DE10041215A1 - Gegen Procalcitonin gerichtete Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung - Google Patents
Gegen Procalcitonin gerichtete Antikörper, ihre Herstellung und VerwendungInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft gegen Procalcitonin gerichtete Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung insbesondere in Therapie und Diagnostik. Die Antikörper sind dadurch gekennzeichnet, daß sie an Procalcitonin nicht jedoch an freies Calcitonin, freies Katacalcin und freies N-Procalcitonin binden.
Description
Die Erfindung betrifft gegen Procalcitonin gerichtete Antikörper, ihre Herstellung und
Verwendung.
Procalcitonin ("pCT") ist ein aus 116 Aminosäuren bestehendes Protein mit einem
Molekulargewicht von ca. 13000 Dalton. Es stellt das Prohormon von Calcitonin dar,
welches unter normalen Stoffwechselbedingungen in den C-Zellen der Schilddrüse
gebildet und sezerniert wird. Die Synthese von pCT und Calcitonin beginnt mit der
Translation eines 141 Aminosäuren umfassenden Vorläuferpeptides, dem
Preprocalcitonin ("Pre-pCT"). Die Aminosäuresequenz von menschlichem Pre-pCT
wurde 1984 von Moullec et al. in FEBS Letters, 167: 93-97 beschrieben. Nach
Abspaltung des Signalpeptides (ersten 25 Aminosäuren von Pre-pCT) entsteht pCT.
Bei Gesunden wird durch spezifische Proteolyse aus pCT intrazellulär das Hormon
Calcitonin (Aminosäuren 60-91 der pCT-Aminosäuresequenz) sowie das N-
Procalcitonin (Aminosäuren 1-57 der pCT-Aminosäuresequenz) und das Katacalcin
(Aminosäuren 96-116 der pCT-Aminosäuresequenz) gebildet (s. a. Conlon et al.
(1988) Biochem. J., 256: 245-250). Das pCT sowie dessen Fragmente wurden
insbesondere bei bestimmten Tumorerkrankungen (Ghillani et al. (1989) Cancer
Research, 49: 6845-6851) sowie bei Sepsis (EP-B1-0 656 121) und SIRS ("systemic
inflammatory response syndrome") (Snider et al. (1997) J. Investig. Med., 45: 552-
560) in erhöhter Konzentration im Serum bzw. Plasma von Patienten nachgewiesen.
Bei der typischen Sepsis werden Bakterien von einem Herd aus ständig oder
schubweise in die Blutbahn abgegeben. Die klinischen Erscheinungen werden durch
Endotoxin oder durch andere pyrogene und toxische Substanzen in ihrer Interaktion
mit Körpermechanismen verursacht. Der akute Einbruch löst Schüttelfrost und in
schweren Fällen eine Schockreaktion aus. Sonderformen des septischen Schocks
sind das Waterhouse-Friderichsen-Syndrom und das Toxinschocksyndrom (TSS).
Das TSS ist als ein akutes Krankheitsbild bei Staphylokokken-Infektionen bekannt,
das durch ein spezielles Staphylokokken-Toxin hervorgerufen wird. Eine schwere
Sepsis entwickelt sich relativ häufig bei Patienten mit schweren Grunderkrankungen
wie z. B. Tumorerkrankungen, schweren Verbrennungen und Traumen.
Die Bedeutung des Nachweises der Erreger im Blut ("positive Blutkultur,
Bakteriämie") ist für die Sepsisdiagnose in den Hintergrund getreten, da in der Regel
nur in 20 bis 40% der Sepsisfälle die Blutkultur positiv ist. Der Sepsisbegriff hat sich
deshalb einem Wandel unterzogen. Der moderne Begriff "Sepsis" beschreibt ein
klinisches Syndrom, welches in der Regel Fieber, Leukozytose,
Bewußtseinsveränderungen, einen hyperdynamischen Kreislauf ("warmer Schock")
und einen hypermetabolischen Zustand umfaßt, wobei eine positive Blutkultur als
Voraussetzung für die Diagnose einer Sepsis nicht mehr erforderlich ist.
In WO 98/33524 wird vorgeschlagen, Antikörper, die an pCT binden, zur Therapie
von Sepsis und SIRS einzusetzen.
Über lange Jahre wurden polyklonale Antikörper, die durch Immunisierung mit
Calcitonin gewonnen wurden, zum Nachweis des sogenannten immunreaktiven
Calcitonins, welches neben Calcitonin auch das Procalcitonin und weitere
Bruchstücke des Procalcitonins umfaßt, verwendet. Durch die Immunisierung mit
synthetischen Peptiden, deren Aminosäuresequenz mit der Sequenz von
Teilabschnitten des Procalcitonins übereinstimmt, gelang es verschiedene
monoklonale Antikörper herzustellen, die an verschiedene Epitope des Calcitonins
und Katacalcins binden (Ghillani et al. (1988) J. Immunol., 141: 3156-3163).
Auf Basis dieser Antikörper wurden auch Sandwich-Immunoassays zum Nachweis
von pCT bzw. Calcitonin in Serumproben entwickelt. Zum Nachweis von Calcitonin-
Vorläufermolekülen wurde eine Kombination eines Anti-Katacalcin-Antikörpers mit
einem Anti-Calcitonin-Antikörper vorgeschlagen (EP-B1-0 656 121). Eine solche
Methode hat jedoch den Nachteil, daß zum pCT-Nachweis mindestens zwei
Antikörper, die an möglichst weit auseinanderliegende pCT-Bereiche binden müssen,
benötigt werden.
Für den Fachmann stellt sich daher die Aufgabe, andere spezifische
Bindungspartner bereitzustellen, die es erlauben, pCT auch nur mit einem
spezifischen Bindungspartner nachweisen zu können.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Antikörper
gelöst, die an Procalcitonin nicht jedoch an freies Calcitonin, freies Katacalcin und
freies N-Procalcitonin binden. Bevorzugt sind im Sinne der Erfindung Antikörper, die
an ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-
Asn-Leu-Ser binden, sowie Antikörper, die an ein Peptid mit der Aminosäuresequenz
Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser binden.
Im Gegensatz zu den bisher bekannten Antikörpern, die pCT und zugleich aber auch
freies Calcitonin oder freies Katacalcin oder freies N-Procalcitonin binden, können
die erfindungsgemäßen Antikörper auch alleine in kompetitiven Testverfahren oder in
immunhistochemischen Methoden zum spezifischen pCT-Nachweis eingesetzt
werden. Hinzu kommt, daß die erfindungsgemäßen Antikörper zur
affinitätschromatographischen Aufreinigung von pCT aus einer Probe, die auch pCT-
Spaltprodukte enthält, besonders geeignet sind.
Obwohl Ghillani et al. bei ihren Immunisierungsversuchen auch Peptide, die die
Aminosäuresequenz Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp bzw. die Aminosäuresequenz Val-Gly-
Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser enthalten, eingesetzt haben, gelang ihnen
trotz intensiven Bemühens um die Identifizierung der pCT-Epitope nur die
Bereitstellung von Antikörpern, die entweder das "reife" Calcitonin oder pCT
gemeinsam mit Calcitonin bzw. pCT gemeinsam mit Katacalcin erkennen.
Überraschenderweise ist es nun gelungen, Antikörper zu erzeugen, die an
Procalcitonin nicht jedoch an freies Calcitonin, freies Katacalcin und freies N-
Procalcitonin binden.
Im folgenden werden spezifische Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert:
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind solche Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, daß diese Antikörper Procalcitonin nicht jedoch freies Calcitonin, freies Katacalcin und freies N-Procalcitonin binden.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind solche Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, daß diese Antikörper Procalcitonin nicht jedoch freies Calcitonin, freies Katacalcin und freies N-Procalcitonin binden.
Unter dem Begriff "Antikörper" ist im Sinne dieser Erfindung ein Immunglobulin, z. B.
ein Immunglobulin der Klasse bzw. Subklasse IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3,
IgG4, IgM, zu verstehen. Ein Antikörper weist mindestens eine Bindungsstelle (häufig
Paratop genannt) für ein Epitop (häufig auch antigene Determinante genannt) auf
einem Antigen oder Hapten auf. Ein solches Epitop ist z. B. durch seine räumliche
Struktur und/oder durch das Vorhandensein von polaren und/oder apolaren Gruppen
gekennzeichnet. Die Bindungsstelle des Antikörpers ist komplementär zum Epitop.
Die Antigen-Antikörper-Reaktion bzw. die Hapten-Antikörper-Reaktion funktioniert
nach dem sogenannten "Schlüssel-Schlüsselloch-Prinzip", und ist in der Regel in
einem hohen Grad spezifisch, d. h. die Antikörper vermögen kleine Abweichungen in
der Primärstruktur, in der Ladung, in der räumlichen Konfiguration und der sterischen
Anordnung des Antigens oder Haptens zu unterscheiden. Insbesondere die
sogenannten "complementary determining regions" des Antikörpers tragen zur
Bindung des Antikörpers an das Antigen oder Hapten bei.
Der Begriff "Antigene" umfaßt monovalente und polyvalente Antigene. Ein
polyvalentes Antigen ist ein Molekül oder ein Molekülkomplex, an das/den mehr als
ein Immunglobulin gleichzeitig binden kann, während bei einem monovalenten
Antigen jeweils nur ein einziger Antikörper zur selben Zeit binden kann. Als Hapten
wird üblicherweise ein Molekül bezeichnet, das nicht für sich allein immunogen ist,
sondern das zu Immunisierungszwecken üblicherweise an einen Träger gebunden
wird.
