ES2280170T3 - Soluciones de procalcitonina humana. - Google Patents
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Abstract
Solución que contiene (I) un polipéptido o varios polipéptidos, conteniendo dichos polipéptidos la secuencia de aminoácidos de la procalcitonina humana (Ver secuencia) o la secuencia de aminoácidos (Ver secuencia) o la secuencia de aminoácidos (Ver secuencia) y (II) uno o varios ésteres de esterol de Fórmula general (I): R1 - O - (O)C - R2 - C(O) - O - [CH2 - CH2 - O]n- CH2 - CH2 - OH Fórmula I en donde n = 1-200 y R1 es esterol, R2 es un anillo alifático o aromático de 4 a 8 átomos de carbono, en donde al menos uno puede estar sustituido por N, S u O, o presenta una cadena lineal o ramificada que tiene de 0 a 12 átomos de carbono y (III) poligelina.
Description
Soluciones de procalcitonina humana.
La invención se refiere a soluciones
estabilizadas que contienen procalcitonina humana, así como a la
preparación de testigos y patrones mediante tales soluciones.
La procalcitonina ("pCT") es una proteína
que consta de 116 aminoácidos y que tiene un peso molecular de
aproximadamente 13.000 dalton. Es la prohormona de calcitonina que,
bajo condiciones metabólicas normales, se produce y se secreta en
las células C de la tiroides. La síntesis de pCT y de calcitonina se
inicia con la traducción de la preprocalcitonina
("pre-pCT"), un péptido precursor que comprende
141 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de la
pre-pCT humana ha sido descrita por Moullec y col.,
en FEBS Letters, 167: 93-97 en 1984. La pCT
se forma después de escindir el péptido señal (los primeros 25
aminoácidos de la pre-pCT). En las personas sanas,
la hormona calcitonina (aminoácidos 60-91 de la
secuencia de aminoácidos de pCT) y la
N-procalcitonina (aminoácidos 1-57
de la secuencia de aminoácidos de la pCT) y la catacalcina
(aminoácidos 96-116 de la secuencia de aminoácidos
de pCT) se producen intracelularmente a partir de pCT mediante
proteolisis específica (véase también, Conlan y col. (1988) Biochem
J., 256:245-250). La pCT y los fragmentos de
la misma se detectaron en concentraciones crecientes en el suero o
en el plasma de pacientes, en particular en casos de ciertas
enfermedades neoplásicas (Ghillani y col., (1989) Cancer Research,
49:6845-6851) y de sepsis (documento
EP-B1-0656121) y de SIRS (síndrome
de respuesta inflamatoria sistémica) (Snider y col., (1997) J.
Investig. Med. 45:552-
560).
560).
Durante la sepsis típica, se liberan bacterias
desde un foco continuamente o en fases a la corriente sanguínea.
Las endotoxinas u otras sustancias pirógenas o tóxicas por su
interacción con mecanismos corporales, provocan las manifestaciones
clínicas. El brote agudo provoca escalofríos y, en casos agudos, una
reacción de choque. Las formas especiales de choque séptico son el
síndrome de Waterhouse-Friderichsen y el síndrome de
choque tóxico (TSS). El TSS es conocido como un cuadro clínico
agudo en infecciones con estafilococos que están provocadas por una
toxina especial de los estafilococos. Una sepsis grave se desarrolla
con relativa frecuencia en pacientes con trastornos primarios
graves, como por ejemplo, enfermedades neoplásicas, quemaduras
graves y traumas.
La importancia para el diagnóstico de la sepsis
de detectar agentes patógenos en la sangre ("cultivo sanguíneo
positivo, bacteriemia") ha quedado en un segundo plano, porque en
general el cultivo sanguíneo es positivo sólo en 20 a 40% de los
casos de sepsis. El término sepsis ha sufrido por ello un cambio. El
término "sepsis" moderno describe un síndrome clínico que
comprende en general fiebre, leucocitosis, alteraciones de la
conciencia, una circulación hiperdinámica ("choque de calor")
y un estado hipermetabólico, no siendo más necesario un cultivo
sanguíneo positivo como prerrequisito para el diagnóstico de la
sepsis.
El documento WO 98/33524 sugiere el empleo de
anticuerpos que se unen a la pCT para la terapia de la sepsis y del
SIRS.
Durante muchos años se han empleado anticuerpos
policlonales que se obtenían por la inmunización con calcitonina,
para detectar la calcitonina denominada inmunorreactiva que, además
de la calcitonina, también comprende procalcitonina y otros
fragmentos de la procalcitonina. Mediante la inmunización con
péptidos sintéticos que tienen secuencias de aminoácidos que se
corresponden con las secuencias de segmentos de procalcitonina, se
pudieron producir diversos anticuerpos monoclonales que se unen a
diversos epítopos de la calcitonina y la catacalcina (Ghillani y
col. (1988) J. Immunol., 141: 3156-3163).
Basándose en estos anticuerpos, se desarrollaron
también inmunoensayos de tipo sándwich para detectar pCT o
calcitonina en muestras de suero. Para la detección de las moléculas
precursoras de la calcitonina, se sugirió una combinación de un
anticuerpo anti-catacalcina con un anticuerpo
anti-calcitonina. Como material de partida, se
empleó un péptido sintético ajustado a estos a estos
anticuerpos.
Es conocido que en los ensayos inmunoquímicos
las señales medidas para los patrones y las muestras no tienen que
ser necesariamente idénticas, incluso si la cantidad de antígeno es
exactamente la misma. Si los antígenos patrones y de la muestra no
son realmente idénticos en relación con su reactividad
inmunoquímica, los anticuerpos empleados en el ensayo reconocerán
mejor uno u otro de los antígenos. Esto conduce finalmente a
diferentes señales medidas para las muestras y los patrones.
