JPH02306996A - 酸性線維芽細胞成長因子の抗体，その用途およびペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、測定用試薬、精製用試薬として有用な酸性線
維芽細胞成長因子（以下、ａＦＧＦと略称することもあ
る。）の抗体、その用途およびその抗原として用いるこ
とのできるペプチドに関する。

従来の技術 ａＦ　Ｇ　Ｆは、視床下部、脳、網膜などに見いだされ
ている分子量約１，６万、等電点が５〜７である内皮細
胞成長因子であり。ヘパリンと強く結合するという特徴
があり、また血管新生因子として一般に知られている。

発明が解決しようとする課題 癌組織には、それ自身の誘導した多数の不整な血管が存
在していることが確認されている。しかるに、種々の組
織や体液中の血管新生因子を測定することは、癌の診断
に役立つものと思われる。

更に、３ＦＧＦは、中枢神経系に関与するところで多く
見つかっていることから、中枢神経系においても重要な
役割を果たしていると思われる。そこで、種々の組織や
体液中のａＦＧＦの測定は、中枢神経系に関与する疾患
などの診断にも大いに役立つものと期待出来る。また、
ａＦ　Ｇ　Ｆの抗体を作成することができれば、ａＦＧ
Ｆの精製に利用できることが考えられる。

削延復決するための手段 本発明者らは、上記の事情に鑑み、鋭意研究し、ａＦＧ
Ｆの部分ペプチドを免疫原として抗体を作成したところ
、ａＦＧＦとの結合能の高い抗体が得られ、該抗体をサ
ンドインチ法による免疫化学的測定法に付すと感度層＜
ａＦＧＦを測定でき、しかも該抗体を用いるとａＦＧＦ
を効率良く精製できることを見い出し、これらに基づい
てさらに研究した結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）
の部分ペプチドとキャリア用蛋白との複合体を免疫原と
して得られた抗体；　（２）担体上に保持された抗酸性
線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）抗体、および担体上に
保持された抗体とは抗原決定部位を異にする抗ａＦ　Ｇ
　Ｆ抗体に標識剤を直接結合させた結合物を用いてａＦ
ＧＦを測定することを特徴とするａＦＧＦの免疫化学的
測定法、（３）酸性線維芽細胞成長因子（ａＦ　Ｇ　Ｆ
　）を、ａＦＧＦの部分ペプチドとキャリア用蛋白との
複合体を免疫原として得られた抗体を用いて精製するこ
とを特徴とするａＦＧＦの精製法；　およびａＦＧＦの
部分ペプチドすなわち、（４）ａＦＧＦの第１〜１１番
目のシークエンスのうちの連結した８〜１０個のアミノ
酸からなるペプチド：（５）ａＦＧＦ’の第５５〜６６
番目のシークエンスのうちの連結した８〜ｌＯ個のアミ
ノ酸性からなるペプチド：　　（６）ａＦＧＦの第１０
３〜１１３番目のシークエンスのうちの連結した７〜９
個のアミノ酸からなるペプチド；（７）ａＦＧＦの第１
３１〜１３３番目のシークエンスのうちの連結した８〜
９個のアミノ酸からなるペプチドである。

ａＦ　Ｇ　Ｆとしては、天然由来のものでもよく、また
、遺伝子工学的手法により製造されたものでもよい。

ａＦＧＦとしては、ウシ型のもの、ヒト型のもの、など
が挙げられる。ウシ型のもの、ヒト型のもののアミノ酸
配列は、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチ・コミユニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　　ａｎｄ　　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＣｏｍｍｕ
ｎ　１ｃａｔ　１ｏｎｓ）第６１１−６１７頁（１９８
６年）に記載されている。

また、ａＦＧＦとしては、その一部が変異されたムティ
ンでもよい。

ａＦ　Ｇ　Ｆの部分ペプチドとしては、たとえばＮ末端
側のシークエンス；　Ｃ末端側のシークエンス；　全ア
ミノ酸配列の中心部付近のシークエンスを含むａＦＧＦ
の部分ペプチドが挙げられる。

該Ｎ末端側のシークエンスを含むａＦ’ＧＦの部分ペプ
チドとしては、上記したものが挙げられるが、さらにａ
ＦＧＦの第１番目〜第１１番目のシークエンスのうちの
第１番目または第２番目のアミノ酸から始まる８〜１０
個のアミノ酸からなるシークエンスを含むａＦＧＦの部
分ペプチドが挙げられる。

該Ｃ末端側のシークエンスを含むａＦＧＦの部分ペプチ
ドとしては、上記したちのが挙げられるが、さらにａＦ
ＧＦの第１３１番目〜第１４０番目のシークエンスのう
ちの第１３１〜１３３番目のアミノ酸から始まる８〜９
個のアミノ酸からなるシークエンスを含むａＦ　Ｇ　Ｆ
の部分ペプチドが挙げられる。

該中心部付近のシークエンスを含むａＦＧＦの部分ペプ
チドとしては、上記したものが挙げられるが、さらにａ
ＦＧＦの第５５〜６６番目のシークエンスのうち第５５
〜５７番目のアミノ酸カラ始まる８〜１０個のアミノ酸
からなるシークエンスを含むａＦＧＦの部分ペプチド、
またはたとえばａＦＧＦの第１０３〜１１３番目のシー
クエンスのうち第１０３〜１０５番目のアミノ酸から始
まる７〜９個のアミノ酸からなるシークエンスを含むａ
ＦＧＦの部分ペプチドが挙げられる。

Ｎ末端側のシークエンスの具体例としては、例えば、 Ｐｈｅ−＾５ｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−＾
５ｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ。

！ Ｐｈｅ−＾５ｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−＾
５ｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ。

＾５ｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔ
ｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ。

など、 Ｃ末端側のシークエンスの具体例としては、例えば、 など、 中心部付近のシークエンスとしては、例えば、Ｌｙｓ−
Ｓｅｒ−１’ｈｒ−Ｇｌｕ−ｆｉｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｐｈ６−Ｌｅｕ。

などを含むａＦ　Ｇ　Ｆの部分ペプチドが含まれる。

本発明で用いられる部分ペプチドは、ペプチド合成の公
知の常套手段で製造し得る。そしてそれは、固相法、液
相法のいずれによっても良い。

そのようなペプチド合成の方法としては、例えば、’Ｔ
ｈｅ　　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ″、第１巻（１９６６）、５
ｃｈｒｏｄｅｒ　ａｎｄＬｕｂｋｅ著、Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ、　　Ｕ、Ｓ、
＾１、“ペプチド合成”、泉屋ら著、丸善株式会社（１
９７５）あるいは“ペプチド合成の基礎と実験１、泉屋
ら著、丸善株式会社（１９８５）に記載の方法が挙げら
れる。

また、該部分ペプチドは、適当な酵素によりａＦＧＦを
切断することにより製造してもよい。

該方法としては、たとえば、“生化学実験講座１タンパ
ク質の化学■”、日本生化学全編、東京化学同人（１９
７６）の２５５ページから３３２ページに記載の方法が
挙げられる。

該部分ペプチドは、キャリア用蛋白と結合される。該キ
ャリアー用蛋白としては、例えば、キナログロブリン、
牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、ヘモシアニン
なとがあＣｆられる。

該部分ペプチドとキャリアー用蛋白との結合には、公知
の常套手段を用いて実施し得る。結合に用いる試薬とし
ては、例えば、ゲルタールアルデヒド、水溶性カルボジ
イミドなどがあげられる。

ペプチドとキャリアー用蛋白との使用比は、約１対ｌな
いし約１対４が適当であり、反応のｐｌ（は、中性付近
、特に７．３前後が良好な結果を与える場合が多い。ま
た、反応に要する時間は、約２〜６時間が良い場合が多
いが、特に、約３時間が適当である。このようにして作
成された複合物は、常套手段で約４°Ｃ前後で水に対し
て透析し、凍結して保存しても良いし、凍結乾燥して１
ｖ存しても良い。

ポリクローナル抗体を製造するためには、以上のように
して製造した免疫原は、温血動物に接種される。上記抗
体の製造に用いられる温血動物としては、例えば、哺乳
温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ラット、マウス
、モルモット、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハ
ト、アヒル、ガチコウ、ウズラ）などが挙げられる。免
疫原を、混血動物に接種する方法としては、動物に接種
する免疫原は、抗体産生をするに有効な量でよく、例え
ば、ウサギに１回＋ａ１ｇを１１の生理食塩水およびフ
ロイントの完全アジュバントで乳化して、背部ならびに
後肢掌皮下に４週問おきに５回接種すると抗体を産生さ
せる場合が多い。このようにして、温血動物中に形成さ
れた抗体を採取する方法としては、例えばウサギでは、
通常最終接種後７日から１２日の間に耳静脈から採取し
、遠心分離して血清として得られる。得られた抗血清は
、通常、各抗原ペプチドを保持させた担体を用いるアフ
ィニティクロマトグラフィーで吸着した両分を回収する
ことＣεよりポリクローナル抗体を＄＃製することが出
来る。