Unter dem Begriff Antikörper sind im Sinne dieser Erfindung nicht nur komplette
Antikörper zu verstehen sondern ausdrücklich auch Antikörperfragmente, wie z. B.
Fab, Fv, F(ab')2, Fab'; sowie auch chimäre, humanisierte, bi- oder oligospezifische,
oder "single chain" Antikörper; des weiteren auch Aggregate, Polymere und
Konjugate von Immunglobulinen und/oder deren Fragmenten, sofern die
Bindungseigenschaften an das Antigen oder Hapten erhalten sind.
Antikörperfragmente lassen sich beispielsweise durch enzymatische Spaltung von
Antikörpern mit Enzymen wie Pepsin oder Papain herstellen. Antikörperaggregate, -
polymere und -konjugate können durch vielfältige Methoden generiert werden, z. B.
durch Hitzebehandlung, Umsetzung mit Substanzen wie Glutaraldehyd, Reaktion mit
immunglobulin-bindenden Molekülen, Biotinylierung von Antikörpern und
anschließende Reaktion mit Streptavidin oder Avidin, etc.
Bei einem Antikörper im Sinne dieser Erfindung kann es sich um einen monoklonalen
oder um einen polyklonalen Antikörper handeln. Der Antikörper kann nach den
üblichen Verfahren hergestellt worden sein, z. B. durch Immunisierung des Menschen
oder eines Tieres, wie z. B. Maus, Ratte, Meerschweinchen, Kaninchen, Pferd, Schaf,
Ziege, Huhn (s. a. Messerschmid (1996) BIOforum, 11: 500-502), und anschließender
Gewinnung des Antiserums; oder durch die Etablierung von Hybridomazellen und
der anschließenden Reinigung der sekretierten Antikörper; oder durch Klonierung
und Expression der Nukleotidsequenzen bzw. modifizierter Versionen davon, die die
Aminosäuresequenz kodieren, die für die Bindung des natürlichen Antikörpers an
das Antigen und/oder Hapten verantwortlich sind.
Unter "freiem" Calcitonin, Katacalcin und N-Procalcitonin sind die weiter oben
beschriebenen pCT-Spaltprodukte Calcitonin, Katacalcin und N-Procalcitonin zu
verstehen, die in vivo durch Proteolyse von pCT gebildet werden können.
Ganz bevorzugte Antikörper im Sinne dieser Erfindung sind Antikörper, die an ein
Peptid mit der Aminosäuresequenz Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-Asn-Leu-
Ser oder an ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-
Asp-Met-Ser-Ser binden. Andere bevorzugte Antikörper im Sinne dieser Erfindung
sind Antikörper die an ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-
Gly oder an ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp binden.
Besonders bevorzugte Antikörper im Sinne dieser Erfindung sind auch die pCT-
bindenden Antikörper, die von der Hybridomazelllinie 98-31/04 produziert werden.
Diese Hybridomazelllinie wurde am 16.12.1999 bei der DSMZ-Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, Braunschweig,
Deutschland, unter der Eingangsnummer DSM ACC2437 hinterlegt.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung sind spezifische Bindungspartner, die an
ein Epitop binden, das von einem erfindungsgemäßen Antikörper erkannt wird.
Unter einem "spezifischen Bindungspartner" ist ein Mitglied eines spezifischen
Bindungspaars zu verstehen. Bei den Mitgliedern eines spezifischen Bindungspaars
handelt es sich um zwei Moleküle, die jeweils mindestens eine zu einer Struktur des
anderen Moleküls komplementäre Struktur aufweisen, wobei die beiden Moleküle
sich über eine Bindung der komplementären Strukturen zu binden vermögen. Der
Begriff Molekül umfaßt auch Molekülkomplexe wie z. B. Enzyme, die aus Apo- und
Coenzym bestehen, Proteine, die aus mehreren Untereinheiten bestehen,
Lipoproteine bestehend aus Protein und Lipiden, etc. Spezifische Bindungspartner
können natürlich vorkommende aber auch z. B. mittels chemischer Synthese,
mikrobiologischer Techniken und/oder gentechnologischer Verfahren hergestellte
Substanzen sein. Zur Illustration des Begriffs spezifischer Bindungspartner, aber
nicht als Einschränkung zu verstehend, sind z. B. zu nennen: Thyroxinbindendes
Globulin, steoridbindende Proteine, Antikörper, Antigene, Haptene, Enzyme, Lektine,
Nukleinsäuren, Repressoren, Oligo- und Polynukleotide, Protein A, Protein G, Avidin,
Streptavidin, Biotin, Komplementkomponente C1q, nukleinsäurebindende Proteine,
etc. Spezifische Bindungspaare sind beispielsweise: Antikörper-Antigen, Antikörper-
Hapten, Operator-Repressor, Nuclease-Nukleotid, Biotin-Avidin, Lektin-
Polysaccharid, Steorid-steoridbindendes Protein, Wirkstoff-Wirkstoffrezeptor,
Hormon-Hormonrezeptor, Enzym-Substrat, IgG-Protein A, komplementäre Oligo-
oder Polynukleotide, etc.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Antikörper ist es dem Fachmann
nun möglich, z. B. durch Kompetitionsexperimente (s. a. Peters et al. (1985)
Monoklonale Antikörper, Springer Verlag, Kapitel 12.2 "Epitop-Analyse"), andere
spezifische Bindungspartner, Antikörper ausdrücklich miteingeschlossen, zu
identifizieren, die an das Epitop eines erfindungsgemäßen Antikörpers binden. So
lassen sich, nach dem Fachmann bekannten Techniken mittlerweile mit Hilfe von
Phage Display Bibliotheken, über synthetische Peptiddatenbanken oder mittels
"Recombinatorial Antibody Libraries" spezifische Bindungspartner selektieren (Larrick
& Fry (1991) Human Antibodies and Hybridomas, 2: 172-189).
Gegenstand dieser Erfindung ist auch ein erfindungsgemäßer Antikörper oder
erfindungsgemäßer spezifischer Bindungsparter, der mit einer Festphase und/oder
einer Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert ist.
Der Begriff "Festphase" im Sinne dieser Erfindung beinhaltet einen Gegenstand, der
aus porösem und/oder nicht porösem, in der Regel wasserunlöslichem Material
besteht und die unterschiedlichsten Formen aufweisen kann, wie z. B. Gefäß,
Röhrchen, Mikrotitrationsplatte, Kugel, Mikropartikel, Stäbchen, Streifen, Filter- oder
Chromatographiepapier, etc. In der Regel ist die Oberfläche der Festphase hydrophil
oder kann hydrophil gemacht werden. Die Festphase kann aus den
unterschiedlichsten Materialien bestehen wie z. B. aus anorganischen und/oder aus
organischen Materialien, aus synthetischen, aus natürlich vorkommenden und/oder
aus modifizierten natürlich vorkommenden Materialien. Beispiele für
Festphasenmaterialien sind Polymere wie z. B. Zellulose, Nitrozellulose,
Zelluloseacetat, Polyvinylchlorid, Polyacrylamid, vernetzte Dextranmoleküle,
Agarose, Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polymethacrylat oder Nylon;
Keramik; Glas; Metalle, insbesondere Edelmetalle wie Gold und Silber; Magnetid;
Mischungen oder Kombinationen derselben; etc. Auch Zellen, Liposomen oder
Phospholipidvesikel, sind vom Begriff Festphase miterfaßt.
Die Festphase kann einen Überzug aus einer oder mehreren Schichten aufweisen,
z. B. aus Proteinen, Kohlehydraten, lipophilen Substanzen, Biopolymeren,
organischen Polymeren oder Mischungen hiervon, um beispielsweise die
unspezifische Bindung von Probenbestandteilen an die Festphase zu unterdrücken
oder zu verhindern, oder um beispielsweise Verbesserungen zu erreichen
hinsichtlich der Suspensionsstabilität von partikulären Festphasen, der
Lagerstabilität, der formgebenden Stabilität oder der Resistenz gegen UV-Licht,
Mikroben oder sonstige zerstörend wirkender Agenzien.
Bei einem "signalbildenden System" kann es sich um eine oder mehrere
Komponenten handeln, wobei es sich wenigstens bei einer Komponente um ein
nachweisbares Label handelt. Als Label ist jedes Molekül zu verstehen, das selbst
ein Signal produziert oder die Produktion eines Signals induzieren kann wie z. B. eine
fluoreszierende Substanz, eine radioaktive Substanz, ein Enzym, oder eine
chemilumineszierende Substanz. Das Signal kann beispielsweise anhand der
Enzymaktivität, der Lumineszenz, der Lichtabsorption, der Lichtstreuung, der
ausgestrahlten elektromagnetischen oder radioaktiven Strahlung, oder einer
chemischen Reaktion nachgewiesen oder gemessen werden.
Ein Label vermag selbst ein nachweisbares Signal zu erzeugen, so daß keine
weiteren Komponenten notwendig sind. Viele organische Moleküle absorbieren
ultraviolettes und sichtbares Licht, wobei durch die Lichtadsorption übertragene
Energie diese Moleküle in einen angeregten Energiezustand kommen können, und
die absorbierte Energie in Form von Licht einer anderen Wellenlänge als der des
eingestrahlten Lichts abgeben. Wieder andere Label können direkt ein
nachweisbares Signal erzeugen wie z. B. radioaktive Isotope oder Farbstoffe.