Como consecuencia, el uso de fragmentos de
antígeno como patrón en lugar de la proteína completa, está asociado
frecuentemente con desventajas y puede conducir en particular a
medidas distorsionadas. Además, en general no es posible que los
epítopos basados en la estructura tridimensional de la proteína
plegada correctamente estén representados correctamente por
péptidos más cortos. Esto da como resultado el que no sea posible
obtener anticuerpos contra tales epítopos de la conformación,
cuando se emplean péptidos como inmunógenos. Esto es ventajoso en
particular en los formatos de ensayo competitivo, si la sustancia
que se va a detectar tiene la misma reactividad inmunoquímica que
la fase sólida correspondiente o el reactivo del ensayo unido a la
etiqueta.
Aunque la secuencia completa de aminoácidos de
la pCT humana se conoce desde 1984, no se ha conseguido hasta la
fecha preparar pCT humana, en particular en grandes cantidades y de
forma reproducible. Además, sólo se podía expresar en E.
coli la pCT de múrido, mediante procedimientos de modificación
genética (Rehli y col. (1996) Biochem Biophys. Res. Com.
226:420-425).
Sin embargo, la pCT de múrido difiere de la pCT
humana en tal grado (aproximadamente 77% de homología a nivel de
aminoácidos), que todavía supone un problema para los expertos en la
técnica el desarrollar un procedimiento mediante el cual la pCT
humana se pueda producir en cantidades relativamente elevadas,
costes favorables y de forma aislada, para poder emplearla
particularmente como inmunógeno y/o como antígeno sérico patrón o
testigo.
En el documento de solicitud de patente europea
publicada EP-1026506 A1, que era anterior a la fecha
de solicitud internacional de la presente solicitud pero posterior
a la fecha más antigua de solicitud de prioridad de la presente
solicitud, se publicó finalmente la preparación recombinante también
de una procalcitonina humana así como su uso como patrón después de
añadir determinadas sustancias para la estabilización.
Además, en el documento de solicitud de patente
europea publicada EP-0997735 A2, que era anterior a
la fecha de solicitud internacional de la presente solicitud pero
posterior a la fecha más antigua de solicitud de prioridad de la
presente solicitud, se informa de la estabilización de determinados
líquidos biológicos, como por ejemplo suero, plasma, licores,
exudados de la pleura o líquido ascitis.
Adicionalmente, en el documento de patente de
EE.UU. nº 3057782, se publicó un producto gelatinoso reticulado,
así como su uso como alternativa del plasma sanguíneo.
En la presente memoria descriptiva, la
procalcitonina (pCT) se puede producir como un polipéptido aislado
que contiene la secuencia de aminoácidos de la pCT humana, en
particular si se prepara con ayuda de procedimientos de
modificación genética. La secuencia de aminoácidos de la pCT humana
se muestra en la Fig. 1.
La expresión "procedimientos de modificación
genética" de acuerdo con esta invención, también significa en
particular procedimientos en los que el polipéptido que se va a
expresar es producido en células eucariotas o procariotas, la
secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido que se va
a expresar y que incluye las secuencias de ácidos nucleicos
recombinantes que se han introducido previamente en estas células,
por ejemplo, mediante vectores, liposomas, proyectiles o
coprecipitación con sales. En otro procedimiento, un gen que ya
está presente de forma natural en la célula y que codifica el
polipéptido que se va a expresar, se activa mediante medidas
activadoras, por ejemplo, por amplificación génica o activación
mediante secuencias de promotor y/o potenciadoras introducidas
artificialmente o mediante deleción de secuencias de unión al
represor, de modo que esta célula expresa el polipéptido que se va
a expresar en cantidades más elevadas que de forma natural.
La expresión "secuencia de aminoácidos de la
pCT humana" de acuerdo con esta invención, también significa
secuencias de aminoácidos ligeramente alteradas por intercambio,
deleción o adición de aminoácidos y estas alteraciones no deben
tener una influencia negativa grave sobre las propiedades de unión
del polipéptido frente a anticuerpos anti-pCT. El
experto en la técnica puede comprobar ésto, basándose en estudios de
unión adecuados, empleando anticuerpos anti-pCT
disponibles.
El término "péptidos" de acuerdo con esta
invención, comprende amidas ácidas que se descomponen en aminoácidos
con la hidrólisis, por ejemplo, polímeros de aminoácidos tales
como, por ejemplo, polipéptidos, oligopéptidos, proteínas o
fragmentos de proteínas. Las moléculas con menos de diez aminoácidos
unidos se denominan en general oligopéptidos y con más de diez se
denominan polipéptidos.
Otros polipéptidos de acuerdo con la invención,
son polipéptidos aislados que contienen la secuencia de aminoácidos
mostrada en la Fig. 2A o 2B y que se preparan preferentemente
empleando procedimientos de modificación genética.
Un procedimiento preferido de acuerdo con la
invención es también un procedimiento para la preparación de
procalcitonina humana, en donde (i) un gen que codifica un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la
procalcitonina humana, se inserta en un vector, (ii) un organismo
hospedador se transforma con este vector que contiene el gen y
(iii) el polipéptido expresado por el organismo hospedador se aísla.
Unas variantes preferidas de este procedimiento de acuerdo con la
invención son aquellas en las que se prepara un polipéptido que
tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con las Figs. 1, 2A o
2B.
Un "vector" es en particular una molécula
de ADN o de ARN que es capaz de replicarse en un organismo
hospedador y a partir de la cual se puede construir una molécula de
ADN o de ARN recombinante, mediante la incorporación de uno o de
varios genes ajenos. Ejemplos de vectores comunes son plásmidos
bacterianos; genomas víricos, en particular el genoma de
bacteriófagos; cromosomas y plásmidos de levaduras, en particular
YEp, YIp, YRp, YAC, plásmido Ti; así como vectores derivados de
adenovirus, papilomavirus y retrovirus. Para facilitar la expresión
de un gen ajeno, un vector en general tiene un promotor que, si es
posible, es inducible física o químicamente y que inicia la
transcripción de un ARN mensajero que codifica la proteína que se va
a expresar. Además, un vector en general tiene una secuencia de
ácidos nucleicos que produce la detención de la transcripción y
secuencias de ácidos nucleicos que causan una traducción muy eficaz,
tales como por ejemplo, un sitio de unión al ribosoma en el caso de
expresión bacteriana. Adicionalmente, un vector de expresión debe
tener secuencias de detención de la traducción en todos los marcos
de lectura posibles.
