ES2304340T3 - Anticuerpos dirigidos contra procalcitonina, su preparacion y uso. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo que se une a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys- Arg-Asp-Met-Ser-Ser, caracterizado porque se une a la procalcitonina pero no se une a la calcitonina libre, a la catacalcina libre ni a la N-procalcitonina libre y porque es producido por la línea de células de hibridoma 98-31/04 (DSM ACC2437).

Description

Anticuerpos dirigidos contra procalcitonina, su preparación y uso.

La invención se refiere a anticuerpos contra la procalcitonina, a su preparación y a su uso.

La procalcitonina ("pCT") es una proteína que consta de 116 aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 13.000 dalton. Es la prohormona de la calcitonina que se produce y se secreta, bajo condiciones metabólicas normales, en las células C del tiroides. La síntesis de la pCT y de la calcitonina se inicia con la traducción de la preprocalcitonina ("pre-pCT"), un péptido precursor que comprende 141 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de la pre-pCT humana ha sido descrita por Moullec y col. en FEBS Letters, 167:93-97 en 1984. La pCT se forma después de eliminar por corte el péptido señal (los primeros 25 aminoácidos de la pre-pCT). En personas sanas, la hormona calcitonina (aminoácidos 60-91 de la secuencia de aminoácidos de la pCT) y la N-procalcitonina (aminoácidos 1-57 de la secuencia de aminoácidos de la pCT) y la catacalcina (aminoácidos 96-116 de la secuencia de aminoácidos de la pCT) se producen de forma intracelular a partir de la pCT, mediante proteolisis específica (véase también, Conlon y col. (1988) Biochem, J., 256:245-250). La pCT y sus fragmentos se detectaron en concentraciones incrementadas en el suero o en el plasma de pacientes, en particular con determinadas enfermedades tumorales (Ghillani y col. (1989) Cancer Research, 49:6845-6851), con sepsis (documento de patente europea EP-B1-0656121) y con SIRS (síndrome de la respuesta inflamatoria sistémica, del inglés "Systemic inflammatory response syndrome") (Snider y col. (1997) J. Investig. Med., 45:552-560).

Durante la sepsis típica, las bacterias se liberan desde un foco en la corriente sanguínea de forma continua o por tandas. La endotoxina u otras sustancias pirógenas o tóxicas interaccionan con los mecanismos corporales provocando los síntomas clínicos. El brote agudo provoca escalofríos y en los casos graves una reacción de choque. Las formas especiales de choque séptico son el síndrome de Waterhouse-Friderichsen y el síndrome del choque tóxico (TSS). El TSS se conoce por un cuadro clínico agudo en infecciones con estafilococos, causadas por una toxina específica de los estafilococos. Una sepsis grave se desarrolla con una frecuencia relativa en pacientes con enfermedades primarias tales como, por ejemplo, enfermedades neoplásicas, quemaduras graves y traumas.

La detección de los agentes patógenos en la sangre ("cultivo sanguíneo positivo, bacteremia") ha perdido importancia para el diagnóstico de la sepsis porque el cultivo sanguíneo en general sólo es positivo en 20 a 40% de los casos de sepsis. El concepto sepsis ha sufrido por tanto un cambio. El concepto moderno de "sepsis" describe un síndrome clínico que comprende en general fiebre, leucocitosis, alteraciones de la conciencia, una circulación hiperdinámica ("choque caliente") y un estado hipermetabólico, no siendo más necesario un cultivo sanguíneo positivo como prerrequisito para el diagnóstico de una sepsis.

El documento WO 98/33524 sugiere el empleo de anticuerpos que se unen a pCT, para la terapia de la sepsis y del SIRS.

Durante muchos años se han obtenido anticuerpos policlonales a partir de la inmunización con calcitonina y se emplearon para detectar la denominada calcitonina inmunorreactiva que, además de la calcitonina, también comprende la procalcitonina y fragmentos adicionales de la procalcitonina. Mediante la inmunización con péptidos sintéticos que tienen secuencias de aminoácidos correspondientes a las secuencias de los segmentos de procalcitonina, se consiguió la producción de distintos anticuerpos monoclonales que se unían a distintos epítopos de la calcitonina y la catacalcina (Ghillani y col. (1988) J. Immunol., 141:3156-3163).

Basándose en estos anticuerpos, se desarrollaron también inmunoensayos de tipo sándwich para detectar pCT y calcitonina en muestras séricas. Se sugirió una combinación de un anticuerpo anti-catacalcina y un anticuerpo anti-calcitonina para detectar las moléculas precursoras de la calcitonina (documento de patente europea EP-B1-0656121). Sin embargo, el inconveniente de este método es que la detección de pCT requiere al menos dos anticuerpos que se unan a segmentos de pCT en regiones que estén lo más separadas posible.

Por tanto, un experto en la técnica tendrá que poner a disposición otro partícipe específico en la unión que permita la detección de pCT, incluso sólo con un partícipe específico en la unión.

Este objetivo se consigue proporcionando los anticuerpos de acuerdo con la invención que se unen a la procalcitonina pero no a la calcitonina libre, a la catacalcina libre y a la N-procalcitonina libre. De acuerdo con la invención, se prefieren los anticuerpos que se unen a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser.

En contraposición a los anticuerpos conocidos hasta la fecha, que se unen a pCT pero que al mismo tiempo se unen también a la calcitonina libre o a la catacalcina libre o a la N-procalcitonina libre, los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden emplear también de forma separada en ensayos competitivos o en métodos inmunohistoquímicos para la detección específica de pCT. Además, los anticuerpos de acuerdo con la invención son particularmente adecuados para purificar la pCT a partir de una muestra que también contiene fragmentos de pCT, mediante cromatografía de afinidad.

\newpage

Aunque Ghillani y col. se esforzaron en sus experimentos de inmunización para identificar epítopos de pCT, empleando también los péptidos que comprendían la secuencia de aminoácidos Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp o Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser, sólo pudieron proporcionar anticuerpos que reconocían la calcitonina "madura" o la pCT junto con calcitonina o pCT junto con catacalcina.

Sorprendentemente, ahora se ha conseguido producir anticuerpos que se unen a la procalcitonina pero no a la calcitonina libre, a la catacalcina libre, ni a la N-procalcitonina libre.

A continuación se describen con más detalle las realizaciones específicas de la invención.

Es un objeto de la invención los anticuerpos caracterizados porque se unen a la procalcitonina pero no se unen a la calcitonina libre, a la catacalcina libre ni a la N-procalcitonina libre.