Wieder andere Label benötigen zur Signalerzeugung weitere Komponenten, d. h. das
signalproduzierende System schließt in einem solchen Fall all die für die
Signalbildung benötigten Komponenten mit ein wie z. B. Substrate, Coenzyme,
Quencher, Beschleuniger, zusätzliche Enzyme, Substanzen, die mit Enzymprodukten
reagieren, Katalysatoren, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Ionen etc.
Geeignete Label (s. a. EP-A2-0 515 194; US 5,340,716; US 5,545,834; Bailey et al.
(1987) J. Pharmaceutical & Biomedical Analysis 5: 649-658) sind beispielsweise
Enzyme einschließlich Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Glukose-6-
Phosphatdehydrogenase, Alkoholdehydrogenase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase,
Luciferase, Urease und Acetylcholinesterase; Farbstoffe; fluoreszierende
Substanzen einschließlich Fluorescein, Isothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin,
Phycocyanin, Ethidiumbromid, 5-Dimethylaminonapthalen-1-sulfonyl und
fluoreszierende Chelate von seltenen Erden; chemilumineszierende Substanzen
einschließlich Luminol, Isoluminol, Acridiniumverbindungen, Olefin, Enolether,
Enamin, Arylvinylether, Dioxen, Arylimidazol, Lucigenin, Luciferin und Aequorin;
Sensitizer einschließlich Eosin, 9,10-Dibromoanthracen, Methylen Blau, Porphyrin,
Phthalcyanin, Chlorophhyll, Rose Bengal; Coenzyme; Enzymsubstrate; radioaktive
Isotope einschließlich 125I, 131I, 14C, 3H, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 59Fe, 57Co und 75Se;
Partikel einschließlich magnetische Partikel oder Partikel, bevorzugt Latexpartikel,
die selbst beispielsweise mit Farbstoffen, Sensitizern, fluoreszierenden Substanzen,
chemilumineszierenden Substanzen, Isotopen oder anderen nachweisbaren Labeln
markiert sein können; Solpartikel einschließlich Gold- oder Silbersolen; Liposomen
oder Zellen, die selbst mit nachweisbaren Labeln markiert sein können; etc.
Ein signalbildendes System kann auch Komponenten umfassen, die bei räumlicher
Nähe miteinander in eine nachweisbare Wechselwirkung treten können, z. B. in Form
von Energiespendern und Energieempfängern wie beispielsweise Photosensitizer
und chemolumineszierende Substanzen (EP-A2-0 515 194), Photosensitizer und
Fluorophore (WO 95/06877), radioaktives Iod125 und Fluorophore (Udenfriend et al.
(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672-8676), Fluorophore und Fluorophore (Mathis
(1993) Clin. Chem. 39: 1953-1959) oder Fluorophore und Fluoreszenz-Quencher (US 3,996,345).
Unter einer Wechselwirkung zwischen den Komponenten ist die direkte Übertragung
von Energie zwischen den Komponenten, z. B. durch Licht- oder Elektronenstrahlung
sowie über kurzlebige reaktive chemische Moleküle, miteingeschlossen. Ferner
umfaßt sind hiervon auch Vorgänge, bei denen die Aktivität einer Komponente durch
eine oder mehrere andere inhibiert oder verstärkt wird, beispielsweise die Hemmung
oder Steigerung der Enzymaktivität oder die Hemmung, Steigerung oder
Veränderung (z. B. Wellenlängenverschiebung, Polarisation) des von der
beeinflußten Komponente ausgesendeten elektromagnetischen Strahlung. Die
Wechselwirkung zwischen den Komponenten umfaßt auch Enzymkaskaden. In
diesem Fall sind die Komponenten Enzyme, von denen mindestens eines das
Substrat für ein anderes liefert, so daß eine maximale oder minimale
Reaktionsgeschwindigkeit der gekoppelten Substratumsetzung resultiert.
Eine effektive Wechselwirkung zwischen den Komponenten findet in der Regel statt,
wenn diese räumlich benachbart vorliegen, also z. B. innerhalb eines
Abstandbereiches von wenigen µm, insbesondere innerhalb eines Abstandbereiches
von unter 600 nm, bevorzugt unter 400 nm, ganz besonders bevorzugt von unter 200 nm.
Mikropartikel werden häufig als Festphase und/oder als Label genutzt. Unter dem
Begriff "Mikropartikel" sind im Sinne dieser Erfindung Teilchen zu verstehen, die
einen ungefähren Durchmesser von wenigstens 20 nm und nicht mehr als 20 µm
aufweisen, üblicherweise zwischen 40 nm und 10 µm, bevorzugt zwischen 0,1 und
10 µm, besonders bevorzugt zwischen 0,1 bis 5 µm, ganz besonders bevorzugt
zwischen 0,15 und 2 µm. Die Mikropartikel können regelmäßig oder unregelmäßig
geformt sein. Sie können Kugeln, Spheroide, Kugeln mit mehr oder weniger großen
Kavitäten oder Poren darstellen. Die Mikropartikel können aus organischem, aus
anorganischem Material oder aus einer Mischung oder Kombination von beiden
bestehen. Sie können aus einem porösen oder nicht porösen, einem schwellfähigen
oder nicht schwellfähigen Material bestehen. Prinzipiell können die Mikropartikel
jegliche Dichte haben, bevorzugt sind jedoch Partikel mit einer Dichte, die der Dichte
des Wassers nahekommt wie etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml. Die bevorzugten
Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen suspendierbar und möglichst lange
suspensionsstabil. Sie mögen durchsichtig, teilweise durchsichtig oder
undurchsichtig sein. Die Mikropartikel können aus mehreren Schichten bestehen wie
beispielsweise die sogenannten "core-and-shell" Partikel mit einem Kern und einer
oder mehreren umhüllenden Schichten. Der Begriff Mikropartikel umfaßt
beispielsweise Farbstoffkristalle, Metallsolen, Silica-Partikel, Glaspartikel,
Magnetpartikel, Polymerteilchen, Öltropfen, Lipidpartikel, Dextran, und
Proteinaggregate. Bevorzugte Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen
suspendierbare und aus wasserunlöslichem Polymermaterial bestehende Partikel,
insbesondere aus substituierten Polyethylenen. Ganz besonders bevorzugt sind
Latexpartikel z. B. aus Polystyrol, Acrylsäurepolymeren, Methacrylsäurepolymeren,
Acrylnitril-Polymeren, Acrylnitril-Butadien-Styrol, Polyvinylacetat-Acrylat,
Polyvinylpyridin, Vinylchlorid-Acrylat. Von besonderem Interesse sind Latexpartikel
mit reaktiven Gruppen an ihrer Oberfläche wie beispielsweise Carboxyl-, Amino- oder
Aldehydgruppen, die eine kovalente Bindung z. B. von spezifischen
Bindungspartnem an die Latexpartikel erlauben. Die Herstellung von Latexpartikeln
ist beispielsweise in EP 0 080 614, EP 0 227 054 und EP 0 246 446 beschrieben.
Der Begriff "assoziiert" ist breit zu verstehen und umfaßt beispielsweise eine
kovalente und eine nicht-kovalente Bindung, eine direkte und eine indirekte Bindung,
die Adsorption an eine Oberfläche und den Einschluß in eine Vertiefung oder einen
Hohlraum, etc. Bei einer kovalenten Bindung sind die Antikörper oder
Bindungspartner über eine chemische Bindung an die Festphase oder an das Label
gebunden. Beispiele für eine nicht-kovalente Bindung sind die
Oberflächenadsorption, der Einschluß in Hohlräume oder die Bindung von zwei
spezifischen Bindungspartnern. Neben einer direkten Bindung an die Festphase
oder das Label können die Antikörper oder Bindungspartner auch indirekt über
spezifische Wechselwirkung mit anderen spezifischen Bindungspartnern an die
Festphase oder das Label gebunden sein (s. a. EP-A2-0 411 945). Dies soll anhand
von Beispielen näher illustriert werden: Der biotinylierte Antikörper kann über
labelgebundenes Avidin an das Label gebunden werden; oder es kann ein
Fluorescein-Antikörperkonjugat über festphasengebundene Anti-Fluorescein-
Antikörper an die Festphase gebunden werden; oder der Antikörper kann über
Immunglobulin-bindende Proteine an die Festphase oder das Label gebunden
werden.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung sind erfindungsgemäße Antikörper oder
spezifische Bindungsparter, die als ein in vitro oder in vivo Diagnostikum oder als ein
Bestandteil eines in vitro oder in vivo Diagnostikums verwendet werden.
Bei einem in vivo Diagnostikum wird der erfindungsgemäße Antikörper oder der
erfindungsgemäße spezifische Bindungspartner, z. B. mit einem radioaktiven Isotop
markiert, einem Lebewesen wie z. B. einem Menschen oder einem Tier appliziert. Er
reichert sich bevorzugt in den Organen oder Geweben an, die pCT vermehrt
enthalten oder herstellen. Durch die Detektion der Orte mit erhöhter
Strahlungsintensität können beispielsweise pCT-produzierende Tumorherde
lokalisiert und mit bildgebenden Verfahren räumlich dargestellt werden.
