CN114478745B - 一种重组降钙素原pct的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，包括以下步骤：培养诱导、破菌和分离纯化，所述分离纯化依次包括离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析。本发明将离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析相结合为组合层析法，即将这三种方法的优点结合起来进行重组PCT蛋白分离纯化，得到的PCT蛋白的纯品纯度大于90％，纯度高为建立免疫学检测方法提供原材料，具有重要意义。离子交换层析、疏水层析和凝胶层析的顺序及实验条件是实现PCT蛋白纯度达到90％以上的关键点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法。
背景技术
降钙素原(procalcitonin，PCT)是人11号染色体中降钙素原基因表达的产物。目前PCT的分离纯化技术主要为疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析以及亲和层析。
疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。该技术虽然操作成本低，但得到的PCT蛋白得率较低、纯化速度不高、纯度较低，活性不高。
离子交换层析是根据蛋白表面带电量不同进行蛋白质的分离纯化技术。该技术得到的PCT蛋白纯度不高、活性较差。凝胶过滤层析是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离纯化。该技术虽然操作条件较温和，但是凝胶载量低、选择性差，纯化速度较低。
亲和层析是利用目标蛋白与亲和载体配基有较强的吸附力，从而将目标蛋白与其他物质分离目的。此技术虽然可以有效避免蛋白的活性，但目标蛋白分离纯化实验条件要求高。
本发明将离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析组合进行PCT蛋白分离纯化，充分利用每种方法的优势，使得到的蛋白得率高，纯度高为建立免疫学检测方法提供原材料，具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，以解决现有技术中的问题。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、培养诱导：
LB培养基，1mMIPTG诱导，可溶表达，诱导结束A600＝3.498，获得湿菌；
S2、破菌：
在步骤S1中得到的湿菌中加入破菌液，冰浴超声，超声破菌后，取1ml小样，用于电泳；其余样品离心后，上清用于后续分离纯化或-20℃保存；
S3、分离纯化：
S31、疏水层析：选用丁基，辛基或苯基疏水介质，优选丁基，用含0.75M硫酸铵的缓冲液为平衡缓冲液，缓冲液pH7.0-9.0，优选pH8.0；上样后采用无硫酸的相同缓冲液进行梯度洗脱，所选梯度为6CV；
S32、离子交换层析：选用弱阴离子或强阴离子交换介质，优选DEAEFF，进行第二步层析纯化；所需平衡缓冲液A为pH8.0，20mM Tris；洗脱缓冲液B为：pH8.0 20mM Tris+1MNaC；上样后采用梯度洗脱，洗脱条件：0-100％B，6CV洗脱；
S33、组和层析：
S331：装填DEAE FF介质的层析柱，用pH8.0，20mM Tris缓冲液进行平衡，上样后同样缓冲液进行淋洗，随后用pH8.0，20mM Tris+1M NaCl缓冲液进行洗脱，流速5ml/min，梯度洗脱，收集洗脱峰，用3M的硫酸铵调节洗峰峰电导54.2ms/cm。
S332：装填ButylFF层析柱，用pH8.0，20mM Tris+0.75M(NH4)2SO4的缓冲液进行平衡，平衡后将DEAE洗脱并调节电导后的样品上样，淋洗后采用pH8.0，20mM Tris+0.3M硫酸铵，pH8.0，20mM Tris+0.2M硫酸铵，以及pH8.0，20mM Tris进行梯阶跃洗脱，收集20mM Tris+0.3M硫酸铵洗脱峰进行后续纯化。