El término "anticuerpo" significa en general una inmunoglobulina, por ejemplo, una inmunoglobulina de la clase o la subclase IgA, IgD, IgE, IgG_{1}, IgG_{2a}, IgG_{2b}, IgG_{3}, IgG_{4}, IgM. Un anticuerpo comprende al menos un sitio de unión (denominado frecuentemente un parátopo) para un epítopo (denominado también frecuentemente determinante antigénico) sobre un antígeno o un hapteno. Un epítopo tal se caracteriza, por ejemplo, por su estructura tridimensional y/o por la presencia de grupos polares y/o apolares. El sitio de unión del anticuerpo es complementario al epítopo. La reacción antígeno-anticuerpo o la reacción de hapteno-anticuerpo discurre según el denominado "principio de llave-cerradura" y en general es altamente específico, es decir, los anticuerpos son capaces de distinguir pequeñas diferencias en la estructura primaria, en la carga, en la configuración tridimensional y en la disposición estérica del antígeno o del hapteno. En particular, las regiones denominadas "determinantes de la complementariedad" del anticuerpo, contribuyen a la unión del anticuerpo con el antígeno o con el hapteno.

El término "antígenos" comprende antígenos mono y polivalentes. Un antígeno polivalente es una molécula o un complejo molecular al que se puede unir simultáneamente más de una inmunoglobulina, mientras que en el caso de un antígeno monovalente sólo se puede unir al mismo tiempo un solo anticuerpo. Un hapteno indica generalmente una molécula que por sí misma no es inmunógena, pero que para fines de inmunización generalmente se une a un soporte.

El término anticuerpos, de acuerdo con la invención, significa no sólo anticuerpos completos sino que expresamente también fragmentos de anticuerpos, tales como por ejemplo, Fab, Fv, F(ab)'_{2}, Fab'; así como anticuerpos quiméricos, humanizados, bi u oligoespecíficos, o "monocatenarios"; además también significa agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas y/o fragmentos de los mismos en tanto que mantengan las propiedades de unión al antígeno o al hapteno. Los fragmentos de anticuerpo se pueden preparar, por ejemplo, mediante digestión enzimática de los anticuerpos, empleando enzimas tales como pepsina o papaína. Los agregados, los polímeros y los conjugados de anticuerpos se pueden generar por una variedad de métodos, por ejemplo, mediante tratamiento térmico, reacción con sustancias tales como glutaraldehído, reacción con moléculas que se unen a inmunoglobulinas, biotinilación de anticuerpos y la reacción posterior con estreptavidina o avidina, etc.

En el caso de los anticuerpos de acuerdo con esta invención, se trata de los anticuerpos que se unen a pCT que son producidos por la línea celular de hibridoma 98-31/04. Esta línea celular de hibridoma se depositó el 16-12-1999 ante la "DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, Alemania, con el número de entrada DSM ACC2437.

También es un objeto de la presente invención un anticuerpo de acuerdo con la invención, que está asociado con una fase sólida y/o con un componente de un sistema generador de señales.

La expresión "fase sólida" de acuerdo con esta invención, comprende un objeto que consta de un material poroso y/o no poroso, generalmente insoluble en agua y que puede tener diversas formas, tales como por ejemplo, un recipiente, un tubo de ensayo, una placa de microtitulación, perlas, micropartículas, varillas, tiras, papel de filtro o de cromatografía, etc. En general, la superficie de la fase sólida es hidrófila o se puede hacer hidrófila. La fase sólida puede comprender materiales muy diversos tales como, por ejemplo, materiales inorgánicos y/o orgánicos, materiales sintéticos, materiales presentes en la naturaleza y/o materiales presentes en la naturaleza modificados. Ejemplos de materiales de la fase sólida son polímeros tales como, por ejemplo, celulosa, nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, moléculas de dextrano reticuladas, agarosa, poliestireno, polietileno, polipropileno, polimetacrilato o nilón; cerámica; vidrio; metales, en particular metales nobles tales como oro y plata; magnetita; mezclas o combinaciones de los mismos; etc. La expresión fase sólida también comprende células, liposomas o vesículas de fosfolípidos.

La fase sólida puede tener un revestimiento de una o varias capas, por ejemplo, de proteínas, carbohidratos, sustancias lipofílicas, biopolímeros, polímeros orgánicos o mezclas de los mismos, para evitar o prevenir, por ejemplo, la unión no específica de constituyentes de la muestra en la fase sólida, o para conseguir, por ejemplo, mejoras en la estabilidad de la suspensión de fases sólidas particulares, en la estabilidad durante el almacenamiento, en la estabilidad de la conformación o en la resistencia a la luz UV, a los microbios o a otros agentes destructivos.

Un "sistema generador de señales" puede tener uno o varios componentes, siendo al menos un componente un marcador detectable. Un marcador significa cualquier molécula que produzca una señal por sí misma o que sea capaz de inducir la producción de una señal, tal como por ejemplo, una sustancia fluorescente, una sustancia radiactiva, una enzima o una sustancia quimioluminiscente. La señal se puede detectar o medir, por ejemplo, mediante actividad enzimática, luminiscencia, absorción luminosa, dispersión de la luz, emisión electromagnética o radiactiva o una reacción química.

Un marcador puede ser capaz de producir el mismo una señal detectable, de modo que no sean necesarios otros componentes. Muchas moléculas orgánicas absorben la luz ultravioleta y la visible, siendo posible que estas moléculas alcancen un nivel energético excitado debido a la energía transferida por la absorción luminosa, y emitan la energía absorbida como luz con una longitud de onda diferente a la de la luz incidente. Otros marcadores pueden producir directamente una señal detectable, tal como por ejemplo, isótopos radiactivos o colorantes.

Otros marcadores requieren componentes adicionales para la producción de señales, es decir, el sistema que produce la señal incluye en este caso todos los componentes necesarios para generar la señal, tales como por ejemplo, sustratos, coenzimas, extintores de la fluorescencia, aceleradores, enzimas adicionales, sustancias que reaccionan con productos enzimáticos, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, iones, etc.

Marcadores adecuados (véanse también los documentos EP-A2-0515194; US 5.340.716; US 5.545.834; Bailey y col. (1987) J. Pharmaceutical & Biomedical Analysis 5:649-658) son, por ejemplo, enzimas que incluyen la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la deshidrogenasa de la glucosa-6-fosfato, la deshidrogenasa de alcohol, la oxidasa de glucosa, la \beta-galactosidasa, la luciferasa, la ureasa y la acetilcolinesterasa; colorantes; sustancias fluorescentes que incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, bromuro de etidio, cloruro de 5-dimetilaminonaftalen-1-sulfonilo y quelatos fluorescentes de tierras raras; sustancias quimioluminiscentes que incluyen luminol, isoluminol, compuestos de acridina, olefina, éter enólico, enamina, aril-vinil-éter, dioxeno, arilimidazol, lucigenina, luciferina y aecuorina; sensibilizadores que incluyen la eosina, 9,10-dibromoantraceno, azul de metileno, porfirina, ftalocianina, clorofila, rosa de bengala, coenzimas; sustratos enzimáticos; isótopos radiactivos que incluyen ^{125} I, ^{131}I, ^{14}C, ^{3}H, ^{32}P, ^{35}S, ^{51}Cr, ^{59}Fe, ^{57}Co y ^{75}Se; partículas que incluyen partículas magnéticas o partículas, preferentemente partículas de látex que pueden estar marcadas ellas mismas con, por ejemplo, colorantes, sensibilizadores, sustancias fluorescentes, sustancias quimioluminiscentes, isótopos u otros marcadores detectables, partículas de sol que incluyen soles de oro y plata; liposomas o células que se pueden marcar ellas mismas con marcadores detectables, etc.

