JPH0436194A - モノクローナル抗体、ハイブリドーマ、それらの製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 東！上東机反九更 本発明はヘパリンバインディング・セクレトリー・トラ
ンスフォーミング・ファクター（以下ｈｓｔ−１と略称
することもある）蛋白質に対するモノクローナル抗体、
ハイブリドーマ、それらの製造法および用途に関する。

良東夙投１ ｈｓｔ　−１遺伝子は、ヒト胃癌組織より単離されたト
ランスフォーミング遺伝子であり　［Ｈ。

５ａｋａｌｏｔｏら、プロシージングスオブザナショナ
ルアカデミーオブザサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）　８３：　
３９９７（１９８６））、その遺伝子産物は細胞成長因
子の１つである線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と構造お
よび生物活性が似ていることが判明した（Ｔ、　Ｙｏｓ
ｈｉｄａら、プロシージングスオブザナショナルアカデ
ミーオブザサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）　　８４：　７３０５（１９８７）、　
Ｋ、　Ｍｉｙａｇａｗａ　ら、オンコジーン（Ｏｎｃｏ
ｇｅｎｅ）　　３．３８３（１９８８））。また、ｈｓ
ｔ　−１遺伝子は、胃癌のみならず大腸癌、肝癌、エイ
ズ患者のカポシ肉腫より分離されており［Ｔ。

Ｋｏｄａら、ジャパニーズジャーナルオブキャンサーリ
サーチ（Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　
　（Ｇａｎｎ）７８：　３２５（１９８７）、　Ｈ，Ｎ
ａｋａｇａｗａ　ら、ジャパニーズジャーナルオブキャ
ンサー　リサーチ（Ｊｐｎ、　Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　（Ｇａｎｎ）７８：　６５
１（１９８７）、Ｙ、　Ｙｕａｓａら、ジャパニーズジ
ャーナルオブキャンサーリサーチ（Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　（Ｇａｎｎ）７８：　１０３
６（１９８７）、　Ｐ、　Ｄｅｌｌｉ　Ｂｏｖｉ　ら、
セル（Ｃｅ１ｌ）　５０：　７２９（１９８７）］、こ
の遺伝子は塩基性ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、Ｉｎｔ−２遺伝
子産物などと共に、ヘパリンへの結合性を有するＦＧＦ
ファミリーを形成すると考えられている。上記カポシ肉
腫より分離された遺伝子はに−ＦＧＦとも呼ばれてし）
る。このようにｈｓｔ−１遺伝子は種々の癌組織より分
離されることから、癌化への関与が考えられる他、細胞
成長因子の働きをもつトランスフォーミング遺伝子であ
ることから、その遺伝子産物はＦＧＦと同様損傷の治療
薬などの予防治療薬となる可能性も持っている。

なお、　ｈｓｔ　−１は、Ｈ５ＴＦＩと記載されること
もある［Ｍ、Ｙｏｓｈｉｄａら、プロシージングスオブ
ザナショナルアカデミーオブザサイエンス（Ｐｒｏｃ、
ｈｓｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　、ｖｏ
ｌ、　８５．　ｐｐ。

４８６１−４８６４　（１９８８））。

ｈｓｔ−１遺伝子の塩基配列は既に報告されており（Ｍ
、Ｔａ１ｒａら、プロシージングスオブザナショナルア
カデミーオブザサイエンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）　
　８４：　２９８０（１９８７）、　Ｔ。

Ｙｏｓｈｉｄａら、プロシージングスオブザナショナル
アカデミーオブザサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　　８４．７３０５（
１９８７））、同報告にはこれから推測されるｈｓｔ−
１の構成アミノ酸も示されている。

しかし天然に存在するｈｓｔ−１は極めて微量であると
考えられ、未だに生体材料よりｈｓｔ−１を取得した報
告はない。

が　　しようとする 上記のように天然に存在するｈｓｔ−１は極めて微量で
あり、またこれまでｈｓｔ−１の定量法として容易に使
用できる方法は確立されておらず、ｈｓｔ　−１を医薬
品あるいは試薬として開発する上で欠かすことのできな
いｈｓｔ　−１に関する性状などの基礎知見について不
明の点が非常に多い。

従って、ｈｓｔ　−１に関する多くの基礎知見２例えば
ｈｓｔ−１の生体内における分布やその産生様式などを
知ることができれば、ｈｓｔ−１と癌との関連が究明さ
れるのみならず、該ｈｓｔ　−１の医薬品・試薬として
の開発も容易になると考えられる。

また、　ｈｓｔ　−１蛋白質の量髪正確に知ることは、
この蛋白質を遺伝子組換え体から精製する際にも重要で
ある。さらに、ｈｓｔ　−１蛋白質を投与した動物の血
中ｈｓｔ　−１蛋白質源度を追跡することは非常に重要
であるが、サンプル中に血清が混入するため従来の３Ｔ
３細胞を用いた方法では測定出来ない。通常、ｈｓｔ−
１の測定は血清濃度を下げて培養し、ＤＮＡ合成を低下
させた３Ｔ３細胞にｈｓｔ−１を加え、ＤＮＡ合成能が
どの・程度回復するかにより逆算される。しかしながら
、この方法は細胞を用いるため操作が微妙で測定誤差が
大きく、シかも結果を得るのに長時間を要するという欠
点を有する。従って、上記目的のために簡便かつ正確な
ｈｓｔ　−１蛋白質の測定手段の開発が望まれている６ 課　を　　するための 上記実状にかんがみ、本発明者らはｈｓｔ　−１蛋白質
の実用的な測定手段を見い出すべく種々検討した結果、
その測定を可能ならしめるｈｓｔ−１蛋白質に対するモ
ノクローナル抗体を作製し、これに基づいてさらに研究
した結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）ヘパリンバインディング・セクレトリ
ー・トランスフォーミング・ファクター（ｈｓｔ−１）
蛋白質に対する、下記の性質を有するモノクローナル抗
体： （ａ）分子量：約１４０〜１６０キロダルトン、（ｂ）
酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）および塩基性線維
芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のいず九とも交差反応しな
い、 （ｃ）免疫グロブリンクラスがＩｇＧに属する；（２）
ｈｓｔ７１蛋白質で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺
乳動物のリンパ球様細胞とからなるクローン化されたハ
イブリドーマ： （３）ｈｓｔ−１蛋白質で免疫した哺乳動物の脾臓細胞
と、哺乳動物のリンパ球様細胞とを細胞融合し、クロー
ニングすることを特徴とする上記（２）記載のハイブリ
ドーマの製造法； （４）上記（２）記載のハイブリドーマを液体培地中ま
たは哺乳動物の腹腔内で増殖し、モノクローナル抗体を
生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上
記（１）記載のモノクローナル抗体の製造法；および （５）上記（１）記、載のモノクローナル抗体を用いる
ことを特徴とするｈｓｔ−１蛋白質の横比・定量法に関
するものである。

ｈｓｔ　−１は、Ｔａ１ｒａら、プロシージングスオブ
ザナショナルアカデミーオブザサイエンス（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、　８４
．２９８０−２９８４（１９８７）においては、２０６
個のアミノ酸配列からなるものとして示されている。

しかしながら、Ｄｅｌ　１ｉ−Ｂｏｖｉらは、モレキュ
ラーアントセルラーバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、　８
．２９３３−２９４１（１９８８）において、サルＣＯ
５−１細胞で発現させる（目的物をに−ＦＧＦと称して
いる。）とＮ末端から３０個あるいは３１個のアミノ酸
が脱離されたものが得られることを示している。したが
って、ｈｓｔ−１の成熟タンパクとしては、上記２０６
個のアミノ酸配列のＮ末端から３１個のアミノ酸が脱離
されたアミノ酸配列（第１図に示す）を有するものとす
るのが最も妥当であると考えられる。

本発明におけるｈｓｔ−１蛋白質としては、上記した成
熟タンパクやｈｓｔ−１ムテインが挙げられる。

該ｈｓｔ−１ムティンとしては、ｈｓｔ　−１の欠損型
ムティンが挙げられる 該欠損型ムティンとしては、ｈｓｔ−１の構成アミノ酸
のうち少なくとも１個のアミノ酸が欠損しており、ｈｓ
ｔ−１活性を有するものが挙げられる。

該欠損型ムティンとしては、ｈｓｔ−１の連続した構成
アミノ酸が１ないし４３個欠損しているものが好ましい
。

本発明の欠損型ムティンのさらに好ましい例としては、
Ｎ末端より連続した構成アミノ酸が１ないし４３個欠損
しているものが挙げられる。さらに好ましくはＮ末端よ
りアミノ酸番号２７までが欠損したムティン（ｈｓｔ−
１ムテインＮ２７と称することもある。アミノ酸配列は
、第１２図参照。）を挙げることができる。