また、ミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法［ネ
イチーア（Ｎａｔｕｒｅ）、第２５６巻（１９７５）　
、第４９ｓ！］に記載の方法と同様の方法により得られ
るモノクローナル抗体も利用できる。すなわち、該モノ
クローナル抗体は、免疫原のポリペプチドまたは蛋白複
合体で哺乳動物を免疫し、取り出した肺臓細胞と同種ま
たは異種のリンパ球様細胞とを細胞融合によりハイブリ
ドーマとし、これをクローン化し、ここで得られたハイ
ブリドーマを哺乳動物に接種し、モノクローナル抗体を
生成蓄積せしめ、これを採取して製造される。

抗体分子は、ＩｇＧでもよ（、または、そのフラクシヨ
ン（例、Ｆ（ａｂ’　）ｔ、Ｆａｂ’　もしくはＦａｂ
ｌであっても良い。なかでも、標識剤を直接結合させる
抗体分子はＰａｂ’　であることが好ましい。

このようにして得られた抗体は、ａＦ　Ｇ　Ｆの免疫化
学的測定法における試薬として用いることができる。

該ａＦＧＦの免疫化学的測定法によって、生体組織や体
液中のａＦＧＦの世を測定することができ、これにより
、前述した如く、たとえば種々の組織や体液中の血管新
生因子を測定することにより、癌の診断に役立つと考え
られる。

担体に保持する抗体は、抗ａＦＧＦ抗体が用いられる。

本発明の測定法において用いられる標識剤を結合させた
抗体は、上記担体に保持された抗体とは抗原決定部位を
異にする抗ａＦＧＦ抗体に標識剤を直接結合させたもの
を用いる。

本発明の免疫化学的測定法において用いられる抗ａＦＧ
Ｆ抗体としては、ａＦ　Ｇ　Ｆに対して結合能を有する
ものであればいずれでもよい。

特に、ａＦ　Ｇ　Ｆの部分ペプチドとキャリア用蛋白と
の複合体を免疫原として得られた抗体が好ましい。

ａＦＧＦの測定方法において用いられる担体上に保持さ
れた抗体における担体としては、例えば、ゲル粒子（例
、アガロースゲル［例、セファロース４Ｂ、セファロー
ス６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデ
ン）製）］、デキストランゲル［例、セファデックスＧ
−７５、セファデックスＧ−１００、セファデックスＧ
−２００（ファルマシア・ファインケミカル社（スエー
デン）製）］、ポリアクリルアミドゲルＦ例、バイオゲ
ルＰ−３０、バイオゲルＰ−６０、バイオゲルＰ−１０
０（バイオラッド・ラボラトリーズ辻（米国）製）］、
セルロース粒子［例、アヒセル（脂化成製）、イオン交
換セルロース（例、ジエチルアミンエチルセルロース、
カルボキシメチルセルロース）］、物理的吸青剤［例、
ガラス（例、ガラス球、ガラスロッド、アミノアル牛ル
ガラス球、アミノアルキルガラスロッド）、シリコン片
、スチレン系樹脂（例、ポリスチレン球、ポリスチレン
粒子）、イムノアッセイ用プレート（例、ヌンク社（デ
ンマーク）製）］、イオン交換樹脂（例、弱酸性陽イオ
ン交換樹脂［例、アンバーライトＩＲＣ−５０（ローム
・アンド・ハース社（米国）製）、ゼオカーブ２２６（
バームチット社（西ドイツ）製）］、弱塩基性陰イオン
交換樹脂［例、アンバーライトＩＲ−４８１ダウエック
ス３（ダウケミカル社（米国）製）コ）　などが挙げら
れる。

担体に抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用し
得るが、例えば、“代謝”、第８巻（１９７１年）、第
６９６頁に記載されているブロムシアン法、ゲルタール
アルデヒド法などが挙げられる。

また、より簡便な方法として物理的に担体表面に眼前さ
せてもよい。

標識剤を結合させた抗体における標識剤としては、放射
性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられ
るが、酵素を用いるのが好ましい。

酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いる
ことができるが、ペルオキシダーゼが好ましい。ペルオ
キシダーゼとしては、種々の起源のものを用いることが
できるが、その例としてはたとえば西洋わさび、パイナ
ツプル、イチジク、せ諸、ソラマメ、トウモロコシなど
から得られるベルオキ／ダーゼが挙げられ、特に西洋わ
さびから抽出されたホースラディツシュ　ペルオキシダ
ーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
）（ＩＩＲＰ）が好ましい。

ペルオキシダーゼと抗体を結合するにあたり、抗体分子
としてのＦａｂ’　のチオール基を利用するために、あ
らかじめペルオキシダーゼにマレイミド基を導入したも
のを用いると好都合である。

マレイミド基をペルオキシダーゼに導入する方法として
は、ペルオキシダーゼのアミノ基を介してマレイミド基
を導入することができる。そのためには、Ｎ−サクシニ
ミジル−マレイミド−カルボキシレート誘導体を用いる
ことができ、好ましくは、Ｎ−（γ−マレイミドブチル
オキシ）サクンイミド（ＧＭＢＳと略称することもある
）などが良い。従って、マレイミド基とペルオキシダー
ゼとの間に一定の基が入っていることとなってもよい。

ＣＭＢＳをペルオキシダーゼに反応させるには、両者を
、ｐｌ＋約６ないし８の緩衝液中で約１０ないし５０℃
の温度で約１０分ないし２４時間反応させることによっ
て行われる。該緩衝液としては、たとえば、ｐＩ＋７．
０の０．１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。このよう
にして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼは、たと
えばゲルクロマトグラフィーなどにより精製することが
できる。該ゲルクロマトグラフィーを行う際に用いられ
る担体としては、例えば、セファデックスＧ−２５［フ
ァルマシア・ファインケミカル社（スエーデン）製］、
バイオゲルＰ−２［バイオラッド・ラボラトリーズ社（
米国）製］などが挙げられる。

マレイミド化ペルオキシダーゼと抗体分子との反応は、
両者を緩衝液中で約０°Ｃないし４０°Ｃの温度で、約
１ないし４８時間反応させることにより行うことができ
る。該緩衝液としては、たとえば、ｐｌ＋６．０の５ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０．１１
１リン酸緩衝液などが挙げられる。このようにして得ら
れたペルオキシダーゼ標識抗体は、たとえばゲルクロマ
トグラフィーなどにより精製することができる。該ゲル
クロマトグラフィーを行う際に用いられる担体としては
、例えば、セファデックスＧ−２５［ファルマシア・フ
ァインケミカル辻（スエーデン）　製］　、バイオゲル
Ｐ−２［バイオラッド・ラボラトリーズ社（米国）製］
などが挙げられる。

さらに、ペルオキシダーゼにチオール基を導入し、マレ
イミド化された抗体分子と反応させても良い。

ペルオキシダーゼ以外の酵素を抗体に直接結合させるに
は、ペルオキシダーゼの場合に準じて行なうことができ
、また、自体公知のグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸
法、水溶性カルボジイミド法などが用いられる。

本発明の測定系における被検試料としては、尿、血清、
血漿、髄液等の体液、あるいは、動物細胞や菌体の抽出
液またはその培養上清が挙げられる。

本発明の測定方法の例として、標識剤がペルオキシダー
ゼの場合について以下に具体的に説明するが、ペルオキ
シダーゼに限定されるものではない。

まず、■、担体に保持された抗体に、測定すべきａＦＧ
Ｆ含汀の分析対象物を加えて抗原抗体反応を１１った後
、これに、前記で得られたペルオキシダーゼと抗ａＦＧ
Ｆ抗体との結合物を加えて反応させる。

この本測定系における被検試料としては、尿、血清、血
漿、Ｍ液等の体液、あるいは、動物細胞や菌体の抽出液
またはその培養上清が挙げられる。

■　■で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの是質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。

■：上記■〜■の操作を既知量のａＦ　Ｇ　Ｆの標準溶
液に対してあらかじめ行い、ａＦＧＦと吸光度もしくは
蛍光強度との関係を標準曲線として作成しておく。

■：未知量のａＦＧＦを含む分析対象物（彼検試４））
について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線に
あてはめ、分析対象物中のａＦ　Ｇ　Ｆの世を測定する
。

本発明の、ａＦ　Ｇ　Ｆを、ａＦＧＦの部分ペプチドと
キャリア用蛋白との複合体を免疫原として得られた抗体
を用いて精製するには、該抗体を用いてアフィニティー
カラムクロマトグラフィーを行なうことにより行なうこ
とができる。