Un sistema generador de señales también puede comprender componentes que pueden interaccionar entre sí de forma detectable en la proximidad espacial, por ejemplo, como donantes de energía y aceptores de energía, tales como, por ejemplo, sustancias fotosensibles y quimioluminiscentes (documento EP-A2-0515194), sustancias fotosensibles y fluoróforos (documento WO 95/06877), yodo^{125} radiactivo y fluoróforos (Udenfriend y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:8672-8676), fluoróforos y fluoróforos (Mathis (1993) Clin. Chem. 39:1953-1959) o fluoróforos y extintores de la fluorescencia (documento US 3.996.345).

Una interacción entre los componentes incluye una transferencia directa de energía entre los componentes, por ejemplo, mediante radiación luminosa o electrónica y mediante moléculas químicas reactivas de vida corta. También comprende adicionalmente procesos en los que la actividad de un componente se inhibe o se refuerza con la actividad de otro o de varios componentes, por ejemplo, la inhibición o el incremento de la actividad enzimática o la inhibición, el incremento o el cambio de la radiación electromagnética emitida por el componente afectado (p. ej., desviación de la longitud de onda, polarización). La interacción entre los componentes también comprende cascadas enzimáticas. En este caso, los componentes son enzimas, en donde al menos una de las cuales proporciona el sustrato de otra, dando como resultado una mayor o menor velocidad de la reacción de conversión del sustrato acoplado.

Una interacción eficaz entre los componentes tiene lugar generalmente cuando estos están en una proximidad espacial, es decir, por ejemplo, a pocos \mum de distancia, en particular a una distancia inferior a 600 nm, preferentemente menor de 400 nm, especialmente preferida una distancia inferior a 200 nm.

Las micropartículas se emplean generalmente como fase sólida y/o como marcador. El término "micropartícula" de acuerdo con esta invención, significa partículas que tienen una diámetro aproximado de al menos 20 nm y no más de 20 \mum, normalmente entre 40 nm y 10 \mum, preferentemente entre 0,1 y 10 \mum, particularmente preferido entre 0,1 y 5 \mum, muy particularmente preferido entre 0,15 y 2 \mum. Las micropartículas pueden tener una forma regular o irregular. Pueden comprender esferas, esferoides, esferas que tienen cavidades o poros más o menos grandes. Las micropartículas pueden comprender material orgánico, material inorgánico o una mezcla o combinación de ambos. Pueden comprender material poroso o no poroso, material hinchable o no hinchable. En principio, las micropartículas pueden tener cualquier densidad; sin embargo, se prefieren las partículas que tienen una densidad cercana a la densidad del agua, tal como desde aproximadamente 0,7 hasta aproximadamente 1,5 g/ml. Las micropartículas preferidas se pueden suspender en soluciones acuosas y son estables en suspensión durante el mayor tiempo posible. Pueden ser transparentes, parcialmente transparentes u opacas. Las micropartículas pueden comprender una pluralidad de capas, tales como, por ejemplo, las partículas denominadas "core-and-shell" que tienen un núcleo y una o varias capas envolventes. El término micropartícula comprende, por ejemplo, cristales de colorante, soles de metal, partículas de sílice, partículas de vidrio, partículas magnéticas, partículas de polímeros, gotas de aceite, partículas de lípidos, dextrano y agregados proteicos. Las micropartículas preferidas son partículas que se pueden suspender en soluciones acuosas y que comprenden material polímero insoluble en agua, en particular polietilenos sustituidos. Se prefiere muy particularmente las partículas de látex fabricadas, por ejemplo, a partir de poliestireno, polímeros de ácido acrílico, polímeros de ácido metacrílico, polímeros de acrilonitrilo, acrilnitrilo/butadieno/estireno, poli(acetato de vinilo/acrilato), polivinilpiridina, cloruro de vinilo/acrilato. Son de particular interés las partículas de látex que tienen en su superficie grupos reactivos tales como, por ejemplo, grupos carboxilo, amino o aldehído que facilitan el enlace covalente, por ejemplo, de partícipes específicos en la unión, con las partículas de látex. La preparación de partículas de látex se describe, por ejemplo, en los documentos EP 0080614, EP 0227054 y EP 0246446.

El término "asociado" tiene un significado amplio y comprende, por ejemplo, un enlace covalente y uno no covalente, una unión directa y una indirecta, la adsorción a la superficie y la inclusión en una cavidad o depresión, etc. En el caso de un enlace covalente, los anticuerpos o los partícipes en la unión se unen a la fase sólida o al marcador a través de un enlace químico. Ejemplos de enlace no covalente son la adsorción a la superficie, la inclusión en cavidades o la unión de dos partícipes específicos en la unión. Además de la unión directa a la fase sólida o al marcador, los anticuerpos o los partícipes en la unión se pueden unir indirectamente a la fase sólida o al marcador a través de una interacción específica con otros partícipes específicos en la unión (véase también el documento EP-A2-0411945). Esto se ilustrará con más detalle con los ejemplos: el anticuerpo biotinilado se puede unir al marcador a través de la avidina unida al marcador; o un conjugado de fluoresceína y anticuerpo se puede unir a la fase sólida a través de anticuerpos anti-fluoresceína unidos a la fase sólida; o el anticuerpo se puede unir a la fase sólida o al marcador a través de proteínas que se unen a inmunoglobulinas.

Otro objeto de esta invención son anticuerpos de acuerdo con la invención que se emplean como un agente de diagnóstico in vitro o in vivo o como un componente de un agente de diagnóstico in vitro o in vivo.

En el caso de un agente de diagnóstico in vivo, el anticuerpo de acuerdo con la invención o el partícipe específico en la unión de acuerdo con la invención, p. ej., marcado con un isótopo radiactivo, se administra a un organismo, tal como por ejemplo, un ser humano o un animal. Se acumula preferentemente en los órganos o tejidos que contienen o producen pCT en cantidades incrementadas. A través de la detección de los lugares que tienen una intensidad de la radiación incrementada, es posible, por ejemplo, localizar focos tumorales productores de pCT y mostrarlos tridimensionalmente empleando procesos de formación de imágenes.

En el caso de un agente de diagnóstico in vitro, el analito que se va a detectar, por ejemplo, procalcitonina, se detecta en una muestra fuera del cuerpo de un ser humano o un animal vivo o se determina la concentración o la cantidad del mismo.