Otros procedimientos particularmente preferidos
de acuerdo con la invención, se caracterizan porque el vector, p.
ej., pQE-30, que codifica un segmento de fusión,
preferentemente polihistidina, permite más tarde una purificación
simple de la proteína de fusión procalcitonina.
Células hospedadoras adecuadas para el
procedimiento de acuerdo con la invención, son células humanas,
animales, vegetales o procariotas; se prefiere particularmente las
células de E. coli.
Una "proteína de fusión" significa de
acuerdo con la invención, una proteína que comprende pCT y otro
polipéptido u oligopéptido C-terminal o
N-terminal, que se traduce en su totalidad como un
polipéptido. El segmento de fusión debe aumentar preferentemente la
capacidad de expresión de la procalcitonina y/o favorecer una simple
purificación posterior mediante cromatografía de afinidad de la
proteína de fusión.
Preferentemente, los procedimientos de acuerdo
con la invención emplearán cromatografía de afinidad a metales y/o
filtración en gel para aislar el polipéptido de acuerdo con la
invención.
En el caso de cromatografía de afinidad a
metales se aprovecha el hecho de que la matriz del gel de la
cromatografía contiene iones metálicos cargados doblemente, unidos
a quelato, por ejemplo, Ni^{2+} y que todavía tiene una
pluralidad de sitios de coordinación del ión metálico accesibles y
libres que se pueden unir reversiblemente a proteínas que contienen
una pluralidad de histidinas sucesivas. La elución del polipéptido
de polihistidina bajo condiciones suaves, se puede conseguir a
continuación de forma competitiva, por ejemplo, mediante tampones
que contienen
imidazol.
imidazol.
Esta invención se refiere adicionalmente a un
plásmido que contiene una o varias secuencias de ácidos nucleicos
que codifican uno o varios de los polipéptidos de acuerdo con la
invención. Un plásmido particularmente preferido, denominado
internamente pQE-PCT, se depositó el
16-12-1999 en la DSMZ ("Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH") Mascheroder
Weg 1b, Braunschweig, Alemania, con el número de depósito DSM
13203.
La presente invención se refiere adicionalmente
a soluciones de pCT estables que se pueden emplear, por ejemplo,
como testigos, patrones o para otras aplicaciones in vitro e
in vivo. "Estable" significa en este contexto que la
propiedad deseada de la procalcitonina presente en la solución, por
ejemplo, la capacidad de unirse a anticuerpos específicos,
permanece en general sin variación durante un periodo de tiempo
específico, en particular, durante el almacenamiento de líquido,
mientras que en las soluciones de pCT "inestables", esta
propiedad se altera significativamente durante el mismo periodo de
tiempo.
Las soluciones de pCT estables se pueden
preparar añadiendo (I) un polipéptido de acuerdo con la invención,
(II) ésteres de esterol y (III) poligelina de una matriz con
suero/plasma o una matriz exenta de suero/plasma.
Particularmente, en soluciones de pCT empleadas
como testigos de pCT o patrones de pCT, la pCT empleada también
puede ser, por ejemplo, un péptido que se ha aislado a partir de
fuentes naturales o se ha producido por recombinación y que
contiene al menos partes considerables de la secuencia de
aminoácidos de la pCT humana tales como, por ejemplo, productos de
la escisión de pCT relativamente largos. Sin embargo, el péptido
tiene que ser adecuado como antígeno sérico testigo o patrón en un
método de detección de pCT cuantitativo o
cualitativo.
cualitativo.
Los ésteres de esteroles adecuados para preparar
la solución de pCT de acuerdo con la invención, pertenecen a la
clase de sustancias esteroides (derivados de gonano) que se
caracterizan generalmente por un grupo hidroxilo en la posición
3\beta. Las diferencias principales están en la cadena lateral
localizada en la posición 17(20). Los esteroles constituyen
una clase mayor (Beyer y col. (1981), Lehrbuch der organischen
Chemie, págs. 649-664 "Steroide"). Se pueden
emplear de forma ventajosa, la vitamina D3, el estigmasterol y,
particularmente ventajosa, el colesterol y los derivados del
mismo.
Los ésteres de esteroles que se van a emplear de
acuerdo con la invención, tienen adicional y preferentemente un
grupo polietilenglicol (grupo PEG) unido mediante un ácido
dicarboxílico. En principio, se pueden emplear todos los ácidos
dicarboxílicos conocidos; el uso de ácido succínico, ácido adípico o
ácido sebácico es particularmente ventajoso.
Además, el grupo PEG debe asegurar esencialmente
la solubilidad del éster de esterol, de modo que un experto en la
técnica sea capaz de determinar sin dificultad la longitud óptima,
si es necesario, en un experimento. De acuerdo con la práctica, las
siguientes longitudes de cadena son ventajosas: polietilenglicol
600, polietilenglicol 900 o polietilenglicol 3000.
Los ésteres de esteroles empleados
preferentemente para preparar las soluciones de pCT de acuerdo con
la invención, tienen la Fórmula general I:
Fórmula
IR_{1}-O-(O)C-R_{2}-C(O)-O-[CH_{2}-CH_{2}-O]_{n}-CH_{2}-CH_{2}-OH
en
donde
n = 1-200 y
R_{1} es esterol,
R_{2} es un anillo alifático o aromático de 4
a 8 átomos de carbono, en donde al menos uno puede estar sustituido
por N, S u O, o presenta una cadena lineal o ramificada que tiene de
0 a 12 átomos de carbono, se prefiere especialmente el uso de
ésteres de esteroles en los que R_{1} es un compuesto con la
Fórmula general II:
en
donde
R_{4} y R_{5} pueden ser H o -CH_{3},
R_{6} puede ser una cadena lineal o ramificada
con 1 a 12 átomos de C, un grupo -OH o un grupo =O,
los anillos A, B, C y D pueden estar
independientemente saturados, insaturados o aromáticos,
y cuando R_{4} es -C(19)H_{3},
el anillo B se puede abrir entre C(9) y C(10) con
formación de un doble enlace entre C(9) y C(19).
