі, піддаються, головним чином, клітини, які знаходяться на зовнішній периферії згаданої пухлини; ці периферійні мішені утворюють так званий "бар'єр зв'язувального сайту", який запобігає проникненню до внутрішньої частини пухлини ІДжавід (димжмеїа) та інші, 1992, Сапсег Кев. 52 5144-5153). Тканина у межах згаданої пухлини, завдяки волокнистій стромі та компактній Ме. масі пухлинних клітин, є, як правило, занадто щільною для проникнення молекул у діапазоні розміру антитіл. с

Більше того, пухлини, як відомо, мають підвищений інтерстиціальний тиск завдяки відсутності лімфатичного дренування, що також перешкоджає припливу екзогенних молекул. Див. свіжу оглядову статтю |Джен Р. (даіп К.) -- (1994), сі. Ат. 271 58-65), присвячену факторам, які впливають на включення терапевтичних засобів до пухлин. «І

Незважаючи на існування очевидних обмежень для лікування твердих пухлин шляхом спрямованої доставки

Зо пухлиноспецифічних антигенів, згадані пухлини все ж таки мають загальну рису, яка забезпечує альтернативну - антигенну мішень для антитілотерапії. Після перевищення певного розміру, пухлини, без виключення, стають залежними від незалежного кровопостачання для адекватного забезпечення киснем та живильними речовинами для підтримки росту. У разі, якщо до цього кровопостачання можна буде втрутитись або його перекрити, це « надасть реальну потенційну можливість приречення тисяч пухлинних клітин до голодування у процесі росту. Під З час свого розвитку пухлина переключається на ангіогенний фенотип шляхом продукування різноманітних с наборів ангіогенних факторів, які впливають на ендотеліальні клітини прилеглих капілярів з стимулюванням їх

Із» проліферації та міграції. Структура цих новоутворених кровоносних судин є вкрай неупорядкованою з численними сліпими закінченнями та норицями, наслідком чого є підвищене просочування, що явно контрастує з упорядкованою структурою капілярів у нормальній тканині. Індукування ангіогенезу супроводжується активацією експресії поверхневих антигенів певних клітин, багато з яких є спільними з судинною сіткою. Ідентифікування і антигенів, які є специфічними для новоутвореної судинної сітки пухлин, є головним обмежувальним фактором «» для розвитку загальної терапії для твердих пухлин шляхом спрямованої доставки лікарських препаратів до судинної сітки. Згаданий антиген, який є предметом цього винаходу, має безпосереднє відношення до цієї - проблеми. ка 20 Під час прогресування пухлини, позаклітинний матрикс довколишньої тканини піддається реструктуризації через посередництво двох головних процесів: (1) протеолітична деградація складових позаклітинного матриксу с нормальної тканини та (2) синтез де помо складових позаклітинного матриксу як пухлинними клітинами, так і клітинами, які мають відношення до строми, активованих цитокінами, індукованими пухлиною. Два вищезгадані процеси, у сталому стані, призводять до утворення "пухлинного позаклітинного матриксу", який забезпечує більш 29 придатне середовище для прогресування пухлини, а також якісно та кількісно відрізняється від позаклітинного

ГФ) матриксу нормальних тканин. Серед складових цього матриксу знаходяться великі ізоформи: тенасцин та фібронектин (ЕМ); у описі цих білків, як ізоформ, визнається їх екстенсивна структурна гетерогенність, яка о проявляється на транскрипційної/у, посттранскрипційному та посттрансляційному рівні (див. далі). Предметом цього винаходу є одна з ізоформ фібронектину, так звана ізоформа В-- (В-ЕМ). 60 Фібронектини (ЕМ) є мультифункціональними глікопротеїновими складовими великої молекулярної маси як позаклітинного матриксу, так і загальної води організму. Вони є залученими до багатьох різних біологічних процесів, наприклад, до утворення та підтримки нормальної клітинної морфології, міграції клітин, гемостазу та тромбозу, загоєння ран та пухлинного перетворення |див. оглядові статті Алітало (Аїйаїо) та інших, 1982;

Ямада (Уатада), 1983; Гайне (Нупевз), 1985; Рослаті (Киозіапйії) та інших, 1988; Гайне, 1990; Оуенс (Омепв) та бо |інші, 1986). Структурна різноманітність фібронектинів обумовлена альтернативним сплайсингом трьох ділянок

(ЕБ-А, ЕО-В та ШСЗ) первинного фібронектинового транскрипту (Гайне, 1985; Зарді (7агаї) та інші, 1987) з утворенням, як мінімум, 20 різних ізоформ, причому експресування деяких з них відрізняється у пухлинній та нормальній тканині. Як відомо, одночасно з регулюванням, специфічним для тканин та шляху розвитку, характер сплайсингу мРНК передфібронектину у трансформованих клітин та злоякісних пухлин виявляється розрегульованим |Кастеллані (СавзіейПйапі) та інші, 1986; Борсі (Вогві) та інші, 1987; Вартіо (Мапйіо) та інші, 1987; Зарді та інші, 1987; Барон (Вагопе) та інші, 1989; Карнемолла (Сагпетоїа) та інші, 1989; ОСяма (Оуата) та інші, 1989, 1990; Борсі та інші, 19925). Фактично, ізоформи фібронектину, до складу яких входять послідовності ЕО-А, ЕО-В та ШС5, більшою мірою експресуються трансформованими клітинами та клітинами /о злоякісних пухлин, аніж нормальними клітинами. Зокрема, ізоформи фібронектину, до складу яких входить послідовність ЕО-В (ізоформа Вк), експресуються на високому рівні ембріональними та пухлинними тканинами, а також під час загоєння ран, у той час як їх експресія нормальними тканинами дорослої особи є обмеженою (Нортон (Могіоп) та інші, 1987; Шварцбауер (Зспулагг7рацег) та інші, 1987; Гутман (Сцітап) та Корнблітт (Когпріїй, 1987; Карнемолла та інші, 1989; Френч-Констант (Егепсп-Сопвіапі) та інші, 1989; Френч-Констант ув та Гайне, 1989; Летінен (І айіпеп) та інші, 1991). Молекули ВАРМ не виявляються у зрілих судинах, однак є активованими у ангіогенних кровоносних судинах у нормальній тканині (наприклад, під час розвитку слизової оболонки матки), у тканині, у якій відбувається патологічний процес (наприклад, при діабетичній ретинопатії) та під час розвитку пухлини (Кастеллані та інші, 1994).

Послідовність ЕЮО-В є повним гомологічним повтором ІІ типу, яка кодується окремим екзоном та де складу го якої входить 91 амінокислота. У протилежність альтернативно сплайсованій ізоформі ШС8, яка включає зв'язувальний сайт, специфічний для клітинного типу, біологічна функція ізоформ Аж та В.- все ще становить предмет обговорень (Хамфріз (Нитрнгіез) та інші, 1986).

Присутність самої ізоформи В-- становить пухлиноіндукований антиген, однак, на додаток до цього, експресія

ЕО-В експонує у повторі 7 типу ІП (який передує ЕО-В) антиген, який, за нормальних умов, є криптантигеном; сч ов ОСКІЛЬКИ цей епітоп у молекулах фібронектину, позбавлених ЕЮО-В, не експонується, з цього витікає, що експресія ЕО-В індукує експресію неоантигенів як безпосередньо, так і опосередковано. Цей криптантигенний і) сайт утворює мішень для моноклонального антитіла (тАБ), яке позначається, як ВС-1 (Карнемолла та інші, 1992). Специфічність та біологічні властивості цього тАб було описано у ЕР 0344134 В1, і його можна одержати з гібридом, депозитованим у Європейській Колекції Культур Клітин Тварин, Портон Даун, Солебері, Ге! зо Великобританія, під номером 88042101. Моноклональні антитіла було вдаю застосовано для визначення місцезнаходження ангіогенних кровоносних судин пухлин без перехресної реактивності зі зрілим судинним с ендотелієм, що ілюструє потенціал ізоформ ЕМ для терапії судин з застосуванням мішеневих лікарськлх «- конструкцій на основі моноклональних антитіл.

Існують, однак, деякі застереження щодо специфічності ВС-1 тАбБ. Той факт, що ВС-1 безпосередньо не « розпізнає ізоформу Вт, став підставою дія питання про те, чи не може у деяких тканинах епітоп, розпізнаний ї-

ВС-1, бути демаскованим за відсутності ЕЮО-В, і, таким чином, опосередковано викликати небажану перехресну реактивність ВС-1. Більш того, ВС-1 є строго специфічним для людської ізоформи Вж. Це означає, що проведення досліджень на тваринах відносно біорозподілу та локалізації ВС-1 у пухлині є неможливим.

Незважаючи на те, що було одержано поліклональні антитіла до рекомбінантних злитих білків, до складу яких «

Входить ізоформа В (Петерс (Реїегв) та інші, 1995), вони реагують тільки з ЕМ, який було оброблено з с М-гліканазою з метою демаскування епітопу.

Додатковою загальною проблемою при застосуванні мишачих моноклональних антитіл є утворення людських ;» антимишачих антитіл (НАМА) (І Шрофф (Зспгой) та інші, 1985; Деджагер (Оеєіадег) та інші, 1988). Наслідком утворення НАМА є цілий ряд ефектів, від нейтралізування введеного антитіла, що веде до зменшення терапевтичної дози, до алергічних реакцій, сироваткової хвороби та ниркової недостатності. -І Незважаючи на те, що було ідентифіковано поліклональні антисироватки, які вступають до реакції з рекомбінантною ЕО-В (див. перед тим), виділення тАбрз» з тією ж самою специфічністю, що і у ВС-1, було, як пи правило, завжди пов'язане з труднощами, оскільки людські та мишачі білки ЕО-В демонструють, фактично, 10095 - гомологію послідовності. Таким чином, людський білок може сприйматись мишею, як аутоантиген, внаслідок чого 5о У неї не цей білок не виникає імунної реакції. Фактично, впродовж більше ніж десяти років інтенсивних де досліджень у цій галузі, було ідентифіковано тільки одне моноклональне антитіло з опосередкованою

Ге) реактивністю відносно ізоформи В-ЕМ (ВС-1) при повній відсутності прямого розпізнавання ЕО-В. Це майже безсумнівно свідчить про те, що специфічність ВС-1 спрямована на криптичний епітоп, експонований внаслідок

ЕБ-В, а не на частину самої ЕО-В, яка може бути відсутня у мишачому фібронектині і, внаслідок цього, не в розглядатись, як "своє" імунною системою миші.

Цей винахід було здійснено завдяки застосуванню альтернативної стратегії, у порівнянні до попередньо

Ф) застосованих, у якій виключено необхідність попередньої імунізації фібронектином або ЕО-В: антитіла зі ка специфічністю до ізоформи ЕЮО-В було одержано, як одноланцюговий фрагмент Гуз (зсЕм8) з бібліотек варіабельних ділянок людського антитіла, які відображаються на поверхні ниткоподібного бактеріофагу (|Ніссім бо (Міввіт) та інші, 1994; див. такс ж УУО92/01047, УУО92/20791, М/О93/06213, УУО93/11236, УУО93/191721.

Авторами цього винаходу, за допомогою бібліотеки фагів антитіл, було встановлено, що специфічні зсЕм5 можуть бути виділеними як прямим селекціонуванням на рекомбінантних фрагментах ЕМ, до складу яких входить домен ЕО-В, так і на самих рекомбінантних ЕО-В, у разі, якщо згадані антигени нанесено на тверду поверхню ("пенінг"). Ці ж самі джерела антигену було успішно використано для продукування зсув "другого 65 покоління" з поліпшеними властивостями відносно батьківських клонів у процесі "визрівання афінности".

Авторами було встановлено, що виділені зсув сильно та специфічно реагували з ізоформою В'- людського фібронектину без попередньої обробки М-гліканазою.

У разі протипухлинного застосування, людські домени зв'язування комплексів антитіло-антиген, які надаються цим винаходом, мають перевагу, яка полягає у тому, що вони не піддаються впливу людських антимишачих антитіл. На додаток до цього, як вказувалось у прикладі, наведеному перед тим, вони є придатними для проведення імуногістохімічного аналізу пухлинної тканини лк іп міго, так і іп мімо. Ці та інші застосування додатково обговорюються у цьому описі і є очевидними для пересічних фахівців у цій галузі.

Термінологія

Специфічний зв'язувальний агент 70 Цей термін означає члена пари молекул, які мають взаємну зв'язувальну специфічність. Згадані члени специфічної зв'язувальної пари можуть бути одержані природним шляхом або синтезуватись повністю або частково. Один з членів згаданої пари молекул має на своїй поверхні ділянку або порожнину, яка специфічно зв'язується з і є, таким чином, комплементарною, до певної просторової та полярної структури іншого члену згаданої пари молекул. Таким чином, члени згаданої пари мають властивість специфічного взаємного /5 Зв'язування. Прикладами типів специфічних зв'язувальних пар є антиген-антитіло, біотин-авідин, рецептор комплексу гормон-гормон, рецептор-ліганд, фермент-субстрат.

Антитіло

Цей термін означає природний імуноглобулін або імуноглобулін, частково або повністю одержаний синтетичним шляхом. Згаданий термін означає також будь-який поліпептид або білок, який має зв'язувальний домен, який є доменом зв'язування антитіла (або гомологічним до нього). Згадані поліпептиди або білки можуть бути одержаними з природних джерел або частково/повністю продукуватись синтетичним шляхом. Прикладами антитіл є ізотипи імуноглобуліну та їх субкласи; фрагменти, які мають домен зв'язування антитіла, наприклад,

Еар, зсЕм, Ем, аАБ, га; та половинчасті антитіла.