Bei einem in vitro Diagnostikum wird der nachzuweisende Analyt, z. B. Procalcitonin,
in einer Probe außerhalb eines lebenden menschlichen oder tierischen Körpers
nachgewiesen oder dessen Konzentration oder Menge bestimmt.
Unter einer "Probe" ist im Sinne der Erfindung das Material zu verstehen, das die
nachzuweisende Substanz (Beispiele für den Begriff "Analyt" siehe EP-A2-0 515 194,
Seiten 8-15) vermutlich enthält. Der Begriff Probe umfaßt beispielsweise biologische
Flüssigkeiten oder Gewebe insbesondere von Menschen und Tieren wie Blut,
Plasma, Serum, Sputum, Exudat, bronchoalveoläre Lavage, Lymphflüssigkeit,
Synovialflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Vaginalschleim, Feces, Urin, Liquor, Haare,
Haut, Gewebeproben oder -schnitte. Ferner werden umfaßt Zellkulturproben,
pflanzliche Flüssigkeiten oder Gewebe, forensische Proben, Wasser- und
Abwasserproben, Nahrungsmittel, Arzneimittel. Gegebenenfalls müssen die Proben
vorbehandelt werden, um den Analyten für das Nachweisverfahren zugänglich zu
machen oder um störende Probenbestandteile zu entfernen. Solche Vorbehandlung
von Proben mag die Abtrennung und/oder Lyse von Zellen beinhalten, das
Präzipitieren, die Hydrolyse oder die Denaturierung von Probenbestandteilen wie
z. B. Proteinen, die Zentrifugation von Proben, das Behandeln der Probe mit
organischen Lösungsmitteln wie z. B. Alkohole, insbesondere Methanol; das
Behandeln der Probe mit Detergenzien. Häufig wird die Probe in ein anderes,
meistens wässriges, Medium überführt, welches mit dem Nachweisverfahren
möglichst nicht interferieren soll.
Die erfindungsgemäßen Antikörper und/oder die erfindungsgemäßen spezifischen
Bindungsparter können in einem Verfahren zum quantitativen oder qualitativen
Nachweis eines Analyten, bevorzugt Procalcitonin, in einer Probe verwendet werden.
Bei einem quantitativen Nachweis wird die Menge oder die Konzentration des
Analyten in der Probe gemessen. Von dem Begriff des "quantitativen Nachweises"
sind auch semiquantitative Methoden umfaßt, die nur die ungefähre Menge oder
Konzentration des Analyten in der Probe erfassen oder nur zu einer relativen
Mengen- oder Konzentrationsangabe dienen können. Unter einem qualitativen
Nachweis ist der Nachweis des Vorhandenseins des Analyten in der Probe
überhaupt oder das Anzeigen, daß die Konzentration des Analyten in der Probe
unterhalb oder oberhalb eines bestimmten oder mehrerer bestimmter
Schwellenwerte liegt, zu verstehen.
pCT läßt sich beispielsweise mit den erfindungsgemäßen Antikörpern und/oder den
erfindungsgemäßen spezifischen Bindungspartnem immunhistochemisch in
Zellausstrichen, Gewebeschnitten oder Gewebeproben nachweisen. So werden
beispielsweise von dem zu untersuchenden Gewebe Gefrierschnitte oder
Paraffinschnitte angefertigt. Die Schnitte werden mit den erfindungsgemäßen
Antikörpern unter geeigneten Reaktionsbedingungen inkubiert. Nach Auswaschen
der nichtgebundenen erfindungsgemäßen Antikörper werden die Bereiche, an die die
erfindungsgemäßen Antikörper gebunden haben, detektiert. Dies kann ohne weitere
Zwischenschritte erfolgen, wenn die Antikörper z. B. mit Fluoreszenzlabeln versehen
sind. Alternativ können die gebundenen erfindungsgemäßen Antikörper
beispielsweise mit Hilfe von entsprechenden spezifischen, mit einem Label
assoziierten Bindungspartnern, die an die gebundenen erfindungsgemäßen
Antikörper binden können, detektiert werden.
Der Nachweis von pCT mit den erfindungsgemäßen Antikörpern und/oder den
erfindungsgemäßen spezifischen Bindungspartnern kann beispielsweise auch mit
Verfahren erfolgen wie beispielsweise: Western Blot, Dot Blot, Immunelektrophorese,
Immunfixations-Elektrophorese, Elektroimmundiffusion, Immunpräzipitation, radiale
Immundiffusion, Immunfixation, Immunchromatographie, Latex-Agglutination,
turbidimetrischer oder nephelometrischer Test, homogener oder heterogener
Bindungstest, Ein- oder Zweischritt-Test, Sandwich-Test, indirekter Test, kompetitiver
Test, "point-of-care"-Teste, etc. Diese und andere Nachweisverfahren sind
beispielsweise in "Labor und Diagnose", ed. L. Thomas, TH-Books
Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt, 1998, Kapitel 60, oder in "Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - An Introduction to
Radioimmunoassay and Related Techniques", ed. T. Chard, Elsevier, Amsterdam,
1987, beschrieben.
Bei Bindungstesten wird der Analyt, soweit in der Probe vorhanden, an einen oder
mehrere analytspezifische Bindungspartner gebunden, und es bilden sich Analyt
analytspezifische(r) Bindungspartner-Komplexe aus.
Bei homogenen Bindungstesten erfolgt keine Trennung zwischen freien und
komplexgebundenen Analyten. Beispiele für homogene Immunoassays (s. a.
Boguslaski & Li (1982) Applied Biochemistry and Biotechnology, 7: 401-414) sind
viele turbidimetrische oder nephelometrische Methoden, wobei die zum Nachweis
verwendeten spezifischen Bindungspartner mit Latexpartikel assoziiert sein können;
EMIT®-Teste; CEDIA®-Teste; Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays;
Luminescent Oxygen Channeling Immunoassays (EP-A2-0 515 194; Ullman et al.
(1994) Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 5426-5430; Ullman et al. (1996) Clinical Chemistry,
42: 1518-1526); etc.
Heterogene Bindungsteste sind durch einen oder mehrere Trennungsschritte
und/oder Waschschritte gekennzeichnet. Die Trennung kann beispielsweise durch
Immunfällung, Fällung mit Substanzen wie Polyethylenglykol oder Ammoniumsulfat,
Filtration, magnetische Abtrennung, Anbindung an eine Festphase wie z. B. an ein
Röhrchen, an eine Kugel, an eine Mikrotitrationsplattenvertiefung, oder an ein Filter-
oder Chromatographiepapier, erfolgen. Bei heterogenen Bindungstesten ist häufig
ein spezifischer Bindungspartner mit einer Komponente eines signalbildenden
Systems und ein spezifischer Bindungspartner mit einer Festphase assoziiert
(betreffend indirekter Bindung s. a. EP-A2-0 411 945). Es kann sich hierbei um
unterschiedliche oder um die gleichen spezifischen Bindungspartner handeln, z. B.
kann ein Analytspezifischer monoklonaler Antikörper sowohl als Fänger (z. B. als
Festphasenantikörper) als auch als markierter Antikörper eingesetzt werden, wenn
der Analyt mehr als ein Epitop aufweist.
Bei heterogenen Sandwich-Testen wird der Analyt üblicherweise von einem
Festphasen-assoziierten spezifischen Bindungspartner und einem spezifischen
Bindungspartner, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert
ist, gebunden. Bei den spezifischen Bindungspartnem kann es sich im Fall eines
Sandwich-Immunassays um Analyt-spezifische Antikörper handeln oder, wenn der
Analyt selbst ein Antikörper ist, um das Antigen und/oder um ein "modifiziertes
Antigen", z. B. einem gelabelten Antigen, einem Antigenteilstück, einem
Antigenanalogon. Beispiele für solche Sandwichkomplexe sind: Festphase-
Antikörper<<Analyt<<Antikörper-Label oder Festphase-
Antigen<<Analyt(= Antikörper)<<Antigen-Label.
Eine andere Ausführungsform eines heterogenen Immunoassays ist der indirekte
Immunoassay: Der Analyt ist in diesem Fall ein Antikörper. Einer der spezifischen
Bindungspartner ist dessen Antigen und/oder ein modifiziertes Antigen und der
andere spezifische Bindungspartner ist ein Antikörper, der den Analyten bindet,
und/oder ein Immunglobulin-bindendes Protein. Beispiele für solche Komplexe, die
bei einem indirekten Immunoassay gebildet werden können, sind: Festphase-Anti-
IgM-Antikörper<<Analyt( = Anti-HbsAg-IgM)<<HBsAg-Label oder Festphase-
HBsAg<<Analyt(= Anti-HbsAg-IgG)<<Protein A-Label.
Bei einem heterogenen kompetitiven Immunoassay konkurriert der Proben-Analyt mit
einem "modifizierten Analyten", z. B. einem gelabelten Analyten, einem
Analytteilstück, einem Analytanalogon, etc., um eine limitierte Anzahl Analyt-
spezifischer Bindungsstellen. Beispiele zur Illustration des Prinzips: (i) Proben-Analyt
konkurriert mit einem Analyt, der mit einer Komponente eines signalbildenden
Systems assoziiert ist, um die Bindung an Festphasen-assoziierte Analyt-spezifische
Antikörper oder (ii) Proben-Analyt konkurriert mit Festphasen-assoziiertem Analyt um
die Bindung an Analyt-spezifische Antikörper, die mit einer Komponente eines
signalbildenden Systems assoziiert sind.