Una "muestra" de acuerdo con la invención, significa el material que presumiblemente contiene la sustancia que se va a detectar (para ejemplos del término "analito", véase el documento EP-A2-0515194, páginas 8 a 15). El término muestra comprende, por ejemplo, fluidos o tejidos biológicos, en particular de seres humanos y animales, tales como sangre, plasma, suero, esputo, exudado, lavado bronquioalveolar, fluido linfático, fluido sinovial, fluido seminal, moco vaginal, heces, orina, fluido cerebroespinal, pelos, piel, muestras de tejidos o secciones de tejidos. Además comprende muestras de cultivos celulares, fluidos o tejidos vegetales, muestras forenses, muestras de agua y de agua residual, alimentos, medicamentos. Eventualmente hay que tratar previamente las muestras para que el analito esté disponible para el método de detección o para retirar constituyentes que interfieren con la muestra. Un tratamiento previo tal de las muestras, puede incluir la eliminación y/o la lisis de células, la precipitación, la hidrólisis o la desnaturalización de constituyentes de la muestra, tales como por ejemplo, proteínas, centrifugación de las muestras, tratamiento de la muestra empleando disolventes orgánicos tales como, por ejemplo, alcoholes, en particular metanol; tratamiento de la muestra empleando detergentes. La muestra se transfiere frecuentemente a otro medio, generalmente acuoso que, si es posible, no debe interferir con el método de detección.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden emplear en un método para la detección cuantitativa o cualitativa de un analito, procalcitonina, en una muestra.

En un ensayo cuantitativo, se mide la cantidad o la concentración del analito en la muestra. La expresión "ensayo cuantitativo" también comprende métodos semicuantitativos que pueden medir sólo la cantidad o la concentración aproximada del analito en la muestra, o que sirven sólo para indicar cantidades o concentraciones. Un ensayo cualitativo significa detectar si el analito está presente en la muestra o indicar que la concentración de analito en la muestra es inferior o superior a un umbral particular o a varios umbrales particulares.

Empleando los anticuerpos de acuerdo con la invención es posible detectar pCT, por ejemplo, inmunohistoquímicamente en frotis celulares, en secciones de tejido o en muestras de tejido. Por tanto, por ejemplo, las criosecciones o las secciones de parafina se preparan a partir del tejido que se va a examinar. Las secciones se incuban con los anticuerpos de acuerdo con la invención, bajo condiciones de reacción adecuadas. Después de separar con lavado los anticuerpos no unidos de acuerdo con la invención, se detectan las áreas a las que se unen los anticuerpos de acuerdo con la invención. Si los anticuerpos se proporcionan, por ejemplo, con marcadores fluorescentes, no es necesario realizar ninguna etapa intermedia. Alternativamente, los anticuerpos unidos de acuerdo con la invención, se pueden detectar empleando partícipes específicos en la unión adecuados que se asocian con un marcador y que son capaces de unirse a los anticuerpos unidos de acuerdo con la invención.

La detección de pCT con los anticuerpos de acuerdo con la invención, se puede realizar también con métodos tales como, por ejemplo, transferencia de tipo Western, transferencia de puntos, inmunoelectroforesis, electroforesis con inmunofijación, electroinmunodifusión, inmunoprecipitación, inmunodifusión radial, inmunofijación, inmunocromatografía, aglutinación con látex, prueba turbidimétrica o nefelométrica, ensayo de unión homogénea o heterogénea, ensayo de una o de dos etapas, ensayo de tipo sándwich, ensayo indirecto, ensayo competitivo, pruebas en el "punto de atención", etc. Estos y otros métodos de detección se describen, por ejemplo, en "Labor und Diagnose", compilador L. Thomas, TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt, 1998, capítulo 60 o en "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques", compilador T. Chard, Elsevier, Ámsterdam, 1987.

En los ensayos de ligación, el analito, si está presente en la muestra, se une a uno o a varios partícipes específicos en la unión al analito, y se forman los complejos analito/partícipe(s) específico(s) del analito.

En los ensayos de ligación homogéneos, los analitos libres y los unidos al complejo no se separan. Ejemplos de inmunoensayos homogéneos (véase también Bogulaski & Li (1982) Applied Biochemistry and Biotechnology, 7:401-414) son muchos métodos turbidimétricos o nefelométricos, pudiendo estar asociados los partícipes específicos en la unión, empleados en la detección, con partículas de látex; ensayos EMIT®, ensayos CEDIA®; inmunoensayos de polarización fluorescente; inmunoensayos con tecnología LOCI (del inglés, "Luminiscent Oxygen Channeling Immunoassays") (documento de patente EP-A2-0515194; Ullman y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., 91:5426-5430; Ullman y col. (1996) Clinical Chemistry, 42:1518-1526); etc.

Los ensayos de ligación heterogénea comprenden una o varias etapas de separación y/o etapas de lavado. La separación se puede realizar, por ejemplo, con inmunoprecipitación, precipitación empleando sustancias tales como polietilenglicol o sulfato de amonio, filtración, separación magnética, unión a una fase sólida, tal como, por ejemplo, a un tubo de ensayo, una perla, a un pocillo de una placa de microtitulación o a un papel de filtro o un papel de cromatografía. En los ensayos de ligación heterogénea, frecuentemente un partícipe específico en la ligación está asociado con un componente de un sistema generador de señales y un partícipe específico en la ligación está asociado con una fase sólida (véase también el documento EP-A2-0411945 en relación con la ligación indirecta). En este caso, los partícipes específicos en la ligación pueden ser diferentes o iguales, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal específico del analito se puede emplear como agente de captura (por ejemplo, como un anticuerpo en la fase sólida) y como un anticuerpo marcado si el analito contiene más de un epítopo.

En los ensayos heterogéneos de tipo sándwich, el analito se une generalmente a un partícipe especifico en la unión, asociado a una fase sólida y a un partícipe específico en la unión asociado con un componente de un sistema generador de señales. En el caso de un inmunoensayo de tipo sándwich, los partícipes específicos en la unión pueden ser anticuerpos específicos del analito o, si el analito mismo es un anticuerpo, el antígeno y/o un "antígeno modificado", por ejemplo, un antígeno marcado, un fragmento de antígeno, un análogo de antígeno. Ejemplos de tales complejos de tipo sándwich son: anticuerpo de en fase sólida-analito-marcador del anticuerpo o antígeno en fase sólida-analito (= anticuerpo)-marcador del antígeno.

Otra realización de un inmunoensayo heterogéneo es el inmunoensayo indirecto: en este caso, el analito es un anticuerpo. Uno de los partícipes específicos en la unión es el antígeno del mismo y/o un antígeno modificado y el otro partícipe específico en la unión es un anticuerpo que se une al analito y/o una proteína que se une a una inmunoglobulina. Ejemplos de tales complejos que se pueden formar en un inmunoensayo indirecto son: anticuerpo anti-IgM en fase sólida-analito (= IgM anti-HBsAg)-marcador de HBsAg o HBsAg en fase sólida-analito (IgG anti-HBsAg)-marcador de la proteína A.

En un inmunoensayo competitivo heterogéneo, el analito de la muestra compite con un "analito modificado", por ejemplo, un analito marcado, un fragmento de analito, un análogo de analito, etc., por un número limitado de sitios de unión específicos del analito. Ejemplos que ilustran el principio son: (i) el analito de la muestra compite con un analito asociado con un componente de un sistema generador de señales, por la unión a un anticuerpo específico del analito asociado a la fase sólida, o (ii) el analito de la muestra compite con un analito asociado a la fase sólida para unirse a un anticuerpo específico del analito, asociado con un componente de un sistema generador de señales.

