DE10027954A1 - Humanes Procalcitonin, dessen Herstellung und Verwendung - Google Patents
Humanes Procalcitonin, dessen Herstellung und VerwendungInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft humanes Procalcitonin, dessen Herstellung und Verwendung. Insbesondere beschrieben ist ein Verfahren zur Herstellung von humanem Procalcitonin, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Gen kodierend für ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von humanem Procalcitonin enthält, in einen Vektor eingefügt wird; ein Wirtsorganismus mit diesem Gen-enthaltenden Vektor transformiert wird und das von dem Wirtsorganismus exprimierte Polypeptid isoliert wird. Ferner wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide insbesondere als Arzneimittel und Diagnostika beschrieben.
Description
Die Erfindung betrifft humanes Procalcitonin, dessen Herstellung, insbesondere
durch gentechnische Verfahren, und dessen Verwendung.
Procalcitonin ("pCT") ist ein aus 116 Aminosäuren bestehendes Protein mit einem
Molekulargewicht von ca. 13000 Dalton. Es stellt das Prohormon von Calcitonin dar,
welches unter normalen Stoffwechselbedingungen in den C-Zellen der Schilddrüse
gebildet und sezerniert wird. Die Synthese von pCT und Calcitonin beginnt mit der
Translation eines 141 Aminosäuren umfassenden Vorläuferpeptides, dem
Preprocalcitonin ("Pre-pCT"). Die Aminosäuresequenz von menschlichem Pre-pCT
wurde 1984 von Moullec et al. in "FEBS Letters", 167: 93-97 beschrieben. Nach
Abspaltung des Signalpeptides (ersten 25 Aminosäuren von Pre-pCT) entsteht pCT.
Bei Gesunden wird durch spezifische Proteolyse aus pCT intrazellulär das Hormon
Calcitonin (Aminosäuren 60-91 der pCT-Aminosäuresequenz) sowie das N-
Procalcitonin (Aminosäuren 1-57 der pCT-Aminosäuresequenz) und das Katacalcin
(Aminosäuren 96-116 der pCT-Aminosäuresequenz) gebildet (s. a. Conlon et al.
(1988) Biochem. J., 256: 245-250). Das pCT sowie dessen Fragmente wurden
insbesondere bei bestimmten Tumorerkrankungen (Ghillani et al. (1989), "Cancer
Research", 49: 6845-6851) sowie bei Sepsis (EP-B1-0 656 121) und SIRS ("systemic
inflammatory response syndrome") (Snider et al. (1997) J. Investig. Med., 45: 552-
560) in erhöhter Konzentration im Serum bzw. Plasma von Patienten nachgewiesen.
Bei der typischen Sepsis werden Bakterien von einem Herd aus ständig oder
schubweise in die Blutbahn abgegeben. Die klinischen Erscheinungen werden durch
Endotoxin oder durch andere pyrogene und toxische Substanzen in ihrer Interaktion
mit Körpermechanismen verursacht. Der akute Einbruch löst Schüttelfrost und in
schweren Fällen eine Schockreaktion aus. Sonderformen des septischen Schocks
sind das Waterhouse-Friderichsen-Syndrom und das Toxinschocksyndrom (TSS).
Das TSS ist als ein akutes Krankheitsbild bei Staphylokokken-Infektionen bekannt,
das durch ein spezielles Staphylokokken-Toxin hervorgerufen wird. Eine schwere
Sepsis entwickelt sich relativ häufig bei Patienten mit schweren Grunderkrankungen
wie z. B. Tumorerkrankungen, schweren Verbrennungen und Traumen.
Die Bedeutung des Nachweises der Erreger im Blut ("positive Blutkultur,
Bakteriämie") ist für die Sepsisdiagnose in den Hintergrund getreten, da in der Regel
nur in 20 bis 40% der Sepsisfälle die Blutkultur positiv ist. Der Sepsisbegriff hat sich
deshalb einem Wandel unterzogen. Der moderne Begriff "Sepsis" beschreibt ein
klinisches Syndrom, welches in der Regel Fieber, Leukozytose,
Bewußtseinsveränderungen, einen hyperdynamischen Kreislauf ("warmer Schock")
und einen hypermetabolischen Zustand umfaßt, wobei eine positive Blutkultur als
Voraussetzung für die Diagnose einer Sepsis nicht mehr erforderlich ist.
In WO 98/33524 wird vorgeschlagen, Antikörper, die an pCT binden, zur Therapie
von Sepsis und SIRS einzusetzen.
Über lange Jahre wurden polyklonale Antikörper, die durch Immunisierung mit
Calcitonin gewonnen wurden, zum Nachweis des sogenannten immunreaktiven
Calcitonins, welches neben Calcitonin auch das Procalcitonin und weitere
Bruchstücke des Procalcitonins umfaßt, verwendet. Durch die Immunisierung mit
synthetischen Peptiden, deren Aminosäuresequenz mit der Sequenz von
Teilabschnitten des Procalcitonins übereinstimmt, gelang es, verschiedene
monoklonale Antikörper herzustellen, die an verschiedene Epitope des Calcitonins
und Katacalcins binden (Ghillani et al. (1988), "J. Immunol.", 141: 3156-3163).
Auf Basis dieser Antikörper wurden auch Sandwich-Immunoassays zum Nachweis
von pCT bzw. Calcitonin in Serumproben entwickelt. Zum Nachweis von Calcitonin-
Vorläufermolekülen wurde eine Kombination eines Anti-Katacalcin-Antikörpers mit
einem Anti-Calcitonin-Antikörper vorgeschlagen. Als Standardmaterial wurde ein auf
diese Antikörper abgestimmtes, synthetisches Peptid als Standardmaterial eingesetzt.
Es ist bekannt, daß das Meßsignal von Standards und Proben bei immunchemischen
Testen nicht zwangsläufig auch bei absolut gleicher Antigenmenge identisch sein
muß. Sind Standard- und Probenantigen nicht wirklich hinsichtlich ihrer
immunchemischen Reaktivität identisch, werden die im Test eingesetzten Antikörper
entweder das eine oder das andere Antigen besser erkennen. Dies führt letzlich zu
unterschiedlichen Meßsignalen von Proben und Standards.
Hieraus folgt, daß die Verwendung von Antigenbruchstücken als Standardantigen
anstatt des gesamten Proteins häufig mit Nachteilen verbunden ist, insbesondere
kann dies zu verfälschten Meßwerten führen. Ferner können die auf der räumlichen
Struktur des richtig gefalteten Proteins beruhenden Epitope in der Regel mit kürzeren
Peptiden nicht richtig dargestellt werden. Dies hat zur Folge, daß bei der
Verwendung von Peptiden als Immunogen keine Antikörper gegen solche
Konformationsepitope gewonnen werden können. Auch gerade in kompetitiven
Testformaten ist es vorteilhaft, wenn die nachzuweisende Substanz die gleiche
immunchemische Reaktivität wie das entsprechende Festphasen- oder Label-
gebundene Testreagenz aufweist.
Obwohl die komplette Aminosäuresequenz von humanem pCT bereits seit 1984
bekannt war, ist es bisher nicht gelungen, humanes pCT insbesondere in größeren
Mengen und reproduzierbar herzustellen. Bisher konnte einzig murines pCT mittels
gentechnischer Verfahren in E.coli exprimiert werden (Rehli et al. (1996) Biochem
Biophys. Res. Com., 226: 420-425).
Das murine pCT unterscheidet sich von humanem pCT jedoch so deutlich (etwa 77%
Homologie auf Aminosäureebene), daß sich für den Fachmann weiterhin die
Aufgabe stellt, ein Verfahren zu entwickeln, welches erlaubt, humanes pCT in
größeren Mengen, kostengünstig und in isolierter Form herzustellen, um dieses
insbesondere als Immunogen und/oder als Standard- und Kontrollserenantigen
einsetzen zu können.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen 1-3
beschriebenen, erfindungsgemäßen Polypeptide, den in den Ansprüchen 10 und 11
beschriebenen, erfindungsgemäßen Plasmiden, den in Anspruch 12 beschriebenen,
erfindungsgemäßen Zellen und den in den Ansprüchen 4-9 beschriebenen,
erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren. Die erfindungsgemäßen Polypetide, d. h.
die Polypeptide nach einem der Ansprüche 1-3 oder die Verfahrensprodukte nach
einem Verfahren gemäß der Ansprüche 4-9, können insbesondere in den Gebieten
Diagnostik und Therapie nutzbringend eingesetzt werden. Bevorzugte
Ausführungsformen der Erfindung sind in den Ansprüchen 13-23 offenbart. Ferner
können die erfindungsgemäßen Polypetide zur Immunisierung verwendet werden,
um erfindungsgemäße Antikörper zu gewinnen. Eine weitere Ausführungsform der
Erfindung sind die in den Ansprüchen 24-29 beschriebenen pCT-Lösungen.
Die Machbarkeit der erfindungsgemäßen Expression von humanem pCT war nicht
vorhersagbar: pCT wird nicht als pCT in der Zelle exprimiert, sondern entsteht aus
Präprocalcitonin durch proteolytische Abspaltung des N-terminalen Signalpeptids. Es
war davon auszugehen, daß pCT ohne das Signalpeptid bei Eukaryonten nicht im
natürlichen Zellkompartiment exprimiert wird und sich unterschiedlich faltet, dadurch
potentiell biologisch inaktiviert und möglicherweise auch instabil wird. Auch die
heterologe Expression in E.coli statt der natürlichen Expression in animalen Zellen
und die im Rahmen der Erfindung versuchte Expression eines Fusionsproteins von
Procalcitonin und N-terminal dazu der artifiziellen Sequenz MRGSHHHHHHGS war
von den Erfolgsaussichten her nicht absehbar. In der Literatur ist zwar die
Expression von murinen pCT als Poly-His-Fusion in E.coli beschrieben (Rehli et al.),
jedoch lassen sich davon keine Ableitungen für die Machbarkeit der Expression des
humanen pCTs treffen, da dieses auf Aminosäureebene nur zu etwa 77% identisch
ist und daher ein völlig anderes Verhalten zu erwarten ist. Weiter wurde das murine
pCT nicht direkt nach der vermuteten Spaltstelle des Signalpeptids (A25/V26)
(Jakobs et al., 1981, Science, 213: 457-459) exprimiert, sondern nur ein um 7 Aminosäuren
verkürztes Fragment des murinen Procalcitonins, was wiederum
unabsehbare Folgen für die Exprimierbarkeit haben kann. Schließlich enthält die
Veröffentlichung weder die genauen Fermentationsbedingungen noch die erzielbaren
Ausbeuten nach Reinigung des Fusionsproteins.
Im folgenden werden spezifische Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert:
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polypeptid, insbesondere
wenn es mit Hilfe gentechnischer Verfahren hergestellt wurde, welches die
Aminosäuresequenz von humanem pCT enthält. Die Aminosäuresequenz von
humanem pCT ist in Fig. 1 dargestellt.
Unter dem Begriff "gentechnische Verfahren" sind im Sinne dieser Erfindung
insbesondere auch Verfahren zu verstehen, bei denen das zu exprimierende
Polypeptid von eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen produziert wird, wobei
die für das zu exprimierende Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz,
rekombinante Nukleinsäuresequenzen miteingeschlossen, in diese Zellen z. B. mittels
Vektoren, Lipososomen, Projektilen oder Co-Präzipation mit Salzen vorher
eingebracht wurde. Bei einem anderen Verfahren wird ein bereits in der Zelle
natürlicherweise vorhandenes Gen, das das zu exprimierende Polypeptid kodiert,
durch aktivierende Maßnahmen, z. B. durch Genamplifikation oder durch Aktivierung
mittels artifiziell eingebrachter Promotor- und/oder Enhancer-Sequenzen oder durch
Deletion von Repressor-bindenden Sequenzen, so aktiviert, daß die Zelle das zu
exprimierende Polypeptid in größerer Menge als natürlicherweise exprimiert.
Unter dem Begriff "Aminosäuresequenz von humanem pCT" sind im Sinne dieser
Erfindung auch durch Austausch, Deletion oder Hinzufügen von Aminosäuren leicht
abgewandelte Aminosäuresequenzen zu verstehen, wobei diese Änderungen keinen
gravierenden negativen Einfluß auf die Bindungseigenschaften des Polypeptids
gegenüber Anti-pCT-Antikörpern haben sollen. Der Fachmann kann dies anhand von
entsprechenden Bindungsstudien mit vorhandenen Anti-pCT-Antikörpern überprüfen.
Der Begriff "Peptide" im Sinne dieser Erfindung umfaßt Säureamide, die bei
Hydrolyse in Aminosäuren zerfallen, beispielsweise Aminosäurepolymere wie z. B.
Polypeptide, Oligopeptide, Proteine oder Proteinfragmente. Sind nicht mehr als zehn
Aminosäuren miteinander verknüpft, so spricht man in der Regel von Oligopeptiden,
darüber hinaus von Polypeptiden.