哺乳動物に免疫するｈｓｔ　−１蛋白質としては、ｈｓ
ｔ　−１の成熟タンパクでも、また、上記したそのムテ
ィンでもよい。

ｈｓｔ　−１の成熟タンパクを得るためには、たとえば
上述のｈｓｔ−１のポリペプチドをコードする塩基配列
を有するＤＮＡを含有する発現型ベクターを作製し、適
当な宿主細胞に導入してｈｓｔ−１を産生させればよい
。発現型ベクターとしては、例えば、 （イ）　ｈｓｔ　−１をコードするＲＮＡを分離し、（
ロ）該ＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を１
次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、 （ハ）該相補ＤＮＡをプラスミドに組み込み、（ニ）得
られた組み換えプラスミドで宿主を形質転換し、 （ホ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から適
当な方法１例えばＤＮＡプローブを用いたコロニーハイ
ブリダイゼーション法、により目的とするＤＮＡを含有
するプラスミドを単離し。

（へ）そのプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ
を切り出し、 （ト）場合によりＡＴＧコドンを含むオリゴヌクレオチ
ドを結合させ、 （チ）該ＤＮＡをビークル中のプロモーターの下流に連
結する。ことにより製造することができる。

ｈｓｔ　−１をコードするＲＮＡは、ヒトの種々の癌細
胞、例えば、胃癌、大腸癌、肝癌、カポシ肉腫、ヒト胚
細胞性腫瘍、ヒトｈｓｔ　−１遺伝子によるＮＩＨ３Ｔ
３　トランスフォーマントなどから得ることができる。

このようにして得られた発現ベクターを、適当な宿主（
例、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞）に組み込み、得
られた形質転換体を培地に培養することにより、ｈｓｔ
　−１を製造することができる。

該ムティンを製造するためには、特定部位指向性変異誘
発技＠　（Ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｃｌ　ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ）が採用される。該技術は周知であり、アー
ル・エフ・レイザー（Ｌａｔｈｅｒｖ　Ｒ，Ｆ、　）及
びジエイ・ピー・レコック（Ｌｅｃｏｑ、　Ｊ、Ｐ、　
）、ジエネテイツク・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミツクブレス社
（１９８３年）第３１−５０頁、に示されている。オリ
ゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・スミス（
Ｓａ＋ｉｔｈ、　Ｍ、　）及びニス・ギラム（Ｇｉｌｌ
ａｍ、　Ｓ、　）、ジェネテイツク・エンジニアリング
：原理と方法、プレナムプレス社（１９８１年）３巻　
１−３２頁に示されている。

該ムティンをコードする構造遺伝子を製造するためには
、たとえば。

（ａ）ｈｓｔ−１の構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖
ＤＮＡを突然変異株オリゴヌクレオチドプライマーと維
種形成させる（この１本鎖で代替えすべきシスティン用
フトン、又は場合によりこのコドンと対合をつくるアン
チセンス・トリプレットを包含する領域に対して上記プ
ライマーは相補的なものである。但し、当該コドンの他
のアミノ酸暗号化用コドン、又は場合によりアンチセン
ス・トリプレットとの不一致はこの限りでない。）、（
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、
突然変異性へテロニ量体（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）
を形成させる。及び （ｃ）この突然変異性へテロニ量体を複製する。

次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。

このようにして得られたプラスミドで適当な宿主を形質
転換し、得られた形質転換体を培地に培養することによ
り、ムティンを製造することができる。

該ｈｓｔ−１蛋白質を免疫するに際しては、ｈｓｔ　−
１蛋白質をキャリヤー蛋白との複合体としてから、これ
を免疫に用いてもよい。

該キャリヤー蛋白としては、たとえばウシ血清アルブミ
ン、ウシサイログロブリン、ヘモシアニンなどが挙げら
れる。

キャリヤー蛋白との複合体を用いる場合に、キャリヤー
蛋白とｈｓｔ　−１蛋白質とのカップリング比率は、約
０．１−３０倍（キャリヤー／ｈｓｔ−１蛋白質二重量
比）で用いられる。望ましくは約０．５〜５倍が用いら
れる。

また、ハプテンとキャリヤー蛋白とのカプリングには、
種々の縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデ
ヒドやカルボジイミド等が好都合に用いられる。

ｈｓｔ−１蛋白質またはこれとキャリヤー蛋白との複合
体を用いて免疫するに際し、免疫する哺乳動物は、羊、
山羊、兎、モルモット、ラット、マウス等の実験動物が
使われるが、モノクローナル抗体を得るためには、ラッ
ト、マウスが好ましい。

免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、皮下、腹腔
内、静脈内、筋肉内、皮内等のいずれのルートからでも
可能であるが、主として皮下、腹腔内、静脈内に（とり
わけ皮下）注入するのが好ましい。

また、免疫間隔、免疫量等も可変度は高く、種々の方法
が可能であるが１例えば２週間隔で約２〜６回免疫し、
最終免疫後、約１〜５日、好ましくは約２〜４日後に摘
出した脾臓細胞を用いる方法がよく用いられる。免疫量
は１回にペプチド量として、マウス当り約０．１　μｇ
以上、好ましくは約１０μｇ〜３００μｇ用いることが
望ましい。又、腓臓を摘出する前に、部分採血を行い、
血中の抗体価の上昇を確認した上で、脾臓細胞を用いる
融合実験を行うことが望ましい。

上記脾臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融合は例えば摘
出したマウスの脾臓細胞を、ヒポキサンチン−グアニン
−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ
−）や、チミジンキナーゼ欠損（ＴＫ″″）の様なマー
カーを持った適切な同種または異種（好ましくは同種）
の哺乳動物のミエローマ［例、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ・８
Ｕ１（南隣ら、　ジャーナル・オブ・イムノロジカル・
メソッド８０５５（１９８５））］等の、リンパ球様細
胞株との間で融合させる。例えばケラ−およびミルスタ
インらの方法［ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６
：　４９５（１９７５）］に準じて融合させることによ
り製造される。

たとえばミエローマ細胞と牌細胞とを約１＝５の割合で
、たとえばイスコツ培地とハムＦ−１２培地を１：１に
混合した培地（以下ＩＨ培地と称する。

）に懸濁させ、センダイウィルス、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）等の融合剤が用いられる。

もちろんジメチルスルホキシド（ＤＭＳ○）その他の融
合促進剤を加えることも可能である。ＰＥＧの重合度は
、ふつう約１０００〜６０００、時間は約０゜５〜３０
分、濃度は約１０％〜８０％等が用いられるが、好まし
い条件の一例として、Ｐ　Ｅ　Ｇ６０００を約３５〜５
５％で約４〜１０分処理することにより、効率よく融合
させることが出来る。融合細胞は、ヒボキサンチン−ア
ミノプテリン−チミジン培地［ＨＡＴ培地；ネイチャー
、２５６，４９５（１９７５）コ等を用いて、選択的に
増殖させることが出来る。

増殖して来た細胞の培養上清は、目的とする抗体産生が
あるか否かについてスクリーニングを行うことができる
が、抗体価のスフ・リーニングは次の様に行うことが出
来る。即ち、この場合には、まず第１段階として免疫し
たペプチドに対する抗体産生の有無を、ラジオイムノア
ッセイ（ｔＡ）法またはエンザイムイムノアソセイ（Ｅ
　Ｉ　Ａ）法等の方法で調へることが出来るが、これら
の方法についても種々の変法が可能である。好ましい測
定法の一例として、ＥｒＡを用いる一つの方法について
述へる。セルロースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗
マウスイムノグロブリン抗体を常法に従ってカプリング
させておき、これに測定したい培養上清や、マウスの血
清を加え、一定時間、定温（約４〜４０　’Ｃを示す。

以下においても同様。）で反応させる。この後、反応物
をよく洗った後、摩素でｓ識したペプチド（酵素とペプ
チドを常法に従いカプリングさせた後精製）を加え、一
定時間、定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵
素基質を加え、一定時間、定温で反応させ、その後、生
成発色物を吸光度または蛍光度等で測定することが出来
る。

選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いたペプチドに対
する抗体活性のみられたウェルの細胞は。

限界稀釈法等によりクローニングを行うことが望ましい
。クローン化された細胞の上清について同様にスクリー
ニングを行い抗体価の高いウェルの細胞を増やすことに
より、免疫したベプチ［・と反応性を示すモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドマクローンが得られる。

このようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液
体培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地た
とえばＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４０［Ｍｏｏｒｅ。

Ｇ、Ｅ、、　ｅｔ、　ａｌ、ジャーナル・オブ・アメリ
カン・メディカル・アソシエーション（Ｊ、　Ａｍ、　
Ｍｅｄ。

Ａｓ５ｏｃ、）　１９９．５４９（１９６７）］に約０
．１−４０％の牛血清を加えた培地等で約２〜１０日間
、好ましくは約３〜５日間培養することにより、培養液
から該モノクローナル抗体を得ることができる。また、
哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、腹水を採
取することにより抗体を取得することが出来る。このた
めには１例えばマウスの場合、ミネラルオイル等を前も
って接種したＢＡＬＢ／ｃ等のマウスに約１×１０４〜
１ＸＩＯ７個、好ましくは約５ＸＩＯ’〜２Ｘ１０’個
のハイブリドーマを腹腔内に接種し、約７〜２０日後、
好ましくは約１０〜１４日後に腹水液を採取する。腹水
に生成薔積した抗体は。