Los ensayos de tipo sándwich, los ensayos competitivos y los ensayos indirectos también se pueden realizar como métodos de ensayos homogéneos (véase también el documento de patente EP-A2-0515194).

La expresión "pruebas en el punto de atención" o "pruebas POC" (del inglés, "point-of-care test") tiene un significado amplio. Incluye pruebas que no necesitan un dispositivo analizador o de medición separado para realizar o evaluar la prueba. En muchos casos, las pruebas POC se basan en métodos de inmunocromatografía, separaciones de complejos inmunes por filtración y/o técnicas de inmunofijación. Las pruebas POC se emplean en particular en mediciones en el sitio de atención, por ejemplo, en la cama del hospital o en el hogar, para el médico de urgencias y/o el médico de cabecera y menos para el laboratorio a gran escala. Las pruebas POC también las pueden realizar en particular personas sin una formación técnica asistencial fundamental y sin experiencia en el campo de la medicina de laboratorio. La expresión "pruebas POC" de acuerdo con esta invención, también significa las llamadas pruebas en el hogar o pruebas OTC que las pueden realizar personas inexpertas en medicina, son, por ejemplo, diversas pruebas de embarazo vendidas para uso en el hogar. Además, los pruebas POC se refieren, por ejemplo, a la detección de marcadores del infarto cardiaco, drogas, medicamentos, marcadores de infecciones y marcadores de inflamación. En muchas pruebas POC, los partícipes específicos en la unión se asocian con tiras o discos de filtro o de cromatografía, durante el curso de la prueba. Una reacción positiva o negativa de la prueba se puede asociar, por ejemplo, con la aparición o no de una banda coloreada en un campo particular de la prueba y/o con la aparición o no de un símbolo particular, por ejemplo, "+", "-" y/o con la intensidad de la señal medida respectiva.

Una prueba POC para la pCT, por ejemplo, se puede establecer del modo siguiente: la muestra y los anticuerpos marcados que son capaces de unirse a pCT, se aplican a una tira del ensayo. Los marcadores adecuados son, por ejemplo, partículas de látex coloreadas, oro coloidal, enzimas, etc. Si la pCT está presente en la muestra, se formarán los complejos pCT/anticuerpo. Estos complejos se mueven hacia una zona en la que los anticuerpos son capaces de unirse a diferentes epítopos de pCT, gracias a la fuerza capilar, y se fijan, por ejemplo, como una banda o se fijan durante el curso de la prueba (por ejemplo, a través de un puente de biotina/avidina). Los complejos marcados de pCT/anticuerpo se unen en esta zona y forman un complejo de tipo sándwich con los anticuerpos fijados. La intensidad de la señal marcada es proporcional a la concentración de la muestra de pCT en este caso. En un método de prueba POC competitiva, la pCT y/o los fragmentos de pCT pueden estar fijados por ejemplo, en una zona de la tira del ensayo o se fijarán durante el curso del ensayo. Esta pCT fijada competiría con la pCT de la muestra para unirse a los anticuerpos anti-pCT marcados. Alternativamente, los anticuerpos anti-pCT fijados y la pCT marcada también se pueden emplear para construir una prueba competitiva para pCT.

Una realización particularmente preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, es un ensayo nefelométrico o turbidimétrico, en particular un ensayo que emplee anticuerpos de acuerdo con la invención, preferentemente asociados con partículas de látex.

Otro objeto de acuerdo con la invención es un equipo de reactivos para un ensayo que contiene uno o varios de los anticuerpos de acuerdo con la invención. Un equipo de reactivos tal contiene generalmente todos los componentes del ensayo o sólo algunos componentes, en forma empaquetada. Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden asociar, por ejemplo, con una o con varias fases sólidas y/o con uno o con varios componentes de un sistema generador de señales. El equipo de reactivos del ensayo puede contener, por ejemplo, patrones, testigos, así como otros reactivos tales como, por ejemplo, tampones, soluciones de lavado, soluciones que inducen la señal medida y/o sustrato de la enzima; cubetas, pipetas y/o instrucciones. Un equipo de reactivos para el ensayo particularmente preferido contiene anticuerpos de acuerdo con la invención, asociados a partículas de látex.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención también se pueden emplear para la cromatografía de afinidad. La expresión "cromatografía de afinidad" significa un método según el cual sustancias, en particular biopolímeros, se purifican y se aíslan y que se basa en el hecho de que muchas sustancias se pueden unir a sus partícipes específicos en la unión de forma selectiva, no covalente o reversible. El principio del procedimiento implica que el partícipe específico en la unión esté unido, generalmente de forma covalente, a una matriz insoluble (p. ej., vidrios porosos, geles a base de gel de agarosa, celulosa, dextrano, polímero y sílice) y que se ponen en contacto con una muestra que contiene la sustancia. La sustancia buscada se inmoviliza y se retiene por su interacción específica con el partícipe específico en la unión unido a la matriz, mientras que todas las demás sustancias contenidas en la muestra se eliminan por elución. El biopolímero buscado se desprende a continuación de la matriz, empleando un eluyente adecuado que anula la unión no covalente entre la sustancia y el partícipe específico en la unión (véase también, E. Buddecke (1989) Grundrisse der Biochemie, Walter de Gruyter, capítulo 7 "Proteine").

Esta invención comprende adicionalmente anticuerpos de acuerdo con la invención en un medio para inyección estéril, farmacéuticamente adecuado. Un medio para inyección estéril, farmacéuticamente adecuado significa, por ejemplo, una solución exenta de pirógenos estéril, por ejemplo solución salina u otra solución con electrolitos, tales como las que se emplean convencionalmente para la administración de medicamentos, de vacunas o de medios de contraste por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea.

Otro objeto de la invención es el uso de los anticuerpos de acuerdo con la invención como agentes de diagnóstico, como ingrediente de un agente de diagnóstico, como medicamentos o como un ingrediente de un medicamento. La invención también incluye el uso de los anticuerpos de acuerdo con la invención y/o los partícipes específicos en la unión de acuerdo con la invención, para el tratamiento del SIRS (síndrome de la respuesta inflamatoria sistémica), la sepsis y/o tumores, en particular, tumores malignos que producen pCT. El SIRS es una respuesta inflamatoria sistémica a lesiones del tejido con los síntomas de disfunción orgánica remota. La invención incluye adicionalmente un procedimiento para preparar un medicamento, por ejemplo, para el tratamiento de tumores, sepsis y/o SIRS, que contiene los anticuerpos de acuerdo con la invención.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden emplear para el tratamiento intracorpóreo o también extracorpóreo. Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden tener su actividad reforzada a través de isótopos radiactivos y/o por la unión de sustancias farmacológicamente activas. El documento WO 98/33524 describe la aplicación terapéutica de anticuerpos anti-pCT con mayor detalle. Además, la pCT se podría eliminar de la sangre de un paciente, por ejemplo, por un procedimiento análogo a la diálisis, poniendo en contacto la sangre o el plasma de forma extracorpórea con anticuerpos estériles y fijados de acuerdo con la invención.

