СП
о
О)
ел Изобретение относитс к произво ству ферментных препаратов тромболитического действи , а именно ,-к способу получени урокиназы, приме н емой в медицинской практике, пре имущественно при тромбоэмболически заболевани х. Известен способ выделени уроки назы, включающий очистку фермента с использованием сульфатаммонийного осаждени , многократного, центри фугировани , гельфильтрации на сефадексах , ионообменной хроматографии .l. Недостатки способа состо т в мн гостадчйности, трудоемкости и длительности процедуры. Наиболее близок к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату способ очистки урокиназы, включающий гидрофобную и аффинную хроматографию биологических источников фермента 2. Основные недостатки способа зак чаютс в необходимости предварител ной концентрации выдел емого фермента и использовании обогащенных биологических источников. Цель изобретени - увеличение удельной активности целевого проду та. Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу выделени урокиназы из биологических источни ков, включающему гидрофобную хроматографию , хроматографию провод т дважды на колонке с бензилсефарозой в присутствии 20%-ного сульфата аммони , а элюцию урокиназы осу ществл ют формиатным буфером рН 4, причем первую сорбцию урокиназы на носителе осуществл ют при рН7,0 а вторую - при рН 4,0 с последующей гель-фильтрацией. Использование гидрофобного носител позвол ет избирательно и пр тически полностью извлечь фермент, а путем изменени условий сорбции при повторной хроматографии удал ю с балластные белки. Способ вьаделени урокиназы осуществл етс следующим образом. К среде кондиционировани клето почек человека RH добавл ют сульфат аммони до 20%-ного насьщени и довод т рН раствора 1 М трис до 7,П..Раствор пропускают через колонку , упакованную гидрофобным сор бентом и бензилсефарозой и уравновешенную и,1 М трис-НС1 буфером 7,0, содержащим 0,4 М Had и 20% сульфата аммони . Колонку промьгеают уравнорешивающим буфером и элюируют урокиназу формиатным буфером рН 4,0. На второй стадии к элюату добавл ют сульфат аммони до 20%-ного насьпцени , сорбируют его на той же колонке с бензилсефарозой, уравновешенной -0,05 М формиатным буфером рН 4,0, содержащим 20% сульфата аммони . Колонку промывают уравновешивающим буфером. Урокиназу элюируют 0,05 М формиатным буфером рН 4,0. Окончательную очистку осуществл ют гель-фильтрацией на ультрагеле АсА 54. Белки элюируют 0,05 М трис-НС1 рН 7,5, содержащим 0,2 М NaCl. Фракции, содержащие урокиназу , диали уют и лиофильно высушивают . Пример 1. К 1 литру среды кондиционировани культуры клеток почек человека RH, содержащей 35 ME урокиназы на 1 мл, добавл ют 106 г сульфата аммони до 20%-ного насыщени , подвод т рН до 7,0 1 М трис. Раствор нанос т на колонку 1-7 см, упакованную 20 мл бензилсефлрозы, котора предварительно уравновещена 0,1 М трис-НС1 буфером рН 7,0, содержащим 0,4 М NaCl и 20% сульфата аммони . Все процедуры провод т при комнатной температуре. Скорость нанесени среды кондиционировани 250 мл/ч. Колонку промывают с такой же скоростью уравновешивающим буфером до полного прекращени вымывани красител , содержащегос в среде кондиционировани , и белков, не св завшихс со смолой. Урокиназной активности в этих фракци х не обнаружено. Св занный на колонке i фермент злюируют 0,05 М формиатным буфером рН 4,0 со скоростью 40 мл/ч. Удельна активность урокиназы после первой стадии очистки составл ет 3800 МЕ/мг. Выход 92%. На второй стадии к 16 мл полученного раствора урокиназы добавл ют 1,6 г сульфата аммони до 20%-ного насыщени . Вторую хроматографию провод т на той же колонке с бензилсефарозой , но уравновешенный 0,05 М формиатным буфером рН 4,0, содержащим 20% сульфата аммони . После нанесени раствора белка колонку промьтают 100 мл уравновешивающего буфера со скоростью 250 мл после чего урокиназу элюируют 0;,05 формиатным буфером рН 4,0 со скоростью 40 мл/ч. Удельна активность урокиназы после второй стадии очистки состав л ет 42000 МЕ/мг. Выход 76%. Сконцентрированный ультрафильтрацией на амиконе (фильтр РМ-Ю до 2 мл раствор урокиназы нанос т на колонку 1-57 см, упакованную ультрагелем АсА 54 и уравновешенную 0,05 М трис-НС1 буфером рН 7,5 содержащим 0,2 М NaCl. Скорость эл ции белков 7 мл/ч. Фракции, содерж щие урокиназную активность, диализуют и лиофильно высушивают. Удельна активность препарата после последней стадии очистки сос тавл ет 190000 МЕ/мг. Выход 64%. Прим ер 2.-Ц качестве исход ного сырь используют обедненную среду кондиционировани культуры клеток почек человека RH, содержащую 3 ME урокиназы на 1 мл. На первой стадии аналогично при меру 1 получают урокиназу с удельной активностью 3350 МЕ/мг. Выход 95%. Удельна активность урокиназы после второй стадии очистки состав л ет 38000 ME/мл. Выход продукта 7 После последней стадии очистки удельна активность урокиназы 120000 МЕ/мл. Выход 68%. П р и М е р 3. Третьи порции среды кондиционировани культуры клеток почек человека RH объемом по 200 мл кажда с суммарной активностью урокиназы 5600 МЕ/мл (удельна активность 28 МЕ/мл обрабатывают аналогично примеру 1 на первой стадии хроматографии, но с измененной конечной концентрацией сульфата аммони на каждую порцию соответственно 10, 20 и 30%. Вьгход продукта соответственно составл ет 41,92 и 89% с активностью урокиназы в каждой конечной порции:2300, 5150 и 5000 МЕ/мл. Максимальный выход продукта достигаетс при концентрации сульфата аммони 20%. Предлагаемый способ обеспечивает получение препарата урокиназы из обедненных сред кондиционировани , содержащих урокиназу до 3 МЕ/мл; отличаетс быстротой очистки (до 1 сут ) и высокой удельной активностью получаемого препарата урокиназы в результате исключени нескольких трудоемких процедур, таких как предварительна концентраци , диализ и центрифугирование, так как одновременно осуществл етс концентраци и очистка фермента. По сравнению с известными предлагаемый способ значительно упрощен, поскольку на двух стади х процесса используетс одна и та же хроматографическа колонка.