Se prefiere muy especialmente el uso de ésteres
de esterol en los que el residuo de esterol procede del colesterol,
la vitamina D3, el estigmasterol o la estrona.
Ventajosamente, el éster de esterol se añade en
una concentración tal que la concentración en la solución de pCT es
0,05-5% en peso, preferentemente
0,1-3% en peso, particularmente preferida
0,5-1,5% en peso.
Las soluciones de pCT de acuerdo con la
invención también pueden contener inhibidores de proteasas, por
ejemplo, aprotinina, benzamidina, bestatina, cistatina, pepstatina,
PMSF, inhibidor de tripsina y/o detergentes, en particular
detergentes no iónicos y/o de tipo iónico híbrido.
La poligelina es una mezcla a base de proteínas
de gelatina degradadas térmicamente y reticuladas y se puede
preparar según el documento de patente DE-A1155134 y
el documento de patente de EE.UU. nº 3057782. La poligelina se
añade ventajosamente de modo que la concentración en la solución de
pCT sea de 0,1-10% en peso, preferentemente de
1-8% en peso, particularmente preferida de
2-6% en peso.
Para medir el efecto estabilizador, en
particular en soluciones de pCT que sirven como patrones y/o
testigos, se puede determinar, por ejemplo, la pCT en un
procedimiento de medición nefelométrico.
Otra realización de esta invención comprende el
uso de patrones, testigos y soluciones de pCT de acuerdo con la
invención, en métodos para la detección cuantitativa o cualitativa
de pCT, calcitonina, catacalcina, N-procalcitonina
y/o otros fragmentos de pCT en una muestra.
La Fig. 1 muestra la secuencia de aminoácidos de
la pCT humana.
La Fig. 2 muestra la secuencia de aminoácidos de
un polipéptido de acuerdo con la invención sin segmento de fusión
(A) y con el segmento de fusión (B).
La Fig. 3 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos del vector pQE-30 (3462 pares de
bases).
La Fig. 4 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos del inserto que codifica la pCT y que se clonó en
pQE-30, incluyendo el sitio de corte empleado.
La Fig. 5 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la pCT humana.
Los ejemplos descritos a continuación sirven
como ilustraciones ejemplares de aspectos individuales de esta
invención y no se deben entender como una restricción.
El extremo N-terminal de la pCT
(véase la Fig. 1) se construyó mediante oligonucleótidos sintéticos,
mientras que la construcción del extremo C-terminal
se realizó mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
basándose en ADN genómico de placenta humana:
Como cebadores se emplearon los dos
oligonucleótidos siguientes:
1094: 5' GTG GGA TCC GCA CCA TTC AGG TCT GCC CTG
GAG AGC AGC CCA GCA GAC CCG GCC ACG CTC AGT GAG GAC GAA GCG CGC CTC
CTG CTG GCT GCA CTG GTG CA 3'
1095: 5' GTG AAG CTT AGA TCT GGG GCT GTC CAG GCT
GGA GCC CTC TCT CTC TTG CTC CTG CTC CAG CTC ACT GGC CTT CAT CTG CAC
ATA GTC CTG CAC CAG TGC AGC CA 3'
En donde en cada caso 16 nucleótidos
3'-terminales eran complementarios entre sí.
Se realizó la siguiente PCR:
En una mezcla de reacción de 50 \mul se
pipetearon dNTP 0,25 mM (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania), 1
\muM de cada uno de los cebadores 1094 y 1095, Tris HCl 10 mM, pH
8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,001% de gelatina, 2,5 U de
polimerasa de ADN Ampli-Taq (Perkin Elmer,
Branchburg, New Jersey, EE.UU.) y se amplificó mediante el
termociclador "GenAmp 9700" de Perkin Elmer (todas las
reacciones posteriores con PCR se realizaron también con el mismo
aparato) según el siguiente programa de temperaturas:
Inicial: 5 min, 94ºC
5 x el ciclo: 94ºC 30 seg, 52ºC 30 seg y 72ºC 30
seg
Terminal: 72ºC 10 min.
Cinco \mul de esta mezcla se transfirieron a
una mezcla de nuevo aporte de 50 \mul, tal y como se ha descrito
anteriormente, pero empleando los cebadores 1098 y 1099
1098: 5' GTG GGA TCC GCA CCA TTC 3'
1099: 5' GTG AAG CTT AGA TCT GGG GC 3'
y la reacción se realizó empleando
el siguiente programa de
temperatura:
Inicial: 5 min, 94ºC
30 x el ciclo: 94ºC 30 seg, 56ºC 30 seg y 72ºC
30 seg
Terminal: 72ºC 10 min.
Cinco \mul de esta mezcla se ligaron con 0,5
\mug del vector pCR2.1 del equipo de reactivos de clonación
TA-Cloning kit de Invitrogen, de acuerdo con las
instrucciones del fabricante y se transformaron en E. coli
INV\alphaF'. El plásmido construido recientemente se aisló y se
secuenció empleando métodos convencionales y, al mismo tiempo, se
encontró un intercambio de aminoácidos de L a R en la posición 37 de
la procalcitonina.