例えば硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマト
グラフィー等により、容易にモノクローナル抗体を純粋
な免疫グロブリンとして単離することが８来る。

このようにして、ｈｓｔ−１蛋白質に対するモノクロー
ナル抗体が得られる。

本発明のモノクローナル抗体にあっては、免疫原のペプ
チドのｈｓｔ　−１蛋白質と特異的に結合する。

なお、本発明のモノクローナル抗体は、製造時に用いた
免疫原のペプチドとは異なるｈｓｔ　−１蛋白質と結合
する場合もある。

本発明のモノクローナル抗体は、下記の性質を有する： （ａ）分子量：約１４０〜１６０キロダルトン、（ｂ）
酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）および塩基性線維
芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のいずれとも交差反応しな
い、 （。）免疫グロブリンクラスがＩｇＧに属する。

更に本発明のモノクローナル抗体の内いくつかはｈｓｔ
−１蛋白質に対する中和活性を有し、活性型のｈｓｔ−
１蛋白質を測定可能であり、またはｈｓｔ−１蛋白質に
起因する病気の治療薬として用いる可能性もある。

本発明のモノクローナル抗体は、ｈｓｔ−１蛋白質に結
合することから、ｈｓｔ−１蛋白質測定用試薬として極
めて有用である。さらに生体臓器２組織中のｈｓｔ−１
蛋白質の測定を容易にすることは、ｈｓｔ　−１蛋白質
に関する基礎知見（例えば生体内分布）を得る上からも
極めて有用である。生体臓器、組織中のｈｓｔ−１蛋白
質の検出には通常酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）などによ
る定量、あるいは蛍光抗体法やラジオイムノアッセイ法
（ＲＩ　Ａ法）が用いられる。またこれらの臓器、組織
中に存在するｈｓｔ−１蛋白質の大きさを知るにはタン
パクのウェスタンブロッティング法が有効である。

この方法は臓器９組織由来の粗抽出液あるいはその部分
精製試料をアクリルアミド電気泳動した後。

メンブランフィルタ−にトランスファーし、ＨＲＰ結合
抗ｈｓｔ−１蛋白質抗体で検出する。また癌細胞の中に
は細胞自身がｈｓｔ−１を産生じ、そのｈｓｔ−１によ
り増殖を続ける場合のあることが考えられる。このよう
な癌に抗ｈｓｔ−１蛋白質抗体を作用させると増殖を促
進するｈｓｔ−１が中和され。

癌細胞の増殖阻止、すなわち制癌物質としての作用が期
待される。またｈｓｔ−１を産生する癌では、抗体を用
いてそのｈｓｔ−１を定量することができ癌の診断検査
薬にも応用できる。さらに該抗体とｈｓｔ−１蛋白質と
の結合能を利用し、抗体アフィニティーカラムを作製し
てｈｓｔ−１蛋白質の精製の試薬として利用することも
できる。

ｈｓｔ−１蛋白質を検出、定量するために用いられる抗
体分子は、ＩｇＧでもよく、また、そのフラクション（
例、Ｆ（ａｂ″）２．Ｆａｂ’もしくはＦａｂ）であっ
ても良い。なかでも、標識剤を直接結合させる抗体分子
はＦａｂ’であることが好ましい。

本発明のモノクローナル抗体は、ｈｓｔ−１蛋白質の免
疫化学的測定法における試薬として用いることができる
。

該ｈｓｔ−１蛋白質の免疫化学的ホク定法によって。

生体組織や体液中のｈｓｔ−１蛋白質の量を測定するこ
とができ、これにより、前述した如く、たとえば種々の
組織や体液中の血管新生因子を測定することにより、癌
の診断に役立つと考えられる。

担体に保持する抗体は、抗ｈｓｔ−１蛋白質抗体が用い
られる。

本発明の測定法において用いられる標識剤を結合させた
抗体は、上記担体に保持された抗体とは抗原決定部位を
異にする抗ｈｓｔ　−１蛋白質抗体に標識剤を直接結合
させたものを用いる。

本発明の免疫化学的測定法において用いられる抗ｈｓｔ
　−１蛋白質抗体としては、ｈｓｔ−１蛋白質に対して
結合能を有するものであればいずれでもよい。

ｈｓｔ−１蛋白質の測定方法において用いられる担体上
に保持された抗体における担体としては、例えば、ゲル
粒子（例、アガロースゲルｃ例、セファロース４Ｂ、セ
ファロース６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社（
スエーデン）製）］、デキストランゲル［例、セファデ
ックスＧ−７５、セファデックスＧ−１００、セファデ
ックスＧ−２００（ファルマシア・ファインケミカル社
（スエーデン）製）］、ポリアクリルアミドゲル［例、
バイオゲルＰ−３０、バイオゲルＰ−６０．バイオゲル
Ｐ−１００（バイオランド・ラボラトリーズ社（米国）
製）］、セルロース粒子［例、アビセル（旭化成製）、
イオン交換セルロース（例、ジエチルアミノエチルセル
ロース、カルボキシメチルセルロース）コ、物理的吸着
剤［例、ガラス（例、ガラス球、ガラスロッド、アミノ
アルキルガラス球、アミノアルキルガラスロッド）、シ
リ・コン片、スチレン系樹脂（例、ポリスチレン球、ポ
リスチレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例、ヌ
ンク社（デンマーク）製）］、イオン交換樹脂（例、弱
塩性陰イオン交換樹脂［例、アンバーライトＩＲＣ−５
０（ローム・アンド・ハース社（米国）製）、ゼオカー
ブ２２６（パームチット社（西ドイツ）Ｉｔり］、弱塩
基性陰イオン交換樹脂［例、アンバーライトＩＲ−４Ｂ
、ダウエックス３（ダウケミカル社（米国）製）］）な
どが挙げられる。

担体に抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用し
得るが、例えば、″代謝″、第８巻（１９７１年）、第
６９６頁に記載されているブロムシアン法、ゲルタール
アルデヒド法などが挙げられる。また、より簡便な方法
として物理的に担体表面に吸着させてもよい。

標識剤を結合させた抗体における標識剤としては、放射
性同位元素、酵素、蛍光物質１発光物質などが挙げられ
るが、酵素を用いるのが好ましい。

酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いる
ことができるが、ペルオキシダーゼが好ましい。ペルオ
キシダーゼとしては、種々の起源のものを用いることが
できるが、その例としてはたとえば西洋わさび、パイナ
ツプル、イチジク、甘藷、ソラマメ、トウモロコシなど
から得られるペルオキシダーゼが挙げられ、特に西洋わ
さびから抽出されたホースラデイツシュ　ペルオキシダ
ーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
）　（ＨＲＰ）が好ましい。

ペルオキシダーゼと抗体を結合するにあたり、抗体分子
としてのＦａｂ’のチオール基を利用するために、あら
かじめペルオキシダーゼにマレイミド基を導入したもの
を用いる・と好都合である。

マレイミド基をペルオキシダーゼに導入する方法として
は、ペルオキシダーゼのアミノ基を介してマレイミド基
を導入することができる。そのため、には、Ｎ−サクシ
ニミジル−マレイミド−カルボキシレート誘導体を用い
ることができ、好ましくは、Ｎ−（γ−マレイミドブチ
ルオキシ）サクシイミド（ＧＭＢＳと略称することもあ
る）などが良い。従って、マレイミド基とペルオキシダ
ーゼとの間に一定の基が入っていることとなってもよい
。

Ｇ　Ｍ　Ｂ　Ｓをペルオキシダーゼに反応させるには。

両者を、ｐＨ約６ないし８の緩？＃液中で約１０ないし
５０℃の温度で約１０分ないし２４時間反応させること
によって行われる。該緩衝液としては、たとえば、ｐＨ
７，０の０．１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。この
ようにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼは、
たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより精製するこ
とができる。該ゲルクロマトグラフィーを行う際番こ用
いられる担体としては、例えば、セファデックスＧ−２
５［ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデン）
製コ、バイオゲルＰ−２［バイオラット・ラボラトリー
ズ社（米国）製コなどが挙げられる。

マレイミド化ペルオキシダーゼと抗体分子との反応は、
両者を緩衝液中で約０戸Ｃないし４０　’Ｃの温度で、
約１ないし４８時間反応させることにより行うことがで
きる。該緩衝液としては、たとえば、ｐＨ６，０の５ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０．１Ｍ
リン酸緩衝液などが挙げられる。

このように′して得られたペルオキ、シダーゼ標識抗体
は、たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより精製す
ることができる。該ゲルクロマトグラフィーを行う際に
用いられる担体としては、例えば、セファデックスＧ　
−２’５　［ファルマシア・ファインケミカル社（スエ
ーデン）製コ、バイオゲルＰ−２［バイオラット・ラボ
ラトリーズ社（米国）製］などが挙げられる。