該アフィニティーカラムクロマトグラフィーは、たとえ
ば、該抗体を適切な担体に力、ブリングさせ、これをカ
ラムに充め、ａＦＧＦを含む溶液をカラムに通し吸着さ
せ、次いで溶出させることにより行なうことができる。

該担体としては、たとえば、先に記載された担体と同様
のものが挙げられる。とりわけケル粒子や各種合成樹脂
が好都合に用いられる。たとえばＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖ
ａＬｅｄ　　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ（ファルマシ
ア・ファインケミカル社製）、アフィゲル−１０，アフ
ィゲル１５（バイオラッド・ラボラトリーズ社製）など
が挙げられる。

抗体を担体にカップリングさせるには、公知の常套手段
を応用し得るが、たとえば“代謝°゛、第８巻（１９７
１年）、第６９６頁に記載されているブロムシアン法、
ゲルタールアルデヒド法カ挙ケラれる。また、水溶性カ
ルボジイミドを用いる方法、活性エステル法なども用い
ることができるが、より簡単な方法として物理的に担体
表面に吸着させてもよい。

このようにして得られた抗体カラムを用いて精製を行な
うには、抗体を結合させた担体を充てんした抗体カラム
に中性付近の緩衝液中のａＦＧＦを吸着させる。次にカ
ラムを同じ緩衝液で洗浄したのち、特異的に吸着された
ａＦ　Ｇ　Ｆを溶出させる。特異的に吸収された抗体を
溶出するには、たとえば、低ｐＨもしくは高ｐＨの緩衝
液、高ｌｎ度の塩を含イｆする緩衝液を用いて行なわれ
る。

該低ｐＨの緩衝液としては、たとえばｐＨ２，３の０．
１７Ｍ　　グリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ１，８の０、Ｉ
Ｍ　　第二クエン酸ナトリウム−塩酸緩衝液などが挙げ
られる。

該高ｐＨの緩衝液としては、たとえばｐＨ１１のアンモ
ニア水、ｐＨ１１，７の０，２Ｍホウ酸ナナトリウム緩
衝液どが挙げられる。

該高濃度の塩を含有する緩衝液としては、たとえば６Ｍ
グアニジン塩酸溶液、７Ｍ尿素溶液などが挙げられる。

上記の溶出は、バッチ法でもよく、またカラムを用いる
方法でもよい。

抗体の溶出液はたとえば透析して精製する。たとえば低
ｐＨの緩衝液で溶出した時は、たとえば０．１Ｍ炭酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ１０，５）、高ｐＨの緩衝液で溶
出した時は、たとえばＯ，１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（
ｐＨ３，０）で中性化したのち、たとえば０．１％Ｎａ
Ｎ３を含む０　、０２　Ｍリン酸食塩緩衝液（ｐＨ８，
０）に対して透析する。また高、・鹿皮の塩を含有する
緩衝液で溶出した抗体液は直接に上記のリン酸食塩緩衝
液に透析して保存することもできる。また、上記溶出液
または透析液を凍結乾燥して得られた凍結乾燥標品とし
て保存することもできる。

このようにして精製されたａＦ　Ｇ　Ｆは、極めて高単
位のものであり、たとえば、創傷の治癒促進剤として用
いることができ、また、神経細胞増殖作用を有するので
、各種神ｊ１障害の治療に有効に（す用できる。

ａＦＧＦを上記治療のための医薬として用いるには、そ
のまま粉末として、または他の薬理学的に許容されうる
担体、賦形剤、希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤
１錠剤、カプセル剤、液剤、軟膏）として、温血動物（
例、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、犬、
ネコ）に対して非経口的または経口的に安全に投与する
ことができる。

上記の医薬組成物としての製剤化は常法に従って行なわ
れる。

ａＦＧＦを上記した医薬として用いる場合には、たとえ
ば上記した温血動物に、投与ルート、症状などを考慮し
て、１日量約１０ｎｇないし１０μｇ／ｋｇの中から適
当量を選んで投与される。

また、このようにして精製されたａＦＧＦは、細胞培養
を促進させるための試薬として用いることができる。こ
の場合、ａＦＧＦを好ましくは、培地ＩＱあたり約Ｏ１
１〜１０μｇとなるように培地に加えることが好ましい
。

本発明のａＦＧＦの部分ペプチドは、たとえば上記した
抗体を製造する際の抗原として用いることができる。

火車側 以下に参考例、実施例をもって、本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明は、これらによってなんら限定され
るものではない。

参考例１　組換え型ヒトａＦＧＦの調製ヒトａＦ　Ｇ　
Ｆを、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｆｐ　、　　９６
０　（１９８７）　；　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６３　。

１６４７１　（１９８ｇ）、およびＩＣ５Ｕ　　５ｈｏ
ｒｔ　　Ｒｅｐｏｒｔｖｏｌｕｍｅ　　８．　　　＾ｄ
ｖａｎｃｅｓ　　　　ｉｎ　　　Ｇｅｎｅ　　　Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ　：Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ　　ａｎｄ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　１９８８　Ｍ
ｉａｍｉ　Ｂｉｏ／ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＷｉｎｔｅｒ
　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐａ
ｇｅ　１１０．に記載の方法を参考にして、次に示す方
法により製造した。

（ａ）　　発現プラスミドの構築 化学合成されたヒトａＦＧＦのｃＤＮＡ（第１図）をｐ
Ｕ　Ｃ１８（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、　　１０１　。

２０−７８　（１９８３））に組み込んだプラスミドｐ
Ｔ８９１、７を１３ｓｐＭ！で切断し、ｌａｒｇｅ　ｆ
ｒａｇｍｅｎｔの反応によりこの部位を平滑末端にした
後ＢａｗｒＨｒで消化して０．４５ＫｂのＤＮＡ断片を
調製した。

ベクターＤＮＡにはＴ７フアージのφ１０プロモーター
を保持するｐＥ　Ｔ　３ｃ（５ｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ、Ｙ
、らＪ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　ｌ　８９　：　ｌ　ｌ　３−１
３０　（１９８６））を用い、ｐＥＴ３ｃを　Ｎｄｅｌ
で切断し、ｌａｒｇｅ　ｒｒａｇｍｅｎｔで平滑末端と
した後Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼによりＮ　ｃｏ　Ｉリン
カ−５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’を結合させた。このプラ
スミドをＮｃｏｒで切断し、その部位をＤＮＡポリメラ
ーゼ１ａｒｇｅ　ｒｒａｇｔｔｈｅｎｔにより′″ＶＶ
滑化後ＢａｍＨＩで切断してＳＩＯの配列を除き、そこ
に先の０．４５Ｋｂ　ｂｌｕｎｔ　ＢｓｐＭ　Ｉ　−Ｂ
ａｉＨＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて組み込んで
ＰＴＢ９７５を得た（第２図）。

（ｂ）　　ヒトａＦ　Ｇ　Ｆ　ｃＤ　Ｎ　Ａの大腸菌で
の発現次に大腸菌ＭＭ２９４株にＴ７フアージのＲＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ　３　
（Ｓｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ、　ＬらＪＪｏｌ、Ｂｉｏｌ、
　ｌ　８９　：　ｌ　１３−１３０　（１９８６））を
溶原化させ、さらにＴ７フアージのリゾチーム遺伝子を
もつプラスミドｐＬｙｓＳ（Ｓｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ、　
ＬらＪ、Ｍｏ１．８ｉｏ１．１８９　：　ｌ　ｌ　３−
１３０　（１９８６））を導入し、大腸菌ＭＭ２９４（
ＤＥ３　）／　ｐＬｙｓ　Ｓ株を作製した。この大腸萌
株にｐＴＢ９７５を導入し、大腸菌ＭＭ２９４　（Ｄ　
Ｅ　３）／ｐＬｙｓＳ　、　ｐＴ　Ｂ　９７５をつくっ
た。この菌を３５μｇ／−アンピシリン、１０μｇ／藏
クロラムフェニコールを含む培地で３７°Ｃで培養し、
濁度がＫｌｅｔｔ　Ｉ　７０になったときインプロピル
β−Ｄチオガラクトシド（Ｉ　ＰＴＧ）を最終濃度が０
．５ｍＭになるように加え更に３時間培養を継続した。

菌体を遠心により集め、水冷したＰＢＳで洗った後、再
集菌し使用時まで一２０°Ｃに保存した。

（ｃ）　　ヒトａＦＧＦの精製 １１ｉｔｅｒ培養から集めた菌体を１００滅の水冷１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，４）、　　Ｉ　Ｃ
）ｎＭ　ＥＤＴＡ、０．６Ｍ　ＮａＣｌ、１０％ンｇ糖
、０．２５ｍＭＰＭＳ−Ｆに懸濁し、卵白リゾチームを
０．５ｔａｇ／！Ｒ１となるように添加した。１時間水
中に放置後３７℃で５分間インキュベートし、水冷下で
超音波処理（２０秒間、２回）を行い、遠心（ＳＯＲＶ
ＡＬＬ。