Sandwich-Teste, kompetitive Teste und indirekte Teste können auch als homogene
Testverfahren durchgeführt werden (s. a. EP-A2-0 515 194).
Der Begriff "point-of-care-Teste" oder "POC-Teste" ist breit zu verstehen. Er schließt
Teste ein, bei denen kein separates Analyse- oder Meßgerät zur Testdurchführung
oder Testauswertung benötigt wird. POC-Teste basieren in vielen Fällen auf
immunchromatographische Verfahren, Immunkomplexabtrennungen per Filtration
und/oder Immunfixationstechniken. Die POC-Teste sind insbesondere für
Messungen vor Ort, z. B. am Krankenbett oder daheim, für den Notarzt und/oder
beim niedergelassenen Arzt und weniger für das Großlabor gedacht. POC-Teste
können insbesondere auch von Personen, die keine eingehende medizinisch-
technische Ausbildung und Erfahrung auf dem Gebiet der Laboratoriumsmedizin
haben, durchgeführt werden. Unter der Begriff "POC-Teste" sind im Sinne dieser
Erfindung auch sogenannte Heimteste oder OTC-Teste zu verstehen, die von
medizinischen Laien durchgeführt werden dürfen, so z. B. die diversen
Schwangerschaftsteste die für den Heimgebrauch vertrieben werden. Andere POC-
Teste betreffen beispielsweise den Nachweis von Herzinfarktmarkern, Drogen,
Arzneimitteln, Infektions- und Entzündungsmarkern. Bei vielen POC-Testen sind
oder werden im Laufe der Testdurchführung spezifische Bindungspartner an oder auf
Filter- oder Chromatographiestreifen oder -scheiben assoziiert. Eine positive oder
negative Nachweisreaktion kann zum Beispiel mit dem Erscheinen oder
Nichterscheinen einer Farbbande in einem bestimmten Testfeld verknüpft sein
und/oder dem Erscheinen oder Nichterscheinen eines bestimmten Symbols, z. B.
einem "+", einem "-" und/oder der Intensität des jeweiligen Meßsignals.
Ein POC-Test für pCT kann beispielsweise so aufgebaut sein: Probe und gelabelte
Antikörper, die an pCT zu binden vermögen, werden auf einen Teststreifen
aufgetragen. Geeignete Label sind z. B. gefärbte Latexpartikel, kolloidales Gold,
Enzyme, etc. Sofern pCT in der Probe enthalten ist, werden sich pCT-
Antikörperkomplexe ausbilden. Diese Komplexe bewegen sich mittels Kapillarkraft in
Richtung auf einen Bereich, in dem Antikörper, die an andere pCT-Epitope zu binden
vermögen, z. B. in Form einer Bande fixiert sind oder im Laufe des Testverfahrens
fixiert werden (z. B. über eine Biotin-Avidin-Brücke). Die gelabelten pCT-
Antikörperkomplexe werden in diesem Bereich gebunden und bilden mit den fixierten
Antikörpern einen Sandwichkomplex aus. Die Intensität des Labelsignals ist hier
proportional zur pCT-Probenkonzentration. Bei einem kompetitiven POC-
Testverfahren können beispielsweise pCT und/oder pCT-Fragmente in einem
Bereich des Teststreifens fixiert sein oder im Laufe des Testverfahrens fixiert
werden. Dieses fixierte pCT würde mit pCT aus der Probe um die Bindung an
gelabelte anti-pCT-Antikörper kompetitieren. Alternativ können auch fixierte anti
pCT-Antikörper und gelabeltes pCT für den Aufbau eines kompetitiven pCT-Testes
eingesetzt werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist
ein nephelometrischer oder ein turbidimetrischer Test, insbesondere ein solcher Test
bei dem erfindungsgemäße Antikörper und/oder erfindungsgemäße spezifische
Bindungspartner - bevorzugt an Latexpartikel assoziiert - eingesetzt werden.
Ein anderer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Testkit, der einen oder mehrere
der erfindungsgemäßen Antikörper und/oder einen oder mehrere der
erfindungsgemäßen spezifischen Bindungspartner enthält. In einem solchen Kit sind
üblicherweise alle oder nur einige Komponenten eines Testes in abgepackter Form
enthalten. Die erfindungsgemäßen Antikörper und die erfindungsgemäßen
spezifischen Bindungspartner können beispielsweise mit einer oder mehreren
Festphasen und/oder einer oder mehreren Komponenten eines signalbildenden
Systems assoziiert sein. Der Testkit kann beispielsweise Standards; Kontrollen;
sowie andere Reagenzien, wie z. B. Puffer, Waschlösungen, Meßsignal-auslösende
Lösungen und/oder Enzymsubstrat; Küvetten; Pipetten und/oder Testanweisungen
enthalten. Eine besonders bevorzugter erfindungsgemäßer Testkit enthält an
Latexpartikel assoziierte erfindungsgemäße Antikörper.
Die erfindungsgemäßen Antikörper und erfindungsgemäßen spezifischen
Bindungspartner lassen sich auch für die Affinitätschromatographie verwenden.
Unter dem Begriff "Affinitätschromatographie" ist eine Methode zur Reinigung und
Isolierung von Substanzen, insbesondere Biopolymeren, zu verstehen, die auf der
Tatsache beruht, daß viele Substanzen mit für sie spezifischen Bindungspartnern
eine selektive, nichtkovalente, reversible Bindung eingehen können. Das Prinzip des
Verfahrens besteht darin, daß der spezifische Bindungspartner an eine unlösliche
Matrix (z. B. poröse Gläser, Gele auf Agaraose-, Cellulose-, Dextran-, Polymer- und
Kieselgelbasis) in der Regel kovalent gebunden und in Kontakt mit einer die
Substanz enthaltenden Probe gebracht wird. Die gesuchte Substanz wird wegen
ihrer spezifischen Wechselwirkung mit dem Matrix-gebundenen spezifischen
Bindungspartner immobilisiert und zurückgehalten, während alle anderen in der
Probe enthaltenen Substanzen durch Eluation abgetrennt werden. Anschließend wird
das gesuchte Biopolymere mit einem geeigneten Eluationsmittel, das die
nichtkovalente Bindung zwischen Substanz und spezifischen Bindungspartner
aufhebt, von der Matrix abgelöst (s. a. E. Buddecke (1989) Grundrisse der Biochemie,
Walter de Gryter, Kapitel 7 "Proteine").
Ein anderer Gegenstand dieser Erfindung umfaßt erfindungsgemäße Antikörper
und/oder erfindungsgemäße spezifische Bindungsparter in einem pharmazeutisch
verträglichen, sterilen Injektionsmedium. Unter einem pharmazeutisch verträglichen,
sterilen Injektionsmedium ist beispielsweise eine keimfreie, pyrogenfreie Lösung, z. B.
Saline oder eine andere Elektrolytlösung, zu verstehen wie sie üblicherweise zur
intravenösen, intramuskulären, intraperitonealen oder subkutanen Verabreichung
von Arzneimitteln, Impfstoffen oder Kontrastmitteln verwendet wird.
Wieder ein anderer Gegenstand dieser Erfindung ist die Verwendung der
erfindungsgemäßen Antikörper und/oder der erfindungsgemäßen spezifischen
Bindungsparter als Diagnostikum, als Bestanteil eines Diagnostikums, als
Arzneimittel oder als Bestandteil eines Arzneimittels. Von der Erfindung
miteingeschlossen ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper
und/oder der erfindungsgemäßen spezifischen Bindungsparte zur Behandlung der
SIRS ("systemic inflammatory response syndrome"), der Sepsis und/oder Tumore,
insbesondere bösartige pCT-produzierende Tumore. SIRS ist eine systemische,
entzündliche Antwort auf eine Gewebeschädigung mit den Zeichen einer entfernt
ablaufenden Organdysfunktion. Ferner wird von der Erfindung umfaßt ein Verfahren
zur Herstellung eines Arzneimittels, beispielsweise zur Behandlung von Tumoren,
der Sepsis und/oder der SIRS, enthaltend die erfindungsgemäßen Antikörper
und/oder die erfindungsgemäßen spezifischen Bindungspartner.
Die erfindungsgemäßen Antikörper und/oder die erfindungsgemäßen spezifischen
Bindungsparter können zur Behandlung intrakorporal oder auch extrakorporal
eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper und/oder die
erfindungsgemäßen spezifischen Bindungsparter können durch radioaktive. Isotope
und/oder durch die Anbindung pharmakologisch wirksamer Substanzen in ihrer
Wirksamkeit verstärkt werden. Die therapeutische Applikation von anti-pCT-
Antikörpern ist in WO 98/33524 näher erläutert. Darüber hinaus könnte pCT aus dem
Blut eines Patienten beispielsweise auch mit einem Dialyse-analogen Verfahren
entfernt werden, wobei das Blut oder das Plasma extrakorporal mit sterilen und
fixierten erfindungsgemäßen Antikörpern und/oder erfindungsgemäßen spezifischen
Bindungspartner in Kontakt gebracht wird.