さらに、ペルオキシダーゼにチオール基を導入し、マレ
イミド化された抗体分子と反応させても良い。

ペルオキシダーゼ以外の酵素を抗体に直接結合させるに
は、ペルオキシダーゼの場合に準じて行なうことができ
、また、自体公知のグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸
法、水溶性カルボジイミド法などが用いられる。

本発明の測定系における被検試料としては、尿、血清、
血漿、髄液等の体液、あるいは、動物細胞や菌体の抽出
液またはその培養上清が挙げられる。

本発明の測定方法の例として、標識剤がペルオキシダー
ゼの場合について以下に具体的に説明するが、ペルオキ
シダーゼに限定されるものではない。

まず、■：担体に保持された抗体に、測定すべきｈｓｔ
　−１蛋白質含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を
行った後、これに、前記で得られたペルオキシダーゼと
抗ｈｓｔ−１蛋白質抗体との結合物を加えて反応させる
。

この本測定系における被検試料としては、尿、血清、血
漿、髄液等の体液、あるいは、動物細胞や菌体の抽出液
またはその培養上清が挙げられる。

■：■で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。

■：上記■〜■の操作を既知量のｈｓｔ　−１蛋白質の
標準溶液に対してあらかじめ行い、ｈｓｔ−１蛋白質と
吸光度もしくは蛍光強度との関係を標準曲線として作成
しておく。

■：未知量のｈｓｔ　−１蛋白質を含む分析対象物（被
検試料）について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標
準曲線にあてはめ、分析対象物中のｈｓｔ−１蛋白質の
量を測定する。

ｈｓｔ　−１蛋白質に対するモノクローナル抗体とキャ
リア用蛋白との複合体を免疫原として得られた抗体を用
いてｈｓｔ−１蛋白質を精製することができる。これに
は、該抗体を用いてアフィニティーカラムクロマトグラ
フィーを行なうことにより行なうことができる。

該アフィニティーカラムクロマトグラフィーは、たとえ
ば、該抗体を適切な担体にカップリングさせ、これをカ
ラムに充め、ｈｓｔ−１蛋白質を含む溶液をカラムに通
し吸着させ、次いで溶出させることにより行なうことが
できる。

該担体としては、たとえば、先に記載された担体と同様
のものが挙げられる。とりわけゲル粒子や各種合成樹脂
が好都合に用いられる。たとえばＣＮ　Ｂ　ｒ　−ａｃ
ｔｉｖａｔｅｄ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　（ファ
ルマシア・ファインケミカル社製）、アフィゲル−１０
、アフィゲル１５（バイオランド・ラボラトリーズ社製
）などが挙げられる。

抗体を担体にカップリングさせるには、公知の常套手段
を応用し得るが、たとえば゛′代謝”、第８巻（１９７
１年）、第６９６頁に記載されているブロムシアン法、
ゲルタールアルデヒド法が挙げられる。

また、水溶性カルボジイミドを用いる方法、活性エステ
ル法なども用いることができるが、より簡単な方法とし
て物理的に担体表面に吸着させてもよい。

このようにして得られた抗体カラムを用いて精製を行な
うには、抗体を結合させた担体を充てんした抗体カラム
に中性付近の緩衝液中のｈｓｔ　−１蛋白質を吸着させ
る。次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したのち、特異的に
吸着されたｈｓｔ−１蛋白質を溶出させる。特異的に吸
収された抗体を溶出するには、たとえば、低ｐＨもしく
は高ｐＨの緩衝液、高濃度の塩を含有する緩衝液を用い
で行なわれる。

該低ｐＨの緩衝液としては、たとえばｐＨ２，３の０．
１７Ｍ　　グリシン−塩酸緩衝液、ＰＨ１，８の０．１
Ｍ　第二クエン酸ナトリウム−塩酸緩衝液などが挙げら
れる。

該高ＰＨの緩衝液としては、たとえばｐＨ１１のアンモ
ニア水、ＰＨ１１，７の０．２Ｍホウ酸ナナトリウム緩
衝液どが挙げられる。

該高濃度の塩を含有する緩衝液としては、たとえば６Ｍ
グアニジン塩酸溶液、７Ｍ尿素溶液などが挙げられる。

上記の溶出は、バッチ法でもよく、またカラムを用いる
方法でもよい。

抗体の溶出液はたとえば透析して精製する。たとえば低
ｐＨの緩衝液で溶出した時は、たとえば０．１Ｍ炭酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ１０，５）、高ｐＨの緩衝液で溶
出した時は、たとえば０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（
ｐＨ３，０）で中性化したのち、たとえば０．１％Ｎａ
Ｎ、を含む０．０２Ｍリン酸食塩緩衝液（ｐ　Ｈ８，０
）に対して透析する。また高濃度の塩を含有する緩衝液
で溶出した抗体液は直接に上記のリン酸食塩緩衝液に透
析して保存することもできる。また、上記溶出液または
透析液を凍結乾燥して得られた凍結乾燥標品として保存
することもできる。

このようにして精製されたｈｓｔ　−１蛋白質は、顕著
な血管内皮細胞などの細胞の増殖促進活性や血管新生促
進作用を有し、毒性は低いので、火傷、創傷、術後組織
などの治癒促進剤などの治療薬として用いることができ
る。また、細胞培養を促進させるための試薬として用い
ることができる。

ｈｓｔ−１蛋白質を上記治療のための医薬として用いる
には、そのまま粉末として、または他の薬理学的に許容
されうる担体、賦形剤、希釈剤とともに医薬組成物（例
、注射剤、錠剤、カプセル剤、液剤、軟膏）として、温
血動物（例、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサ
ギ、犬、ネコ）に対して非経口的または経口的に安全に
投与することができる。

上記の医薬組成物としての製剤化は常法に従って行なわ
れる。

ｈｓｔ−１蛋白質を上記した医薬として用いる場合には
、たとえば上記した温血動物に、投与ルート、症状など
を考慮して、１日量約１０ｎ　ｇないし１０μｇ／ｋｇ
の中から適当量を選んで投与される。

また、このようにして精製されたｈｓｔ−１蛋白質は、
細胞培養を促進させるための試薬として用いることがで
きる。この場合、ｈｓｔ−１蛋白質を好ましくは、培地
ＩＱあたりに約０．１〜１０μｇとなるように培地に加
えることが好ましい。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　　Ｃｏｍ
ｍ１ｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍ
ｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野におけ
る慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。ま
た、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に
明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ　　：相補的デオキシリボ核酸Ａ　　　：アデ
ニン Ｔ　　　：チミン Ｇ　　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ　　　：リボ核酸 ｄＡＴＰ　　：デオキシアデノシン三すン酸ｄＴＴＰ　
　：デオキシチミジン三すン酸　　ＧＴＰ ＣＴＰ ＴＰ ｄｒ 　ＤＴＡ ＤＳ ｌｙ ｌａ ａｌ ｅｕ １ｅ ｅｒ ｈｒ ｙｓ ｅｔ ｌｕ ｓｐ ｙｓ ｒｇ ｉｓ ：デオキシグアノシン三すン謙 ：デオキシシチジン三リン酸 ：アデノシン三リン酸 ：チミジン ：エチレンジアミン四酢酸 ニドデシル硫酸ナトリウム ニゲリシン ：アラニン ：バリン ：ロイシン ：イソロイシン ：セリン ：スレオニン ：システィン ：メチオニン ：グルタミン酸 ：アスパラギン酸 ：リジン ：アルギニン ：ヒスチジン ｈｅ Ｔｙｒ ｒｐ Ｐｒ。

ｓｎ ｉｎ ｌｚ ：フエニールアラニン ：チロシン ニトリブトファン ：プロリン ：アスパラギン ：グルタミン ：２−クロロベンジルオキシカルボニ ル ＢｒＺ　　　　：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｚｌ　　　　：ベンジル Ｂｏｃ　　　：ｔ−ブトキシカルボニル後述の参考例２
において製造された形質転換体および後述の実施例１に
おいて製造されたハイブリドーマは財団法人発酵研究所
（ＩＦＯ）、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所（ＦＲＩ）に寄託されている。これらの寄託臼および
寄託番号を次の第１表に示す。なお、ＦＲ４のＦＥＲＭ
ＢＰ番号は、ブダペスト条約に基づく寄託の受託番号を
示す。

第１表 以下に参考例、実施例をもって、本発明をさらに詳しく
説明するが１本発明は、これらによってなんら限定され
るものではない。

以下の実施例に記載のヒトリコンビナントｂＦＧＦ　　
（ｒｈｂＦＧＦ）はＩｗａｎｅら、バイオフィジカルバ
イオケミカルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｉｍｕｎ、
）１４６゜４７０（１９８７）、ヨーロッパ特許出願公
開筒２３７，９６６号公報に記載の方法で製造されたも
のを用いた。

ヒトリコンビナントａ　Ｆ　Ｇ　Ｆについては、後述の
参考例１に記載の方法で製造さ、れたものを用いた。

ヒトリコンビナントｈｓｔ　−１ムテインＮ２７　（ｈ
ｓｔ−１のＮ末端よりアミノ酸番号２７までが欠損した
ムティン）については、後述の参考例２に記載の方法で
Ｍ造されたものを用いた。