Weitere erfindungsgemäße Polypetide sind isolierte Polypeptide, die die in Fig. 2A
oder 2B dargestellte Aminosäuresequenz enthalten und bevorzugt mit Hilfe
gentechnischer Verfahren hergestellt wurden.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist ein Verfahren zur Herstellung von
humanem Procalcitonin, wobei:
(i) ein Gen kodierend für ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von humanem Procalcitonin, enthält, in einen Vektor eingefügt wird,
(ii) ein Wirtsorganismus mit diesem Gen-enthaltenden Vektor transformiert wird und
(iii) das von dem Wirtsorganismus exprimierte Polypeptid isoliert wird. Bevorzugte Varianten diese erfindungsgemäßen Verfahrens sind solche, bei denen ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 1, 2A oder 2B hergestellt wird.
(i) ein Gen kodierend für ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von humanem Procalcitonin, enthält, in einen Vektor eingefügt wird,
(ii) ein Wirtsorganismus mit diesem Gen-enthaltenden Vektor transformiert wird und
(iii) das von dem Wirtsorganismus exprimierte Polypeptid isoliert wird. Bevorzugte Varianten diese erfindungsgemäßen Verfahrens sind solche, bei denen ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 1, 2A oder 2B hergestellt wird.
Ein "Vektor" ist insbesondere ein DNA- oder RNA-Molekül, das in einem
Wirtsorganismus zur Replikation in der Lage ist und aus dem man durch Einbau
eines oder mehrerer fremder Gene ein rekombiniertes DNA- oder RNA-Molekül
konstruieren kann. Beispiele für gebräuchliche Vektoren sind bakterielle Plasmide;
virale Genome, insbesondere die Genome von Bakteriophagen; Hefechromosomen
u. -plasmide, insbesondere YEp, YIp, YRp, YAC; Ti-Plasmid; sowie von Adenoviren;
Papillomaviren und Retroviren abgeleitete Vektoren. Zur Ermöglichung der
Expression des fremden Gens verfügt ein Vektor in der Regel über einen Promotor,
welcher möglichst physikalisch oder chemisch induzierbar die Transkription einer
Boten-RNA initiiert, welche für das zu exprimierende Protein kodiert. Ferner weist ein
Vektor in der Regel eine Nukleinsäuresequenz auf, die einen Transkriptionsstop
bewirkt, und Nukleinsäuresequenzen, die eine möglichst effiziente Translation
bewirken, wie beispielsweise bei bakterieller Expression eine Ribosomen-
Bindungsstelle. Außerdem sollte ein Expressionsvektor über Translationsstop-
Sequenzen in allen möglichen Leserastern verfügen.
Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren sind dadurch gekennzeichnet,
daß der Vektor, z. B. pQE-30, einen Fusionsanteil, bevorzugt Poly-Histidin, kodiert,
welcher später eine einfache Aufreinigung des Procalcitonin-Fusionsproteins erlaubt.
Geeignete Wirtszellen für die erfindungsgemäßen Verfahren sind menschliche,
tierische, pflanzliche oder prokaryontische Zellen; besonders bevorzugt sind E.coli.-
Zellen.
Unter einem "Fusionsprotein" ist im Sinne dieser Erfindung ein Protein zu verstehen,
daß sich aus pCT und entweder C- oder N-terminal einem weiteren Poly- oder
Oligopeptid zusammensetzt, welches insgesamt als ein Polypeptid translatiert wird.
Der Fusionsanteil sollte bevorzugt entweder die Exprimierbarkeit des Procalcitonins
erhöhen und/oder eine spätere einfache, affinitätschromatographische Aufreinigung
des Fusionsproteins ermöglichen.
Bevorzugt wird in den erfindungsgemäßen Verfahren zur Isolierung des
erfindungsgemäßen Polypeptids Metallaffinitätschromatographie und/oder
Gelfiltration eingesetzt werden.
Bei der Metallaffinitätschromatographie wird die Tatsache ausgenutzt, daß eine
Chromatographie-Gelmatrix, welche Chelat gebundene zweiwertige Metallionen,
beispielsweise Ni2+, enthält und wobei noch mehre Koordinationsstellen des
Metallions frei zugänglich sind, mit Proteinen, welche mehrere Histidine in Folge
enthalten, eine reversible Bindung eingehen kann. Eine schonende Elution des Poly-
Histidinpolypeptids kann dann kompetitiv beispielsweise durch imidazolhaltige Puffer
erreicht werden.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Plasmid, welches eine oder
mehrere Nukleinsäuresequenzen enthält, die eines oder mehrere der
erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren. Ein ganz besonders bevorzugtes
erfindungsgemäßes Plasmid mit der internen Bezeichnung pQE-PCT wurde am
16.12.1999 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, Deutschland, mit der
Hinterlegungsnummer DSM 13203 hinterlegt.
Eine andere, erfindungsgemäße Ausführungsform sind tierische, pflanzliche, isolierte
menschliche oder prokaryontische Zellen, die ein oder mehrere erfindungsgemäße
Polypeptide exprimieren können.
Wieder eine andere Ausführungsform dieser Erfindung ist die Verwendung der
erfindungsgemäßen Polypeptide als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Antikörpern ist dadurch
gekennzeichnet, daß als Immunisierungsantigen ein oder mehrere
erfindungsgemäße Polypeptide als Immunogen verwendet werden. Antikörper, die
mittels dieses Verfahrens gewonnen wurden, werden nachfolgend
"erfindungsgemäße Antikörper" genannt.
Unter dem Begriff "Antikörper" ist im Sinne dieser Erfindung ein Immunglobulin, z. B.
ein Immunglobulin der Klasse bzw. Subklasse IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3,
IgG4, IgM, zu verstehen. Ein Antikörper weist mindestens eine Bindungsstelle (häufig
Paratop genannt) für ein Epitop (häufig auch antigene Determinante genannt) auf
einem Antigen oder Hapten auf. Ein solches Epitop ist z. B. durch seine räumliche
Struktur und/oder durch das Vorhandensein von polaren und/oder apolaren Gruppen
gekennzeichnet. Die Bindungsstelle des Antikörpers ist komplementär zum Epitop.
Die Antigen-Antikörper-Reaktion bzw. die Hapten-Antikörper-Reaktion funktioniert
nach dem sogenannten "Schlüssel-Schlüsselloch-Prinzip", und ist in der Regel in
einem hohen Grad spezifisch, d. h. die Antikörper vermögen kleine Abweichungen in
der Primärstruktur, in der Ladung, in der räumlichen Konfiguration und der sterischen
Anordnung des Antigens oder Haptens zu unterscheiden. Insbesondere die
sogenannten "complementary determining regions" des Antikörpers tragen zur
Bindung des Antikörpers an das Antigen oder Hapten bei.
Der Begriff "Antigene" umfaßt monovalente und polyvalente Antigene. Ein
polyvalentes Antigen ist ein Molekül oder ein Molekülkomplex, an das/den mehr als
ein Immunglobulin gleichzeitig binden kann, während bei einem monovalenten
Antigen jeweils nur ein einziger Antikörper zur selben Zeit binden kann. Als Hapten
wird üblicherweise ein Molekül bezeichnet, das nicht für sich allein immunogen ist,
sondern das zu Immunisierungszwecken üblicherweise an einen Träger gebunden
wird.
Unter dem Begriff Antikörper sind im Sinne dieser Erfindung nicht nur komplette
Antikörper zu verstehen sondern ausdrücklich auch Antikörperfragmente, wie z. B.
Fab, Fv, F(ab')2, Fab'; sowie auch chimäre, humanisierte, bi- oder oligospezifische,
oder "single chain"-Antikörper; des weiteren auch Aggregate, Polymere und
Konjugate von Immunglobulinen und/oder deren Fragmenten, sofern die
Bindungseigenschaften an das Antigen oder Hapten erhalten sind.
Antikörperfragmente lassen sich beispielsweise durch enzymatische Spaltung von
Antikörpern mit Enzymen wie Pepsin oder Papain herstellen. Antikörperaggregate, -
polymere und -konjugate können durch vielfältige Methoden generiert werden, z. B.
durch Hitzebehandlung, Umsetzung mit Substanzen wie Glutaraldehyd, Reaktion mit
immunglobulin-bindenden Molekülen, Biotinylierung von Antikörpern und
anschließende Reaktion mit Streptavidin oder Avidin, etc.
Bei einem Antikörper im Sinne dieser Erfindung kann es sich um einen monoklonalen
oder um einen polyklonalen Antikörper handeln. Der Antikörper kann nach den
üblichen Verfahren hergestellt worden sein, z. B. durch Immunisierung des Menschen
oder eines Tieres, wie z. B. Maus, Ratte, Meerschweinchen, Kaninchen, Pferd, Schaf,
Ziege, Huhn (s. a. Messerschmid (1996), "BIOforum", 11: 500-502), und anschließender
Gewinnung des Antiserums; oder durch die Etablierung von Hybridomazellen und
der anschließenden Reinigung der sekretierten Antikörper; oder durch Klonierung
und Expression der Nukleotidsequenzen bzw. modifizierter Versionen davon, die die
Aminosäuresequenz kodieren, die für die Bindung des natürlichen Antikörpers an
das Antigen und/oder Hapten verantwortlich sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können
die als Immunisierungsantigen verwendeten, erfindungsgemäßen Polypeptide
ungebunden und/oder trägerbunden zur Immunisierung verwendet werden. Typische
Träger sind beispielsweise Proteine, wie z. B. Ovalbumin, Albumin oder Hämocyanin,
oder Polymere, wie z. B. Polyethylenglykol, Polyacrylamid oder Poly-d-Glutamin-d-
Lysin. Die Polypeptide können beispielsweise mit Hilfe von Carbodiimid oder
Glutaraldehyd an diese Träger gebunden werden oder auch mittels eines
bifunktionalen Reagenzes, welches auch als Abstandhalter ("Spacer") wirken kann
(Beispiele und Kopplungsmethoden s. z. B. Wong S. (1993) Chemistry of Protein
Conjugation and Cross-Linking, CRC Press, Inc. Boca Raton).
Das Immunisierungsantigen kann beispielsweise in phosphatgepufferter Saline
aufgenommen werden und mit Freund'schen Adjuvans versetzt werden. Diese
Emulsion kann dann z. B. intradermal, intraperitoneal und/oder subkutan einem Tier,
beispielsweise einem Kaninchen, einer Maus, einer Ratte, einem Meerschweinchen,
einem Pferd, einem Schaf, einer Ziege, einem Huhn etc., appliziert werden. Booster-
Injektionen, wobei das Immunisierungsantigen auch mit inkomplettem Freund'schen
Adjuvans emulgiert sein kann, können helfen, die Immunantwort zu steigern.
Erfindungsgemäße polyklonale Antikörper können aus dem Antiserum der
immunisierten Tiere gewonnen werden. Mittels Affinitätschromatographie über eine
Matrix, an die beispielsweise pCT oder pCT-Bruchstücke gebunden wurden, können
diese Antikörper weiter aufgereinigt werden.
Um erfindungsgemäße, monoklonale Antikörper zu erzeugen, werden z. B. nach den
allgemein bekannten Verfahren (s. z. B. Harlow & Lane (1988), "Antibodies: A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor; Peters et al.
(1985), "Monoklonale Antikörper: Herstellung und Charakterisierung", Springer-Verlag)
die Immunzellen immunisierter Tiere, wie z. B. einer Maus, mit Myelomzellen zum
Erzeugen von monoklonale Antikörper ("MAK") produzierenden Hybridoma-Zellen
verschmolzen und anschließend geeignete Klone isoliert. Die Auswahl der die
gewünschten MAK produzierenden Klone wird mit Hilfe spezifischer
Screeningverfahren durchgeführt. Hierbei wird die Bindungsspezifität der in den
Zellkulturüberstand abgegebenen Antikörper z. B. an das Immunisierungsantigen, an
einen etwaigen Träger des Immunisierungsantigens, an pCT, an freies Calcitonin,
freies Katacalcin und freies N-Procalcitonin, beispielsweise mittels
Enzymimmunoassays, Radioimmunoassays und/oder Western Blots überprüft.
Hybridome, die erfindungsgemäße Antikörper herstellen, werden kloniert. Die so
gewonnenen Hybridoma-Zelllinien stehen dann für eine dauerhafte MAK-Produktion
zur Verfügung. Größere Antikörpermengen lassen sich beispielsweise aus
Zellkulturüberstand, insbesondere aus Fermentern oder Rollerkulturen, sowie aus
Aszites gewinnen.
Je nach gewünschtem Verwendungszweck ist es vorteilhaft, nur Teile der Antikörper,
wie z. B. Fab-, F(ab')2-, oder Fab'-Fragmente, einzusetzen. Diese können
beispielsweise mit den dem Fachmann bekannten enzymatischen Spaltverfahren
(s. a. z. B. Harlow & Lane (1988), "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) erzeugt werden.