１８　Ｋｒｐｍ、　３０　ｍｉｎ、　４℃）して−Ｌ清
を得た。この」−清を２００−の水冷２０　ｍＭ　Ｔ　
ｒｉｓ−ＨＣＣ（ｐｆ（７，４）、ｌ　　ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡと混和し、２０ｍＭＴｒｉｓ−ｔ（Ｃ（！（ｐＨ７
，４）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

０．２ＭＮａＣｌ２で平衡化したヘパリンセファロース
カラム（径２．５Ｘ４ｃｔａ）にかけた。カラムを１５
０ｄの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＲ（ｐ！４７．４）、
　　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．５Ｍ　　ＮａＣ（でｔシ
ラた後、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！（１）Ｈ７，４
）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

１．５ＭＮａ（ｌｊで蛋白を溶出した。溶出液を６ｈ＝
Ｉ。

毎に分画し、ＯＤ　、、、をモニターして２番目のピー
ク画分（８−１１番、計　２４−）を果めた（第３図）
。この両分２２ｄに対して等量の２０−ＭＴｒｉｓ　　
ＨＣ（！（ｐＨ７，４）、ｌａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、２Ｍ（
ＮＨ，）２Ｓｏ、を混和し、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
（１（ｐＨ７，４）、１＋＊Ｍ　ＥＤＴＡ、１Ｍ（ＮＨ
，）ｔＳＯ。

で平衡化したフェニルセフ１０−ス力ラム（径２．５Ｚ
８ｃｍ）にかけたく流速　０　、５　ｄ／ｆｆ１ｉｎ、
　）。

２０−の同じ緩衝液でカラムを洗った後、ＩＭからＯＭ
の硫酸アンモニウム直線的濃度勾配（流速０　、　Ｆｊ
−／ｌ１ｉｎ、、勾配時間２００分）をかけ、溶出され
た画分４０−５５を集め（第４図）、ｆｉ　％２ヒトａ
ＦＧＦとした。

（ｄ）　　逆相Ｃ４ＨＰＬＣ 精製ヒトａＦ　Ｇ　Ｆ　１．２ｄｇ／−溶液を０，２５
−のＯ凹％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と混合し、逆相
Ｃ４カラム（ＹＹＤＡＣ）　Ｉニアブライし、０．１％
ＴＦΔ存在下に０％から９０％アセトニトリルの直線的
濃度勾配をかけ溶出パターンを調へた。流速１ａｍ　／
ｓｉｎ、、勾配時間６０分で行った（第５図）。

（ｅ）　　生物活性 ヒ）ａＦＧＦの活性は佐々田らの方法（Ｓａｓａｄａら
、　　Ｍｏ１．　　Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌ、８　：　５
８８　５９４（１９８８））に従い、マウスＢＡＬＢ／
ｃ３Ｔ３細胞のＤＮＡ合成誘起を［３Ｈ］チミジンの取
り込みを指標として測定した。検体添加時、必要に応じ
て培地中および検体中にヘパリン（ＳＩＧＭＡ　　Ｇｒ
ａｄｅ　Ｉ　）溶液を混合した。

実施例１ （１）　　トＬｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−０１１′（つ／ａＦ　Ｇ　
Ｆ　［５７−６４］、ペプチド（Ｉ））の製造アプライ
ド・バイオシステムズ社４３０Ａ型全自動ペプチド合成
機を用い、Ｂｏｃ−Ｐｈｅフェニルアセタミドメチル（
ＰＡＭ）樹脂Ｑ　、　５　ｍｍｏｌｅより出発し、以下
のアミノ酸を順次縮合及び脱Ｂｏａ反応に付した。

Ｂｏａ−Ｇｌｎ−ＯＨ Ｂｏｃ　−Ｇ　ｌ　ｙ　−０１１ Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚ１２）−０Ｈ Ｂｏａ−Ｇｌｕ−（ＯＣＩＩｅｘ）−０１１Ｂｏｃ−Ｔ
ｈｒ（ＢｚＱ、）−０１１ Ｂｏｃ　−３ｅｔ（Ｂｚ１２）　−０ｉｌＢｏａ−Ｌｙ
ｓ（ＣＣＺ）−０Ｈ Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル ＢｚＱ　：ベンジル ＣＣＺ：２−クロルベンジルオキシカルボニル斯くして
Ｈｏｅ−Ｌｙｓ（Ｃ（２Ｚ）−Ｓｅｒ（Ｂｚ１２）−Ｔ
ｈｒ（Ｂｚ＋２）−Ｇｌｕ（ＯＣＨｅｘ）−Ｔｈｒ（Ｂ
ｚ（り−Ｇｌｙ−（ｉｌｎ−Ｐｈｅ−ＰＡＭ樹脂１．３
２ｇを得た。このうち５００ｍｇをアニソール０．５ｄ
及びジメチルスルフィド０．５蔵を含む弗化水素５．０
扉中でＯ’Ｃ，６０分間処理した後、弗化水素を減圧留
去し、残留物をエチルエーテルで洗浄後、目的物をＩＮ
酢酸３０−で抽出し、アンバーライトＩ　ＲＡ−４００
（酢酸型）のカラム（２Ｘ５　ｃｍ）でイオン交換し、
溶出液を凍結乾燥した。

これをＩＮ−酢酸５蔵にとかし、セフアゾ、クスＬＨ−
２０（ファルマシア社製；カラム：２．５Ｘ１２５ｃｍ
；溶出液：ＩＮ−酢酸）によるゲルろ過にて精製して、
目的物を得た。収Ｄ？９４ｍｇＲｒＯ，１６（酢酸エチ
ル：ブタノール：酢酸：水＝ｌ：１ｌｌ） アミノ酸分析値：Ｔｈｒ　１．９８：　　Ｓｅｒ　Ｏ，
８５；　　Ｇｌｕ２．０４：　　Ｇｌｙ　１．００；　
　Ｐｈｅ　１．（１３；　　Ｌｙｓ　Ｏ，９９（２）　
　ＩＩ−Ｌｙｓ−旧５−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−０１１（ウシａＦ　Ｇ　Ｆ　［１０５−１
１１］、ペプチド（■））の製造アプライド・バイオシ
ステムズ社４３０Ａ型全自動ペプチド合成機を用い、Ｈ
ｏｃ−Ｌｅｕ　ＰＡＭ樹脂Ｑ　、　５　ｌｌ１ａｏｌｅ
より出発し、以下のアミノ酸を順次、縮合及び脱Ｂｏｃ
反応に付した。

Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−０１１ Ｂｏｃ　−Ｖａ　ｌ　−０ｆｆ Ｂｏａ−Ｐｈｅ−Ｏｆｆ Ｂｏａ−Ｔｒｐ−Ｏｉｌ Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（丁ｏｓ）−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃ（２Ｚ）−０１１ 斯くして得られたペプチド樹脂をジメチルフォルムアミ
ド（Ｄ　Ｍ　Ｆ　）中１−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル（ＨＯＢｔ）で処理して、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＣＺ）
−１１ｉｓ−丁ｒｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
−ＰＡＭ樹脂１．１３ｇを得た。このうち３００ｍｇを
アニソールＯ，：Ｍ及びジメチルスルフィド０．３ｄを
含む弗化水素３蔵中でＯ’Ｃ，６０分間処理した後、弗
化水素を減圧留去し、残留物をエチルエーテルで洗浄後
、目的物をＩＮ酢酸３０−で抽出し、アンバーライトＩ
ＲＡ−４００（酢酸型）のカラム（２Ｘ５ｃｍ）でイオ
ン交換し溶出液を凍結乾燥した。これをＩＮ−酢酸５ｄ
にとかし、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社
製；カラム：　２．５Ｘ　Ｉ　２５ｃｍ；溶出液：ＩＮ
酢酸）によるゲルろ過にて精製して、目的物を得た。収
量　４０ｍｇ Ｒｆ　　Ｏ，５２（酢酸エチル：ブタノール；酢酸：水
＝ｌ：ｌ：Ｉ：１） アミノ酸分析値：Ｌｙｓ　Ｏ，９１＋　　ｌ１ｉｓ　１
．０１：　　ＴｒＰＯ，８５；　　Ｇｌｙ　１．００；
　　Ｖａｌ　１．０３；　　Ｌｅｕ　１．旧：　　Ｐｈ
ｅｌ、　１４ （３）　　トＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ
−５ｅｒ−Ｓｅｒ−＾５ｐ−ＯＨ（ウシａＦ　Ｇ　Ｆ　
［１３３−１４０］、ペプチド（■））の製造 アプライド・バイオシステムズ社４３０Ａ型全自動ペプ
チド合成機を用い、Ｂｏａ−Ａｓｐ（Ｏｌｌｌｚ（り　
−ＰＡＭ樹脂０　、５　ｍｍｏ１６より出発し、以下の
アミノ酸を順次、縮合及び脱Ｂｏｃ反応に付した。