参考例１（組換え型ヒトａＦＧＦの調製）ヒトａ　ＦＧ
Ｆを、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ）　５　、９５０（１９，！１７）；ジャーナルオブ
バイオロジカルケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２６３
．１６４７１　（１９８８）、およびＩＣ５ｕシヨート
　　リポート（Ｓｈｏｒｔ　Ｒｅｐｏｒｔ）　　ｖｏｌ
ｕｍｅ　８　。

アドパンシズインジーンテクノロジー（Ａｄνａｎｃｅ
ｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　　ニブ
ロチインエンジニアリングアンドプロダクション（Ｐｒ
ｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｉｏｎ）　、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆｔ
ｈｅ　１９８８　Ｍｉａｍｉ　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、　ＩＲＬ
　Ｐｒｅｓｓ、　ｐａｇｅ　１１０．に記載の方法を参
考にして１次に示す方法により製造した。

（ａ）　　　　プラスミドの構 化学合成されたヒトａＦＧＦのｃＤＮＡ（第２図）を　
ｐＵｃｌｇ［メンツズインエンザイモロジー（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、　ｌ（則、
２Ｏ−７８（１９８３）コに組み込んだプラスミドｐＴ
Ｂ９１７をＢｓＰＭＩで切断し、ｌａｒｇｅ　ｆｒａｇ
ｍｅｎｔの反応によりこの部位を平滑末端にした後、Ｂ
ａｍＨＩで消化して０．４５ＫｂのＤＮＡ断片を調製し
た。ベクタ・−ＤＮＡにはＴ７フアージのφ１０プロモ
ーターを保持するｐ　Ｅ　Ｔ　３　ｃ　　（Ｓｔｕｄｉ
ｅｒ、　Ｆ、Ｊ　ら　ジャーナルオブモレキュラーバイ
オロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

）　１８９　：　１１３−１３０（１９８６））を用い
、ｐＥＴ３ｃをＮｄｅｌで切断し、　ｌａｒｇｅ　ｆｒ
ａｇａ＋ｅｎｔで平滑末端とした後Ｔ４　　ＤＮＡリガ
ーゼによりＮｃｏ＋リンカ５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’　
を結合させた。このプラスミドをＮｃｏｒで切断し、そ
の部位をＤＮＡポリメラーゼｌａｒｇｅ　ｆｒａｇｍｅ
ｎｔにより平滑化した後ＢａｍＨＩで切断してＳＩＯの
配列を除き、そこに先の０，４５Ｋｂ　ｂｌｕｎｔ　Ｂ
　ｓｐＭ　Ｉ　−Ｂ　ａｍＨＩ断片をＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて組み込んでＰＴＢ９７５を得た（第３図）。

（ｂ）ヒトａＦＧＦｃＤＮＡの　、　　での次に大腸菌
ＭＭ２９４株にＴ７フアージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子を組み込んだλファージＤＥ　３　（Ｓｔｕｄｉｅｒ
、Ｆ、Ｗ、ら、ジャーナルオブモレキュラーバイオロジ
−（ＪｏＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、）１８９：１１３−１３
０（１９８６））を溶原化させ、さらにＴ７フアージの
りゾチーム遺伝子をもつプラスミドｐｌｙｓｓ（Ｓｔｕ
ｄｉｅｒ、　Ｆ、υ、らジャーナルオブモレキュラーバ
イオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　１８９　：　
１１３−１３０（１９８６））を導入し、大腸菌ＭＭ２
９４　（ＤＥ３）／ｐｌｙｓｓ株を作製した。この大腸
菌株にｐＴＢ９７５を導入し、大腸菌ＭＭ２９４　（Ｄ
Ｅ　３）／ｐＬｙｓＳ、ｐＴＢ９７５をつくった。この
菌を３５μｇ／ＩＩＱアンピシリン、１０μｇ　／　ｍ
　Ｑクロラムフェニコールを含む培地で３７℃で培養し
、濁度がＫ　ｌ　ｅ、ｔ　ｔ１７０になったときイソプ
ロピルβ−Ｄチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度
が０．５＋ａＭになるように加え更に３時間培養を継続
した。菌体を遠心により集め、水冷したＰＢＳで洗った
後、再集菌し使用時まで一２０℃に保存した。

（ｃ）ヒトａＦＧＦの １１ｉｔｅｒ培養から集めた菌体を１００ｍ　Ｑの水冷
１０ｍＭ　　Ｔｒｉ　　５−ＨＣ１２（ｐＨ７，４）、
１０ｎ＋Ｍ　　ＥＤＴＡ、　０．６ＭＮ　ａ　ＣＱ　、
　１０％０％シボ　　０．２５ｍＭ　ＰＭＳＦに懸濁し
、卵白リゾチームを０．５■／ｍＱとなるように添加し
た。１時間水中に放置後３７℃で５分間インキュベート
し、水冷下で超音波処理（２０秒間、２回）を行い、遠
心（ＳＯＲＶＡＬＬ、　１８Ｋｒｐｍ、　３０ｍ１ｎ、
　４℃）して上清を得た。この上清を２００ｍＱの水冷
２０＋ｎＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＱ　（ｐ　Ｈ７，
４）、　１ｍＭＥＤＴＡと混和し、２０ｍＭ　　Ｔ　ｒ
　ｉ　ｓ　−ＨＣＱ（ｐ　Ｈ７，４）、　１＋＋＋Ｍ　
Ｅ　ＤＴＡ、　０．２Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱで平衡化したヘ
パリンセファロースカラム（径２．５Ｘ　４　ａｎ　）
にかけた。カラムを１５０＋ａ　Ｑの２０ｍＭＴｒｉ　
ｓ　−ＨＣＱ　（ｐ　Ｈ７，４）、　１ｍＭ　Ｅ　ＤＴ
Ａ、　０．５ＭＮａＣＱで洗った後、２０ｍＭ　Ｔ　ｒ
　ｉ　ｓ　−ＨＣＱ（ｐＨ７，４）、　１＋ａＭ　　Ｅ
ＤＴＡ、　１．５Ｍ　ＮａＣＲで蛋白を溶出した。溶出
液を６　ｔｓＱ毎に分画し、○Ｄ２８゜をモニターして
２番目のピーク画分（８−１１番、計２４ｍΩ）を集め
た（第４図）。この両分２２ａＱに対して等量の２０ｍ
Ｍ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ、−ＨＣＱ　（ｐ　Ｈ７゜４）、１
ｍＭ　ＥＤＴＡ、２Ｍ　（ＮＨ４）２Ｓｏ４を混和し、
　２Ｏｎ＋Ｍ　　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＱ　（ｐ　Ｈ
７，４）、　　１ｍＭＥＤＴＡ、ＬＭ　（ＮＨ４）２Ｓ
ｏ４で平衡化したフェニルセファロースカラム（径２．
５Ｘ８ｃｍ）にかけた（流速０．５ｍ　Ｑ　／　ｗｉｎ
、）。２０ｍ　ｍの同じ緩衝液でカラムを洗った後、Ｉ
ＭからＯＭの硫酸アンモニウム直線的濃度勾配（流速０
．５１１ＩＱ　／　ｍｉｎ、、勾配時間２００分）をか
け、溶出された画分４０−５５を集め（第５図）、精製
ヒトａＦＧＦとした。

（ｄ）’　　Ｃ４ＨＰＬＣ 精製ヒトａＦＧＦ　１．２ｍｇ／＋ＩＩＱ溶液を０．２
５＋ｎＱの０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と混合
し、逆相Ｃ４カラム（ｖＹＤＡＣ）にかけ、０．１％Ｔ
ＦＡ存在下に０％から９０％アセトニトリルの直線的濃
度勾配をかけ溶出パターンを調べた。流速１■Ω／＋＋
＋ｉｎ、、勾配時間６０分で行った（第６図）。

（ｅ）１隻五作 ヒトａ　ＦＧＦの活性は佐々田らの方法（Ｓａｓａｄａ
ら、モレキュラーセルバイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１
ｌ　Ｂｉｏｌ、）　８　：　５８８−５９４（１９８ｇ
）に従い、マウスＢＡＬ　Ｂ　／　ｃ　３　Ｔ　３細胞
のＤＮＡ合成誘起を［’Ｈコチミジンの取り込みを指標
として測定した。検体添加時、必要に応して培地中およ
び検体中にヘパリン（ＳＩＧＭＡ　Ｇｒａｄｅ　Ｉ　）
　ｍ液を混合した。

参考例２（ヒトリコンビナントｈｓｔ　−１ムテインＮ
２７の調製） （ａ）発現プラスミドの構築 ヒトｈｓｔ−１ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫ。

Ｃ５［プロシージングスオブザナショナルアカデミーオ
ブザサイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）　８４．２９８０−２９８４（１
９８７）：ｌ　　をＨｉｎｄｍで切断し、Ｅ、　ｃｏｌ
ｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　　Ｋｌｅｎｏｗ断片反応に
より平滑化した。ここにＢ　ａ　ｍ　Ｈ１リンカ−をＴ
４リガーゼ反応により連結したのち。