Otro objeto de la invención es un procedimiento para preparar un anticuerpo de acuerdo con la invención que comprende emplear para la inmunización uno o varios péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser.

El término "péptidos" comprende amidas ácidas que se descomponen en aminoácidos en la hidrólisis, por ejemplo, polímeros de aminoácidos tales como, por ejemplo, polipéptidos, oligopéptidos, proteínas o fragmentos de proteínas. Las moléculas con no más de diez aminoácidos ligados se denominan en general oligopéptidos, con más de diez se denominan polipéptidos. Un oligopéptido según la definición de esta invención también comprende cadenas de aminoácidos de hasta aproximadamente 20 aminoácidos.

\global\parskip0.900000\baselineskip

Un objeto de esta invención es también el oligopéptido con la secuencia de aminoácidos Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser. Este péptido se puede emplear como antígeno de la inmunización para la preparación de los anticuerpos de acuerdo con la invención.

Los péptidos empleados como antígeno de inmunización se pueden utilizar para la inmunización en forma no unida y/o unida a un soporte. Los soportes típicos son, por ejemplo, proteínas tales como por ejemplo, ovoalbúmina, albúmina o hemocianina, o polímeros tales como, por ejemplo, polietilenglicol, poliacrilamida o poli(d-glutamina-d-lisina). Los péptidos se pueden unir a este soporte, por ejemplo, empleando carbodiimida o glutaraldehído o también empleando un reactivo bifuncional que también puede actuar como un espaciador (para los ejemplos y los métodos de acoplamiento, véase, p. ej., Wong S. (1993) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press Inc., Boca Raton).

El antígeno de inmunización, por ejemplo, se puede suspender en solución salina tamponada con fosfato y tratar con coadyuvante de Freund. Esta emulsión se puede administrar a continuación, por ejemplo, por vía intradérmica, intraperitoneal y/o subcutánea, a un animal, por ejemplo un conejo, un ratón una rata, una cobaya, un caballo, una oveja, una cabra, un pollo, etc. Inyecciones de refuerzo pueden ayudar a incrementar la respuesta inmune, siendo también posible que el antígeno de la inmuniación esté emulsionado con coadyuvante incompleto de Freund.

Dependiendo del fin deseado para la aplicación, es ventajoso emplear sólo fragmentos del anticuerpo, tales como por ejemplo, Fab, Fv, F(ab)'_{2}, Fab'. Estos se pueden producir, por ejemplo, mediante métodos de corte enzimático conocidos por los expertos en la técnica (véase también, p. ej., Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor).

Los sitios de unión al antígeno de un anticuerpo se localizan en los denominados dominios variables, codificados por los genes V. Empleando métodos de ingeniería genética bien conocidos (véase, p. ej., Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 2ª edición; McCafferty y col. (1990) Nature 348:552-554) también es posible determinar la secuencia de ácidos nucleicos correspondiente de un anticuerpo de acuerdo con la invención y de este modo también la secuencia de aminoácidos correspondiente, si todavía no se conoce por la secuenciación de los aminoácidos. Para tales análisis, se puede emplear como material de partida células de hibridoma o células inmunes que producen anticuerpo de animales inmunizados.

Conociendo la secuencia de ácidos nucleicos y/o la secuencia de aminoácidos, es posible entonces emplear métodos convencionales de ingeniería genética y de biología molecular (véase también, Johnson & Chiswell (1993) Current Opinion in Structural Biology, 3:564-571), para preparar anticuerpos humanizados, quiméricos, bi u oligoespecíficos y péptidos obtenidos a partir de la "región determinante de la complementariedad" (unidades mínimas de reconocimiento), fragmentos monocatenarios y/o productos de fusión funcionales, por ejemplo, estructuras artificiales de anticuerpo-enzima preparadas por recombinación (véase, p. ej., Larrick & Fry (1991) Human Antibodies and Hybridomas, 2:172-189; Kitano y col., (1986) Appl. Microbiol. Biotechnol., 24:282-286; Thompson y col. (1986) J. Immunol. Methods, 94 7-12) que se unen a procalcitonina pero no se unen a calcitonina libre, catacalcina libre y N-procalcitonina libre. Empleando estos péptidos incluidos en el término "anticuerpo", es posible, por ejemplo, conseguir una disminución de la inmunogenicidad y/o una eficacia mejorada cuando se administran como medicamento o como agente de diagnóstico in vivo, y/o serán ventajosos cuando se emplean como un agente de diagnóstico in vitro o como parte del mismo. Los anticuerpos también se pueden preparar empleando, cuando es adecuado, métodos de ingeniería genética en células vegetales tales como, por ejemplo, células de levadura (Fischer y col. (1999) Biol. Chem., 380: 825-839; Hiatt y col. (1982) Genetic Engineering, 14:49-64), células animales y procariotas (véase, p. ej., el documento WO 95/25172) y células humanas aisladas.

Otro objeto de esta invención es la línea celular de hibridoma 98-31/04. Esta línea celular de hibridoma se depositó el 16-12-1999 ante la DSMZ "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, Alemania, con el número de entrada DSM ACC2437.

La Fig. 1 muestra una representación gráfica de pCT humana y los productos de su escisión proteolítica; aa= aminoácido(s).

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis peptídica

Dos péptidos "P1" y "P2" que se corresponden con los aminoácidos 53-64 y 88-99 de la procalcitonina humana (véase también la Fig. 1) y que tienen la secuencia:

P1: Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser

P2: Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser

\global\parskip1.000000\baselineskip

se sintetizaron del modo siguiente:

P1 y P2 se sintetizaron en un sintetizador peptídico de Applied Biosystems, modelo 431A con una reacción química de aminoácidos 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (fmoc). Los grupos protectores presentes se eliminaron por escisión con tratamiento con ácido trifluoroacético.

Ejemplo 2 Acoplamiento de los péptidos a un soporte

Los péptidos se acoplaron a seroalbúmina bovina (BSA, Centeon Pharma, Marburg, Alemania) (véase también Rusin y col. (1992) Biosens. Bioelectron., 7:367-373; Kitagawa y col. (1983) J. Biochem., 94:1165-1172).

En concreto: 100 mg de BSA en 20 ml de tampón de borato de litio 0,1 M, pH 8,0, se mezclaron con 41,8 mg de N-gamma-maleimidobutiriloxisuccinimida (GMBS) (Cabiochem-Novabiochem GmbH, Bad Soden, Alemania) y se incubaron a 20ºC durante 30 minutos. A continuación, en la mezcla de reacción se ajusta el pH con NaH_{2}(PO_{4}) 0,1 M, pH 6,0 (solución BSA-GMBS).