El ADN genómico se aisló a partir de 2 g de
tejido de placenta humana empleando métodos convencionales (todos
los protocolos descritos como métodos convencionales proceden de
"Current Protocols in Molecular Biology", 1995, Wiley &
Sons Inc., Nueva York, EE.UU.) y se empleó como molde para la
siguiente PCR:
En una mezcla de reacción de 50 \mul, se
añadió pipeteando 0,5 \mug (1 \mul) de ADN genómico humano como
molde y 1 \mug de cada cebador 1100 y 1101, de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, al equipo de reactivos Taq PCR Core
Kit, nº de catálogo 201223 (Qiagen Hilden, Alemania).
\global\parskip0.930000\baselineskip
1100: 5' GTG TCT AGA TCT AAG CGG 3'
1101: 5' GTG AAG CTT TTA GTT GGC 3'
y se amplificó según el siguiente
programa de
temperaturas:
Inicial: 3 min, 94ºC
30 x el ciclo: 94ºC 30 seg, 45ºC 30 seg y 72ºC
30 seg
Terminal: 72ºC 10 min.
Cinco \mul de esta mezcla se ligaron con 0,5
\mug del vector pCR2.1 procedente del equipo de reactivos
clonación de Invitrogen TA Cloning Kit, según las instrucciones del
fabricante y se transformaron en E. coli INV\alphaF'. El
plásmido construido recientemente se aisló y se secuenció empleando
métodos convencionales, confirmándose la presencia de la secuencia
de tipo silvestre.
Un \mug del vector pQE-30
(Qiagen) se abrió empleando las endonucleasas de restricción BamHI y
HindIII (todas las endonucleasas de restricción se obtuvieron de
Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). Además, el extremo
N-terminal se escindió del plásmido pCR2.1 que
contenía el extremo N-terminal, empleando BamHI y
HindIII (BamHI y HindIII se habían introducido artificialmente
mediante PCR), se aisló empleando métodos convencionales y se ligó
en el vector pQE-30 abierto. La estructura
artificial se aisló y se abrió empleando BglII y HindIII (BglII
está presente naturalmente en el extremo 3' del extremo
N-terminal y se podía emplear aquí para la
estructura). Finalmente, el extremo C-terminal se
escindió del vector pCR2.1 que contenía el extremo
C-terminal, empleando BglII y HindIII, se aisló
empleando métodos convencionales y se ligó en el vector
pQE-30 abierto con BglII y HindIII y que todavía
contenía el extremo N-terminal. El clon que contenía
el plásmido correcto se identificó y la estructura artificial se
verificó por secuenciación. El inserto empleado para la construcción
y la extensión desde BamHI a HindIII se muestra en la Fig. 4; la
secuencia de pCT humana natural se muestra en la Fig. 5.
La expresión de la procalcitonina se realizó en
primer lugar a escala menor de 1 ml:
Se inoculó 1 ml de medio LB (Current Protocols
in Molecular Biology) que contenía 50 \mug de ampicilina (Sigma,
Deisenhofen, Alemania) con una colonia aislada del plásmido de
expresión en la cepa JM109 de E. coli, y se indujo con una
DO_{600} de 0,4 con IPTG 1 mM
(isopropil-tiogalactósido, Sigma) durante 2 h.
Se encontró sorprendentemente una fuerte
expresión de la proteína de fusión de la pCT humana con el extremo
N-terminal MRGSHHHHHHGS del vector pQE, cuando se
analizaba la proteína total del cultivo en un gel PAGE teñido con
Coomassie (Current Protocols in Biology).
A continuación se realizó la expresión a mayor
escala, empleando condiciones convencionales, es decir, se realizó
un cultivo de una noche de un clon aislado en 100 ml de medio LB que
contenía 50 \mug/ml de ampicilina y se agitó a 37ºC. Este cultivo
se dejó crecer hasta la fase estacionaria y se diluyó 1:50 en 1 l de
medio LB de nuevo aporte (ampicilina 50 \mug/ml), se agitó
adicionalmente a 37ºC y se indujo con una DO_{600} de 0,6 con
IPTG 1 mM durante 3 h.
En este caso se encontró sorprendentemente una
caída drástica de la expresión de la proteína de fusión o una
supresión completa de la misma. Este resultado negativo era
reproducible, llegando a la conclusión que la proteína de fusión es
tóxica para E. coli y que tiene lugar muy rápidamente una
selección de mutantes que no expresan la proteína de fusión o la
expresan muy débilmente. Por tanto se intentó mejorar la
expresión
Para ello se cambió la cepa de expresión (JM109,
M15, BL21 y W3110) (Stratagene, La Jolla, Calif.), se varió el
nivel de presión de la selección, variando la concentración de
ampicilina, se varió la fuerza de la inducción cambiando el
inductor IPTG y la duración de la expresión mediante un seguimiento
del curso de la fuerza de inducción después de la inducción.
De este modo se obtuvieron los siguientes
parámetros óptimos:
Células JM109 transformadas recientemente con el
plásmido de expresión, se dejaron crecer con agitación durante una
noche, en medio LB con 100 \mug/ml de ampicilina a 37ºC y a
continuación se diluyeron 1:50 en 1 l de medio LB de nuevo aporte
(ampicilina 100 \mug/ml) y se continuó agitando a 37ºC y con una
DO_{600} de 0,4, se indujeron con IPTG 2 mM durante 3 h.
Manteniendo estas condiciones óptimas, se
obtuvieron de forma reproducible aproximadamente 13 mg de proteína
de fusión a partir de un cultivo de 1 l, después de purificar bajo
condiciones naturales mediante cromatografía de afinidad metálica,
de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Talon Metal
Affinity Resin, Clontech, Palo Alto, Calif.) y posterior filtración
en gel sobre Superdex®75 HiLoad (Amersham Pharmacia).
La secuencia aminoterminal de la procalcitonina
humana recombinante se determinó por degradación automática de
Edman, en un secuenciador de Applied Biosystems 477A.
La secuencia aminoterminal encontrada según el
vector pQE, es idéntica a la encontrada para pCT a partir de un
tumor de tiroides humano (J. M. Conlon y col. (1988) Biochem. J.