Ein anderer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines
erfindungsgemäßen Antikörpers, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß zur
Immunisierung ein oder mehrere Peptide verwendet werden, die die Amino
säuresequenz Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly, bevorzugt die Aminosäuresequenz Asp-
Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser, und/oder die Aminosäuresequenz
Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp, bevorzugt die Aminosäuresequenz Val-Gly-Ala-Pro-Gly-
Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser, enthalten. Bei einem bevorzugten
erfindungsgemäßen Verfahren ist mindestens eines der zur Immunisierung
verwendeten Peptide ein Oligopeptid, vorzugsweise ein trägergebundenes
Oligopeptid. Ein anderes bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines
erfindungsgemäßen Antikörpers umfaßt die Verwendung eines oder mehrerer
Peptide mit der Aminosäuresequenz Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly, der
Aminosäuresequenz Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser, der
Aminosäuresequenz Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp und/oder der Aminosäuresequenz
Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser zur Immunisierung, wobei diese
Peptide auch trägergebunden sein können. Die erfindungsgemäßen Antikörper
können auch hergestellt werden, durch die Verwendung von natürlich
vorkommenden und/oder rekombinanten pCT als Immunisierungsantigen. Des
weiteren können auch Peptide zur Immunisierung verwendet werden die eine oder
mehrere der folgenden Aminosäuresequenzen Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly, Asp-Ser-
Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser, Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp und/oder Val-
Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser repetitiv enthalten, beispielsweise
Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly oder Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-
Arg-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly oder
Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-
Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser-Val-Gly-
Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser.
Der Begriff "Peptide" im Sinne dieser Erfindung umfaßt Säureamide, die bei
Hydrolyse in Aminosäuren zerfallen, beispielsweise Aminosäurepolymere wie z. B.
Polypeptide, Oligopeptide, Proteine oder Proteinfragmente. Sind nicht mehr als zehn
Aminosäuren miteinander verknüpft, so spricht man in der Regel von Oligopeptiden,
darüber hinaus von Polypeptiden. Oligopeptid gemäß Definition dieser Erfindung
umfaßt auch noch Aminosäureketten von bis zu etwa 20 Aminosäuren.
Ein Gegenstand dieser Erfindung sind auch die beiden Oligopeptide mit der
Aminosäuresequenz Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser und der
Aminosäuresequenz Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser. Diese
Peptide können als Immunisierungsantigen zur Herstellung der erfindungsgemäßen
Antikörper verwendet werden.
Die als Immunisierungsantigen verwendeten Peptide können ungebunden und/oder
trägerbunden zur Immunisierung verwendet werden. Typische Träger sind
beispielsweise Proteine, wie z. B. Ovalbumin, Albumin oder Hämocyanin, oder
Polymere, wie z. B. Polyethylenglykol, Polyacrylamid oder Poly-d-Glutamin-d-Lysin.
Die Peptide können beispielsweise mit Hilfe von Carbodiimid oder Glutaraldehyd an
diese Träger gebunden werden oder auch mittels eines bifunktionalen Reagenzes,
welches auch als Abstandhalter ("Spacer) wirken kann (Beispiele und
Kopplungsmethoden s. z. B. Wong S. (1993) Chemistry of Protein Conjugation and
Cross-Linking, CRC Press, Inc. Boca Raton).
Das Immunisierungsantigen kann beispielsweise in Phosphat-gepufferter Saline
aufgenommen werden und mit Freund'schem Adjuvans versetzt werden. Diese
Emulsion kann dann z. B. intradermal, intraperitoneal und/oder subkutan einem Tier,
beispielsweise einem Kaninchen, einer Maus, einer Ratte, einem Meerschweinchen,
einem Pferd, einem Schaf, einer Ziege, einem Huhn, etc., appliziert werden. Booster-
Injektionen, wobei das Immunisierungsantigen auch mit inkomplettem Freund'schen
Adjuvans emulgiert sein kann, können helfen, die Immunantwort zu steigern.
Erfindungsgemäße polyklonale Antikörper können aus dem Antiserum der
immunisierten Tiere gewonnen werden und können per Affinitätschromatographie
über eine Matrix, an die beispielsweise pCT oder die als Immunisierungsantigen
eingesetzten Peptide gebunden wurden, weiter aufgereinigt werden.
Um erfindungsgemäße monoklonale Antikörper zu erzeugen, werden nach den
allgemein bekannten Verfahren (s. z. B. Harlow & Lane (1988) Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor; Peters et al.
(1985) Monoklonale Antikörper: Herstellung und Charakterisierung, Springer Verlag)
die Immunzellen immunisierter Tiere, wie z. B. einer Maus, mit Myelomzellen zum
Erzeugen von monoklonalen Antikörper ("MAK") produzierenden Hybridoma-Zellen
verschmolzen und anschließend geeignete Klone isoliert. Die Auswahl der die
gewünschten MAK produzierenden Klone wird mit Hilfe spezifischer
Screeningverfahren durchgeführt. Hierbei wird die Bindungsspezifität der in den
Zellkulturüberstand abgegebenen Antikörper z. B. an das Immunisierungsantigen, an
einen etwaigen Träger des Immunisierungsantigens, an pCT, an freies Calcitonin,
freies Katacalcin und freies N-Procalcitonin, beispielsweise mittels
Enzymimmunoassays, Radioimmunoassays und/oder Western Blots überprüft.
Hybridome, die erfindungsgemäße Antikörper herstellen, werden kloniert. Die so
gewonnenen Hybridoma-Zelllinien stehen dann für eine dauerhafte MAK-Produktion
zur Verfügung. Größere Antikörpermengen fassen sich beispielsweise aus
Zellkulturüberstand, insbesondere aus Fermentern oder Rollerkulturen, sowie aus
Aszites gewinnen.
Je nach gewünschtem Verwendungszweck ist es vorteilhaft nur Teile der Antikörper,
wie z. B. Fab-, F(ab')2-, oder Fab'-Fragmente, einzusetzen. Diese können
beispielsweise mit den dem Fachmann bekannten enzymatischen Spaltverfahren
(s. a. z. B. Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) erzeugt werden.
Die Antigenbindungsstellen eines Antikörpers befinden sich in den sogenannten
variablen Domänen, die durch die V-Gene kodiert sind. Mit den bekannten
gentechnischen Methoden (s. z. B. Sambrock et al. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 2nd edition;
McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552-554) kann auch die entsprechende
Nukleinsäuresequenz eines erfindungsgemäßen Antikörpers ermittelt werden sowie
dadurch auch die entsprechende Aminosäuresequenz, sofern diese noch nicht per
Aminosäuresequenzierung bereits bekannt war. Als Ausgangsmaterial für derartige
Analysen können die Hybridomazellen bzw. die Antikörper produzierenden
Immunzellen immunisierter Tiere eingesetzt werden.
In Kenntnis der Nuklein- und/oder Aminosäuresequenz können mit Hilfe üblicher
gentechnologischer und molekularbiologischer Methoden (s. a. Johnson & Chiswell
(1993) Current Opinion in Structural Biology, 3: 564-571) dann humanisierte, chimäre,
bi- oder oligospezifische Antikörper sowie von der "complementarity determining
region" abgeleitete Peptide ("minimal recognition units"), single-chain Fragmente,
und/oder funktionelle Fusionsprodukte, z. B. rekombinant hergestellte Antikörper-
Enzym-Konstrukte, hergestellt werden (s. z. B. Larrick & Fry (1991) Human
Antibodies and Hybridomas, 2: 172-189; Kitano et al. (1986) Appl. Microbiol.
Biotechnol, 24: 282-286; Thompson et al. (1986) J. Immunol. Methods, 94: 7-12), die
an Procalcitonin nicht jedoch an freies Calcitonin, freies Katacalcin und freies N-
Procalcitonin binden. Mit solchen unter dem Begriff "Antikörper" eingeschlossenen
Peptiden kann beispielsweise eine Verringerung der Immunogenität und/oder eine
verstärkte Wirksamkeit bei Verabreichung als Arzneimittel oder in vivo
Diagnostikum erzielt werden und/oder es ergeben sich Vorteile für den Einsatz als
oder in einem in vitro Diagnostikum. Die Antikörper sind auch herstellbar ggf. unter
Zuhilfenahme gentechnologischer Methoden in pflanzlichen - wie z. B. Hefezellen -
(Fischer et al. (1999) Biol. Chem., 380: 825-839; Hiatt et al. (1992) Genetic
Engineering, 14: 49-64), tierischen und prokaryontischen Zellen (s. z. B. WO 95/25172)
sowie isolierten menschlichen Zellen.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung sind auch tierische, pflanzliche oder
prokaryontische Zellen sowie isolierte menschliche Zellen, die einen
erfindungsgemäßen Antikörper produzieren. Eine bevorzugte Ausführungsform
dieser Erfindung umfaßt Hybridomazellinien, die die erfindungsgemäßen Antikörper
produzieren, beispielsweise die Hybridomazelllinie 98-31/04. Diese
Hybridomazelllinie wurde am 16.12.1999 bei der DSMZ Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, Braunschweig,
Deutschland, mit der Eingangsnummer DSM ACC2437 hinterlegt.
Fig. 1 stellt eine schematische Darstellung von humanem pCT und dessen
proteolytische Spaltprodukte dar; AS = Aminosäure(n).
Die im folgenden beschriebenen Beispiele dienen zur exemplarischen Beleuchtung
einzelner Aspekte dieser Erfindung und sind nicht als Einschränkung zu verstehen.