S333、装填Superdex 75胶过滤柱，缓冲液为pH7.4，20mM PB+0.1M Na2SO4，将ButylFF洗脱峰上样，收集洗脱峰为目标产品。
进一步的，所述步骤S1中，共获得12.3g湿菌。
进一步的，所述步骤S2中，将12.3g湿菌中加入100ml破菌液。
进一步的，所述步骤S2中，破菌液包括20mM tris、1mM EDTA和2mM PMSF，破菌液的pH＝8.0。
进一步的，所述步骤S2中，超声功率300W，超声时工作5s，停止5s，工作4min，重复6次。
进一步的，所述步骤S2中，在12000rpm，4℃离心30min。
进一步的，所述步骤S2中，破菌后溶液发黄且透亮。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将离子交换层析、疏水层析和凝胶层析相结合为组合层析法，即将这三种方法的优点结合起来进行PCT蛋白分离纯化，得到的PCT蛋白的纯品纯度大于90％，纯度高为建立免疫学检测方法提供原材料，具有重要意义。离子交换层析、疏水层析和凝胶层析的顺序及实验条件是实现PCT蛋白纯度达到90％以上的关键点。
附图说明
图1是步骤S2中破菌后的电泳结果图；
图2是步骤S31的层析图及电泳检测图；
图3是步骤S32的层析图及电泳检测图；
图4是步骤S33的层析色谱图，其中：(a)为DEAE层析色谱图，(b)为Butyl FF层析色谱图，(c)为Superdex 75层析色谱图；
图5是步骤S33的纯度检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例1
一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、培养诱导：
LB，摇瓶发酵4×500ml；
可溶表达，诱导结束A600＝3.498，共获得12.3g湿菌；
S2、破菌：
菌体12.3g+100ml破菌液(pH8.0,20mM tris+1mM EDTA+2mM PMSF))，冰浴超声(工作5s，停止5s，工作4min，重复6次)，超声破菌后，取1ml小样，用于电泳，其电泳结果如图1所示；其余样品在12000rpm，4℃离心30min，分离上清和沉淀，上清用于后续的分离纯化，或直接保存在-20℃(破菌后溶液发黄且透亮)；
S3、分离纯化，包括以下方式：
S31、疏水层析：
1ml butyl FF柱的层析纯化：A液：pH8.0 20mM Tris+0.75M(NH4)2SO4 B液：pH8.020mM Tris，流速：1ml/min，洗脱条件：0-100％B，6CV；
所述步骤S31的层析图及电泳检测图如图2所示；
S32、阴离子交换层析：
1ml DEAE柱的层析纯化：A液：pH8.0 20mM Tris B液：pH8.0 20mM Tris+1M NaCl，流速：1ml/min，洗脱条件：0-100％B，6CV洗脱；
所述步骤S32的层析图及电泳检测图如图3所示；
S33、组和层析
S331、DEAE FF
层析柱：5ml DEAEFFHitrap
缓冲液A：pH8.0 20mM Tris
缓冲液B：pH8.0 20mM Tris+1M NaCl
流速：5ml/min，
S332、Butyl FF
层析柱：1mlButyl FFHitrap柱
缓冲液A：pH8.0 20mM Tris+0.75M(NH4)2SO4
缓冲液B：pH8.0 20mM Tris，流速：1ml/min
样品处理：DEAE洗脱峰用3M硫铵调电导到54.2ms/cm
洗脱条件：阶跃洗脱，60％B-70％B-100％B
S333、Superdex 75
样品：20200303-pro3-丁基-60％B洗脱峰
缓冲液：pH7.4,20mM PB+0.1M Na2SO4，
流速：0.8ml/min，上样1ml。
所述步骤S33的层析色谱图和步骤S33的纯度检测结果图如图4和5所示。
实验证明，根据本发明提供的方法得到的PCT蛋白的纯品纯度大于90％。
实施例2
一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、培养诱导：
LB培养基(常规培养基)，1mMIPTG诱导，可溶表达，诱导结束A600＝3.498，获得12.3g湿菌；
S2、破菌：