256:245-250) (véase la Tabla 1)).
La determinación de la masa molecular relativa
de la procalcitonina recombinante preparada, se realizó mediante
espectrometría de masas con electronebulización. La pCT recombinante
obtenida después de la expresión y la purificación se dializó
frente a agua destilada y se midió a una concentración de 50
\mug/ml en metanol/agua/ácido acético (50/50/0,1) (voltaje del
orificio 90 V; voltaje de la nebulización de los iones 5000 V).
La masa molecular media de la pCT humana
recombinante calculada a partir del espectro obtenido era de 14235
\pm 2 dalton.
El resultado se corresponde muy bien con la masa
teórica de 14239 dalton calculada basándose en la secuencia de
aminoácidos teórica (J. M. Conlon y col. (1988) Biochem. J.,
256:245-250) y teniendo en cuenta el segmento
de fusión del vector pQE (vector pQE: MRGSHHHHHHGS) y el
intercambio de aminoácidos en la posición 37 (L a R) y confirma de
este modo la expresión de la pCT humana recombinante.
El LUMItest® PCT (B.R.A.H.M.S, Berlín) es un
ensayo inmunoluminométrico para determinar la procalcitonina. Dos
anticuerpos monoclonales que se unen a la procalcitonina en dos
sitios diferentes (segmentos de la calcitonina y de la catacalcina)
se emplean para el mismo.
Después de realizar el ensayo de acuerdo con la
descripción del ensayo del fabricante, se determinan las señales de
luminiscencia en un luminómetro adecuado. El tamaño de la señal de
luminiscencia es directamente proporcional a la concentración de
pCT de la muestra respectiva. Con los valores de la señal
luminiscente para los patrones acompañantes, se puede construir una
curva patrón a partir de la cual se puede leer la concentración
desconocida de la procalcitonina de la muestra.
La pCT recombinante obtenida después de la
expresión y la purificación, se determinó en dos diluciones
diferentes en un LUMItest® PCT, de acuerdo con las instrucciones
del fabricante (véase la Tabla 2).
\global\parskip1.000000\baselineskip
El siguiente contenido en pCT de acuerdo con el
LUMItest® PCT, se calcula para las dos muestras examinadas,
teniendo en cuenta las dos diluciones empleadas (1:10.000 y
1:100.000).
Dil. 1 de pCT rec.: 0,5041 mg/ml
Dil. 2 de pCT rec.: 0,4463 mg/ml
Esta investigación apoya la identidad de la pCT
recombinante y la pCT humana y muestra el posible uso de la pCT
rec., por ejemplo, como material sérico patrón y/o testigo en un
ensayo de diagnóstico para determinar pCT humana.
Ratones BALB/c se inmunizaron
intraperitonealmente con 20 \mug de pCT rec. en coadyuvante
completo de Freund. Un refuerzo de 20 \mug de pCT rec. en
coadyuvante incompleto de Freund (ICN Biomedical GmbH, Eschwege,
Alemania) tiene lugar después de 4 semanas y otro refuerzo de 20
\mug de pCT rec. sin coadyuvante de Freund, después de 8 semanas.
Los tres últimos días antes de la fusión, se refuerzan los ratones
por vía intravenosa cada uno con 20 \mug de pCT recombinante.
Después de sacrificar los ratones por inhalación
de CO_{2}, se extirparon los bazos y se prepararon suspensiones
celulares individuales en medio Eagle modificado con Dulbecco exento
de suero (DMEM, CC Pro GmbH, Neustadt/W, Alemania). Las células se
centrifugaron (652 x g) y se lavaron dos veces en DMEM.
Posteriormente, se determinó el número de células mediante tinción
con azul de tripano. Se añadieron 2 x 10^{7} células de mieloma
(Sp2/0) a 10^{8} células de bazo. Después de centrifugar (360 x
g), se eliminó el material sobrenadante, se añadió 1 ml de solución
de polietilenglicol (PEG 4000, Merck Eurolab, Bruchsal, Alemania;
aproximadamente 50% en DMEM) al sedimento celular y las células
resuspendidas se incubaron durante 1 minuto a 37ºC. Posteriormente,
se añadieron aproximadamente 10 ml de DMEM gota a gota y se incubó a
temperatura ambiental durante 2 a 4 minutos. Las células fusionadas
se separaron por centrifugación (326 x g) y el sedimento se
resuspendió en DMEM + 20% de FBS (suero fetal de ternera,
BioWhittaker Europe, Verviers, Bélgica) + solución HAT (CC Pro GmbH,
Neustadt/W, Alemania) y se introdujeron en placas de cultivo de 24
pocillos (Costar). La concentración celular aproximada por pocillo
era 5 x 10^{4} hasta 5 x 10^{6} células.
Dos o tres semanas más tarde, se retiraron las
colonias celulares resultantes (híbridos) y se transfirieron a
placas de cultivo nuevas.
La especificidad de los anticuerpos liberados en
el cultivo celular se sometió a ensayo en una primera etapa,
empleando placas de microtitulación revestidas con antígeno de
inmunización (Nunc, tipo B), revestimiento 0,2 \mug/ml = 0,003
\mug/pocillo.
En cada pocillo de la placa de microtitulación
se pipetearon 100 \mul de material sobrenadante del cultivo
(dilución 1:2) y se incubaron desde +15 hasta +25ºC durante 1 hora.
Después de lavar la placa dos veces empleando solución de lavado
POD (OSEW; Dade Behring, Marburg, Alemania), se introdujeron 100
\mul de conjugado de IgG/F(ab')_{2}-POD
(Dade Behring, Marburg, Alemania) en cada pocillo y se incubaron
desde +15 hasta +25ºC durante 1 hora. Después de lavar la placa de
nuevo dos veces se introdujeron en cada pocillo 100 \mul de
solución de cromógeno TMB (Dade Behring, Marburg, Alemania) y se
incubaron desde +15 hasta +25ºC durante otros 30 minutos. Después
de incubar, se introdujeron 100 \mul de la solución de detención
POD (Dade Behring, Marburg, Alemania) en cada pocillo y la placa de
microtitulación se analizó a 450 nm en un BEP II (Procesador II de
ELISA de Behring).