ＢａｍＨＩ−５ｔｙｌで切断して０．４９ｋｂ　ＤＮＡ
断片を得た。合成オリゴヌクレオチド５’　Ｔ　Ａ　Ｔ
ＧＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＣ３’および５’
ＣＴＴＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡ３’
を上記０．４９ｋｂ　ＤＮＡの５′末端側に連結して得
られた０、５１ｋｂ　Ｎｄ　ｅ　Ｉ−Ｂ、ａｍＨＩ　　
ＤＮＡ断片（開始コドンＡＴＧ、ヒトｈｓｔ−１ｃＤＮ
ＡのヌクレオチドＮｏ、　４１３〜９１６を含む）を、
Ｔ７フアージのφ１０プロモーターを有する大腸菌用発
現ベクターｐＥＴ３ｃ　　［ジーン（Ｇｅｎｅ）　５６
，１２５−１３５（１９８７）］のＮｄｅｌ−ＢａｍＨ
Ｉ間に組み込んでｐＴＢ１０５１を得た（第７図）。

（ｂ）ｃＤＮＡの大腸菌での発現 大腸菌Ｍ　Ｍ　２９４株にＴ７フアージのＲＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ３（Ｓｔｕｄ
ｉｅｒ、　Ｆ、１１１．ら、ジャーナルオブモレキュラ
ーバイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　　１
８９　：　１１３−１３０　（１９８６）　）を溶原化
させ、さらにＴ７フアージのリゾチーム遺伝子をもつプ
ラスミドｐＬｙｓＳ　（Ｓｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ、Ｗ、ら
、ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（Ｊ、　Ｍ
ｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　　１８９　：　１１３−１３０
（１９８６））を導入し、大腸菌ＭＭ２９４　（ＤＥ　
３）／ｐＬｙｓＳ株を作製した。

上記（ａ）で得られたプラスミドＰ　Ｔ　Ｂ　１０５１
を、この大腸菌Ｍ　Ｍ　２９４　（Ｄ　Ｅ　３　）　／
　ｐＬｙｓＳ株に導入し、大腸菌ＭＭ２９４　（Ｄ　Ｅ
　３　）／ｐＬｙｓＳ＋　ｐ　Ｔ　Ｂ　１０５１（ＩＦ
○１４９５２．　ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２６２１）を作製
した。この菌を１０μｇ　／　ｍ　Ｑクロラムフェニコ
ール、３５μｇ／ｌＩＱアンピシリンを含むし培地で培
養し、　Ｋｌｅｔｔ値が約１２０の時点で、イソプロピ
ルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（Ｉ　ＰＴＧ）を最終
濃度が０．４ｍＭになるように加え更に４時間培養を継
続した。菌体を遠心により集め、水冷したフォスフェー
トバッフアートセライン（ＰＢＳ）で洗った後、再集菌
し使用時まで一２０℃に保存した。

（ｃ）組換え型ｈｓｔ　−１ムテインの精製１０１ｉｔ
ｅｒ培養から集めた菌体を２５Ｏｎ＋　Ｑの氷冷１０ｗ
ｒＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｎ　（ｐ　Ｈ７，４）、
１０ｍＭ　Ｅ　Ｄ　ＴＡ、０．５Ｍ　ＮａＣＱ、１０％
ショ糖、１＋ｎＭＰＭＳＦに懸濁し、卵白リゾチームを
０．５■／ＩＩＩＱとなるように添加した。１時間水中
に放置後３７℃で５分間インキュベートし、水冷下で超
音波処理（２０秒間、２回）を行い、遠心（ＳＯＲＶＡ
ＬＬ、　１８にｒｐｍ、３０ｍ１ｎ＋４℃）して上清を
得、これを菌体抽出液とした。

菌体抽出液２５０ａ＋　Ｑを２０ｔａＭ　Ｔｒｉ　５−
ＨＣＱｐＨ７，６，０，５Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱ溶液で平衡
化したＱセファロース（ファルマシア）カラム（径５×
５■）に通し、抽出液中の核酸成分を除去した。カラム
からの素通り液および２０ｍＭ　Ｔｒｉ　５−ＨＣＱ、
ｐＨ７，６，０，５Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱ溶液でのカラム洗
液を合わせて集めた（Ｑセファロース素通り画分４５０
ｍＱ、）。この画分をヘパリンカラム５ｈｏｄｅｘ　Ａ
　Ｆ−ｐａｋ　ＨＲ−２０９４，（２ａｎ　Ｉ　Ｄ　Ｘ
、２５ａｎ、昭和電工型）を装備した高速液体クロマト
グラフィー装置（ギルソン社）にかけた。カラムを、２
０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　５−ＨＣＱ　　ＰＨ７，６溶液、
次いで２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ　　ｐＨ７，６，０，
５ＭＮａＣＱ溶液で洗った後、２０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　
５−ＨＣＱ　　ｐ　Ｈ７，６、バッファー中、０６５Ｍ
から２ＭのＮａＣｆ１の直線勾配溶出（Ｌｉｎｅａｒｇ
ｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ、１８０ｍ１ｎ、流速
６．０ｍ　Ｑ　／　ｍ１ｎ）を行った。

溶出パターンを第８図に示す。第８図において、縦軸は
○Ｄｚａｏの吸収値、およびグラジェント中のＮａＣｌ
２濃度を示している。横軸はフラクション番号を示して
おり、ｔｉａ＋ｅｏでグラジェント溶出を開始した。０
．７５分毎の両分を分取した。これらの蛋白質の比活性
、及びｈｓｔ　−１ムテイン回収量を第１表に示した。

また、ピークを与えた各フラクションの５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ　（１２，５％ポリアクリルアミドゲル）を第９図に
示した。

第　１　表　　　　　−二　未測定 蛋白量ｍ　ｇ　　ｈｓｔ−１活性（ｍ　ｇ　ｂＦＧＦＭ
ｉ）粗抽出液　　　　２５３０　　　　　３．８（ｄ）
逆相Ｃ４ＨＰＬＣ ヘパリンＨＰＬＣカラムからの溶出画分＃５６を約半量
（タンパク３００μｇ）を逆相ｃ４カラム（ＶＹＤＡＣ
）にかけ０．１％ＴＦＡ存在下に０％から９０％アセト
ニトリルの直線的濃度勾配をかけ溶出パターンを調へた
。流速１ｍＱ／ｗｉｎ、勾配時間６０分で行った（第１
０図）。３６〜３７分に検出されたピーク画分の５ＤＳ
−ＰＡＧＥ　（１２，５％ポリアクリルアミドゲル）を
ヘパリンカラムからの溶出画分５６と共に第１１図に示
す。

なお、第１１図において、１は分子量マーカー（５０ｎ
　ｇ　）の、２はヘパリンＨＰＬＣカラムより溶出され
たフラクション５６（５０ｎｇ）の、３はヘパリンＨＰ
ＬＣカラムより溶出されたフラクション５６　（１００
ｎ　ｇ　）の、４は逆相ＨＰＬＣ溶出画分（５０ｎ　ｇ
　）の、５は逆相ＨＰＬＣ溶出画分（１００ｎｇ）の１
２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動のパターンを
それぞれ示す。また、これらの蛋白の比活性は組換え型
ヒトｂＦＧＦ　（ｒｈｂＦＧＦ）（ヨーロッパ特許公開
第２３７，９６６号公報）を１．００とした場合０．４
３と測定された。これら精製過程の比活性の変化、およ
びｈｓｔ　−１ムテインＮ２７の回収量を第２表に示し
た。なお、第２表において。

比活性は、ウシ脳下垂体由来ＦＧＦ　（全酒造製）の活
性を１とした。

このようにして、第１２図に示すアミノ酸配列を有する
ｈｓｔ　−１ムテインＮ２７を得た。

賞５２天メ百函分　２１５２　　０・０１４　　　９１
（ｅ）生物活性 ｈｓｔ　−１ムテインの活性は佐々田らの方法（Ｓａｓ
ａｄａら、モレキュラーセルノベイオロジ−（Ｍｏ１．
　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ）　、　伸５８８−５９４（１９
８８））に従し１、マウスＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　３
　Ｔ　３細胞のＤＮＡ合成誘起を［３Ｈ］チミジンの取
り込みを指標として測定した。結果を上述の第２表に示
した。

実施例１ （１）免疫： Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（♀８週令）に対し生理
食塩水０．３ｍＱに溶解させた５０μｇの抗原ｈｓｔ−
１ムティンＮ２７（参考例２で得られたもの）と同量の
フロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社）を混合し
て皮下に注射した。２週間後に同量の抗原と０．３ｍＱ
のフロインド不完全アジュバントの混合物を皮下に再投
与した。さらにその２週後、４週後に同様の追加免疫を
行ない、４次免疫の２週後に生理食塩水に溶かした７２
μｇのｈｓｔ−１ムテインＮ２７を静脈内に接種した。

（２）細胞融合： 上記（１）で得られた免疫マウスより、抗原最終投与の
３日後牌臓を摘出し、細胞融合に用いる細胞を得た。こ
の細胞は、イスコツ培地とハムＦ−１２培地を１：１の
比率で混合した培地（以下■Ｈ培地と略す）に懸濁した
。

マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ・８ＵＩは１
０％ウシ胎児血清を含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　　１６４０培地
で５％炭酸ガス、９５％空気の条件で継代培養した。

細胞融合は、ケーラーおよびミルスタインらが確立した
方法［ケーラー、Ｇ、およびミルスタイン、Ｃ０：ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６，４９５（１９７５）
］に準じて行った。上記ミエローマ細胞２．４　Ｘ　１
０’個と上述した方法で得られた免疫されたリンパ球１
．２ＸＩＯ８個を混合、遠沈し、０．３ｍｕのＩＨ培地
に溶解した４５％ポリエチレングリコール６０００　（
以下Ｐ　Ｅ　０６０００）を滴下した。Ｐ　Ｅ　０６０
００溶液は、予め３７℃に温め、ゆっくりと滴下した。

８分後３７℃に予湿したＩＨ培地１分間に０．５ｍＱず
つ加え１０ｍＱとした後、室温で６００回転１５分遠心
し上清を除去した。この細胞沈澱物を２０％仔牛血清を
含むＩＨ培地２００ｍ　Ｑに懸濁し、９６ウエルマイク
ロプレート（ヌンク社）に１００μＱずつ７６８ウェル
植えつけた。１日後、ＨＡＴ　（ヒポキサンチン１×１
０−４Ｍ、アミノプテリン４Ｘ１０−７Ｍ、チミジン１
．６ＸＩＯ−５Ｍ）を含んだＩＨ培地（２０％仔牛血清
含有）（以下ＨＡＴ培地と称する。）を各ウェルに１０
０μΩずつ添加し、さらに３日おきに、培地の１／２量
をＨＡＴ培地と交換した。このようにして生育した細胞
は雑種細胞である。

（３）抗体産生細胞の検索： 参考例２記載の方法で精製されたりコンビナンドｈｓｔ
−１ムティンＮ２７を１０μｇ／ｍｆｌになるよう０．
０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８，５）で希釈し、その１００
μＱを９６ウエルイムノプレート（ヌンク社製）の各ウ
ェルに入れ４℃−夜装置し、固層にｈｓｔ　−１ムテイ
ンＮ２７を結合させた。０．１５Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱを含
有する０、０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄し
た後、余剰の結合部位をふさぐ・ため、１％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を含有する０、ＯＩＭリン酸緩衝液
を２００μΩずつウェルに注入して、使用時まで冷所に
保存した。以上のようにして得られたヒトｈｓｔ−１ム
ティンＮ２７を結合した９６ウエルイムノプレートに、
雑種細胞培養上清を１００μΩずつ加え室温で２時間イ
ンキュベートした。培養上清を除去、洗浄後２次抗体と
して西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）Ｉｊｔ識抗
マウスＩｇＧヤギ抗体（カッベル社）を加え室温で２時
間インキュベートした。２次抗体を除去し、よくウェル
を洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液（０，０２％
Ｈ２Ｏ２と０．１５％　０−）ユニレンジアミンを含む
ｐＨ５，５のクエン酸ナトリウム緩衝液）を１００Ｉｔ
Ω加え、２５℃で１０分反応させ、２Ｎ−硫１１１１１
００μΩを加えることにより酵素反応を停止した後、マ
イクロプレート用自動比色計（ＭＴＰ−３２、コロナ社
製）を用い、４９２ｎ＋＋＋における吸光度を測定した
（ＥＬＩＳＡ法）。この方法により７ウエルに結合抗体
の存在が観察された。

（４）雑種細胞のクローニング： これらのウェル中の細胞を、１ウエルあたり０．５個と
なるように、予め５Ｘ１０’個／ウェルのマウス胸腺細
胞を栄養細胞としてまいておいた９６ウエルマイクロプ
レートにまき、クローニングを行った。その結果、それ
ぞれのウェルがら代表的なりローン細胞各１を得、合計
７のクローン細胞５すなわちＨ３−２４，Ｈ５−１０１
，Ｈ５−１１４，Ｈ５−１３１（ＩＦＯ５０２３７、Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−２９０６）、ＭＳ−２１０，Ｈ５−２３
３（ＩＦＯ５０２３＆、ＦＥＲＭ　ＢＰ−２９０７）、
　Ｈ５−２７６を得た。

（５）抗体の製造： 上記（４）においてクローニングによって得られた７種
のハイブリドーマクローンそれぞれを、あらかじめ０．
５ｍＭのミネラルオイルを腹腔内に投与しておいたＢ　
Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの腹腔内に１匹あたりｌＸｌ
０’個接種することにより腹水化を行なった。ハイブリ
ドーマを腹腔に投与して１０日後、腹水を採取した。得
られたそれぞれの腹水約１０１１ＩＱから、ステーリン
ら［ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー、　２
５６，９７５０−９７５４（１！ｌ”８１）コの方法に
準じてモノクローナル抗体を精製した。

まず腹水からフィブリン様物質を除去するため１０．０
００回転１５分間遠心した後、リン酸緩衝液−食塩水（
ＰＢ　Ｓ　：　８．１ｍＭ−Ｎ　ａ２８ＰＯ４，１，５
ｍＭＫ　Ｈ２Ｐ　０４＋　２７ｍＭ　　Ｋ　ＣＱ　＋　
１３７ｍＭ　　Ｎ　ａ　Ｃｎ　。

ｐＨ７，２）で２８０ｎｍの紫外部吸収（Ａ、、ｏ）が
１２〜１４の値を示す濃度に希釈した。希釈後サンプル
に飽和硫酸アンモニウム溶液を４７％の濃度になるよう
に加え、４℃で攪拌しながら６０分間塩析を行ない、そ
の後遠心（１０，０００回転、１５分間）を行なって沈
澱物を得た。沈澱物を５０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃｆｌ含有２
０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ７，９）に溶遊し、同溶液
２Ｑに対して透析を行なった。２時間後、２Ｑの新しい
同じ透析液に換え、さらに１５時間透析を行なった。透
析後、沈澱を除去するため１０，０００回転１５分間遠
心を行ない、上清をＡ、。の値が２０〜３０の濃度にな
るように調製した。このサンプルを充分量の５０ｍＭ　
−Ｎ　ａ　ＣＡ含有トリス緩衝溶液で平衡化した２０ｍ
　ＱのＤＥＡＥセルロースカラム（ワットマンＤＥ、２
）にがけ、５０ｍＭ　Ｎ　ａ　ＣＱ含有トリス緩衝溶液
でよく洗った後、５０ｍＭ　−５００ｒｓＭ　ＮａＣＲ
を含む同緩衝液の濃度勾配溶液を用いて１．５ｍｎ１分
の流出速度で分画を行なって素通り分画を濃縮し、それ
ぞれの精製モノクロ−・ナル抗体Ｈ５−２４，ＭＳ−１
０１，８５−１１４゜ＨＳ　−１３１、Ｍ　Ｓ　−２１
０Ｔ　ＨＳ　−２３３、およびＨ３−２７６を得た。

抗体の純度の確認にはラエムリらの方法〔ネイｆヤ＋、
　２２７．６８０−６８５（１９７０）］　ニ準シテＳ
　Ｄ　Ｓ　−ポリアクリルアミドゲル電気体動を用いた
。すなわち、硫安塩析し、ＤＥＡＥセルロースカラムで
素通りした分画を、２−メルカプトエタノールで還元し
、アクリルアミド濃度１０％のゲルを用いて１８０ボル
トで２．５時間泳動を行なった。その結果、いずれのモ
ノクローナル抗体も分子量５２に前後にＨ鎖、２８に前
後にＬ鎖の２つのバンドが誌められた。

（６）抗体のサブクラスの測定： 抗体のサブクラスは次の方法で測定した。即ち参考例２
で得られたりコンビナンドｈｓｔ−１ムティンＮ２７を
コートした９６ウエルイムノプレートにクローン化され
たそれぞれのハイブリドーマ培養上清を１００μΩ入れ
室温で２時間インキュベートした。培養上清を除去、洗
浄後ウサギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ
、ＩｇＧ３、Ｋ鎖、λ鎖に対する抗体（カッベル社）を
それぞれ１００μΩ入れ室温で２時間インキュベートし
た。

それぞれの抗体を除去、洗域後ＨＲＰ標識ヤギ抗体つサ
ギＩｇＧ抗体（カッベル社）を加え室温で２時間インキ
ュベートした。標識抗体を除去し、よく洗浄した後、上
記（３）記載の方法で酵素反応を行ない吸光度を測定し
た。その結果、モノクローナル抗体Ｈ５−２４，Ｈ５−
１１４，Ｈ５−１３１の３種はＩｇＧ１・Ｋ型、他の４
種Ｈ５−１０１、Ｈ８−２１０，Ｈ８−２３３，ＭＳ−
２７６はＩｇＧ２ｂ−に型のサブクラスであることが判
明した。