Die Antigenbindungsstellen eines Antikörpers befinden sich in den sogenannten
variablen Domänen, die durch die V-Gene kodiert sind. Mit den bekannten
gentechnischen Methoden (s. z. B. Sambrock et al. (1989), "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 2nd edition;
McCafferty et al. (1990), Nature 348: 552-554) kann auch die entsprechende
Nukleinsäuresequenz eines erfindungsgemäßen Antikörpers ermittelt werden sowie
dadurch auch die entsprechende Aminosäuresequenz, sofern diese noch nicht per
Aminosäuresequenzierung bereits bekannt war. Als Ausgangsmaterial für derartige
Analysen können die Hybridomazellen bzw. die Antikörper produzierenden
Immunzellen immunisierter Tiere eingesetzt werden.
In Kenntnis der Nuklein- und/oder Aminosäuresequenz können mit Hilfe üblicher
gentechnischer und molekularbiologischer Methoden (s. a. Johnson & Chiswell
(1993), Current Opinion in Structural Biology, 3: 564-571) dann humanisierte, chimäre,
bi- oder oligospezifische Antikörper sowie von der "complementarity determining
region" abgeleitete Peptide ("minimal recognition units"), single-chain-Fragmente,
und/oder funktionelle Fusionsprodukte, z. B. rekombinant hergestellte Antikörper-
Enzym-Konstrukte, hergestellt werden (s. z. B. Larrick & Fry (1991), "Human
Antibodies and Hybridomas", 2: 172-189; Kitano et al (1986), Appl. Microbiol.
Biotechnol, 24: 282-286; Thompson et al. (1986), J. Immunol. Methods, 94 7-12), die
an Procalcitonin nicht jedoch an freies Calcitonin, freies Katacalcin und freies N-
Procalcitonin binden. Mit solchen unter dem Begriff "Antikörper" eingeschlossenen
Peptiden kann beispielsweise eine Verringerung der Immunogenität und/oder eine
verstärkte Wirksamkeit bei Verabreichnung als Arzneimittel oder in-vivo-
Diagnostikum erzielt werden und/oder es ergeben sich Vorteile für den Einsatz als
oder in einem in-vitro-Diagnostikum. Die Antikörper sind auch herstellbar ggf. unter
Zuhilfenahme gentechnischer Methoden in pflanzlichen - wie z. B. Hefezellen -
(Fischer et al. (1999), "Biol. Chem.", 380: 825-839; Hiatt et al. (1992), Genetic
Engineering, 14: 49-64)), tierischen und prokaryontischen Zellen (s. z. B. WO 95/25172)
sowie isolierten menschlichen Zellen.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung sind auch tierische, pflanzliche oder
prokaryontische Zellen sowie isolierte, menschliche Zellen, die einen
erfindungsgemäßen Antikörper produzieren.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Antikörper ist es dem Fachmann
auch möglich, z. B. durch Kompetitionsexperimente (s. a. Peters et al. (1985),
"Monoklonale Antikörper", Springer-Verlag, Kapitel 12.2 "Epitop-Analyse"), andere
spezifische Bindungspartner, Antikörper ausdrücklich miteingeschlossen, zu
identifizieren, die an das Epitop eines erfindungsgemäßen Antikörpers binden. So
lassen sich, nach dem Fachmann bekannten Techniken mittlerweile mit Hilfe von
Phage-Display-Bibliotheken, über synthetische Peptiddatenbanken oder mittels
"Recombinatorial Antibody Libraries" spezifische Bindungspartner selektieren (Larrick
& Fry (1991), "Human Antibodies and Hybridomas", 2: 172-189).
Unter einem "spezifischen Bindungspartner" ist ein Mitglied eines spezifischen
Bindungspaars zu verstehen. Bei den Mitgliedern eines spezifischen Bindungspaars
handelt es sich um zwei Moleküle, die jeweils mindestens eine zu einer Struktur des
anderen Moleküls komplementäre Struktur aufweisen, wobei die beiden Moleküle
sich über eine Bindung der komplementären Strukturen zu binden vermögen. Der
Begriff Molekül umfaßt auch Molekülkomplexe, wie z. B. Enzyme, die aus Apo- und
Coenzym bestehen; Proteine, die aus mehreren Untereinheiten bestehen;
Lipoproteine bestehend aus Protein und Lipiden, etc. Spezifische Bindungspartner
können natürlich vorkommende aber auch z. B. mittels chemischer Synthese,
mikrobiologischer Techniken und/oder gentechnischer Verfahren hergestellte
Substanzen sein. Zur Illustration des Begriffs spezifischer Bindungspartner, aber
nicht als Einschränkung zu verstehend, sind z. B. zu nennen: Thyroxinbindendes
Globulin, steoridbindende Proteine, Antikörper, Antigene, Haptene, Enzyme, Lektine,
Nukleinsäuren, Repressoren, Oligo- und Polynukleotide, Protein A, Protein G, Avidin,
Streptavidin, Biotin, Komplementkomponente C1q, nukleinsäurebindende Proteine,
etc.. Spezifische Bindungspaare sind beispielsweise: Antikörper-Antigen, Antikörper-
Hapten, Operator-Repressor, Nuclease-Nukleotid, Biotin-Avidin, Lektin-
Polysaccharid, Steorid-steoridbindendes Protein, Wirkstoff-Wirkstoffrezeptor,
Hormon-Hormonrezeptor, Enzym-Substrat, IgG-Protein A, komplementäre Oligo-
oder Polynukleotide, etc.
Gegenstand dieser Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen
Polypeptide in der Affinitätschromatographie, insbesondere zum Aufreinigen von an
pCT bindenden, spezifischen Bindungspartnern.
Unter dem Begriff "Affinitätschromatographie" ist eine Methode zur Reinigung und
Isolierung von Substanzen, insbesondere Biopolymeren, zu verstehen, die auf der
Tatsache beruht, daß viele Substanzen mit für sie spezifischen Bindungspartnern
eine selektive, nicht kovalente, reversible Bindung eingehen können. Das Prinzip des
Verfahrens besteht darin, daß der spezifische Bindungspartner an eine unlösliche
Matrix (z. B. poröse Gläser, Gele auf Agarose-, Cellulose-, Dextran-, Polymer- und
Kieselgelbasis) in der Regel kovalent gebunden und in Kontakt mit einer die
Substanz enthaltenden Probe gebracht wird. Die gesuchte Substanz wird wegen
ihrer spezifischen Wechelswirkung mit dem Matrix-gebundenen, spezifischen
Bindungspartner immobilisiert und zurückgehalten, während alle anderen in der
Probe enthaltenen Substanzen durch Eluation abgetrennt werden. Anschließend wird
das gesuchte Biopolymere mit einem geeigneten Eluationsmittel, das die
nichtkovalente Bindung zwischen Substanz und spezifischem Bindungspartner
aufhebt, von der Matrix abgelöst (s. a. E. Buddecke (1989), "Grundrisse der Biochemie",
Walter de Gruyter, Kapitel 7 "Proteine").
Wieder ein anderer Gegenstand dieser Erfindung ist die Verwendung der
erfindungsgemäßen Polypeptide und/oder der erfindungsgemäßen Antikörper als
Diagnostikum, als Bestandteil eines Diagnostikums, zur Herstellung eines
Diagnostikums, als Arzneimittel, als Bestandteil eines Arzneimittels und/oder zur
Herstellung eines Arzneimittels.
Unter dem Begriff "Diagnostikum" ist im Sinne dieser Erfindung ein Mittel zu
verstehen, welches insbesondere dazu dient, etwaige Erkrankungen, den
Gesundheitstatus, den körperlichen oder geistigen Zustand von Lebewesen
festzustellen und/oder Stoffe oder Lebewesen in Proben nachzuweisen oder zu
quantifizieren. Bei einem "in-vitro-Diagnostikum" wird der nachzuweisende Analyt,
z. B. Procalcitonin oder gegen Procalcitonin gerichtete Antikörper, in einer Probe
außerhalb eines lebenden menschlichen oder tierischen Körpers nachgewiesen
und/oder dessen Konzentration oder Menge bestimmt. Die erfindungsgemäßen
Polypeptide und/oder die erfindungsgemäßen Antikörper können unmarkiert oder
markiert mit einem Label, z. B. einem radioaktiven Isotop, auch als "in-vivo-
Diagnostikum" beispielsweise im Rahmen eines Funktionstests oder eines
Szintigraphieverfahrens einem Lebewesen appliziert werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können z. B. in physiologisch aktive pCT-
Spaltprodukte, wie insbesondere Calcitonin, weiterverarbeitet werden, um ein
Arzneimittel herzustellen, mit dem man beispielsweise auf den Calcium- und
Knochenstoffwechsel einwirken kann. Des weiteren können die erfindungsgemäßen
Polypeptide selbst oder auch die erfindungsgemäßen Antikörper entweder allein oder
zusammen mit einer oder mehreren pharmakologisch wirksamen Substanzen als
Arzneimittel verabreicht werden, z. B. zur Behandlung von Tumoren, Sepsis und/oder
SIRS. Die erfindungsgemäßen Polypeptide oder auch die erfindungsgemäßen
Antikörper können auch durch Modifikationen und/oder durch die Anbindung
pharmakologisch wirksamer Substanzen in ihrer Wirksamkeit verstärkt werden.
Wieder ein anderer Gegenstand dieser Erfindung umfaßt die erfindungsgemäßen
Polypetide und/oder die erfindungsgemäßen Antikörper in einem pharmazeutisch
verträglichen, sterilen Injektionsmedium. Unter einem pharmazeutisch verträglichen,
sterilen Injektionsmedium ist beispielsweise eine keimfreie, pyrogenfreie Lösung, z. B.
Saline oder eine andere Elektrolytlösung, zu verstehen wie sie üblicherweise zur
intravenösen, intramuskulären, intraperitonealen oder subkutanen Verabreichung
von Arzneimitteln, Impfstoffen oder Kontrastmitteln verwendet wird.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide und/oder die erfindungsgemäßen Antikörper
können insbesondere auch in einem Verfahren zum quantitativen oder qualitativen
Nachweis eines Analyten, bevorzugt Procalcitonin oder gegen Procalcitonin
gerichtete Antikörper, in einer Probe verwendet werden. In einem solchen
erfindungsgemäßen Nachweisverfahren können beispielsweise die
erfindungsgemäßen Polypeptide als Standardantigen und/oder als spezifischer
Bindungspartner in einem Analyt-Bindungspartner-Komplex dienen.
Bei einem quantitativen Nachweis wird die Menge oder die Konzentration des
Analyten in der Probe gemessen. Von dem Begriff des "quantitativen Nachweises"
sind auch semiquantitative Methoden umfaßt, die nur die ungefähre Menge oder
Konzentration des Analyten in der Probe erfassen oder nur zu einer relativen
Mengen- oder Konzentrationsangabe dienen können. Unter einem qualitativen
Nachweis ist der Nachweis des Vorhandenseins des Analyten in der Probe
überhaupt oder das Anzeigen, daß die Konzentration des Analyten in der Probe
unterhalb oder oberhalb eines bestimmten oder mehrerer bestimmter
Schwellenwerte liegt, zu verstehen.
Unter dem Begriff "Analyt" ist die nachzuweisende Substanz zu verstehen. Beispiele
für einen Analyten sind in EP-A2-0 515 194 auf den Seiten 8-15 aufgeführt.
Unter einer "Probe" ist im Sinne der Erfindung das Material zu verstehen, das die
nachzuweisende Substanz vermutlich enthält. Der Begriff Probe umfaßt
beispielsweise biologische Flüssigkeiten oder Gewebe, insbesondere von Menschen
und Tieren, wie Blut, Plasma, Serum, Sputum, Exudat, bronchoalveoläre Lavage,
Lymphflüsigkeit, Synovialflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Vaginalschleim, Feces, Urin,
Liquor, Haare, Haut, Gewebeproben oder -schnitte. Ferner werden umfaßt
Zellkulturproben, pflanzliche Flüssigkeiten oder Gewebe, forensische Proben,
Wasser- und Abwasserproben, Nahrungsmittel, Arzneimittel. Gegebenenfalls
müssen die Proben vorbehandelt werden, um den Analyten für das
Nachweisverfahren zugänglich zu machen oder um störende Probenbestandteile zu
entfernen. Solche Vorbehandlung von Proben mag die Abtrennung und/oder Lyse
von Zellen beinhalten, das Präzipitieren, die Hydrolyse oder die Denaturierung von
Probenbestandteilen wie z. B. Proteinen, die Zentrifugation von Proben, das
Behandeln der Probe mit organischen Lösungsmitteln wie z. B. Alkohole,
insbesondere Methanol; das Behandeln der Probe mit Detergenzien. Häufig wird die
Probe in ein anderes, meistens wässriges, Medium überführt, welches mit dem
Nachweisverfahren möglichst nicht interferieren soll.