En una segunda etapa se sometieron a ensayo los
híbridos, tal y como se ha descrito anteriormente, empleando placas
de microtitulación (Nunc, tipo B) revestidas con los siguientes
péptidos:
i. pCT humana recombinante (0,03
\mug/pocillo)
ii Conjugado de calcitonina humana y
BSA (0,5 \mug/pocillo, Bachem, prod. nº
H-2250)
iii Conjugado de catacalcina humana
(PDN-21) y BSA (0,5 \mug/pocillo, Peninsula, prod.
nº 6004)
iv Conjugado del péptido flanqueante
N-terminal de calcitonina y BSA (0,5 \mug/pocillo,
Bachem, prod. nº H-3076) =
N-procalcitonina humana.
Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Las células aisladas de híbridos que producen
los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención (que se
unen a pCT humana), se clonaron empleando un micromanipulador
(Leitz, Wetzlar, Alemania).
La subclase del anticuerpo se determina mediante
el equipo de reactivos para isotipificar anticuerpos monoclonales
de ratón IsoStrip® de Boehringer Mannheim, Alemania.
Para la producción de mayores cantidades de
anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención, se
transfirieron los clones celulares correspondientes a botellas de
tipo rodillo (Corning Costar Alemania, Bodenheim) y se expandieron
hasta el volumen final deseado a 37ºC. A continuación, la suspensión
del cultivo en rodillo se filtra a través de 0,22 \mum para
eliminar las células. La solución de anticuerpos que ahora está
exenta de células, se concentra mediante ultrafiltros (30
kilodalton de grado de admisión) y se purifica posteriormente
En la solución de anticuerpos obtenida, se
ajusta el pH con tampón fosfato 0,14 M pH 8,6 y se aplica a una
columna de cromatografía cargada con rProtein A Sepharose Fast Flow
(Amersham Pharmacia) (1 ml de rProtein A Sepharose Fast Flow se
emplea por 10 mg del anticuerpo que se va a purificar). Todos los
componentes no unidos se eliminan lavando la columna con tampón
fosfato 0,14 M, pH 8,6. El anticuerpo unido se eluye de la columna
con ácido cítrico 0,1 M pH 3,0 y se dializa frente a acetato sódico
0,05 M + NaCl 0,5 M + Tris 0,05 M + azuro sódico 0,01%, pH 7,0.
Cada uno de los anticuerpos monoclonales
anti-calcitonina de acuerdo con la invención y de
los anticuerpos monoclonales anti-catacalcina de
acuerdo con la invención, se unieron a partículas de látex
preparadas de acuerdo con el documento EP-0246445
con un diámetro desde 250 hasta 310 nm.
El polímero de látex empleado se diluyó hasta un
contenido en sólidos de 4% en peso, empleando agua destilada. Los
anticuerpos que se iban a unir se diluyeron hasta tener un contenido
en proteínas de 5 mg/ml, empleando acetato sódico 0,05 M + NaCl 0,5
M + Tris 0,05 M + azuro sódico 0,01%, pH 7,0. Un ml del polímero
mencionado anteriormente se mezcló con 200 \mul de solución de
anticuerpo. A continuación, se añadieron 0,050 ml de una solución
de Tween 20 al 20% (Merck Eurolab, Darmstadt, Alemania) y la mezcla
se mezcló de nuevo. Se añadió a la misma 0,025 ml de HCl 1 N, dando
como resultado un pH de aproximadamente 3. Después de incubar a
temperatura ambiente durante 30 minutos, se añadieron 0,25 ml de
tampón fosfato 1 M pH 6,5 y 0,25 ml de solución de cianoborohidruro
sódico (25 mg/ml) y se mezcló bien. Esto fue seguido de incubación a
temperatura ambiente durante una hora.
Esta mezcla para cargar se centrifugó a
continuación a aproximadamente 50.000 durante 30 minutos. El
material sobrenadante se retiró. El residuo se resuspendió en 4 ml
de tampón imidazol pH 8,1 (5 g/l de imidazol, 40 g/l de sacarosa, 1
g/l de albúmina humana). Esto fue seguido de tratamiento con
ultrasonidos (Branson Sonyfier B15) durante 30 segundos. El
reactivo dispersado de nuevo de este modo, se diluyó en una
proporción en volumen de 1:7,5 empleando el tampón de imidazol
mencionado anteriormente y se sometió a ultrasonidos de nuevo
durante 30 segundos.
El contenido en proteínas de la pCT recombinante
obtenida después de la expresión y purificación, se determinó en la
preparación mediante una determinación de las proteínas de acuerdo
con Lowry y col. (1951, J. Biol. Chem. 193,
265-275). Para preparar un patrón, se tomó una
cantidad adecuada de esta preparación en una solución salina
tamponada con fosfato con 10 g/l de seroalbúmina bovina y se calculó
el contenido en pCT recombinante.
Los reactivos preparados de acuerdo con el
Ejemplo 7(i) mediante la unión del anticuerpo monoclonal de
anti-calcitonina de acuerdo con la invención y el
anticuerpo anti-catacalcina de acuerdo con la
invención, a partículas de látex, se mezclaron en una proporción de
volumen de 1 + 1 y se emplearon para medir la pCT en un suero patrón
y en los sueros de pacientes, en un analizador de nefelometría de
Behring (BNA, Dade Behring, Marburg, Alemania). El reactivo
mezclado se aglutina cuando se mezcla con las muestras que contienen
pCT. La intensidad de la luz dispersada en el BNA es dependiente de
la concentración de pCT de la muestra, de modo que la concentración
de pCT en la muestra se puede determinar comparando con las
diluciones de un patrón de concentración conocida. El analizador de
nefelometría de Behring realiza automáticamente las diluciones
necesarias del patrón, empleando N-Diluens (Dade
Behring, Marburg, Alemania). El resultado medido se calcula
automáticamente empleando una función logit-log.