在步骤S1中得到的12.3g湿菌中加入100ml破菌液(破菌液包括20mM tris、1mMEDTA和2mM PMSF，pH8.0)，冰浴超声(超声功率300W，超声时工作5s，停止5s，工作4min，重复6次)，超声破菌后溶液发黄且透亮，取1ml小样，用于电泳；其余样品离心(在12000rpm，4℃离心30min)后，上清用于后续分离纯化或-20℃保存；
S3、分离纯化：
S31、疏水层析：选用丁基，用含0.75M硫酸铵的缓冲液为平衡缓冲液，缓冲液pH9.0；上样后采用无硫酸的相同缓冲液进行梯度洗脱，所选梯度为6CV；
S32、离子交换层析：选用弱阴离子或强阴离子交换介质，优选DEAEFF，进行第二步层析纯化；所需平衡缓冲液A为pH8.0，20mM Tris；洗脱缓冲液B为：pH8.0 20mM Tris+1MNaC；上样后采用梯度洗脱，洗脱条件：0-100％B，6CV洗脱；
S33、组和层析：
S331：装填DEAE FF介质的层析柱，用pH8.0，20mM Tris缓冲液进行平衡，上样后同样缓冲液进行淋洗，随后用pH8.0，20mM Tris+1M NaCl缓冲液进行洗脱，流速5ml/min，梯度洗脱，收集洗脱峰，用3M的硫酸铵调节洗峰峰电导54.2ms/cm。
S332：装填ButylFF层析柱，用pH8.0，20mM Tris+0.75M(NH4)2SO4的缓冲液进行平衡，平衡后将DEAE洗脱并调节电导后的样品上样，淋洗后采用pH8.0，20mM Tris+0.3M硫酸铵，pH8.0，20mM Tris+0.2M硫酸铵，以及pH8.0，20mM Tris进行梯阶跃洗脱，收集20mM Tris+0.3M硫酸铵洗脱峰进行后续纯化。
S333、装填Superdex 75胶过滤柱，缓冲液为pH7.4，20mM PB+0.1M Na2SO4，将ButylFF洗脱峰上样，收集洗脱峰为目标产品。
实施例3
一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、培养诱导：
LB培养基(常规培养基)，1mMIPTG诱导，可溶表达，诱导结束A600＝3.498，获得12.3g湿菌；
S2、破菌：
在步骤S1中得到的12.3g湿菌中加入100ml破菌液(破菌液包括20mM tris、1mMEDTA和2mM PMSF，pH8.0)，冰浴超声(超声功率300W，超声时工作5s，停止5s，工作4min，重复6次)，超声破菌后溶液发黄且透亮，取1ml小样，用于电泳；其余样品离心(在12000rpm，4℃离心30min)后，上清用于后续分离纯化或-20℃保存；
S3、分离纯化：
S31、疏水层析：选用丁基，用含0.75M硫酸铵的缓冲液为平衡缓冲液，缓冲液pH8.0；上样后采用无硫酸的相同缓冲液进行梯度洗脱，所选梯度为6CV；
S32、离子交换层析：选用弱阴离子或强阴离子交换介质，优选DEAEFF，进行第二步层析纯化；所需平衡缓冲液A为pH8.0，20mM Tris；洗脱缓冲液B为：pH8.0 20mM Tris+1MNaC；上样后采用梯度洗脱，洗脱条件：0-100％B，6CV洗脱；
S33、组和层析：
S331：装填DEAE FF介质的层析柱，用pH8.0，20mM Tris缓冲液进行平衡，上样后同样缓冲液进行淋洗，随后用pH8.0，20mM Tris+1M NaCl缓冲液进行洗脱，流速5ml/min，梯度洗脱，收集洗脱峰，用3M的硫酸铵调节洗峰峰电导54.2ms/cm。
S332：装填ButylFF层析柱，用pH8.0，20mM Tris+0.75M(NH4)2SO4的缓冲液进行平衡，平衡后将DEAE洗脱并调节电导后的样品上样，淋洗后采用pH8.0，20mM Tris+0.3M硫酸铵，pH8.0，20mM Tris+0.2M硫酸铵，以及pH8.0，20mM Tris进行梯阶跃洗脱，收集20mM Tris+0.3M硫酸铵洗脱峰进行后续纯化。
S333、装填Superdex 75胶过滤柱，缓冲液为pH7.4，20mM PB+0.1M Na2SO4，将ButylFF洗脱峰上样，收集洗脱峰为目标产品。
实施例4
一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、培养诱导：
LB培养基(常规培养基)，1mMIPTG诱导，可溶表达，诱导结束A600＝3.498，获得12.3g湿菌；