Der erfindungsgemäße Nachweis eines Analyten mit den erfindungsgemäßen
Polypeptiden und/oder den erfindungsgemäßen Antikörpern kann mit Verfahren
erfolgen wie beispielsweise: Western Blot, Dot Blot, immunhistochemische
Testverfahren, Immunelektrophorese, Immunfixations-Elektrophorese,
Elektroimmundiffusion, Immunpräzipitation, radiale Immundiffusion, Immunfixation,
Immunchromatographie, Latex-Agglutination, turbidimetrischer oder
nephelometrischer Test, homogener oder heterogener Bindungstest, Ein- oder
Zweischritt-Test, Sandwich-Test, indirekter Test, kompetitiver Test, "point-of-care"-
Teste, etc. Diese und andere Nachweisverfahren sind beispielsweise in "Labor und
Diagnose", ed. L. Thomas, TH-Books-Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt, 1998,
Kapitel 60, oder in "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -
An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques", ed. T. Chard,
Elsevier, Amsterdam, 1987, beschrieben.
Bei Bindungstesten wird der Analyt, soweit in der Probe vorhanden, an einen oder
mehrere analytspezifische Bindungspartner gebunden, und es bilden sich Analyt-
analytspezifische(r) Bindungspartner-Komplexe aus.
Bei homogenen Bindungstesten erfolgt keine Trennung zwischen freien und
komplexgebundenen Analyten. Beispiele für homogene Immunoassays (s. a.
Boguslaski & Li (1982), "Applied Biochemistry and Biotechnology", 7: 401-414) sind
viele turbidimetrische oder nephelometrische Methoden, wobei die zum Nachweis
verwendeten spezifischen Bindungspartner mit Latexpartikel assoziiert sein können;
EMIT®-Teste; CEDIA®-Teste; Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays;
Luminescent-Oxygen-Channeling-Immunoassays (EP-A2-0 515 194; Ullman et al.
(1994) Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 5426-5430; Ullman et al. (1996), "Clinical Chemistry",
42: 1518-1526); etc.
Heterogene Bindungsteste sind durch einen oder mehrere Trennungsschritte
und/oder Waschschritte gekennzeichnet. Die Trennung kann beispielsweise durch
Immunfällung, Fällung mit Substanzen wie Polyethylenglykol oder Ammoniumsulfat,
Filtration, magnetische Abtrennung, Anbindung an eine Festphase wie z. B. an ein
Röhrchen, an eine Kugel, an eine Mikrotitrationsplattenvertiefung, oder an ein Filter-
oder Chromatographiepapier, erfolgen. Bei heterogenen Bindungstesten ist häufig
ein spezifischer Bindungspartner mit einer Komponente eines signalbildenden
Systems und ein spezifischer Bindungspartner mit einer Festphase assoziiert
(betreffend indirekter Bindung s. a. EP-A2-0 411 945). Es kann sich hierbei um
unterschiedliche oder um die gleichen spezifischen Bindungspartner handeln; z. B.
kann ein analytspezifischer, monoklonaler Antikörper sowohl als Fänger (z. B. als
Festphasenantikörper) als auch als markierter Antikörper eingesetzt werden, wenn
der Analyt mehr als ein Epitop aufweist.
Bei heterogenen Sandwich-Testen wird der Analyt üblicherweise von einem
Festphasen-assoziierten, spezifischen Bindungspartner und einem spezifischen
Bindungspartner, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert
ist, gebunden. Bei den spezifischen Bindungspartnern kann es sich im Fall eines
Sandwich-Immungssays um Analyt-spezifische Antikörper handeln oder, wenn der
Analyt selbst ein Antikörper ist, um das Antigen und/oder um ein "modifiziertes
Antigen", z. B. einem gelabelten Antigen, einem Antigenteilstück, einem
Antigenanalogon. Beispiele für solche Sandwichkomplexe sind: Festphase-
Antikörper<<Analyt<<Antikörper-Label oder Festphase-
Antigen<<Analyt(=Antikörper)<<Antigen-Label.
Eine andere Ausführungsform eines heterogenen Immunoassays ist der indirekte
Immunoassay: Der Analyt ist in diesem Fall ein Antikörper. Einer der spezifischen
Bindungspartner ist dessen Antigen und/oder ein modifiziertes Antigen, und der
andere spezifische Bindungspartner ist ein Antikörper, der den Analyten bindet,
und/oder ein Immunglobulin-bindendes Protein. Beispiele für solche Komplexe, die
bei einem indirekten Immunoassay gebildet werden können, sind: Festphase-Anti-
IgM-Antikörper<<Analyt(=Anti-HbsAg-IgM)<<HBsAg-Label oder Festphase-
HBsAg<<Analyt(=Anti-HbsAg-IgG)<<Protein A-Label.
Bei einem heterogenen, kompetitiven Immunoassay konkurriert der Proben-Analyt mit
einem "modifizierten Analyten", z. B. einem gelabelten Analyten, einem
Analytteilstück, einem Analytanalogon, etc., um eine limitierte Anzahl Analyt-
spezifischer Bindungsstellen. Beispiele zur Illustration des Prinzips:
(i) Proben-Analyt konkurriert mit einem Analyt, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, um die Bindung an Festphasen-assoziierte Analyt-spezifische Antikörper oder
(ii) Proben-Analyt konkurriert mit Festphasen-assoziiertem Analyt um die Bindung an Analyt-spezifische Antikörper, die mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert sind.
(i) Proben-Analyt konkurriert mit einem Analyt, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, um die Bindung an Festphasen-assoziierte Analyt-spezifische Antikörper oder
(ii) Proben-Analyt konkurriert mit Festphasen-assoziiertem Analyt um die Bindung an Analyt-spezifische Antikörper, die mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert sind.
Sandwich-Teste, kompetitive Teste und indirekte Teste können auch als homogene
Testverfahren durchgeführt werden (s. a. EP-A2-0 515 194).
Der Begriff "point-of-care-Teste" oder "POC-Teste" ist breit zu verstehen. Er schließt
Teste ein, bei denen kein separates Analyse- oder Meßgerät zur Testdurchführung
oder Testauswertung benötigt wird. POC-Teste basieren in vielen Fällen auf
immunchromatographischen Verfahren, Immunkomplexabtrennungen per Filtration
und/oder Immunfixationstechniken. Die POC-Teste sind insbesondere für
Messungen vor Ort, z. B. am Krankenbett oder daheim, für den Notarzt und/oder
beim niedergelassenen Arzt und weniger für das Großlabor gedacht. POC-Teste
können insbesondere auch von Personen, die keine eingehende medizinisch-
technische Ausbildung und Erfahrung auf dem Gebiet der Laboratoriumsmedizin
haben, durchgeführt werden. Unter der Begriff "POC-Teste" sind im Sinne dieser
Erfindung auch sogenannte Heimteste oder OTC-Teste zu verstehen, die von
medizinischen Laien durchgeführt werden dürfen, so z. B. die diversen
Schwangerschaftsteste die für den Heimgebrauch vertrieben werden. Andere POC-
Teste betreffen beispielsweise den Nachweis von Herzinfarktmarkern, Drogen,
Arzneimitteln, Infektions- und Entzündungsmarkern. Bei vielen POC-Testen sind
oder werden im Laufe der Testdurchführung spezifische Bindungspartner an oder auf
Filter- oder Chromatographiestreifen oder -scheiben assoziiert. Eine positive oder
negative Nachweisreaktion kann zum Beispiel mit dem Erscheinen oder
Nichterscheinen einer Farbbande in einem bestimmten Testfeld verknüpft sein
und/oder dem Erscheinen oder Nichterscheinen eines bestimmten Symbols, z. B.
einem "+", einem "-" und/oder der Intensität des jeweiligen Meßsignals.
Ein POC-Test für pCT kann beispielsweise so aufgebaut sein: Probe und gelabelte
erfindungsgemäße Antikörper, die an pCT zu binden vermögen, werden auf einen
Teststreifen aufgetragen. Geeignete Label sind z. B. gefärbte Latexpartikel,
kolloidales Gold, Enzyme, etc. Sofern pCT in der Probe enthalten ist, werden sich
pCT-Antikörperkomplexe ausbilden. Diese Komplexe bewegen sich mittels
Kapillarkraft in Richtung auf einen Bereich, in dem Antikörper, die an andere pCT-
Epitope zu binden vermögen, z. B. in Form einer Bande fixiert sind oder im Laufe des
Testverfahrens fixiert werden (z. B. über eine Biotin-Avidin-Brücke). Die gelabelten
pCT-Antikörperkomplexe werden in diesem Bereich gebunden und bilden mit den
fixierten Antikörpern einen Sandwichkomplex aus. Die Intensität des Labelsignals ist
hier proportional zur pCT-Probenkonzentration. Bei einem kompetitiven POC-
Testverfahren können beispielsweise die erfindungsgemäßen Polypeptide in einem
Bereich des Teststreifens fixiert sein oder im Laufe des Testverfahrens fixiert
werden. Die fixierten erfindungsgemäßen Polypeptide würden mit pCT aus der Probe
um die Bindung an gelabelte anti-pCT-Antikörper kompetitieren. Alternativ können
auch fixierte anti-pCT-Antikörper und gelabelte erfindungsgemäße Polypeptide für
den Aufbau eines kompetitiven pCT-Testes eingesetzt werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist
ein nephelometrischer oder ein turbidimetrischer Test, insbesondere ein solcher
Test, bei dem erfindungsgemäße Antikörper und/oder erfindungsgemäße
Polypeptide an Latexpartikel assoziiert eingesetzt werden. Eine anderes bevorzugtes
Verfahren ist ein kompetitives Nachweisverfahren bei dem die erfindungsgemäßen
Polypeptide mit einer Festphase und/oder einer Komponente eines signalbildenden
Systems assoziiert sind.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung sind erfindungsgemäße Polypeptide, die
mit einer Festphase und/oder einer Komponente eines signalbildenden Systems
assoziiert sind. Ferner können auch die erfindungsgemäßen Antikörper mit einer
Festphase und/oder einer Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert
sein.
Der Begriff "assoziiert" ist breit zu verstehen und umfaßt beispielsweise eine
kovalente und eine nichtkovalente Bindung, eine direkte und eine indirekte Bindung,
die Adsorption an eine Oberfläche und den Einschluß in eine Vertiefung oder einen
Hohlraum, etc. Bei einer kovalenten Bindung sind die erfindungsgemäßen
Polypeptide und/oder die erfindungsgemäßen Antikörper über eine chemische
Bindung an die Festphase oder an das Label gebunden. Beispiele für eine nicht-
kovalente Bindung sind die Oberflächenadsorption, der Einschluß in Hohlräume oder
die Bindung von zwei spezifischen Bindungspartnern. Neben einer direkten Bindung
an die Festphase oder das Label können die erfindungsgemäßen Polypeptide
und/oder die erfindungsgemäßen Antikörper auch indirekt über spezifische
Wechselwirkung mit anderen spezifischen Bindungspartnern an die Festphase oder
das Label gebunden sein (s. a. EP-A2-0 411 945). Dies soll anhand von Beispielen
näher illustriert werden: Das biotinylierte erfindungsgemäße Polypeptid kann über
labelgebundenes Avidin an das Label gebunden werden, oder es kann ein
Fluorescein-erfindungsgemäßes Polypeptid-Konjugat über festphasengebundene
Anti-Fluorescein-Antikörper an die Festphase gebunden werden, oder der
erfindungsgemäße Antikörper kann über Immunglobulin-bindende Proteine an die
Festphase oder das Label gebunden werden.
Der Begriff "Festphase" im Sinne dieser Erfindung beinhaltet einen Gegenstand, der
aus porösem und/oder nicht porösem, in der Regel wasserunlöslichem Material
besteht und die unterschiedlichsten Formen aufweisen kann, wie z. B. Gefäß,
Röhrchen, Mikrotitrationsplatte, Kugel, Mikropartikel, Stäbchen, Streifen, Filter- oder
Chromatographiepapier etc. In der Regel ist die Oberfläche der Festphase hydrophil
oder kann hydrophil gemacht werden. Die Festphase kann aus den
unterschiedlichsten Materialien bestehen wie z. B. aus anorganischen und/oder aus
organischen Materialien, aus synthetischen, aus natürlich vorkommenden und/oder
aus modifizierten natürlich vorkommenden Materialien. Beispiele für
Festphasenmaterialien sind Polymere wie z. B. Zellulose, Nitrozellulose,
Zelluloseacetat, Polyvinylchlorid, Polyacrylamid, vernetzte Dextranmoleküle,
Agarose, Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polymethacrylat oder Nylon;
Keramik; Glass; Metalle, insbesondere Edelmetalle wie Gold und Silber; Magnetid;
Mischungen oder Kombinationen derselben etc. Auch Zellen, Liposomen oder
Phospholipidvesikel sind vom Begriff Festphase miterfaßt.