実施例２ （１）抗体の酵素標識 精製Ｈ８−１３１抗体（５，８ｍｇ／＋ｎＲ）　１．５
ｍＱを０．１Ｍ　　ＮａＣＱを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ４，５）に対して４℃で２０時間透析し、ペプシ
ン（シグマ社製、米国）　（０，３■）を加え、３７°
Ｃで２０時間消化した。ＩＭＴｒｉｓでｐＨを８にして
反応を止め、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ４４　（ＩＢＦ
社製、フランス）のカラムで０．１５Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ
Ｑを含む０．０２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）を溶出
液として分離し、Ｆ（ａｂ’）ｚを得た。

これを、１＋ｎＱに濃縮後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）に対して４℃で２０時間透析し、０．２Ｍメ
ルカプトエチルアミン、５ｓ＋Ｍ　　ＥＤＴＡ、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，０）　Ｏ，ｆ＋Ｑを加えて
、３７℃、９０分間還元した。反応液を５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　Ｇ−２５ｆｉｎｅ　（ファルマシア・ファインケミ
カル社製、スエーデン）（φｌＸ６０ｃｍ）で５ｍＭ　
　ＥＤＴＡ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を溶
出液として分離し、Ｆａｂ’画分を得た。一方、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ベーリンガーマンハ
イム社製、西ドイツ）１０■を１．４＋＋＋Ｑの０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶かし、Ｎ−（γ−マ
レイミドブチルオキシ）サクシイミド　（ＧＭＢＳ）２
．１■をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ　Ｍ　Ｆ　
）■００μＱに溶かして加え、３０℃で６０分間攪拌後
、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５ｆｉｎｅ　（φ１．２Ｘ
６０ａｎ）で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を溶
出液として分離し、マレイミド基の導入されたＨＲＰを
得た（マレイミド化ＨＲＰ）。Ｆａｂ’　とマレイミド
化ＨＲＰをモル比で１：１になるように混ぜ、４°Ｃて
２０時間反応した。反応液を、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　Ａｃ
Ａ４４のカラムで０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，０
）を溶出液として分離し、酵素標識抗体（Ｈ８−１３１
−ＨＲＰ）を得た。

（２）抗体結合固相の作製 精製Ｈ３−２３３抗体を１０Ｍｇ／ｍＱになるよう０．
０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８，５）で希釈し、その１００
μＱを９６ウエルイムノプレートの各ウェルに入れ４℃
−夜装置し、固相に抗体を結合させた。

０．１５Ｍ　　Ｎ　ａ　ＣＱを含有する０、０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄した後、１％ＢＳＡを含
有する０、０１Ｍリン酸緩衝液を２００μＱずつウェル
に注入して、使用時まで冷所に保存した。

（３）サンドインチＥＩＡ法 種々の濃度に調製したｈｓｔ−１ムテインＮ２７溶液１
００μＱを、抗体を結合させたウェルに入れ４０Ｃで一
夜インキユベートした。ｈｓｔ−１ムテインＮ２７溶液
を除去後、１００倍に希釈したＨＲＰＷ識Ｈｓ−１３１
抗体をウェル当たり１００μＱ加え、室温で２時間イン
キュベートした。標識抗体を除去後、ＨＲＰ基質溶液を
加え、実施例１記載と同様の方法で以下酵素反応を行な
い４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、本
測定系でのｈｓｔ−１ムテインＮ２７の検出限界は１．
２Ｐｇ／ウェルと非常に低濃度での検出が可能であった
（第１３図）。

（４）サンドイッチＥＩＡの特異性 設定したサンドイッチＥＩＡが、ｈｓｔ　−１に特異的
であるかどうかを検討するため、種々の濃度に調製した
ヒトリコンビナントａＦＧＦ（参考例１記載の方法で得
たもの）およびヒトリコンビナントｂＦＧＦ、ウシａＦ
ＧＦおよびｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄシステム社）を抗原として
サンドイッチＥＩＡを行なった。すなわち、Ｈ５−２３
３抗体を結合したウェルに上記の抗原調製液１００μΩ
入れ４℃で一夜インキユベートした。抗原を除去後、１
００倍に希釈したＨ５−１３１−ＨＲＰ溶液をウェル当
り１００μＱ加え、以下、上記と同様の方法で反応性の
有無を検討した。その結果ヒトａ　Ｆ　Ｇ　Ｆおよびヒ
トｂＦＧＦ、ウシａＦＧＦおよびウシｂＦＧＦが１μｇ
　／　ｍ　Ｑの高濃度であっても本サンドイッチＥＩＡ
では検出されず、本性はｈｓｔ−１蛋白質を特異的に認
識する系であることが判った（第１４図：ヒトａＦＧＦ
、ヒトｂＦＧＦのみの結果を記載）６ （５）ヘパリンの影響 ヘパリンの存在によってサンドイッチＥＩＡが影響され
るかどうかの検討を行なった。すなわち、種々の濃度に
調製したｈｓｔ−１ムテインＮ２７溶液に、ヘパリンを
１０μｇ　／　ｒａ　Ｑまたは１００μｇ／ＩＩＩＱに
なるように加え、サンドイッチＥＩＡに供した。

その結果、本ＥＩＡによるｈｓｔ−１蛋白質の認識能は
、ヘパリンが存在してもほとんど影響さ九ず、１１−２
ｐ／ウエルの検出感度を維持した（第１５図）。

見五東羞果 本発明のモノクローナル抗体は、ｈｓｔ−１蛋白質と特
異的に結合し、また結合能も高いので、ｈｓｔ−１蛋白
質測定用試薬などとして有利に用いることができる。

また本発明のモノクローナル抗体の内いくつかは、中和
活性能を有しており、活性型のｈｓｔ、−１蛋白質を測
定でき、また治療薬としても用いられる可能性がある。

【図面の簡単な説明】

第１図はｈｓｔ−１の成熟タンパクのアミノ酸配列を示
し、第２図は化学合成されたヒトａ　ＦＧＦのｃＤＮＡ
配列を示し、第３図はプラスミドＰＴＢ９７５の構築図
である。 第４図、第５図および第６図は参考例１におけるヒトａ
ＦＧＦの精製におけるカラムクロマトグラムに関する図
である。 第７図は参考例２におけるプラスミドＰＴＢＩ０５１の
構築図であり、第８図および第１０図は参考例２におけ
るｈｓｔ　−１ムテ不ンの精製におけるカラムクロマト
グラムに関する図である。第９図および第１１図は各々
第８図および第１０図のカラムクロマトグラフィーにお
けるピーク成分の電気泳動図である。 第１２図は参考例２のｈｓｔ　−１ムテインのアミノ酸
配列図である。 第１３図、第１４図および第１５図は実施例１における
、ｈｓｔ　−１ムテインの検出、およびその特異性に関
するグラフである。 第４図

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヘパリンバインディング・セクレトリー・トラン
   スフォーミング・ファクター（ｈｓｔ−１）蛋白質に対
   する、下記の性質を有するモノクローナル抗体： （ａ）分子量：約１４０〜１６０キロダルトン、（ｂ）
   酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）および塩基性線維
   芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のいずれとも交差反応しな
   い、 （ｃ）免疫グロブリンクラスがＩｇＧに属する。
2. （２）ｈｓｔ−１蛋白質が、ｈｓｔ−１の欠損型ムテイ
   ンである請求項１記載の抗体。
3. （３）ｈｓｔ−１の欠損型ムテインが、ｈｓｔ−１の連
   続した構成アミノ酸が１ないし４３個欠損しているムテ
   インである請求項２記載の抗体。
4. （４）ｈｓｔ−１蛋白質で免疫した哺乳動物の脾臓細胞
   と、哺乳動物のリンパ球様細胞とからなるクローン化さ
   れたハイブリドーマ。
5. （５）ｈｓｔ−１蛋白質が、ｈｓｔ−１の欠損型ムテイ
   ンである請求項４記載のハイブリドーマ。
6. （６）ｈｓｔ−１の欠損型ムテインが、ｈｓｔ−１の連
   続した構成アミノ酸が１ないし４３個欠損しているムテ
   インである請求項５記載のハイブリドーマ。
7. （７）ｈｓｔ−１蛋白質で免疫した哺乳動物の脾臓細胞
   と、哺乳動物のリンパ球様細胞とを細胞融合し、クロー
   ニングすることを特徴とする請求項４記載のハイブリド
   ーマの製造法。
8. （８）請求項４記載のハイブリドーマを液体培地中また
   は哺乳動物の腹腔内で増殖し、モノクローナル抗体を生
   成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求
   項１記載のモノクローナル抗体の製造法。
9. （９）請求項１記載のモノクローナル抗体を用いること
   を特徴とするｈｓｔ−１蛋白質の検出・定量法。
10. （１０）酵素免疫測定法を行なう請求項９記載のｈｓｔ
    −１蛋白質の検出・定量法。