ＢｏＣ−Ｓｅｒ（Ｂｚ（り　−０Ｈ Ｂｏａ−Ｓｅｒ（Ｂｚ（）　−０Ｈ Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ Ｂｏａ−Ｐｒｏ−ＯＲ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏｆｆ 斯くして、Ｂｏａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−１，ｅｕ−Ｐｒｏ
−Ｖａｌ−３ｅｒ（Ｂｚ□−５ｅｒ（ＢｚＩ２）−Ａｓ
ｐ（ＯＢｚ＆）−ＰＡＭ　８Ｉ脂１．ＩＯｇを得た。

このうち５００＋ａｇをアニソール０．６１ｎｌ及びジ
メチルスルフィド０．６−を含む弗化水素６゜〇−中で
Ｏ’Ｃ，６０分間処理した後、弗化水素を減圧留去し、
残留物をエチルエーテルで洗浄後、目的物をＩＮ−酢酸
４０黛で抽出し、アンバーライトＩＲＡ−４００（酢酸
型）のカラム（２Ｘ５ｃｍ）でイオン交換し、溶出液を
凍結乾燥した。これをＩＮ酢酸５ｍｆ！にとかじ、セフ
ァデックスＬ　Ｈ−２０（ファルマシア社製；カラム：
　２．５　Ｘ　Ｉ　２５ｃｍ：溶出液二１Ｎ酢酸）によ
るゲルろ過にて精製して目的物を得た。

収量　　１２０ｍｇ Ｒｒ　　Ｏ，４３（酢酸エチル：ブタノール：酢酸：水
−１：Ｉ：１：１） アミノ酸分析値：Ａｓｐ　１．００；　　Ｓｅｒ　１．
９５；　　Ｐｒ。

２．０６；　　Ｖａｔ　Ｇ、９８；　　Ｌｅｕ　２．Ｑ
ｌ（４）　　　Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−＾ｓｎ−丁ｙｒ−ｔ、ｙｓ−ＯＨ（ウ
シａＦ　Ｇ　Ｆ　［１−９］、ペプチド（■））の製造
アプライド・バイオシステムズ社、４３０Ａ型全自動ペ
プチド合成機を用い、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃ（！Ｚ）　Ｐ
ＡＭ樹脂Ｑ　、５　ｓａ＋ｏｌｅより出発し、以下のア
ミノ酸を順次、縮合及び脱Ｂｏｃ化反応に付した。

Ｂｏａ−Ｔｙｒ（ＢｒＺ）−０１１ Ｂｏａ−Ａｓｎ−ＯＨ Ｂｏａ−Ｇｌｙ−０１１ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−０１１ Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｏｉｌ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｂｏａ−Ａｓｎ−Ｏｔｌ Ｂｏａ−Ｐｈｅ−ＯＨ ＢｒＺ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル斯くして
、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−＾５ｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−＾ｓｎ−Ｔｙｒ（ＢｒＺ）−Ｌｙｓ（Ｃ１２Ｚ
）−ＰＡＭ樹脂１．２４ｇを得た。

このうち４００＋ａｇをアニソール０．５−及びジメチ
ルスルフィド０．５１１＃１を含む弗化水素５．０−中
で０℃、６０分間処理した後、弗化水素を減圧留去し残
留物をエチルエーテルで洗浄後、目的物を１Ｎ酢酸３０
ｄで抽出し、アンバーライ）ＩＲＡ−４００（酢酸型）
のカラム（２Ｚ５ｃｍ）でイオン交換し、溶出液を凍結
乾燥した。これをＩＮ＝酢酸５−にとかし、セファデッ
クスｔ、　Ｈ−２０（ファルマンア社製；カラム：　２
．５×１２５ｃｍ：溶出１ｆｆｌ：ＩＮ酢酸）によるゲ
ルろ過にて精製して目的物を得た。

収量　５７．５＠ｇ Ｒｒ　　Ｏ，４１（酢酸エチル：ブタ／−ル：酢酸：水
−１：ｌ：ｌ：ｌ） アミノ酸分析値：　Ａｓｐ　１．９９；　　Ｐｒｏ　！
、　０３；　　Ｇｌｙｌ、００；　　Ｌｅｕ　１．９９
；　　Ｔｙｒ　Ｏ，７５；　　Ｐｈｅ　Ｏ，９７；　　
ＬｙｓＯ１９５ （５）　　Ｈ−Ｐｈｅ−＾５ｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−０１１（ヒトａ
Ｆ　Ｇ　Ｆ　［１−９］、ペプチド（■））の製造アプ
ライド・バイオシステムズ社、４３０Ａ型全自動ペプチ
ド合成機を用い、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃ（２Ｚ）　ＰＡＭ
樹脂Ｑ　、　５　ｍａ＋ｏｌｅより出発し、以下のアミ
ノ酸を順次、縮合及び脱Ｂｏｃ化反応に付した。

Ｂｏａ−Ｔｙｒ（ＢｒＺ）　−０Ｈ Ｂｏｃ−Ａｓｎ−０１１ Ｂｏｃ　−Ｇ　Ｉ　Ｙ　−０ｆｆ Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ Ｂｏａ−Ｐｒｏ−０１１ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏｉｌ Ｂｏａ−Ａｓｎ−Ｏｌｌ Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｏｌｌ 斯くして、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＡｓｎＴｙｒ（ＢｒＺ）−１，ｙｓ（
Ｃ＆Ｚ）−ＰＡＭ樹脂１．１３ｇを７６）だ。

これをアニソールｌ　、　３４　ｕ＝１及びジメチルス
ルフＣド１．３４ｔｅを含む弗化水素１３蔵中でｏ’ｃ
。

６０分間処理した後、弗化水素を減圧留去し、残留物を
エチルエーテルで洗浄後、目的物をＩＮ酢酸５０ｄで抽
出し、これをアンバーライトＩＲＡ−４００（酢酸型）
のカラム（２Ｘ　５　ｃｍ）でイオン交換し、溶出液を
凍結乾燥した。これを３０％酢酸１０ｘｆｆｌにとかし
、セファデックスＧ−５０（ファルマシア社製；カラム
：　５ｘ　Ｉ　Ｉ　Ｏｃｍ；溶出液：３０％酢酸）によ
るゲルろ過にて精製し、部分精製品２６７　ｍｇを得た
。これを０．ＩＮ酢酸２０蔵にとかし、ＣＭ−５２（ワ
ットマン社製、カラム２．２ＸＩ８ｃａ；溶出法：０．
０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４，５）−０，１
５Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ６，５）によるグラ
ジェント溶出）によるイオン交換クロマトグラフィーに
て精製し目的物を得た。

収量　２１３ｍｇ Ｒｆ　　Ｏ，５０（ｎ−ブタノール：ビリンン：酢酸。

水−５：５：ｌ：４） アミノ酸分析値：　Ａｓｐ　１．９８：　　Ｇｌｙ　　
Ｉ。００；　　ＬｅｕＯ，９９：　　Ｔｙｒ　Ｏ，９７
；　　Ｐｈｅ　１．ＱＯ；　　Ｌｙｓ　Ｏ，９８；　　
Ｐｒ。

２、ｌＯ 実施例２　抗ａＦＧＦ抗体の製造 （１）　Ｈ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−ＯＨ［ペプチド（Ｉ）］に
対する抗体の製造ペプチド（１）４ｍｇおよび牛チログ
ロブリン（ＢＴＧと略称する）１２ｍｇを０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７、３）　１．、５ｍ１に溶解し、１％
ゲルタールアルデヒド水溶液を０．５ｍｌ加えて室温で
３時間撹拌後、４℃で透析（生理食塩水２ｈ２）Ｌ、生
理食塩水にて８ｍｌとして１ｍｌずつ分注して凍結１ｖ
存した。　このペプチド（＋）−ＢＴＧ縮合縮合液溶液
ｌｌｌ１ｌロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ
’ｓ　ｃｏｍｐＩｅＬｅ　ａｄｊｕｖａｎＬ）１ｍｌを
加えてよく混和し、乳剤を作り、これをウサギの両大腿
部筋肉内、両後肢掌皮下および背部皮下数ケ所に注射し
た。以上の操作を４週おきに５回行い最終免疫後１週間
で採血し、遠心分離して抗血清を得た。

次いで抗血清を０．１５ＭＮａｃｌを含む０．０２Ｍホ
ウ酸緩衝液（ｐｉｇ、　０）で１０倍に希釈し、ペプチ
ド（１）を結合したセファロース４Ｂカラム（直径１．
２ｃｍ、長さ４ｃｎ＋）に付した。