Die Festphase kann einen Überzug aus einer oder mehreren Schichten aufweisen,
z. B. aus Proteinen, Kohlehydraten, lipophilen Substanzen, Biopolymeren,
organischen Polymeren oder Mischungen hiervon, um beispielsweise die
unspezifische Bindung von Probenbestandteilen an die Festphase zu unterdrücken
oder zu verhindern, oder um beispielsweise Verbesserungen zu erreichen
hinsichtlich der Suspensionsstabilität von partikulären Festphasen, der
Lagerstabilität, der formgebenden Stabilität oder der Resistenz gegen UV-Licht,
Mikroben oder sonstige zerstörend wirkender Agenzien.
Bei einem "signalbildenden System" kann es sich um eine oder mehrere
Komponenten handeln, wobei es sich wenigstens bei einer Komponente um ein
nachweisbares Label handelt. Als Label ist jedes Molekül zu verstehen, das selbst
ein Signal produziert oder die Produktion eines Signals induzieren kann wie z. B. eine
fluoreszierende Substanz, eine radioaktive Substanz, ein Enzym, oder eine
chemilumineszierende Substanz. Das Signal kann beispielsweise anhand der
Enzymaktivität, der Lumineszenz, der Lichtabsorption, der Lichtstreuung, der
ausgestrahlten elektromagnetischen oder radioaktiven Strahlung, oder einer
chemischen Reaktion nachgewiesen oder gemessen werden.
Ein Label vermag selbst ein nachweisbares Signal zu erzeugen, so daß keine
weiteren Komponenten notwendig sind. Viele organische Moleküle absorbieren
ultraviolettes und sichtbares Licht, wobei durch die Lichtadsorption übertragene
Energie diese Moleküle in einen angeregten Energiezustand kommen können, und
die absorbierte Energie in Form von Licht einer anderen Wellenlänge als der des
eingestrahlten Lichts abgeben. Wieder andere Label können direkt ein
nachweisbares Signal erzeugen wie z. B. radioaktive Isotope oder Farbstoffe.
Wieder andere Label benötigen zur Signalerzeugung weitere Komponenten, d. h. das
signalproduzierende System schließt in einem solchen Fall all die für die
Signalbildung benötigten Komponenten mit ein, wie z. B. Substrate, Coenzyme,
Quencher, Beschleuniger, zusätzliche Enzyme, Substanzen, die mit Enzymprodukten
reagieren, Katalysatoren, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Ionen etc.
Geeignete Label (s. a. EP-A2-0 515 194; US 5,340,716; US 5,545,834; Bailey et al.
(1987), "J. Pharmaceutical & Biomedical Analysis" 5: 649-658) sind beispielsweise
Enzyme einschließlich Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Glukose-6-
Phosphatdehydrogenase, Alkoholdehydrogenase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase,
Luciferase, Urease und Acetylcholinesterase; Farbstoffe; fluoreszierende
Substanzen einschließlich Fluorescein, Isothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin,
Phycocyanin, Ethidiumbromid, 5-Dimethylaminonapthalen-1-sulfonyl und
fluoreszierende Chelate von seltenen Erden; chemilumineszierende Substanzen
einschließlich Luminol, Isoluminol, Acridiniumverbindungen, Olefin, Enolether,
Enamin, Arylvinylether, Dioxen, Arylimidazol, Lucigenin, Luciferin und Aequorin;
Sensitizer einschließlich Eosin, 9,10-Dibromoanthracen, Methylen-Blau, Porphyrin,
Phthalcyanin, Chlorophyll, Rose Bengal; Coenzyme; Enzymsubstrate; radioaktive
Isotope einschließlich 125I, 131I, 14C, 3H, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 59Fe, 57Co und 75Se;
Partikel einschließlich magnetische Partikel oder Partikel, bevorzugt Latexpartikel,
die selbst beispielsweise mit Farbstoffen, Sensitizern, fluoreszierenden Substanzen,
chemilumineszierenden Substanzen, Isotopen oder anderen nachweisbaren Labeln
markiert sein können; Solpartikel einschließlich Gold- oder Silbersolen; Liposomen
oder Zellen, die selbst mit nachweisbaren Labeln markiert sein können etc.
Ein signalbildendes System kann auch Komponenten umfassen, die bei räumlicher
Nähe miteinander in eine nachweisbare Wechselwirkung treten können, z. B. in Form
von Energiespendern und Energieempfängern wie beispielsweise Photosensitizer
und chemolumineszierende Substanzen (EP-A2-0 515 194), Photosensitizer und
Fluorophore (WO 95/06877), radioaktives Iod125 und Fluorophore (Udenfriend et al.
(1985), Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672-8676), Fluorophore und Fluorophore (Mathis
(1993), Clin. Chem. 39: 1953-1959) oder Fluorophore und Fluoreszenz-Quencher (US 3,996,345).
Unter einer Wechselwirkung zwischen den Komponenten ist die direkte Übertragung
von Energie zwischen den Komponenten, z. B. durch Licht- oder Elektronenstrahlung
sowie über kurzlebige reaktive, chemische Moleküle, miteingeschlossen. Ferner
umfaßt sind hiervon auch Vorgänge, bei denen die Aktivität einer Komponente durch
eine oder mehrere andere inhibiert oder verstärkt wird, beispielsweise die Hemmung
oder Steigerung der Enzymaktivität oder die Hemmung, Steigerung oder
Veränderung (z. B. Wellenlängenverschiebung, Polarisation) des von der
beeinflußten Komponente ausgesendeten elektromagnetischen Strahlung. Die
Wechselwirkung zwischen den Komponenten umfaßt auch Enzymkaskaden. In
diesem Fall sind die Komponenten Enzyme, von denen mindestens eines das
Substrat für ein anderes liefert, so daß eine maximale oder minimale
Reakionsgeschwindigkeit der gekoppelten Substratumsetzung resultiert.
Eine effektive Wechselwirkung zwischen den Komponenten findet in der Regel statt,
wenn diese räumlich benachbart vorliegen, also z. B. innerhalb eines
Abstandbereiches von wenigen µm, insbesondere innerhalb eines Abstandbereiches
von unter 600 nm, bevorzugt unter 400 nm, ganz besonders bevorzugt von unter 200 nm.
Mikropartikel werden häufig als Festphase und/oder als Label genutzt. Unter dem
Begriff "Mikropartikel" sind im Sinne dieser Erfindung Teilchen zu verstehen, die
einen ungefähren Durchmesser von wenigstens 20 nm und nicht mehr als 20 µm
aufweisen, üblicherweise zwischen 40 nm und 10 µm, bevorzugt zwischen 0,1 und
10 µm, besonders bevorzugt zwischen 0,1 bis 5 µm, ganz besonders bevorzugt
zwischen 0,15 und 2 µm. Die Mikropartikel können regelmäßig oder unregelmäßig
geformt sein. Sie können Kugeln, Spheroide, Kugeln mit mehr oder weniger großen
Kavitäten oder Poren darstellen. Die Mikropartikel können aus organischem, aus
anorganischem Material oder aus einer Mischung oder Kombination von beiden
bestehen. Sie können aus einem porösen oder nicht porösen, einem schwellfähigen
oder nicht schwellfähigen Material bestehen. Prinzipiell können die Mikropartikel
jegliche Dichte haben; bevorzugt sind jedoch Partikel mit einer Dichte, die der Dichte
des Wassers nahekommt, wie etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml. Die bevorzugten
Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen suspendierbar und möglichst lange
suspensionsstabil. Sie mögen durchsichtig, teilweise durchsichtig oder
undurchsichtig sein. Die Mikropartikel können aus mehreren Schichten bestehen, wie
beispielsweise die sogenannten "core-and-shell"-Partikel mit einem Kern und einer
oder mehreren umhüllenden Schichten. Der Begriff Mikropartikel umfaßt
beispielsweise Farbstoffkristalle, Metallsolen, Silica-Partikel, Glaspartikel,
Magnetpartikel, Polymerteilchen, Öltropfen, Lipidpartikel, Dextran, und
Proteinaggregate. Bevorzugte Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen
suspendierbare und aus wasserunlöslichem Polymermaterial bestehende Partikel,
insbesondere aus substituierten Polyethylenen. Ganz besonders bevorzugt sind
Latexpartikel z. B. aus Polystyrol, Acrylsäurepolymeren, Methacrylsäurepolymeren,
Acrylnitril-Polymeren, Acrylnitril-Butadien-Styrol, Polyvinylacetat-Acrylat,
Polyvinylpyridin, Vinylchlorid-Acrylat. Von besonderem Interesse sind Latexpartikel
mit reaktiven Gruppen an ihrer Oberfläche wie beispielsweise Carboxyl-, Amino- oder
Aldehydgruppen, die eine kovalente Bindung z. B. von spezifischen
Bindungspartnern an die Latexpartikel erlauben. Die Herstellung von Latexpartikeln
ist beispielsweise in EP 0 080 614, EP 0 227 054 und EP 0 246 446 beschrieben.
Ein anderer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Testkit, der einen oder mehrere
der erfindungsgemäßen Antikörper und/oder einen oder mehrere der
erfindungsgemäßen Polypeptide enthält. In einem solchen Kit sind üblicherweise alle
oder nur einige Komponenten eines Testes in abgepackter Form enthalten. Die
erfindungsgemäßen Antikörper und die erfindungsgemäßen Polypeptide können
beispielsweise mit einer oder mehreren Festphasen und/oder einer oder mehreren
Komponenten eines signalbildenden Systems assoziiert sein. Der Testkit kann
beispielsweise Standards, Kontrollen sowie andere Reagenzien, wie z. B. Puffer,
Waschlösungen, Meßsignal-auslösende Lösungen und/oder Enzymsubstrat,
Küvetten, Pipetten und/oder Testanweisungen enthalten. Eine besonders
bevorzugter erfindungsgemäßer Testkit enthält an Latexpartikel assoziierte
erfindungsgemäße Polypeptide und/oder erfindungsgemäße Antikörper.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide in Standards und/oder
Kontrollen ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. Bei
Nachweisverfahren wird die Konzentration, Menge oder Aktivität einer
nachzuweisenden Substanz in einer Probe häufig mit Hilfe von Referenz- oder
Standardkurven bestimmt. Zur Erstellung solcher Referenzkurven werden Standards,
auch Kalibratoren genannt, die eine bestimmte bekannte Konzentration, Menge oder
Aktivität des Analyten enthalten, im Nachweisverfahren gemessen. Durch Vergleich
der Proben-Meßsignalwerte mit der Referenzkurve kann letzlich die Konzentration,
Menge oder Aktivität des Analyten in der Proben ermittelt werden.
Kontrollen enthalten ähnlich wie die Standards eine bestimmte bekannte
Konzentration, Menge oder Aktivität des Analyten oder eines modifizierten Analyten
und dienen zur Überprüfung des Nachweisverfahrens.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Standards und/oder Kontrollen wird eine
bestimmte Menge eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Polypeptide einer
Matrix zugefügt. Diese Matrix kann beispielsweise ein menschliches oder tierisches
Serum oder Plasma sein oder auch eine künstliche Matrix wie beispielsweise ein
proteinloser oder ein proteinhaltiger Puffer, der auch noch weitere Stoffe enthalten
kann. Die Standards und Kontrollen können auch einen oder mehrere zusätzliche
Analyte enthalten. Sie können in flüssiger, gefrorener oder lyophilisierter Form
vorliegen, so daß entweder direkt oder erst nach Aufbereitung in den
Nachweisverfahren eingesetzt werden können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind stabile pCT-Lösungen, die
beispielsweise als Kontrollen, Standards oder auch für andere in-vitro- sowie in-vivo-
Anwendungen genutzt werden können. "Stabil" bedeutet in diesem Zusammenhang,
daß die gewünschte Eigenschaft des in der Lösung enthaltenen Procalcitonins, z. B.
die Bindungsfähigkeit an bestimmte Antikörper, über einen bestimmten Zeitraum
insbesondere bei Flüssiglagerung weitgehend unverändert bleibt, während sich diese
Eigenschaft bei "instabilen" pCT-Lösungen im gleichen Zeitraum deutlich verändert.
Stabile pCT-Lösungen lassen sich herstellen, indem die erfindungsgemäßen
Polypeptide und Sterinester einer serum/plasma-haltigen oder serum/plasma-freien
Matrix zugefügt werden.
Insbesondere bei als pCT-Kontrollen und/oder als pCT-Standards eingesetzten pCT-
Lösungen kann das eingesetzte pCT auch z. B. ein aus natürlichen Quellen isoliertes
oder rekombinant hergestelltes Peptid sein, welches zumindest wesentliche
Teilbereiche der Aminosäuresequenz von humanen pCT enthält, wie zum Beispiel
größere Spaltprodukte von pCT. Das Peptid muß aber in einem Verfahren zum
quantitativen oder qualitativen Nachweis von pCT als Standard- und/oder
Kontrollserumantigen geeignet sein.
Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen pCT-Lösung geeigneten Sterinester
gehören zu der Stoffklasse der Steroide (Gonanderivate), die allgemein eine
Hydroxygruppe in der 3-β-Position kennzeichnet. Wesentliche Unterschiede
bestehen in der in 17(20)-Stellung haftenden Seitenkette. Sterine stellen eine große
Klasse dar (BEYER et al. (1981), "Lehrbuch der organischen Chemie", S. 649-664
"Steroide"). Vorteilhafterweise können Vitamin D3, Oestron, Stigmasterin und
besonders vorteilhaft Cholesterin und desen Derivate verwendet werden.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Sterinester besitzen bevorzugt außerdem eine
über eine Dicarbonsäure gekoppelte Polyethylenglykolgruppe (PEG-Gruppe).
Prinzipiell können alle bekannten Dicarbonsäuren verwendet werden; besonders
vorteilhaft ist die Verwendung von Bernsteinsäure, Adipinsäure oder Sebacinsäure.
Die PEG-Gruppe soll im wesentlichen auch die Löslichkeit des Sterinesters
gewährleisten, so daß der Fachmann, gegebenenfalls durch ein Experiment, die
optimale Länge leicht bestimmen kann. Erfahrungsgemäß sind folgende
Kettenlängen vorteilhaft: Polyethylenglycol 600, Polyethylenglycol 900 oder
Polyethylenglycol 3000.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen pCT-Lösungen werden bevorzugt
Sterinester der allgemeinen Formel I eingesetzt:
R1-O-(O)C-R2-C(O)-O-[CH2-CH2-O]n-CH2-CH2-OH Formel I,
worin n = 1-200 und
R1 = Sterin ist,
R2 = aliphatischer oder aromatischer Ring mit 4 bis 8 C-Atomen, von denen mindestens eines durch N, S oder O ersetzt werden kann, oder eine geradlinige oder verzweigte Kette mit 0 bis 12 C-Atomen darstellt, besonders bevorzugt ist die Verwendung der Sterinester in denen R1 eine Verbindung der allgemeinen Formel II ist:
R1 = Sterin ist,
R2 = aliphatischer oder aromatischer Ring mit 4 bis 8 C-Atomen, von denen mindestens eines durch N, S oder O ersetzt werden kann, oder eine geradlinige oder verzweigte Kette mit 0 bis 12 C-Atomen darstellt, besonders bevorzugt ist die Verwendung der Sterinester in denen R1 eine Verbindung der allgemeinen Formel II ist:
R4 und R5H oder -CH3 sein können,
R6 eine geradkettige oder verzweigte Kette mit 1 bis 12 C-Atomen, eine -OH oder =O Gruppe sein kann,
die Ringe A, B, C und D jeder für sich gesättigt, ungesättigt, oder aromatisch sein können
und, wenn R4 = -C(19)H3 ist, der Ring B zwischen C(9) und C(10) unter Ausbildung einer Doppelbindung zwischen C(9) und C(19) geöffnet sein kann.
R6 eine geradkettige oder verzweigte Kette mit 1 bis 12 C-Atomen, eine -OH oder =O Gruppe sein kann,
die Ringe A, B, C und D jeder für sich gesättigt, ungesättigt, oder aromatisch sein können
und, wenn R4 = -C(19)H3 ist, der Ring B zwischen C(9) und C(10) unter Ausbildung einer Doppelbindung zwischen C(9) und C(19) geöffnet sein kann.
Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung von Sterinestern, wobei der
Sterinrest von Cholesterin, Vitamin D3, Stigmasterin oder Oestron stammt.
Vorteilhafterweise wird der Sterinester in einer solchen Konzentration zugesetzt, daß
die Konzentration in der pCT-Lösung 0.05-5 Gew.-%, bevorzugterweise 0.1-3 Gew.-
%, besonders bevorzugterweise 0.5-1.5 Gew.-% beträgt.
Die erfindungsgemäßen pCT-Lösungen können auch Proteinaseinhibitoren, z. B.
Aprotinin, Benzamidin, Bestatin, Cystatin, Pepstatin, PMSF, Trypsin-Inhibitor,
und/oder Detergenzien, insbesondere nicht-ionische und/oder zwitter-ionische
Detergenzien, enthalten.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsart der pCT-Lösung enthält neben den
Sterinestern auch Polygeline. Polygeline ist eine Mischung aus thermisch abgebauten
und vernetzten Gelatineproteinen und kann hergestellt werden nach der deutschen
Auslageschrift 11 55 134 oder dem US-Patent 3057782. Vorteilhafterweise wird
Polygeline in einer solchen Konzentration zugesetzt, daß die Konzentration in der
pCT-Lösung 0.1-10 Gew.-% bevorzugterweise 1-8 Gew.-% besonders
bevorzugterweise 2-6 Gew.-% beträgt.
Zur Messung des Stabilisierungseffektes - insbesondere bei als Standards und/oder
Kontrollen dienenden pCT-Lösungen - kann beispielsweise pCT in einem
nephelometrischen Meßverfahren bestimmt werden.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung beinhaltet die Verwendung der
erfindungsgemäßen Standards, Kontrollen und pCT-Lösungen in Verfahren zum
quantitativen oder qualitativen Nachweis von pCT, Calcitonin, Katacalcin, N-
Procalcitonin und/oder anderen pCT-Fragmenten in einer Probe.
Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz von humanem pCT.
Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Polypeptids ohne (A)
und mit (B) Fusionsanteil.
Fig. 3 zeigt die Nukleinsäuresequenz des Vektors pQE-30 (3462 Basenpaare).
Fig. 4 zeigt die Nukleinsäuresequenz des pCT-kodierenden Inserts, welches in pQE-
30 kloniert wurde, einschließlich der verwendeten Schnittstellen.
Fig. 5 zeigt die Nukleinsäuresequenz von humanem pCT
Die im folgenden beschriebenen Beispiele dienen zur exemplarischen Beleuchtung
einzelner Aspekte dieser Erfindung und sind nicht als Einschränkung zu verstehen.
Der N-Terminus von pCT (siehe Fig. 1) wurde mittels synthetischer Oligonukleotide
konstruiert, während der C-Terminus mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) auf
Basis genomischer humaner plazentärer DNA durchgeführt wurde:
Verwendet wurden als Primer die beiden folgenden Oligonukleotide:
Wobei die jeweils 16 3'-terminalen Nukleotide zueinander komplementär waren.
Es wurde folgende PCR durchgeführt:
In einem 50-µl-Reaktionsansatz wurden (0,25 mM dNTP (Amersham Pharmacia,
Freiburg, Deutschland, je 1 µM der Primer 1094 und 1095, 10 mM Tris HCl, pH 8.3,
50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0,001% Gelatine, 2,5 U Ampli-Taq-DNA-Polymerase
(Perkin Elmer, Branchburg, New Jersey, USA)) pipettiert und nach folgendem
Temperaturprogramm mittels des Thermocyclers "GenAmp 9700" von Perkin Elmer
(auch alle weiteren PRC-Reaktionen wurden auf demselben Gerät durchgeführt)
amplifiziert:
Initial: 5' 94°C
5 × der Zyklus: 94°C 30 sec, 52°C 30 sec und 72°C 30 sec
Terminal: 72°C 10 min.
5 × der Zyklus: 94°C 30 sec, 52°C 30 sec und 72°C 30 sec
Terminal: 72°C 10 min.
5 µl dieses Ansatzes wurden in einem neuen 50-µl-Ansatz wie oben jedoch unter
Verwendung der Primer 1098 und 1099
und nach folgendem Temperaturprogramm durchgeführt:
Initial: 5' 94°C
30 × der Zyklus: 94°C 30 sec, 56°C 30 sec und 72°C 30 sec
Terminal: 72°C 10 min.
30 × der Zyklus: 94°C 30 sec, 56°C 30 sec und 72°C 30 sec
Terminal: 72°C 10 min.
5 µl dieses Ansatzes wurden mit 0,5 µg des Vektors pCR2.1 des TA-Cloning-Kits von
Invitrogen nach Angaben des Herstellers ligiert und in E.coli INVαF' transformiert.
Das neukonstruierte Plasmid wurde nach Standardmethoden isoliert und
sequenziert; dabei wurde ein Aminosäureaustausch von L zu R an Position 35 des
Procalcitonins gefunden.
Nach Standardmethoden (alle als Standardmethoden beschriebenen Protokolle
stammen aus "Current Protocols in Molecular Biology", 1995, Wiley & Sons, Inc. New
York, USA) wurde aus 2 g humanem Plazentagewebe genomische DNA isoliert und
als Template für die folgende PCR eingesetzt:
In einem 50-µl-Reaktionsansatz wurden laut Herstellerangaben zu dem Taq PCR
Core-Kit Cat. No.: 201223 (Qiagen, Hilden, Deutschland) als Template 0,5 µg (1 µl)
gen. hum. DNA, und als Primer je 1 µg der Primer 1100 und 1101 hinzu pipettiert
und nach folgendem Temperaturprogramm amplifiziert:
Initial: 3' 94°C
30 × der Zyklus: 94°C 30 sec, 45°C 30 sec und 72°C 30 sec
Terminal: 72°C 10 min.
30 × der Zyklus: 94°C 30 sec, 45°C 30 sec und 72°C 30 sec
Terminal: 72°C 10 min.
5 µl dieses Ansatzes wurden mit 0,5 µg des Vektors pCR2.1 des TA-Cloning-Kits von
Invitrogen nach Angaben des Herstellers ligiert und in E.coli INVαF' transformiert.
Das neukonstruierte Plasmid wurde nach Standardmethoden isoliert und
sequenziert; hierbei konnte das Vorliegen der Wildtypsequenz bestätigt werden.
1 µg des Vektors pQE-30 (Qiagen) wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamHI
und HindIII (sämtliche Restriktionsendonukleasen wurden von Boehringer
Mannheim, Mannheim, Deutschland, bezogen) geöffnet. Weiter wurde aus dem
Plasmid pCR2.1, welches den N-Terminus enthielt, der N-Terminus mittels BamHI
und HindIII (BamHI und HindIII waren artifiziell über die PCR eingeführt worden)
ausgeschnitten, nach Standardmethoden isoliert und in den geöffneten Vektor pQE-
30 ligiert. Das Konstukt wurde isoliert und mittels BgIII und HindIII geöffnet (BgIII
kommt natürlicherweise am 3'Ende des N-Terminus vor und konnte hier zur
Kontruktion eingesetzt werden). Schließlich wurde aus dem Vektor pCR2.1., welcher
den C-Terminus enthielt, der C-Terminus mittels BgIII und HindIII ausgeschnitten,
nach Standardmethoden isoliert und in den mit BgIII und HindIII geöffneten Vektor
pQE-30, welcher schon den N-Terminus enthielt, ligiert. Der das korrekte Plasmid
enthaltende Klon wurde identifiziert und das Konstrukt durch Sequenzierung
verifiziert. Das von BamHI bis HindIII reichende, für die Konstruktion verwendete
Insert ist in Fig. 4, die natürliche humane pCT-Sequenz in Fig. 5 gezeigt.
Die Expression von Procalcitonin wurde zunächst im Kleinstmaßstab von 1 ml
durchgeführt:
1 ml LB-Medium (Current Protocols in Molecular Biology), welches 50 µg Ampicillin
(Sigma, Deisenhofen, Deutschland) enthielt, wurde mit einer Einzelkolonie des
Expressionsplasmids im E.coli-Stamm JM109 angeimpft und bei einer OD600 von 0,4
mit 1 mM IPTG (Isopropyl-Thio-galaktosid, Sigma) für 2 h induziert.
Unerwarteterweise wurde dabei eine starke Expression des Fusionsproteins von
humanem pCT mit dem N-Teminus des pQE-Vektors MRGSHHHHHHGS bei
Analyse des Gesamtproteins der Kultur in einem Coomassie-gefärbten PAGE-Gel
(Current Protocols in Molecular Biology) gefunden.
Hierauf wurde die Expression in einem größeren Maßstab nach
Standardbedingungen durchgeführt, d. h. von einem Einzelklon wurde eine
Übernachtkultur in 100 ml LB-Medium, welche 50 µg/ml Ampicillin enhielt angelegt
und bei 37°C geschüttelt. Diese stationär gewachsene Kultur wurde 1 : 50 in 1 l
frisches LB-Medium (Ampicillin 50 µg/ml) verdünnt, weiter bei 37°C geschüttelt und
bei einer OD600 von 0,6 mit 1 mM IPTG für 3 h induziert.