Para la medición se mezclaron 100 \mul de la muestra o del patrón
con 100 \mul de N-Diluens (Dade Behring, Marburg,
Alemania) y con 40 \mul del reactivo mezclado en una cubeta de
reacción y el cambio en la señal medida (en bit) se midió en el BNA
12 minutos después. Los resultados se resumen en la Tabla 4.
Para preparar la solución de pCT de forma
particularmente adecuada como patrón y/o testigo, se tomó en
diferentes matrices una cantidad adecuada de pCT recombinante
obtenida después de la expresión y la purificación.
Matriz
1
Solución salina tamponada con fosfato pH 7,2 + 1
g/l de NaN_{3} + 40 g/l de poligelina (Hoechst Marion Roussel
Deutschland, GmbH, prod. nº 125590) + 80000 UIK/l de Antagosan®
(ingrediente activo: aprotinina; Hoechst Marion Roussel
Deutschland, GmbH, prod. nº 122162).
Matriz
2
Solución salina tamponada con fosfato pH 7,2 + 1
g/l de NaN_{3} + 40 g/l de poligelina (Hoechst Marion Roussel
Deutschland, GmbH, prod. nº 125590) + 80000 UIK/l de Antagosan®
(ingrediente activo: aprotinina; Hoechst Marion Roussel
Deutschland, GmbH, prod. nº 122162) + 10 g/l de colesterol, soluble
en agua (Sigma, nº de catál. C-1145).
Matriz
3
Plasma-citrato humano exento de
lipoproteína (preparado según el Ejemplo 4 del documento
EP-0606616) + 1 g/l de NaN_{3} + 80000 UkL/l de
Antagosan® (ingrediente activo: aprotinina; Hoechst Marion Roussel
Deutschland, GmbH, prod. nº 122162).
Matriz
4
Plasma-citrato humano exento de
lipoproteína (preparado según el Ejemplo 4 del documento
EP-0606616) + 1 g/l de NaN_{3} + 80000 UIK/l de
Antagosan® (ingrediente activo: aprotinina; Hoechst Marion Roussel
Deutschland, GmbH, prod. nº 122162) + + 10 g/l de colesterol,
soluble en agua (Sigma, nº de catál. C-1145).
Para comprobar la estabilidad de la solución de
pCT, ésta se almacenó de +2ºC hasta +8ºC y después de diferentes
periodos de tiempo de almacenamiento, se determinó el cambio en la
señal medida (en bits) por el método de detección de pCT, según el
Ejemplo 7(iii). Los resultados se muestran en la Tabla 5.
Resultado: La solución de pCT que se basa en la
matriz 2 es particularmente estable. La adición de colesterol
también favorece la estabilidad de la pCT en una matriz de
suero/plasma.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Dade Behring Marburg GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procalcitonina humana, su
preparación y su uso
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Ma1236
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 19962434.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-12-22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 10016278.9
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-04-03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 10027954.6
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-06-08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: cebador, ADN no genómico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: cebador, ADN no genómico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: cebador, ADN no genómico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgggatccg caccattc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: cebador, ADN no genómico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgaagctta gatctggggc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: cebador, ADN no genómico
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgtctagat ctaagcgg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: cebador, ADN no genómico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgaagcttt tagttggc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: proteína, procalcitonina humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: proteína, procalcitonina humana
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Descripción del organismo
desconocido: proteína, procalcitonina humana
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<223> Descripción del organismo
desconocido: proteína, procalcitonina humana
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<213> Desconocido
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<223> Descripción del organismo
desconocido: proteína, procalcitonina humana
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<223> Descripción del organismo
desconocido: proteína, procalcitonina humana
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desconocido: secuencia de ADN, procalcitonina humana
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<212> ADN
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<223> Descripción del organismo
desconocido: secuencia de ADN, procalcitonina humana
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<400> 15
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Claims (6)
1. Solución que contiene (I) un
polipéptido o varios polipéptidos, conteniendo dichos polipéptidos
la secuencia de aminoácidos de la procalcitonina humana
o la secuencia de
aminoácidos
o la secuencia de
aminoácidos
y (II) uno o varios ésteres de
esterol de Fórmula general
(I):
Fórmula
IR_{1}-O-(O)C-R_{2}-C(O)-O-[CH_{2}-CH_{2}-O]_{n}-CH_{2}-CH_{2}-OH
en
donde
n = 1-200 y
R_{1} es esterol,
R_{2} es un anillo alifático o aromático de 4
a 8 átomos de carbono, en donde al menos uno puede estar sustituido
por N, S u O, o presenta una cadena lineal o ramificada que tiene de
0 a 12 átomos de carbono
y (III) poligelina.
2. Solución según la reivindicación 1, en
donde R_{1} es un compuesto con la Fórmula general II:
en
donde
R_{4} y R_{5} son H o -CH_{3},
R_{6} es una cadena lineal o ramificada con 1
a 12 átomos de C, un grupo -OH o un grupo =O,
los anillos A, B, C y D están cada uno
independientemente saturados, insaturados o aromáticos,
y cuando R_{4} es -C(19)H_{3},
el anillo B se abre entre C(9) y C(10) con formación
de un doble enlace entre C(9) y C(19).
3. Solución según la reivindicación 1, en
donde R_{1} se selecciona entre el grupo: colesterol, vitamina
D3, estigmasterol y estrona.
4. Solución según una de las
reivindicaciones 1-3, en donde la concentración del
éster de esterol es desde 0,05% en peso hasta 5% en peso.
5. Solución según una de las
reivindicaciones 1-4, en donde la concentración de
poligelina es desde 0,1% en peso hasta 10% en peso.
6. Testigo y/o patrón que comprende una
solución según una de las reivindicaciones anteriores.
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