S2、破菌：
在步骤S1中得到的12.3g湿菌中加入100ml破菌液(破菌液包括20mM tris、1mMEDTA和2mM PMSF，pH8.0)，冰浴超声(超声功率300W，超声时工作5s，停止5s，工作4min，重复6次)，超声破菌后溶液发黄且透亮，取1ml小样，用于电泳；其余样品离心(在12000rpm，4℃离心30min)后，上清用于后续分离纯化或-20℃保存；
S3、分离纯化：
S31、疏水层析：选用辛基，用含0.75M硫酸铵的缓冲液为平衡缓冲液，缓冲液pH7.0；上样后采用无硫酸的相同缓冲液进行梯度洗脱，所选梯度为6CV；
S32、离子交换层析：选用弱阴离子或强阴离子交换介质，优选DEAEFF，进行第二步层析纯化；所需平衡缓冲液A为pH8.0，20mM Tris；洗脱缓冲液B为：pH8.0 20mM Tris+1MNaC；上样后采用梯度洗脱，洗脱条件：0-100％B，6CV洗脱；
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、培养诱导：
LB培养基，1mMIPTG诱导，可溶表达，诱导结束A600＝3.498，获得湿菌；
S2、破菌：
在步骤S1中得到的湿菌中加入破菌液，冰浴超声，超声破菌后，取1ml小样，用于电泳；其余样品离心后，上清用于后续分离纯化或-20℃保存；
S3、分离纯化：
S31、疏水层析：选用丁基，辛基或苯基疏水介质，用含0.75M硫酸铵的缓冲液为平衡缓冲液，缓冲液pH7.0-9.0；上样后采用无硫酸的相同缓冲液进行梯度洗脱，所选梯度为6CV；
S32、离子交换层析：选用弱阴离子或强阴离子交换介质，进行第二步层析纯化；所需平衡缓冲液A为pH8.0，20mM Tris；洗脱缓冲液B为：pH8.0 20mM Tris+1M NaCl；上样后采用梯度洗脱，洗脱条件：0-100％B，6CV洗脱；
S33、组和层析：
S331：装填DEAE FF介质的层析柱，用pH8.0，20mM Tris缓冲液进行平衡，上样后同样缓冲液进行淋洗，随后用pH8.0，20mM Tris+1M NaCl缓冲液进行洗脱，流速5ml/min，梯度洗脱，收集洗脱峰，用3M的硫酸铵调节洗峰峰电导54.2ms/cm；
S332：装填ButylFF层析柱，用pH8.0，20mM Tris+0.75M(NH4)2SO4的缓冲液进行平衡，平衡后将DEAE洗脱并调节电导后的样品上样，淋洗后采用pH8.0，20mM Tris+0.3M硫酸铵，pH8.0，20mM Tris+0.2M硫酸铵，以及pH8.0，20mM Tris进行梯阶跃洗脱，收集20mM Tris+0.3M硫酸铵洗脱峰进行后续纯化；
S333、装填Superdex 75胶过滤柱，缓冲液为pH7.4，20mM PB+0.1M Na2SO4，将Butyl FF洗脱峰上样，收集洗脱峰为目标产品。
2.根据权利要求1所述的一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中，共获得12.3g湿菌。
3.根据权利要求1或2所述的一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中，将12.3g湿菌中加入100ml破菌液。
4.根据权利要求3所述的一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中，破菌液包括20mM tris、1mM EDTA和2mM PMSF，破菌液的pH＝8.0。
5.根据权利要求1所述的一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中，超声功率300W，超声时工作5s，停止5s，工作4min，重复6次。
6.根据权利要求1所述的一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中，在12000rpm，4℃离心30min。
7.根据权利要求1所述的一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中，破菌后溶液发黄且透亮。
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