０゜１５ＭＮａｃｌを含む０．０２Ｍホウ酸緩市液（ｐ
Ｈ３，０）にてカラムを洗浄し、次いでＯ，１Ｍグリシ
ン−塩酸ＩＲ街液（ｐＨ２，０）で溶出することによっ
て、ペプチド（１）に対する抗体ＡＦＭＩＤを得た。

（２）　Ｈ−Ｌｙｇ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ
−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−（翔［ペプチド（■）］に対する抗
体の製造 ペプチド（［１）４＋ｎｇおよび牛チログロブリン（Ｂ
ＴＧと略称する）１２Ｂを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，３）　ｌ、　５ｍｌに溶解し、■＃６グルタールア
ルデヒド水溶液を０．５蕩ｌ加えて室温で３時間撹拌後
、４°Ｃで透析（生理食塩水２ｉ２Ｘ２）Ｌ、生理食塩
水にて８蕩ｌとして１蕩ｌずつ努注して凍結保存した。

このペプチド（１１）−ＢＴＧ縮合体溶液１ｍｌにフロ
イントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）１蕩ｌを加尤てよく混
相し、乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉内、両
後肢掌皮下および背部皮下数ケ所に注射した。以」二の
操作を４週おきに５回行い最終免疫ｉ（１週間で採血し
、遠心分離して抗血清を得た。

＜３）　トＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−’／ａｔ
−３ｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−０１１［ペプチド（■）］
に対する抗体の製造ペプチド（１ｍ）　４ｍｇおよび８
７０１２ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，３）　
！、５揖ｌに溶解し、１％ゲルタールアルデヒド水溶液
を０．５＋ａｌ加えて室温で３時間撹拌後、４°Ｃで透
析（生理食塩水：１２ｘ２）　Ｌ、生理食塩水にて８１
として１蕩ｌずつ分注して凍結保存した。このペプチド
（ＩＩＩ）−ＢＴＧ縮合縮合液溶液１１ロイントの完全
アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　
ａｄｊｕｖａｎＬ）１蕩ｌを加えてよく混和し、乳剤を
作り、これをウサギの両大腿部筋肉内、両後肢掌皮下お
よび背部皮下数ケ所に注射した。以上の操作を４週おき
に５回行い最終免疫後１週間で採血し、遠心分離して抗
血清を得た。

次いで抗血清を０．１５ＭＮａＣ１を含む０．０２Ｍホ
ウ酸緩衝液（ｐｌ＋８．０）で１０倍に希釈し、ペプチ
ド（ＩＴＩ）を結合したセファロース４８カラム　（直
径１．２ｃｍ、長さ４ｃｍ）に付した。　０．１５ＭＮ
ａｃＩを含む０．０２Ｍホウ酸緩衝液（ｐｌ＋８．０）
にてカラムを洗浄し、次いで０．１Ｍグリシン−塩酸緩
衝液（ｐ）１２．０）で溶出することによって、ペプチ
ド（１）に対する抗体＾ＰＣＩＤを（４た。

（４）　トＰｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｃｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−＾５ｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｏ１１［ペプチド（
■）］に対する抗体の製造ペブ＋　Ｆ（■）　４ＩＩＩ
ｇおよびＢＴＧ１２ｒＲｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（＋
）Ｈ７，３）　１．５蕩ｌに溶解し、１％ゲルタールア
ルデヒド水溶液を０．５ａ＋１加えて室温で３時間撹拌
後、４°Ｃで透析（生理食塩水２１２Ｘ２）　Ｌ、生理
食塩水にて８蕩ｌとして１蕩ｌずつ分注して凍結保存し
た。このペプチド（＋ｖ）−ｏｒｃｍ合体溶ｉ＆１ｍｌ
にフロイントの完全アジユバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　
ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）＋ａｌｌを加え
てよく混和し、乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋
肉内、両後肢掌皮下および背部皮下数ケ所に注９．１シ
た。以上の操作を４週おきに４回行い最終免疫後ｂａ間
で採血し、遠心分離して抗血清を得た。

次いで抗血清を０．１５１ＮａＣ１を含む０．０２Ｍホ
ウ酸綾南液（ｐＨ８，０）で１０倍に希釈し、ペプチド
（ＩＶ）を結合したセファロース４Ｂカラム（直径１゜
２ｃｎ＋、　長す４ｃｍ）に付した。

０、　＋５ＭＮａｃＩを含む０．０２Ｍホウ酸緩衝液（
ｐＨ８，０）にてカラムを洗浄し、次いで０．１Ｍグリ
／ンー塩酸緩ｉｔｉ　’ｔｒｌ　（ｐ＋ｉ：ｉ、　ｏ）
で溶出することによ一〕で、ペプチド（ｒＶ）に対する
抗体ＡＦＮ２Ｃを得た。

（５）　ＩＩ−Ｐｈｅ−＾５ｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＯＩ（［ペプチ
ド（ｖ）１に対する抗体の製造ペブ千Ｆ（Ｖ）４ｍｇお
よびＢＴＧ１２Ｂを０．１Ｍ’Ｊ：／酸緩衝液（ｐＨ７
，３）　１．５蕩ｌに溶解し、１％ゲルタールアルデヒ
ド水溶液を０．５蕩ｌ加えて室温で３時間撹拌後、４℃
で透析（生理食塩水２１２Ｘ２）　Ｉ、、生理食塩水に
て８■１として１蕩ｌずつ分注して凍結保存した。この
ペプチド（Ｖ）−ＢＴＧ縮合体溶ｉｆｆ１１ｍｌにフロ
イントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）ｆｓｌを加えてよく混
和し、乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉内、両
後肢掌皮下および背部皮下数ケ所に注射した。以上の操
作を４週おきに４回行い最終免疫後１週間で採血し、遠
心分離して抗血清を得た。

次いで抗血清を０．１５ＭＮａＣ１を含む０．０２Ｍホ
ウ酸緩衝液（ｐｒｉｇ、　Ｏ）テ１０倍に希釈し、ベブ
チＦ（Ｖ）を結合したセファロース４Ｂカラム（直径ｉ
、　２ｃｍ、長さ４ｃｍ）に付し、た。

０、１５ＭＮａｃｌを含む０：　０２Ｍホウ酸緩衝液（
ｐＨ８，０）にてカラムを洗浄し、次いで０．ＩＭグリ
ンンー塩酸緩衝液（ｐｌ＋２．０）で溶出することによ
って、ペプチド（Ｖ）に対する抗体１１ＡＦＮＩＢを得
た。

実施例３　標識剤結合抗体の調製 実施例２の（４）で得たＡＦｌ１２Ｃの溶出画分を、０
、１ＭＮａｃＩを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液＜ｐＨ４，５
）に対して４°Ｃで２０時間透析し、ペプシン（シグマ
社製、米国）（０，１ｍｇ）を加え、３７℃で８時間消
化した。１ＭＴｒｉｓでｐＨを８にして反応を止め、Ｕ
ｌｔｒｏｇｅｌ　Ａｃ＾４４（ＩＢＦ社製、フランス）
のカラムで０．１５ＭＮａＣ１を含む０．０２Ｍホウ酸
緩衝液（ｐＨ８，０）を溶出液として分離し、Ｆ（ａｂ
’　Ｌを得た。

これを、１ｍｌに濃縮後、０．１Ｍリン酸緩衝液（＋）
Ｈ６，０）に対して４℃で２０時間透析し、０．２Ｍメ
ルカプトエチルアミン、　５ｄＥＤＴＡ、　０．　ＬＭ
リン酸緩゛衝液（ｐＨ１６，０）　Ｏ，１ｍｌを加えて
、３７℃、９０分分間光した。反応液を５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　Ｇ−２５ｆｉｎｅ　（ファルマシア・ファインケミ
カル社製、スエーデン）（φｌＸ６０ｃｍ）で５ｍＭＥ
ＤＴ＾、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を溶出液
として分離し、Ｆａｂ’画分を得た。一方、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）　（ベーリンガーマンハイ
ム社製、西ドイツ）　１０ｍｇを１．５ｍｌのｏ、　ｉ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶かし、Ｎ−（γ〜マ
レイミドブチルオキシ）サクシイミド（ＧＭＢＳ）　３
．５ｔａｇをＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
　１００μｍに溶かして加え、３０℃で６０分間撹拌後
、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５ｆｉｎｅ　（φ１．２Ｘ
６０ｃｍ）で０．１ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞を
溶出液として分離し、マレイミド基の導入されたＨＪ？
Ｐを得た（マレイミド化ＨＲＰ）。Ｆａｂ’　とマレイ
ミド化ＨＲＰをモル比で１：１になるように混ぜ、４℃
で２００時間反応た。反応液を、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　Ａ
ｃＡ４４のカラムで０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）を溶出液として分離し、酵素標識抗体（ＡＦＮ２Ｃ−
１１ＲＰ）を得た。