Zwei Peptide "P1" und "P2" entsprechend den Aminosäuren 53-64 und 88-99 des
humanen Procalcitonins (s. a. Fig. 2) mit der Sequenz:
P1: Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser
P2: Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser
wurden wie folgt synthetisiert:
P1 und P2 werden an einem Applied Biosystem, Model 431A Peptidsynthesizer mit 9-Fluroenylmethyloxicarbonyl (Fmoc) Aminosäurenchemie synthetisiert. Die vorhandenen Schutzgruppen wurden durch Behandlung mit Trifluoressigsäure abgespalten.
P1: Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser
P2: Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser
wurden wie folgt synthetisiert:
P1 und P2 werden an einem Applied Biosystem, Model 431A Peptidsynthesizer mit 9-Fluroenylmethyloxicarbonyl (Fmoc) Aminosäurenchemie synthetisiert. Die vorhandenen Schutzgruppen wurden durch Behandlung mit Trifluoressigsäure abgespalten.
Die Peptide wurden an Rinderserum-Albumin (RSA, Centeon Pharma, Marburg,
Germany) gekoppelt (s. a. Rusin et al. (1992) Biosens. Bioelectron., 7: 367-373;
Kitagawa et al. (1983) J. Biochem., 94: 1165-1172).
Im einzelnen: 100 mg RSA werden in 20 ml 0,1 M Lithium-Borat-Puffer pH 8,0 mit
41,8 mg N-gamma-Maleimidobytyryloxysuccinimide (GMBS) (Calbiochem-
Novablochem GmbH, Bad Soden, Deutschland) versetzt und 30 Minuten bei 20°C
inkubiert. Anschließend wird das Reaktionsgemisch gegen 0,1 M NaH2(PO4) pH 6,0
umgepuffert (RSA-GMBS-Lösung).
17,5 mg P1 oder P2 werden in 1,75 ml 0,1 M Lithium-Borat-Puffer pH 8,0 gelöst, und
2,1 mg S-acetylmercaptobernsteinsäure-anhydrid (Fluka Chemie GmbH,
Deisenhofen, Deutschland) gelöst in Dioxan (22,2 mg/ml) zugegeben und 30 Minuten
bei 20°C inkubiert. Anschließend werden 475 µl 1 M Hydroxylamin-Lösung zugesetzt
und weitere 15 Minuten bei 20°C inkubiert. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird mit
16 ml RSA-GMBS-Lösung versetzt und 2 Stunden bei 20°C inkubiert. Anschließend
wird die Reaktion durch Zugabe von 0,1 M N-ethylmalemid-Lösung abgestoppt und
gegen Phosphat-gepufferter Saline pH 7,2 umgepuffert.
BALB/c Mäuse wurden jeweils mit 20 µg P1-RSA-Konjugat bzw. 20 µg P2-RSA-
Konjugat in kompletten Freund'schen Adjuvans intraperitoneal immunisiert. Nach 4
Wochen erfolgte ein Booster mit jeweils 20 µg P1-RSA-Konjugat bzw. 20 µg P2-
RSA-Konjugat in inkompletten Freund'schen Adjuvans (Fa. ICN Biomedical GmbH,
Eschwege, Deutschland) und nach 8 Wochen mit jeweils 20 µg P1-RSA-Konjugat
bzw. 20 µg P2-RSA-Konjugat ohne Freund'schen Adjuvans. Die letzten 3 Tage vor
der Fusion wurden die Mäuse intravenös mit jeweils 20 µg P1-RSA-Konjugat bzw.
20 µg P2-RSA-Konjugat geboostert.
Nach dem Töten der Mäuse durch CO2-Inhalation wurden die Milzen entnommen
und Einzelzellsuspensionen in serumfreien Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium
(DMEM, Fa. CC Pro GmbH, Neustadt/W, Deutschland) hergestellt. Die Zellen
wurden zentrifugiert (652 g) und 2 × in DMEM gewaschen. Anschließend wurde die
Zellzahl mittels Trypanblau-Färbung bestimmt. Zu etwa 108 Milzzellen wurden 2 × 107
Myelomzellen (Sp2/0) gegeben. Nach dem Zentrifugieren (360 g) wurde der
Überstand verworfen, 1 ml Polyethylenglycol-Lösung (PEG 4000, Fa. Merck Eurolab,
Bruchsal, Deutschland; ca. 50%ig in DMEM) auf das Zellpellet gegeben und nach
Resuspension 1 Minute bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde tropfenweise ca. 10 ml
DMEM zugegeben und 2 bis 4 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die
fusionierten Zellen wurden abzentrifugiert (326 g) und das Pellet in DMEM + 20%
FKS (fötales Kälberserum, Fa. Biowithaker Europe, Verviers, Belgien) + HAT-
Lösung (Fa. CC Pro GmbH, Neustadt/W, Deutschland) resuspendiert und in 24 Well-
Zellkulturplatten (Fa. Costar) abgefüllt. Die ungefähre Zellkonzentration pro Well
betrug 5 × 104 bis 5 × 106 Zellen.
2-3 Wochen später wurden die entstandenen Zellkolonien (Hybride) entnommen
und in neue Kulturplatten überführt.
Die Spezifität der in die Zellkultur abgegebenen Antikörper wurden in einem ersten
Testschritt mit Hilfe von Immunisierungsantigen-beschichteten Mikrotiterplatten (Fa.
Nunc, Typ B), Beschichtung 0,2 µg/ml ≈ 0,003 µg/Vertiefung, getestet.
In jede Vertiefung der Mikrotitterplatte wurden 100 µl Zellkulturüberstand
(Verdünnung 1 : 2) pipettiert und 1 Stunde bei +15 bis +25°C inkubiert. Nach
zweimaligen Waschen der Platte mit Waschlösung-POD (OSEW; Fa. Dade Behring,
Marburg, Deutschland) wurden in jede Vertiefung 100 µl anti-Maus IgG/F(ab)2-POD-
Konjugat (Fa. Dade Behring, Marburg, Deutschland) eingefüllt und 1 Stunde bei +15
bis +25°C inkubiert. Nach weiterem zweimaligen Waschen der Platte wurde in jede
Vertiefung 100 µl Chromogen TMB-Lösung (Fa. Dade Behring, Marburg,
Deutschland) eingefüllt und weitere 30 Minuten bei +15 bis +25°C inkubiert. Nach der
Inkubation wurde in jede Vertiefung 100 µl Stopplösung POD (Fa. Dade Behring,
Marburg, Deutschland) eingefüllt und die Mikrotiterplatte am BEP II (Behring-ELISA-
Prozessor II, Fa. Dade Behring, Marburg, Deutschland) bei 450 nm ausgewertet.
In einem 2. Testschritt wurden die Hybride wie oben beschrieben überprüft mit Hilfe
von Mikrotiterplatten (Fa. Nunc, Typ B), die mit folgenden Peptiden beschichtet
waren:
- a) Rekombinantes humanes pCT (0,03 µg/Vertiefung). Die Herstellung von rekombinanten pCT ist im Detail in der am 22. Dezember 1999 beim Deutschen Patent- und Markenamt parallel eingereichten Anmeldung mit dem Titel "Humanes Procalcitonin, dessen Herstellung und Verwendung" beschrieben (Aktenzeichen 199 62 434.8). Ein zur Expression von pCT in E. coli geeignetes Plasmid wurde am 16.12.1999 bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der Nummer DSM 13203 hinterlegt. Dieses Plasmid kann mittels Standardmethoden (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, 1997) in einen geeigneten E. coli Stamm (z. B. JM109; Stratagene, LaJolla, USA) transformiert werden. Klone können nach Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agarplatten, welche 50 µg/ml Ampicillin als Selektionsmedium enthalten, gewonnen werden. Die Expression des Procalcitonins kann nach folgendem Prozedere erfolgen: Frisch mit dem Expressionsplasmid transformierte JM109 werden über Nacht bei 37°C unter Schütteln in LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin angezogen und dann 1 : 50 in 1 l frischem LB-Medium (Ampicillin 100 µg/ml) verdünnt und weiter bei 37°C geschüttelt, und bei einer OD600 von 0,4 mit 2 mM IPTG für 3 h induziert. Bei Einhaltung dieser optimierten Bedingungen wurden reproduzierbar ca. 13 mg Fusionsprotein aus 1 l Kultur nach einer Reinigung unter nativen Bedingungen über Metallaffinitätschromatographie nach Angaben des Herstellers (Talon Metal Affinity Resin, Clontech, Palo Alto, USA) und anschließender Gelfiltration über Superdex 75 HiLoad (Amersham Pharmacia), erhalten.
- b) Calcitonin human RSA-Konjugat (0,5 µg/Vertiefung, Fa, Bachem, Prod. Nr.: H- 2250).
- c) Katacalcin human (PDN-21) RSA-Konjugat (0,5 µg/Vertiefung, Fa, Peninsula, Prod. Nr.: 6004).