Se disuelven 17,5 mg de P1 o de P2 en 1,75 ml de tampón de borato de litio 0,1 M, pH 8,0 y 2,1 mg de anhídrido de ácido S-acetilmercaptosuccínico (Fluka Chemie GmbH, Deisenhofen, Alemania) disueltos en dioxano (22,2 mg/ml) se añaden y se incuban a 20ºC durante 30 minutos. Posteriormente, se añaden 475 \mul de solución de hidroxilamina 1 M y se incuba a 20ºC durante otros 15 minutos. La mezcla de reacción obtenida, se mezcla con 16 ml de solución de BSA/GMBS y se incuba a 20ºC durante 2 horas. Después, la reacción se detiene añadiendo solución de N-etilmaleimida 0,1 M y el pH se ajusta con solución salina tamponada con fosfato a pH 7,2.

Ejemplo 3 Preparación de anticuerpos monoclonales a) Inmunización de los ratones

Se inmunizó intraperitonealmente a cada uno de los ratones BALB/c con 20 \mug de conjugado P1-BSA y conjugado P2-BSA en coadyuvante completo de Freund. Después de 4 semanas se reforzó con 20 \mug de conjugado P1-BSA o 20 \mug de conjugado P2-BSA en coadyuvante incompleto de Freund (ICN Biomedical GmbH, Eschwege, Alemania) y después de 8 semanas con 20 \mug de conjugado P1-BSA o 20 \mug de P2-BSA sin coadyuvante de Freund. Los tres últimos días antes de la fusión, los ratones se reforzaron por vía intravenosa con 20 \mug de conjugado P1-BSA o 20 \mug de conjugado P2-BSA.

b) Fusión

Después de sacrificar los ratones por inhalación de CO_{2}, se extirparon los bazos y se prepararon suspensiones celulares aisladas en medio de Eagle modificado con Dulbecco, exento de suero (DMEM, CC Pro GmbH, Neustadt/W, Alemania). Las células se centrifugaron (652 g) y se lavaron dos veces en DMEM. A continuación, se determinó el número de células mediante tinción con azul de tripano. A aproximadamente 10^{8} células de bazo se añadieron 2 x 10^{7} células de mieloma (Sp2/0). Después de centrifugar (360 g) se eliminó el material sobrenadante, se añadió 1 ml de solución de polietilenglicol (PEG 4000, Merck Eurolab, Bruchsal, Alemania; aproximadamente al 50% en DMEM) al sedimento celular y las células resuspendidas se incubaron durante 1 minuto a 37ºC. Posteriormente se añadieron gota a gota aproximadamente 10 ml de DMEM y se incubó a temperatura ambiente durante 2 a 4 minutos. Las células fusionadas se separaron por centrifugación (326 g) y el sedimento se resuspendió en DMEM + 20% de FBS (suero bovino fetal, Bio Whittaker Europe, Verviers, Bélgica) + solución HAT (CC Pro GmbH, Neustadt/W, Alemania) y se cargaron en placas de cultivo con 24 pocillos (Costar). La concentración celular aproximada por pocillo era 5 x 10^{4} hasta 5 x 10^{6} células.

Dos a tres semanas después, se retiraron las colonias celulares resultantes (híbridos) y se transfirieron a placas de cultivo nuevas.

c) Determinación de la especificidad de los anticuerpos

La especificidad de los anticuerpos liberados en el cultivo celular se sometió a ensayo en una primera etapa, empleando placas de microtitulación revestidas con antígeno de inmunización (Nunc, tipo B), revestimiento 0,2 \mug/ml \approx 0,003 \mug/pocillo.

En cada pocillo de la placa de microtitulación se pipetearon 100 \mul de material sobrenadante del cultivo celular (dilución 1:2) y se incubaron a +15 hasta +25ºC durante 1 hora. Después de lavar dos veces las placas empleando la solución de lavado POD (OSEW; Dade Behring, Marburg, Alemania), se introdujeron 100 \mul de conjugado de IgG anti-ratón/F(ab')_{2}-POD (Dade Behring, Marburg, Alemania) en cada pocillo y se incubaron a +15 hasta +25ºC durante 1 hora. Después de lavar otra vez las placas dos veces, se introdujeron 100 \mul de solución de cromógeno TMB (Dade Behring, Marburg, Alemania en cada pocillo y se incubaron a +15 hasta +25ºC durante otros 30 minutos. Después de la incubación, se introdujeron 100 \mul de solución de detención POD (Dade Behring, Marburg, Alemania) en cada pocillo y se evaluó la placa de microtitulación a 450 nm en un BEP II (Behring ELISA Procesador II, Dade Behring, Marburg, Alemania).

En una segunda etapa, los híbridos se sometieron a ensayos tal y como se ha descrito anteriormente, empleando placas de microtitulación (Nunc, tipo B) revestidas con los siguientes péptidos:

i.

pCT humana recombinante (0,03 \mug/pocillo). La preparación de la pCT recombinante se describe con detalle en el documento de solicitud de patente presentado de forma paralela el 22 de diciembre de 1999 ante la Oficina Alemana de Patentes y Marcas, con el título "Procalcitonina humana, su preparación y su uso" (número de expendiente 199 62 434.8). Un plásmido adecuado para la expresión de pCT en E. coli se depositó en la DSMZ "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" con el número de entrada DSM 13203, el 16 de diciembre de 1999. Este plásmido se puede transformar en una cepa de E. coli adecuada (p. ej. JM109; Stratagene, LaJolla, EE.UU.) empleando métodos convencionales (Current Protocolos in Molecular Biology, Wiley, 1997). Los clones se pueden obtener después de extender la mezcla de la transformación sobre placas de agar LB que contienen 50 \mug/ml de ampicilina para la selección. La procalcitonina se puede expresar empleando el siguiente procedimiento: células JM109 de nuevo aporte, transformadas con el plásmido de expresión, se dejaron crecer durante una noche con agitación en medio LB con 100 \mug/ml de ampicilina a 37ºC y a continuación se diluyeron 1:50 en 1 l de medio LB de nuevo aporte (100 \mug/ml de ampicilina) y se continuó agitando a 37ºC, y cuando se obtuvo una DO_{600} de 0,4, se indujo con IPTG 2 mM durante 3 h. Manteniendo estas condiciones óptimas, se obtuvieron aproximadamente 13 mg de proteína de fusión de forma reproducible, a partir de 1 l de cultivo después de la purificación bajo condiciones naturales, a través de cromatografía de afinidad a metal, según las instrucciones del fabricante (Talon Metal Affinity Resin, Clontech, Palo Alto, EE.UU.) y una filtración en gel posterior sobre Superdex 75 HiLoad (Amersham, Pharmacia).

ii.

Conjugado de calcitonina y BSA humana (0,5 \mug/pocillo, Bachem, prod. nº: H-2250).

iii.

Conjugado de catacalcina y BSA humana (PDN-21) (0,5 \mug/pocillo, Peninsula, prod. nº: 6004).

iv.