Можна взяти моноклональні та інші антитіла і застосувати методи генної інженерії для одержання інших сч ов антитіл або химерних молекул, які зберігають специфічність вихідного антитіла. Такі методи можуть залучати введення ДНУ, яка кодує варіабельну ділянку імуноглобуліну, або гіперваріабельні ділянки (СОКз) антитіла до і) константних ділянок, або константні ділянки плюс остовні ділянки різних імуноглобулінів. Див., наприклад,

ЕР-А-184187, В 2188638А або ЕР-А-239400). Гібридома або інша клітина, яка продукує антитіло, може бути об'єктом генетичної мутації або інших змін, які можуть або можуть не змінювати зв'язувальну специфічність Ге! зо продукованих антитіл.

Оскільки антитіла можуть бути модифіковані різними шляхами, термін "антитіло" повинен розглядатись як с такий, що означає будь-який специфічний зв'язувальний член або речовину, яка має зв'язувальний домен з «- необхідною специфічністю. Таким чином, цей термін означає фрагменти антитіл, їх похідні, функціональні еквіваленти або гомологи антитіл, у тому числі, будь-який поліпептид, який включає домен зв'язування - імуноглобуліну (як природного, так і повністю/частково одержаного синтетичним шляхом). Сюди входять також ї- химерні молекули, які включають домен зв'язування імуноглобуліну або його еквівалент, злиті з іншим поліпептидом. Клонування та експресію химерних антитіл описано (у ЕР-А-0120694 та ЕР-А-01250231.

Було показано, що фрагменти цілого антитіла можуть виконувати функцію зв'язувальних антитіл. Прикладами зв'язувальних фрагментів є (ії) фрагмент Раб, який складається з доменів МІ, МН, Сі. та СНІ; (її) фрагмент Ра, « який складається з доменів МН та СНІ; (ії) фрагмент Ем, який складається з доменів МІ та МН окремого з с антитіла; (ім) фрагмент ЯАБ ГУорд (УУага) та інші, 1989), який складається з домену МН; (м) ізольовані . гіперваріабельні ділянки; (мі) фрагменти К(ар)2, двовалентний фрагмент, який складається з двох пов'язаних и?» фрагментів Раб; (мії) одноланцюгові молекули Ем (зсЕУ), де домен МН та домен МІ. зв'язані пептидним лінкером, який надає двом доменам можливість об'єднання з утворенням сайту зв'язування антигену |Бірд (Віга) та інші, 1988; Гастон (Нивіоп) та інші, 19881; (мії) біспецифічні одноланцюгові димери Ем (РСТ/0О592/09965) та (їх) -І "половинчасті антитіла", мультивалентні або мультиспецифічні фрагменти, які було сконструйовано шляхом злиття генів (МУО94/13804: Голлігер (Ноїїїдег) та інші, 1993). о Половинчасті антитіла є мультимерами поліпептидів, причому кожний поліпептид включає перший домен, - який складається зі зв'язувальної ділянки легкого ланцюгу імуноглобуліну, та другий домен, який складається

Зі зв'язувальної ділянки важкого ланцюгу імуноглобуліну; обидва згадані домени є зв'язаними (наприклад, о пептидним лінкером), однак, нездатними до взаємооб'єднання з утворенням сайту зв'язування антигену: сайти

Ге зв'язування антигену утворюються шляхом об'єднання першого домену одного поліпептид) у межах згаданого мультимеру з другим доменом іншого поліпептиду у межах згаданого мультимеру (М/094/13804).

У разі необхідності застосування біспецифічних антитіл, ними можуть бути традиційні біспецифічні ов антитіла, які можна одержувати різноманітними шляхами |Голлігер та Вінтер (УмМіпіег), 1993), наприклад, хімічним або з гібридних гібридом, або це можуть бути будь-які фрагменти згаданих перед тим біспецифічних (Ф, антитіл. Перевага може надаватись використанню зсЕм димерів або половинчастих антитіл, на противагу ка використанню повних (двовалентних) антитіл. Половинчасті антитіла та зсЕм можуть конструюватись без Ес ділянки, з використанням тільки варіабельних доменів, що потенційно зменшує ефекти антиідіотипової взаємодії. бо До інших форм біспецифічних антитіл належать одноланцюгові "Ухапивіпв", опис яких наведено (У Траунекера (Тгашпескег) та інших, (1991).

Біспецифічні половинчасті антитіла, у протилежність біспецифічним повним антитілам, можуть також бути особливо придатними, оскільки вони легко конструюються та експресуються Е. соїї. Половинчасті антитіла (та багато інших поліпептидів, наприклад, фрагменти антитіл) з відповідними зв'язувальними властивостями, можуть бе лего відбиратись за допомогою фагового відображення |М/О94/13804| з бібліотек Якщо одне плече половинчастого антитіла повинно підтримуватись постійним, наприклад, зі специфічністю, спрямованою проти антигену Х, у такому разі можна зробити бібліотеку, де інше плече є змінним, та підібрати антитіло відповідної специфічності.

Домен зв'язування антигену

Цей термін описує частину антитіла, до складу якого входить ділянка, яка специфічно зв'язується з та є комплементарною до частини або усього антигену. У разі, якщо антиген є великим, антитіло може зв'язуватись тільки з певною частиною згаданого антигену, яка носить назву епітопу. Домен зв'язування антигену може забезпечуватись однією або декількома варіабельними доменами антитіла. У переважному варіанті, до складу домену зв'язування антигену входить варіабельна ділянка легкого ланцюгу антитіла (МІ) та варіабельна ділянка /о важкого ланцюгу антитіла (МН).

Специфічний

Цей термін означає ситуацію, коли у одного з членів специфічної зв'язувальної пари відсутнє будь-яке суттєве зв'язування з іншими молекулами, окрім тієї, яка є його специфічним зв'язувальним партнером. Цей термін застосовують також у тому разі, коли, наприклад, домен зв'язування антигену, є специфічним для певного /5 епітопу, який переноситься численними антигенами. У цьому випадку, специфічний зв'язувальний агент, який несе домен зв'язування антигену, буде здатним до зв'язування з різними антигенами, які переносять згаданий епітоп.

Функціонально еквівалентна варіантна форма

Цей вираз означає молекулу (варіант), яка, незважаючи на структурну відмінність від іншої молекули (батьківської), зберігає деяку суттєву гомологію, а також, як мінімум, деякі біологічні функції батьківської молекули, наприклад, здатність до зв'язування з певним антигеном або епітопом. Варіанти можуть бути у формі фрагментів, похідних або мутантів. Варіант, похідна або мутант можуть бути одержані шляхом модифікування батьківської молекули доданням, видаленням, заміщенням або введенням однієї або декількох амінокислот, або зв'язуванням іншої молекули. Ці зміни можуть здійснюватись на нуклеотидному або білковому рівні. Наприклад, сч ов Ззакодованим поліпептидом може бути фрагмерт Рар, який після цього зв'язується з хвостом Ес з іншого джерела. У альтернативному варіанті, може бути зв'язаним маркер, наприклад, фермент, флуоресцеїн і т.ін. і)

За цим винаходом, надається специфічний зв'язувальний агент, який є специфічним для онкоембріонального домену ЕО-В фібронектину (ЕМ).

Специфічні зв'язувальні агенти, за цим винаходом, безпосередньо зв'язуються з доменом ЕО-В. За одним Ге! зо варіантом втілення, специфічний зв'язувальний агент зв'язується, після обробки ЕМ протеазою термолізином, з будь-яким або усіма фібронектинами, до складу яких входить ЕО-В. За додатковим варіантом втілення, с специфічний зв'язувальний агент зв'язується з будь-яким або усіма фібронектинами, до складу яких входять «- гомологічні повтори типу І, які включають домен ЕО-В. Відомі фібронектини ідентифіковано |У двох роботах

Карнемолла (Сагпетоїіа) та інших, 1989; 19921. Посилання на "усі фібронектини, до складу яких входить ЕЮО-В" « зв Може розглядатись, як посилання на усі фібронектини, ідентифіковані у згаданих роботах, як такі, що включають ї-

ЕО-В.

Специфічний зв'язувальний агент, у переважному варіанті, зв'язує людський ЕЮО-В, та, у переважному варіанті, В-ЕМ, як мінімум, одного іншого виду, наприклад, миші, пацюка та/або курчати. У переважному варіанті, згаданий член специфічної зв'язувальної пари є здатним до зв'язування як ЕЮО-В людського « фібронектину, так ії ЕО-В нелюдського фібронектину, наприклад, миші, що надає можливість випробування та пт) с аналізу члену специфічної зв'язувальної па; ж на тваринній моделі.

Члени специфічної зв'язувальної пари, за цим винаходом, зв'язують ЕО-В фібронектину без конкурування з ;» загальнодоступним депозитованим антитілом ВСО-1, яке обговорюється у цьому описі. ВС-1 є строго специфічним для людської ізоформи Вт. Члени специфічної зв'язувальної пари, за цим винаходом, не зв'язують той же самий епітоп, що і ВС-1. -І Зв'язування специфічним зв'язувальним агентом, за цим винаходом, ВАЕМ може пригнічуватись доменом

ЕО-В. пи За одним з аспектів цього винаходу, зв'язувальний домен, відносно ЕО-В ЕМ, має постійну дисоціації (Ка) - 6Х108М або менше, у разі визначення у формі чистого мономеру. юю 50 За одним з аспектів цього винаходу, зв'язувальний домен реагує з, тобто є здатним до зв'язування з ЕО-В фібронектину без попередньої обробки згаданого ЕО-В фібронектину М-гліканазою. (Че) Члени специфічної зв'язувальної пари, за цим винаходом, можуть надаватись у вигляді ізолятів або у очищеній формі, тобто, у вигляді препарату або лікарської форми, вільних від інших членів специфічної зв'язувальної пари, наприклад, антитіл або фрагментів антитіл, або вільних від інших членів специфічної

Зв'язувальної пари, здатних до зв'язування ЕО-В фібронектину. У переважному варіанті, специфічні зв'язувальні агенти, за цим винаходом, надаються у, по суті, чистій формі. Вони можуть бути "моноклональними" у тону о значенні, що походять з одного клону, у противагу обмеженню антитілами, одержаними за допомогою ко традиційної гібридомної технології. Як обговорювалось перед тим, члени специфічної зв'язувальної пари, за цим винаходом, можуть одержуватись за допомогою технології відображення бактеріофагу та/або експресії у бо рекомбінантних, наприклад, бактеріальних клітинах-хазяях. Попереднього розкриття моноклонального члену специфічної зв'язувальної пари, який безпосередньо зв'язує ЕО-В фібронектину, не існує.

У переважному варіанті, до складу специфічного зв'язувального елеменгу входить антитіло. Специфічний зв'язувальний елемент може включати поліпептидну послідовність у формі фрагменту антитіла, наприклад, одноланцюгового Ем (зсЕм). Можуть бути використані фрагменти антитіл інших типів, наприклад, Раб, Раб, 65 Кіаб)2, Рарс, Рась або половинчасте антитіло ІВінтер та Мілстайн (Міївіеіп), 1991; М/О94/138041. Специфічний зв'язувальний агент може бути у формі повного антитіла. Згадане повне антитіло може бути у будь-якій з форм ізотипів антитіл, наприклад, дО, ІдДА, 90, ІДЕ та ІМ, та у будь-якій з форм субкласів ізотипу, наприклад,

ІДО1 або Ідсаі.

Згадане антитіло може мати будь-яке походження, наприклад, людське, мишаче, овече або кроляче.

Фахівцям у цій галузі є очевидними інші похідні. У переважному варіанті, згадане антитіло має людське походження. Термін "людське" означає антитіло, яке частково або повністю одержано з людської кКДНК, білкової .або пептидної бібліотеки. Цей термін включає гуманізовані пептиди або білки нелюдського походження, які було піддано модифікуванню з метою надання людських характеристик молекулі антитіла і, таким чином, надання згаданій молекулі можливості проходження захисних рівнів імунної системи людини. 70 Специфічний зв'язувальний агент може одержуватись також методами генної інженерії і бути, наприклад, біспецифічною молекулою антитіла (або фрагментом, наприклад, К(аб)2), яка має одне плече зв'язування антигену (тобто, специфічний домен) проти ЕО-В фібронектину, як розкривається у описі, та інше плече проти іншої специфічності або двовалентної/мультивалентної молекули.

На додаток до послідовностей антитіла, до складу специфічного зв'язувального агенту можуть входити інші /5 амінокислоти, наприклад, ті, які утворюють пептид або поліпептид, або згадана молекула може наділятись іншими функціональними характеристиками на додаток до здатності зв'язування антигену. Наприклад, згаданий специфічний зв'язувальний агент може включати мітку, фермент або його фрагмент і т.ін.

Згаданий зв'язувальний домен може включати частину або весь МН домен, який кодується сегментом ембріонального типу або сегментом реаранжованого гену. Зв'язувальний домен може включати частину або 2о весь МІ. каппа домен або МУ! лямбда домен.

Згаданий зв'язувальний домен може включати послідовність МНІ1, МНЗ або УНА ембріонального гену або її реаранжовану форму.

Специфічний зв'язувальний агент, за цим винаходом, може включати варіабельну ділянку важкого ланцюгу (МН" домен), яка є похідною людського сегменту ембріонального типу ОРА7, послідовність якого представлено сч ов на ФіглЛ(а), залишки 1-98. Опис номенклатури "ОР" наведено (У Томлінсона (Тотіїпвоп) та інших, (1992)).

Згадана амінокислотна послідовність СОКЗ може мати наведений далі вигляд: Зег Ге Рго Гуз. Згаданою (8) амінокислотною послідовністю СОКЗ може бути сіу Ма! Су АІа РНе Аго Рго Туг Агд Гуз Нів Сію. Таким чином, згаданий зв'язувальний домен специфічного зв'язувального агенту, за цим винаходом, може включати УН домен, до складу якого входять амінокислотні послідовності, представлені на Фіг.1(а) для СО51 та СО52. Ге! зо Згаданий зв'язувальний домен може включати варіабельну ділянку легкого ланцюгу ("МІ" домен), яка є похідною людського сегменту ембріонального типу ОРІ 16, послідовність якого представлено на Фіг.1(р), як с кодони 1-90. «-

Згаданий домен МІ. може включати послідовність СОКЗ Авп Зег Зег Рго Маї Маї І еи Азп Су Маї Маї. Згаданий домен МІ. може включати послідовність СОКЗ Авп Зег Зег Рго РНе Сім Ніз Авп І еи Маї Маї. «

Специфічні зв'язувальні агенти за цим винаходом можуть включали функціонально еквівалентні варіанти ї- послідовностей, наведених на Фіг.17, наприклад, одну або декілька амінокислот було введено, видалено, заміщено або додано, за умови збереження властивості, яку наведено у цьому описі. Наприклад, послідовність

СОКЗ може бути змінена або остовні ділянки можуть бути піддані одній або декільком змінам, або згадана остовна ділянка може бути заміщена іншою остовною ділянкою або модифікованою формою, за умови, що « специфічний зв'язувальний агент зв'язує ЕО-В. з с Одна або декілька гіперваріабельних ділянок з домену МІ. або МН домену зв'язування антигену можуть бути використані у так званому "СОК-трансплантуванні", у якому одна або декілька СОК послідовностей першого з антитіла вміщені до остовної ділянки послідовностей не цього антитіла, наприклад, іншого антитіла, як розкривається (у ЕР-8-02394001. СОК послідовності для СО51 та СО52 наведено на Фіг.1(а) та 1(Б).

Специфічним зв'язувальним агентом, за цим винаходом, може бути такий агент, який конкурує з антитілом -І або зсЕм, опис яких наведено, за зв'язування з ЕО-В фібронектину. Конкурування між зв'язувальними агентами може бути легко проаналізоване іп міо, наприклад, міченням одного зв'язувального агенту специфічною ве репортерною групою, яка може легко виявлятись у присутності іншого неміченого зв'язувального агентас-ів), з - наданням можливості ідентифікування специфічних зв'язувальних агентів, які зв'язують той же самий епітоп або епітоп, який перекривається. о Специфічний зв'язувальний агент за цим винаходом може бути застосованим у способі, який включає

Ге) спричинення або забезпечення зв'язування специфічного зв'язувального агенту з його епітопом. Зв'язування може здійснюватись після введення ссавцю, наприклад, людині або гризуну, наприклад, миші, специфічного зв'язувального агенту. 5Б Цим винаходом передбачається застосування специфічного зв'язувального агенту, згаданого перед тим, як діагностичного реактиву для пухлин. Експериментальні дані, одержані на тваринній моделі, опис якої наводиться (Ф, далі, показують, що зв'язувальні агенти, за цим винаходом, є придатними для локалізування пухлин іп мімо. ка До переважних специфічних зв'язувальних агентів за цим винаходом належать агенти, які зв'язуються з пухлинами людини, наприклад, у кріостатних зрізах, які демонструють інвазивний або ангіогенний фенотип, а бо також ті, які зв'язуються з ембріональними тканинами, наприклад, у кріостатних зрізах. Зв'язування може бути продемонстроване імуноцитохімічним забарвлюванням.

У переважному варіанті втілення, згаданий специфічний зв'язувальний агент не зв'язує або суттєво не зв'язує тенасцин, білок позаклітинного матриксу.

За іншим переважним варіантом втілення, згаданий специфічний зв'язувальний агент не зв'язує або суттєво б5 не зв'язує нормальну людську шкіру, наприклад, у кріостатному зрізі та/або як демонструється за допомогою імуноцитохімічного забарвлювання.

У додаткових варіантах втілення згадані специфічні зв'язувальні агенти, за цим винаходом, не зв'язуються або суттєво не зв'язуються з однією або декількома нормальними тканинами (наприклад, у кріостатному зрізі та/(або як демонструється за допомогою імуноцитохімічного забарвлювання), відібраними, з печінки, селезінки, нирок, шлунку, тонкої кишки, товстої кишки, яєчнику, матки, сечового міхура, підшлункової залози, надниркових залоз, скелетних м'язів, серця, легень, щитовидної залози та головного мозку.

Специфічний зв'язувальний агент для ЕО-В може використовуватись, як агент для спрямованої доставки лікарського препарату іп мімо, який може бути застосованим для специфічного демонстрування присутності та місцезнаходження пухлин, які експресують або є пов'язаними з ЕО-В фібронектину. Він може застосовуватись, як 70 імуносцинтиграфічний агент. Цей винахід надає спосіб визначення присутності клітини або пухлини, яка експресує або є пов'язаною з експресією ЕО-В фібронектину, причому згаданий спосіб включає контактування клітин зі специфічним зв'язувальним агентом у тому вигляді, у якому його надано, та визначення зв'язування згаданого специфічного зв'язувального агенту зі згаданими клітинами. Згаданий спосіб може здійснюватись іп мімо або іп міго на експериментальному зразку кліщі, видалених зі згаданого тіла.

Реактивність антитіл відносно зразку клітин може визначатись будь-якими прийнятними засобами. Однією з можливостей є мічення окремими репортерними молекулами. Згадані репортерні молекули можуть безпосередньо або опосередковано генерувати сигнали, які піддаються виявленню та, | у переважному варіанті, вимірюванню. Зв'язування репортерних молекул може бути безпосереднім або опосередкованим, ковалентним, наприклад, через пептидний зв'язок, або нековалентним. Зв'язування через пептидний зв'язок може бути го результатом рекомбінантного експресування злиття генів, які кодують молекулу антитіла та репортерну молекулу.

Одним з переважних способів є ковалентне зв'язування кожного антитіла з окремим флюорохромним, фосфорним або лазерним барвником, який посідає спектрально ізольовані характеристики поглинання або емісії. До придатних флюорохромних барвників належать флуоресцеїн, родамін, фікоеритрин та Техасський сч

Червоний. До придатних хромогенних барвників належить діамінобензидин.

Інші репортерні групи включають макромолекулярні колоїдні частинки або матеріал у вигляді твердих і) частинок, наприклад, латексні кульки, які можуть забарвлюватись, є магнітними або парамагнітними та біологічно або хімічно активними агентами, які можуть безпосередньо або опосередковано викликали сигнали, які піддаються виявленню, наприклад, спостерігаються візуально, та реєструються за допомогою електронних б зо приладів або іншим чином. Ці молекули можуть бути ферментами, які каталізують реакції, сприяють розвитку або зміні забарвлення та викликають зміни, наприклад, електричних характеристик. Вони можуть збуджуватись на с молекулярному рівні з переходом електронів між енергетичними рівнями, наслідком чого є характеристичне «- спектральне поглинання або емісія. Вони можуть включати хімічні складові, які застосовуються у поєднанні з біосенсорами. Можуть бути застосованими системи виявлення комплексів біотин/авідин або біотин/стрептавідин « зв Та лужної фосфатази. ї-

Спосіб визначення зв'язування не є особливістю цього винаходу і фахівцям у цій галузі надається можливість вибору придатного способу за власним уподобанням та загальним рівнем знань.

Згадані сигнали, які утворюються окремими кон'югатами антитіло-репортерна група, можуть бути використані для виведення абсолютних або відносних даних, які піддаються кількісному визначенню, щодо відповідного « 470 Зв'язування антитіл у зразках клітин (нормальних та експериментальних). На додаток до цього, для кількісного з с визначення загальної популяції клітин може бути застосовано загальний ядерний барвник, наприклад, пропідію . йодид, що забезпечує визначення кількісних співвідношень між окремими популяціями клітин та загальною "» кількістю клітин. У разі зв'язування радіонуклеотиду, наприклад, 7291, 111|п або У9т7То з антитілом, якщо це антитіло локалізується, переважно, у пухлині, а не у нормальних тканинах, присутність радіоізотопної мітки у пухлинній тканині може виявлятись та кількісно визначатись за допомогою гамма-камери. Якість одержаного -І зображення згаданої пухлини знаходиться у безпосередній залежності від співвідношення сигнал:шум. їх Згадані антитіла можуть використовуватись як діагностичні агенти для відслідковування пухлин з новоутвореними судинними сітками, а також застосовуватись, наприклад, у модифікованій формі, для доставки - цитотоксичних агентів або для ініціювання коагуляції у межах нових кровоносних судин, завдяки чому вони позбавляють пухлину, яка розвивається, кисню та живильних речовин і, завдяки цьому, становлять собою ді опосередковану форму терапії пухлин. (Че) Цей винахід передбачає також застосування згаданого перед тим специфічного зв'язувального агенту, як терапевтичного засобу, наприклад, у разі одержання його методами генної інженерії або шляхом поєднання або зв'язування, у вигляді злитого білку, який посідає ефекторну функцію. Специфічний зв'язувальний агент, за цим винаходом, може застосовуватись для спрямованої доставки токсину, радіоактивного елементу, Т-клітин, клітин-вбивць або інших молекул до пухлини, яка експресує або пов'язана з необхідним антигеном. о Відповідно до цього, додаткові аспекти цього винаходу надають способи лікування, які включають введення ко специфічного зв'язувального агенту у вигляді, у якому його надано, фармацевтичних композицій, до складу яких входить такий специфічний зв'язувальний агент, та використання такого специфічного зв'язувального агенту при бо виготовленні медикаменту для введення, наприклад, у способі виготовлення медикаменту або фармацевтичної композиції, який включає поєднання згаданого специфічного зв'язувального агенту з фармацевтично прийнятним наповнювачем.

За цим винаходом, передбачені композиції можуть бути введеними людям. Введення, у переважному варіанті, здійснюється у "терапевтично ефективній кількості? причому згадана кількість є достатньою для 65 благотворного впливу на пацієнта. Таким благотворним впливом може бути, як мінімум, поліпшення, як мінімум, одного симптому. Фактична введена кількість, швидкість та часовий графік введення будуть залежати від природи та тяжкості стану, який піддається лікуванню. Призначення лікування, наприклад, прийняття рішень відносно дозування і т.ін., знаходиться у межах відповідальності лікарського персоналу та лікаря. Відповідні дози антитіла є добре відомими у цій галузі; |див. Ледерманн (І едептапп) та інші, (1991); Бегшо К.Д. (Вадзпауе К.О.) та інші, (1991).

Композиція може вводитись самостійно або у поєднанні з іншими засобами лікування, одночасно або послідовно, що залежить від стану, який піддається лікуванню.

До складу фармацевтичних композицій за цим винаходом та для застосування за цим винаходом, на додаток до активного інгредієнту, може входити фармацевтично прийнятний наповнювач, носій, буфер, стабілізатор або 7/0 Інші речовини, добре відомі фахівцям у цій галузі. Такі речовини не повинні бути токсичними і не повинні зашкоджувати ефективності активного інгредієнту. Точна природа носія або іншої речовини буде залежати від шляху введення, який може бути пероральним або ж введення може здійснюватись шляхом впорскування, наприклад, внутрішньовенного.

Фармацевтичні композиції, призначені для перорального введення, можуть бути у таблетованій, капсульованій, порошковій або рідинній формі. До складу таблетки може входити твердий носій, наприклад, желатина або ад'ювант. До складу рідинних фармацевтичних композицій, як правило, входить рідкий носій, наприклад, вода, нафта, тваринна або рослинна олія, мінеральне або синтетичне масло. Вони можуть включати фізіологічний сольовий розчин, декстрозу або інший сахаридний розчин, або гліколі, наприклад, етиленгліколь, пропіленгліколь або поліетиленгліколь.

Згаданий активний інгредієнт, призначений для внутрішньовенного впорскування або впорскування до місця захворювання, може бути у формі парентерально прийнятного водного розчину, вільного від пірогенів, який має відповідний рН, ізотонічність та стійкість. Пересічні фахівці у цій галузі цілююм спроможні приготувати придатні розчини з застосуванням, наприклад, ізотонічних носіїв, наприклад, фізіологічного розчину для впорскувань, розчину Рінгера для впорскувань, лактатного розчину Рінгера для впорскувань. За потребою, с об Можуть включатись консерванти, стабілізатори, буфери, антиоксиданти та/або інші додатки.

Специфічний зв'язувальний агент, за цим винаходом, може бути одержаним шляхом експресування з і) кодувальної нуклеїнової кислоти. Нуклеїнова кислота, яка кодує будь-який специфічний зв'язувальний агент у вигляді, у якому він надається, становить один з аспектів цього винаходу; те ж саме стосується і способу одержання специфічного зв'язувального агенту, який включає експресування його з кодувальної нуклеїнової Ге!

Зо Кислоти. Експресія може традиційно забезпечуватись шляхом культивування рекомбінантних клітин-хазяїв, які вміщують відповідну нуклеїнову кислоту, за відповідних умов. с

Нуклеїнова кислота може кодувати будь-яку з амінокислотних послідовностей доменів зв'язування комплексу с п антитіло-антиген, опис яких наведено, або будь-яку функціонально еквівалентну форму. Зміни можуть здійснюватись на нуклеотидному рівні шляхом додання, заміщення, видалення або введення одного або - декількох нуклеотидів, причому згадані зміни можуть або можуть не відображатись на амінокислотному рівні у ї- залежності від виродженості генетичного коду.