実施例４　抗体感作プレートの調製 実施例２　で得たＡＦＭＩＤあるいはＡＦＣＩＤを０．
１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）にて１０μｇ／ｉｆとな
るように希釈し、ＥＩＡ用イムノプレート１（ヌンク社
製、デンマーク）の各ウェルにｌＯＯμｌずつ注入して
４°Ｃで一夜放置して感作させた。０．１５ＭＮａｃｌ
を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞にて洗浄
した後、０．１％ＢＳ＾を含む０、Ｏ１輩リン酸緩衝液
（ｐＨ１７，０）を各ウェルに注入して用時まで冷所保
存した。

実施例５　　ａＦＧＦの測定 （１）　　検量線の作成 （ａ）試薬 ■　実施例３で得られた酵素標識抗体＾ＦＮ２Ｃ−ＨＲ
Ｐ■　実施例４で得た抗体感作マイクロプレート■　ウ
シ由来ａＦ　Ｇ　Ｆ　（Ｂ　ａＦ　Ｇ　Ｆ　ＸＲ＆Ｄ社
、米国）θ〜１μｇ／ｓｌ ■　緩衝液＾（０，１５Ｍ　ＮａＣ１を含むｐｌ＋７．
０の０．０２Ｍ’Ｊン酸緩衝液） 緩衝ＩＢ（ｔｏ％子牛血清、０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含
むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液）■　ペルオキ
シダーゼ基質溶Ｋｌ（０，０２％過酸化水素（！：　Ｏ
，ｔＳ％０−フェニレンジアミンを含むｐＨ５，５のク
エン酸ナトリウム緩衝液） 酵素反応停止溶液（２Ｎ−硫酸） （ｂ）測定 実施例４で得られた抗体感作プレートの各ウェルに、緩
衝液Ｂに溶解させたａＦＧＦ溶液１００μｍをに注入し
、２５℃で２時間反応させた。各ウェルを緩衝液＾で洗
浄後、酵素標識抗体溶液１００μｍを加えて２５℃でさ
らに２時間反応させた。各ウェルを緩衝液Ａで洗浄し、
ペルオキシダーゼ基質ｍ　ｉ＆を１００μｌ加え２５℃
で３０分反応させ、酵素反応停止溶液１００μｌ加えて
反応を停止させた後、マイクロプレート用自動比色計（
ＭＴＰ−３２，コロナ社製）を用い、　４９２ｎ−にお
ける吸光度を測定した。ＢａＦＧＦの濃度と吸光度との
関係を第６図に示す。第６図において、−〇−はＡＦＣ
ＩＤを感作したマイクロプレートを用いた場合、−・−
はＡＦＭＩＤを感作したマイクロプレートを用いた場合
のＢａＦＧＦの濃度と吸光度との関係をそれぞれ示す。

（２）　　ａＦ　Ｇ　Ｆの免疫化学的測定キ・ノドおよ
びａＦＧＦの測定 下記のａＦ　Ｇ　Ｆ免疫化学的測定キットを用い、下記
の操作法に従って、被検試料中のａＦＧＦｉｌを測定す
る。

（ａ）試薬 （１）実施例３で得られた酵素標識抗体Ａ　Ｆ　Ｎ　２
−ＨＲＰ （２）実施例４で得られた抗体感作マイクロプレート （３）０〜Ｉμｇ／ｓｃのウシ由来標ＱａＦＧＦ（４）
緩衝液Ａ（０，ｌ　５Ｍ　ＮａＣ１２を含むｐｉ（７，
０の０．０２Ｍリン酸緩衝液） 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、０．１５Ｍ　ＮａＣｒｔを
含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝１夜） （５）ｏ−フ二二レンジアミン （６）上記（５）の溶解に用いる緩衝液Ｄ（０，０２％
過酸化水素、０．００５％チメロサールを含むｐＨ５，
５のＯ，１Ｍクエン酸緩衝液）（７）酵素反応停止液（
２Ｎ−硫酸） （ｂ）測定 緩衝液Ｂに溶解させたａＦ　Ｇ　Ｆ標準溶液あるいは緩
衝液Ｂで希釈された被検試料溶液１００μｅを、Ｆｔ　
街液入で洗浄された（２）の各ウェルに注入し、２５°
Ｃで２時間反応させる。各ウェルを緩衝液Ａで洗浄後、
試薬（１）　ｌ　ＯＯμＱを加えて、２５℃でさらに２
時間反応させる。各ウェルを緩衝液入で洗浄後、試薬（
６）で溶解した０、１５％の試薬（５）１００μｅを加
えて２５℃で３０分反応させる。

各ウェルに試薬（７）　ｌ　ＯＯμＣを添加して反応を
停止させ、４９２ｎ量の吸光度をマイクロプレート用自
動比色計（ＭＴＰ−３２，コロナ社製）を用いて測定す
る。漂ｒ＄ａＦＧＦの検量線を作成し、被検試料で得ら
れた吸光度から、ａＦＧＦａ度を得る。

実施例６ １）抗体結合樹脂の作製 ＣＮ　Ｂ　ｒ　−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　　５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　４　Ｂ　　Ｉ　ｇを、グラフフィルター上で１
ｍＭ塩酸（２００ｄ）により、洗浄と膨潤を繰り返した
。

カブプリングバッファー（０，５Ｍ　ＮａＣ１を含むＯ
，１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８、０））にてゲルを洗浄した
後、実施例２（３）で得られたＡＦＣＩＤ４ｍｇを含む
カップリングバッファー中にゲルを加え、全量をカップ
リングバッファーで１０蔵として、４℃で２０時間かく
はんした。

グラスフィルター上でゲルを口取し、これを０．２Ｍ　
Ｇｌｙ−ＮａＯＨ（ｐＨ８，０）に移して、室温で２時
間か（はんした。

ゲルを口取し、カノブリングバノフア−と０．５ＭＮａ
Ｃｆｆを含むＯ，ＩＭ酢酸ｎ　ｉｔｉ　ｉ（！で洗浄し
、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中で４℃で保
存した。

２）市販のウシ由来ａＦ　Ｇ　Ｆの精製■）で調製した
ゲル０．５に！ｌをカラム（内径０．８ｃ＋ａ）につめ
、緩衝液Ａ（０，ｆ　５Ｍ　ＮａＣ（ｌを含む０．０５
Ｍヘベス緩衝液（ｐＨ７，５））にて充分洗浄した。

市販のつ／由来ａＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ社（米国）、ａＦＧＦ
ｌμｇに対し５０μｇのＢＳＡを含む）をａＦＧＦの濃
度としてｌＯμｇ／ｄとなるように蒸留水で溶解し、そ
のうち１００μジを」二記カラムに流しｌこ。

カラムを緩衝液入で充分洗浄した後、緩衝液Ｂ（０，２
Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，０））にてａＦＧＦ
を溶出した。溶出液は、１ＭＴｒｉｓにて中和した。

３）精製ａＦ　Ｇ　Ｆの純度 ２）で精製前のａＦＧＦ溶液と、精製後のａＦＧＦ溶出
液を、ＦＰＬＣシステム（ファルマシア・ファインケミ
カル社、スウェーデン）を用いて液体クロマトグラフィ
ーで検定した。

カラムは、ゲルろ適用カラムである５ｕｐｅｒｏｓｅ１
２を用い、溶出液は緩衝液Ａを用い、流速は０、ＦＭ！
／分とした。

溶出パターンを第７図および第８図に示す。

第７図は精製前のパターンを、第８図は精製後のパター
ンをそれぞれ示し、第７図および第８図を比較すると、
極めて高純度にａＦ　Ｇ　Ｆが精製されていることがわ
かる。

実施例７　ヒト型ａＦ　Ｇ　Ｆの測定 （１）　　標識剤結合抗体の調製 実施例２の（５）で得たＨＡＦＮＩＢの溶出画分を、０
．１ＭＮａｃｌを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐｆ１４．
５）に対して４℃で２０時間透析し、ペプシン（シグマ
ＩＩ：　製、米国）（０，ｌａｇ）を加え、３７℃で８
時間消化した。１ＭＴｒｉｓでｐＨを８にして反応を止
め、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　Ａｃ＾４４（ＩＢＦ社製、フラ
ンス）ツカ５ムチ０．１５［ａｃＩを含む０．０２Ｍホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）を溶出液として分離し、Ｐ（
ａｂ’　）＝を得た。