- d) Calcitonin N-Terminal Flanking Peptide RSA-Konjugat (0,5 µg/Vertiefung, Fa, Bachem, Prod. Nr.: H-3076) = humanes N-Procalcitonin
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Einzelne Zellen von Hybriden, die die erfindungsgemäßen Antikörper produzieren
(Bindung an humanes pCT nicht jedoch an freies Calcitonin, freies Katacalcin und
freies N-Procalcitonin), wurden mit einem Mikromanipulator (Fa. Leitz, Wetzlar,
Deutschland) kloniert. Der so erhaltene Klon 98-31/04 wurde am 16.12.1999 bei der
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, Deutschland, unter der Eingangsnummer
DSM ACC2437 hinterlegt.
Die Subklasse des Antikörpers 98-31/04 wurde mittels IsoStrip™-Mouse Monoclonal
Antibody Isotyping Kit- der Fa. Boehringer Mannheim, Deutschland als IgG1
bestimmt.
Für die Produktion größerer Mengen Antikörper werden die entsprechenden
Zellklone in Rollerflaschen (Fa. Corning Costar Deutschland, Bodenheim) überführt,
und bis zum gewünschten Endvolumen bei +37°C expandiert. Danach wird die
Rollerkultur-Suspension zur Entfernung der Zellen über 0,22 µm filtriert. Die jetzt
zellfreie Antikörperlösung wird über Ultrafilter (Trenngrenze 30 000 Dalton)
ankonzentriert und anschließend aufgereinigt.
Die erhaltene Antikörperlösung wird gegen 0,14 M Phosphatpuffer pH 8,6
umgepuffert und auf ein mit rProtein A Sepharose Fast Flow (Fa. Amersham
Pharmacia) gefüllte Chromatographiesäule aufgetragen (pro 10 mg zu reinigender
Antikörper werden 1 ml rProtein A Sepharose Fast Flow eingesetzt). Alle nicht
gebundenen Komponenten werden durch Waschen der Säule mit 0,14 M
Phosphatpuffer pH 8,6 entfernt. Der gebundene Antikörper wird mit 0,1 M
Zitronensäure pH 3,0 von der Säule eluiert und gegen 0,05 M Natriumacetat + 0,5 M
NaCl + 0,05 M Tris + 0,01% Natriumazid pH 7,0 dialysiert.
An Latexpartikel hergestellt nach EP-0 246 446 mit einem Durchmesser von 250 bis
310 nm wurde jeweils ein erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper und ein
gegen Katacalcin gerichteter monoklonaler Antikörper gebunden:
Das verwendete Latexpolymerisat wurde mit dest. Wasser auf einen Feststoffgehalt
von 4 Gew.-% verdünnt. Die zu bindenden Antikörper wurden mit 0,05 M
Natriumacetat + 0,5 M NaCl + 0,05 M Tris + 0,01% Natriumazid pH 7,0 auf einen
Proteingehalt von 5 mg/ml verdünnt. 1 ml des obengenannten Polymerisats wurde
mit 200 µl Antikörper-Lösung gemischt. Dann wurden 0,050 ml einer 20%igen
Lösung von Tween 20 (Fa. Merck Eurolab, Darmstadt, Deutschland) hinzugegeben
und das Ganze nochmals gemischt. Hierzu wurde 0,025 ml 1 N HCL zugegeben, so
daß ein pH-Wert von ca. 3 erreicht wurde. Nach einer Inkubationszeit von 30 min. bei
Raumtemperatur wurde 0,25 ml 1 M Phosphatpuffer pH 6,5 und 0,25 ml
Natriumcyanborhydrid-Lösung (25 mg/ml) hinzugesetzt und gut durchgemischt.
Anschließend erfolgte eine Inkubation von einer Stunde bei Raumtemperatur.
Dieser Beladungsansatz wurde sodann 30 min. bei ca. 50 000 g zentrifugiert. Der
Überstand wurde verworfen. Der Rückstand wurde in 4 ml Imidazolpuffer pH 8,1
(5 g/L Imidazol, 40 g/L Saccharose, 1 g/L Humanalbumin) resuspendiert. Anschließend
erfolgte eine Ultraschall-Behandlung (Bronson Sonyfier B!%) für 30 Sekunden. Das
so redispergierte Reagenz wurde im Volumenverhältnis 1 : 7,5 mit dem zuvor
genannten Imidazolpuffer verdünnt und nochmals 30 Sekunden mit Ultraschall
behandelt.
Die nach Beispiel 4a) durch Bindung des erfindungsgemäßen Antikörpers und des
Antikörpers gegen Katacalcin an Latexpartikel hergestellten Reagenzien wurden in
einem Volumenverhältnis 1+1 gemischt und zur Messung von pCT in Patientenseren
am Behring Nephelometer Analyser (BNA, Dade Behring, Marburg, Deutschland)
eingesetzt. Das gemischte Reagenz wird bei Mischung mit pCT- haltigen Proben
agglutiniert. Die Intensität des Streulichts im BNA ist von der pCT-Konzentration der
Probe abhängig. Zur Messung wurden 100 µl Probe (1 Normalserum, 3 pCT-haltige
Patientenproben (BRAHMS LUMItest® PCT, < 100 ng/ml pCT)) mit 100 µl N-Diluens
(Dade Behring, Marburg, Deutschland) und mit 40 µl des gemischten Reagenzes in
der Reaktionskuvette gemischt und nach 12 min. die Veränderung des Meßsignals
(in Bit) am BNA gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Claims (20)
1. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper Procalcitonin nicht
jedoch freies Calcitonin, freies Katacalcin und freies N-Procalcitonin bindet.
2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper an
ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-
Asn-Leu-Ser oder der Aminosäuresequenz Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-
Asp-Met-Ser-Ser bindet.
3. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der
Antikörper von der Hybridomazelllinie 98-31/04 (DSM ACC2437) produziert
wird.
4. Spezifischer Bindungspartner, dadurch gekennzeichnet, daß er an ein Epitop
bindet, das von einem Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1-3 erkannt
wird.
5. Antikörper oder spezifischer Bindungspartner nach einem der Ansprüche 1-4,
dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper und/oder der spezifische
Bindungspartner mit einer Festphase und/oder einer Komponente eines
signalbildenden Systems assoziiert sind.
6. Antikörper oder spezifischer Bindungspartner nach einem der Ansprüche 1-4
zur Verwendung als in vitro oder in vivo Diagnostikum oder als Bestandteil
eines in vitro oder in vivo Diagnostikums.
7. Antikörper oder spezifischer Bindungspartner nach einem der Ansprüche 1-4
zur Verwendung in einem Verfahren zum quantitativen oder qualitativen
Nachweis eines Analyten, bevorzugt Procalcitonin, in einer Probe.
8. Antikörper oder spezifischer Bindungspartner nach einem der Ansprüche 1-4
zur Verwendung in der Affinitätschromatographie.
9. Antikörper oder spezifischer Bindungspartner nach einem der Ansprüche 1-4
in einem pharmazeutisch verträglichen, sterilen Injektionsmedium.
10. Antikörper oder spezifischer Bindungspartner nach einem der Ansprüche 1-4
zur Verwendung als Arzneimittel oder als Bestandteil eines Arzneimittels.
11. Antikörper oder spezifischer Bindungspartner nach einem der Ansprüche 1-4
zur Behandlung der Sepsis, des SIRS und/oder von Tumoren.
12. Testkit enthaltend einen oder mehrere Antikörper und/oder einen oder mehrere
spezifische Bindungspartner nach einem der Ansprüche 1-5.
13. Arzneimittel enthaltend einen oder mehrere Antikörper und/oder einen oder
mehrere spezifische Bindungspartner nach einem der Ansprüche 1-4.
14. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1-3,
dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung ein oder mehrere Peptide
verwendet werden, die die Aminosäuresequenz Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly,
bevorzugt die Aminosäuresequenz Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-Asn-
Leu-Ser, und/oder die Aminosäuresequenz Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp, bevorzugt
die Aminosäuresequenz Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser,
enthalten.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines
der zur Immunisierung verwendeten Peptide ein Oligopeptid, vorzugsweise ein
trägergebundenes Oligopeptid, ist.
16. Tierische, pflanzliche oder prokaryontische Zelle sowie isolierte menschliche
Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß diese Antikörper nach einem der
Ansprüche 1-3 produziert.
17. Hybridomazelllinie, dadurch gekennzeichnet, daß diese Antikörper nach einem
der Ansprüche 1-3 produziert.
18. Hybridomazelllinie nach Anspruch 17 mit der Bezeichnung 98-31/04, die bei der
DSMZ unter der Eingangsnummer DSM ACC2437 hinterlegt wurde.
19. Peptid mit der Aminosäuresequenz Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-Gly-Asn-
Leu-Ser.
20. Peptid mit der Aminosäuresequenz Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-
Ser-Ser.
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---|---|---|---|---|
DE102007009751A1 (de) * | 2007-02-28 | 2008-09-04 | B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft | Verfahren zur selektiven Bestimmung von Procalcitonin 1-116 für diagnostische Zwecke sowie Antikörper und Kits zur Durchführung eines solchen Verfahrens |
US8236496B2 (en) | 2005-03-21 | 2012-08-07 | Sirs-Lab Gmbh | Use of gene activity classifiers for the in vitro classification of gene expression profiles of patients with infectious/non-infectious multiple organ failure |
US8476200B2 (en) | 2004-10-13 | 2013-07-02 | Sirs-Lab Gmbh | Method for differentiating between the non-infectious and infectious causes of multiple organ failure |
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2000
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- 2000-11-25 ES ES00125846T patent/ES2304340T3/es not_active Expired - Lifetime
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