Системи клонування та експресування поліпептиду у різноманітних клітинах-хазяях є добре відомими. До придатних клітин-хазяїв належать бактерії, клітини ссавців, дріжджі та бакуловірусні системи. До ліній клітин ссавців, доступних у цій галузі для експресування гетерологічного пептиду, належать клітини яєчнику « китайського хом'ячка, клітини Нег а, клітини нирок молодого хом'ячка та багато інших. Традиційним переважним з с бактеріальним хазяїном є Е. соїї. . Експресія антитіл та фрагментів антитіл у прокаріотичних клітинах, наприклад, Е. соїї, є добре и?» розробленою у цій галузі. Огляд див., |наприклад, у Плактан (Рішск(йип), (1991)). Експресія у еукаріотичних клітинах у культурі також є доступною для фахівців у цій галузі, як факультативний варіант продукування специфічного зв'язувального агенту; див. свіжі огляди, |наприклад, Рефф (Кей, (1993); Трілл (Ті) та інші, -І (19953).

Придатні вектори, до складу яких входять, відповідно, регуляторні послідовності, у тому числі, промоторні пи послідовності, кінцеві послідовності, поліаденілювальні послідовності, енхансерні послідовності, маркерні - гени та інші послідовності, можуть вибиратись або конструюватись. Вектори можуть бути плазмідами, векторами 5о на основі вірусу, наприклад, бактеріофагами або фазмідами, відповідно. Докладніше, |див., наприклад, ю Моїіесшіаг Сіопіпд: а І арогаїогу Мапиа!: друге видання, Сембрук (ЗатбгоокК) та інші, 1989, видавництво Соїа

Ге) Зргіпуд Нагбог І арогаїогу Ргезв). Багато відомих способів та протоколів маніпулювання нуклеїновими кислотами, наприклад, під час виготовлення генно-інженерних конструкцій з нуклеїновими кислотами, мутагенезу, секвенування, введення ДНК до клітин, експресування генів та аналізу білків докладно описано |у пог дво Ртоюосоїв іп Моіесціаг Віоіоду, друге видання, видавець Озбел (А!йзирбеї) та інші, видавництво дойп УМіеу 5 5опв, 19921. Згадані роботи Сембрука та інших, а також Озбела та інших включено до цього опису посиланням. (Ф) Таким чином, додатковим аспектом цього винаходу надається клітина-хазяїн, яка вміщує нуклеїнову кислоту, ка як розкривається у цьому описі. Наступним додатковим аспектом надається спосіб, який включає введення згаданої нуклеїнової кислоти до клітини-хазяїна. Згадане введення може здійснюватись будь-яким придатним во способом. У разі еукаріотичних клітин, до придатних способів належать трансфекція фосфатом кальцію, діетиламіноетилцелюлозою-декстраном, електропорація, ліпосомоопосередкована трансфекція та трансдукція з застосуванням ретровірусу або іншого вірусу, наприклад, коров'ячої віспи, або, у разі клітин комах, бакуловірусу. У разі бактеріальних клітин, до придатних способів належать трансформація хлоридом кальцію, електропорація та трансфекція за допомогою бактеріофагу. 65 Після згаданого введення може спричинюватись або здійснюватись експресія зі згаданої нуклеїнової кислоти, наприклад, шляхом культивування клітин-хазяїв за умов експресування згаданого гену.

За одним з варіантів втілення, згадана нуклеїнова кислота за цим винаходом інтегрується до згаданого геному (наприклад, хромосоми) згаданої клітин 4-хазяїна. Процес інтегрування може активізуватись завдяки включению послідовностей, які стимулюють рекомбінування зі згаданим геномом, відповідно до стандартних способів.

Після продукування специфічного зв'язувального агенту, він може застосовуватись, наприклад, будь-яким чином, який розкривається у цьому описі, наприклад, при виготовленні фармацевтичного або діагностичного продукту, наприклад, набору, до складу якого, на додаток до згаданого специфічного зв'язувального агенту, входить один або декілька реактивів для визначення зв'язування згаданого агенту з клітинами, як 7/0 обговорювалось.

Додаткові аспекти цього винаходу та варіанти втілення будуть зрозумілими фахівцям у цій галузі. З метою повного зрозуміння цього винаходу далі наводяться приклади, які носять виключно ілюстративний, а ні в якому разі не обмежувальний характер. Посилання робляться на наступні фігури:

На Фіг.1 показано впорядковано розміщені амінокислотні послідовності МН та МІ. одноланцюгових фрагментів 7/5 8сгув СО5-1 та СО5-2. На Фіг.1(а) показано послідовності МН; на Фіг.1(р) показано послідовності МІ. Позначені

СО (1, 2 та 3). Найгомологічнішим сегментом людського ембріонального типу МН до обох фрагментів зсЕмуз є сегмент ОР47 сімейства МНЗ; сегментом МІ обох клонів є ОРІ 16, легкий ланцюг, який було використано для одержання бібліотеки вихідного зсЕм |Ніссім та інші, 19941. Підкреслено залишки, якими взаємовідрізняються два згадані клони.

Фіг2: На Фіг2А показано модель структури домену субодиниці людського ЕМ. Позначено ділянки варіабельності ШС8, ЕБ-А та ЕО-В, обумовлені альтернативним сплайсингом перед-мРНК ЕМ. На згаданій Фіг. позначено також внутрішні гомології, а також головні продукти розщеплення термолізином, до складу яких входить ЕО-В |Зарді та інші, 1987). На Фіг.2В8 показано електрофореграми плазми у поліакриламідному гелі у присутності 4-1895о додецилсульфату натрію, а також УІЗВМА ЕМ та їх термолізинових гідролізатів, забарвлених сч барвником Кумасі світло-синім та імуноблоти з застосуванням, як зондів, ВС-1, І5Т-6, СбО5-1 та СО5-2.

Нерозщеплен їй (смуга 1) та розщеплений ЕМ плазми з застосуванням термолізину у дозі Тмкг/мг ЕМ (смуга 3) та і) 10мкг/мг ЕМ (смуга 4). Нерозщеплений (смуга 2) та розщеплений У/ІЗВМА ЕМ з застосуванням термолізину у дозі 1мкг/мг (смуга 5), 5мкг/мг (смуга 6) та 1Омкг/мл (смуга 7) ЕМ. Цифрами на правій стороні вказано головні продукти розщеплення термолізином, показані на Фіг2А. Значеннями зліва вказано стандарти молекулярної Ге! зо маси у кілодальтонах (КО).

Фіг.3: На ФігЗА показано повторні послідовності ЕМ типу ПШ, які входять до складу злитих та с рекомбінантних білків, експресованих у Е. соїї та реактивність згаданих білків відносно СОо5-1 та Со5-2, а «- також відносно тАбз ВС-1 та ІЗТ-6. На Фіг.3В показано гель, забарвлений барвником Кумасі світло-синім, та імуноблоти з застосуванням, як зондів, С(О5-1, СО5-2, ВС-1, ІЗТ-6. Індексування смуг відповідає індексуванню «

Зв пептидних конструкцій у верхній частині фігури. Значеннями зліва вказано стандарти молекулярної маси у ї- кілодальтонах.

Фіг.4: Мишачий тепловізор; мишачий тепловізор, який було використано у експериментах з цілеспрямованою доставкою препарату, складається з чорної, нефлуоресцентної коробки, спорядженої вольфрамовою галогеновою лампою, фільтрами збудження та емісії, специфічними для інфрачервоного флюорофору СУ7 та « контрольованою комп'ютером 8-бітовою монохромною цифровою відеокамерою. з с Фіг5: Спрямована доставка мічених флуоресцентним барвником фрагментів антитіла до мишачої тератокарциноми РО за допомогою мономерного зсЕм (СбОо5-1) та димерного зсЕм (СбО5-1)2, спрямованих на ;» В-РМ. Димерний зсЕм (01.3)2 зі зв'язувальною специфічністю до лізоциму було використано, як негативний контроль.

Фіг6: Спрямована доставка мічених флуоресцентним барвником фрагментів антитіла до мишачої -І тератокарциноми РО за допомогою афінно зрілого зсЕм (Сб0о5-2) та нижчого за рівнем афінности зсЕм (2851), спрямованих на один епітоп В-ЕМ. Цілеспрямовану доставку виявлено як у великих пухлинах (приблизно, 0,6 ве грама), які через 48 годин вкрились кіркою чорного кольору, яка частково погіршує зображення, так і у - невеликих пухлинах (приблизно, 0,2 грама).

Усі згадані документи включено до цього опису як посилання. ю Перелік Прикладів

Ге) Приклад 1 - Виділення людських зсЕмув, специфічних для домену ЕЮ-В людського ЕМ.

Приклад 2 - Визрівання афінности людських зсЕмв, специфічних для домену ЕО-В людського ЕМ.

Приклад З - Специфічність афінно зрілих зсЕмв для фібронектинів, до складу яких входить ЕЮ-В.

Приклад 4 - Застосування афінно зрілих анти-ЕО-В зсЕмз при імуногістохімічному забарвлюванні зрізів людських та мишачих пухлин.

Ф) Приклад 5 - Застосування афінно зрілих анти-ЕО-В зсЕмз при спрямованій доставці препарату до людських ка пухлин іп мімо.

Приклад 6 - Спрямована доставка препарату до ксенотрансплантованої мишачої тератокарциноми ЕГО у бо "толих" мишей.

Приклад 1 - Виділення людських зсЕмув, специфічних для домену ЕЮ-В людського ЕМ.

Для селекції рекомбінантних антитіл було використано бібліотеку людського зсЕм фагу |ІНіссім (Мівззіт) та інші, 1994). Як джерело антигену для селекції, було використано дві різні форми ЕЮО-В ізоформи і у обох випадках згаданою ізоформою був рекомбінантний білок людини. 65 Рекомбінантні ЕМ пептиди, до складу яких входили повтори типу І 2-11(8-) та 2-11(В'-) було експресовано у ЕвПегіспіа сої.

Конструкцію було виготовлено з використанням кКДНК ЕМ клонів рЕНІ154 (Корнблітт (Когпріїн() та інші, 1985), ХЕ10 та ДЕ2 ІКарнемолла та інші, 1989). Генно-інженерні конструкції на основі кКДНК, стягувальні основи 2229-4787 |Корнблітт та інші, 1985) було введено до згаданого вектору РОЕ-3/5 за допомогою набору ОІАехргезз

Від компанії Сіадеп (Четсворт, Каліфорнія). Рекомбінанти ЕМ-П 2-11 (В-) та (В) було очищено засобами імуноафінної хроматографії з застосуванням тАбБ ЗЕЗ (Піршбахер (Ріегзспраснег) та інші, 19811, кон'югованого до Сефарози 4В (компанія Ріапгтасіа). Фрагменти ДНК для одержання фрагментів рекомбінантного ЕМ, до складу яких входили гомологічні повтори типу ІП 7889, 789, ЕЮО-В та ЕМ-6, були одержані ампліфікацією за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (РОК) з застосуванням ДНК-полімерази Ма (компанія РегкКкіп 70 ЕІтег). Матрицею служила кДНК клонів ЕМ 2-11(В-) та ЕМ 2-11 (8-3. Праймери було призначено для забезпечення можливості клонування РОК продуктів до рОЕ-12 за допомогою набору ОіІАехргезз (компанія

Оіадеп). У подальшому вони трансформувались до Е. соїї та експресувались. Усі клони кКДНК було секвеновано за допомогою набору для секвенування ДНК Зедпепавзе 2.0 (компанія ОВ).

Рекомбінантні білки було очищено шляхом хроматографування (смола Мі-МТА, компанія ІМАС) у 75 Відповідності до інструкцій виробника (компанія Сіадеп) з застосуванням гексагістидинової мітки на карбоксильному кінці ЕМ фрагменту. Злитий білок ЕО-В-рса! було одержано шляхом клонування КДНК ЕО-В до вектору на основі бактеріофагу Х9И11 з одержанням клону ЛЕЮО-В. Клон ХсйЕМбО (до складу якого входила частина послідовності ЕО-В) було одержано, як злитий білок з клонованого курячого ЕМ рспЕМбоО |Нортон та інші, 19871.

Для селекції бібліотеки людського зсЕм фагу, кожен з двох різних рекомбінантних антигенів (7889 та ЕО-В) було піддано трьом циклам пенінгу. Пробірки для імунологічних досліджень (компанія Мипс; Махізогр, Роскілд,

Данія) було сенсибілізовано обома антигенами впродовж ночі у концентрації 5Омкг/мл у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (РВ5) (20ММ фосфатного буферу, 0,15М Масі, рН7,2). Першим згаданим антигеном був фрагмент рекомбінантного ЕМ 7889, домен ЕЮ-В якого фланкується прилеглими гомологічними Ге повторами ЕМ типу І; його було сенсибілізовано при 49С впродовж ночі. Другим згаданим антигеном була (5) рекомбінантна ЕО-В |Зарді та інші, 1987) з гексагістидиновою міткою на карбоксильному кінці; цей білок це має у своєму складі лізинових залишків, завдяки чому кінцева аміногрупа першої згаданої амінокислоти є доступною для сайтспецифічної ковалентної імобілізації ЕО-В до реактивних планшетів, призначених для здійснення імуноферментного твердофазного аналізу (ЕГІЗА) (компанія Мипс; Сомаїїпк). Сенсибілізацію здійснювали (є) впродовж ночі при кімнатній температурі. сч

Після трьох циклів пенінгу елюйований фаг вводили до клітин Е. соїї НВ2151 і висівали, як описано |Ніссім та інші, 19941). Після кожного циклу селекції відбирали 95 стійких до ампіциліну окремих колоній для «-- ідентифікування антигенспецифічних зсЕмз засобами ЕЇІЗА. Клони, які під час постановки Е ІЗА давали « максимальні сигнали на антигени, які було використано для пенінгу, відбирали для подальшого аналізу та для визрівання афінности. Було показано також, що згадані клони забезпечують специфічне забарвлення зрізів і - поліморфної гліобластоми та пухлин грудної залози під час імуноцитохімічного забарвлювання, докладніший опис якого наведено у Прикладі 4.

Приклад 2 - Визрівання афінности людських зсЕуз, специфічних для домену ЕЮО-В людського ЕМ. «

Клони З5СОЕ (після селекції за допомогою 7889) та 2851 (після селекції за допомогою тільки домену ЕЮ-В) було відібрано, як претендентні антитіла на визрівання афінности. З метою урізноманітнення легких ланцюгів, т с як засобу поліпшення афінности, автори цього винаходу дослідили просту стратегію визрівання афінности, ч засновану на рандомізуванні шести центральних залишків (0ОЗ5ОМН) легкого ланцюгу СОКЗ з застосуванням ни вироджених олігонуклеотидів та полімеразно-ланцюгової реакції (РСК) (Фіг.ї1), за умови потенційної різноманітності послідовностей 209-6,4Х107. Ця ділянка (разом з важким ланцюгом СОКЗ) знаходиться у центральній частині антигензв'язувального сайту |Падлен (Радіап), 1994). Автори також піддали мутації і аргініновий залишок, який безпосередньо передує ділянці з шести залишків, з одержанням серину для ї» запобігання можливості домінування електростатичних ефектів під час селекції.

Плазміду з окремої бактеріальної колонії, яка експресує "батьківський" зсЕм фрагмент, було піддано РСК - ампліфікації з праймерами І МВЗ (5 САС БАА АСА ОСТ АТО АС 3) та СОМЗ-6-МІ -ОК (5 СТ оо ССС тес ко 20 (бС САА ТАС САС МММ МММ МММ МММ МММ ММУМ АСА ОСА СТТ АСА СТА АТА СТС АСС СТ 3) (94С (171-552 1131-72 ЦЗО", 25 циклів; відносно буферів та умов, |див., Маркс (Магкв) та інші, 19911. с Одержаний продукт піддавали очищенню методом імуносорбції у лунках з гелем (з метою видалення слідових кількостей згаданої плазміди, до складу якої входить вихідний зсЕм ген) та використовували, як матрицю на другому етапі ампліфікації з праймерами І МВ3З та Л-МоїЕгОмК (5 АТТ ост тт сстТ тт тосС оос сСос осс 29 ТАб САС ОСТ СА СТТ ост ССС тТос ос 3) (94С (17-55С (17-72С ("30"), 25 циклів). Неочищений продукт (ФІ РСК, який давав одну смугу правильної молекулярної маси на агарозному гелі, видаляли очищенням безпосередньо з суміші, одержаної після проведення полімеразно-ланцюгової реакції, за допомогою центрифуги ді Зріп-Віпа (компанія ЕМС, Рокленд, Мен, США), піддавали подвійному розщепленню за допомогою Месо/Мої! та лігували до фазміди рНЕМІ, яку було очищено методом імуносорбції у лунках з гелем та розщеплено за 60 допомогою Меоі/Мої ЇХугенбум (Нооодепроот) та інші, 1991), до складу якої входила імітаційна вставка

Мео|/МоїйІ, для полегшення відокремлення вектору, який було розщеплено двічі, від вектору, який розщеплювався тільки один раз. Згаданий вектор одержували за допомогою набору Ріазтійд тахі-ргер компанії Оіадеп (Четсворт,

Каліфорнія, США). У суміші до лігування було використано, приблизно, 5мкг розщепленої плазміди та вставки.

Згадану суміш екстрагували один раз фенолом, один раз сумішшю фенолу/хлороформу/ізоамілового спирту бо (25:25:1), після чого осаджували етанолом з застосуванням глікогену (компанія Воепгіпдег, Мангейм, Германія),

як носію, та сушили за допомогою експрес-вакуумної сушарки. Одержаний осад ресуспендували у 20мкл води та піддавали електропорації у електрокомпетентних клітинах ТО1 Е. соїї (Гібсон (сірзоп), 1984). Автори цього винаходу використовували, як правило, електрокомпетентні клітини у титрі 10 "трансформантів/мкг, у разі

Застосування концентрованих розчинів гліцерину, або 10 "Отрансформантів/мкг, у разі застосування свіжовиготовлених електрокомпетентних клітин. У разі застосування процедури, опис якої наведено, вихід, як правило, складав 2107 клонів.

Після цього бібліотеку визрівання було піддано такій же самій обробці, як і у разі бібліотеки Ніссіма

ІНіссім та інші, 1994) з метою одержання фагових частинок, які було застосовано для одного циклу селекції на 70 пробірках для імунологічних досліджень, з використанням 7889 (1Омкг/мл), як антигену, після чого було здійснено наступний цикл кінетичної селекції |Хокінс (Нам/Ккіпз) та інші, 1992). Цей етап селекції було здійснено шляхом інкубування біотинільованого 7889 (1ОнНМ) з суспензією фагу (приблизно, 1072 туберкулінових одиниць) у 295 суміші молока-забуференого фосфатом фізіологічного розчину (296 МРВ5) з першого циклу селекції впродовж 5 хвилин з наступним доданням небіотинільованого 7889 (1мкМ) з витримуванням дня 72 проходження конкурування впродовж 30 хвилин. Після цього до згаданої реакційної суміші додавали 100мкл кульок, вкритих стрептавідином (Оупа!:М480), попередньо блокованих у 296 МРВ5, перемішували впродовж 2 хвилин, після чого фіксували за допомогою магніту і 10 разів поперемінно промивали (РВБЗО,190

Твін-20о-буферу) та РВ5. Частинки фагу елюювали зі згаданих кульок за допомогою 0,5мл 100ММ триетиламіну.

Після цього одержаний розчин нейтралізували 0,25мл 1М Трис-буферу, рН7,4 і використовували для інфікування клітин НВ2151, які знаходились у фазі експоненційного росту (Ніссім та інші, 1994). 95 стійких до ампіциліну окремих колоній було використано для одержання супернатантів, які вміщували зсЕм |Ніссім та інші, 1994).

Одержані супернатанти перевіряли за допомогою ЕЇ ІЗА, імуногістохімічними методами та на установці ВіАсоге з метою ідентифікування найкращих зв'язувальних агентів. Після цього згадані зв'язувальні агенти субклонували між сайтами 5ЗП1/Мо!й вектору експресії рОМ268 ІНері (Мегі) та інші, 1996), до якого додавали мітку, яка с піддається фосфорилюванню, епітоп РІГ АС та гексагістидинову мітку на С-кінцевий край всЕм. г)

Окремі колонії відповідних антитіл, субклонованих у рОМ268, вирощували при 372С на планшетах 2ХТУ, які вміщували 1О0Омг/л ампіциліну та 0,190 глюкози. Коли культури клітин досягали рівня оптичної густини

О0900-0,8, на планшети додавали середовище ІРТО до кінцевої концентрації їмМ і культивування продовжували на протязі 16-20 годин при 30 2С. Після центрифугування (центрифуга 5-3 Зогмаї! гоог, Ф 7О0боб/хв, ЗО хвилин), одержаний супернатант фільтрували, концентрували та вносили до буферу насичення се (50ММ фосфату, рН7,4, 500мММ Масі, 20мМ імідазолу) за допомогою пристрою з дотичною течією Міпізейе - (компанія Рійгоп). Одержаний розчин наносили на їмл смоли Мі-МТА (компанія Оіадеп), промивали 5О0мл буферу насичення та елюювали за допомогою елюювального буферу (50ММ фосфату, рН7,4, 500мМ Масі, 100мМмМ «І імідазолу). Одержане очищене антитіло аналізували за допомогою електрофорезу у поліакриламідному гелі у м присутності додецилсульфату натрію |(БО5-РАСЕ) (Леммлі (І аеттії), 1970) та діалізували проти РВ5 при 4260.

Очищені препарати зсЕм піддавали додатковому очищенню методом імуносорбції у лунках з гелем за допомогою хроматографічної установки для рідинної хроматографії швидкого розділення (ЕРІ С), обладнаної колонкою

З-75 (компанія Рпагтасіа), оскільки відомо, що мультивалентні зсЕм фрагменти можуть демонструвати штучне « 20 добре зв'язування на установці ВіАсоге |Джонссон (допезвоп) та інші, 19911 внаслідок ефектів авідності ІНіссім -о та інші, 1994; Крозерс (СтоїПегв) та Мецгер (Меїгодег), 1972). Концентрація антитіл у ЕРІ С-очищених мономерних с фракціях визначалась спектрофотометрично з прийняттям рівня поглинання при 28Онм 1,4 одиниці для 1мг/мл :з» 8сЕмМ розчину. Зв'язування моновалентного зсЕм у різних концентраціях у діапазоні 0,1-їмкМ у РВ5 вимірювали на установці ВіАсоге (компанія Ріагтасіа Віозепзог) з застосуванням наступних антигенів: (ї) 1000 резонансних

ОДИНИЦЬ (КО) біотинільованого фрагменту 7889 рекомбінантного ЕМ, імобілізованого на стружці, -1 сенсибілізованій стрептавідином, який специфічно зв'язувався 250 Би зсегм; (ії) 200 КИ рекомбінантного ЕО-В, хімічно імобілізованого на М-кінцевій аміногрупі, який специфічно зв'язувався 600 КИ зем; (ії) 3500 КИ т» ЕО-В-збагаченого фібронектину У/ІЗВМА (див. Приклад 3), який специфічно зв'язувався 150 КИ зсЕм. Кінетичний - аналіз даних здійснювали за інструкціями виробника. На основі якісного аналізу супернатантів, які вміщували антитіла, здійсненого на установці ВіАсоге, було відібрано по одному варіанту кожного зсЕм клону з визрілою іме) афінністю: клон С(О5-1 з селекції, яку було здійснено за допомогою фрагменту 7889, та клон СО5-2 з селекції, с яку було здійснено за допомогою фрагменту ЕЮО-В рекомбінантного ЕМ. У Таблиці 1 наведено константи швидкості асоціації (Коп) та константи швидкості дисоціації (Кок), разом з вирахованими константами рівноважної дисоціації (Ка) для обох зсЕуз та вихідного клону 2851. Незважаючи на те, що константи рівноважної дисоціації обох клонів СОо5-1 та СО5-2 знаходяться у наномольному діапазоні, клон СО5-2 продемонстрував більше поліпшення, порівняно зі своїм батьківським клоном (Ка-1нм) (поліпшення з 11ОнНМ), відносно усіх трьох білків, (Ф) які було випробувано на сенсорній стружці (Таблиця 1). Згадане поліпшення було обумовлене, головним чином, ка константою уповільненої кінетичної дисоціації (107 в"), яка визначалась за допомогою препаратів мономерних антитіл (не показано). 60 Стратегія визрівання, здається, є загальною і вона дозволила одержати антитіла з поліпшеною афінністю проти білку, який зв'язує мальтозу, цитохрому С, позаклітинного домену мишачого ендогліну (0.М., Л.Вайдер (/Муудег), Р.Клеменц (К.Кіетепг)), цитомегаловірусу (А.Р., Г.Нері (О.Мегі), Р.Ботті (К.Войі), Р.М., ядерного пухлинного маркерного білку НМОІ-С (А.Р., П.Солдані (Р.БЗоїдапі), В.Джанкотті (М.Сіапсойі), Р.М.) та маркеру пухлин яєчнику - плацентарної лужної фосфатази (М.Донарен (М.ЮОеопагаіїп) та А.А.Епенетос 65 (А.А.Ерепеїйоз)). Згадана стратегія, таким чином, здається, щонайменше, такою ж ефективною, як і інші стратегії визрівання (Маркс та інші, 1992; Лоу (ому) та інші, 1996)| і надає антитіла, афінність яких наближається до афінності антитіл, одержаних з дуже великих бібліотек комплексів фаг-антитіло (Гриффітс (ОСгійййв) та інші, 1994; Воген (Мацодпап) та інші, 1996).

Афінно зрілі клони СО5-1 та СО5-2 секвенували та піддали порівняльному аналізу з базою даних генів антитіл М людського ембріонального типу (М-ВАЗ5Е), після чого транслювали за допомогою програми МасМесіог.

Ген МН обох клонів був найбільш гомологічним до людського ембріонального ОР47 (МУНЗ), і, на додаток, кожний клон мав різні послідовності МН СОКЗ (Фіг.1). Згаданим геном МІ. обох клонів був ембріональний ОРІ 16, який використовувався під час конструювання людського синтетичного набору зсгУ, опис якого наведено у |Ніссіма та інших, 19941. МІ СОКЗ послідовності відрізнялись одна від одної у чотирьох з шести рандомізованих залишків 7/0 «Фігура 165). фрагментів зсбм СО5-1 та СО5-2 відносно білків, до складу яких входить домен ЕР-В ле || вв 101 ва 100010 | мя й

І ПТО ТЕ КЕТТ МТ Шондуттнтннння

Експерименти здійснювали, як описано у розділі "Матеріали та Методи". "Значення Кояй та Коп мають точність х/-3095, на основі точності визначення концентрацій та у зв'язку з незначною різницею результатів, які було одержано при використанні різних ділянок сенсограми для процедури підбору. Ка-к ор/Коп.

Приклад З - Специфічність афінно зрілих зсЕмв для фібронектинів, до складу яких входить ЕЮ-В. с 25 Імунореактивність двох афінно зрілих зсув, СО5-1 та СО5-2 спочатку оцінювали за допомогою ЕПІЗА і (У порівнювали безпосередньо з тАБ ВОС-1 (яке розпізнає ізоформу В-ЕМ) та тАБ ІЗТ-6, яке розпізнає тільки ізоформи ЕМ, які не мають ЕО-В ІКарнемолла та інші, 1989; 19921. Характеристики цих тАбБе повідомлялись раніше (Карнемолла та інші, 1989; 1992). У подальшому було проведено п'ять аналізів на специфічність з використанням численної групи фрагментів ЕМ, які було одержано шляхом обробки термолізином, та б 30 рекомбінантних злитих білків. с

Згадані антигени, які було використано для ЕГІЗА та імуноблотингу, бути одержані наступним чином. ЕМ очищали з людської плазми та з кондиціонованого живильного середовища лінії клітин УУІЗВМА13, як - повідомлялось раніше (|Зарді та інші, 1987). Очищені фібронектики розщеплювали термолізином (протеаза типу «ЩЕ

Х; компанія Зідта Спетіса! Со.), як повідомлялось (Карнемолла та іншими (1989)). Фрагменти нативного ЕМ 110

Зо кілодальтон (В-) та нативного ЕМ 120 кілодальтон (Вт) (див. Фіг.2) очищали з ЕМ перевару, як повідомлялось - раніше |Борсі та інші, 1991). Велику ізоформу тенасцину-С очищали, як повідомлялось (Сагінаті (Задіпаїї) та іншими (1992)). Рекомбінантні білки експресували та очищали, як описано у Прикладі 1. 5ЗО5-РАСЕ та вестерн-блотинг здійснювали, (як описано Карнемолла та іншими (1989))|. «

Усі антигени, які було використано у ЕЇІ5А, розводили у РВ5 до концентрації 50-10Омкг/мл та 70 сенсибілізували при 49 впродовж ночі у лунках планшету Іттипо-Ріаїе (компанія Мипс, Роскілд, Данія). 8 с Незв'язаний антиген видаляли разом з РВ5, після чого планшети блокували РВ5, до складу якого входило 395 (у з відношенні маси до об'єму) сироваткового альбуміну великої рогатої худоби (ВЗА), впродовж 2 годин при 3720.

Після цього планшети чотири рази промивали РВ5, до складу якого входило 0,0595 Твін-буферу 20 (РВ5Т).

Після цього антитіла зв'язувались при 372С впродовж 1,5 годин; зсЕмз попередньо інкубували з антисироваткою, -1 що спрямованою проти послідовності мітки: тАб М2 (компанія Кодак, Нью Хейвен, Коннектикут) для мітки РІГ АС або 9Е 0 (Американська колекція типових культур, Роквіл, Меріленд) для мітки тус. Контрольними перевіреними т» антитілами були тАбБз ВС-1 та ІЗТ-6. Після чотирьох промивок РВОТ, планшети інкубували впродовж 1 години - при 372С з розведеним 1:2000 (у РВ5Т 395 ВЗА) біотинільованим козячим антимишачим Ідс (компанія Віо-ЗРА

Оімізіоп, Мілан, Італія). Згадані промивки було повторено, і впродовж 1 години при 372С додавали комплекс ю стрептавідин-біотинільована лужна фосфатаза (розведення 1:800 у РВЗ5Т, до складу якого входить 2иМ МасС12)

Ге) (компанія Віо-ЗРА Оімівіоп, Мілан, Італія). Згадану реакцію здійснювали з застосуванням таблетованого фосфатазного субстрату (компанія Зідта) у 1095 діетаноламіні, рНеО,8; оптичну густину визначали при 405нм.

Результати представлено далі у Таблиці 2. о 7 вовл|рововслфвтя юю ЕМ плазми | 007 | 004 (009| 173 во вв

Тенасцин. | 001 | 002 |006 002

Імунореактивність зсЕм та моноклональних антитіл з антигенами, одержаними з фібронектину, визначали за допомогою ЕГІЗА. Наведені значення представляють оптичну густину, визначену при 405нм після віднімання фонового сигналу. Вказані дані представляють собою середнє для чотирьох експериментів з максимальним 1095 9 середнім квадратичним відхиленням.

Ідентичність різних згаданих форм фібронектину, які було використано у експерименті, виглядає наступним чином: ЕМ плазми-фібронектин плазми людини; УМІЗ8-МА ЕМ-фібронектин з супернатантів фібробластів, трансформованих 5М40 |Зарді та інші, 1987); п110кО-оброблений термолізином домен ЕМ 4 без ЕО-В; п120кО-оброблений термолізином домен ЕМ 4, до складу якого входить ЕЮО-В; гес ЕМ7В89-домен ЕО-В, то фланкований прилеглими гомологічними повторами ЕМ типу ПП; гес ЕМ 789-томологічні повтори ЕМ типу І з доменом ЕО-В; гес ЕБ-В-тільки рекомбінантний ЕО-В; гес ЕМб6-ПЛО Мен 6 рекомбінантного ЕМ.

Як Со5-1, так і бо5-2 розпізнають рекомбінантний ЕО-В пептид, а також усі нативні або рекомбінантні ЕМ фрагменти, до складу яких входить послідовність ЕЮО-В, у той же час вони не зв'язуються з жодним з ЕМ фрагментів, позбавленим ЕО-В. Крім того, СО5-1 та С(Оо5-2 не реагують з тенасцином (до складу якого входить т5 п'ятнадцять гомологічних повторів типу І: Сірі (Зігі) та інші, 1991| та ЕМ плазми, який не містить рівнів послідовності ЕО-В, які піддаються виявленню, у продуктах розщеплення термолізином |(|Зарді та інші, 1987). У протилежність цьому, СО5-1 та СО5-2 активно реагують з ЕМ, очищеним з лінії клітин УУІЗВМА, трансформованих

ЗМ40. До складу майже 70-9095 ЕМ молекул з цієї лінії клітин входить ЕЮ-В, як показують результати експериментів з розщепленням термолізином та нуклеазою 51 з застосуванням очищеного ЕМ та повної РНК, одержаної зі згаданої лінії клітин (Зарді та інші, 1987; Борсі та інші, 1992). Специфічність згаданих зсЕм8 до компоненту ЕЮ-В ЕМ було додатково продемонстровано застосуванням розчинного рекомбінантного ЕЮ-В для пригнічення зв'язування СО5-1 та/або СО5-2 з ЕМ на клітинах УУІЗВМА (дані не наведено).

Наведені дані підтверджують те, що СО5-1 та СО5-2 специфічно реагують тільки з тими похідними ЕМ, до складу яких входить домен ЕЮО-В. Воки демонструють такий же самий рівень реакційної здатності, що і тАБ ВОС-1, с за виключенням випадку з рекомбінантним ЕЮО-В, який не було розпізнано ВС-1. Згадана інтенсивність Го) одержаних сигналів ЕГІЗА відносно контрольних тАБ відображає високу специфічність двох зсЕмз до антигенів, до складу яких входить ЕО-В.

Специфічність СО5-1 та СОо5-2 було додатково досліджено на імуноблотах з використанням ЕМ з плазми та зо клітин УМІЗВУА та їх термолізинових переварів. У разі розщеплення термолізином, РМ з клітин УМІЗВМА (до складу більшості з яких входить ЕО-В) утворює фрагмент з молекулярною масою 120 кілодальтон (до складу якого се входить ЕЮО-В), та легший фрагмент з молекулярною масою 120 кілодальтон, до складу якого ЕЮО-В не входить -

ІФіг.2А; Зарді та інші, 1987). У разі додаткового розщеплення домену з молекулярною масою 120 кілодальтон утворюється два фрагменти: фрагмент з молекулярною масою 85 кілодальтон, до складу якого, на «І карбоксильному кінці, входить послідовність ЕО-В майже у повному об'ємі, та послідовність з молекулярною 35 . . о пр, - масою 35 кілодальтон |Фіг.2А; Зарді та інші, 1987).

На лівій стороні Фіг.2В представлено гелевий блок (забарвлений Кумасі) білкових фракцій, аналізованих засобами імуноблотингу. ЕМ плазми (смуга 1) та термолізинові перевари білку (смуга 3, яка вміщує білок з молекулярною масою 110 кілодальтон, та смуга 4, яка вміщує розщеплений білок з молекулярною масою 110 « дю кілодальтон) не були розпізнані СО5-1 та С(о5-2. У протилежність цьому, ЕМ клітин У/ІЗВМА, збагачений ЕО-В, як - інтактний (смуга 2), так і після інтенсивного розщеплення термолізином (смуги 5, б та 7), був розпізнаний с обома зсЕм фрагментами. Найменшим ЕМ-похідним фрагментом, який може бути специфічно розпізнаний :з» СОо5-1, був білок з молекулярною масою 120 кілодальтон (зі стягувальними повторами 2-11 типу І включно), У той час, як СО5-2, на додаток до М-кінця ЕО-В, був здатен розпізнати стягувальні повтори 2-7 фрагменту з молекулярною масою 85 кілодальтон |Фіг.28В; Зарді та інші, 1987). Ці результати свідчать про те, що два зсіЕув5 - 15 реагують з різними епітопами у межах послідовності ЕО-В. Зв'язування СО5-2 з доменом, який має молекулярну масу 85 кілодальтон, вказує на те, що епітоп для цього клону знаходиться на амінокінці ЕО-В. У протилежність т» цьому, втрата зв'язування СО5-1 у разі розщеплення домену з молекулярною масою 120 кілодальтон до домену - з молекулярною масою 85 кілодальтон демонструє те, що він розпізнає епітоп, який знаходиться ближче до карбоксильного кінця молекули ЕО-В. ко 20 Тонку специфічність СОо5-1 та СОо5-2 було додатково досліджено за допомогою імуноблотингу з с застосуванням фрагментів рекомбінантного ЕМ та злитих білків з або без послідовності ЕО-В. Злиті білки ЕМ було одержано, як описано І(Карнемолла та іншими (1989)). Результати цих експериментів представлено на Фіг.3; для ототожнення схематичної діаграми зі структурою доменів людського ЕМ, див. Карнемолла та інші, 1992.

Одержані профілі зв'язування, по суті, підтверджують те, що раніше було встановлено за допомогою ЕГІЗА та 59 імуноблотів на очищеному ЕМ та продуктах протеолітичного розщеплення: СО5-1 та СО5-2 активно реагували з

ГФ) фрагментами ЕМ, до складу яких входив ЕЮ-В (смуги 2 та 4), однак, не проявляли реактивності відносно

ГФ послідовностей ЕМ, позбавлених ЕО-В (смуги 1 та 3). СО5-1 не реагував ні з людським (смуга 5), ні з курячим (смуга 6) злитим білком ЕО-В, у той час, як 5-2 активно реагував з обома фрагментами (Фіг.3). Ці результати во можуть відображати певні конформаційні обмеження епітопу ЕМ, до складу якого входить ЕО-В, розпізнаного

Соз5-1; можливо, наприклад, що епітоп є чутливим до денатурування або некоректно представлений у разі фракціонування засобами ЗО5-РАСЕ та перенесення та тверду підкладку, наприклад, нітроцелюлозу.

Наведені результати, якщо їх взяти разом, демонструють, що СО5-1 та СО5-2 міцно та специфічно зв'язуються з фібронектинами, до складу яких входить ЕО-В, на ділянках, які відрізняються одна від одної та відрізняються від структури ЕО-В, яка розпізнається тАБ ВОС-1. 65 Приклад 4 - Застосування афінно зрілих анти-ЕО-В зсЕмз при імуногістохімічному забарвлюванні зрізів людських та мишачих пухлин.

Соз5-1 та Со5-2 було використано для імунолокалізації молекул ЕМ, до складу яких входив ЕО-В, у різних нормальних та неопластичних тканинах людини. Шкіру було обрано, як нормальну тканину, оскільки відомо, що під час загоєння поранень шкіри у макрофагах та фібробластах експресується ізоформа В-ЕМ |(Карнемолла та інші, 1989; Браун (Вгомп) та інші, 19931. Дві обрані людські пухлини раніше було аналізовано на специфічність забарвлювання антифібронектиновими тАре»г: поліморфну гліобластому докладно вивчали, оскільки клітини ендотелію у судинах цієї пухлини знаходяться у стані активної проліферації з активізованими ангіогенетичними процесами, у тому числі, експресією В-ЕМ ізоформ (|Кастеллані та інші, 1994). На додаток до цього, 7/0 дослідження, які було проведено на численній групі нормальних, гіперпластичних та неопластичних тканин грудної залози людини, надали додаткові свідчення на користь кореляції між ангіогенезом та експресією В-ЕМ

І(Качмарек (Касгтагек) та інші, 19941.

Для експериментів, опис яких наведено, імуногістохімічне забарвлювання СО5-1 та СО5-2 порівнювали з імуногістохімічним забарвлюванням тАбБ ВС-1 (яке розпізнає В-ЕМ ізоформу) та інших тАбз, які, як відомо, /5 реагують або з всіма відомими варіантами ЕМ ізоформи (ІЗТ-4), або тільки з ЕМ ізоформами, які є позбавленими

ЕО-В (151-6). Про визначення характеристик усіх згаданих контрольних антитіл раніше повідомлялось

І(Карнемолла та інші, 1989; 19921).