Überraschenderweise wurde dabei ein drastischer Einbruch bzw. eine völlige
Einstellung der Expression des Fusionsproteins festgestellt. Dieses negative
Ergebnis ließ sich reproduzieren, was darauf schließen läßt, daß das Fusionsprotein
für E.coli toxisch wirkt und sehr schnell eine Selektion auf Mutanten erfolgt, die das
Fusionsprotein nicht oder nur sehr schlecht exprimieren. Es wurde daher versucht,
die Expression zu optimieren.
Variiert wurde dabei der Expressionsstamm (JM109, M15, BL21 und W3110
(Stratagene, LaJolla, USA), die Stärke des Selektionsdrucks über die Variation der
Ampicillin-Konzentration, die Stärke der Induktion über Variation des Induktors IPTG
und die Expressionsdauer durch Verfolgung des zeitlichen Verlaufs der
Induktionsstärke nach der Induktion.
Gefunden wurden dabei die folgenden optimalen Parameter:
Frisch mit dem Expressionsplasmid transformierte JM109 werden über Nacht bei
37°C unter Schütteln in LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin angezogen und dann
1 : 50 in 1 l frischem LB-Medium (Ampicillin 100 µg/ml) verdünnt und weiter bei 37°C
geschüttelt, und bei einer OD600 von 0,4 mit 2 mM IPTG für 3 h induziert.
Bei Einhaltung dieser optimierten Bedingungen wurden reproduzierbar ca. 13 mg
Fusionsprotein aus 1 l Kultur nach einer Reinigung unter nativen Bedingungen über
Metallaffinitätschromatographie nach Angaben des Herstellers (Talon Metal Affinity
Resin, Clontech, Palo Alto, USA) und anschließender Gelfiltration über SuperdexTM 75
HiLoad (Amersham Pharmacia), erhalten.
Die aminoterminale Sequenz des rekombinaten, humanen Procalcitonins wurde
durch automatischen Edmanabbau an einem Applied-Biosystems-477A-Sequenzer
bestimmt.
Die gefundene, aminoterminale Sequenz ist nach der Sequenz des pQE-Vektors
identisch zu der gefundenen von pCT aus einem humanen Schilddrüsentumor (J. M.
Conlon et al. (1988), Biochm. J. 256: 245-259) (s. Tabelle 1).
Die Bestimmung der relativen Molekülmasse des hergestellten, rekombinanten
Procalcitonins erfolgte mittels Elektrospray-Massenspektrometrie. Das nach
Expression und Aufreinigung erhaltene, rekombinante pCT wurde gegen destilliertes
Wasser dialysiert und in einer Konzentration von 50 µg/ml in Methanol/Wasser/
Essigsäure (50/50/0.1) vermessen (Orifice-Spannung 90 V; Ionenspray-Voltage
5000 V).
Die aus dem erhaltenen Spektrum berechnete, mittlere Molekülmasse von
rekombinanten humanen pCT beträgt 14235 ± 2 Dalton.
Das Ergebnis ist in sehr guter Übereinstimmung mit der auf Basis der theoretischen
Aminosäuresequenz (J. M. Conlon et al. (1988), Biochem. J., 256: 245-250) und
unter Berücksichtigung des pQE-Vektor-Fusionanteils (pQE-Vektor:
MRGSHHHHHHGS) und des Aminosäurenaustauschs an Position 35 (L zu R)
berechneten theoretischen Masse von 14239 Dalton und bestätigt somit die
Expression von rekombinanten humanen pCT.
Der LUMItest® PCT (B. R. A. H. M. S. Berlin) ist ein immunoluminometrischer Assay zur
Bestimmung von Procalcitonin. Dabei werden zwei monoklonale Antikörper, die das
Procalcitonin an zwei verschiedenen Stellen (dem Calcitonin- und dem Katacalcin-
Anteil) binden, eingesetzt.
Nach Durchführung des Tests gemäß Testbeschreibung des Herstellers werden die
Lumineszenzsignale in einem dafür geeigneten Luminometer ermittelt. Die Größe
des Lumineszenzsignals ist der PCT-Konzentration der jeweiligen Probe direkt
proportional. Über die Lumineszenzsignal-Werte der mitgeführten Standards läßt
sich eine Standardkurve erstellen, an der die unbekannte Procalcitonin-
Konzentration der Probe abgelesen werden kann.
Das nach Expression und Aufreinigung erhaltene, rekombinante pCT wurde in zwei
verschiedenen Verdünnungen im LUMItest® PCT, nach Arbeitsanleitung des
Herstellers, bestimmt (siehe Tabelle 2).
Unter Berücksichtigung der beiden eingesetzten Verdünnungen (1 : 10 000 und 1 : 100 000)
errechnet sich für die beiden untersuchten Proben folgender pCT-Gehalt nach
LUMItest® PCT.
Rek. PCT Verd 1: 0,5041 mg/ml
Rek. PCT Verd 2: 0,4463 mg/ml.
Rek. PCT Verd 2: 0,4463 mg/ml.
Diese Untersuchung untermauert die Identität des rekombinanten pCT mit humanen
pCT und zeigt die Verwendbarkeit von rek. pCT zu Beispiel als Standard- und/oder
Kontrollserenmaterial in einem diagnostischen Assay zur Bestimmung von humanen
pCT.
BALB/c-Mäuse werden mit 20 µg rek. pCT in kompletten Freund'schen Adjuvants
intraperitoneal immunisiert. Nach 4 Wochen erfolgt ein Booster mit 20 µg rek. pCT in
inkompletten Freund'schen Adjuvants (Fa. ICN Biomedical GmbH, Eschwege,
Deutschland) und nach 8 Wochen mit 20 µg rek. pCT ohne Freund'schen Adjuvants.
Die letzten 3 Tage vor der Fusion werden die Mäuse intravenös mit je 20 µg rek. pCT
geboostert.
Nach dem Töten der Mäuse durch CO2-Inhalation wurden die Milzen entnommen
und Einzelzellsuspensionen in serumfreien Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium
(DMEM, Fa. CC Pro GmbH, Neustadt/W, Deutschland) hergestellt. Die Zellen
wurden zentrifugiert (g-Zahl 652) und 2 × in DMEM gewaschen. Anschließend wurde
die Zellzahl mittels Trypanblau-Färbung bestimmt. Zu etwa 108 Milzzellen wurden
2 × 107 Myelomzellen (Sp2/0) gegeben. Nach dem Zentrifugieren (g-Zahl 360) wurde
der Überstand verworfen, 1 ml Polyethylenglycol-Lösung (PEG 4000, Fa. Merck,
Eurolab, Bruchsal, Deutschland; ca. 50%ig in DMEM) auf das Zellpellet gegeben und
nach Resuspension 1 Minute bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde tropfenweise
ca. 10 ml DMEM zugegeben und 2 bis 4 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die
fusionierten Zellen wurden abzentrifugiert (g-Zahl 326) und das Pellet in DMEM +
20% FKS (fötales Kälberserum, Fa. Biowithaker Europe, Verviers, Belgien) + HAT-
Lösung (Fa. CC Pro GmbH, Neustadt/W, Deutschland) resuspendiert und in 24 Well-
Zellkulturplatten (Fa. Costar) abgefüllt. Die ungefähre Zellkonzentration pro Well
betrug 5 × 104 bis 5 × 106 Zellen.
2-3 Wochen später wurden die entstandenen Zellkolonien (Hybride) entnommen
und in neue Kulturplatten überführt.
Die Spezifität der in die Zellkultur abgegebenen Antikörper wurden in einem ersten
Testschritt mit Hilfe von Immunisierungsantigen-beschichteten Mikrotiterplatten (Fa.
Nung, Typ B), Beschichtung 0,2 µg/ml ≈ 0,003 µg/Vertiefung, getestet.
In jede Vertiefung der Mikrotiterplatte wurden 100 µl Zellkulturüberstand
(Verdünnung 1 : 2) pipettiert und 1 Stunde bei +15 bis +25°C inkubiert. Nach
zweimaligem Waschen der Platte mit Waschlösung-POD (OSEW; Fa. Dade Behring,
Marburg, Deutschland) wurden in jede Vertiefung 100 µl anti-Maus IgG/F(ab)2-POD-
Konjugat (Fa. Dade Behring, Marburg, Deutschland) eingefüllt und 1 Stunde bei +15
bis +25°C inkubiert. Nach weiterem zweimaligem Waschen der Platte wurde in jede
Vertiefung 100 µl Chromogen-TMB-Lösung (Fa. Dade Behring, Marburg,
Deutschland) eingefüllt und weitere 30 Minuten bei +15 bis +25°C inkubiert. Nach der
Inkubation wurde in jede Vertiefung 100 µl Stopplösung POD (Fa. Dade Behring,
Marburg. Deutschland) eingefüllt und die Mikrotiterplatte am BEP II (Behring-ELISA-
Prozessor II) bei 450 nm ausgewertet.
In einem 2. Testschritt wurden die Hybride wie oben beschrieben überprüft mit Hilfe
von Mikrotiterplatten (Fa. Nung, Typ B), die mit folgenden Peptiden beschichtet
waren:
- a) Rekombinantes humanes pCT (0,03 µg/Vertiefung)
- b) Calcitonin human RSA-Konjugat (0,5 µg/Vertiefung, Fa, Bachem, Prod. Nr.: H- 2250)
- c) Katacalcin human (PDN-21) RSA-Konjugat (0,5 µg/Vertiefung, Fa, Peninsula, Prod. Nr.: 6004)
- d) Calcitonin N-Terminal Flanking Peptide RSA-Konjugat (0,5 µg/Vertiefung, Fa, Bachem, Prod. Nr.: H-3076) = humanes N-Procalcitonin
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgelistet.
Einzelne Zellen von Hybriden, die die erfindungsgemäßen Antikörper produzieren
(Bindung an humanes pCT), wurden mit einem Mikromanipulator (Fa. Leitz, Wetzlar,
Deutschland) kloniert.
Die Subklasse des Antikörpers wird mittels IsoStripTM-Mouse Monoclonal Antibody
Isotyping-Kit der Fa. Boehringer, Mannheim, Deutschland, bestimmt.
Für die Produktion größerer Mengen der erfindungsgemäßen Antikörper werden die
entsprechenden Zellklone in Rollerflaschen (Fa. Corning Costar, Bodenheim, Deutschland)
überführt, und bis zum gewünschten Endvolumen bei +37°C expandiert.
Danach wird die Rollerkultur-Suspension zur Entfernung der Zellen über 0,22 µm
filtriert. Die jetzt zellfreie Antikörperlösung wird über Ultrafilter (Trenngrenze 30 Kilodalton)
ankonzentriert und anschließend aufgereinigt.
Die erhaltene Antikörperlösung wird gegen 0,14 M Phosphatpuffer pH 8,6
umgepuffert und auf ein mit rProtein A Sepharose Fast Flow (Fa. Amersham
Pharmacia) gefüllte Chromatographiesäule aufgetragen (pro 10 mg zu reinigender
Antikörper werden 1 ml rProtein A Sepharose Fast Flow eingesetzt). Alle nicht
gebundenen Komponenten werden durch Waschen der Säule mit 0,14 M
Phosphatpuffer pH 8,6 entfernt. Der gebunde Antikörper wird mit 0,1 M
Zitronensäure pH 3,0 von der Säule eluiert und gegen 0,05 M Natriumacetat + 0,5 M
NaCl + 0,05 M Tris + 0,01% Natriumazid pH 7,0 dialysiert.
An Latexpartikel, hergestellt nach EP-0246 446 mit einem Durchmesser von 250 bis
310 nm wurde jeweils ein erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper gegen
Calcitonin und ein erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper gegen Katacalcin
gebunden:
Das verwendete Latexpolymerisat wurde mit destilliertem Wasser auf einen Feststoffgehalt
von 4 Gew.-% verdünnt. Die zu bindenden Antikörper wurden mit 0,05 M
Natriumacetat + 0,5 M NaCl + 0,05 M Tris + 0,01% Natriumazid pH 7,0 auf einen
Proteingehalt von 5 mg/ml verdünnt. 1 ml des obengenannten Polymerisats wurde
mit 200 µl Antikörper-Lösung gemischt. Dann wurden 0,050 ml einer 20%igen
Lösung von Tween 20 (Fa. Merck Eurolab, Darmstadt, Deutschland) hinzugegeben
und das Ganze nochmals gemischt. Hierzu wurde 0,025 ml 1 N HCL zugegeben, so
daß ein pH-Wert von ca. 3 erreicht wurde. Nach einer Inkubationszeit von 30 min. bei
Raumtemperatur wurde 0,25 ml 1 M Phosphatpuffer pH 6,5 und 0,25 ml
Natriumcyanborhydrid-Lösung (25 mg/ml) hinzugesetzt und gut durchgemischt.
Anschließend erfolgte eine Inkubation von 1 Stunde bei Raumtemperatur.
Dieser Beladungsansatz wurde sodann 30 min. bei ca. 50 000 g zentrifugiert. Der
Überstand wurde verworfen. Der Rückstand wurde in 4 ml Imidazolpuffer pH 8,1
(5 g/L Imidazol, 40 g/L Saccharose, 1 g/L Humanalbumin) resuspendiert. Anschließend
erfolgte eine Ultraschall-Behandlung (Bronson Sonyfier B!%) für 30 Sekunden. Das
so redispergierte Reagenz wurde im Volumenverhältnis 1 : 7,5 mit dem zuvor
genannten Imidazolpuffer verdünnt und nochmals 30 Sekunden mit Ultraschall
behandelt.
Der Proteingehalt des nach Expression und Aufreinigung erhaltenen rekombinanten
pCT wurde mittels einer Proteinbestimmung nach Lowry et al. (1951, J. Biol.Chem.
193, 265-275) in der Präparation bestimmt. Zur Herstellung eines Standards wurde
eine geeignete Menge dieser Präparation in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit
10 g/l Rinderserum-Albumin aufgenommen und der Gehalt an rekombinanten pCT
berechnet.
Die nach Beispiel 7(i) durch Bindung des erfindungsgemäßen Antikörpers gegen
Calcitonin und des erfindungsgemäßen Antikörpers gegen Katacalcin an
Latexpartikel hergestellten Reagenzien wurden in einem Volumenverhältnis 1 + 1
gemischt und zur Messung von pCT in einem Standard und in Patientenseren am
Behring-Nephelometer-Analyser (BNA, Dade Behring, Marburg, Deutschland)
eingesetzt. Das gemischte Reagenz wird bei Mischung mit pCT-haltigen Proben
agglutiniert. Die Intensität des Streulichts im BNA ist von der pCT-Konzentration der
Probe abhängig, so dass durch Vergleich mit Verdünnungen eines Standards
bekannter Konzentration die pCT-Konzentration in der Probe ermittelt werden kann.
Die erforderlichen Verdünnungen des Standards mit N-Diluens (Dade Behring,
Marburg, Deutschland) werden automatisch vom Behring-Nephelometer-Analyser
erstellt. Das Messergebnis wird automatisch anhand einer Logit-log-Funktion
berechnet. Zur Messung wurden 100 µl Probe oder Standard mit 100 µl N-Diluens
(Dade Behring, Marburg, Deutschland) und mit 40 µl des gemischten Reagenz in
der Reaktionskuvette gemischt und nach 12 min. die Veränderung des Meßsignals
(in Bit) am BNA gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Zur Herstellung der insbesondere als Standard und/oder Kontrolle geeigneten pCT-
Lösung wurde eine geeignete Menge des nach Expression und Aufreinigung
erhaltenen rekombinanten pCT in verschiedenen Matrizes aufgenommen.
Phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,2 + 1 g/l NaN3 + 40 g/l Polygeline (Hoechst
Marion Roussel, Deutschland GmbH, Prod. Nr.: 125590) + 80000 KIE/I Antagosan®
(Wirkstoff: Aprotinin, Hoechst Marion Roussel, Deutschland GmbH, Prod. Nr.: 122162).
Phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,2 + 1 g/l, NaN3 + 40 g/l Polygeline (Hoechst
Marion Roussel, Deutschland GmbH, Prod. Nr.: 125590) + 80000 KIE/I Antagosan®
(Wirkstoff: Aprotinin, Hoechst Marion Roussel, Deutschland GmbH, Prod. Nr.: 122162)
+ 10 g/l Cholesterol, water soluble (Fa. Sigma, Best. Nr. C-1145).
Lipoproteinfreies Human-Citratplasma (Herstellung gemäß Beispiel 4 von EP-0 606 616)
+ 1 g/l NaN3 + 80000 KIE/I Antagosan® (Wirkstoff: Aprotinin, Hoechst Marion
Roussel, Deutschland GmbH, Prod. Nr.: 122162).
Lipoproteinfreies Human-Citratplasma (Herstellung gemäß Beispiel 4 von EP-0 606 616)
+ 1 g/l NaN3 + 80000 KIE/I Antagosan® (Wirkstoff: Aprotinin, Hoechst Marion
Roussel, Deutschland GmbH, Prod. Nr.: 122162) + 10 g/l Cholesterol, water soluble
(Fa. Sigma, Best. Nr. C-1145).
Zur Überprüfung der Stabilität der pCT-Lösung wurde diese bei +2°C bis +8°C
eingelagert und nach unterschiedlich langen Lagerzeiten die Veränderung des
Meßsignals (in Bit) im pCT-Nachweisverfahren gemäß Beispiel 7(iii) ermittelt. Die
Ergebnisse sind in den Tabelle 5 zusammengefaßt.
Ergebnis: Die auf der Matrix 2 basierende pCT-Lösung ist besonders stabil. Der
Zusatz von Cholesterol fördert auch die Stabilität von pCT in Serum/Plasma-Matrix.
Claims (29)
1. Isoliertes, bevorzugt mit Hilfe gentechnischer Verfahren hergestelltes
Polypeptid, enthaltend die Aminosäuresequenz von humanem Procalcitonin
2. Isoliertes, bevorzugt mit Hilfe gentechnischer Verfahren hergestelltes
Polypeptid, enthaltend die Aminosäuresequenz
3. Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 2, enthaltend die Aminosäuresequenz
4. Verfahren zur Herstellung von humanem Procalcitonin, dadurch
gekennzeichnet, daß ein Gen kodierend für ein Polypeptid, das die
Aminosäuresequenz von humanem Procalcitonin enthält, in einen Vektor
eingefügt wird; ein Wirtsorganismus mit diesem Gen-enthaltenden Vektor
transformiert wird und das von dem Wirtsorganismus exprimierte Polypeptid
isoliert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid nach
einem der Ansprüche 1-3 hergestellt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der
Wirtsorganismus eine menschliche, tierische, pflanzliche oder prokaryontische
Zelle, bevorzugt eine E.coli.-Zelle, ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4-6, dadurch gekennzeichnet, daß der
Vektor einen Fusionsanteil, bevorzugt Poly-Histidin, kodiert, welcher später
eine einfache Aufreinigung des Procalcitonin-Fusionsproteins erlaubt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4-7, dadurch gekennzeichnet, daß pQE-
30 als Vektor verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4-8, dadurch gekennzeichnet, daß zur
Isolierung des Polypeptids Metallaffinitätschromatographie und/oder Gelfiltration
eingesetzt werden.
10. Plasmid, enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen, die eines oder
mehrere der Polypeptide nach Anspruch 1-3 kodieren.
11. Plasmid nach Anspruch 10 mit der Hinterlegungsnummer DSM 13203
12. Tierische, pflanzliche, isolierte menschliche oder prokaryontische Zellen,
dadurch gekennzeichnet, daß diese ein Polypeptid nach einem der Ansprüche
1-3 exprimieren können.
13. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3 oder Verfahrensprodukt nach einem
der Ansprüche 4-9 in einem pharmazeutisch verträglichen, sterilen
Injektionsmedium.
14. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3 oder Verfahrensprodukt nach einem
der Ansprüche 4-9 zur Verwendung als Diagnostikum, als Bestandteil eines
Diagnostikums und/oder zur Herstellung eines Diagnostikums.
15. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3 oder Verfahrensprodukt nach einem
der Ansprüche 4-9 zur Verwendung als Arzneimittel, als Bestandteil eines
Arzneimittels und/oder zur Herstellung eines Arzneimittels.
16. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3 oder Verfahrensprodukt nach einem
der Ansprüche 4-9 zur Verwendung als Immunogen zur Herstellung von
Antikörpern.
17. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß als
Immunisierungsantigen ein oder mehrere Polypeptide gemäß einem der
Ansprüche 1-3 und/oder ein oder mehrere Verfahrensprodukte gemäß einem
der Ansprüche 4-9 als Immunogen verwendet werden.
18. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-3 oder
Verfahrensprodukt nach einem der Ansprüche 4-9 in der
Affinitätschromatographie.
19. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-3 oder eines
Verfahrensproduktes nach einem der Ansprüche 4-9 in einem Verfahren zum
quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten, bevorzugt
Procalcitonin oder gegen Procalcitonin gerichtete Antikörper.
20. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3 oder Verfahrensprodukt nach einem
der Ansprüche 4-9 assoziiert mit einer Festphase und/oder einer Komponente
eines signalbildenden Systems.
21. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-3 oder eines
Verfahrensproduktes nach einem der Ansprüche 4-9 in Standards und/oder
Kontrollen.
22. Testkit enthaltend ein oder mehrere Polypeptide nach einem der Ansprüche 1-3
und/oder ein oder mehrere Verfahrensprodukte nach einem der Ansprüche 4-9.
23. Kontrolle und/oder Standard, enthaltend ein oder mehrere Polypeptide nach
einem der Ansprüche 1-3 und/oder ein oder mehrere Verfahrensprodukte nach
einem der Ansprüche 4-9.
24. Lösung enthaltend ein oder mehrere Polypeptide nach einem der Ansprüche 1-3
und/oder ein oder mehrere Verfahrensprodukte nach einem der Ansprüche 4-9
und einen oder mehrere Sterinester der allgemeinen Formel I:
R1-O-(O)C-R2-C(O)-O-[CH2-CH2-O]n-CH2-CH2-OH Formel I,
worin n = 1-200 und
R1 = Sterin ist
R2 = aliphatischer oder aromatischer Ring mit 4 bis 8 C-Atomen, von denen mindestens eines durch N, S oder O ersetzt werden kann, oder eine geradlinige oder verzweigte Kette mit 0 bis 12 C-Atomen darstellt.
R1-O-(O)C-R2-C(O)-O-[CH2-CH2-O]n-CH2-CH2-OH Formel I,
worin n = 1-200 und
R1 = Sterin ist
R2 = aliphatischer oder aromatischer Ring mit 4 bis 8 C-Atomen, von denen mindestens eines durch N, S oder O ersetzt werden kann, oder eine geradlinige oder verzweigte Kette mit 0 bis 12 C-Atomen darstellt.
25. Lösung nach Anspruch 24, wobei R1 eine Verbindung der allgemeinen Formel
II ist:
R4 und R5 H oder -CH3 sein können
R6 eine geradkettige oder verzweigte Kette mit 1 bis 12 C-Atomen, eine -OH oder = O Gruppe sein kann,
die Ringe A, B, C und D jeder für sich gesättigt, ungesättigt, oder aromatisch sein können
und, wenn R4 = -C(19)H3 ist, der Ring B zwischen C(9) und C(10) unter Ausbildung einer Doppelbindung zwischen C(9) und C(19) geöffnet sein kann.
R4 und R5 H oder -CH3 sein können
R6 eine geradkettige oder verzweigte Kette mit 1 bis 12 C-Atomen, eine -OH oder = O Gruppe sein kann,
die Ringe A, B, C und D jeder für sich gesättigt, ungesättigt, oder aromatisch sein können
und, wenn R4 = -C(19)H3 ist, der Ring B zwischen C(9) und C(10) unter Ausbildung einer Doppelbindung zwischen C(9) und C(19) geöffnet sein kann.
26. Lösung nach Anspruch 24, wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe:
Cholesterin, Vitamin D3, Stigmasterin und Oestron.
27. Lösung nach einem der Ansprüche 24-26, wobei die Konzentration des
Sterinesters 0.05 Gew.-% bis 5 Gew.-% beträgt.
28. Lösung nach einem der Ansprüche 24-27, wobei die Lösung zusätzlich
Polygeline enthält.
29. Lösung nach Anspruch 28, wobei die Polygeline-Konzentration 0.1 Gew.-% bis
10 Gew.-% beträgt.
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Cited By (3)
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WO2008040328A2 (de) | 2006-10-01 | 2008-04-10 | Brahms Aktiengesellschaft | Diagnose von infektionen oder entzündungserkrankungen der atemwege und lunge assoziiert mit herzinsuffizienz |
EP2378290A1 (de) | 2006-11-12 | 2011-10-19 | B.R.A.H.M.S GmbH | Diagnose und Risikostratifizierung von Infektionen und chronischen Erkrankungen der Atemwege und Lungen mittels Pro-Vasopressin, insbesondere Copeptin oder Neurophysin II |
EP3502706A1 (de) | 2017-12-20 | 2019-06-26 | B.R.A.H.M.S GmbH | Workflow für risikobewertung und patientenmanagement unter verwendung von procalcitonin und midregional-proadrenomedullin |
-
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- 2000-06-08 DE DE10027954A patent/DE10027954A1/de not_active Withdrawn
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EP3502706A1 (de) | 2017-12-20 | 2019-06-26 | B.R.A.H.M.S GmbH | Workflow für risikobewertung und patientenmanagement unter verwendung von procalcitonin und midregional-proadrenomedullin |
WO2019122100A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | B.R.A.H.M.S Gmbh | Workflow for risk assessment and patient management using procalcitonin and midregional-proadrenomedullin |
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