これを、１１に濃縮後、０．１ＭＩＪン酸緩衝液（ｐ１
１６．０）に対して４℃で２０時間透析し、０．２Ｍメ
ルカプトエチルアミン、　５ｓＭＥＤＴＡ、　Ｏ，１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）　０．１＠ｌを加えて、３
７℃、９０分分間光した。反応液を５ｅｐｈａｄｅｘ　
Ｇ−２５ｆｉｎｓ　（ファルマシア・ファインケミカル
ン上製、スエーデン）（φｌＸ６０ｃＩ１１）で５１１
ＩＭ１ミＤＴＡ、　０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６、０
）を溶出液として分離し、Ｆａｂ’画分を得た。一方、
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＩＩＲＰ）（ベーリンガ
ーマンハイム社製、西ドイツ）　１０ｍｇを１．５ｍｌ
の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ１１７．０）に溶かし、Ｎ
−（γ−マレイミドブチルオキシ）サグ／イミド（ＧＭ
ＢＳ）　３．５ｏ＋ｇをＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）　１００μｌに溶かして加え、３０°Ｃで６
０分間撹拌後、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５ｆｉｎｅ　
（φ１．２Ｘ６０ｃｍ）で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）を溶出液として分離し、マレイミド基の導入さ
れたＨＲＰを得た（マレイミド化＋１１？Ｐ）。Ｆａｂ
’　とマレイミド化１１？Ｐをモル比でＩ：１になるよ
うに混ぜ、４°Ｃで２００時間反応た。反応液を、Ｕｌ
ｔｒｏｇｅｌ　Ａｃ＾４４のカラムで（１，１Ｍリン酸
緩衝液（ｐ）１７．０）を溶出液として分離し、酵素標
識抗体（ＩＩＡＦＮＩＢ−ｉｌＲＰ）を得た。

（２）　ヒトａＦ　Ｇ　Ｆの測定 （２−１）　　検ｍｖＡの作成 （ａ）試薬 ■　上記実施例７の（１）で得られた酵素を票識抗体１
１ＡＦＮＩＢ−ＨＲＰ ■　実施例４で得たＡＦＣＩＤ感作マイ感作マイクロプ
レート例１で得たヒト型ａＦＧＦ（ＨａＦＧＦ）０〜ｌ
μｓ／ｍｌ ■　緩衝液Ａ（０，１５Ｍ　ＮａＣ１を含むｐＨ１７，
０の０．０２Ｍリン酸緩衝液） 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、０．１５Ｍ　！１ａｃｌを
含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩ｉＩｉ液）■　ペ
ルオキシダーゼ基質溶液（０，０２％過酸化水素と０．
１５％０−フェニレンジアミンを含むｐｌ＋５．５のク
エン酸すｌ・リウム緩衝液）酵素反応停止溶液（２Ｎ−
硫酸） （ｂ）測定 実施例４で得られた抗体感作プレートの各ウェルに、緩
衝液Ｂに溶解させたａＦ　Ｇ　Ｆ溶液１００μｍを注入
し、２５℃で２時間反応させた。各ウェルを緩衝液＾で
洗浄後、酵素標識抗体溶液１００μｍを加えて２５℃で
さらに２時間反応させた。各ウェルを緩衝液Ａで洗浄し
、ペルオキシダーゼ基質溶液を１００μ！加え２５℃で
３０分反応させ、酵素反応停止溶液１００μｌ加えて反
応を停止させた後、マイクロプレート用自動比色計（Ｍ
ＴＰ−３２，コロナ社製）を用い、４９２ｎｍにおける
吸光度を測定した。ヒ）ａＦＧＦのＩｎ度と吸光度との
関係を第９図に示す。

（２−２）　　ヒトａＦＧＦの免疫化学的測定キットお
よびヒトａＦ　Ｇ　Ｆの測定 下記のヒ）ａＦＧＦ免疫化学的測定キットを用い、ド記
のｔｔ作法に従って、；皮検試料中のヒ）ａｌ：　Ｇ　
Ｆ計を測定する。

（ａ）試薬 （１）実施例７の（１）で得られた酵素標識抗体ｔｌＡ
ＦＮＩＢＡ　−１１ＲＰ （２）実施例４で得られた抗体感作マイクロプレート （３）　０〜１　ｔｔ　ｇ／’ｄのヒト型ａＦ　Ｇ　Ｆ
　（参考例１で得たもの） （４）緩衝液Δ（０，１５Ｍ　ＮａＣＱを含むｐＨ７，
０の０．０２Ｍリン酸緩衝液） 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、０゜１５ＭＮａＣｌ２を含
むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液） （５）ｏ−フェニレン、ジアミン （６）上記（５）の溶解に用いる緩衝液Ｄ（０，０２％
過酸化水素、０．００５％チメロサールを含むｐＨ５，
５のｏ、ｉＭクエン酸緩衝液）（７）酵素反応停止液（
２Ｎ−硫酸） （ｂ）測定 緩衝液Ｂに溶解させたａ　Ｆ　Ｇ　Ｆけ準溶液あるいは
緩衝液Ｂで希釈された被検試料溶液１００１を、緩衝液
Ａで洗浄された（２）の各ウェルに注入し、２５℃で２
時間反応させる。各ウェルを援ｉ！ｉ液入で洗浄後、試
薬（１）　１００μりを加えて、２５°Ｃでさらに２時
間反応させる。δウェルを緩衝液入で洗浄後、試薬（６
）で溶解した０、１５％の試薬（５）１００μＱを加え
て２５°Ｃで３０分反応させる。

各ウェルに試薬（７）　１００μａを添加して反応を停
止させ、４９２ｎａの吸光度をマイクロプレート用自動
比色計（ＭＴＰ−３２，コロナ社製）を用いて測定する
。標Ｆ＄ａＦＧＦの検量線を作成し、被検試料で得られ
た吸光度から、ａＦＧＦ濃度を得る。

発明の効果 本発明のａＦＧＦの部分ペプチドを免疫原とし゛ＣＣ得
心れた抗体は、ａＦ　Ｇ　Ｆとの結合能が高いので、ａ
ＦＧＦを効率良く精製することかできる。

また、本発明のａＦＧＦの免疫化学的測定法によると、
感度良＜ａＦＧＦを測定することができる。

また、本発明のａＦ　Ｇ　Ｆの部分ペプチドは、部位特
異抗体の産生を効率良く行なうことができるので、抗体
５２　造の際の抗原として有利に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、参考例Ｉで用いられた、ヒ）ａＦＧＦのｃＤ
ＮＡ配列を示す。 第２図は、蓼考例１で得られた、プラスミドｐＴ１３９
７５の構築図を示す。 第３図は、参考例１で得られた、溶出パターンを示す。 第４図は、参考例１で得られた、溶出パターンを示す。 第５図は、参考例１で得られた、溶出パターンを示す。 第６図は、実施例５で得られたつ／ａＦＧＦの濃度と吸
光度との関係を示す。 第７図は、実施例６（３）で得られた、精製前のａＦＧ
ＦＪ度についての溶出パターンを示す。 第８図は、実施例７（３）で得られた、゛精製後のａＦ
ＧＦについての溶出パターンを示す。 第９図は、実施例７で得られた、ヒ）ａＦＧＦの濃度と
吸光度との関係を示す。 代理人　　弁理士　岩　１）　　弘 へ 第３図 □ｍ−」 フラクシ璽ン数 第４図 ２０　　　３０　　　　ｕ　　　　５０　　　６０　　
　７０　　　　８゜フラクシ璽ン数 第５図 保持時間（分） 第６図 ＢｏＦＧＦのり」Ｌ（ｎｇ／？ニンレ）ｇＩｐｃ７図 溶出呼量□□□ 第８図 溶土斗間（分）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）の部分ペプ
   チドとキャリア用蛋白との複合体を免疫原として得られ
   た抗体。
2. （２）担体上に保持された抗酸性線維芽細胞成長因子（
   ａＦＧＦ）抗体、および担体上に保持された抗体とは抗
   原決定部位を異にする抗ａＦＧＦ抗体に標識剤を直接結
   合させた結合物を用いてａＦＧＦを測定することを特徴
   とするａＦＧＦの免疫化学的測定法。
3. （３）抗体が、ａＦＧＦの部分ペプチドとキャリア用蛋
   白との複合体を免疫原として得られた抗体である請求項
   ２記載の測定法。
4. （４）酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）を、ａＦＧ
   Ｆの部分ペプチドとキャリア用蛋白との複合体を免疫原
   として得られた抗体を用いて精製することを特徴とする
   ａＦＧＦの精製法。
5. （５）酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）の第１〜１
   １番目のシークエンスのうちの連結した８〜１０個のア
   ミノ酸からなるペプチド。
6. （６）酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）の第５５〜
   ６６番目のシークエンスのうちの連結した８〜１０個の
   アミノ酸からなるペプチド。
7. （７）酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）の第１０３
   〜１１３番目のシークエンスのうちの連結した７〜９個
   のアミノ酸からなるペプチド。
8. （８）酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）の第１３１
   〜１４０番目のシークエンスのうちの連結した８〜９個
   のアミノ酸からなるペプチド。