Нормальні та неопластичні тканини було одержано зі зразків, які відбирались під час хірургічного втручання. Встановлено, що приготування та фіксація тканин є критичною для точного та чутливого виявлення 2о молекул, до складу яких входить ЕМ (ІКастеллані та інші, 1994). Призначені для імуногістохімічних досліджень кріостатні зрізи товщиною бмкм підсушували у повітрі та фіксували у холодному ацетоні впродовж десяти хвилин. Імунозабарвлювання здійснювали за допомогою набору для забарвлювання, до складу якого входить комплекс стрептавідину-біотину та лужної фосфатази (компанія Віо-зРА Оімізіоп, Мілан, Італія), нафтолу-АБ-МХ-фосфату та барвника "Міцний Червоний" (Разі Кей ТК) (компанія Зідта). Для контрастного сч забарвлювання було застосовано гематоксилін Джілла з наступним вміщенням до гліцергелю (компанія Рако,

Карпентерія, Каліфорнія), як повідомлялось раніше Кастеллані та іншими, 1994. З метою додаткового (8) аналізування специфічності у експериментах з позитивним забарвлюванням тканин, специфічність до ЕО-В було продемонстровано попереднім інкубуванням антитіл з рекомбінантним ЕО-В доменом з наступним визначенням, як описувалось перед тим. б зо Результати цих експериментів, у цілому, показують, що СО5-1 та СбО5-2 реагують з тими ж самими гістологічними структурами, що і тАБб ВСОС-1. Картина забарвлювання, яку було одержано у разі використання с шкіри з СО5-1, Сбо5-2 та ВОС-1, відображає відсутність ЕЮО-В у ЕМ, експресованому у дермі. Під час п забарвлювання зрізів тканини інвазивного раку ендокринних залоз, СО5-1, СО5-2 та ВС-1 продемонстрували обмежений розподіл забарвлення, яке обмежується ділянкою між неопластичними клітинами та стромою. Це - співпадає з даними про те, що, незважаючи на однорідний розподіл загального об'єму ЕМ у стромі пухлини, ї- експресія В-ЕМ обмежується певними ділянками, і ними виявляються ті ж самі ділянки, які було попередньо успішно локалізовано (у 9596 випадків) при інвазивному раці ендокринних залоз за допомогою тАБ ВС-1

ІКачмарек та інші, 19941.

Було підтверджено попередні дані, одержані під час забарвлювання ВС-1 пухлини поліморфної « гліобластоми. Кастеллані та інші (1994) спостерігав типозу картину забарвлювання гломерулоподібних судинних пт») с структур, і у наших експериментах було показано, що С(о5-1 та СО5-2 забезпечують якісно ідентичні результати.

Існує, однак, важлива різниця між СОо5-1 та СОо5-2, та тАБ ВС-1: було показано, що два людські зсЕу8 ;» зв'язуються як з курячим, так і з мишачим В-ЕМ, у той час, як ВС-1 є строго людськоспецифічним. СО5-2 реагував з курячими зародками (дані не наведено), а СО5-1 та СО5-2 реагували з мишачими пухлинами.

Було продемонстровано також забарвлювання С(О5-1 судинних структур на зрізах мишачої тератокарциноми -І Е9У. У протилежність до цього, усі нормальні мишачі тканини, які було піддано випробуванням (печінка, селезінка, нирки, шлунок, тонка кишка, товста кишка, яєчники, матка, сечовий міхур, підшлункова залоза, о надниркові залози, скелетні м'язи, серце, легені, щитовидна залоза та головний мозок), продемонстрували - негативну забарвлювальну реакцію з СО5-1 та СО5-2 (дані не наведено). Завдяки використанню рекомбінантного ЕО-В домену для повного пригнічення одержаного забарвлення було показано, що структури, ю забарвлені на зрізах тератокарциноми Е9, є ЕО-В специфічними (дані не наведено).

Ге) Приклад 5 - Застосування афінно зрілих анти-ЕО-В зсЕмз при спрямованій доставці препарату до людських пухлин іп мімо.

Лінію клітин ЗКМЕЇ -28 меланоми людини було використано для індукування ксенотрансплантованих пухлин дво у толих" мишей віком 6-10 тижнів (лінія ВаІр-с або МЕ-1; компанія Нагіап, Великобританія) шляхом підшкірного впорскування до одного боку 1 х10' клітин/мишу. Мишам, у яких з'явились пухлини, через хвостову вену

Ф, впорскували 100мкл 1мг/мл розчину зсЕм4і-СУ7.4 у РВ5З після того, як діаметр пухлин досягав, приблизно, 1см. ко Мічення рекомбінантних антитіл СУ7 забезпечувалось шляхом додання 100мкл 1М розчину бікарбонату натрію, рН-9,3, та 200мкл розчину СУ7-різ-ЮОЗи (компанія Атегепат; номер за каталогом РА17000; 2мг/мл у бо диметилсульфоксиді (0ОМ5О)) до мл розчину антитіл у РВЗ5 (мг/мл). Через 30 хвилин при кімнатній температурі до згаданої суміші додавали 100мкл 1М. Трис-буферу, рн-7,4 і мічене антитіло відокремлювали від фарбнику, який не прореагував, за допомогою змінних колонок РО10 (компанія Ріагтасіа Віоїесі, Піскатавей, Нью Джерсі,

США), урівноважених РВ5. Елюйовані фракції антитіла зеленого кольору концентрували, приблизно, до мг/мл за допомогою центрифужних склянок Сепігісоп-10 (компанія Атісоп, Беверлі, Массачусетс, США). 65 Співвідношення мічення, яке було досягнуто, наближалось, звичайно, до рівня одна молекула СУ7:одна молекула, антитіла. Це визначалось спектрофотометрично з 1см кюветами, за умови, що 1мг/мл розчин антитіла дає поглинання 1,4 одиниці при 280нм, що молярний коефіцієнт погашення СУ7 при 747нм складає 200000 (М'см/) та нехтуючи поглинанням СУ7 при 28Онм. Імунореактивність зразків антитіл після мічення було підтверджено або зміщенням смути (Нері (Мегі) та інші, 19965), або афінним хроматографуванням на колонці з антигеном, або аналізом на установці ВіАсоге. Зображення мишей одержували за допомогою саморобного тепловізора через регулярні проміжки часу з анестезуванням тварин, яке забезпечувалось вдиханням суміші кисню/фторотану. Кожну пробу перевіряли на двох-восьми тваринах для підтвердження відтворюваності результатів. Згадані процедури здійснювали згідно до Ліцензії на Дослідження (Великобританія) "Спрямована доставка лікарського препарату до пухлини", яку було видано на ім'я Д. Нері (ШК РРІ. 80/1056). 70 Згаданий тепловізор представляв собою модифікацію системи фотодетектування |Фоллі (Роїїї) та інших (1994)), яка забезпечувала використання інфрачервоного фторофору СУ7. Інфрачервоне освітлення було обрано з метою забезпечення кращого проникнення до тканин. Флуоресценція СУ7 ( »76бОнм) є невидимою для людини і потребує використання контрольованої комп'ютером цифрової відеокамери. Згаданий мишачий тепловізор представляє собою пофарбовану у чорний колір світлонепроникну коробку, споряджену 100Вт 75 Ввольфрамовою галогеновою лампою та фільтром збудження діаметром 50мм, спеціально розробленим для СУ7 (компанія Спгота Согрогайоп, Бреттлборо, Вермонт, США; 673-748нм). Освітлювальний промінь, з великим рівнем наближення, забезпечував однорідне освітлення площини 5х1Осм, на якій розміщували мишу, призначену для візуалізації. Флуоресценцію приймали за допомогою 8-бітної монохромної цифрової відеокамери Риїпіх, спорядженої телескопічним об'єктивом та 50мм фільтром для пропускання флуоресценції (компанія Спгота Согрогайоп, Бреттлборо, Вермонт, США; 765-855нм), яку було сполучено з системою Ітадерок (компанія Кіпеїйїс

Ітадіпа Ца., Ліверпуль, Великобританія). Згадана система включала комп'ютер, споряджений пристроєм для введення та реєстрування кадрів зображення та програмою для введення та інтегрування послідовних зображень. Для процесу усереднення використовували, як правило, три послідовні зображення з 50мс проміжками часу; зазначена кількість постійно витримувалась під час одержання зображень однієї тварини для Ге забезпечення можливості безпосереднього порівняння спрямованої доставки лікарського препарату до пухлини о у різні моменти часу. Після цього зображення у форматі теплобачення (ТІРЕ) перетворювали на візуалізовані файли (РІСТ) за. допомогою програми Сгарпісв Сопмепег та піддавали обробці на комп'ютері Рожег Масіпіозп 7100/66 за допомогою програми МасОгам Ро.

Схематичне зображення конструкції згаданого апарату представлено на Фіг.4. Ге)

Ці експерименти показали, що обидва зсЕм під час візуалізації на макроскопічному рівні знаходились у пухлині. сч

Мікроскопічну демонстрацію спрямованої доставки лікарського препарату до новоутвореної судинної сітки - пухлин, які розвивались, за допомогою двох анти-ЕОВ зсЕмуз було здійснено наступним чином. "Голим' мишам та/або мишам з важким комбінованим імунодефіцитом (ЗСІЮ), які мали т ксенотрансплантовану людську меланому ЗКМЕЇ!-28 або мишачу тератокарциному БО на одному боці, |че впорскували немічені зсЕм фрагменти з міткою РІГ АС або біотинільовані зсЕм фрагменти.

Мишей забивали через різні проміжки часу після впорскування, одержували зрізи пухлинної та непухлинної тканини, які забарвлювали згідно до традиційних імуногістохімічних протоколів за допомогою анти-ГЇ Ас М2 « антитіла (компанія Кодак, 181) або реактивів для виявлення на основі стрептавідину. Оптимального рівня 470 спрямованої доставки лікарського препарату до пухлини досягали, як правило, через 12 годин після - с впорскування. Було продемонстровано, що СО5-1 та СО5-2 зв'язувались з новоутвореною судинною сіткою як ц ксенотрансплантованої людської пухлини, так і мишачої тератокарциноми. ,» Приклад 6 - Спрямована доставка препарату до ксенотрансплантованої мишачої тератокарциноми ЕГО у "голих"'мишей.

Автори цього винаходу індукували тверді пухлини на боках "голих" мишей шляхом підшкірного впорскування -і 4х1059 клітин мишачої тератокарциноми Е9. Згадана пухлина у мишей росте дуже швидко, досягає діаметру 1см, ї» приблизно, через один тиждень після впорскування і має добре розвинуту судинну сітку. З метою візуалізації спрямованої доставки препарату до пухлини, авторами цього винаходу була використана модифікація -й методології фотодетектування Фоллі та інших (1994), яка надає можливість кінетичної оцінки процесу 7 50 спрямованої доставки препарату до пухлини та виведення антитіла на тій же самій тварині, яка візуалізується через різні проміжки часу, як докладно було описано перед тим (див. Фіг.4).

Ме, З метою спрямованої доставки препарату до згаданої пухлини та полегшення виявлення антитіл, зсеЕм(Со5-І), зсЕСОо5-2) та анти-лізоцимгой зсЕм(О1.3) ІМакКафферті (МсСапбепу) та інші, 1990) було помічено гомодимеризаційною міткою |Пек (РаскК) та інші, 1993) шляхом субклонувания згаданих антитіл у сайтах ЗЙ1/Мо! вектору експресії рОІМ50. Цей вектор є похідним рОМ268 (Нері та інші, 19965), у якого послідовність Нізб о згаданої мітки заміщено наступною послідовністю: СОСІ ТО ТО АРТ РОЇ ЕОЕ КЗА ГОТ ЕІА НІЇ КЕК ЕК. ЕРІ

ІАА Н, до складу якої входить цистеїновий залишок та амфіпатична спіраль білку Роз для ковалентної ко гомодимеризації фрагментів антитіл (Ейбот (Абаїе) та інші, 1990). Повної ковалентної димеризації досягти не вдалось: до складу, приблизно, 30-5095 фрагментів антитіл входили ковалентно зв'язані димери. бо Фрагменти антитіла очищали за допомогою афінної хроматографії на колонках, які було одержано шляхом зв'язування лізоциму курячих яєць (01.3) або 7889 (анти-ЕО-В антитіла; Карнемолла та інші, 1996) з

СКВг-активованогю сефарозою (компанія РНагтасіа Віоїесп, Піскатавей, Нью Джерсі, США). Супернатанти вводили до афінних підкладок, які після цього промивали РВ5, РВЗО,5М Масі та елюювали 100ММ ЕВЗМ. Після цього згадані антитіла діалізували проти РВ5. 65 Згадані антитіла мітили, як описано перед тим, після чого впорскували до хвостової вени мишей, які мали пухлини, з 100мкл мг/мл розчину зсЕмі-СУ; у РВ5, коли діаметр пухлин досягав, приблизно, 1см.

Як показано на Фіг.5, зсЕМ(СОо5-1) виявляли у пухлині впродовж, приблизно, трьох днів, незважаючи на те, що впродовж того ж самого періоду часу спостерігалось також його активне виведення зі згаданої пухлини.

Однак мало місце також деяке забарвлювання стегнової кістки. Спрямована доставка СО5-1 до пухлини значно поліпшувалась завдяки введенню амфіпатичної спіралі, до складу якої входив цистеїновий залишок на С-кінці для стимулювання димеризащі антитіла (Пек та інші, 1993). І дійсно, локалізація димерного зсЕмСОо5-2) » з 24 до 72 годин, здавалось, суттєво не зменшувалась. У протилежність до цього, негативний контроль (димерне антитіло зсЕм(О01.3)2, анти-лізоцимне антитіло) демонстрував швидке видалення без локалізації, яка піддавалась би виявленню, у пухлині або стегновій кістці. 70 ЗсЕм (2851) демонструвало незначне проникнення до пухлини через б годин (не показано), і зовсім не виявлялось Через 24 години або пізніше (Фіг.б6). Визрівання афінности забезпечувало значне поліпшення спрямованої доставки згаданого антитіла до пухлини: так, зсЕМ(СОо5-2) ефективно досягало малих та великих пухлин Е9, незважаючи на те, було воно мономером (Фіг.б) або димером (не показано). Через два дні було встановлено, що відсоток впорскнутої дози антитіла на грам пухлини складав, приблизно, 2 у разі зсЕМС 5-2) /5 Мономеру та 3-4 у разі зсЕм(СОоз-2) димеру. Доза, доставлена до пухлини зсгСОоз-2), також перевищувала дозу, доставлену зсЕмМ(С(Оо5-1) (Фіг.5 та 6), і добре корелювала з відповідними афінностями (Таблиця 1).