Conjugado de calcitonina BSA y péptido N-terminal flanqueante (0,5 \mug/pocillo, Bachem, prod. nº: H-3076) = N-procalcitonina humana.

Los resultados se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1 Determinación de la especificidad del anticuerpo a través de la valoración de las placas de microtitulación en un BEP II (Procesador II de ELISA de Behring) a 450 nm

1

d) Clonación

Células híbridas aisladas que producían los anticuerpos de acuerdo con la invención (que se unen a la pCT humana pero no a la calcitonina libre, a la catacalcina libre ni a la N-procalcitonina libre) se clonaron empleando un micromanipulador (Leitz, Wetzlar, Alemania). El clon 98-31/04 así obtenido, se depositó ante la DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, Alemania, con el número de entrada DSM ACC2437, el 16 de diciembre de 1999.

e) Determinación de la subclase de anticuerpo

La subclase del anticuerpo 98-31/04 se determinó como IgG1, mediante el equipo de reactivos para la determinación del isotipo del anticuerpo monoclonal IsoStrip®-Ratón de Boehringer Mannheim, Alemania.

f) Producción de anticuerpos

Para la producción de grandes cantidades de anticuerpos, se transfirieron los clones celulares correspondientes a frascos rotativos (Corning Costar Deutschland, Bodenheim) y se expandieron hasta obtener el volumen final deseado a 37ºC. A continuación, la suspensión del frasco rotativo se filtró a través de 0,22 \mum, para eliminar las células. La solución con anticuerpos exenta de células se concentró a través de ultrafiltros (límite 30.000 dalton) y posteriormente se purificó.

g) Purificación de los anticuerpos

En la solución de anticuerpos obtenida, se ajustó el pH con tampón fosfato 0,14 M a pH 8,6 y se aplicó la solución a una columna de cromatografía cargada con rProtein A Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia) (se emplea 1 ml de rProtein A Sepharose Fast Flow por 10 mg del anticuerpo que se va a purificar). Todos los componentes no unidos se retiraron lavando la columna con tampón fosfato 0,14 M, pH 8,6. El anticuerpo unido se eluye de la columna con ácido cítrico 0,1 M, pH 3,0 y se dializó frente a acetato sódico 0,05 M + NaCl 0,5 M + Tris 0,05 M + 0,01% de azuro sódico pH 7,0.

Ejemplo 4 Detección de pCT en una muestra a) Unión del MAb a partículas de látex

Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención y un anticuerpo monoclonal anti-catacalcina se unieron a cada partícula de látex preparada según el documento de patente EP-0246 446 con un diámetro de 250 a 310 nm:

El polímero de látex utilizado se diluyó hasta tener un contenido en sólidos del 4% en peso empleando agua destilada. Los anticuerpos que se iban a unir, se diluyeron hasta tener un contenido en proteínas de 5 mg/ml, empleando acetato sódico 0,05 M + NaCl 0,5 M + Tris 0,05 M + 0,01% de azuro sódico pH 7,0. Se mezcló 1 ml del polímero mencionado anteriormente con 200 \mul de solución de anticuerpo. A continuación se añadieron 0,050 ml de una solución de Tween 20 al 20% (Merck Eurolab, Darmstadt, Alemania) y se mezcló todo de nuevo. Se añadió a la misma 0,025 ml de HCl 1 N, dando como resultado un pH de aproximadamente 3. Después de incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, se añadieron 0,25 ml de tampón fosfato 1 M pH 6,5 y 0,25 ml de solución de cianoborohidruro sódico (25 mg/ml) y se mezcló bien. Esto fue seguido de una incubación a temperatura ambiente durante una hora.

Esta mezcla para cargar se centrífugo a continuación a aproximadamente 50.000 g durante 30 minutos. El material sobrenadante se retiró. El residuo se resuspendió en 4 ml de tampón imidazol pH 8,1 (5 g/l de imidazol, 40 g/l de sacarosa, 1 g/l de albúmina humana). Esto fue sometido a ultrasonidos (Bronson Sonyfier B15) durante 30 segundos. El reactivo dispersado de nuevo de este modo, se diluyó en una relación de volumen de 1:7,5 empleando el tampón imidazol mencionado anteriormente y se sometió de nuevo a ultrasonidos durante 30 segundos.

b) Detección de pCT

Los reactivos preparados de acuerdo con el Ejemplo 4a), mediante la unión del anticuerpo de acuerdo con la invención y el anticuerpo anti-catacalcina, a partículas de látex, se mezclaron en una relación de volumen de 1+1 y se emplearon para medir la pCT en los sueros de pacientes en un analizador de nefelometría de Behring (BNA, Dade Behring, Marburg, Alemania). El reactivo mezclado se aglutinó mezclando con las muestras que contenían pCT. La intensidad de la luz dispersada en el BNA es dependiente de la concentración de pCT en la muestra. Para la medición se mezclaron 100 \mul de muestra (1 suero normal, 3 muestras de pacientes que contenían pCT (BRAHMS LUMItest® PCT, > 100 ng/ml de pCT) con 100 \mul de N-Diluens (Dade Behring, Marburg, Alemania) y 40 \mul del reactivo mezclado en una cubeta de reacción y el cambio en la señal medida (en bits) en el BNA se midió después de 12 minutos. Los resultados se exponen en la Tabla 2.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

2

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Dade Behring Marburg GmbH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Anticuerpos dirigidos contra la procalcitonina, su preparación y su uso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> MA1237

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 19962417.8

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 22-12-1999

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 10016277.0

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 03-04-2000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 10041215.7

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 22-08-2000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Lys Arg Cys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ser Pro Arg Ser Lys Arg Cys Gly Asn Leu Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Gly Lys Lys Arg Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Gly Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Met Ser Ser}

Claims (10)

1. Anticuerpo que se une a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser, caracterizado porque se une a la procalcitonina pero no se une a la calcitonina libre, a la catacalcina libre ni a la N-procalcitonina libre y porque es producido por la línea de células de hibridoma 98-31/04 (DSM ACC2437).

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo está asociado a una fase sólida y/o a un componente de un sistema generador de señales.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, para emplear como agente de diagnóstico in vitro o in vivo o como componente de un agente de diagnóstico in vitro o in vivo.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1, para emplear en un procedimiento para detectar de forma cuantitativa o cualitativa la procalcitonina en una muestra.

5. Anticuerpo según la reivindicación 1, para emplear en cromatografía de afinidad.

6. Equipo de reactivos que contienen el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1.

7. Procedimiento para la preparación del anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque para la inmunización se emplea el péptido que tiene la secuencia de aminoácidos Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser y porque se escoge el anticuerpo que se une a la procalcitonina pero no se une a la calcitonina libre, a la catacalcina libre ni a la N-procalcitonina libre.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el péptido utilizado para la inmunización se encuentra fijado a un soporte.

9. Línea celular de hibridoma con la designación 98-31/04 que se ha depositado ante la DSMZ, con el número de entrada DSM ACC2437.

10. Péptido con la secuencia de aminoácidos Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser.