JPH0315758A

JPH0315758A - 線維芽細胞増殖因子の検出・測定法および腫瘍の診断法

Info

Publication number: JPH0315758A
Application number: JP6347990A
Authority: JP
Inventors: Yuji Sato; 雄二佐藤; Jii Furiizen Henrii; ヘンリー　ジー　フリーゼン
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-03-15
Filing date: 1990-03-14
Publication date: 1991-01-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、サンドイッチ法による線維芽細胞増殖因子（
以下、ＦＧＦと略称することもある。）の検出・測定法
および該検出・測定法を用いる腫瘍の診断法に関する。

従来の技術ＦＧＦは、ペプチド性因子で、等電点が塩基性の塩基性
ＦＧＦと酸性のＦＧＦがあり、共に全アミノ酸配列が明
らかにされている（　Ｆ，　Ｅｓｃｈら・Ｐｒｏｃ．　
Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８　５　
：　６　５　０　７（１９８５）およびＫ．＾．　Ｔｈ
ｏＩＩｌａｓ　ら：　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ
．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８２　：　６４０９（１　９８
５））。

ＦＧＦは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは３Ｔ３細胞や血管内皮
細胞を含む中胚葉由来細胞に対して増殖促進作用を、ｉ
ｎ　　ｖｉｖｏ　　では血管新生作用を示すことが知ら
れている（Ｄ．　Ｇｏｇｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら：Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　８　：　９　５　（
　１　９　８　７　））　。中でもＦＧＦの血管新生作
用は細胞増殖作用とｔ目まって、損傷，火傷の治療薬，
血栓症．動脈硬化症などの予防治療薬として用いられる
ものである。

発明が解決しようとする課題天然に存在するＦＧＦは極めて微量であり、特にこれを
ヒトの組織から得る試みは種々の制約によって極めて困
難であった。さらにこれ這ＦＧＦの定量法として容易に
使える方法は確立されておらず、これらの理由からＦＧ
Ｆを医薬品として開発する上で欠かすことの出来ないＦ
ＧＦに関する性状などの基礎知見について不明の点が非
常に多い。

従って、ＦＧＦに関する多くの基礎知見、例えばＦＧＦ
の生体内における分布やその産生様式などを知ることが
できれば、該ＦＧＦの医薬品としての開発が容易となる
。

また、ＦＧＦの量を正確に知ることは、この蛋白質を遺
伝子組換え体から精製する際にも重要である。さらに、
ＦＧＦを投与した動物の血中ＦＧＦ濃度を追跡すること
は非常に重要であるが、サンプル中に血清が混入するた
め従来の３７３細胞を用いた方法では測定出来ない。通
常、ＦＧＦの測定は血清濃度を下げて培養し、ＤＮＡ合
成を低下させた３Ｔ３細胞にＦＧＦを加え、ＤＮＡ合成
能がどの程度回復するかにより逆算される。しかしなが
ら、この方法は細胞を用いるため操作が微妙で測定誤差
が大きく、しかも結果を得るのに長時間を要するという
欠点を有する。従って、上記目的のために簡便かつ正確
なＦＧＦの測定手段の開発が望まれている。

また、患者が腫瘍を保持するかどうかを極めて簡便に知
る方法が望まれている。

課題を解決するための手段上記実情にかんがみ、本発明者らはＦＧＦの実用的な測
定手段を見い出すべく種々検討した結果、サンドイッチ
法における二つの結合体のうち、標識剤を結合する結合
体としてヘパリンを用いることにより、ＦＧＦを高感度
で測定することができることを見い出し、これに基づい
てさらに研究した結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）担体に保持された抗体、被検試料およ
び標識剤を結合したヘパリンを用いるサンドイッチ法に
よってＦＧＦを検出・測定する方法；および（２）該サ
ンドイッチ法により腫瘍を診断する方法である。

本発明の検出・測定法としては、ラジオイムノアッセイ
（以下、ＲＩＡと略称することもある。）でもよく、ま
た酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡと略称することもある
。）でもよい。

ＦＧＦとしては、温血噛乳勤物のＦＧＦであればいずれ
でもよい。また、そのムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）でもよ
い。したがって、本明細書においては、ＦＧＦはとくに
ことわりのない限り、そのムテインをも含むことも鼻る
。

ＦＧＦとしては、酸性のもの（以下、ａ　ＦＧＦと略称
することもある。）、塩基性のもの（以下、ｂＦＧＦと
略称することもある。）が挙げられる。

特に、塩基性ＦＧＦが好ましい。

ＦＧＦとしては、天然由来のものでもよく、また、遺伝
子工学的手法により製造されたものでもよい。

また、該噛乳動物のａ　ＦＧＦの例としては、たとえば
、ウシのａＦＧＦ［：Ｋ．＾．Ｔｈｏｎ＋ａｓら；Ｐｒ
ｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　
８　１　：　３　５　７　（１　９８４）〕、ヒトのａ
　Ｆ　Ｇ　Ｆ　［Ｇ．　Ｇｉｒａｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅ
ｇｏら；　ＢｉｏｃｈｅＩｌ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒ
ｅｓ．　Ｃｏｍｉｕｎ．　Ｉ　３　８　：６１１（１９
８６））などがあげられる。

該噛乳動物のｂＦＧＦの例としては、たとえば、ウシの
ｂＦＧＦ　［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．　Ｎ
ａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．）ＵＳＡ．第８２巻　
第６５０７頁（１９８５年）〕、ヒトのｂＦＧＦ　［ヨ
ーロッパ特許公開公報第２３７９６６号公報，ヨーロピ
アン・モレキュラー・バイオロジー・オーガナイゼイシ
ョン０ジャーナル（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　　Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　
（ＥＭＢＯ）Ｊｏｕｒｎａｌ第５巻，第２　５　２　３
．頁（１９８６年）〕などがあげられる。

上記ムテインとしては、本来、元のべブチドあるいは蛋
白質のアミノ酸配列が変異したものであり、したがって
該変異としては、アミノ酸付加，構成アミノ酸の欠損，
他のアミノ酸への置換が挙げられる。

該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ酸
が付加しているものが挙げられる。

該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のＦＧ
Ｆ構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。

該他のアミノ酸への置換としては、少なくとも■個のＦ
ＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの
が挙げられる。

ＦＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加しているムテ
インにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、ベブ
チドを発現する際に用いられる開始コドンに基因するメ
チオニンや、シグナルペブチドは含まれないものである
。

付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１個
であるが、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。

さらに好ましくは、ＦＧＦと相同性（ホモロジー）が認
められており、同様の活性を示すタンパクのアミノ酸配
列の一部あるいはすべてが挙げられる。

ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が欠損し
ているムテインにおける欠損している構成アミノ酸の数
としては、ＦＧＦの有する特徴を失わない限り何個でも
よい。

ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が別のア
ミノ酸で置換されているムテインにおける置換される前
の少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸の数としては、
ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。

置換される前の構成アミノ酸の例としては、システイン
，システイン以外のものが挙げられる。

システインが特に好ましい。置換される前の構成アミノ
酸としてシステイン以外のものとしては、アスパラギン
酸，アルギニン，グリシン，バリンなどが挙げられる。

置換される前の構成アミノ酸がシステインである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリシン，パリン，アラニン，ロイシン，インロ
イシン，チロシン，フェニルアラニン，ヒスチジン，ト
リブトファン，セリン，スレオニン，メチオニンなどが
挙げられる。特に、セリン，スレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がシステイン以外のもので
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性，疎水性あるいは電荷の点で、
置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつものを遺
ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラギン
酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてアスパ
ラギン，スレオニン，パリン，フェニルアラニン，アル
ギニンなどが挙げられるが、特にアスパラギン，アルギ
ニンが好ましい。

置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換さ
れたあとのアミノ酸としてグルタミン，スレオニン，ロ
イシン，フェニルアラニン，アスパラギン酸が挙げられ
るが、特にグルタミンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合には
、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン，ロ
イシン，フエニルアラニン，セリン，グルタミン酸，ア
ルギニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン，アラ
ニン，ロイシン，システイン，グルタミン，アルギニン
，アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニンが好
ましい。

置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セリン，ロイシン
，ブロリン，グリシン，リジン，アスパラギン酸などが
挙げられ、特にセリンが好ましい。

置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスパラギ
ン酸，アルギニン，グリシン，セゾン，バリンが好まし
い。

置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン，グ
ルタミン，アルギニン，スレオニン，メチオニン，セリ
ン，ロイシンが好ましい。

置換されたムテインの最も好ましいものとしては、構成
アミノ酸であるシステインがセリンに置換されたものが
最も好ましい。

上記の置換においては、２以上の置換を同時に行なって
もよい。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換され
るのが好ましい。

本発明のムテインは、上記した付加．欠損，置換の２つ
または３つが組み合わさったものでもよい。

該ムテインを製造するためには、特定部位指向性変異誘
発技術（Ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）が採用される。該技術は周知であり、アール
・エフ・レイサー（Ｌａｔｈｅｒ，　Ｒ．　Ｆ．　）及
びジエイ・ピー−１／コック（Ｌｅｃｏｑ，　Ｊ．　Ｐ
．），ジェネテイック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミックプレ
ス社（１９８３年）第３１−５０頁、に示されている。

オリゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・スミ
ス（Ｓｍｉｔｈ，　Ｍ．）及びエス・ギラム（Ｇｉｌｌ
ａｍ，　Ｓ．）、ジエネテイック・エンジニアリングニ
原理と方法、プレナムプレス社（１９８１年）３巻　ｌ
−３２頁に示されている。

該ムテインをフードする構造遺伝子を製造するためには
、たとえば、（ａ）ＦＧＦの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖ＤＮ
Ａを突然変異株オリゴヌクレオチドブライマーと雑種形
成させる（この１本鎖で代替えすべきシステイン用コド
ン、又は場合によりこのコドンと対合をつくるアンチセ
ンス・トリブレットを包含する領域に対して上記ブライ
マーは相浦的なものである。但し、当該コドンの他のア
ミノ酸暗号化用コドン、又は場合によりアンチセンス・
トリプレットとの不一致はこの限りでない。）、（ｂ）
ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、突然
変異性へテロニ量体（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）を形
成させる、及び（ｃ）この突然変異性へテロニ領域体をｍｌする。

次に、突然変異化された遺伝子を運搬するフ１一ジＤＮ
Ａを単離し、プラスミドヘ組み込む。

このようにして得られたプラスミドで適当な宿主を形質
転換し、得られた形質転換体を培地に培養することによ
り、ムテインを製造することができる。

上記ムテインの例としては、たとえばパイオケミカル・
アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシ
ョンズ（　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄＢｉｏｐ｝
＋ｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏ＋ｎｍｕｎｉ
ｃａｔｉｏｎｓ）第１５１巻　第７０１〜７０８頁（１
９８８年），ヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ．２８１，８
２２号公報に記載のものが挙げられる。

本発明方法は、非競合法による免疫化学的測定法である
゜サンドイッチ法の原理に基づいて行なわれるものであ
る。

本発明方法に用いられる担体としては、例えば、ゲル粒
子（例、アガロースゲル〔例、セファロース４Ｂ，セフ
ァロース６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社（ス
エーデン）製）〕、デキストランゲル〔例、セファデッ
クスＧ−７５、セファデックスＧ−　１　０　０，セフ
ァデックスＧ−２００（ファルマシア●ファインケミカ
ル社（スエーデン）製）〕、ポリアクリルアミドゲル〔
例、バイオゲルＰ−３０、バイオゲルＰ−６０、バイオ
ゲルＰ−１００（バイオラノド・ラボラトリーズ社（米
国）製）〕、セルロース粒子〔例、アビセル（旭化成製
）、イオン交換セルロース（例、ジエチルアミノエチル
セルロース、カルボキシメチルセルロース）〕、物理的
吸着剤〔例、ガラス（例、ガラス球、ガラスロッド、ア
ミノアルキルガラス球、アミノアルキルガラスロッド）
、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ボリスチレン球、
ポリスチレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例、
ヌンク社（デンマーク〉製）〕、イオン交換樹脂（例、
弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲＣ−
５Ｑ（ローム・アンド・ハース社（米国）製）、ゼオカ
ーブ２２６（パームチット社（西ドイツ）製）〕、弱塩
基性陰イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩ　Ｒ−４
Ｂ，ｆウエックス３（ダウケミカル社（米国）製）］　
ｌなどが挙げられる。

本発明方法の結合体として用いられるＦＧＦに体する抗
体は、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体で
もよい。

該ＦＧＦに対するポリクローナル抗体は、抗原としての
ＦＧＦを温血動物に接種しＦＧＦに対する抗体を産生さ
せ、採取することにより製造される。

該抗原としてのＦＧＦは、天然のＦＧＦと同様の生物学
的もしくは免疫学的活性を有するものであればいずれで
もよく、例えば遺伝子工学技術により製造されるＦＧＦ
や、その生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分
のアミノ酸配列からなるフラグメントでもよい。これら
の遺伝子工学技術で製造されるＦＧＦはポリペプチドの
アミノ末端にざらにＭｅｔを有していてもよく、またＦ
ＧＦとそのアミノ末端にさらにＭｅｔを有するＦＧＦと
の混合物でもよい。

上記フラグメントは、ペブチド合成の公知の常套手段で
製造し得る。そしてそれは、固相法、液相法のいずれに
よっても良い。そのようなペブチド合成の方法としては
、例えば、“Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ第１巻（１９６
６）、Ｓｃｈｒ６ｄｅｒ　　ａｎｄ　　Ｌｕｂｋｅ著、
＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，
　Ｕ．Ｓ．Ａ．、“ペプチド合成”、泉屋ら著、丸善株
式会社（１　９　７　５）あるいは“ベプチド合成の基
礎と実験”、泉屋ら著、丸善株式会社（１　９　８　５
）に記載の方法が挙げられる。

また、該フラグメントは、適当な酵素によりＦＧＦを切
断することにより製造してもよい。該方法としては、た
とえば、“生化学実験講座１　タンパク質の化゛学■”
、日本生化学会編、東京化学同人（１　９　７　６）の
２５５ページから３３２ページに記載の方法が挙げられ
る。

上記抗原としてのＦＧＦは、キャリア用蛋白と結合され
る。該キャリアー用蛋白としては、例えば、牛チログロ
プリン、牛血清アルブミン、牛ガンマグロプリン、ヘモ
シアニン、フロインドの完全アジュバント（デイフコ社
製）などがあげられる。

該抗原としてのＦＧＦとキャリアー用蛋白との結合には
、公知の常套手段を用いて実施し得る。

結合に用いる試薬としては、例えば、グルタールアルデ
ヒド、水溶性カルボジイミドなどがあげられる。抗原と
してのＦＧＦとキャリアー用蛋白との使用比は、約ｌ対
ｌないし約１対１０が適当であり、反応のｐＨは、中性
付近、特に約６〜８前後が良好な結果を与える場合が多
い。また、反応に要する時間は、約１〜１２時間が良い
場合が多いが、特に、約２〜６時間が適当である。この
ようにして作成された複合物は、常套手段で約０〜ｌ８
゜Ｃ前後で水に対して透析し、凍結して保存しても良い
し、凍結乾燥して保存しても良い。

ポリクローナル抗体を製造するためには、上記のように
して製造した免疫原を温血動物に接種される。上記抗体
の製造に用いられる温血動物としては、例えば、啼乳温
血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、
モルモット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ
、ハト、アヒル、ガチョウ、ウズラ）などが挙げられる
。免疫原を、温血動物に接種する方法としては、動物に
接種する免疫原は、抗体産生をする有効な量でよく、例
えば、ウサギに１回ＩＩＩＩｇをｌｊ！ｌ２の生理食塩
水およびフロイントの完全アジュバンドで乳化して、背
部ならびに後肢掌皮下に４週問おきに５回接種すると抗
体を産生させる場合が多い。このようにして、温血動物
中に形成された抗体を採取する方法としては、例えばウ
サギでは、通常最終接種後７日から１２日の間に耳静脈
から採取し、遠心分離して血清として得られる。得られ
た抗血清は、通常、各抗原ペブチドを保持させた担体を
用いるアフィニティクロマトグラフィーで吸着した画分
を回収することによりポリクローナル抗体を精製するこ
とが出来る。

また、ミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法〔ネ
イチュア（Ｎａｔｕｒｅ）、第２５６巻（１　９　７　
５）、第４９５頁〕に記載の方法と同様の方法により得
られるモノクローナル抗体も利用できる。すなわち、該
モノクローナル抗体は、免疫原のポリペブチドまたは蛋
白複合体で噛乳動物を免疫し、取り出した胛臓細胞と同
種または異種のリンパ球様細胞とを細胞融合によりハイ
ブリドーマとし、これをクローン化し、ここで得られた
ハイブリドーマを噛乳動物に接種し、モノクローナル抗
体を生成蓄積せしめ、これを採取して製造される。

免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、皮下、腹腔
内、静脈内、筋肉内、皮肉等のいずれのルートからでも
可能であるが、主としては皮下、腹腔内、静脈内に（と
りわけ皮下）注入するのが好ましい。また、免疫間隔，
免疫量等も可変度は高く、種々の方法が可能であるが、
例えば２週間隔で約２〜６回免疫し、最終免疫後、約ｌ
〜５回、好ましくは約２〜４日後に摘出した牌臓細胞を
用いる方法がよく用いられる。免疫量は１回にペブチド
量として、マウス当り約０．１　ｔｔｇ以上、好ましく
は約ＩＯμｇ〜３００μｇ用いることが望ましい。また
、牌臓を摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗体価
の上昇を確認した上で、牌臓細胞を用いる融合実験を行
うことが望ましい。

上記牌臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融合は例えば摘
出したマウスの牌臓細胞を、ヒポキサンチンーグアニン
ーホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲ’
ｒ”）や、チミジンキナーゼ欠損（Ｔ　Ｋ−）の様なマ
ーカーを持った適切な同種または異種（好ましくは同種
）のミエローマｃ例、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ・８ＵＩ（市
森　他　ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド
　８０　　５５（１９８５）））等の、リンパ球様細胞
株との間で融合させる。例えばケラーおよびミルスタイ
ンらの方法〔ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）２　５　６　
：　４　９　５　（１９７５））に準じて融合させるこ
とにより製造される。たとえばミエローマ細胞と牌細胞
とを約１：５の割合で、たとえばイスコフ培地とハムＦ
−１２培地をｌ：１に混合した培地（以下ＩＨ培地と称
する。）に懸濁させ、センダイウイルス，ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）等の融合剤が用いられる。もちろ
んジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）その他の融合促進
剤を加えることも可能である。ＰＥＧの重合度は、ふつ
う約１０００〜６０００，時間は約０．５〜３０分，濃
度は約１０％〜８０％等が用いられるが、好ましい条件
の一例として、ＰＥＧ　　６０００を約３５〜５５％で
約４〜ｌＯ分処理することにより、効率よく融合させる
ことが出来る。融合細胞は、ヒボキサンチンアミノブテ
リンーチミジン培地［ＨＡＴ培地；ネイチャー，ｌ五６
．４９５（１９７５）Ｅ等を用いて、選択的に増殖させ
ることが出来る。

増殖して来た細胞の培養上清は、目的とする抗体産生が
あるか否かについてスクリーニングを行うことができる
が、抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来
る。即ち、この場合には、まず第１段階として免疫した
べブチドに対する抗体産生の有無を、ラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ）法またはエンザイムイムノア，セイ（Ｅ
ｒＡ）法等の方法で調べることが出来るが、これらの方
法についても種々の変法が可能である。好ましい測定法
の一例として、ＥＩＡを用いる一つの方法について述べ
る。セルロースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウ
スイムノグ口プリン抗体を常法に従ってカブリングさせ
ておき、これに測定したい培養上清や、マウスの血清を
加え、一定時間、定温（約４〜４０’Ｃを示す。以下に
おいても同様。）で反応させる。この後、反応物をよく
洗った後、酵素で標識したペプチド（酵素とべブチドを
常法に従いカブリングさせた後精製）を加え、一定時間
，定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基質
を加え、一定時間，定温で反応させ、その後、生成発色
物を吸光度または蛍光度等で測定することが出来る。

選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いたべブチドに対
する抗体活性のみられたウエルの細胞は、限界稀釈法等
によりクローニングを行うことが望ましい。クロー゛ン
化された細胞の上清について同様にスクリーニングを行
い抗体価の高いウエルの細胞を増やすことにより、免疫
したペプチドと反応性を示すモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマクローンが得られる。

このようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液
体培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地た
とえばＲ　ＰＭ　Ｉ　−　１　６　４　０　ＣＭｏｏｒ
ｅ．Ｇ．　Ｅ．，　ｅｔ．　ａｌ．　　ジャーナル・オ
プ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｊ．
　Ａｔ　Ｍｅｄ．＾ｓｓｏｃ．）１９９，５４９（１９
６７））に約０．１〜４０％の牛血清を加えた培地等で
約２〜１０日間、好ましくは約３〜５日間培養すること
により、培養液から該モノクローナル抗体を得ることが
できる。また、噛乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖
させ、腹水を採取することにより抗体を取得することが
出来る。このためには、例えばマウスの場合、ミネラル
オイル等を前もって接種したＢＡ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ等の
マウスに約ＩＸＩＯ’　〜ＩＸＩＯ’個、好ましくは約
５ＸｌＯ’〜２Ｘ１０”個のハイブリドーマを腹腔内に
接種し、約７〜２０日後、好ましくは約１０〜１４日後
に腹水液を採取する。

腹水に生戊蓄積した抗体は、例えば硫安分画，ＤＥＡＥ
−セルロースカラムクロマトグラフィー等により、容易
にモノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単
離することが出来る。

抗体分子は、ＩｇＧでもよく、または、そのフラクショ
ン｛例、Ｆ　（ａｂ’）ｔ，　　Ｆ　ａｂ’，　Ｆ　ａ
　ｂ　”，　Ｆ　ａｂ）であっても良い。なかでも、標
識剤を直接結合させる抗体分子はＦ　ａｂ’であること
が好ましい。

担体に抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用し
得るが、例えば、“代謝”、第８巻（１９７１年）、第
６９６頁に記載されているプロムシアン法、グルタール
アルデヒド法などが挙げられる。また、より簡便な方法
として物理的に担体表面に吸着させてもよい。例えば、
抗体を０．１〜１０μｇ／ウエル，９６穴プラスチック
プレート（Ｆ！ＡＪえばヌンク社，デンマークのイムノ
プレート），ガラスビーズ，プラスチックビーズなとの
担体に固定する。固定は、プラスチックの場合約４℃，
一夜または室温で約０．５〜４時間反応させることによ
り行われる。ガラスの場合、例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．　　Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，第８０巻，第
３５１３−３５１６頁（１９８３年）に記載したような
方法で固定する。その他、抗体固定のための各種プレー
ト（前述，ヌンク社等）の市販されているものを使うこ
ともできる。

本発明方法に用いられるヘパリンとしては、Ｄーグルコ
サミン，Ｄ−グルクロン酸，Ｌ−イズロン酸から成る多
糖のＮ一硫酸，Ｎ−アセチルおよび〇一硫酸置換体が挙
げられる。

標識剤としては、ＲＩＡの場合は、たとえば放射性同位
元素１　’Ｈｌ　　”５Ｉなどが挙げられる。

該放射性同位元素としては、たとえば、３Ｈ，１１５ｒ
などが挙げられる。

標識剤としては、ＥＩＡの場合は、たとえば酵素．蛍光
物質，発光物質などが挙げられるが、酵素を用いるのが
好ましい。酵素としては、安定で比活性の大きなものが
好ましく、ベルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
、β〜Ｄ〜ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ
等を用いることができるが、ベルオキシダーゼが好まし
い。ベルオキシダーゼとしては、種々の起源のものを用
いることができるが、その例としてはたとえば西洋わさ
び、パイナップル、イチジク、甘薯、ソラマメ、トウモ
ロコシなどから得られるベルオキシダーゼが挙げられ、
特に西洋わさびから抽出されたホースラディッシュ　ペ
ルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　　ｐｅｒｏ
ｘｉｄａｓｅ）（Ｈ　Ｒ　Ｐ　）が好ましい。

蛍光物質としては、たとえばＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｉｎ　　Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ），　　ロ
ーダミン，ランクナイドキレートなどが挙げられる。

発光物質としては、たとえば、アクゾジニウムエステル
などが挙げられる。

ヘパリンに標識剤を結合させるには、まず、ペブチドや
蛋白質に対して反応性の高いヘパリン分子を選択する。

これはまず〔＾Ｄ．　Ｃａｒｄｉｎら；スロンボーシス
・リサーチ（ＴｈｒｏｌＩｌｂ．　Ｒｅｓ．）３　４　
：　５４１（１９８４）］に記載のあるＬｏｗ　　ｄｅ
ｎｓｉｔｙ１ｉｐｏｐｒｏＬｅｉｎ　（Ｌ　Ｄ　Ｌ　）
−ＡＨｉＧｅｉ　ｌ　Ｏを用いる方法が挙げられる。こ
れによって精製された高反応性ヘパリン（Ｈｉｇｈ　　
ｒｅａｃｔｉｖｅ　　ｈｅｐａｒｉｎ）（Ｈ　Ｒ　Ｈ　
）に標識剤を結合させる。標識剤としては例えばＩｔＪ
が挙げられる。１５１をＨＲＨに結合させるにあたって
標識比活性をなるべく高めることが必要となる。これに
は例えばＨＲＨにヒドロキシフェニル基を導入すること
が考えられる。これには〔Ｎ．　ｆＩｉｒｏｓｅら・ア
ナリテイカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．　　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．）土５６：３２０（１９８６）］に記載
のあるＢｏｌｔｏｎ　　Ｈｕｎｔｅｒ試薬を用いる方法
があげられる。

これによりヒドロキシフエニルーＨＲＨが得られる。こ
れに″５ｒを導入するには公知の常套手段を応用し得る
が、例えばＣＲ．　Ｈ．　Ｒａｊａら：＾ｎａｌ．　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．　ｌ　３９　：　１６８（１　９８４）
）に記載のＩｏｄｏｇｅｎを用いる方法がある。

本発明の測定系における被検試料としては、尿、血清、
血漿、髄液等の体液、あるいは、細胞や菌体の抽出液ま
たはその培養上清が挙げられる。

本発明の測定方法のＥＩＡの例として、標識剤がベルオ
キシダーゼの場合について以下に具体的に説明するが、
ベルオキシダーゼに限定されるものではない。

まず、■担体に保持された抗体に、測定すべきＦＧＦを
含む被検試料を加えてＦＧＦを結合させ、これに、ベル
オキシダーゼを結合したヘパリンを加え反応させる。

■：　■で得られた反応生成物にベルオキシダーゼの基
質を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定
することにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。

■：　上記■〜■の操作を既知量のＦＧＦの標準溶液に
対してあらかじめ行い、ＦＧＦと吸光度もしくは蛍光強
度との関係を標準曲線として作成しておく。

一■：　未知量のＦＧＦを含む分析対象物（被検試料）
について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線に
あてはめ、分析対象物中のＦＧＦの量を測定する。

本発明の測定方法のＲＩＡの例として、標識剤が目５１
の場合について以下に具体的に説明するが、″６Ｉに限
定されるものではない。

まず■担体に保持された抗体に測定すべきＦＧＦを含む
被検試薬を加えてＦＧＦと結合させ、これにヘパリン（
ヒドロキシフエニルーＨＲＨ）を加え反応させる。

■　■で得られた反応生戊物のγ一放射活性を測定する
。

■　土記■一■の操作を既知量のＦＧＦの標準液に対し
てあらかじめ行いＦＧＦとγ一放射活性の関係を標準曲
線として作成しておく。

■　未知量のＦＧＦを含む分析対象物（被検試料）につ
いて得られたγ一放射活性を標準曲線にあてはめ分析対
象物中のＦＧＦの量を測定する。

本法は今後、臨床検体（血液，血清，血漿，尿，腹水、
嚢胞液、胸水，髄液など）中のＦＧＦの倹出・測定や、
ＦＧＦの組織内，臓器内分布の検討に有力な手段を提供
するものである。

本発明方法においては、標識剤を結合する結合体トシテ
、ヘパリンを用いるため、測定感度が高く、従って血中
の微量のＦＧＦを検出・測定できる。

本発明のＦＧＦの検出・測定法を利用して腫瘍の診断に
も応用可能である。すなわち、腫瘍細胞はＦＧＦを大量
に放出することが考えられるので、腫瘍を保持する患者
の血液、尿、腹水、胸水、脳脊髄液、滲出液、胃液、嚢
胞肢等には正常人の場合より大量にＦＧＦを含有してい
ると考えられる。

したがって、患者から得られた彼検試料中に大量のＦＧ
Ｆが認められれば、該患者は腫瘍を保持するであろうと
の一次的診断を行うことができる。

このように、担体に保持された抗体，被検試料および標
識剤を結合したヘパリンを用いるサンドイッチ法によっ
て線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を検出・測定すること
により腫瘍を診断することを特徴とする本発明の腫瘍の
診断法により、患者は該腫瘍を保持するかどうかの一次
的スクリーニングとしての診断をおこなうことができる
。

該腫瘍としては、例えば、脳腫瘍、肺腫瘍、消化管腫瘍
、肝腫瘍、膵腫瘍、胆嚢腫瘍、胆管腫瘍、腎腫瘍、膀胱
腫瘍、副腎腫瘍、横紋筋腫瘍、崩紋筋肉腫、平滑筋肉腫
、内分泌腺腫症、副甲状腺腫、副甲状腺癌などが挙げら
れる。

検出・測定方法は、上記の方法と同様におこなうことが
できる。

本明細書において、アミノ酸などを略号で表示する場合
、ＩＵＰＡＣ−［ＵＢ　　Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ　　ｏｎ
Ｂｉｏｃｈｅａ＋ｉｃａｌ　　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒ
ｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づ
くものであり、その例を下記する。また、アミノ酸に関
し光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ
ー体を示すものとする。

Ｔｙｒ：　　チロシンＮｌｅ：　　ノルロイシン以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるべきものではない。

参考例ｌ（１）抗（Ｔｙｒ”）　　ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ　（１−１
１）Ｎ　ｌｅ”ウサギ抗体の調整ペブチド（Ｔｙｒ目）　ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ　（１−１１
）Ｎ　Ｉｅ”ＣＭ．　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，　Ｙ．　Ｓ
．　Ｋｌａｕｓｎｅｒ，　Ｍ．　Ａ．　Ｏｎｄｅｔｔｉ
“Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ″Ｊｏｈｎ’
Ｗｅｉｌｙ　　ａｎｄ　　Ｓｏｎｓ，Ｎ．　Ｙ．（１　
９　７　６）に記載の方法と同様の方法で製造される。

なお、本品は、Ａｌｂｅｒｔａ　　ＰｅｐｔｉｄｅＩｎ
ｓｔｉｔｕｔｅ，　Ｅｄｍｏｎｔｏｎ　　Ａｌｂｅｒｔ
ａ，　Ｃａｎａｄａがら購入した。〕をＫ　Ｌ　Ｈ　（
Ｋｅｙｈｏｌｅ　　ＬｙｍｐｅｔＨｅｍｏｃｙａｎｉｎ
）とグルタールアルデヒドを用いて結合したものを、該
ペブチドが１００μｇｏｄとなるようにリン酸緩衝液（
Ｐ　Ｂ　Ｓ　）（ＮａＣ（２　８　０　０　Ｏｎ＋ｇ／
Ｑ　．ＫＣ（１　２００ｍｇ／１２，ＮａＨＰＯ．・７
Ｈ−０２　１　６　０ｔａｇ／（１．　　Ｋ　ＨｔＰ０
．　２　０　０ｔｎｇ／（１．　ＭｇＣ（Ｉｔ　・６Ｈ
，Ｏ　　ｌｏＯ＋ｎｇ＃！）に溶かしたものを等量のフ
ロイントコンブリートアジュバント（Ｄｉｆｃｏ社）と
混合した。これをウサギの皮膚内へｌｍ投与し、以後２
週間毎に上記合成ペブチドｌＯＯμｇｏｄを等量のイン
コンブソートアジュバントＣＤｉｒｃｏ社）と混合した
ものを投与した。計５回投与して得られた血液を室温に
５時間静置後、４℃にｌ６時間放置したのち３　０　０
　０ｒｐｍ，　　１’０分間遠心し、その上清を抗［Ｔ
ｙｒ”）ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ　（１−１１）Ｎ　Ｉｅ”ウ
サギ血清とした。また、臭化シアン活性化セファ口−ス
４Ｂ（ファルマシア社）０．５ｇをグラスフィルターに
移し、２０ｍの０．００１Ｎ塩酸を加えて充分に膨潤さ
せたのち、４００ｄの同塩酸溶液でよく洗浄した。一方
、１００μＱの〔Ｔ　ｙｒ”　］ヒトｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　
（１−Ｈ）Ｎ　Ｉｓ”ベプチド溶液（蛋白量４０Ｉｌｇ
／Ｉ１！ｌ２）へ２ｄの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム０．
５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えたのち、０．１Ｍ水酸化
ナトリウム溶液でｐａｌを８．４に調整した。

この溶液へ上記臭化シアン活性化セファロース４Ｂを加
え、室温で２時間反応した。反応後、ゲルをグラスフィ
ルターに移し、ｌＯＯｄの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム０
．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄した。ついで、ｌｏｔ
ｆ２の０．ＩＭＴｒｉｓ塩酸ｐＨ８．０溶液中へゲルを
加え、ゆっくり撹拌しながら４゜Ｃで２０時間反応させ
て、残存活性基をマスクした。ゲルは０．１Ｍ重炭酸ナ
トリウム溶岐，ＩＭ食塩含有０．１Ｍ酢酸（ｐＨ　４　
．　０　）．　　Ｉ　Ｍ食塩含有０．１Ｍホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．０）各１０Ｃ）ｄで順次洗浄した。本品をＰ
ＢＳに懸濁してカラムにつめ、４°Ｃに保存した。

前記血清をこのカラムにかけカラムは２　８　０　ｎｍ
の吸収がなくなるまでＰＢＳで十分に洗浄した。

ついで０．２Ｍグリシン塩酸緩衝１（ｐＨ２．３）１０
％Ｄｉｏｘａｎｅで溶出を行い、溶出画分に、すぐ１／
３量のＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　（ｐＨ７．４）を添加
し中和した。この溶液をＰＢＳに対して４゜Ｃで１６時
間透析した。透析後１０．００Ｏｒｐｍ，１０分間遠心
し、その上清液を抗［Ｔｙｒ”］　ヒＩ−ｂＦＧ　Ｆ　
（１−１１）Ｎ　Ｉｅ”ウサギ抗体として用いた。

本抗体の特異性をみるために、ウシ角膜内皮細胞（ＢＣ
Ｅ　ｃｅｌｌ）の培養土清中のヘパリン結合タンパクと
組換体ｂＦＧＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウエスター
ン　プロッティングを行った。その結果、ｂＦＧＦの位
置（レーン２）に特異的なバンド（レーンｌ）が検出さ
れた（第１図参照）。

実施例ｌ（１）　”’ｆ標識ヘパリンの作成：＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
１　５　６　＋　　３　２　０３２５（１９８６）に記
載された方法に従って、１ＳＩを用いて以下のように標
識した。

ヘパリンをＬｏｗ　　ｄｅｎｓｉｉｔｙ　　ｌｉｐｏｐ
ｒｏｔｅｉｎ　（ＬＤし）一＾ｆｒｉＧｅｌｌ　Ｏ　　
ｃｏｌｕＩＩｎで精製してＨＲＨ（１１ｉｇｈ　　Ｒｅ
ａｃｔｉｖｅ　　Ｈｅｐａｒｉｎ）とし、これにＢａｌ
ｔｏｎ１１ｕｎｔｅｒ試薬を反応させ、ヒドロキシフェ
ニル基を導入した。ヨウド化にはＩｍＣｉの１″５Ｉを
用い、１５μｇのＩｏｄｏｇｅｎを固相化された試験管
内で氷冷下で１５分間ヨウド化を行った。未反応の口５
Ｉは蒸留水に対して透析して除き、１１５■−ヘパリン
とした。

（２）　”！−ヘパリンを用いた２−サイトのＲＩＡ９６ウエルマイクロタイタープレート（ＤｉｎａＬｅｃ
ｈ）のウエル間の差をなくすために、生理食塩水／０．
１％Ｔｖｅｅｎ２　０で洗浄した後、蒸留水ですすいで
、エタノールで処理してよく乾燥したものを以下の過程
で用いた。

プレートの各ウエルに１００μｇあるいは２　０　０　
ｔｔＱの抗（Ｔｈｒ”］　　ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ　（１−
１１）Ｎ　ｌｅ目ウサギ抗体（３μｇ／ｄ　）　（参考
例１で得られたちの）を加えて４゜Ｃで一晩置いた。溶
液を捨てた後プレートをＰＢＳで洗浄し、ｌ％ＢＳＡ（
牛血清アルブミン）／ＰＢＳ／０．０４％Ｎ　ａ　Ｎ　
３を３００μｅ入れて４゜Ｃで一晩以上置き、プロッキ
ングを行った。

プレート中の溶液を捨て、適当に希釈すると共にＮａＣ
Ｑ濃度を０．５Ｍｌ．ＪＩ整した試料を加えて４℃で一
晩置いた。

試料を吸着した後、０．　５　Ｍ　ＮａＣＱ／　Ｐ　Ｂ
　Ｓで各ウエルを洗浄し、上記（１）に記した口Ｓ１−
ヘパリンを各ウエルにｌＯ〜２０Ｘ１０’ｃｐ一加えて
、４℃で一晩置いた。０．５Ｍ　ＮａＣＱ　／ＰＢＳで
各ウエルを十分洗浄した後、各ウエルをはさみで切り取
りガンマーカウンターで各ウエルのカウントを測定した
。

組換体由来ウシｂＦＧＦを用いてこのＲＩＡを行って得
られた標準曲線は第２図に示すようになった（ｎ＝３，
ｍ＋ｓＥ）。この曲線から本Ｒ［Ａは下限１〜１０ｐｇ
程度迄のｂＦＧＦを検出することができることがわかっ
た。なお、該組換体ウシｂＦＧＦは、アムジエン社（Ｕ
ＳＡ）より購入した。

また、上記と同様の方法で、血清が本ＲＩＡに与える影
響を調べた。結果を第３図に示す。第３図において、一
−一一はＯ、１％ＦＣＳの、一は３０％ＦＣＦの、一−
−−−−は５０％ＦＣＳの場合の結果をそれぞれ示す。

第３図に示された結果から、５％，１０％，２０％，３
０％，５０％の牛胎児血清（ＦＣＳ）はほとんど影響が
なく、血液中のｂＦ　Ｇ　Ｆを定量することができるこ
とが分かった。

さらに、上記と同様のＲＩＡ法により、多発性内分泌腺
腫症ｌ型の患者および正常人の血漿中のｂＦ　Ｇ　Ｆを
測定した。結果を次の第ｌ表に示す。

第１表実施例２　（腫瘍患者血中のｂＦＧＦｊｌの測定）実施
例１に記載のｂＦＧＦ定量法と同様の方法を用い、内分
泌腺腫症，副甲状腺腫症および副甲状腺癌の患者血中の
ｂＦＧＦ量を定量した。結果を第４図に示す。第４図に
おいて、（１）は正常人（ｎ＝１１）の、（２）は家族
性多発性内分泌腺腫症患者（ｎ＝３７）の、（３）は家
族性多発性内分泌腺腫症患者（ｎ−１２）の親族であり
発症を認めていない者の、（４）は散在性副甲状腺腫患
者（ｎ＝１２）の、（５）は副甲状腺癌患者（ｎ＝６）
の結果をそれぞれ示す。第４図から、これらの患者では
、明らかに血中ｂＰＧＦｊｌが多いことが判明した。こ
れらの結果は、本ｂＦＧＦ定量法が腫瘍の診断法として
用いることが出来ることを示している。

発明の効果本発明のＦＧＦの検出・測定法によると、微量のＦＧＦ
を高感度に測定することができるので、体液や細胞中の
ＦＧＦを有利に検出，　ｌＩｌ１定することができ、ま
た腫瘍の診断法としても用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、参考！／４１で得られた、抗（Ｔｈｒ”〕ヒ
トｂＦ　Ｇ　Ｆ　（１−１１）Ｎ　ｌｅ”ウサギ抗体の
ウエスターンブ口ッティングの結果を示す。第２図は、実施例１（２）で得られた、組み換体由来ウ
シｂＦ　Ｇ　Ｆを用いたＲＩＡの標準曲線を示す。第３図は、実施例１（２）で得られた、血清存在下での
ｂＦ　Ｇ　Ｆ測定への影響を示す。第４図は、実施例２で得られた患者血中のｂＦＧＦの量
を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）担体に保持された抗体、被検試料および標識剤を
結合したヘパリンを用いるサンドイッチ法によって線維
芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を検出・測定することを特徴
とするＦＧＦの検出・測定法。
（２）ＦＧＦが塩基性ＦＧＦである請求項１記載の検出
・測定法。
（３）担体に保持された抗体、被検試料および標識剤を
結合したヘパリンを用いるサンドイッチ法によって線維
芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を検出・測定することにより
腫瘍を診断することを特徴とする腫瘍の診断法。
（４）ＦＧＦが塩基性ＦＧＦである請求項３記載の診断
法。