Здається, однак, що зсЕм(2851) та зсЕмМ(СбОо5-2) є схильними до протеолітичного розщеплення і демонструють високий рівень засвоєння печінкою (Фіг.б), у той час, як антитіла зсЕм(СО5-1) були значно більш стійкими та демонстрували нижчій рівень засвоєння печінкою (Фіг.5).

Довідкова література

А!йзирвеї еї аї. едв., допп Уміеу 5 5опв, 1992; Зпогі Ргоїосоїв іп МоїІесціаг Віоіоду, Зесопа Еайіоп.

Аа еї а. Аду. Сапсег Кев. 37, 111-158 (1982).

Вадзпаме К.О. еї аї. (1991) Апііроду, Ітіппосопіцда(ез апа Кадіорпагтасеціїсаів 4: 915-922.

Вагопе ег аІ. ЕМВО )). 8, 1079-1085 (1989). с

Віга еї аї, Зсіепсе, 242, 423-426, (1988).

Вогзві еї аї. 9. СеїІ. Віо!. 104, 595-600 (1987). і)

Вогзі еї а). Апа!. Віоспет. 192, 372-379 (1991).

Вогзі еї а). Іпі. У. Сапсег 52, 688-692 (1992а).

Вогзі еї а). Ехр. СеїЇ Кез. 199, 98-105 (19926). Ге! зо Вгомп еї а). Атег. 9. РаїйоЇ!.,142, 793-801 (1993).

Сагттетоїа еї а. 9. Сеї! Віої. 108, 1139-1148 (1989). с

Сагттетоїа еї а). 9. Віої. Спет 24689-24692 (1992). «-

СазвзіеїйІапі еї аї. 9. СеїІ. Вісі. 103, 1671-1677 (1986).

Савзіе|апі еї а. Іпі. 9. Сапсег 59, 612-618 (1994). «

СтоїПпегз еї а). Іпипипоспетівігу 9, 341-357 (1972). ї-

Редадег еї а! (1988). Ргос. Ат. Авзвос. Сапсег Кев. 29:377.

Еоїї, еї а! (1994), Сапсег Кез., 54, 2643-2649.

Етепсп-Сопвгіапі еї аї. 9. СеїЇ Віої. 109, 903-914 (1989).

Етепсп-Сопвзіапі еї аі. Оемеіортепі 106, 375-388 (1989). « сбірзоп ТУ (1984) РІО (Пезів. (Опімегейу ої Сатрбгідде, Сатрбгідде, ОК). з с СстіНйНв, еї аї. (1994), ЕМВО .). 13, 3245-3260. . Сцтап апа КогпбріїЇнЕ. Ргос. Май). Асад. 5сі. (ОБА) 84, 7179-7182 (1987). и? Намкіпз еї аї. У). Мої. Віої. 226, 889-896 (1992).

Ноїїдег еї а! Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА 90 6444-6448, 1993).

Ноїїїдетг, Р. апа М/іпіег 5. Ситепі Оріпіоп Віогесппої. 4, 446-449 (1993). -І Ноодепроот еї аї!. Мисі. Асіаз Кез 19, 4133-4137 (1991).

Нитрпгіез еї аї. 9. Сеї! Віої. 103, 2637-2647 (1986). о Низіоп еї аії, РМАЗ ОА, 85, 5879-5883, (1988) - Нупез Апп. Кеу. Сеїі Віої. 1, 67-90 (1985).

Уаїп КК. Зсі. Ат. 271, 58-65 (1994). ю Чопззгоп еї аї. ВіоТесппіднез 11, 620-627 (1991).

Ге) Уцмеїа еї аІ. Сапсег Кевз 52, 5144-5153 (1992).

Касгтагек еї аї. Іпії. У. Сапсег 58, 11-16 (1994).

Копбіїнк еї аІ. ЕМВО 3. 4, 1755 (1985).

І айіпеп еї а). І аб. Іпмеві. 64, 375-388 (1991).

Ї едегтапп .).А. еї а). (1991) Іпг У. Сапсег 47: 659-664; І ому еї а! (1996), 9. Мої. Віо!ї., 260, 359-368. (Ф, Магкз еї аї (1991), 9. Мої. Віої., 222, 581-597. ка Магкз еї аї, (1992), Віо/Тесппоіоду, 10, 779-783.

МсСайпПепу, 9., сСгіййАив5, А.О., ММіпіег, с., СВівжеїї, 0.3. (1990) Рнаде апііродіев: ЯЙатепіоиз рпаде бо Зізріауіпуд апіроду магіаріе дотаїпв. Майшге (ІГопадоп), 348, 552-554.

Мегі еї а! (1996а), Віо/Гесппідцев, 20, 708-713.

Мегі еї а! (1996Б), Майте ВіосФесппоіоду, 14, 385-390.

Міввіт еї аІ. ЕМВО .. 13, 692-698 (1994).

Могіоп апа Нупез. Мої. Сеїі. Вісі. 7, 4297-4307 (1987). 65 Омепз ей а). ОХї. Зигм. Еисагуої. Сепез З, 141-160 (1986).

ОСуата еї а). 9. Віої. Спет. 10331-10334 (1989).

Оуата еї а). Сапсег Кезв. 50, 1075-1078 (1990).

Раск еї а). (1993), Віо/Тесппоіоду, 11, 1271-1277.

Реїегз еї а. Сеїї Адпез. Соттип. З, 67-89 (1995).

Ріегзспраснег еї а!. СеїІ 26, 259-267 (1981).

Ріїск(пип, А. Віо/ТесппоЇоду 9: 545-551 (1991).

Кеїї, М.Е. (1993) Сит. Оріпіоп Віогесн. 4: 573-576.

Киозіапнії. Апп. Кеу. Віоспет. 57, 375-413 (1988). задіпаїї еї аІ. Єиг 9. Віоспет. 205, 545-549 (1992). 70 Зспулагграцег егаі. ЕМВО 3. 6, 2573-2580 (1987).

СНО еї а), 1985 Сапсег Кез 45: 879-885.

Зігі ес аї. Мисі. Асідз Кез. 19, 525-531 (1991).

Тотіїпзоп І.М. еї аї, (1992) 9. Мої. Віої!. 227: 776-798.

ТгацпескКег еї аї, Еіпро дошигпаї, 10, 3655-3659, (1991).

Ти 9.9. еї а. (1995) Сит. Оріпіоп Віоїесп 6: 553-560.

Мапіо еї а. 9). СеїЇ Зсіепсе 88, 419-430 (1987).

Уацаднап еї а! (1996), Майшге Віогеснгпої., 14, 309-314.

УМага, Е.5. еї аІ., Машге 341, 544-546 (1989).

М/іпіег, С апа С Міївівїп, Майиге 349, 293-299,1991,

МмО94/13804Уатада. Апп. Кеум. Віоспет. 52, 761-799 (1983). 7агаї егаіІ. ЕМВО У. 6, 2337-2342 (1987).

Claims (29)

Формула винаходу с

1. Виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла, що є специфічним до онкоембріонального домену (о) ЕО-В фібронектину (ЕМ) та таким, що безпосередньо з ним зв'язується, і що характеризується константою дисоціації (Ка) для ЕО-В меншою ніж 1х107 М, у разі його аналізування як очищеного мономера.

2. Виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за п.1, що характеризується константою дисоціації б зо (Ка) для ЕО-В меншою ніж бх107 М, у разі його аналізування як очищеного мономера.

З.Виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за п.1, до складу якого входить домен зв'язування з с антигеном, і цей домен має людське походження. «-

4. Виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за п.1, що зв'язується з усіма фібронектинами (ЕМ), до складу яких входить ЕО-В, після обробки такого ЕМ протеазою - термолізином. З

5. Виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за п.1, що зв'язується з В-ЕМ без обробки цього В-ЕМ ч- М-гліканазою.

6. Виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за п.1, який має варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) послідовності, одержаної з людського ембріонального ОРА7 (кодон 1 СіІи-кодон 98 Аго, включно, див. Фіг. « 1), та послідовність СОКЗ Зегі еи Рго | ув.

7. Виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за п.1, який має варіабельну ділянку важкого ланцюга пе) с (МН) послідовності, одержаної з людського ембріонального ОРА7 (кодон 1 СіІи-кодон 98 Аго, включно, див. Фіг. ц 1), та послідовність СОКЗ Су Маї! Су АІа РНе Аго Рго Туг Ага Гуз Нів Сім. "»

8. Виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за п.1, який має варіабельну ділянку легкого ланцюга (МУ) послідовності, одержаної з людського ембріонального ОРІ 16 (кодон 1 Зег-кодон 90 5ег, включно, див. Фіг. 1), та залишок послідовності СОКЗ - Рго Маї Ма! Геи Авп Су Маї Маї. -І

9. Виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за п.1, який має варіабельну ділянку легкого ланцюга (МУ) послідовності, одержаної з людського ембріонального ОРІ 16 (кодон 1 Зег-кодон 90 5ег, включно, див. Фіг. е 1), та залишок послідовності СОКЗ - Рго Ре Сім Ніз Авп І еи Маї Маї. -

10. Виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за п.1, який має варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) послідовності, одержаної з людського ембріонального ОР47 (колон 1 СіІи-кодон 98 Аго, включно, о див. Фіг. 1), та послідовність СОКЗ. (Че)

11.Виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за будь-яким із пп.1-10, до складу якого входить молекула зсгм.

12. Виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за будь-яким із пп.1-10, до складу якого входить димерна молекула зсгУ.

13. Виділений фрагмент антитіла за будь-яким із пп.6-10. о

14. Виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за будь-яким із пп.1-13 для застосування у терапії. ко

15. Застосування виділеного антитіла або виділеного фрагмента антитіла за будь-яким із пп.1-13 для виготовлення лікарського засобу для спрямованої доставки до пухлин. 60

16. Застосування виділеного антитіла або виділеного фрагмента антитіла за будь-яким із пп.1-13 для виготовлення засобу для візуалізації пухлин.

17. Фармацевтична композиція, яка містить ефективну кількість виділеного антитіла або виділеного фрагмента антитіла за будь-яким із пп.1-13, у поєднанні з фармацевтично прийнятним наповнювачем.

18. Нуклеїнова кислота, яка кодує виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за будь-яким із 65 пп.1-13.

19. Фаг, який кодує виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за будь-яким із пп.1-13.

20. Клітина-хазяїн, трансформована або трансфікована іп міго нуклеїновою кислотою за п.18.

21. Спосіб продукування виділеного антитіла або виділеного фрагмента антитіла за будь-яким із пп.1-13, який відрізняється тим, що включає експресію нуклеїнової кислоти за п.18 у клітині-хазяїні іп мйго для продукування відповідного виділеного антитіла або виділеного фрагмента антитіла.

22. Спосіб продукування виділеного антитіла або виділеного фрагмента антитіла за будь-яким із пп.1-13, який відрізняється тим, що включає: а) скринінг бібліотеки антитіл або фрагментів антитіл, що експресована у фагові, за допомогою рекомбінантного фрагмента фібронектину, до складу якого входить домен ЕЮО-В, одержаний з фібронектину; 70 Б) інфікування бактеріальних клітин-хазяїв позитивними клонами; с) піддавання позитивних фагових клонів процесу визрівання афінності; а) повторення стадій а) та б) для відбору позитивних фагових клонів із поліпшеною афінністю до антигену; е) інфікування клітин-хазяїв позитивними клонами та очищення молекул антитіла зі згаданих клітин-хазяїв.

23. Спосіб за п.22, який відрізняється тим, що стадія а) включає скринінг бібліотеки фрагментів антитіл, 7/5 причому згаданими фрагментами антитіл є молекули зсгу.

24. Спосіб за п.22, який відрізняється тим, що до складу молекул зсЕм входить домен зв'язування з антигеном, і цей домен має людське походження

25. Спосіб за п.22, який відрізняється тим, що стадія а) включає скринінг за допомогою рекомбінантних антигенів 7889 або ЕЮ-В.

26. Спосіб за будь-яким із пп.22-25, який відрізняється тим, що при продукуванні використовується нуклеїнова кислота позитивного клону, з екпресуванням у клітині-хазяїні іп мійго антитіла або фрагмента антитіла, що кодується згаданою нуклеїновою кислотою, причому до складу згаданого антитіла або фрагмента антитіла входить домен зв'язування з антигеном, специфічний до онкоембріонального домену ЕО-В фібронектину (ЕМ) та такий, що безпосередньо з ним зв'язується. сч

27. Спосіб за п.26, який відрізняється тим, що згаданим антитілом є ціле антитіло. й иа І о

28. Спосіб за п.26, який відрізняється тим, що згаданим фрагментом антитіла є молекула зсгУ.

29. Діагностичний набір, до складу якого входять виділене антитіло або виділений фрагмент антитіла за будь-яким із пп.1-13 та одна або більше речовин, які уможливлюють виявлення зв'язування згаданого агента з клітинами пухлини. б с «- « і -

- . и? -і щ» - іме) іЧе) іме) 60 б5